CN1109891A - 防止蛋白质c降解的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及阻止或最大限度减少被活化的蛋白
质C自发降解的方法。作为最佳实例，本发明是在
低pH下，例如pH约6.3至6.5条件下加工、纯化和
/或储存被活化的蛋白质C而完成的。也可以在
3M尿素中保温aPC(除去变性剂后完全回收aPC
活性)，或在极端盐浓度存在下保温aPC而最大限度
地减少aPC的自发降解。本发明还包括将aPC保
存在低pH条件下的、变性剂中的或极端盐浓度下的
aPC配制品。
Description
本发明涉及酶学，特别是涉及防止被活化的蛋白质C降解的方法。
蛋白质C是丝氨酸蛋白酶和天然存在的抗凝剂，它在调节止血中通过激活凝血级联中的因子Ⅴa和Ⅷa而发挥作用。人类蛋白质C是作为有461个氨基酸的单一多肽在体内主要在肝脏中产生的。该前体分子受到多重转译后修饰，包括1）裂解42氨基酸信号序列;2）从一链酶原上蛋白水解除去155位上的赖氨酸残基和156位上的精氨酸残基以得到二链形式的分子（即155个氨基酸残基的轻链通过二硫桥键连接到含丝氨酸蛋白酶的262个氨基酸残基的重链上）;3）群集在轻链前42个氨基酸残基中的9个谷氨酸残基经维生素K依赖性羧化作用，产生9个γ-羧基谷氨酸残基;4）在4个位点上连接糖（1个在轻链中，3个在重链中）。重链含有已明确证实的有Asp257、His 211和Ser 360三位组合的丝氨酸蛋白酶。最后，在钙离子存在下，在体内于磷脂表面由凝血酶激活循环的2链酶原。由于除去重链N末端的十二肽而导致的活化作用，产生具有酶促活性的被激活的蛋白质C（aPC）。
在用大量和高浓度aPC进行的工作中，观察到在重链308位赖氨酸处的蛋白水解剪切部分。该剪切所产生的N末端序列以Glu-Ala-Lys开始，并从重链的C末端产生称为“EAK片段”的111氨基酸片段。EAK片段没有通过二硫键共价连接到轻链上或重链上的N末端部分上。EAK片段还含有丝氨酸蛋白酶的活性位点丝氨酸，但没有Asp或His残基。因此，发现带有EAK片段的蛋白质C制剂已改变了抗凝血剂活性。本发明包括通过在变性剂中，或在极端盐浓度中于降低的pH下保存分子以防止或减少蛋白质C分子降解的方法。
为描述本发明的目的，对本文中使用的术语定义如下。
aPC-活化的人蛋白质C。
APTT-活化的部分组织促凝血酶原激酶时间。
AU-酰胺水解单位。
BME-β-巯基乙醇。
CHES-2[N-环己基氨基]乙烷磺酸。
EAK片段-在蛋白质C重链的308位剪切而产生的111氨基酸片段。
EDTA-乙二胺四乙酸。
HEPES-N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸。
HPC-人蛋白质C酶原。
MEA-2-氨基乙醇。
MES-2-（N-吗啉代）-乙烷磺酸。
新生蛋白质-在mRNA转录本转译后产生的，进行任何转译后修饰之前的多肽。但例如谷氨酸残基的β羧化和天冬氨酸残基的羟化等转译后修饰作用可能在从mRNA转录本完全转译成蛋白质之前开始出现。
蛋白质C活性-负责蛋白质水解、酰胺水解、酯水解和生物学（抗凝血或血纤维蛋白溶解）活性的人蛋白质C的任何性质。试验蛋白质C抗凝血和酰胺水解活性的方法是本领域中已知的（参见Grinnellet al.，1987，Bio/Technology 5：1189-1192）。
rHPC-重组产生的人蛋白质C酶原。
酶原-蛋白水解酶的酶学无活性前体。本文所说的蛋白质C酶原是指一链或二链的，分泌的、无活性形式的蛋白质C。
本说明书中所用的所有氨基酸缩写都是如37 C.F.R.§ 1.822（b）（2）（1990）中所列的被美国专利与商标局接受的氨基酸缩写词。
本发明涉及防止或最大限度减少活化的蛋白质C自发降解的方法。本发明是通过在低pH下，例如，在大约pH6.3至pH7.0条件下完成活化的蛋白质C的加工、纯化和/或储存而给出最佳实例的。也可在3M尿素中保温aPC（在除去变性剂后得以完全回收aPC活性），或在极端盐浓度的存在下保温aPC来尽可能地减少aPC的自发降解。为本公开的目的，极端盐浓度是指盐浓度在大约0.4摩尔以上或大约0.05摩尔以下。本发明也包括使aPC保持在低pH，在变性剂中，或在极端盐浓度下的aPC配制品。
