CZ1395A3 - Minimization method of activated protein c degradation and pharmaceutical preparation containing the activated protein c - Google Patents

Minimization method of activated protein c degradation and pharmaceutical preparation containing the activated protein c Download PDF

Info

Publication number
CZ1395A3
CZ1395A3 CZ9513A CZ1395A CZ1395A3 CZ 1395 A3 CZ1395 A3 CZ 1395A3 CZ 9513 A CZ9513 A CZ 9513A CZ 1395 A CZ1395 A CZ 1395A CZ 1395 A3 CZ1395 A3 CZ 1395A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
protein
activated protein
apc
activated
eak
Prior art date
Application number
CZ9513A
Other languages
English (en)
Inventor
Walter Francis Prouty
Josephine Secnik
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22650141&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ1395(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of CZ1395A3 publication Critical patent/CZ1395A3/cs

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46Hydrolases (3)
    • A61K38/48Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4866Protein C (3.4.21.69)
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/48Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6464Protein C (3.4.21.69)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y304/00Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069Protein C activated (3.4.21.69)
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Description

Způsob nininalizace c euti c ký prostředek
Ob 1 ast_ techn i ky odbourávání akbivovaného pr<í-.f<é?nu Cj a obsahující akbivovaný protein C '— arn
-J
Vynález spadá do oboru enzyaologie a obzvláště se týká zpúsobů prevence odbourávání akbivovaného proteinu 0.
Dosavadní stav techni ky
Protein C je serinová proteáza a přírodně se vyskytující antikoaauíant, který má význaa při regulaci henostasis akbivovánÍB faktorů V;- a VIIIa v koagu lační kaskádě. Lidský protein C se in vivo vytváří především v játrech jako samotný polypetid se 461 aninokysel inarii. Tato prekurzorcvá molekula podléhá četnýn postruns lačrsín modifikacím, mezi něž patří 1> Trápení signální sekvence aninokysel iny 42, 2) probeoiybické odstraňování lysinovéh·;
zbytku v poloze 155 z jednořebězcového vyrocenu a arglminového zbytku v poloze 156 k vytváření dvouřet ězcové formy molekuly íto je lehký řetězec 155 ani nokyse1 i nových zbytků připojený disulíi262 ani nokysei i nových viran inu z závis!;
dickým můstkem k těžkému řetězci obsahujícímu serincvou proteázu), 3>
d.'. .-.yuj ky,d;y aminokyselinách Lehkého řetězce, jejímž výsledkem ve '? zbytků gur;a karboxyg lutanové kyseliny a 4? uid ohydr érové odíranou na 4 yřech růstech fna jednom v lehkém řetězci a na ' r v těžkém r~·lezci'?. Těžký řetězec obsahuje dobře zněný -siáči ssrinove yneteAsp 257, His 211 a Ser 360. Konečně se cirknr_jící d-uouřetězcový zymogen aktivuje in vivo thrembinem na ídosf o 1 i 00 dovcm povrchu v přítonnost.i vápenatého iontu. Výsledkem aktivace je odsiraně.ní -dc-dekapept idu na S-zakončení těžkého řýězce za produkce aktivovaného proteinu C <aFC) majícího enzymaticko yko de:: í .
' 1; práci s velkým množstvím a s vysokými k .-ncertraoem 1 -dť ‘ěžkáko řetězce. Sekvence nového K-Zokc-iřern . -.yíeřoe 0:1střihem, začíná s Giu-Ala-Lys a poskytuie idarey .nundynd uy lil, nazývaný EAK fraoBent“ od C-zakončení těžkého řetězceFragment EAK není vázán kovalent.no k lehkému řetězci nebo k podílu N-zakončení těžkého řetězce prostřednictvím disulfidických vazeb. Fragment EAK obsahuie také aktivní serinové místo serinové prnteázy, avšak nikoli zbytky Asp nebo His. Bylo tudíž zjištěno, že přípravy proteinu C s EAK fragmentem změnily antikoagulační působení. Tento vynález se týká způsobů prevence nebo íli i i ί i íiiči i i. ce odbourávání molekuly proteinu C udržováním molekuly na snížené hodnotě pH, v denaturačnín činidle nebo v extremních koncentracích soli.
