NO320157B1

NO320157B1 - Fremgangsmate for a minimalisere nedbrytning av aktivert protein C, samt stabilt farmasoytisk preparat omfattende aktivert protein C og vandig opplosning av dette.

Info

Publication number: NO320157B1
Application number: NO19950018A
Authority: NO
Inventors: Jr Walter Francis Prouty; Josephine Secnik
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1994-01-05
Filing date: 1995-01-03
Publication date: 2005-11-07
Also published as: KR950032287A; NZ270271A; NO2006006I1; RU2167936C2; EP1087011A3; ES2156190T3; YU295A; ZA9514B; HU9500021D0; LU90992I2; LU90993I2; CN1109891A; FI950044A0; IL112236A; SI0662513T1; GR3036277T3; AU1003195A; CA2139468C; CZ1395A3; EP0662513A1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører enzymologi, nærmere bestemt fremgangsmåter for å minimalisere nedbrytning av aktivert protein C, stabilt farmasøytisk preparat inne-holdende dette og vandig oppløsning av dette.

Protein C er en serinprotease og et naturlig forekommende antikoaguleringsmiddel som spiller en rolle ved reguleringen av hemostase ved å aktivere faktorene Va og VIIIa i koaguleringskaskaden. Humant protein C dannes in vivo hovedsakelig i leveren som et enkelt polypeptid på 461 aminosyrer. Dette forløpermolekylet undergår flere post-translasjonelle modifikasjoner innbefattende 1) spaltning av en signalsekvens på 42 aminosyrer; 2) proteolytisk fjernelse fra enkjede-zymogenet av lysinresten ved posisjon 155 og argininresten ved posisjon 156 for å danne 2-kjedeformen av molekylet (dvs. en lett kjede på 155 aminosyrerester knyttet via en disulfidbro til den serinproteaseholdige tunge kjeden på 262 aminosyrerester); 3) vitamin K-avhengig karboksylering av ni glutaminsyrerester samlet i de første 42 aminosyrene av den lette kjeden, som resulterer i 9 gamma-karboksyglutaminsyrerester; og 4) karbohydrattilknytning ved fire seter (ett i den lette kjeden og tre i den tunge kjeden). Den tunge kjeden inneholder den vel-etablerte serinproteasetriaden av Asp 357, His 211 og Ser 360. Emdelig aktiveres det sirkulerende 2-kjedezymogenet in vivo ved trombin ved en fosfolipidoverflate i nærvær av kalsiumion. Aktivering resulterer ved fjernelse av et dodekapeptid ved N-terminalen av den tunge kjeden, hvilket produserer aktivert protein C (aPC) som har enzymatisk aktivitet.

Ved arbeide med store mengder og høye konsentrasjoner av aPC blir det observert en proteolytisk avklipning ved lysinresten ved posisjon 308 av den tunge kjeden. Sekvensen av den nye N-terminalen generert ved denne avklipningen begynner med Glu-Ala-Lys og gir et fragment på 111 aminosyrer, betegnet "EAK-fragment", fra den C-terminale enden av den tunge kjeden. EAK-fragmentet er ikke knyttet kovalent til den lette kjeden eller den N-terminale delen av den tunge kjeden ved disulfidbindinger. EAK-fragmentet inneholder også det aktive setet serin av serinprotease, men ikke Asp-elier His-restene. Det er følgelig oppdaget at protein C-preparater med EAK-fragmentet har endret antikoaguleringsmiddelaktivitet. Foreliggende oppfinnelse innbefatter fremgangsmåter for å forhindre eller minimalisere nedbrytningen av protein C-molekylet ved å holde molekylet ved en redusert pH, eller i ekstremer av saltkonsentrasjon.

