FI115635B - Menetelmiä proteiini C:n hajoamisen estämiseksi - Google Patents

Description

115635

Menetelmiä proteiini C:n hajoamisen estämiseksi Tämä keksintö koskee entsymologiaa, erityisesti menetelmiä aktivoidun proteiini C:n hajoamisen estämiseksi.

5 Proteiini C on seriiniproteaasi ja luonnossa esiin tyvä hyytymistä estävä aine, jolla on osuus verenvuodon tyrehdyttämisen säätelyssä aktivoimalla faktori Va:ta ja VIIIa:ta hyytymiskaskadissa. Ihmisen proteiini C:tä tehdään in vivo pääasiassa maksassa yhtenä 461 aminohapon polypep-10 tidinä. Tämä prekursorimolekyyli läpikäy useita translaation jälkeisiä modifikaatioita mm. 1) 42 aminohapon sig-naalisekvenssin pilkkoutumisen; 2) lysiinitähteen proteo-lyyttisen poiston yksisäikeisestä tsymogeenistä kohdasta 155 ja arginiinitähteen poiston kohdasta 156 molekyylin 15 kaksiketjuisen muodon muodostamiseksi, (ts. 155 aminohappotähteen kevytketju kiinnittyneenä disulfidisillan avulla seriiniprotesaasin sisältävään 262 aminohappotähteen ras-kasketjuun); 3) K-vitamiinista riippuvaisen, niiden yhdeksän glutamiinihappotähteen karboksylaation, jotka ovat 20 ryhmittyneet kevytketjun 42 ensimmäiseen aminohappoon, jolloin muodostuu 9 gammakarboksiglutamiinihappotähdettä; ja 4) hiilihydraatin kiinnittymisen neljään kohtaan (yksi kevytketjussa ja kolme raskasketjussa). Raskasketju sisältää hyvin pysyvän Asp 257:n, His 211:n ja Ser 360:n serii-25 niproteaasikolmikon. Lopulta kiertävä 2-ketjuinen tsymo-geeni aktivoituu in vivo trombiinilla fosfolipidipinnasta kalsiumionin läsnä ollessa. Aktivointi on seurausta dode-kapeptidin poistosta raskasketjun N-päästä, jolloin muo-: dostuu aktivoitu proteiini C (aPC), jolla on entsymaattis- »tl ♦ , ; , 30 ta aktiivisuutta.

Työskenneltäessä suurten määrien ja korkeiden aPC-, , pitoisuuksien kanssa havaittiin proteolyyttinen leikkautu- minen raskasket jun kohdan 308 lysiini tähteessä. Tässä leikkauksessa muodostuneen uuden N-pään sekvenssi alkaa 35 Glu-Ala-Lys, jolloin muodostuu 111 aminohapon fragmentti, 2 115635 jota kutsutaan "EAK-fragmentiksi", raskasketjun C-termi-naalisesta päästä lähtien. EAK-fragmentti ei kiinnity ko-valenttisesti kevytketjuun tai raskasketjun N-terminaali-seen osaan disulfidisidoksin. EAK-fragmentti sisältää myös 5 seriiniproteaasin aktiivisen kohdan seriinin, mutta ei Asp- eikä His-tähteitä. Näin on havaittu, että proteiini C -preparaateilla, joissa on EAK-fragmentti, on muuntunut hyytymistä estävä vaikutus. Esillä oleva keksintö sisältää menetelmiä proteiini C -molekyylin hajoamisen estämiseksi 10 tai minimoimiseksi pitämällä molekyyli matalassa pHrssa, denaturoivassa aineessa tai äärimmäisissä suolapitoisuuksissa.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksiin tässä esitettyinä seuraavat termit ovat kuten jäljempänä on määri- 15 telty.

aPC - aktivoitu ihmisen proteiini C.

APTT - aktivoitu partiaalinen tromboplastiiniaika.

AU - amidolyyttiset yksiköt.

BME - beeta-merkaptoetanoli.

20 CHES - 2-[N-sykloheksyyliamino]etaanisulfonihappo.

EAK -fragmentti - 111 aminohapon fragmentti, joka muodostuu proteiini C:n raskasketjun pilkkoutumisesta kohdasta 308.

EDTA - etyleenidiamiinitetraetikkahappo.

25 HEPES - N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N'-2-etaani- ,, I ·' sulfonihappo.

: HPC - ihmisen proteiini C:n tsymogeeni.

MEA - 2-aminoetanoli.

J MES - 2-(N-morfoliino)etaanisulfonihappo.