Jednotlivé používané zkratky mají následující významy, aPC - aktivovaný lidský protein 2 APTT-· čas částečně aktivovaného thromboplastinu AU - amidolytické jednotky
E-ME - ý-ner kaptoethanol
CHES- 2Γ N-cy k i ohexylamíno]ethansu ifonová kyselí na
EAK Fragment - fragment aninokyseliny 111 pocházející ze střihu v po-loze 292 těžkého řetězce proteinu 2
EDTA- ethy 1 ord i ar; i nt et raoct ová kyselina
HEFE2 - N-2-Ey drozy ethy lpi poraz in-2! ' -2-ethansu I í onová kyselina EP2 - zymoger· lidského proteinu 2 KEA - 2-amiroethanol
PES
- i N -mocí o line l et d-nsu 1 í oonová
-o rdí'·Λ před o ; os ř, -1ra n s 1 a c n;
smove rysei i 7 a pcdypep1 id vyíváé-uý rr· translaci Im-.nskrip· kýnikoli rosí-i:eas 3 .adu i m i πο-c ikareni ·..'·: 17; O ·. í lil 17 OC O - 7 . -1- O U-7.Γ-a — k Ol ?.·..·>.y 1 c — Z..: y · - TO a ·. i a • a nydroxylare zbytků aspartové kyseliny sήτοι ve. ra protein plně trans letován může začít vyskytov. z n.RM i r ensko ipí a ěk+ iv ii a pr celeru 2 - každá o,·.· 2;· ..·.· 1 idského proteinu 2 ζο,ίροvo in- . · pr o* eo i yl i r ké , amidolytické. ort erudyt i cké a liok,uioké --0.(7.:0-0..0::: nebo profibri noΪytické> akt-ivity. Ztleobv zkrušení antikoagulační a amidolvtické aktivity proteinu pra v odru d
7-ře známe v;··-.:·:.: t j a .· - ·!
raPl sír. 2 až 1192.
o redukovaný pr.·..-·m lidského pr ·. ·· · a n v.
o r adukevany
Zynogen - enzymaticky iriaktivní prekursor- protec» lyt i ekého enzymu. Zynogenera proteinu C se zde vždy míní sekretované, inaktivní formy proteinu C s jedním nebo se dvěma řetězci.
V/eokny zde používané zkratky aminokyselin jsou zkratkami přijatými americkým úřadem United States Patent and Trademark Office a jsou uvedeny v C.F.R. 91,322(b)(2) (1990).
Podstata vynálezu
Způsob minimalizace odbourávání aktivovaného proteinu C spočívá podle vynálezu v tom, že se aktivovaný protein C udržuje v roztoku s hodnotou pH 6,3 až 7,0.
Nejlépe vynález příkladně objasňuje provádění zpracování.
čistění a/nebo skladování aktivovaného proteinu O při nízké hodnotě pH, například přibližně pH 6,3 až přibližně pH 7,0. Samovolné odbourávání aktivovaného lidského proteinu C je možno také minimalizovat inkubováním aktivovaného lidského proteinu C v 311 močovině (k úplnému obnovení aktivity aktivovaného lidského proteinu C dojde ρο edshsanení dona turantu) nebo inkubací akt ivovaného lidského proteinu t v přítomnosti extrémní koncentrace sed. i . Extrémními koncentracemi /·.! se zde vždy míní molární koncentrace
n.·. '. přibližně 0.4 mol t-d·, pod ti mol- Vynález se taká tyká pr·o.túrám antivovaneno tot-éo protsnn 0, tmre sccovny udržet aktivováno . tá··· reíeina 0 ;áu nízkém hodům.ě rá v denaruiunvti. .. : · pni .'mrm mor.*.· . b . ,t v 1ta prominu O v udržování henestasis vyvolala volky zájem mra strmeni nu váů tei ammán oke ho činidla pno nejráznějěí
v as .tdái ni peru á · ,\J 3: tckce vymky · h ib-ut a vysokve n koncen-
* : - ί ί 1 eského prut einu t v p •rumy s i ov en měřítku odkryl a skut.eo-
rot , ze mo 1 oku i cf - 1 úže podléhat .mnoc innému odbouráván i , jez
·. ke .. . ....1:/- a Z ti ko acu1 anoní aktiv itě . Samočinné odbour ávání ak-
ivované ho Iris :<ého přetei nu vesle1 k vytvoření trapnou ru amino-
kyseliny lít nazývaného fmement EAť” b t-zakoněení těžkého řormm. mam-uvr rán :mn; pí :pojen mcie-m iuoo.yo! v.ml^mi k hebkému čt/ot nbo k tommádí těžkého řetězce, 'c mni. á.’.t. ás.dum má át lm;í ním.’? -z inového zbyJ ku .-reriuove proteázy, nikoli však zbytky Asp nebo His. Prostředky proteinu C s EAK fragmentem mají tudíž změněnou protisrážlivou účinnost v důsledku přítomnosti proteolytického střihu.