For formålene med foreliggende oppfinnelse er følgende betegnelser som definert nedenfor.

aPC - aktivert humant protein C

APTT - aktivert partiell tromboplastintid

AU - amidolytiske enheter

BME - beta-merkaptoetanol

CHES - 2[N-cykloheksylamino] etansulfonsyre

EAK-fragment - 111 aminosyrefragmentet som dannes ved en avklipning ved

posisjon 308 av den tunge kjeden av protein C

EDTA - etylendiamintetraeddiksyre

HEPES - N-2-hydroksyetylpiperazin-N'-2-etansulfonsyre

HPC - humant protein C-zymogen

MEA - 2-aminoetanol

MES - 2-(N-morfolino)-etansulfonsyre

Naskerende protein - polypeptidet som dannes ved translasjon av et mRNA-transkript, før noen post-translasjonelle modifikasjoner. Imidlertid kan post-translasjonelle modifikasjoner, så som gamma-karboksylering av glutaminsyrerester og hydroksylering av aspartinsyrerester begynne å finne sted før et protein er fullstendig translatert fra et mRNA-transkript.

Protein C-aktivitet - enhver egenskap av humant protein C som er ansvarlig for proteolytiske, amidolytiske, esterolytiske og biologiske (antikoaguleringsmiddel eller profibrinolytiske) aktiviteter. Fremgangsmåter for å teste for protein C antikoaguleringsmiddel og amidolytisk aktivitet er velkjente innen teknikken, dvs. se Grinnell et al., 1987, Bio/Technology 5:1189:1192.

rPHPC - rekombinant produsert humant protein C-zymogen.

Zymogen - et enzymatisk inaktivt forstadium av et proteolytisk enzym. Protein C-zymogen, slik betegnelsen her benyttes, refererer til utskilte, inaktive former, enten med en kjede eller to kjeder av protein C.

Alle aminosyreforkortelser som benyttes i foreliggende beskrivelse er de som er akseptert av United States Patent and Trademark Office som angitt i 37 C.F.R. §1.822(b)(2)(1990).

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter for å forhindre eller minimalisere autonedbrytning av aktivert protein C. Oppfinnelsen kan best eksemplifiseres ved å utføre bearbeidelsen, rensingen og/eller lagringen av det aktiverte protein C ved lav pH, for eksempel ved ca. pH 6,3 til ca. pH 7,0. Autonedbrytning av aPC kan også minimaliseres ved inkubering av aPC i 3 M urea (fullstendig gjenopprettelse av aPC-aktivitet oppnås etter fjernelsen av denatureringsmidlet) eller ved inkubering av aPC i nærvær av ekstreme konsentrasjoner av salt. For formålene med foreliggende beskrivelse betyr ekstreme saltkonsentrasjoner konsentrasjoner over ca. 0,4 molar eller under ca. 0,05 molar. Foreliggende oppfinnelse innbefatter videre aPC-preparater som opprettholder aPC ved lav pH, eller ved ekstreme saltkonsentrasjoner.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig en fremgangsmåte for å minimalisere nedbrytningen av aktivert protein C, kjennetegnet ved at den innbefatter opprettholdelse av nevnte aktiverte protein C i en oppløsning ved en pH mellom 6,3 og 7,0.

Rollen av protein C ved opprettholdelse av hemostase har utløst en stor interesse i denne forbindelsen som et terapeutisk middel for en lang rekke vaskulære sykdomstilstander. Fremstillingen av høye nivåer og høye konsentrasjoner av humant protein C på indu-striell skala har avdekket det faktum at molekylet kan undergå autonedbrytning som fører til redusert antikoaguleringsmiddelaktivitet. Autonedbrytning av aPC resulterer i dannelsen av et 111 aminosyrefragment, betegnet "EAK-fragment", fra den C-terminale enden av den tunge kjeden. EAK-fragmentet er ikke knyttet kovalent til den lette kjeden eller den N-terminale delen av den tunge kjeden ved disulfidbindinger. EAK-fragmentet inneholder også det aktive setet serinrest av serinproteasen, men ikke Asp- eller His-restene. Følgelig har protein C-preparater med EAK-fragmentet endret antikoaguleringsmiddelaktivitet på grunn av nærværet av den proteolytiske avklipningen.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig videre et stabilt farmasøytisk preparat, kjennetegnet ved at det innbefatter aktivert protein C i en oppløsning med en pH mellom 6,3 og 7,0.

Oppfinnelsen omfatter videre en vandig oppløsning av aktivert protein C, kjennetegnet ved at den innbefatter aktivert protein C ved en pH mellom 6,3 og 6,5.