I t * t 30 Syntyvä proteiini - mRNA-transkriptin translaatios sa muodostunut polypeptidi, ennen mitään translaation jäl-, , keisiä modifikaatioita. Translaation jälkeiset modifikaa tiot, kuten glutamiinihappotähteen gamma-karboksylaatio ja asparagiinihappotähteen hydroksylaatio, saattavat kuiten- 3 115635 kin alkaa ennen kuin proteiini on täysin transloitunut mRNA-transkriptistä.

Proteiini C -aktiivisuus - mikä tahansa ihmisen proteiini C:n ominaisuus, joka saa aikaan proteolyyttistä, 5 amidolyyttistä, esterolyyttistä ja biologista (hyytymistä estävää tai profibrinolyyttistä) aktiivisuutta. Menetelmät proteiini C:n hyytymistä estävän ja amidolyyttisen aktiivisuuden testaamiseksi ovat alalla hyvin tunnettuja, ts. katso Grinnell et ai., Bio/Technology 5 (1987) 1189 - 10 1192.

rHPC - rekombinantisti tuotettu ihmisen proteiini C:n tsymogeeni.

Tsymogeeni - proteolyyttisen entsyymin entsymaattisesti inaktiivinen prekursori. Proteiini C:n tsymogeeni, 15 kuten sitä tässä käytetään, viittaa proteiini C:n eritty neeseen, inaktiiviseen muotoon, joko yksi- tai kaksisäi-keiseen.

Kaikki tässä esityksessä käytetyt aminohappolyhen-teet ovat sellaisia, jotka United States Patent and Trade-20 mark Office on hyväksynyt, kuten seuraavassa esitetään: 37 C.F.R. §1.822 (b) (2) (1990).

Esillä oleva keksintö koskee menetelmiä aktivoidun proteiini C:n autodegradaation estämiseksi ja minimoimiseksi. Keksintöä valaistaan parhaiten esimerkein suoritta-25 maila aktivoidun proteiini C:n valmistus, puhdistus ja/tai säilytys matalassa pH:ssa, esimerkiksi noin pH:ssa 6,3 -: : 7,0. aPC:n autodegradaatiota voidaan myös minimoida inku- boimalla aPC:tä 3 M ureassa (täydellinen aPC:n aktiivisuus : saavutetaan denaturoivan aineen poiston jälkeen) tai inku- , : . 30 boimalla aPC:tä äärimmäisten suolapitoisuuksien läsnä ol lessa. Esillä olevan esityksen tarkoituksissa äärimmäinen , . suolapitoisuus tarkoittaa suolapitoisuuksia, jotka ovat suurempia kuin noin 0,4 molaarinen ja pienempiä kuin noin 0,05 molaarinen. Esillä oleva keksintö sisältää myös aPC-: · : 35 formulaatioita, jotka säilyttävät aPC:n matalassa pH:ssa, 4 115635 denaturoivassa aineessa, tai äärimmäisissä suolapitoisuuksissa.

Proteiini C:n osuus verenvuodon tyrehdyttämisen ylläpitämisessä on synnyttänyt paljon kiinnostusta tätä 5 yhdistettä kohtaan terapeuttisena aineena lukuisiin verisuonisairauksiin. Suurten määrien ja korkeiden ihmisen proteiini C -pitoisuuksien tuottaminen teollisuusmittakaa-vassa on paljastanut sen, että molekyyli voi käydä läpi autodegradaation, jolloin hyytymistä estävä aktiivisuus 10 alenee. aPC:n autodegradaatiosta seuraa 111 aminohapon fragmentin muodostuminen, jota kutsutaan "EAK-fragmentiksi", raskasketjun C-terminaalisesta päästä. EAK-fragmentti ei kiinnity kovalenttisesti kevytketjuun tai raskasketjun N-terminaaliseen osaan disulfidisidoksin. EAK-fragmentti 15 sisältää myös seriiniproteaasin aktiivisen kohdan seriini-tähteen, mutta ei Asp- eikä His-tähteitä. Näin proteiini C -valmisteilla, joissa on EAK-fragmentti, on muuntunut hyytymistä estävä aktiivisuus proteolyyttisen pilkkoutumisen vuoksi.

20 EAK-fragmentin muodostumiseen johtavan autodegra daation vähentämiseksi tai estämiseksi koskematon aktivoitu proteiini C -molekyyli voidaan pitää noin pH:ssa 6,3 - 7,0. Molekyyli voidaan pitää tällaisella pH-alueella kaikkien puhdistus- ja aktivointiprosessien läpi, kuten 25 myös lopullisessa formulaatioliuoksessa. Monia eri pusku-rijärjestelmiä voidaan käyttää liuoksen pH:n ylläpitämi-: ; seksi. Edullisia puskurijärjestelmiä ovat Tris-asetaatti, natriumsitraatti, sitraatti-glysiini ja natriumfosfaatti.