Ke snížení saraocinneno odbouráváni nebo k jeho zabránění, které vede k tvoření EAK fragmentu, může být neporušená aktivovaná molekula proteinu C udržována při hodnotě pH přibližně 6,3 až přibližně 7,0- Molekula může být udržována při hodnotě pH v tomto rozmezí v průběhu všech čisticích a aktivačních procesů, stejně jako v konečné formulaci roztoku. K udržení hodnoty pH v roztoku je možno použít mnoha různých pufrových systémů. Jakožto reprezentativní pufrové systémy se příkladně uvádějí tris-acetát, citrát sodný, systém citrát-glycin a fosfát sodný. Pracovníkům v oboru je jasné, že lze použít i jiných pufrových systému.
Vynálezu se rovněž týká prevence nebo sníženého tvoření fragmentu EAK přechováváním molekuly aktivovaného proteinu C. v roztoku s abnormální koncentrací soli. Například ppři hodnotě pH 7,0 v případě pufru fosfátu sodného je tvoření EAK fragmentu minimální, není-li v pufru přítomna sůl. Avšak při hodnotě pH 7.0 v případě pufru fosfátu sodného je rovněž tvoření EAK fragmentu minimální, je-li koncentrace chloridu sodného přítomného v pufru, přibližně 0,4 M. Mezi těmito dvěma koncentracemi soli dochází ke tvoření EAK fragmentu v proměnlivé míře; pracovníkům v oboru je vša-k zřejmé, že udržováním koncentrace soli pOd 0. Ob M nebo nad 0,4 M se nejsnáze zabrání tvoření EAK fragmentu, nebo jeho tvořeni omezí na niniaus. Jiné výhodné koncentrace soli jsou pod 0,05 M íua-říklad 0,01 M nebo o, M ' . ačkoli k nejlepřím farmaceutickým prostředkům se dospívá, lu-li hodnota pH roztoku udržována na přiblžně pH 7,0, bez přísadsy soli do r-oztoku. Pracovní kům v oboru je zřejmé, že lze použít mnoha různých solí při výrově a zpracování farmaceutických prostředků. Jakožto reprezentativní soli, kterých lze použít podle vynálezu, se uvádějí ehkrid draselný, chlorid vápenatý a jako nejvýhodnější chlorid sodný.
Vynález se dále týká prevence nebo snížení samočinného odbouráváni aktivovaného proteinu b prováděním čištěni a/nebo zpracování v přítomnosti denaturačního činidla. Použít· lze nneho různých denaturačních činidel, avšak nejvýhodnějším ie močovina v koncentracích přibližně 3 M.
