HUT70465A

HUT70465A - Methods for preventing degradation of protein c

Info

Publication number: HUT70465A
Application number: HU9500021A
Authority: HU
Inventors: Walter Francis Prouty; Josephine Secnik
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1994-01-05
Filing date: 1995-01-04
Publication date: 1995-10-30
Also published as: KR950032287A; NZ270271A; NO2006006I1; RU2167936C2; EP1087011A3; ES2156190T3; YU295A; ZA9514B; HU9500021D0; LU90992I2; LU90993I2; CN1109891A; FI950044A0; IL112236A; SI0662513T1; GR3036277T3; AU1003195A; CA2139468C; CZ1395A3; EP0662513A1

Description

A találmány enzimológiai tárgyú; közelebbről az aktivált protein C bomlásának meggátlására szolgáló eljárásokra vonatkozik.

A protein C egy szerin proteináz, az alvadás természetes előfordulású antikoaguláns résztvevője, amely szerepet játszik a hemosztázis szabályozásában, az V és VIII faktorok aktiválása utján. A humán protein C in vivő elsődlegesen a májban szintetizálódik 461 aminosavból álló egyazálu polipeptid formájában. Ξ prekurzor molekula többszörös poszttranszlációs módosuláson megy át, igy 1/ egy 42 aminosavból álló szignál szakasz lehasad, 2/ az egyláncu zimogénből a 155-helyzetü lizincsoport és a 156-helyzetü arginincsoport proteolitikus utón eltávozik és ezáltal a molekula kétláncu formája jön létre /azaz egy 155 aminosavrészt tartalmazó könnyű lánc diszulfidhidon át kapcsolódik a szerin proteinázt tartalmazó, 262 aminosavrészből álló nehéz lánchoz/; 3/ a könnyű lánc első negyvenkét aminosavában tömörült kilenc glutaminsavrész K vitamin-függőén karboxileződik, kilenc gamma-karboxi-glutaminsav-részt eredményezve; és 4/ négy helyI re szénhidrát kötődik /egy a könnyű láncba és három a nehéz láncba/. A nehéz lánc az Asp-257, His-257 és Ser-360 jól dediniált szerin proteináz triádját tartalmazza. Végül in vivő a keringő kétláncu zimogént foszfolipidek felszínén, Ca-ionok jelenlétében trombin aktiválja. Az aktiválás eredményeként a nehéz lánc N-terminális részén egy dekapeptid hasad le és ·· · enzimaktivitással rendelkező aktivált protein C /aPC/ keletkezik.

Nagy mennyiségű és nagy koncentrációjú aPC előállításakor a nehéz lánc 308 helyzetű lizinrészénél vágás” /clip/ figyelhető meg. E vágás által létrehozott uj N-terminus szekvenciája Glu-Ala-Lys-zel kezdődik és égy 111 aminosavból álló töredék, az un. EAK-fragmentum” képződik a nehéz lánc C-terminális végétől kezdődően. Az EAK-fragmentum nem kötődik kovalensen a könnyű lánchoz vagy a nehéz lánc N-terminális részéhez diszulfidkötések utján. Az EAK-töredék a szerin proteináz aktív centrumában szerint is tartalmaz, de nem tartalmaz Asp vagy His maradékot. így felfedezték, hogy az EAK-fragmentumot tartalmazó protein C preparátumok antikoaguláns aktivitása megváltozott. Találmányunk körébe tartoznak a protein C molekula bomlásának megakadályozására vagy a lehető legkisebbre csökkentésére szolgáló eljárások, melyek során a molekulát alacsony pH-η denaturáló reagensben, vagy szélsőséges koncentrációjú sóoldatban tartjuk.

A találmány leírására használt meghatározások jelentése az alábbi.

aPC - aktivált humán protein C.

ΑΡΤΙ - aktivált parciális tromboplasztin idő.

AU - amidolitikus egységek.

EME - béta-merkapto-etanol.

CHES - P-^H-ciklohexil-aminoZ-etánszulfonsav.

