FR2688786A1 - Polypeptide a activite thrombolytique. - Google Patents
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Abstract
L'invention a pour objet un (poly)peptide à activité thrombolytique caractérisé en ce qu'il est extrait du venin de Trimeresurus stejnegeri et/ou possède la séquence NH2 terminale suivante: Val-Phe-Gly-Gly-Asp-Glu-Cys-Asn-Ile-Asn-Glu-Glu-Xxx-Ser-Leu-Val-Val-Leu-Phe-Asn-Ser-Asn-Gly-Phe, dans laquelle Xxx représente un aminoacide génétiquement codable et/ou au moins l'une des séquences peptidiques internes suivantes: a) Ile-Leu-Asn-Glu-Asp-Glu-Gln-Thr-Arg-Asp-Pro-Lys-Ala-Lys-Phe-Phe-Cys-Pro-Asn-Arg, b) Leu-Asp-Ser-Ser-Val-Ser-Asn-Ser-Glu-His, c) Ile-Met-Gly-Trp-Gly-Lys, d) Gln-Val-Ala-Yyy-Thr-Thr-Leu-Cys-Ala-Gly-Ile-Leu-Gln-Gly-Gly-Lys, e) Thr-Ala-Tyr-Ser-Trp-Arg, f) Lys-Lys-Glu-Val-Glu-Lys-Asp-Leu-Asp-Ile, g) Thr-Ile-Pro-Thr-Lys, Yyy représentant un aminoacide génétiquement codable. L'invention a également pour objet une composition thérapeutique contenant un (poly)peptide tel que défini.
Description
La présente invention se rapporte à un nouveau peptide extrait du venin de Trimeresurus stejnegeri qui possède une activité d'activation du plasminogène, ainsi qu'une composition thérapeutique à activité thrombolytique.
Les venins de serpent sont riches en protéines qui provoquent des altérations complexes sur la coagulation du sang et les fonctions des plaquettes.
Ainsi, WO 90/08772 décrit des polypeptides obtenus à partir du venin de serpent Agkistrodon p.
piscivorus inhibiteurs de l'activation plaquettaire possédant notamment la séquence spécifique RGDS.
WO 90/15072 décrit un polypeptide à activité anti-agrégante plaquettaire obtenu à partir de serpents appartenant au genre Trimeresurus.
A ce jour cependant, il n' a été décrit aucun polypeptide isolé à partir de venin de serpent possédant la capacité d'activer spécifiquement le plasminogène, susceptible par conséquent d'être utilisé dans les thrombolyses, survenant dans différentes pathologies, notamment l'infarctus du myocarde.
Les composés les plus couramment utilisés pour réaliser une thrombolyse sont la streptokinase obtenue à partir d'extraits bactériens, qui se combine au plasminogène, l'urokinase qui active sélectivement le plasminogène au contact d'un certain nombre de cellules, et plus particulièrement l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Cependant, ces composés présentent un certain nombre d'inconvénients.
Ainsi, la streptokinase ou l'urokinase sont susceptibles de provoquer des hémorragies en raison de leur action sur la fibrine. Le tPA plus sélectif consiste en une molécule de taille importante possédant une demie vie très courte (de l'ordre de quelques minutes), et de ce fait son utilisation en thérapeutique entraine des coûts très importants.
Les présents inventeurs ont isolé et purifié un polypeptide à partir de venin de serpent chinois
Trimeresurus stejnergeri, dénommé VPA, qui possède un remarquable effet d'activation du plasminogène.
Trimeresurus stejnergeri, dénommé VPA, qui possède un remarquable effet d'activation du plasminogène.
La présente invention a pour objet un (poly)peptide à activité thrombolytique caractérisé en ce qu'il est extrait du venin de Trimeresurus stejnegeri et/ou possède la séquence NH2 terminale suivante Val-Phe-Gly-Gly-Asp-Glu-Cys-Asn- Ile-Asn-Glu- Glu-Xxx-Ser-Leu-Val-Val-Leu-Phe-Asn-Ser-Asn-Gly-Phe, dans laquelle Xxx représente un aminoacide génétiquement codable et/ou au moins l'une des séquences peptidiques internes suivantes
a) Ile-Leu-Asn-Glu-Asp-Glu-Gln-Thr-Arg-Asp-Pro Lys-Ala-Lys-Phe-Phe-Cys-Pro-Asn-Arg,
b) Leu-Asp-Ser-Ser-Val-Ser-Asn-Ser-Glu-His,
c) Ile-Met-Gly-Trp-Gly-Lys,
d) Gln-Val-Ala-Yyy-Thr-Thr-Leu-Cys-Ala-Gly-Ile-
Leu-Gln-Gly-Gly-Lys,
e) Thr-Ala-Tyr-Ser-Trp-Arg,
f) Lys-Lys-Glu-Val-Glu-Lys-Asp-Leu-Asp-Ile,
g) Thr-Ile-Pro-Thr-Lys,
Yyy représentant un aminoacide génétiquement codable, les séquences peptidiques internes ayant été obtenues par digestion tryptique, puis séquençage à l'aide des techniques nouvelles.
a) Ile-Leu-Asn-Glu-Asp-Glu-Gln-Thr-Arg-Asp-Pro Lys-Ala-Lys-Phe-Phe-Cys-Pro-Asn-Arg,
b) Leu-Asp-Ser-Ser-Val-Ser-Asn-Ser-Glu-His,
c) Ile-Met-Gly-Trp-Gly-Lys,
d) Gln-Val-Ala-Yyy-Thr-Thr-Leu-Cys-Ala-Gly-Ile-
Leu-Gln-Gly-Gly-Lys,
e) Thr-Ala-Tyr-Ser-Trp-Arg,
f) Lys-Lys-Glu-Val-Glu-Lys-Asp-Leu-Asp-Ile,
g) Thr-Ile-Pro-Thr-Lys,
Yyy représentant un aminoacide génétiquement codable, les séquences peptidiques internes ayant été obtenues par digestion tryptique, puis séquençage à l'aide des techniques nouvelles.