Vynález není omezen způsoby, jíníš lze aktivovaný protein C vyrábět,. Ačkoli je nej produktivnější vyrábět molekuly aktivovaného proteinu C i- v- t,,>iíibi ιί3π'..’ΐ; i aiiri í.cvííííu i UM t i r Ui-ioz.n i i y pÚS i CO: í i pokroky ve velkoprovozním čištění proteinů izolaci význanných anožství aktivovaného proteinu C z lidského séra. Získávání tak velkého množství proteinu. r. uaožr.iio zpracovávat najednou vysoké koncentrace aktivovaného proteinu C. Jak shora uvedeno, zjistilo se, še koncentrace aktivovaného proteinu riau přibližně 50 mikrogranů na mililitr vykazují sanočinné odbourávání molekuly aktivovaného proteinu C za současného poklesu antikoagulační aktivity. Nejvýznamnější je, že rychlost samočinného odbourávání vzrůstá s rostoucí koncentrací aktivovaného proteinu C v roztokuV průmyslovém měřítku není účinné provádět převozní čisticí piocesy při velmi nízké koncentraci proteinu:: k a £ : c e 1 n :or ker:'.:,-.. e výra.er o ,· v y r n am e.. i ;r;e 2 tzů da 1 e retelnu C PO
Vzhleden k tonu, še průmyslová a šarraceut; výroby aktivovaného proteinu G vyžaduje zpracovávat •K-iekuí daleko převyšující 50 r 1 proprán Š . urorňn ;e covníkům v oboru vyrábět velká množství produktu ý :. poklesu aktivity výrobku. Fornulaee podle tohoto v uncšču j í
-oriší . než jak bylo icsuí v oboru zrárorraccvujkfts :· oneru ?.e zreTé. re způsob c,
SiOŽní ve velkých řper:ař sýr výpc a k u i veco-nehe pre£eue; ý ve vyšších koncert rac ich. aer j.-k- by ; ρ :/::::: ie:
cos? .. : ' o.·' .řr,ý.·; o; rotrop s-močirrýr· od bouř o v i r : r . hroně -.ono Ire - rap 1 n i ch formulací podle- vynálezu rob·: řeckou·, r - ~ o- : i ován i pacienti; trpících; pryen i ;·.····· i poroehm; tbrror. a.
kol., americký patentový spis čísi?; b ppyerp; .
vysledující příklady vynález ebjasňmí n; r;: o ho však bii;.: · ' y ; c ,··.···; -d ·;; í vy :b· ; er u : n k I a d 1 b:c>b.: lidského proteine t
Reakonfoinantní lidský protein C (rHPC) se produkuje v buňkách 293 lidské ledviny způsoby známými pracovníkům v oboru (například americký patentový spis číslo 4 931952, Yan). Gen, kódující lidský protein C, popsal Bang a kol. (americký patentový spis číslo 4 7756241. Plasmidem, použitým k expresi lidského proteinu C v buňkách 293 je plasmid pLPC, který popsal Bang a kol. (americký patentový spis číslo 4 992373). Konstrukce plasmidu 1PLG je také popsána v evropské zveřejněné přihlášce vynálezu číslo O 445939 a také ji popsal Grinell a kol. <1987, Bio/Technology 5, str. 1189 až 1192). V podstatě se plasmid transfektuje do buněk 293, identifikují se stabilní transfornanty, subkultivují se a nechávají se růst v prostředí prostém sera. Po fermentaci se získá buněk prosté prostřed í mi krof i 1tracíLidský protein C se oddělí od kultivační kapaliny přizpůsobeným způsobem, který popsal Van (americký patentový spis číslo 4 981952. Připraví se vyčeřené medium 4 mM v ethylend1amintetraoctové kyselině před jeho absorpcí na anexové pryskyřici (Past Plev Q, Pharmacia). Po promyti čtyřmi objemy sloupce 20 ml! Tris, 200 m!4 chloridu sodného, hodnota pH 7,4 a dvěma objeme sloupce 20 md Tris, 150 mil chloridu sodného, h ndncd.a pH 7.4, ce eluuje vázaný r ekombi nar.tn í zymooen lidského proteinu C £0 md Tris, 150 md chloridu sodného. 10 md chloridu vápenatého, hodnota ρΗ 7,4. Pc· cínování ne čistota linovaného proteinu větší rve 95?r podle GPS-· 1 y e hry 1 am i levé co Prve aLiktrof.rézť.