·· ·· • · • · · · · · _Λ · · · ·· ··

EAK-fragmentum - a protein C nehéz láncának 308-helyzetében levő clip” hatására képződő, 111 aminosavből álló töredék.

EDTA - etilén-diamin-tetraecetsav.

HEPES - N-/2-hidroxi-etil/-piperazin-N’-/2-etánszulfonsav/.

HPC - humán protein G zimogén.

MEA - 2-amino-etanol.

MES - 2-/N-morfolino/-etánszulfonsav.

Naszcens protein - az mRNS minta transzlációjakor képződött polipeptid., posztszintetikus módosulások előtt. Posztszintetikus módositások, mint a glutaminsavrészek gammakarboxilezése és az aszparaginsavrészek hidroxileződése azonban már akkor bekövetkezhet, mielőtt a fehérje egy mRNS mintáról teljesen lefordítódna.

Protein C aktivitás - a proteolitikus, amidolitikus, észterhasitó és biológiai /antikoagluláns vagy profibrinolitikus/ aktivitásokért felelős humán protein C bármely tulajdonsága. A protein C antikoaguláns és amidolitikus aktivitáI sának tesztelésére szolgáló eljárások jól ismertek /lásd Grinnell és munkatársai, Bio/Technology 5., 1189-1192 /1987//.

rHPC - rekombináns módon képződött protein C zimogén.

Zimogén - valamely fehérjebontó enzim enzimatikusan inaktiv prekurzora. Az itt használt protein C zimogén megneve zés az egy vagy kétláncu protein G szekretált, inaktív formáira vonatkozik.

Az aminosavak rövidítései a ”United States Patent and Trademark Office elfogadott rövidítései /37 G.P.R. §1.822/b/ /2/ /1990//.

Találmányunk az aktivált protein G autodegradációjának megakadályozására vagy lehető legkisebbre csökkentésére alkalmas eljárásokra vonatkozik. A találmány legelőnyösebb kivitelezésénél az aktivált protein C tisztítása és/vagy tárolása alacsony pH-értéken, például mintegy pH 6,3 - 7,0 között történik. Az aPC autodegradációja 3 M karbamidban való inkubálással /az aPC aktivitás teljes visszanyerése következik be a denaturáló szer eltávolítása után/, vagy szélsőséges koncentrációjú sóoldat jelenlétében való inkubálással is csökkenthető. E leírásban a szélsőséges sókoncentráció mintegy 0,4 molárisnál nagyobb, vagy mintegy 0,05 molárisnál alacsonyabb koncentrációkat jelent. Találmányunk magába foglalja azokat az aPC készítményeket is, amelyekben az aPC-t alacsony pH-η tartjuk, denaturáló szer vagy szélsőséges sókoncentráI ciók jelenlétében.

A protein G-nek a hemosztázis fenntartásában játszott szerepe nagy érdeklődést váltott ki e vegyület terápiás felhasználása iránt, számos érbetegség kezelése szempontjából. A humán protein C magasabb szintű és koncentrációjú, ipari méretű előállításakor fény derült arra a tényre, hogy a

- 6 molekula autodegradációt szenvedhet, ami az alvadásgátló aktivitás csökkenését eredményezi. Az aPC aut'.odegradáció ja egy EAK-fragmentumnak nevezett, 111 aminosavrészből álló szakasz képződéséhez vezet a nehéz lánc C-terminális végétől kiindulva. Az EAK-töredék nem kötődik kovalens kölcsönhatások utján a könnyű lánchoz vagy a nehéz lánc N-terminális részéhez diszulfidhidak utján. Az EAK-töredék a szerin proteináz aktív helyű szerinrészét is tartalmazza, de nem tartalmaz Asp- vagy His-maradékot. így az EAK-töredéket tartalmazó protein C készítmények megváltozott alvadásgátló aktivitással rendelkeznek a proteolitikus clip” jelenlétének tulajdoníthatóan.