Le polypeptide selon l'invention a été obtenu à partir de Trimeresurus stejnegeri par les étapes de purification comprenant (a) un fractionnement sur gel suivi (b) et (c) de deux chromatographies par échange d' ions.
L'invention a également pour objet une composition thérapeutique comprenant, à titre d'ingrédient actif, un (poly)peptide tel que défini precédemment, utilisable pour réaliser--une thrombolyse chez l'homme ou chez l'animal.
Les compositions selon l'invention sont sous une forme d'administration appropriée, de préférence sous la forme d'une composition pour administration parentérale en bolus ou en perfusion.
Elles conviennent notamment pour effectuer une thrombolyse artérielle, telle qu'une thrombolyse des artères coronaires obstruées au cours d'un infarctus du myocarde.
La quantité de composition administrée est avantageusement comprise entre 0,2 et 10 mg/kg de poids corporel.
On décrira ci-après l'obtention du polypeptide selon l'invention à partir du venin de Trimeresurus stejnegeri ainsi que des propriétés biologiques en se référant aux Fig. annexées sur lesquelles
- la Fig. 1 représente la concentration en protéine
mesurée par adsorption à 280 nm, l'activité d'activation du plasminogène
et l'activité amidolytique sur le S-2238
et le
S-2251
déterminées comme décrit ci-après, du venin de Trimeresurus stejnegeri , après l'étape de filtration sur gel, la barre horizontale représentant les fractions rassemblées pour l'étape de purification suivante ;
- la Fig. 2 représente les pics protéiques obtenus après les étapes de purification par chromatographie d'échange d'ions sur colone Mono-Q à pH 7,8 (étape (a) ; Fig. 2A) et à pH 8,8 (étape (c); Fig.
- la Fig. 1 représente la concentration en protéine
mesurée par adsorption à 280 nm, l'activité d'activation du plasminogène
et l'activité amidolytique sur le S-2238
et le
S-2251
déterminées comme décrit ci-après, du venin de Trimeresurus stejnegeri , après l'étape de filtration sur gel, la barre horizontale représentant les fractions rassemblées pour l'étape de purification suivante ;
- la Fig. 2 représente les pics protéiques obtenus après les étapes de purification par chromatographie d'échange d'ions sur colone Mono-Q à pH 7,8 (étape (a) ; Fig. 2A) et à pH 8,8 (étape (c); Fig.
2B);
- la Fig. 3 représente les résultats d'ac tivation du plasminogène; (A) représentant l'activation du plasminogène en fonction du temps (déterminé par laD.O. à 405 nm en présence de résidus de fibrine obtenus par CNBr, avec le VPA
le t-PA
ou l'urokinase (
et en l'absence de résidus de fibrine, mais en présence de VPA
t-PA
- la Fig. 3 représente les résultats d'ac tivation du plasminogène; (A) représentant l'activation du plasminogène en fonction du temps (déterminé par laD.O. à 405 nm en présence de résidus de fibrine obtenus par CNBr, avec le VPA
le t-PA
ou l'urokinase (
et en l'absence de résidus de fibrine, mais en présence de VPA
t-PA
ou urokinase
; (B) représente la vitesse initiale d'activation du plasminogène par le VPA en absence de résidus de fibrine obtenus par CNBr (exprimée par l'augmentation de l'activité amidolytique sur le S2251) en fonction de la quantité de VPA;
- la Fig. 4 représente les résultats de l'analyse de l'activité fibrinogénolytique directe du
VPA, en l'absence de plasminogène avec des concentrations finales de VPA de 4 pg/ml
1 0,8 pg/ml
0,2 pg/ml
et en présence de plasminogène avec des concentrations finales de VPA de 4 pg/ml
1 0,8 pg/ml
et 0,2 pg/ml
;
I - Purification du polypeptide (VPA) selon l'invention
à partir du venin de Trimeresurus stejnegeri
Les essais suivants ont été réalisés pour suivre la purification du VPA.
a) Activité amydolytigue
L'activité amydolytique du VPA a été déterminée par des essais chromogènes à l'aide d'un spectrophotomètre dans des cuves de 1 cm de trajet optique.
L'activité amydolytique du VPA a été déterminée par des essais chromogènes à l'aide d'un spectrophotomètre dans des cuves de 1 cm de trajet optique.
Les essais ont été réalisés dans un tampon Tris
HCl, pH 7,8 contenant 0,01 % de Tween-80 dans un volume total de 500 pl. Les réactions étaient initiées par addition de VPA à une concentration finale de 600 ng/ml) aux substrats chromogènes suivants, tous dérivés du p-nitroanilide (pNA)
H - D - Phe - Pip - Arg - pNA (S-2238),
H - D - Val - Leu - Lys - pNA (S-2251).
HCl, pH 7,8 contenant 0,01 % de Tween-80 dans un volume total de 500 pl. Les réactions étaient initiées par addition de VPA à une concentration finale de 600 ng/ml) aux substrats chromogènes suivants, tous dérivés du p-nitroanilide (pNA)
H - D - Phe - Pip - Arg - pNA (S-2238),
H - D - Val - Leu - Lys - pNA (S-2251).
La formation de p-nitroanilide a été mesurée de façon continue à 405 nm. La quantité -de substrat hydrolysé a été déterminée à partir de l'absorption à 405 nm en utilisant un coefficient d'extinction molaire de 10.000 pour la p-nitroanilide libre. Les paramètres cinétiques Km ont été calculés par analyse des courbes réciproques doubles de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat.
b) Activation du plasminogène
L'activation du Glu-plasminogène humain par le
VPA a été mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre Kontron en utilisant le S-2251 comme substrat pour le plasminogène activé.