• ;'· Alan ammattimies havaitsee, että on saatavilla monia muita » · * * 30 puskurijärjestelmiä, joita myös voidaan käyttää esillä olevan keksinnön valmistuksessa.

, , Esillä olevan keksinnön eräs näkökohta koskee EAK- * # ' 'II.' fragmentin muodostumisen estämistä tai vähentämistä pitä- **;·’ mällä aktivoitu proteiini C -molekyyli liuoksessa, jossa : ’ : 35 on äärimmäinen suolapitoisuus. Esimerkiksi natriumfosfaat- I i » 5 115655 tipuskurissa, pH:ssa 7, EAK-fragmentin muodostus on minimaalinen, kun puskurissa ei ole suolaa. EAK-fragmentin muodostus on natriumfosfaattipuskurissa, pH:ssa 7,0, kuitenkin myös minimaalinen, kun puskurissa on noin 0,4 M 5 natriumkloridi. Näiden kahden suolapitoisuuden välillä EAK-fragmentin muodostusta tapahtuu vaihtelevia määriä, mutta alan ammattimies havaitsee, että suolapitoisuuden pitäminen alle 0,05 M ja yli 0,4 M estää heti tai minimoi EAK-fragmentin muodostumisen. Muut 0,05 M alapuolella ole-10 vat suolapitoisuudet (esim. 0,01 M tai 0,005 M) ovat edullisia, vaikka paras farmaseuttinen formulaatio syntyy, kun liuoksen pH pidetään noin 7,0:ssa lisäämättä suolaa liuokseen. Alan ammattimies havaitsee, että monia eri suoloja voidaan käyttää farmaseuttisessa valmistuksessa ja formu-15 laatioissa. Esillä olevassa keksinnössä käytettäviä edullisia suoloja ovat kaliumkloridi, kalsiumkloridi ja edullisimpana natriumkloridi.

Esillä olevaa keksintöä eivät rajoita menetelmät, joilla aktivoitua proteiini C:tä voidaan tuottaa. Vaikka 20 on tehokkainta tuottaa aktivoituja proteiini C -molekyylejä käyttäen yhdistelmä-DNA-tekniikkaa, viimeiset edistysaskeleet suuren mittakaavan proteiinin puhdistuksessa ovat tehneet mahdolliseksi huomattavien määrien eristämisen ·’· aktivoitua proteiini C:tä ihmisen seerumista. Näin suu- ···; 25 rien proteiini C -määrien saaminen on saanut aikaan sen, että suuria pitoisuuksia aktivoitua proteiini C:tä voidaan käsitellä samaan aikaan. Kuten edellä on mainittu, keksin-j : : nön tekijät havaitsivat, että aktiivisen proteiini C:n pitoisuudet, yli noin 50 pg:n tason millilitraa kohden, 30 osoittivat aktivoidun proteiini C -molekyylin autodegra-: daatiota siihen liittyvän hyytymistä estävän aktiivisuuden ,···, putoamisen kanssa. Mikä tärkeintä autodegradaation määrä lisääntyy, kun aktivoidun proteiini C:n pitoisuus kasvaa i ’.· liuoksessa. Ei ole tehokasta teollisella tasolla tehdä * ♦ » i » * » · 6 115635 suuren mittakaavan puhdistusprosesseja erittäin alhaisilla proteiinipitoisuuksilla.

Se, että aktivoidun proteiini C:n tuotannon teollinen ja farmaseuttinen käyttö edellyttää molekyylin pro-5 sessoimista pitoisuuksilla, jotka ovat paljon korkeampia kuin 50 pg, esillä olevassa keksinnössä alan ammattimies voi tuottaa suuria määriä tuotetta ilman huomattavaa katoa tuotteen aktiivisuudessa. Esillä olevan keksinnön formu-laatiot sallivat edelleen stabiilien aktivoidun proteiini 10 C:n liuosten säilyttämisen pitemmän ajan kuin mitä tunnetussa tekniikassa tiedettiin.

Alan ammattimies havaitsee, että esillä olevan keksinnön menetelmillä voivat keksintöä harjoittavat henkilöt tehdä suurempia määriä aktivoitua proteiini C:tä korkeam-15 missä pitoisuuksissa kuin aikaisemmin ilman pelkoa tuotteen häviämisestä autodegradaation vuoksi. Lisäksi esillä olevan keksinnön stabiileja farmaseuttisia koostumuksia voidaan helposti käyttää sellaisten potilaiden hoitamiseksi, jotka kärsivät fysikaalisista sairauksista, kuten 20 opettavat Taylor, Jr. et ai., US-patenttijulkaisu nro 5 009 889, joka kokonaisuudessaan on liitetty tähän viitteenä .