Az EAK-töredék képződéséhez vezezető autodegradáció csökkentése vagy megakadályozása céljából az aktivált protein C molekula mintegy 6,3 - 7,0 pH-tartományban tartható az egész tisztitó és aktiváló eljárás, valamint a végső oldattá alakítás folyamán. Az oldat pH-ja számos különböző pufferrendszerrel tartható fenn. Jellemző pufférrendszer például a Tris—acetát, nátrium-citrát, citrát-glicin és nátrium-foszfát. A szakember előtt ismert módon sok más pufférrendszer áll rendelkezésre, amelyek a találmány szerinti eljárásokban alkalmazhatók.

A találmány egy másik arculata az EAK-töredék képződésének megelőzésére vagy csökkentésére vonatkozik az aktuvált protein C molekula szélsőséges koncentrációjú sóoldatban való tartása utján. Például pH 7,0-nél nátrium• · · · • · · · · · ·

-foszfát pufferben az EAK-fragmentum képződése minimális, ha a puffer nem tartalmaz sót. pH 7»0-nél nátrium-foszfát pufferben azonban az EAK-töredék képződése akkor is minimális, ha mintegy 0,4 M NaCl van jelen a pufferben. E két sókoncentrá ció között az EAK-fragmentum képződésének mértéke különböző, de a szakember előtt érthető módon a 0,05 M alatti vagy 0,4 M feletti sókoncentrációk fenntartása által könnyen megelőzhető vagy csökkenthető az EAK-töredék képződése. 0,05 M alatti egyéb sókoncentrációk /például 0,01 M vagy 0,005 M/ előnyösek, de a legjobb gyógyszerészeti készítményhez akkor jutunk, ha az oldat pH-ját mintegy 7,0 értéken tartjuk és sót hem adunk az oldathoz. A szakember előtt világos, hogy sok különféle só használható a gyógyszerészeti feldolgozásnál és formulálásoknál. A találmány szerint használható jellemző sók közé tartozik a kálium-klorid, kalcium-klorid és legelőnyösebben a nátrium-klorid.

A találmány még további aspektusa az aktivált protein C autodegradációjának megelőzésére vagy csökkentésére vonatkozik, mely szerint a tisztítást és/vagy formulálást

I denaturáló ágens jelenlétében hajtjuk végre. Sok különböző denaturáló szer használható, de legelőnyösebb reagens a mintegy 3 M koncentrációjú karbamid.

A találmány nem korlátozódik az aktivált protein C előállítására használható eljárásokra. Bár aktivált protein C molekulák leghatásosabban rekombináns technológiával nyerhetők, • · ι

- 8 ι a nagy léptékű fehérjetisztitásban elért uj előrelépések lehetővé teszik, hogy a humán szérumból jelentős mennyiségű aktivált protein C-t izoláljunk. Ilyen nagy mennyiségű aktivált protein C-hez jutva lehetővé vált nagy koncentrációjú aktivált protein C egy időben való kezelése. Mint említettük, azt a felfedezést tettük, hogy mintegy 50 ug/ml-nél nagyobb koncentrációkban az aktivált protein C molekula autodegradációt szenved és egyidejűleg csökken alvadásgátló aktivitása. Rendkívül fontos, hogy az autodegradáció mértéke nő, ha az oldatban emelkedik az aktivált protein C koncentrációja. Ipari szintű, nagy léptékű tisztítási műveletek végzése nagyon alacsony fehérjekoncentrációnál nem hatékony.

Mivel az aktivált protein C termelés ipari és gyógyszerészeti hasznossága a molekula 5o ug-ot messze meghaladó koncentrációját igényli, a találmány a szakember számára nagy mennyiségű termék előállítását engedi meg a termék aktivitásának jelentős vesztesége nélkül. A találmány szerinti formulálások továbbá lehetővé teszik, hogy a stabil aktivált protein C oldatokat a korábban ismertnél hosszabb ideig tároljuk.