L'activation du Glu-plasminogène humain par le
VPA a été mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre Kontron en utilisant le S-2251 comme substrat pour le plasminogène activé.
Le plasminogène a été mis à incuber à une concentration finale de 100 pg/ml dans un tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7,8, NaCl 0,1 M, Tween-80 0,01 %. La réaction a été initiée par addition de VPA à une concentration finale de 0,5 à 5 pg/ml dans un volume total de 200 u1.
Des quantités aliquotes (50 pl) ont été prélevées à des intervalles de temps variés et testées pour l'activité de la plasmine. Elles ont été introduites dans une cuve de spectrophotomètre contenant 450 pl de S-2251 (0,3 mM) dans du Tris-HCl, pH 7,8, Tween 80 0,01 % et la formation de p-nitroanilide a été mesurée à 405 nm.
Une unité d'activité a été définie comme la quantité de VPA qui en activant le plasminogène pendant une minute, produirait une activité amidolytique de la plasmine d'une milliabsorbance par minute dans les conditions prédéterminées (unité arbitraire).
c) Activité fibrinolytigue avec ou sans plasminogène
Du fibrinogène humain a été incubé dans du
Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,1 M, pH 7,6, à une concentration finale de 0,5 % avec le VPA (concentration finale de 0,2 pg à 4 pg/ml) en présence ou en l'absence de plasminogène (concentration finale de 100 pg/ml) à 37 C pendant des intervales de temps variés.
Du fibrinogène humain a été incubé dans du
Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,1 M, pH 7,6, à une concentration finale de 0,5 % avec le VPA (concentration finale de 0,2 pg à 4 pg/ml) en présence ou en l'absence de plasminogène (concentration finale de 100 pg/ml) à 37 C pendant des intervales de temps variés.
10 p1 de thrombine humaine (63 U NIH/ml) ont été additionnés et l'incubation a été prolongée à température ambiante pendant 30 minutes pour permettre la formation du caillot de fibrine. Le caillot a été centrifugé à 3200 g pendant 20 minutes et la teneur en protéines du surnageant a été déterminée par la méthode de Folin en utilisant comme étalon de la sérum-albumine bovine.
d) Activité phospholipase A2
L'activité phospholipase A2 a été déterminée par une méthode colorimétrique rapide sur des microplaques comme décrit par Lobo de Araujo et Radvanyi (1987); (Determination of phospholipase A2 activity by a colorimetric assay using a pH indicator, Toxicon 25, 1181-1188), en utilisant le rouge phénol comme indicateur de pH pour mesurer la variation du pH provoquée par la libération d'acide gras.
L'activité phospholipase A2 a été déterminée par une méthode colorimétrique rapide sur des microplaques comme décrit par Lobo de Araujo et Radvanyi (1987); (Determination of phospholipase A2 activity by a colorimetric assay using a pH indicator, Toxicon 25, 1181-1188), en utilisant le rouge phénol comme indicateur de pH pour mesurer la variation du pH provoquée par la libération d'acide gras.
e) Activité d'inhibition de l'agrégation plaquettaire
Pour la mesure de l'activité d'inhibition de l'agrégation des plaquettes on a utilisé un plasma riche en plaquettes (PRP) préparé par centrifugation à 375 g pendant 20 minutes à 20 C de sang de lapin (mâles HY/CR, de 3 à 4 kg, de Charles River, Saint-Aubin les Elboeuf,
France) contenant 5 mM d'EDTA ou 0,38 % de citrate de sodium, obtenu en faisant saigner l'artère centrale de l'oreille.
Pour la mesure de l'activité d'inhibition de l'agrégation des plaquettes on a utilisé un plasma riche en plaquettes (PRP) préparé par centrifugation à 375 g pendant 20 minutes à 20 C de sang de lapin (mâles HY/CR, de 3 à 4 kg, de Charles River, Saint-Aubin les Elboeuf,
France) contenant 5 mM d'EDTA ou 0,38 % de citrate de sodium, obtenu en faisant saigner l'artère centrale de l'oreille.
L'agrégation plaquettaire a été mesurée par transmission de la lumière avec un aggrégomètre Chronolog à deux canaux sous agitation continue à 1100 tpm. Les essais ont été réalisés à 37 C avec 0,4 ml de suspension plaquettes additionnée de CaCl2 2 mM. Des inducteurs d'agrégation ont été ajoutés après 2 minutes d'incubation des plaquettes à 37 C et sous agitation, et l'agrégation a été suivie pendant 5 minutes. Des inhibiteurs de l'agrégation ont été ajoutés dans des suspensions de plaquettes deux minutes avant l'addition d'agonistes.
l'intensité de l'agrégation a été comparée à l'agrégation induite par une concentration prédéterminée de thrombine (0,1 unité NIH/ml). L'inhibition a été calculée comme le pourcentage d'agrégation induit par la même concentration de l'agoniste en l'absence d'inhibiteur.
On a également déterminé les activités de type thrombine ainsi que les activités procoagulantes et anticoagulantes.
Le poids moléculaire a été déterminé par électrophorèse sur gel PAGE en l'absence ou en présence de SDS.
Pour les électrophorèses en présence de SDS, les échantillons ont été prétraités dans du SDS seul à 2,5 % (conditions non réductrices) ou dans du SDS à 2,5 % en présence de p-mercaptoéthanol à 5 % (conditions réductrices) à 100" C pendant 10 minutes. Les gels ont été colorés au Bleu Brilliant de Coomasie R à 0,1 % dans un mélange méthanol/acide acétique/eau (3/1/6) et décolorés par diffusion dans la même solution. Les poids moléculaires des protéines analysées ont été estimés par interpolation à partir de la courbe semi-logarithmique de la masse moléculaire relative en fonction de la distance de migration en utilisant les protéines de référence suivantes : phosphorylase b (94 000), sérumalbumine bovine (67 000), ovalbumine (43 000), anhydrase carbonique (30 000), inhibiteur de la trypsine du soja (20 100) et a-lactalbumine (14 400).