Seuraavat esimerkit annetaan esillä olevan keksinnön valaisemiseksi eikä niitä ole tehty sen rajoittamisek-; 25 si.

Esimerkki 1

Ihmisen proteiini C:n tuottaminen : ; : Rekombinanttia ihmisen proteiini C:tä (rHPC) tuo- tettiin Human Kidney 293 -soluissa alan ammattimiehen hy-30 vin tuntemilla menetelmillä, kuten sellaisilla, jotka Yan : ,·, on esittänyt US-patenttijulkaisussa nro 4 981 952, joka kokonaisuudessaan liitetään tähän viitteenä. Geenin, joka koodaa ihmisen proteiini C:tä, esittävät Bang et ai., US-• V patenttijulkaisu nro 4 775 624, joka kokonaisuudessaan : : 35 liitetään tähän viitteenä. Plasmidi, jota käytettiin eks- » > 7 1 1 5635 pressoimaan ihmisen proteiini C:tä 293-soluissa, oli pLPC-plasmidi, jonka esittävät Bang et ai., US-patenttijulkaisu nro 4 992 373, joka kokonaisuudessaan liitetään tähän viitteenä. pLPC-plasmidin rakentaminen kuvataan myös EP-5 patenttijulkaisussa nro 0 445 939 ja sen kuvaavat Grinnell et ai., Bio/Technology 5 (1987) 1189 - 1192, jotka koko naisuudessaan liitetään tähän viitteinä. Lyhyesti plasmidi transfektoitiin 293-soluihin, jonka jälkeen stabiilit transformantit identifioitiin, jatkoviljeltiin ja kasva-10 tettiin seerumivapaassa alustassa. Fermentoinnin jälkeen saatiin soluvapaa alusta talteen mikrosuodattamalla.

Ihmisen proteiini C eristettiin kasvatusnesteestä mukailemalla Yan'n tekniikoita, US-patenttijulkaisu nro 4 981 952, joka kokonaisuudessaan liitetään tähän viittee-15 nä. Kirkastettu alusta tehtiin 4 mM:ksi EDTA:han, ennen kuin se absorboitiin anioninvaihtohartsiin (Fast-Flow Q, Pharmacia). Sen jälkeen kun oli pesty neljällä pylvästila-vuudella 20 mM Tris - 200 mM NaCl:a, pH 7,4 ja kahdella pylvästilavuudella 20 mM Tris - 150 mM NaCl:a, pH 7,4, 20 sitoutunut rekombinantti ihmisen proteiini C:n tsymogeeni eluoitiin 20 mM Tris - 150 mM NaCl - 10 mM CaCl2*.lla, pH 7,4. Eluoitu proteiini oli yli 95-%:isesti puhdas eluution jälkeen varmistettuna SDS-polyakryyliamidigeelielektrofo-··· reesilla.

25 Proteiinia puhdistettiin edelleen tekemällä pro- ',,,· teiini 3 M:ksi NaCl:iin, jonka jälkeen se adsorboitiin « I · hydrofobiseen interaktiohartsiin (Toyopearl Phenyl 650M,

i : : TosoHaas), joka oli tasapainoitettu 20 mM Tris - 3 M

NaCl - 10 mM CaCl2:ssa, pH 7,4. Sen jälkeen kun oli pesty 30 kahdella pylvästilavuudella tasapainotuspuskuria ilman

: .·. CaCl2:a, rekombinantti ihmisen proteiini C eluoitiin 20 mM

.·., Tris:llä, pH 7,4. Eluoitu proteiini valmistettiin aktivaa- tiota varten poistamalla jäljelle jäänyt kalsium. Rekombi- * nantti ihmisen proteiini C vietiin metalliaffiniteettipyl- * * * 35 vääseen (Chelex-100, Bio-Rad) kalsiumin poistamiseksi ja i a i 8 115635 sidottiin jälleen anioninvaihtajaan (Fast Flow Q, Pharmacia) . Nämä molemmat pylväät järjestettiin sarjaan ja tasapainotettiin 20 mM Tris - 150 mM NaCl - 5 mM EDTA:lla, pH 7,4. Proteiinin lisäämisen jälkeen Chelex-100-pylvästä 5 pestiin yhdellä pylvästilavuudella samaa puskuria ennen kuin se poistettiin sarjasta. Anioninvaihtopylväs pestiin kolmella pylvästilavuudella tasapainotuspuskuria ennen kuin proteiini eluoitiin 0,4 M NaCl - 20 mM Tris-asetaa-tilla, pH 6,5. Rekombinantti ihmisen proteiini C- ja re-10 kombinantti aktivoitu proteiini C -liuosten proteiinipitoisuudet mitattiin UV:ssa 280 nm:ssä ekstinktioiden ollessa E0,1% = 1,85 tai 1,95, tässä järjestyksessä.