For å redusere eller forebygge autonedbrytningen som fører til dannelsen av EAK-fragmentet kan det intakte, aktiverte protein C-molekylet holdes ved en pH mellom ca. 6,3 og ca. 7,0. Molekylet kan holdes ved en pH i dette området gjennom alle rense- og aktiveringsprosessene, så vel som i den endelige formuleringsoppløsningen. Mange forskjellige buffersystemer kan anvendes for å opprettholde pH av oppløsningen. Representative buffersystemer innbefatter Tris-acetat, natriumcitrat, citratglycin og natriumfosfat. Fagmannen vil erkjenne at mange andre buffersystemer er tilgjengelige som også kan anvendes i fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Et annet trekk ved foreliggende oppfinnelse vedrører forebyggelsen eller reduksjonen av dannelsen av EAK-fragmentet ved å opprettholde det aktiverte protein C-molekylet i en oppløsning med en ekstrem saltkonsentrasjon. For eksempel, ved pH 7,0 i en natriumfosfatbuffer, er EAK-fragmentdannelsen minimal når det ikke er noe salt til stede i bufferen. Ved pH 7,0 i en natriumfosfatbuffer er imidlertid EAK-fragmentdannelsen også minimal når det er en konsentrasjon på ca. 0,4 M natriumklorid til stede i bufferen. Mellom disse to saltkonsentrasjonene finner EAK-fragmentdannelse sted ved forskjellige hastigheter; men fagmannen vil erkjenne at opprettholdelse av saltkonsentrasjoner under 0,05 M eller saltkonsentrasjoner over 0,4 M lettest vil forhindre eller minimalisere EAK-fragmentdannelse. Andre saltkonsentrasjoner under 0,05 M (for eksempel 0,01 M eller 0,005 M) er foretrukne, selv om det beste farmasøytiske preparatet opptrer når pH av oppløsningen holdes ved ca. pH 7,0 uten salt tilsatt til oppløsningen. Fagmannen vil erkjenne at mange forskjellige salter kan anvendes ved farmasøytisk bearbeidelse og formulering. Representative salter som kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse innbefatter kaliumklorid, kalsiumklorid og, mest foretrukket, natriumklorid.

Foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset av fremgangsmåtene hvorved det aktiverte protein C kan fremstilles. Selv om det er mest effektivt å fremstille aktiverte protein C molekyler ved anvendelse av rekombinant DNA-teknologi, har senere fremskritt innenfor storskala proteinrensing tillatt isolering av betydelige mengder av aktivert protein C fra humant serum. Oppnåelse av stike store mengder av protein C har gjort det mulig å bearbeide høye konsentrasjoner av aktivert protein C samtidig. Som angitt ovenfor, har oppfinnerne oppdaget at konsentrasjoner av aktivert protein C over nivået av ca. 50 mikrogram pr. milliliter demonstrerte autonedbrytning av det aktiverte protein C-molekylet med samtidig fall i antikoaguleringsmiddelaktivitet. Viktigst er det at hastigheten for autnedbrytning øker ettersom konsentrasjonen av aktivert protein C økes i en oppløsning. På et industrielt nivå er det ikke effektivt å gjennomføre storskala-renseprosesser ved meget lave konsentrasjoner av protein.

Idet den industrielle og farmasøytiske anvendeligheten av aktivert protein C-produksjon nødvendiggjør bearbeidelse av molekylet ved konsentrasjoner som langt overskrider 50 mikrogram, gjør foreliggende oppfinnelse det mulig for fagmannen å fremstille store mengder av produktet uten betydelig tap i produktaktivitet. Formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse tillater videre lagring av de stabile aktiverte protein C-opp-løsningene i et lengre tidsrom enn det som er kjent innenfor teknikkens stand.

Fagmannen vil erkjenne at fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse gjør det mulig for de personene som utfører oppfinnelsen å danne større volumer av aktivert protein C i høyere konsentrasjoner enn tidligere tilgjengelig uten fare for å utsettes for produkttap på grunn av autonedbrytning. I tillegg kan de stabile farmasøytiske prepar-atene ifølge foreliggende oppfinnelse lett anvendes for å behandle pasienter som lider fra fysiske sykdomstilstander som beskrevet av Taylor, Jr. et al., US-patent nr. 5009889.