Le point isoélectrique a été déterminé par focalisation isoélectrique sur un dispositif Phastsystem (Pharmacia) en suivant les indications du fabricant et en utilisant des marqueurs pour calibrer le gel (kit de calibrage, Pharmacia). Les gels ont été fixés avec de l'acide trichloracétique à 20 %, colorés avec du Bleu
Brilliant de Coomasie R dans un mélange méthanol/acide acétique/eau (3/1/6) et du CuSO4 à 0,1 %, puis décolorés comme décrit ci-dessus.
Brilliant de Coomasie R dans un mélange méthanol/acide acétique/eau (3/1/6) et du CuSO4 à 0,1 %, puis décolorés comme décrit ci-dessus.
La purification a été réalisée en dissolvant 2 g de venin de serpent lyophylisé dans 20 ml de tampon
Tris-HCl 50 mH, NaCl 0,1 M, pH 7,8 et en mettant à incuber la solution pendant une nuit à 4" C sous agitation modérée, puis en centrifugeant à 6000 g pendant 20 minutes. La petite quantité du culot obtenu a été éliminée et le surnageant déposé sur une colonne de
Sephadex G-75 (5 x 100 cm) équilibrée à 4" C avec le même tampon. L'élution a été réalisée avec le même tampon, des fractions de 8 ml ont été récoltées.
Tris-HCl 50 mH, NaCl 0,1 M, pH 7,8 et en mettant à incuber la solution pendant une nuit à 4" C sous agitation modérée, puis en centrifugeant à 6000 g pendant 20 minutes. La petite quantité du culot obtenu a été éliminée et le surnageant déposé sur une colonne de
Sephadex G-75 (5 x 100 cm) équilibrée à 4" C avec le même tampon. L'élution a été réalisée avec le même tampon, des fractions de 8 ml ont été récoltées.
6 pics d'activité protéique ont été retrouvés à l'issue de la procédure (Fig. 1). L'activité d'activation du plasminogène était majoritairement associée avec la première moitié du pic 4 (fractions 96110) et était distincte des activités procoagulantes et phospholipase A2.
L'activité phospholipase A2 et d'inhibition de l'agrégation plaquettaire induite par la thrombine était concentrée dans les fractions 110 à 147. L'activité de type thrombine était concentrée dans les fractions 67 à 85 et les fractions 82 à 96 comportaient une forte activité fibrinogénolytique.
Les fractions comportant l'activité d'activation du plasminogène spécifique la plus élevée ont été rassemblées et dialysées contre un tampon Tris HC1 20 mM, pH 7,8, pendant 24 heures et déposées sur une colonne HPLC préparative Mono-Q 16/10 équilibrée avec le même tampon.
L'élution a été réalisé à l'aide d'un gradient
NaCl linéaire et a permis d'obtenir 12 pics protéiques (Fig. 2A). L'activité d'activation du plasminogène était principalement concentrée dans le pic 7 et associée aux activités amidolytiques sur S-2238 et S-2251.
NaCl linéaire et a permis d'obtenir 12 pics protéiques (Fig. 2A). L'activité d'activation du plasminogène était principalement concentrée dans le pic 7 et associée aux activités amidolytiques sur S-2238 et S-2251.
Une électrophorèse de PAGE en présence de SDS a révélé une bande principale de 27000 Da dans des conditions non réductrices et 33000 Da dans des conditions réductrices.
Le pic 7 obtenu après cette étape a été rassemblé, lyophylisé et dissous dans de l'eau et finalement dialysé pendant 24 heures contre un tampon
Tris-HCl 20 mM, pH 8,8. L'échantillon obtenu a été déposé sur une nouvelle colonne préparative Mono-Q 16/10 et élué avec un gradient linéaire faible de NaCl. Quatre pics ont été obtenus. L'activité d'activation du plasminogène a été détectée dans le pic 4 (Fig. 2B), à nouveau associée avec des activités amidolytiques sur S-2238 et S-2251.
Tris-HCl 20 mM, pH 8,8. L'échantillon obtenu a été déposé sur une nouvelle colonne préparative Mono-Q 16/10 et élué avec un gradient linéaire faible de NaCl. Quatre pics ont été obtenus. L'activité d'activation du plasminogène a été détectée dans le pic 4 (Fig. 2B), à nouveau associée avec des activités amidolytiques sur S-2238 et S-2251.
Le pic 1 ne présentait pas d'activité protéolytique tandis que les pics 2 et 3 présentaient une activité amidolytique sur S-2238, mais non sur S-2251.
Le tableau I suivant résume la procédure de purification TABLEAU I : PURIFICATION DU VPA
<SEP> Protéine <SEP> Activation <SEP> du <SEP> Facteur <SEP> de <SEP> Rendement
<tb> <SEP> plasminogéne <SEP> purification
<tb> Etape
<tb> <SEP> mg <SEP> % <SEP> unités <SEP> unités
<tb> <SEP> totales <SEP> /mg <SEP> %
<tb> Venin <SEP> 2000 <SEP> 100 <SEP> 3,1 <SEP> x <SEP> 105 <SEP> 153 <SEP> 1 <SEP> 100
<tb> Sephadex <SEP> 258 <SEP> 7,9 <SEP> 2,5 <SEP> x <SEP> 105 <SEP> 1598 <SEP> 10 <SEP> 81
<tb> Mono-Q <SEP> 11 <SEP> 0,55 <SEP> 1,8 <SEP> x <SEP> 105 <SEP> 16915 <SEP> 111 <SEP> 58
<tb> (pH <SEP> 7,8)
<tb> Mono-Q <SEP> 4,2 <SEP> 0,21 <SEP> 1,3 <SEP> x <SEP> 105 <SEP> 30125 <SEP> 197 <SEP> 42
<tb> (pH <SEP> 8,8)
<tb> Une unité d'activité a été définie comme décrit précédemment.