Esimerkki 2

Rekombinantin ihmisen proteiini C:n aktivaatio 15 Naudan trombiini kytkettiin aktivoituun CH-Sepha- rose 4B:hen (Pharmacia) 50 mM HEPESissä, pH 7,5, 4 °C:ssa. Kytkentäreaktio tehtiin hartsiin, joka oli jo pakattu pylvääseen käyttäen noin 5 000 yksikköä trombiinia millilit-raa kohden hartsia. Trombiiniliuosta kierrätettiin pylvään 20 läpi noin kolme tuntia ennen kuin lisättiin MEA:a pitoisuudessa 0,6 ml/1 kierrätysliuosta. MEA:a sisältävää liuosta kierrätettiin vielä 10 - 12 tuntia sen varmistamiseksi, että hartsin reagoimattomat amiinit tulisivat varmasti täydellisesti estetyiksi. Estämisen jälkeen hartsi, : 25 johon oli kytketty trombiinia, pestiin 10 pylvästilavuu- ·,,,' della 1 M NaCl - 20 mM Tris:iä, pH 6,5, kaiken epäspesifi- sesti sitoutuneen proteiinin poistamiseksi ja sitä käytet-; : i tiin aktivointireaktioissa aktivointipuskurissa tapahtuvan tasapainotuksen jälkeen.

30 9 115635

Puhdistettu rHPC tehtiin 5 mMrksi EDTA:n suhteen (jäljelle jääneen kalsiumin kelatoimiseksi) ja laimennettiin pitoisuuteen 2 mg/ml 20 mM Trisrllä, pH 7,4, tai 20 mM Tris-asetaatilla, pH 6,5. Tämä materiaali ajettiin 5 37 °C:ssa 50 mM NaClrlla ja joko 20 mM Trisrllä, pH 7,4, tai 20 mM Tris-asetaatilla, pH 6,5, tasapainotetun trom-biinipylvään läpi. Virtausnopeus säädettiin siten, että rHPC:n ja trombiinihartsin väliseksi kosketusajaksi tulee noin 20 minuuttia. Eluaatti kerättiin ja siitä määritet-10 tiin välittömästi amidolyyttinen aktiivisuus. Mikäli materiaalissa ei ollut spesifistä aktiivisuutta (amidolyyttis-tä) suhteessa asetettuun aPC-standardiin, sitä kierrätettiin uudelleen trombiinipylväässä rHPC:n aktivoimiseksi täydellisesti. Tämän jälkeen materiaali laimennettiin 1:1 15 20 mM puskurilla, kuten edellä, pH:n ollessa joko 7,4 tai 6,5, aPC:n pitämiseksi alhaisemmassa pitoisuudessa seuraa-vaa valmistusvaihetta odoteltaessa.

Liuenneen trombiinin poisto aPC-materiaalista suoritettiin sitomalla aPC anioninvaihtohartsiin (Fast Flow 20 Q, Pharmacia), joka oli tasapainotettu aktivointipuskuris-sa (joko 20 mM Trisrssä, pH 7,4, tai 20 mM Tris-asetaatis-sa, pH 6,5), joka sisälsi 150 mM NaClra. Trombiinilla ei ole vuorovaikutusta anioninvaihtohartsin kanssa näissä ;* olosuhteissa, vaan se kulkee pylvään läpi näytteen apli- ;· 25 kointieluaattiin. Sen jälkeen kun aPC ajetaan pylvääseen, « < I » pestään 2-6 pylvästilavuudella 20 mM tasapainotuspusku-,*··. ria, ennen kuin eluoidaan sitoutunut aPC yksivaiheisella ; eluutiolla käyttäen 0,4 M NaClra joko 5 mM Tris-asetaatis- M.' sa, pH 6,5, tai 20 mM Trisrssä, pH 7,4. Pylvään pesu suu- ' 30 remmillä tilavuuksilla teki helpommaksi täydellisemmän dodekapeptidin poiston. Tästä pylväästä eluoitu materiaali säilytettiin joko jäädytettynä liuoksena (-20 °C) tai kyl-\* mäkuivattuna pulverina.