De følgende eksemplene er tilveiebrakt som en illustrasjon av foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1

Fremstilling av human protein C

Rekombinant humant protein C (rHPC) ble fremstilt i humane nyre-293-celler ved teknikker som er velkjente for fagmannen, slik som de som er beskrevet i Yan, US-patent nr. 4981952. Genet som koder humant protein C er beskrevet og krevet i Bang et al., US-patent nr. 4775624. Plasmidet anvendt for å uttrykke humant protein C i 293-celler var plasmid pLPC som er beskrevet i Bang et al., US-patent nr. 4992373. Konstruksjonen av plasmid pLPC er også beskrevet i europeisk patentpublikasjon nr. 445939, og i Grinnell et al., 1987, Bio/Technology 5:1189-1192. Kort uttrykt ble plasmidet transfisert i 293-celler, de stabile transformantene ble identifisert, underdyrket og grodd i serumfritt medium. Etter fermentering ble cellefritt medium oppnådd ved mikrofiltrering.

Det humane protein C ble separert fra kulturfluidet ved en tilpasning av teknikken til Yan, US-patent nr. 4981952. Det klargjorte mediet ble ført til 4 mM i EDTA før det ble absorbert på en anionbytteharpiks ("Fast-Flow Q", Pharmacia). Etter vasking med 4 kolonnevolumer av 20 mN Tris, 200 nM NaCl, pH 7,4 og 2 kolonnevolumer av 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4, ble det bundede rekombinante humane protein C-zymogenet eluert med 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4. Det eluerte proteinet var mer enn 95% rent etter eluering, bedømt ved hjelp av SDS-polyakrylamid-gelelektroforese.

Ytterligere rensing av proteinet ble utført ved å gjøre proteinet 3 M i NaCl etterfulgt av absorpsjon til en hydrofob interaksjonharpiks (Toyopearl Phenyl 650M", TosoHaas) ekvilibrert i 20 mM Tris, 3 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4. Etter vasking med 2 kolonnevolumer av ekvilibrert buffer uten CaCl2 ble det rekombinante humane protein C eluert med 20 mM Tris, pH 7,4. Det eluerte proteinet ble preparert for aktivering ved fjernelse av gjenværende kalsium. Det rekombinante humane protein C ble ført over en metallaffinitetskolonne (Chelex-100", Bio-Rad) for å fjerne kalsium og igjen bundet til en anionbytter ("Fast Flow Q", Pharmacia). Begge disse kolonnene ble arrangert i serier og ekvilibrert i 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7,4. Etter innføring av proteinet ble "Chelex-100"-kotonnen vasket med et kolonnevolum av den samme bufferen før det ble fjernet fra seriene. Anionbyttekolonnen ble vasket med tre kolonnevolumer av ekvilibrert buffer før eluering av proteinet med 0,4 M NaCl, 20 mM Tris-acetat, pH 6,5. Proteinkonsentrasjoner av rekombinant humant protein C og rekombinante aktiverte protein C-oppløsninger ble målt ved UV 280 nm ekstinksjon E^>^ = 1,85 eller henholdsvis 1,95.

Eksempel 2

Aktivering av rekombinant humant protein C

Bovint trombin ble koblet til aktivert "CH-Sepharose 4B" (Pharmacia) i nærvær av 50 mM HEPES, pH 7,5 ved 4°C. Koblingsreaksjonen ble utført på harpiks allerede pakket i en kolonne ved anvendelse av ca. 5000 enheter tromin/ml harpiks. Trombinopp-løsningen ble sirkulert gjennom kolonnen i ca. 3 timer før tilsetning av MEA til en konsentrasjon på 0,6 ml/l sirkulerende oppløsning. Den MEA-holdige oppløsningen ble sirkulert i ytterligere 10-12 timer for å sikre fullstendig blokkering av de uomsatte aminene på harpiksen. Etter blokkering ble den trombinkoblede harpiksen vasket med 10 kolonnevolumer av 1 M NaCl, 20 mM Tris, pH 6,5 for å fjerne alt ikke-spesifikt bundet protein, og ble benyttet i aktiveringsreaksjoner etter ekvilibrering i aktiveringsbuffer.