<tb> <SEP> plasminogéne <SEP> purification
<tb> Etape
<tb> <SEP> mg <SEP> % <SEP> unités <SEP> unités
<tb> <SEP> totales <SEP> /mg <SEP> %
<tb> Venin <SEP> 2000 <SEP> 100 <SEP> 3,1 <SEP> x <SEP> 105 <SEP> 153 <SEP> 1 <SEP> 100
<tb> Sephadex <SEP> 258 <SEP> 7,9 <SEP> 2,5 <SEP> x <SEP> 105 <SEP> 1598 <SEP> 10 <SEP> 81
<tb> Mono-Q <SEP> 11 <SEP> 0,55 <SEP> 1,8 <SEP> x <SEP> 105 <SEP> 16915 <SEP> 111 <SEP> 58
<tb> (pH <SEP> 7,8)
<tb> Mono-Q <SEP> 4,2 <SEP> 0,21 <SEP> 1,3 <SEP> x <SEP> 105 <SEP> 30125 <SEP> 197 <SEP> 42
<tb> (pH <SEP> 8,8)
<tb> Une unité d'activité a été définie comme décrit précédemment.
La concentration protéique a été estimé à partir de l'absorption à 280 nm, en supposant A280 (1 %) = 10, et par la méthode de Lowry.
Caractéristiques du VPA
Le VPA purifié apparaît par électrophorèse sur
PAGE-SDS sous forme de bande unique et consiste en un polypeptide à chaîne unique ayant un poids moléculaire estimé d'environ 33000 en présence de ss-mercaptoéthanol et de 27000 dans des conditions non réductrices.
Le VPA purifié apparaît par électrophorèse sur
PAGE-SDS sous forme de bande unique et consiste en un polypeptide à chaîne unique ayant un poids moléculaire estimé d'environ 33000 en présence de ss-mercaptoéthanol et de 27000 dans des conditions non réductrices.
Une électrophorèse sur PAGE à pH 6,4 montre en outre que le VPA est un composant mineur du venin brut, même après l'étape de purification sur Sephadex G-75.
La procédure de purification utilisée dans la présente invention a permis d'obtenir environ 4,2 mg de
VPA à partir de 2 g de venin brut.
VPA à partir de 2 g de venin brut.
L'analyse du VPA par focalisation isoélectrique montre une bande protéique unique ayant un pI apparent de 5,2.
Le séquençage de l'extrémité NHz- terminale du
VPA a été réalisé par la méthode de dégradation d'Edman à l'aide d'un séquenceur 470 A en phase gazeuse. Une digestion de la partie interne du polypeptide a été réalisée par la trypsine et a permis d'identifier 7 peptides (peptides a) à g)) qui ont été séquencés par la même méthode.
VPA a été réalisé par la méthode de dégradation d'Edman à l'aide d'un séquenceur 470 A en phase gazeuse. Une digestion de la partie interne du polypeptide a été réalisée par la trypsine et a permis d'identifier 7 peptides (peptides a) à g)) qui ont été séquencés par la même méthode.
Les aminoacides ayant réagi avec la phényl hydantoïne ont été séparés et identifiés par HPLC en phase inverse à l'aide d'un analyseur 120-A PTH sur une colonne RP18.
Les séquences d'aminoacides obtenues sont celles définies précédemment.
Les 12 premiers aminoacides de l'extrémité NH2terminale révèlent une forte homologie avec ceux de l'extrémité NH2-terminale de diverses sérine-protéases extraites de venin de serpent, telles que l'enzyme de type thrombine du venin de Trimeresurus flavoviridis, l'activateur du facteur V de la coagulation du venin de la vipère de Russell (RVV-V) et l'activateur de la protéine C du venin de Agkistrodon contortrix contortrix (ACC-C).
II - Propriétés biologiques et pharmacologiques du VPA
1) Activité amylolytique
En plus des substrats chromogènes S-2238 et S2251, les substrats suivants ont été testés : S 2302 (H
D-Pro-Phe-Arg-pNA), S 2222 (Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA) et
S-2266 (H-D-Val-Leu-Arg-pNA) commercialisés par Kabi
Vitrum (Stockholm, Suède) et CBS 65-25 (H-D-Lys(CBO)-Pro
Arg-pNA) commercialisé par Diagnostics Stago (Asnières,
France).
1) Activité amylolytique
En plus des substrats chromogènes S-2238 et S2251, les substrats suivants ont été testés : S 2302 (H
D-Pro-Phe-Arg-pNA), S 2222 (Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA) et
S-2266 (H-D-Val-Leu-Arg-pNA) commercialisés par Kabi
Vitrum (Stockholm, Suède) et CBS 65-25 (H-D-Lys(CBO)-Pro
Arg-pNA) commercialisé par Diagnostics Stago (Asnières,
France).
Le tableau II ci-dessous résume la spécificité de substrat obtenue avec les différents substrats testés en comparaison, de celle obtenue avec l'urokinase humaine à double chaîne de faible poids moléculaire.