. aPC:n amidolyyttinen aktiivisuus (AU) määritettiin 35 vapauttamalla p-nitroanaliini syhteettisestä substraatis- 10 115635 ta, H-D-Phe-Pip-Arg-p-nitroanilidista (S-2238), joka oli ostettu Kabi Vitrum'sta, käyttäen Beckman DU-7400 -diodi-rivispektrofotometriä. Yksi yksikkö aktivoitua proteiini C:tä määritettiin sellaisena määränä entsyymiä, joka tar-5 vitaan vapauttamaan 1 pmolrn p-nitroaniliinia 1 minuutissa 25 °C:ssa, pH 7,4:ssä, käyttäen p-nitroaniliinille eks-tinktiokerrointa 9 620 M‘1cm"1 405 nm:ssä.

Aktivoidun proteiini C:n hyytymistä estävä aktiivisuus määritettiin mittaamalla hyytymisajan kesto akti-10 voitu partiaalinen tromboplastiiniaika (APTT) -hyytymis-määrityksellä. Standardikäyrä valmistettiin laimennuspus-kuriin (1 mg/ml radioimmunomääritysluokan BSA:ta, 20 mM Trisriä, pH 7,4, 150 mM NaCl:a, 0,02 % NaN3:a) proteiini C:n pitoisuuden ollessa 125 - 1 000 ng/ml, kun taas näyt-15 teistä valmistettiin useita laimennoksia tällä pitoisuus-alueella. Kuhunkin näytekyvettiin lisättiin 50 μΐ kylmää hevosen plasmaa ja 50 μΐ liuotettua aktivoitu partiaalinen tromboplastiiniaika -reagenssia (APTT Reagent, Sigma) ja niitä inkuboitiin 37 °C:ssa 5 minuuttia. Inkuboinnin jäl-20 keen lisättiin 50 μΐ sopivia näytteitä ja standardeja kuhunkin kyvettiin. Laimennuspuskuria käytettiin näytteen tai standardin asemesta hyytyrnisaikataustan määrittämiseksi. Fibrometrin (CoA Screener Hemostasis Analyzer, American Labor) ajastus käynnistettiin välittömästi sen 25 jälkeen kun kuhunkin näytteeseen tai standardiin lisättiin 50 μΐ 37 °C:ista CaCl2:a. Aktivoidun proteiini C:n pitoi-suus näytteissä lasketaan standardikäyrän lineaarisesta ,·, regressioyhtälöstä. Tässä raportoidut hyytymisajat ovat keskiarvoja vähintään kolmesta rinnakkaisesta, myös stan-’ 30 dardikäyrän näytteiden osalta.

Näytteiden valmistamiseksi vertailututkimuksiin • täydellinen aPC:n autodegradaatio (7,3 mg/ml 20 mM Tris - 150 mM NaClrssa) saavutettiin 44 tunnin inkuboinnin jäl-j‘.'; keen 25 °C:ssa tai anioninvaihtohartsissa (FFQ, Pharmacia) .·*·. 35 konsentroinnin jälkeen, pH:ssa 7,4, 4 °C:ssa. Amidolyytti- 11 115635 set aktiivisuusmääritykset, HPLC, N-terminaalinen sekve-nointi ja SDS-PAGE suoritettiin näytteille autodegradaa-tion määrän ja aminohapposekvenssin pilkkoutumiskohtien varmistamiseksi ja kvantitoimiseksi.

5 Esimerkki 3

Aktivoidun proteiini C:n stabilointimääritykset pH: n vaikutus aPC:n aktiivisuuteen määritettiin monitoroimalla AU:ta. Kolmen puskurin järjestelmää käytettiin määrittämään pH-olosuhteita alueella 6 - 9,3 (0,3 pH-10 yksikön lisäyksin) käyttäen 50 mM:na kutakin seuraavaa: MES (pH 5,5 - 7), HEPES (pH 6,8 - 8,2) ja CHES (pH 8,6 -10). aPC laimennettiin 0,4 mg/ml:n lopulliseen pitoisuuteen sopivan pH:n omaavalla puskurilla ja sitä inkuboitiin tässä pitoisuudessa ennen aktiivisuuden mittausta. Näyt-15 teet määritettiin sekä lähtöhetkellä että niiden oltua 30 tuntia 4 °C:ssa käyttäen amidolyyttisiä määrityksiä inku-bointi-pH:ssa. Nämä mittaukset osoittivat amidolyyttiselle aktiivisuudelle kellon muotoisen pH-riippuvuuden. Näiden määritysten tulokset esitetään jäljempänä taulukossa I.