A szakember számára érthető, hogy a találmány szerinti eljárások a találmányt kivitelező személy számára lehetővé teszik, hogy az aktivált protein C nagyobb térfogatait magasabb koncentrációkban állítsa elő a korábban lehetségesnél, anélkül, hogy tartani kellene az autodegradációnak • ·

- 9 betudható terme^veszteségtől. Ezenfelül a találmány szerinti stabil gyógyászati készítmények könnyen alkalmazhatók fizikai rendellenességektől szenvedő betegek kezelésére, amint ezt Taylor Jr. és munkatársai az 5,009,889 számú Egyesült Államokbeli szabadalmi bejelentésben leírják és amelyre itt hivatkozásként utalunk.

A következő példák a találmány bemutatására szolgálnak anélkül, hogy hatókörét korlátoznák.

1. példa

Humán protein C előállítása

Rekombináns humán protein C-t /rHPC/ állítottunk elő humán vesesejtekben /humán kidney 293 cells/ ismert eljárások segítségével /lásd például Yan, 4,981,952 számú Amerikai egyesült Államok-beli szabadalmi leírását/. A humán protein C-t kódoló gént Bang és munkatársai /4,775,624 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás/ ismertették. A humán protein C-nek a fent említett 293 sejtekben történő expressziójához plazmádként pLPC plazmidot használtunk, amelyet Bang és munkatársai Írtak le /4,992,373 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés/. A pLPC plazmid felépítését a 0 445 939 számú európai szabadalmi bejelentésben és Grinnell és munkatársai közleményében /Bio/Technology 2» 1189-1192 /1987/_7 is leírták. Röviden összefoglalva a plazmidot 293 • ·

- 10 transzfektáltuk, majd a stabil transzformált sejteket azonosítottuk, szubkultúrába vittük át és szérummentes táptalajban tovább tenyésztettük. Fermentáció után inikroszürés segítségével sejtmentes tápközeghez jutottunk.

A humán protein C-t elválasztottuk a tenyészlétől Yan technikájának alkalmazása utján /4,981,952 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés/. A szűrt médiumhoz 4 mM koncentrációig EDTA-t adtunk, majd anioncserélő gyantán /Fast-Flow Q, Pharmacia/ abszorbeáltattuk. A gyantát a következő pufferekkel mostuk: 4 oszloptérfogat 20 mM Tris, 200 mM NaCl /pH 7,4/ és 2 oszloptérfogat 20 mM Tris, 150 mM NaCl /pH 7,4/. Mosás után a megkötött rekombináns humán protein C zimogént 20 mM Tris-t, 150 mM NaCl-ot, 10 mM CaClg-ot /pH 7,4/ tartalmazó pufferrel eluáltuk. Az eluált fehérje tisztasága nagyobb volt 95%-nál, amint azt SDS-poliakrilamid gélelektroforézis utján kimutattuk.

A fehérje további tisztítása céljából 3 M koncentrációig NaCl-ot adtunk hozzá, majd 20 mii Tris-t, 3 M NaCl-ot, 10 mM CaClg-ot /pH 7,4/ tartalmazó pufferrel egyensúlyba hozott hidrofób gyantán /Poyopearl Phenyl 650 M, TosoHaas/ adszorbeáltattuk. CaC^-ot nem tartalmazó kiegyensúlyozó puffer 2 oszloptérfogatával mostuk, majd a rekombináns humán protein C-t 20 mM Tris-pufferrel /pH 7,4/ eluáltuk. Aktiváláshoz az eluált fehérjéből eltávolítottuk a maradék kalciumot. A rekombináns humán protein C-t fémkelát-affi♦ · • ι

nitás kromatografáló oszlopon /Chelex-100, Bio-Rad/ bocsátottuk át a kalcium megkötése céljából, majd ismét anioncserélőre vittük fel /Fást Flow Q, Pharmacia/. E két oszlopot sorbakötöttük és 20 mM Tris-t, 150 művi NaCl-ot, 5 mM EDTA-t tartalmazó pufferrel /pH 7,4/ hoztuk egyensúlyba. A fehérje felvitele után a Chelex-100 oszlopot a fenti pufferrel mostuk a két oszlop kapcsolatának megszüntetése előtt. Az anioncserélő oszlopot 3 oszloptérfogat kiegyensúlyozó pufferrel mostuk, majd a fehérjét 0,4 M NaCl-ból és 20 mM Tris-acetátból álló pufferrel /pH 6,5/ eluáltuk. A rekombináns humán protein C és a rekombináns aktivált protein C oldat fehérjekoncentrációját a maximális elnyelés hullámhosszán /280 nm/ mért extinkció alapján határoztuk meg: Εθ*^ = 1,85 illetve 1,95.