Renset rHPC ble gjort 5 mM i EDTA (for å chelatere eventuelt gjenværende kalsium) og fortynnet til en konsentrasjon på 2 mg/ml med 20 mM Tris, pH 7,4 eller 20 mM Tris-acetat, pH 6,5. Dette materialet ble ført gjennom en trombinkolonne ekvilibrert ved 37°C med 50 mM NaCl og enten 20 mM Tris pH 7,4 eller 20 mM Tris-acetat pH 6,5. Strømningshastigheten ble regulert for å tillate ca. 20 minutters kontakttid mellom rHPC og trombinharpiksen. Effluenten ble samlet og straks analysert med henblikk på amidolytisk aktivitet. Dersom materialet ikke hadde en spesifikk aktivitet (amidolytisk) sammenlignbart med en etablert standard av aPC, ble det resirkulert over trombin-kolonnen for å aktivere rHPC fullstendig. Dette ble fulgt av 1:1 fortynning av materialet med 20 mM buffer som ovenfor, med en pH på enten 7,4 eller 6,5 for å holde aPC ved lavere konsentrasjoner under venting på det neste bearbeidelsestrinnet.

Fjernelse av utvasket trombin fra aPC-materialet ble oppnådd ved å binde aPC til en anionbytteharpiks ("FastFlow W", Pharmacia) ekvilibrert i aktiveringsbuffer (enten 20 mM Tris, pH 7,4 eller 20 mM Tris-acetat, pH 6,5) med 150 mM NaCl. Trombin vekselvirker ikke med anionbytteharpiksen under disse betingelsene, men passerer gjennom kolonnen inn i prøveeffluenten. Når aPC er belagt på kolonnen, utføres en 2-6 kolonnevolumvasking med 20 mM ekvilibreringsbuffer før eluering av det bundede aPC med en trinneluering ved anvendelse av 0,4 M NaCl i enten 5 mM Tris-acetat, pH 6,5 eller 20 mM Tris, pH 7,4. Høyere volumvaskinger av kolonnen lettet mer fullstendig fjernelse av dodekapeptidet. Materialet eluert fra denne kolonnen ble lagret enten i en frossen oppløsning (-20°C) eller som et lyofilisert pulver.

Den amidolytiske aktiviteten (AU) av aPC ble bestemt ved frigivelse av p-nitroanilin fra det syntetiske substratet H-D-Phe-Pip-Arg-p-nitroanilid (S-2238) innkjøpt fra Kabi Vitrum, ved anvendelse av et "Beckman DU-7400" dioderekkespektrofotometer. En enhet av aktivert protein C ble definert som mengden av enzym påkrevd for frigjørelse av 1 umol p-nitroanilin i 1 minutt ved 25°C, pH 7,4, ved anvendelse av en ekstinksjons-koeffisient for p-nitroanillin ved 405 nm på 9620 M"<l>cm"<l>.

Antikoaguleringsmiddelaktiviteten av aktivert protein C ble bestemt ved å måle for-lengelsen av koaguleirngstiden i koaguleringsanalysen med aktivert partiell tromboplastintid (APTT), En standard kurve ble preparert i fortynningsbuffer (1 mg/ml radioimmunoanalyse kvalitet BSA, 20 mM Tris, pH 7,4,150 mM NaCl, 0,02% NaH3) varierende i protein C-konsentrasjon fra 125-1000 ng/ml, mens prøver ble preparert ved flere fortynninger i dette konsentrasjonsområdet. Til hver prøvekuvette ble det tilsatt 50 ul av kaldt hesteplasma og 50 ul av rekonstituert aktivert partielt tromboplastin-tidreagens (APTT reagens, Sigma) og inkubert ved 37°C i 5 minutter. Etter inkubering ble 50 (il av de egnede prøvene eller standardene tilsatt til hver kuvette. Fortynningsbuffer ble anvendt i stedet for prøve eller standard for å bestemme basal koagulerings-tid. Tidsmåleren av fibrometeret ("CoA Screener Hemostasis Analyzer", American Labor) ble startet øyeblikkelig etter tilsetningen av 50 ul 37°C 30 mM CaCl2 til hver prøve eller standard. Aktivert protein C-konsentrasjon i prøver beregnes fra den lineære regresjonsligningen av standardkurven. Koaguleringstider som her er rapportert er gjennomsnittet eller et minimum av disse replikatene, innbefattende standard kurve-prøver.