蛋白质C在维持止血中的作用，已激发了对使用该化合物作为多种血管病的治疗剂的很大兴趣。在工业规模上生产高水平和高浓度的人蛋白质C已暴露出这样一个事实，即该分子可发生自发降解而导致抗凝血活性的降低。aPC的自发降解导致从重链的C末端形成一个称为“EAK片段”的111氨基酸片段。EAK片段没有通过二硫键共价连接到轻链上或重链的N末端部分上。EAK片段还包括丝氨酸蛋白酶的活性位点丝氨酸残基，但没有Asp或His残基。因此，由于存在蛋白水解修剪，带有EAK片段的蛋白质C制剂已改变了抗凝血活性。
为了最大限度地减少或防止导致形成EAK片段的自发降解，可将完整的被活化的蛋白质C分子保存在大约6.3至7.0之间的pH条件下。在整个纯化和活化过程中，以及在最终的配制溶液中，均可使分子保持在这一范围的pH条件下。可使用许多不同的缓冲液体系来维持溶液的pH。有代表性的缓冲液体系包括Tris-乙酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸盐-甘氨酸和磷酸钠。熟练的技术人员将会理解到，可以利用其他许多也可用于本发明方法中的缓冲液体系。
本发明的另一方面涉及将活化的蛋白质C分子保存在具有极端盐浓度的溶液中，以防止或减少EAK片段的形成。例如，在pH7.0的磷酸钠缓冲液中，当缓冲液中没有盐时EAK片段生成最少。但在pH7.0的磷酸钠缓冲液中，当缓冲液内存在浓度约0.4M的氯化钠时EAK片段生成也最少。在这两个盐浓度之间，EAK片段以可变的速度形成;但熟练的技术人员将会理解到，盐浓度保持在0.05M以下或0.4M以上时，将最容易防止或减少EAK片段的形成。虽然当溶液的pH保持在大约pH7.0，且不向溶液中加盐时可得到最好的医药配制品，但使用低于0.05M的其他盐浓度（如0.01M或0.005M）也是可取的。熟练的技术人员可以理解到，在药物加工和配制中可以使用许多不同的盐。可用于本发明的有代表性的盐包括氯化钾、氯化钠，以及最优选的氯化钠。
本发明的再一个方面涉及通过在变性剂存在下进行纯化和/或配制来防止或尽可能减少活化的蛋白质C自发降解。可使用许多不同的变性剂，但最优选的变性剂是浓度为大约3M的尿素。
本发明不只限于生产被活化的蛋白质C的方法。虽然最有效的是使用重组DNA技术生产活化的蛋白质C，但最近大规模纯化技术的进展已允许从人血清中分离显著量的活化的蛋白质C。得到如此大量的蛋白质C，即可一次加工高浓度的活化的蛋白质C。如上所述，发明人发现活化的蛋白质C的浓度在每毫升约50毫克以上时，证明有伴随抗凝血剂活性降低的活化的蛋白质C分子的自动降解，最重要的是，自动降解的速率随着溶液中活化的蛋白质C的浓度增加而增加。然而在工业水平上，不能以很低的蛋白质浓度有效地进行大规模纯化处理。
从活化的蛋白质C生产的工业和医药实用性角度看，必须在远超过50毫克的浓度下加工该分子，本发明即可使熟练的技术人员在没有明显丢失产品活性的情况下大量生产该产品。另外，本发明的配方允许以比现有技术已知配制品更长的时间稳定地储存活化的蛋白质C溶液。
熟练的技术人员将会理解到，本发明的方法将会使实践本发明的人能够以比以前可达到的浓度更高的浓度制得更大体积的活化的蛋白质C，而不必害怕因自动降解造成产品丢失。另外，可以按照Toylor，Jr.等人的美国专利5，009，889号中所述方法很容易地使用本发明的稳定的药物配制品治疗患有身体病症的病人。
下列实施例是为举例说明本发明而提供的，它们并不构成对本发明的限制。
实施例1
人蛋白质C的生产
可按照本领域技术人员已知的，例如美国专利4，981，952号（Yan）中所述的技术（该文献全文列为本文参考文献），在人肾293细胞中生产重组人蛋白质C（rHPC）。Bang等人在美国专利4，775，624号（其全文列为本文参考文献）中公开要求保护了编码人蛋白质C的基因。用于在293细胞中表达人蛋白质C的质粒是Bang等人在美国专利4，992，373中公开的质粒pLPC。欧洲专利申请0445939号中，以及Grinnell等人在Bio/Technology 5∶1189-1192（其内容也列为本文参考文献）中也描述了质粒pLPC的构建。简单地说，将质粒转染到293细胞中，然后鉴定稳定的转化体，再培养并使之生长在无血清培养基中。发酵后，经微过滤得到无细胞培养基。