2. példa

Rekombináns humán protein C aktiválása Marha-trombint aktivált CH-Sepharose 4B-hez

I /Pharmacia/ kötöttünk 50 mM HEPES /pH 7,5/ jelenlétében, 4°C-on. A kapcsolási reakciót már az oszlopba betöltött gyantán hajtottuk végre, mintegy 5000 E trombin/ml gyanta alkalmazása utján. A trombinoldatot az oszlopon át mintegy 3 órán át cirkuláltattuk 0,6 ml MEA/liter keringő oldat hozzáadása előtt. A MEA-tartalmu oldatot további 10-12 órán

..ι :.. .

• · · · · • · ·

- 12 cirkuláltattuk, hogy biztosítsuk a nem reagált aminok teljes megkötődését az oszlopon. Megkötés után a trombinhoz kötött gyantát 10 oszloptérfogat 1 M NaCl-ot, 20 mM Tris-t /pH 6,5/ tartalmazó pufferrel mostuk az összes, nem specifikusan megkötött fehérje eltávolítása céljából, és aktiváló pufferrel egyensúlyba hozva az aktiválási reakcióban alkalmaztuk.

Tisztított rHPC-hez 5 mM koncentrációig EDTA-t adtunk /a maradék kalcium kelátképzéssel való megkötése céljából/ és 2 mg/ml koncentrációig 20 mM Tris-pufferrel /pH 7,4/ vagy 20 mM Tris-acetát pufferrel /pH 6,5/ hígítottuk. Az anyagot 37°C-on 50 mM NaCl-dal és 20 mM Tris-pufferrel /pH 7,4/ vagy 20 mM Tris-acetát pufferrel /pH 6,5/ egyensúlyba hozott trombin-oszlopon bocsátottuk át. Az átfolyási sebességet úgy szabályoztuk, hogy az rHPC és a trombin-gyanta érintkezési ideje körülbelül 20 perc legyen. Az oszlopról távozó folyadékot, az effluenst összegyűjtöttük és azonnal meghatároztuk amidolitikus aktivitását. Ha az anyag nem mutatott egy ismert aPC standarddal összehasonlítható specifikus /amidolitikus/ aktivitást, visszavezettük a trombin-oszlopra az ‘rHPC tökéletesebb aktiválása céljából. Ezután az anyagot 20 mM fenti pufferrel /pH 7,4 vagy 6,5/ 1:1 arányban hígítottuk annak érdekében, hogy az aPC koncentrációja alacsony maradjon a következő feldolgozó művelet idejéig.

A kioldódott trombint az aPC anyagtól úgy választottuk el, hogy az aPG-t anioncserélő gyantához /Pást Flow Q,

Pharmacia/ kötöttük, melyet előzőleg aktiváló pufferben /”20 mM Tris /pH 7,4/ vagy 20 mivl Tris-acetát /pH 6,5/_7 150 mM NaCl-dal hoztunk egyensúlyba. Ilyen körülmények között a trombin nem lép kölcsönhatásba az anioncserélő gyantával, hanem áthaladva az oszlopon a mintafelvitel effluensében jelenik meg. Ha már az aPC-t felvittük az oszlopra, 2-6 oszloptérfogat 20 mM kiegyensúlyozó pufferrel mossuk, mielőtt a megkötött aPC-t lépcsős elució utján 0,4 M NaCl-dal /5 mM Tris-acetátban /pH 6,5/ vagy 20 mM Tris-ben /pH 7,4/_7 eluálnánk. Az oszlop nagyobb térfogatú mosóoldatokkal való mosása megkönnyítette a dodekapeptid teljesebb eltávolítását. Az oszlopról eluált anyagot lefagyasztott oldatban /-20°C/ vagy liofilezett porként tároltuk.