20

Taulukko I

Amidolyyttiset määrät (lU/mg aPC) pH 0 tuntia 130 tuntia 6.0 1,63 1,58 25 6,6 4,00 4,63 7,2 9,16 6,68 , . 7,8 11,26 9,26 7,4 7,05 5,16 9.0 3,53 3,53 30

Aktiivisuusmaksimi aPC:lle oli pH:ssa 7,4, kun taas ääri-pH-arvoilla 6 ja 9,3 aktiivisuus osoittautui erittäin al-haiseksi. Vaikka aPC ilmeisesti säilyttää jonkin verran ;\\ amidolyyttistä aktiivisuutta äärimmäisissä pH:issa, nämä 35 tulokset osoittavat, että autodegradaatio vähenee väittä- 12 115635 mällä pH-olosuhteita, joissa aPC:llä oli maksimaalinen aktiivisuus.

Sen määrittämiseksi, oliko aPC:n amidolyyttisen aktiivisuuden pH-riippuvuus EAK-fragmentin muodostuksen 5 funktio, aPC-näytteitä inkuboitiin pH:issa 6,0, 7,5 ja 9,0, pitoisuudessa 1,5 mg/ml, 4 °C:ssa, 18 tuntia. Muodostuneen EAK:n määrä mitattiin integroimalla EAK:n HPLC-hui-pun ala sekä kvalitatiivisesti tarkastelemalla EAK-juovaa SDS-PAGE:ssa. Nämä tulokset eivät osoittaneet EAK:n muo-10 dostuksen lisääntymistä inkuboinnin aikana pH 6,0:ssa, kun taas pH: ssa 7,5 oli noin 30 %:n lisäys ja pH 9,0: ssa 50 %:n lisäys. Huolimatta EAK-fragmentin kohonneista tasoista pH 7,5:n ja 9,0:n näytteillä preparaatilla oli yhä korkea AU-aktiivisuus, kun se mitattiin pH:ssa 7,4. Näin 15 EAK-fragmentin muodostus ei ole välttämättä yhteydessä amidolyyttisen aktiivisuuden häviämiseen. Pikemminkin EAK-fragmentin tulee pysyä tarpeeksi assosioituneena aPC:n raskasketjun loppuosan kanssa seriiniproteaasifunktion ylläpitämiseksi. Jos jotakin, korkeampi EAK-fragmenttisi-20 sältö liittyy korkeampaan amidolyyttiseen aktiivisuuteen.

EAK-fragmentti sisältää katalyyttisen kolmikon (joka sisältää His 211:n ja Asp 257:n, jotka sijaitsevat raskasketjun N-terminaalisessa osassa) aktiivisen kohdan se-riinin (tähde 360). Sen vuoksi, mikäli EAK-fragmentti ei ;· 25 ole kovalenttisesti kiinnittynyt raskasketjun loppuosaan, tämä proteolyyttinen pilkkoutuminen saattaa johtaa alhai-,···. sempaan entsymaattiseen aktiivisuuteen. Eri EAK-määrien . . vaikutuksen kohdistamiseksi hyytymistä estävään aktiivi- suuteen valmistettiin useita eri aPC-eriä, kuten esimer-30 keissä 1 ja 2, supra, on kuvattu. Amidolyyttiset määritykset tehtiin substraattipitoisuuksien ollessa 22 - 198 μΜ nro S-2238, aPC-pitoisuuksien ollessa 1,6 - 3,3 nM (75 -150 ng/ml) 20 mM Tris:ssä, pH 7,4, 150 mM NaCl:ssa. Tämän määrityksen tulokset esitetään jäljempänä taulukossa II.

13 115635

Taulukko II

Prosentuaalinen EAK-sisältö versus spesifinen aktiivisuus mitattuna

Spesifinen aktiivisuus 5 Näytteen nro % EAK AU/mg APTT/mg 1 3 1,13 2,11 2 19 1,35 1,7 3 35 1,52 1,37 4 51 1,64 1,00 10 5 67 1,68 0,78

Hajoamisen pH-riippuvuutta käytettiin hyväksi sellaisten aPC-näytteiden tekemisessä, jotka sisälsivät eri määriä EAK:ta. Nämä näytteet valmistettiin kuten on kuvat-15 tu esimerkeissä 1 ja 2, supra. Näytteitä, joissa oli eri määriä EAK-fragmenttia, verrattiin koskemattomaan aPCrhen (<3 % EAK-fragmenttia). Amidolyyttiset kineettiset parametrit, mm. Km-, Kcat- ja Vmax-arvot, mitattiin kullekin näistä eristä kolmella eri entsyymipitoisuudella ja ne on 20 koottuina taulukossa III.