按照美国专利4，981，952号中公开的Yan的技术从培养液中分离出人蛋白质C。澄清的培养基配制到浓度达4mM的EDTA中后，使其吸附到阴离子交换树脂（Fast-Flow Q，Pharmacia）上。用4倍柱体积的20mM Tris、200mM NaCl（pH7.4）和2倍柱体积的20mM Tris、150mM NaCl（pH7.4）洗柱后，用20mM Tris、150mM NaCl、10mM CaCl2（pH7.4）洗脱结合的重组人蛋白质C酶原。洗脱后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法判断，洗脱的蛋白质纯度大于95%。
为进一步纯化该蛋白质，将蛋白质溶在浓度达3M的NaCl中后，吸附到在20mM Tris、3M NaCl、10mM CaCl2，pH7.4中平衡的疏水相互作用树脂（Toyopearl Phenyl 650M，TosoHaas）上。用2倍柱体积没有CaCl2的平衡缓冲液洗柱后，用20mM Tris，pH7.4洗脱重组人蛋白质C。制备洗脱的蛋白质，以通过除去残留的钙而使之活化。使重组人蛋白质C通过金属亲和柱（Chelex-100，Bio-Rad）以除去钙并再次结合到阴离子交换剂（Fast-Flow Q，Pharmacia）上。这两个柱串联排列并在20mM Tris、150mM NaCl、5mM EDTA，pH7.4中平衡。蛋白质上柱后，用1倍柱体积的同一缓冲液洗Chelex-100柱，然后从串联系列上将其断开。用3倍柱体积的平衡缓冲液洗阴离子交换柱后，用0.4M NaCl、20mM Tris-乙酸盐，pH6.5洗脱蛋白质。通过在UV 280nm的消光值上测定重组人蛋白质C和重组活化的蛋白C溶液的蛋白质浓度（E0.1%分别为1.85或1.95）。
实施例2
重组人蛋白质C的激活
在50mM HEPES、pH7.5存在下，于4℃将牛凝血酶偶联到活化的CH-Sepharose 4B（Pharmacia）上。偶联反应在已装入柱中的树脂上进行，每毫升树脂约使用5000单位凝血酶。凝血酶溶液通过柱约循环3小时后，加入MEA达到每升循环溶液0.6ml的浓度。使含有MEA的溶液继续循环10-12小时，以确保完全封闭树脂上未反应的胺。封闭后，用10倍柱体积的1M NaCl、20mM Tris、pH6.5洗偶联了凝血酶的树脂，以除去所有非特异性结合的蛋白质，并在激活缓冲液中平衡后用于活化反应。
将纯化的rHPC加于EDTA中使浓度达5mM（以螯合任何残留的钙），并用20mM Tris、pH7.4或20mM Tris-乙酸盐、pH6.5将蛋白质稀释到2mg/ml的浓度，使该材料通过37℃用50mM NaCl和20mM Tris（pH7.4）或20mM Tris-乙酸盐（pH6.5）平衡的凝血酶柱。调整流速以使rHPC与凝血酶树脂之间的接触时间约为20分钟。收集流出液并立即进行酰胺水解活性分析。如果该材料没有与已确定的aPC标准品差不多的比活性（酰胺水解活性），则使之再次通过凝血酶柱循环，以完全激活rHPC。然后用20mM上述pH为7.4或6.5的缓冲液以1∶1比例稀释该材料以使aPC保持在低浓度，同时等待进行下一加工步骤。
将aPC结合到已在含150mM NaCl的活化缓冲液（20mM Tris，pH7.4或20mM Tris-乙酸盐，pH6.5）中平衡的阴离子交换树脂（Fast-Flow Q，Pharmacia）上，以从aPC材料中除去滤出的凝血酶。在这些条件下凝血酶不与阴离子交换树脂作用，但可通过柱进入流出液中。一旦aPC上柱后，即用2-6倍柱体积的20mM平衡缓冲液洗柱，然后用加在5mM Tris-乙酸盐，pH6.5或20mM Tris，pH7.4中的0.4M NaCl洗脱结合的aPC。用较大体积缓冲液洗柱有利于更充分地除掉十二肽。将从该柱洗脱的材料以冷冻溶液（-20℃）形式或作为冻干粉末储存。