For å fremstille prøver for komparative undersøkelser ble fullstendig autonedbrytning av aPC (7,3 mg/ml i 20 mM Tris, 150 mM NaCl) oppnådd etter 44 timers inkubering ved 25°C eller etter konsentrasjon på anionbytteharpiks (FFQ, Pharmacia), pH 7,4 ved 4°C. Amidolytiske aktivitetsanalyser, HPLC, N-terminal sekvensering og SDS-PAGE ble utført på prøver for å bekrefte og kvantifisere omfanget av autonedbrytning og spaltningssetene på aminosyresekvensen.

Eksempel 3

Aktivert protein C stabiliseringsanalyser

Effekten av pH på aktiviteten av aPC ble undersøkt ved åovervåke AU. Et trebuffer-system ble anvendt for å etablere pH-betingelser i området 6-9,3 (i 0,3 pH enhets-inkrementer) ved å anvende 50 nM hver av MES (pH 5,5-7), HEPES (pH 6,8-8,2) og CHES (pH 8,6-10). aPC ble fortynnet til en endelig konsentrasjon på 0,4 mg/ml med den egnede pH-bufferen og inkubert ved denne konsentrasjonen før måling av aktivitet. Prøver ble analysert ved både den innledende tiden og etter 30 timer ved 4°C ved anvendelse av amidolytiske analyser utført ved inkuberings pH. Disse målingene viste en klokkeformet pH-avhengighet for amidolytisk aktivitet. Resultatene av disse analysene er angitt nedenfor i tabell I.

Aktivitetsmaksimum for aPC var pH 7,4, mens de ekstreme pH-verdiene på 6 og 9,3 viste sterkt redusert aktivitet. Selv om aPC synes å bevare en viss amidolytisk aktivitet ved pH-ekstremer, antyder disse data at autonedbrytning reduseres ved å unngå pH-betingelser hvori aPC hadde maksimal aktivitet.

For å bestemme om den amidolytiske aktivitets pH-avhengigheten av aPC var en funksjon av EAK-fragmentdannelse, ble aPC-prøver inkubert ved pH 6,0, 7,5 og 9,0, 1,5 mg/ml ved 4°C i 18 timer. Mengden av EAK dannet ble målt ved integrering av arealet under EAK HPLC-toppen, så vel som kvalitativ observasjon av EAK-båndet på SDS-PAGE. Disse dataene viste ingen økning i EAK-dannelse under forløpet av inkuberingen ved pH 6,0, mens det var en økning på ca. 30% ved pH 7,5 og en 50% økning ved pH 9,0. På tross av forhøyede nivåer av EAK-fragment i prøvene ved pH 7,5 og 9,0, hadde preparatet fremdeles høy AU-aktivitet når det ble analysert ved pH 7,4. Følgelig er generering av EAK-fragmentet ikke nødvendigvis forbundet med et tap av amidolytisk aktivitet. Derimot må EAK-fragmentet forbli assosiert nok med resten av den tunge aPC-kjeden til å opprettholde serinproteasefunksjonalitet. Dersom det finnes noen forbindelse, er høyere innhold av EAK-fragment assosiert med høyere amidolytisk aktivitet.