! * f t t > t 1 14 115635

Taulukko lii Kineettiset tulokset Näytteen nro (aPC) Km Vmax Kcat (% EAK) ng/ml (mM) (pmol/ml)min) (1/s) 5 1 (20%) 150 0,12 9102 7 1 113 0,12 8634 6,6 1 75 0,19 8713 6,7 10 2 (67%) 150 0,18 10672 8,2 2 113 0,18 9729 7,5 15 2 75 0,18 9930 7,6 3 (100%) 150 0,16 13142 10,1 3 113 0,14 2337 1,8 20 ' 3 75 0,18 316 0,2

Km-arvot kolmelle aPC-näytteelle osoittautuivat samoiksi, kokeellisen variaation rajoissa, ja niiden keskiarvo on 25 0,16 mM substraattia. Tämä antaa olettaa, että affiniteet- * * < » ti S-2238-substraatille ei lopu hajonneessa aPCrssä. Yllättävää kyllä hajonneella materiaalilla oli vielä AU-ak-tiivisuutta oleellisesti sama määrä kuin koskemattomalla ;/ aPC:llä.

30 Aktivoidulla proteiini C:llä voi olla koskematonta amidolyyttistä funktiota tripeptidisubstraattia kohtaan : : (nro S-2238) jopa korkeassa EAK-fragmenttipitoisuudessa.

! In vitro hyytymistä estävä aktiivisuus voidaan mitata APTT-määrityksellä. Toisin kuin odotettiin korkea AU-ak-.·, 35 tiivisuus ei korreloinut hyytymistä estävään aktiivisuu- 15 115635 teen. Kun AU-aktiivisuus nousi kasvavan EAK-sisällön myötä, APTT-aktiivisuus laski kasvavan EAK-sisällön mukana.

Suolapitoisuuden vaikutusta EAK-fragmentin muodostukseen ja aktivoidun proteiini C:n stabiilisuuteen tut-5 kittiin inkuboimalla aktivoidun proteiini C:n näytteitä eri pH-tasoissa ja suolapitoisuuksissa, jonka jälkeen mitattiin EAK-fragmentin muodostumisen prosentuaalinen osuus tunnissa. Proteiini C:n pitoisuudet määrityksessä olivat 4-5 milligrammaa millilitraa kohden. Kaikki mää-10 ritykset tehtiin 5 - 20 mM fosfaattipuskurissa. Natrium-kloridia käytettiin suolana (kun suolaa oli läsnä) ja kaikki määritykset tehtiin 25 °C:ssa. EAK-fragmentin muodostuksen prosenttiosuus tunnissa mitattiin HPLC-integraa-tiolla. Näiden määritysten tulokset esitetään jäljempänä 15 taulukossa IV.

Taulukko IV

Suolapitoisuuden vaikutus EAK-fragmentin muodostukseen pH Suolapitoisuus EAK:n muodostumxs-%/tunti 20 6,4 400 mM 0,094 7.0 400 mM 0,145 6,4 50 mM 0,292 7.0 50 mM 0,365 , j* 6,4 0 0,038 :* 25 7,0 0 0,092 1 »

Claims (14)

115635

1. Menetelmä aktivoidun proteiini C:n hajoamisen minimoimiseksi, tunnettu siitä, että mainitussa 5 menetelmässä pidetään mainittua aktivoitua proteiini C:tä liuoksessa, jonka pH on noin 6,3 - 7,0.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun liuoksen suolapitoisuus on alle noin 0,050 M tai yli noin 0,40 M.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun liuoksen suolapitoisuus on alle noin 0,050 M.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun liuoksen suolapitoi- 15 suus on alle noin 0,010 M.

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun liuoksen suolapitoisuus on yli noin 0,40 M.

6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että liuoksen suola on natriumklo- ridi.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puskuri valitaan ryhmästä, joka sisältää Tris-asetaatin, natriumsitraatin, sitraatti- 1 · 25 glysiinin ja natriumfosfaatin.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puskuri on Tris-asetaatti.

· 9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, · tunnettu siitä, että puskuri on natriumfosfaatti.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, • tunnettu siitä, että pH on 6,3. • » » ·

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t « I tt‘t tunnettu siitä, että pH on 6,4.

: ·' 12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että pH on 6,5. t | » 115635

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun liuoksen suolapitoisuus on yli 0,40 M.

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että mainittu liuos lisäksi lyofi- lisoidaan. i * 1 * » 115635