使用Beckman DU-7400二极管阵列分光光度计检测从合成底物H-D-Phe-Pip-Arg-对位硝基酰苯胺（S-2238）（购自Kabi Vitrum）释放的对位硝基苯胺，以确定aPC的酰胺水解活性（AU）。1单位激活的蛋白质C定义为使用9620M-1cm-1的对位硝基苯胺在405nm处的消光系数，在1分钟内释放1μmol对位硝基苯胺（25℃，pH7.4）所需酶的量。
在激活的部分组织促凝血酶原激酶时间（APTT）凝血试验中，检测凝血时间的延长以确定被激活的蛋白质C的抗凝血活性。在稀释缓冲液（1mg/ml放射免疫试验级BSA、20mM Tris，pH7.4，150mM NaCl，0.02% NaN3）中制备蛋白质C浓度范围为125-1000ng/ml的标准曲线，同时在该浓度范围内以几个稀释度制备样品。向各样品容器内加入50μl冷马血清和50μl重新配制的激活的部分组织促凝血酶原激酶时间试剂（APTT Reagent，Sigma），并于37℃保温5分钟。保温后，向各小瓶内加入50μl适当的标准样品。用稀释缓冲液代替样品或标准品以确定基础凝血时间。在向各样品或标准品中加入50μl的30mM CaCl2（37℃）后，立即开始纤凝计（fibrometer）（CoA Screener Hemostasis Analyzer，American Labor）的计时。根据标准曲线的线性回归方程计算样品中的激活的蛋白质C浓度。这里所报告的凝血时间是包括标准曲线样品在内的这次重复之最小值的平均数。
为了制备用于比较研究的样品，于25℃保温44小时后或者于4℃在阴离子交换树脂（FFQ，Pharmacia）（pH7.4）上浓缩后，使aPC（7.3mg/ml，在20mM Tris、150mM NaCl中）完全自动降解。对样品进行酰胺水解活性分析、HPLC分析、N末端序列测定和SDS-PAGE分析，以进一步证实和确定自动降解的量，以及氨基酸序列上的裂解位点。
实施例3
激活的蛋白质C稳定性试验
监测AU以检查pH对aPC活性的影响。以使用各50mM MES（pH5.5-7）、HEPES（pH6.8-8.2）和CHES（pH8.6-10）的三个缓冲系统确立范围为6-9.3的pH条件（以0.3pH单位逐渐增加）。用适当的pH缓冲液将aPC稀释到0.4mg/ml的终浓度，并在此浓度保温，然后检测活性。使用在保温pH下进行的酰胺水解试验，于保温开始时和4℃保温30小时后分析各样品。这些检测结果显示出酰胺水解活性对pH的钟形pH依赖性曲线。结果示于下列表Ⅰ中。
表1
酰胺水解速率（IU/mg aPC）
pH 0小时 30小时
6.0 1.63 1.58
6.6 4.00 4.63
7.2 9.16 6.68
7.8 11.26 9.26
8.4 7.05 5.16
9.0 3.53 3.53
pH7.4时显示aPC有最大活性，而在6和9.3的极端pH时则显示出大大降低的活性。虽然在极端pH时aPC似乎保留某些酰胺水解活性，但这一数据揭示可通过避免使aPC有最大活性的pH条件来减少自发降解。
为了确定是否aPC的酰胺水解活性对pH的依赖性是EAK片段形成的函数，于pH6.0、7.5和9.0条件下，将1.5mg/ml的aPC样品于4℃保温18小时。对EAK HPLC峰下面积进行积分，并定量观察SDS-PAGE上的EAK带来检测所形成的EAK的量。这些数据显示，在pH6.0条件下保温过程中EAK产生量没有增加，而在pH7.5时约增加30%，且在pH9.0时增加50%，尽管在pH7.5和9.0样品中有提高的EAK片段水平，但当在pH7.4条件下检测时，该制剂仍有高的AU活性。因此，EAK片段的产生为一定与酰胺水解活性相关。确切地说，EAK片段必须一直保持与aPC重链之其余部分的足够联系，以维持丝氨酸蛋白酶功能性。如果有所区别的话，较高EAK片段含量是与较高酰胺水解活性相关联的。