Az aPC amidolitikus aktivitását p-nitro-anilinnak a H-D-Phe-Pip-Arg-p-nitro-anilid /S-2238/ szintetikus szubsztrátból /Kabi Vitrum/ való felszabadulása alapján határoztuk meg Beckman DU-7400 tipusu két fényutas spektrofotométer segítségével. Az aktivált protein C egy egységét az az enzimmennyiség jelenti, amely 1 umol p-nitro-anilint szabadit fel 1 perc alatt 25°C-on, pH 7,4-nél. A p-nitro-anilin extinkciós koefficiense 405 nm-en 9620 M”^cm”^.

Az aktivált protein C alvadásgátló aktivitását az alvadási idő megnyúlásának mérése utján határoztuk meg az aktivált parciális tromboplasztin idő /ΑΡΤΙ/ alvadási próbájában. Hitelesítő görbét higitó pufferben készítettünk *1. :

• · · · t

- 14 /1 mg/ml rádióimmunassay minőségű marhaszérum-albumin, 20 mM Tris /pH 7,4/, 150 mii NaCl, 0,02% NaN^_7, melynek protein C koncentrációja 125 - 1000 ng/ml, A mintákból e koncentrációtartományban különböző hígításokat készítettünk. Minden mintaküvettához 50 ul hideg lószérumot és 50 ul rekonstituált aktivált parciális tromboplasztin idő reagenst /ΑΡΤΙ reagens, Sigma/ adtunk és 37°C-on 5 percen át inkubáltuk. Inkubálás után 50 ul megfelelő mintát vagy standardot adtunk a küvettákhoz. A minta vagy a standard helyett higitó puffért alkalmaztunk az alap alvadási idő meghatározásához. A fibrométer /CoA Screener Hemostasis Analyzer, American Labor/ időmérőjét azonnal elindítottuk, amikor a mintákhoz vagy standardokhoz 37°C-on hozzáadtunk 30 mM CaClg-ot. A minták aktivált protein C koncentrációját ;a standard görbe lineáris regresszió egyenletéből számítottuk ki. A megadott alvadási idők legalább három párhuzamos mérés átlagai, beleértve a standard görbéhez használt mintákat.

Összehasonlító vizsgálatokhoz úgy készítettünk mintákat, hogy az aPC teljes autodegradációja következzék be /”7,3 mg/ml 20 mM Tris és 150 mM NaCl elegyben7 44 órai inkubálás után 25°C-on, vagy anioncserélő gyantán /FFQ, Pharmacia/ koncentrálva pH 7,4-nél, 4°C-on. Az autodegradáció és az aminosavszakasz hasítási helyeinek megállapítása és menynyiségi értékelése céljából amidolitikus aktivitás próbákat, HPLC-t, N-terminális szdvenálást és SDS-PAGE-t végeztünk a mintákon.

3. példa

Aktivált protein G stabilizálási próbák

A pH-nak az aPC aktivitására gyakorolt hatását az AU /amidolitikus egység/ ellenőrzése utján vizsgáltuk. Három pufferből álló rendszert alkalmaztunk a pH-köriilmények megállapítása céljából a 6 - 9,3 tartományban /0,3 pH-egység növekményekben/, 50 - 50 mM MES /pH 5,5-7/, HEPES /pH 6,8 8,2/ és GHES /pH 8,6 - 10/ puffért használva. Az aPC-t alkalmas pH pufferrel 0,4 mg/ml végkoncentrációig hígítottuk és ennél a koncentrációnál inkubáltuk az aktivitás mérése előtt. A mintákat a kezdeti /nulla/ időpontban és 30 óra múlva vizsgáltuk amidolitikus próbák segítségével, az inkubáláshoz használt pH-η. B mérések alapján az amidolitikus aktivitás pHfüggése haranggörbével adható meg. E próbák eredményeit az