EAK-fragmentet inneholder serinet med aktivt sete (rest 360) av den katalytiske triaden (innbefattende His 211 og Asp 257 funnet i den N-terminale delen av den tunge kjeden). Derfor, dersom EAK-fragmentet ikke er kovalent knyttet til resten av den tunge kjeden, kan den proteolytiske avklipningen resultere i redusert enzymatisk aktivitet. For å fastslå virkningen av forskjellige mengder av EAK på antikoaguleringsmiddelaktivitet ble flere forskjellige porsjoner av aPC fremstilt som beskrevet i eksempler 1 og 2, supra. Amidolytiske analyser ble utført med substratkonsentrasjoner varierende fra 22-198 uM #S-2238, aPC-konsentrasjoner varierende fra 1,6-3,3 nM (75-150 ng/ml) 20 mM Tris, pH 7,4,150 mM NaCl. Resultater av denne analysen er angitt nedenfor i tabell II.

pH-avhengigheten av nedbrytning ble utnyttet for å generere aPC-prøver som inneholdt forskjellige mengder av EAK. Disse prøvene ble fremstilt som beskrevet i eksemplene 1 og 2, supra. Prøver med varierende innhold av EAK-fragment ble sammenlignet med intakt aPC (<3% EAK-fragment). Amidolytiske kinetiske parametre, innbefattende Km, Kcat og Vmax-verdier, ble målt for hver av disse porsjonene ved tre forskjellige enzym-konsentrasjoner, og er sammenfattet i tabell in.

Km-verdier for de tre aPC-prøvene synes å være de samme innenfor eksperimentelle variasjoner og viste en gjennomsnittlig verdi på 0,16 mM substrat. Dette antyder at affinitet for S-2238 substratet ikke er avbrutt i nedbrutt aPC. Overraskende hadde nedbrutt materiale fremdeles AU-aktivitet i det vesentlige lik den for intakt aPC.

Aktivert protein C kan ha intakt amidolytisk funksjonalitet mot et tripeptidsubstrat (#S-2238) selv med et høyt EAK-fragmentinnhold. In vitro antikoaguleringsmiddelaktivitet kan måles i APTT-analysen. Uventet korrelerte høy AU-aktivitet ikke med antikoaguleringsmiddelaktivitet. Mens AU-aktivitet øket med økende EAK-innhold, avtok APTT-aktivitet med økende EAK-innhold.

Virkningen av saltkonsentrasjon på EAK-fragmentdannelse og aktivert protein C-stabilitet ble undersøkt ved å inkubere prøver av aktivert protein C ved forskjellige pH-nivåer og saltkonsentrasjoner, og deretter måling av den prosentvise EAK-fragmentdannelsen pr. time. Protein C-konsentrasjoner i analysen var mellom 4-5 milligram pr. milliliter. Alle analyser ble utført i 5 til 20 mM fosfatbuffer. Natriumklorid ble anvendt som et salt (når salt var til stede) og alle anlyser ble utført ved 25°C. Prosentdelen EAK-fragmentdannelse pr. time ble målt ved HPLC-integrering. Resultater av disse analysene er angitt nedenfor i tabell IV.

Claims

1. Fremgangsmåte for å minimalisere nedbrytningen av aktivert protein C, k a r a k terisert ved at den innbefatter opprettholdelse av nevnte aktiverte protein C i en oppløsning ved en pH mellom 6,3 og 7,0.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at oppløsningen har en saltkonsentrasjon på under 0,050 M eller over 0,40 M.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at oppløsningen har en saltkonsentrasjon under

0,050 M.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at oppløsningen har en saltkonsentrasjon under 0,010 M.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at saltet i oppløsningen er natriumklorid.

6. Stabilt farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det innbefatter aktivert protein C i en oppløsning med en pH mellom 6,3 og 7,0.

7. Farmasøytisk preparat ifølge krav 6, karakterisert ved at det videre innbefatter salt i en konsentrasjon på under 0,050 M eller over 0,4 M.

8. Farmasøytisk preparat ifølge krav 7, karakterisert ved at saltkonsentrasjonen er under 0,05 M.

9. Farmasøytisk preparat ifølge krav 6, karakterisert ved at bufferen er valgt fra gruppen bestående av Tris-acetat, natriumcitrat, citratglycin og natriumfosfat.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at pH er mellom 6,3 og 6,5.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at pH er 6,3.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at pH er 6,4.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at pH er 6,5.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at oppløsningen har en saltkonsentrasjon på over 0,40 M.

15. Vandig oppløsning av aktivert protein C, karakterisert ved at den innbefatter aktivert protein C ved en pH mellom 6,3 og 6,5.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den videre innbefatter lyofilisering av oppløsningen.