TABLEAU Il
Spécificités de substrat
Spécificités de substrat
<tb> <SEP> Activité
<tb> <SEP> amidolytique
<tb> <SEP> Substrat <SEP> Concentration <SEP> ( moles <SEP> de <SEP> pNA <SEP> libé
<tb> <SEP> de <SEP> substrat <SEP> rées/min/min)
<tb> <SEP> (x <SEP> 10-4M) <SEP> VPA <SEP> urokinase
<tb> <SEP> H-D-Phe-Pip-Arg-pNA <SEP> 2 <SEP> 24,5 <SEP> 1,0
<tb> <SEP> (S-2238)
<tb> <SEP> N-D-Val-Leu-Lys-pNA <SEP> 3 <SEP> 5,2 <SEP> --
<tb> <SEP> (S-2251)
<tb> <SEP> H-D-Val-Leu-Arg-pNA
<tb> <SEP> (S-2266) <SEP> 2 <SEP> 8,0 <SEP> 0,3
<tb> <SEP> H-D-Pro-Phe-Arg-pNA
<tb> <SEP> (S-2302) <SEP> 4 <SEP> 3,3 <SEP> 0,2
<tb> <SEP> Bz-Iln-Gln-Gly-Arg
<tb> <SEP> pNA <SEP> (S-2222)
<tb> H-D-Lys(Cho)-Pro- <SEP> 3 <SEP> 0,1 <SEP> 0,77
<tb> <SEP> Arg-pNA
<tb> <SEP> (CBS65-25) <SEP> 3 <SEP> 18,7 <SEP> 2,5
<tb>
Le VPA (15 pl) ou l'urokinase à double chaîne de faible poids moléculaire (15 l) ont été dilués dans 500 p1 de tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7,8, Tween-80 0,01 % contenant le substrat à la concentration indiquée. Les essais ont été réalisés à 25C C et l'absorption mesurée à 405 nm; (---) : non détectable.
<tb> <SEP> amidolytique
<tb> <SEP> Substrat <SEP> Concentration <SEP> ( moles <SEP> de <SEP> pNA <SEP> libé
<tb> <SEP> de <SEP> substrat <SEP> rées/min/min)
<tb> <SEP> (x <SEP> 10-4M) <SEP> VPA <SEP> urokinase
<tb> <SEP> H-D-Phe-Pip-Arg-pNA <SEP> 2 <SEP> 24,5 <SEP> 1,0
<tb> <SEP> (S-2238)
<tb> <SEP> N-D-Val-Leu-Lys-pNA <SEP> 3 <SEP> 5,2 <SEP> --
<tb> <SEP> (S-2251)
<tb> <SEP> H-D-Val-Leu-Arg-pNA
<tb> <SEP> (S-2266) <SEP> 2 <SEP> 8,0 <SEP> 0,3
<tb> <SEP> H-D-Pro-Phe-Arg-pNA
<tb> <SEP> (S-2302) <SEP> 4 <SEP> 3,3 <SEP> 0,2
<tb> <SEP> Bz-Iln-Gln-Gly-Arg
<tb> <SEP> pNA <SEP> (S-2222)
<tb> H-D-Lys(Cho)-Pro- <SEP> 3 <SEP> 0,1 <SEP> 0,77
<tb> <SEP> Arg-pNA
<tb> <SEP> (CBS65-25) <SEP> 3 <SEP> 18,7 <SEP> 2,5
<tb>
Le VPA (15 pl) ou l'urokinase à double chaîne de faible poids moléculaire (15 l) ont été dilués dans 500 p1 de tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7,8, Tween-80 0,01 % contenant le substrat à la concentration indiquée. Les essais ont été réalisés à 25C C et l'absorption mesurée à 405 nm; (---) : non détectable.
La mesures des vitesses de réaction à différentes concentrations de substrat rapportée sous forme de diagramme de Lineweaver-Burk a permis de déterminer un Km du VPA de 13 pM pour le (S-2238), de 370 uM pour le (S-2251) et de 91 pM pour le (S-2302).
Parmi les composés testés, le S-2238 semble avoir la meilleure spécificité de substrat.
2) Activation du plasminogène
L'activation du Glu-plasminogène humain par le
VPA a été déterminée en utilisant le S-2251 comme susbtrat pour le plasminogène activé.
L'activation du Glu-plasminogène humain par le
VPA a été déterminée en utilisant le S-2251 comme susbtrat pour le plasminogène activé.
La Fig. 3 montre que la vitesse initiale d'activation du plasminogène humain par le VPA est proportionnelle à la concentration de VPA.
Le VPA active le plasminogène en l'absence de fibrine ou de fragments de fibrine, à la différence du t-PA qui est fibrine-dépendant (Hoylaerts et al., 1982 (J. Biol. Chem. 257, 2912-2919).
Des essais réalisés en utilisant le fibrinogène comme substrat pour le plasminogène activé ne montrent pas d'activité fibrinogénolytique directe du VPA en l'absence de plasminogène.
Une électrophorèse sur PAGE en présence de SDS révèle qu'en l'absence de plasminogène et avec des durées d'incubation longues (150-180 minutes) à 37 C, le VPA n'attaque quasiment pas la chaîne a du fibrinogène (Fig.
4), montrant ainsi l'absence de dégradation significative directe du fibrinogène par le VPA.
Des études récentes ont montré que les activateurs physiologiques du plasminogène (t-PA et urokinase) non seulement hydrolysent une liaison arginine-valine spécifique du plasminogène, mais clivent également d'autres protéines telles que la fibronectine et dégradent directement le fibrinogène (Weitz et al., 1988, (J. Clin. Invest. 82, 1700-1707); Weitz et Leslie, 1990 (J. Clin. Invest. 86, 203-212).
En présence du plasminogène, la teneur en protéines coagulables décroit fortement après une durée d'incubation courte. Des analyses sur PAGE montrent que les chaînes Aa, Bss mais également y du fibrinogène humain disparaissent rapidement en 30 minutes et sont remplacées par des résidus de dégradation similaires à ceux obtenus avec la plasmine dans des expériences témoins. Ce résultat est concordant avec les analyses réalisées pour déterminer la teneur en protéines coagulables, qui ont montré que la teneur en protéines coagulables décroit jusqu'a zéro en présence de plasminogène en 30 minutes.
Ces résultats indiquent que le VPA convertit le plasminogène en sa forme activée et que le plasminogène activé dégrade le fibrinogène de façon efficace et rapide.