I. táblázat tartalmazza.

I. táblázat

	Amidolizis mértéke	/“NE/mg aPC 7
pH	0 óra	30 óra
6,0	1,63	1,58
6,6	4,00	4,63
7,2	9,16	6,68
7,8	11,26	9,26
8,4	7,05	5,16
9,0	3,53	3,53

Az aPC aktivitás maximuma pH 7,4-nél jelentkezett, mig a szélsőséges 6 és 9,3 pH-értékeknél az aktivitás jelentősen csökkent. Bár úgy tűnik, hogy a szélsőséges pH-értékeknél is visszamarad némi amidolitikus aktivitás, adataink arra utalnak, hogy az autodegradáció csökken, ha elkerüljük azokat a pH-körülményékét, amelyeknél az aPC aktivitása maximális.

Annak megállapítása céljából, hogy az amidolitikus aktivitás pH-függése Összefügg-e az EAK-fragmentum képződésével az aPC mintákat 1,5 mg/ml koncentrációban pH 6,0, 7,5 és 9,0 értéknél 4°C-on 18 órán át inkubáltuk. A képződött EAK mennyiségét az EAK HPLC-csucsa alatti terület integrálása, valamint az SDS-poliakrilamid gél elektroforézissel kapott EAK sáv kvalitatív megfigyelése utján értékeltük. A kapott eredmények szerint pH 6,o-nál történő inkubálás folyamán nem fokozódott az EAK képződés, míg pH 7,5-nél mintegy 30%-os és pH 9,0-nél 50%-os emelkedés következett be. A pH 7,5 és 9,0 értékű minták magasabb EAK-tÖredék szintje ellenére a preparátum pH 7,4-nél vizsgálva még magas AU aktivitást mutatott. így az EAK-fragmentum képződése nem jár szükségszerűen együtt az amidolitikus aktivitás veszteségével. Inkább úgy látszik, hogy az EAK-fragmentumnak megfelelő asszociációban kell maradnia az aPC nehéz láncának maradékával a szerin proteináz funkcionalitás fenntartásához. Lehetséges, hogy a nagyobb EAK-fragmentum tartalom fokozott amidolitikus aktivitással társul.

Az EAK-fragmentum a katalitikus triád /beleértve a nehéz lánc N-terminális részében talált His-211-et és Asp-257-et/ aktiv helyű szerinjét /Ser-360/ tartalmazza.

Ezért ha az EAK-fragmentum nem kötődik kovalensen a nehéz lánc maradékához, e proteolitikus clip az enzimaktivitás csökkenéséhez vezethet. A különböző ΞΑΚ mennyiségek antikoaguláns aktivitásra gyakorolt hatásának meghatározása céljából különböző aPC sarzsokat állítottunk elő a fenti 1. és 2. példában

I leírtak szerint. Az amidolitikus próbákhoz 22 - 198 uM koncentrációjú S-2238 szubsztrátumot, 1,6 - 3,3 nM /75 - 15 ng/ml7 aPC koncentrációt, 20 mM Tris-t /pH 7,4/, 150 mM NaClot alkalmaztunk. E próba eredményeit a II. táblázat tartalmazza

II. táblázat

Százalékos ΞΑΚ-tartalom a specifikus aktivitás függvényében, amidolitikus és antikoaguláns aktivitások mérése alapján

	Specifikus	aktivitás
Minta száma	% EAK	AU/mg	APTI/m,
1	3	1,13	2,11
2	19	1,35	1,7
3	35	1,52	1,37
4	51	1,64	1,00
5	67	1,68	0,78

A bomlás pH-függését különböző mennyiségű EAK-ot tartalmazó aPC minták előállítására használtuk fel. E mintákat a fenti 1. és 2. példa szerint állítottuk elő. .A különböző mennyiségű EAK-töredéket tartalmazó mintákat összehasonlítottuk az intakt aPC-vel / <3% EAK-fragmentum/. Az amidolizis kinetikai paramétereit, beleértve a K^., K_ca^ θθ ^max értékeket, minden sarzsnál három különböző enzimkoncentrációnál határoztuk meg és az eredményeket a III. táblázatban foglaltuk össze.