EAK片段含有催化三元组（包括见于重链N末端部分中的His 211和Asp 257）的活性位点丝氨酸（残基360）。因此，如果EAK片段没有共价连接到重链的其余部分上，则该蛋白水解剪切就可能导致酶促活性降低。为了探讨不同量的EAK对抗凝血活性的影响，按照实施例1和2中所述方法制备不同的几批aPC。用浓度范围为22-198μM的底物（＃S-2238），浓度范围为1.6-3.3nM（75-150ng/ml，在20mM Tris，pH7.4，150mM NaCl中）的aPC进行酰胺水解试验。结果示于下列表Ⅱ中。
表Ⅱ
百分EAK含量与比活性（酰胺水解和抗凝活性）的关系
比活性
样品序号 %EAK AU/mg APTT/mg
1 3 1.13 2.11
2 19 1.35 1.7
3 35 1.52 1.37
4 51 1.64 1.00
5 67 1.68 0.78
利用降解的pH依赖性产生含不同量EAK的aPC样品，按上文实施例1和2中所述方法制备这些样品，将有不同含量EAK片段的样品与完整的aPC（＜3% EAK片段）相比较。以三个不同的酶浓度检测各批样品的酰胺水解动力学参数，包括Km、Kcat和Vmax值。结果总结于表Ⅲ中。
表Ⅲ
动力学数据
样品序号 [aPC] Km Vmax Kcat
(% EAK) ng/ml (mM) (umol/ml/分) (1/秒)
1(20%) 150 0.12 9102 7
1 113 0.12 8634 6.6
1 75 0.19 8713 6.7
2(67%) 150 0.18 10672 8.2
2 113 0.18 9729 7.5
2 75 0.18 9930 7.6
3(100%) 150 0.16 13142 10.1
3 113 0.14 2337 1.8
3 75 0.18 316 0.2
在实验变量内，三个aPC样品的Km值看来是相同的，并且显示0.16mM底物平均值。这一结果提示，在被降解的aPC中对S-2238底物的亲和性没有被破坏。令人惊奇的是，降解的材料仍然具有基本上与完整aPC相似的AU活性。
既使有高EAK片段含量，被活性的蛋白质C亦可能对三肽底物（＃S-2238）有完整的酰胺水解功能。可在APTT试验中检测体外抗凝活性。
意想不到的是，高AU活性与抗凝活性无相互关联。虽然AU活性随着EAK含量的增加而增加，但APTT活性却随着EAK含量增加而降低。
在不同的pH水平和盐浓度下保温被活化的蛋白质C的样品，然后每小时检测EAK片段形成的百分数，以研究盐浓度对EAK片段形成和被活化的蛋白质C稳定性的影响。检测中所用蛋白质C浓度为每毫升4-5毫克。所有检测实验均在5-20mM磷酸盐缓冲液中进行。使用的盐（当存在盐时）是氯化钠，并且所有检测都在25℃下完成。用HPLC积分法测定每小时形成的EAK片段的百分量。结果示于下列表Ⅳ中。
表Ⅳ
盐浓度对EAK片段形成的影响
pH 盐浓度 形成的EAK百分量/小时
6.4 400nM 0.094
7.0 400mM 0.145
6.4 50mM 0.292
7.0 50mM 0.365
6.4 0 0.038
7.0 0 0.092
Claims (10)
1、最大限度减少活化的蛋白质C降解的方法，该方法包括将所说的活化的蛋白质C保存在pH约为6.3至7.0溶液中。
2、根据权利要求2的方法，其中所说的溶液具有低于约0.050M或高于约0.40M的盐浓度。
3、根据权利要求2的方法，其中所说的溶液具有低于约0.050M的盐浓度。
4、根据权利要求2的方法，其中所说的溶液具有低于约0.010M的盐浓度。
5、根据权利要求2的方法，其中溶液中的盐是氯化钠。
6、最大限度减少活化的蛋白质C降解的方法，该方法包括将所说的活化的蛋白质C保存在含有变性剂的溶液中。
7、稳定的药物配制品，其包含加在pH约为6.3至7.0的溶液中的活化的蛋白质。
8、根据权利要求7的药物配制品，其进一步包含浓度低于约0.050M或高于约0.4M的盐。
9、根据权利要求8的药物配制品，其中盐浓度低于约0.05M。
10、根据权利要求7的药物配制品，其中缓冲液选自Tris-乙酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸盐-甘氨酸和磷酸钠。
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