3) Clivage du plasminogéne par le VPA
Le clivage catalytique du plasminogène humain par le VPA a été étudié par SDS-PAGE en présence de l'inhibiteur de la trypsine du soja qui inhibe la plasmine mais non l'activité du VPA afin d'éliminer l'activité protéolytique non spécifique due à la plasmine générée par le plasminogene.
Le clivage catalytique du plasminogène humain par le VPA a été étudié par SDS-PAGE en présence de l'inhibiteur de la trypsine du soja qui inhibe la plasmine mais non l'activité du VPA afin d'éliminer l'activité protéolytique non spécifique due à la plasmine générée par le plasminogene.
Des analyses par électrophorèse d'échantillons prélevés pendant l'incubation du plasminogène avec le VPA en présence de 1 l'inhibiteur de la trypsine du soja montent que dans des conditions non réductrices, aucune modification du poids moléculaire du plasminogène n'est observée. Au contraire, dans des conditions réductrices, la bande polypeptidique de poids moléculaire apparent 94000 correspondant au Glu-plasminogène disparaît pendant l'activation, tandis que deux bandes de Glu-plasmine de poids moléculaires apparents 68000 et 27000 apparaissent simultanément.
Ces observations indiquent que le VPA (en présence de l'inhibiteur de la trypsine de soja) clive la chaîne polypeptidique du plasminogène en un site unique, localisé dans une boucle formée par un pont disulfure. Ceci est analogue au mécanisme d'activation observé avec l'urokinase.
Dans le cas de l'urokinase, il a été montré que ce clivage avait lieu entre les résidus Arg 560 et Val 561 (Robbins et al. 1967 (J. Biol. Chem. 242, 2333-2342), donnant naissance à la Glu-plasmine, consistant en deux polypeptides liés par des ponts disulfure; l'un de ces polypeptides est la chaîne lourde de la plasmine (Mr 68000); l'autre correspond à la chaîne légère de la plasmine (Mr 25000) contenant le résidu sérine du site actif.
4) Effet du VPA sur des protéines de coagulation
Les venins de Agkistrodon contortrix contortrix et de Bothrops atrox ont été utilisés respectivement comme témoins positifs pour l'activation de la protéine
C et du facteur X.
Les venins de Agkistrodon contortrix contortrix et de Bothrops atrox ont été utilisés respectivement comme témoins positifs pour l'activation de la protéine
C et du facteur X.
L'effet du VPA a été analysé sur la prothrombine, le facteur X et la protéine C. Les protéines ont été incubées avec le VPA à 37 C pendant 1 heure (25 pg/ml de facteur X bovin avec 2 pg/ml de VPA en présence de CaCl2 5 mM; 50 pg/ml de prothrombine humaine avec 2 pg/ml de VPA; 20 pg/ml de protéine C humaine avec 2 pg/ml de VPA). Dans ces conditions, aucune activation n'était observée. Après l'incubation, le prothrombine et le facteur X pouvaient toujours être activés par le venin de Bothrops atrox et réaliser une activation complète.
Des analyses sur SDS-PAGE dans des conditions réductrices ou non réductrices montrent qu'aucun clivage n'a lieu lorsque la prothrombine ou le facteur X étaient incubés avec le VPA avec un rapport substrat/enzyme de 50/1, à 37 C pendant 3 heures.
5) Effet des inhibiteurs des protéases sur le
VPA
Le tableau III ci-dessous résume les effets d'inhibiteurs actifs sur différentes classes de protéases sur l'activité du VPA.
VPA
Le tableau III ci-dessous résume les effets d'inhibiteurs actifs sur différentes classes de protéases sur l'activité du VPA.
TABLEAU III
<tb> <SEP> Inhibiteur <SEP> Concentration <SEP> Activité
<tb> <SEP> résiduelle <SEP> (%)
<tb> NPGB <SEP> 1mM <SEP> 0
<tb> PMSF <SEP> lmM <SEP> 0 <SEP>
<tb> EDTA <SEP> 10 <SEP> mM <SEP> 100
<tb> Iodoacétamide <SEP> 5 <SEP> mM <SEP> 84 <SEP> + <SEP> 4
<tb> L-cystéine <SEP> 5 <SEP> mM <SEP> 33 <SEP> + <SEP> 2
<tb> p-aminobenzamidine <SEP> 10 <SEP> mM <SEP> 0 <SEP>
<tb> Benzamidine <SEP> 10 <SEP> mM <SEP> 41 <SEP> + <SEP> 3
<tb> Hirudine <SEP> 25pg/ml <SEP> 100 <SEP> + <SEP> 5
<tb> Antithrombine <SEP> III <SEP> 4 <SEP> pg/ml
<tb> Héparine <SEP> 1 <SEP> U/ml <SEP> 105 <SEP> + <SEP> 5
<tb> Aprotinine <SEP> 10 <SEP> UIT/ml <SEP> 36 <SEP> + <SEP> 2
<tb> Inhibiteur <SEP> de <SEP> la <SEP> 200 <SEP> pg/ml <SEP> 95 <SEP> + <SEP> 5
<tb> trypsine <SEP> du <SEP> soja
<tb>
Le NPGB (p-nitrophényl p-guanidinobenzoate), un réactif spécifique du résidu sérique du site actif des sérine-protéases, inhibe de façon complète l'activité amidolytique du VPA et son activité d'activation du plasminogène. Le VPA est également inhibé par l'inhibiteur PMSF (fluorure de phénylméthane sulfonyle) des sérine-protéases.