« «

III. táblázat

Kinetikai adatok

Minta sz. /% EAK/	/áPC7 ng/ml	/mM/	V max /umol/ml/min/	^Kcat /1 per sec/
1 /20%/	150	0,12	9102	7
1	113	0,12	8634	6,6
1	75	0,19	8713	6,7
2 /67%/	150	0,18	10672	8,2
2	113	0,18	9729	7,5
2	75	0,18	9930	7,6
3 /100%/	150	0,16	13142.	10,1
3	113	0,14	2337	1,8
3	75	0,18	316	0,2

' A három aPC mintánál a értékek a kísérleti ingadozáson belül azonosak és átlagosan 0,16 mM szubsztrátkoncentrációnak felelnek meg. Ez arra utalhat, hogy az S-2238

I szubsztrátum iránti affinitás a degradált aPC-ben nem szűnik meg. Meglepő módon a lebomlott anyag AU-aktivitása lényegében azonos volt az intakt aPC aktivitásával.

Az aktivált protein C-nek ép amidolitikus funkcionalitása lehet a tripeptid szubsztrátummal /S-2238/ szemben még magas EAK-töredék tartalom esetén is. Az in vitro alvadásgátló aktivitás az ΑΡΤΙ próbában határozható meg. Váratlanul

azt találtuk, hogy a magas AU-aktivitás nem mutatott korrelációt az antikoaguláns aktivitással. Mig az AU-aktivitás növekvő EAK-tartalom esetében fokozódott, az ΑΡΤΙ aktivitás növekvő EAK-tartalomnál csökkent.

A sókoncentrációnak az EAK-töredék képződésére és az aktivált protein C stabilitására gyakorolt hatását úgy vizsgáltuk, hogy az aktivált protein C mintákat különböző pH-szinteken és sókoncentrációknál inkubáltuk, majd megmértük az óránkénti EAK-töredék képződés százalékát. A próbában a protein C koncentráció 4-5 mg/ml volt. Minden próbát 5 - 20 mM foszfát-pufferben hajtottunk végre. Sóként NaCl-ot használtunk /ha só jelenlétében végeztük a próbát/ és a hőmérséklet minden esetben 25°C volt. Az 1 órára eső EAKfragmentum képződés %-át a HPLC-csucs integrálása utján határoztuk meg. Az eredményeket a IV. táblázat tartalmazza.

* »♦· • ·

IV. táblázat

Sókoncentráció hatása az EAK-fragmentum képződésére

pH	Sókoncentráció	Képződött EAK % per óra
6,4	400 mM	0,094
7,0	400 mM	0,145
6,4	50 mM	0,292
7,0	50 mM	0,365
6,4	0	0,038
7,0	0	0,092

V

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás aktivált protein C bomlásának csökkentésére, azzal j ellemezve , hogy az aktivált protein C-t mintegy 6,3 - 7,0 pH-ju oldatban tartjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve, hogy az oldat sókoncentrációját mintegy 0,050 M alatt vagy mintegy 0,40 M felett tartjuk.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve, hogy az oldat sókoncentrációját mintegy 0,050 M alatt tartjuk.
4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve, hogy az oldat sókoncentrációját mintegy 0,010 M alatt tartjuk.
5. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oldatban sóként nátrium-kloridot alkalmazunk.
6. Eljárás aktivált protein C bomlásának csökkentésére, azzal jellemezve, hogy az aktivált protein C-t denaturáló reagenst tartalmazó oldatban tartjuk.
7. Stabil gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy aktivált protein C-t tartalmaz mintegy 6,3 - 7,0 pH-ju oldatban.
8. A 1. igénypont szerinti gyógyászati készít- mény, azzal j ellemezve, hogy mintegy 0,050 M alatti vagy mintegy 0,4 M feletti koncentrációban sót is tartalmaz.
9. A 8. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a sókoncentráció mintegy 0,05 M alatt van.
10. A 7. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy pufférként Tris-acetátot, nátrium-citrátot, citrát-glicint vagy nátrium-foszfátot tartalmaz.