<tb> <SEP> résiduelle <SEP> (%)
<tb> NPGB <SEP> 1mM <SEP> 0
<tb> PMSF <SEP> lmM <SEP> 0 <SEP>
<tb> EDTA <SEP> 10 <SEP> mM <SEP> 100
<tb> Iodoacétamide <SEP> 5 <SEP> mM <SEP> 84 <SEP> + <SEP> 4
<tb> L-cystéine <SEP> 5 <SEP> mM <SEP> 33 <SEP> + <SEP> 2
<tb> p-aminobenzamidine <SEP> 10 <SEP> mM <SEP> 0 <SEP>
<tb> Benzamidine <SEP> 10 <SEP> mM <SEP> 41 <SEP> + <SEP> 3
<tb> Hirudine <SEP> 25pg/ml <SEP> 100 <SEP> + <SEP> 5
<tb> Antithrombine <SEP> III <SEP> 4 <SEP> pg/ml
<tb> Héparine <SEP> 1 <SEP> U/ml <SEP> 105 <SEP> + <SEP> 5
<tb> Aprotinine <SEP> 10 <SEP> UIT/ml <SEP> 36 <SEP> + <SEP> 2
<tb> Inhibiteur <SEP> de <SEP> la <SEP> 200 <SEP> pg/ml <SEP> 95 <SEP> + <SEP> 5
<tb> trypsine <SEP> du <SEP> soja
<tb>
Le NPGB (p-nitrophényl p-guanidinobenzoate), un réactif spécifique du résidu sérique du site actif des sérine-protéases, inhibe de façon complète l'activité amidolytique du VPA et son activité d'activation du plasminogène. Le VPA est également inhibé par l'inhibiteur PMSF (fluorure de phénylméthane sulfonyle) des sérine-protéases.
L'aprotinineinhibepartiellement son activité, tandis que l'inhibiteur de la trypsine du soja n'a que peu ou pas d'effet.
Par contraste, la trypsine et la plasmine sont complètement inhibées à ces concentrations d'aprotinine ou d'inhibiteur de la trypsine du soja. Le VPA est inhibé par l'a-aminobenzamidine et la benzamidine. L'antithrombine III/héparine ou l'hirudine n'ont pas d'effet. En outre, l'activité du VPA n'est pas affectée par les chélateurs de métaux (EDTA), ni par les réactifs des groupes thiols, ce qui confirme qu'il n'est ni une thiolprotéase, ni une métalloprotéase.
Claims (6)
1. (Poly)peptide à activité thrombolytique caractérisé en ce qu'il est extrait du venin de Trimeresurus stejnegeri et/ou possède la séquence NH2 terminale suivante Val-Phe-Gly-Gly-Asp-Glu-Cys-Asn-Ile-Asn-Glu- Glu-Xxx-Ser-Leu-Val-Val-Leu-Phe-Asn-Ser-Asn-Gly-Phe, dans laquelle Xxx représente un aminoacide génétiquement codable et/ou au moins l'une des séquences peptidiques internes suivantes
a) île- Leu-Asn-Glu-Asp-Glu-Gln- Thr-Arg-Asp-
Pro-Lys-Ala-Lys-Phe-Phe-Cys-Pro-Asn-Arg,
b) Leu-Asp-Ser-Ser-Val-Ser-Asn-Ser-Glu-His,
c) Ile-Met-Gly-Trp-Gly-Lys,
d) Gln-Val-Ala-Yyy-Thr-Thr-Leu-Cys-Ala-Gly
Ile-Leu-Gln-Gly-Gly-Lys,
e) Thr-Ala-Tyr-Ser-Trp-Arg,
f) Lys-Lys-Glu-Val-Glu-Lys-Asp-Leu-Asp-Ile,
g) Thr-Ile-Pro-Thr-Lys,
Yyy représentant un aminoacide génétiquement codable.
2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il a un poids moléculaire apparent d'environ 33 000.
3. Polypeptide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est obtenu par les étapes de purification comprenant un (a) fractionnement sur gel suivi de (b) et (c) deux chromatographies par échange d' ions
4. Polypeptide selon la revendication 3, caractérisé en ce que
- dans l'étape a), le fractionnement est réalisé sur une colonne de Sephadex G-75 équilibrée avec un tampon Tris HCl 50 mM, NaCl 0,1 M, pH 7,8, l'élution étant réalisée au moyen du même tampon;
- dans l'étape b), la chromatographie par échange d'ions est une chromatographie liquide à haute performance réalisée sur une colonne mono-Q équilibrée avec un tampon Tris HCl 20 mM, pH 7,8, l'élution étant réalisée au moyen d'un gradient linéaire de NaCl; ;
- dans l'étape c), la chromatographie par échange d'ions est une chromatographie liquide à haute performance réalisée sur une colonne mono-Q équilibrée avec un tampon Tris HCl 20 mM, pH 8,8, l'élution étant réalisée au moyen d'un gradient linéaire faible de NaCl.
5. (Poly)peptide selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il présente une activité d'activation du plasminogène.
6. Composition thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle comprend comme ingrédient actif un (poly)peptide tel que défini dans l'une des revendications 1 à 5.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9203467A FR2688786A1 (fr) | 1992-03-23 | 1992-03-23 | Polypeptide a activite thrombolytique. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9203467A FR2688786A1 (fr) | 1992-03-23 | 1992-03-23 | Polypeptide a activite thrombolytique. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2688786A1 true FR2688786A1 (fr) | 1993-09-24 |
Family
ID=9427969
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9203467A Pending FR2688786A1 (fr) | 1992-03-23 | 1992-03-23 | Polypeptide a activite thrombolytique. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2688786A1 (fr) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0020780A1 (fr) * | 1978-11-20 | 1981-01-07 | Ohta Pharmaceutical Co., Ltd. | Materiau fibrinolytique et son procede de fabrication |
-
1992
- 1992-03-23 FR FR9203467A patent/FR2688786A1/fr active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0020780A1 (fr) * | 1978-11-20 | 1981-01-07 | Ohta Pharmaceutical Co., Ltd. | Materiau fibrinolytique et son procede de fabrication |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JOURNAL OF BIOCHEMISTRY. vol. 103, 1988, TOKYO JP pages 596 - 605 T-C. SHIEH ET AL 'Amino acid sequence of a coagulant enzyme, flavoxobin, from Trimeresurus flavoviridis venom' * |
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