čištění p .•vádí při pravici pi-ř-inu Pd lu sočném následující .strmen na hyorofobní int-rakční
Trus, hodr v fa - . « ’ z 4 ' ’ 7 - Si. - 111 i ováný
: ‘Pst r,j.r;ěnf -m z i by t kováře i vápníku
’.'d;Cz -n s k' v ov ‘U aíin itou
s-viái c vác- - se ícě:
eryckyřnci <Tcyopear1 Phenyl (tOM, TosoHaas) vyvařené ve 20 md Trus, Ρ M chloridu sodném. 10 nd chloridu vápenatěn, hodnota pH
7,4. Po promyti dvěma obienv sloupce vyváženého pufru bez chloridu vápena í-éhc;, se rekom ΐ · i raném i lidský rvete i η P e lunte 20 md P r o t s 1 n s a ; ř i; c ·'·.·.' o; o aktiv a c i Pekombinantní lidsky protein O se 'initeu (Ohel ex-1.00 . Blo-Rad) k odstranění dusí Plev O, Pharamcia). Oba tyto •ionpcř . uspořádají v sérii a vyváží se 20 md Tris, 15!I nf! • ‘ cc iv. vij; 5 md etLv1-rdi ar>ntetraoctevou fcv?el ίη«·. v-d7 nota pH 7,4. Po zavedení proteinu, se sloupec Chelex -100 pronyje jedním objeieem sloupce stejného pufru před jeho odpojením ze série. Rnexový sloupec se pronyje 3 objemy sloupce vyváženého pufru před eluovánÍB proteinu 0,4 M chloridem sodným, 20 r:M Tris-acetáten, hodnota pH 6,5. Proteinové koncentrace roztoků rekonbinantního lidského proteinu C a rekombinantního aktivovaného proteinu C se naměří UV 230 na extinkcí E°·14 = 1,95 nebo 1,95.
Příklad 2
Aktivace rekonbinantního lidského proteinu C
Hovězí t.hrombin se kopuluje na aktivovanou CH-Sefarozou 4B (Pharaacia) v přítomnost, i 50 nM HEPES, hodnota pH 7,5 při teplotě 4 C- Kopu lační reakce se provede na pryskyřici již vnesené do sloupce za použití přibližně 5000 jednotek thrombinu na 1 ml pryskyřice. Roztok thrombinu se nechá protékat sloupcem přibližně po dobu tří hodin před přidáním 2-aminoethano!u CKEA) do koncentrace 0,6 ml/1 cirkulujícího roztoku. P ozt ok obsahující KEA se nechá cirkulovat dalších 10 až 12 hodin k za- jištění úplné blokády nezreaoovaných .-.ninů na pryskyřici. Po blokování se pryskyřice s kopulovaným troisbinen promvje 10 objemy sloupce ÍM chloridu sodného, 29 mil Tr ls. hodnota pH 6,5, k odstranění veškerého nes pec ’ * i c Ky v a a.a ί í e, o i o oe i n a *-'* * ,., , e . x-. . v ciC u . o.. — .·. — cích po vyvážení v aktivačním pufru.
Vyčištěný rekombim-stré produkovaný zynopen lidského protei:.u 9 <rPKC) se vnese do 5 mM ethy 1 end i am i ntet raoctové kyseliny fEP-TA) Ck ereletován i veškerého zbytkového vápníku) a rozrodí se na koncentraci 2 mo/ml 20 nM Trio, 1. odnota pd 7,4 nebo 20 mK Tris acetáten, hodnota pH 6,5. Tento materiál se nechá procházet tronbincvýn sloupcem vyváženým při teplete 37 C 50 mM chloridem sodným a 92 20 rdi Tris. hodnotu pú 7,4. nebo 20 nM Tris-acetáten, hodnota pd 6,5. Průtočná rychlost se nastaví na přibližně 20 minut doby styku mezi rííPC a tronbínovou pryskyřicí. Výtok se shrou.',.... . .. l.?,n 2 17 . .ol:ú n? -z ; !· · ' ··’ i-ker
Neměl -li na-.erjál specifickou aktivitu «. nn i do 1 yt i ckou ) srovnatelnou se zavedeným standardem aktivovaného lidského proteinu C
CaPC), recykluje se přes tronbinový sloupec k aktivaci rKPC ke kompletaci- Fo tom následuje ředění na poměr 1 - 1 materiálu 20 mM pufrera jako shora, s hodnotou pH buď 7,4 nebo 6,5 k udržení aPC při nižších koncentracích při prodlevě před dalším zpracováním. 5
Thrombin, vyloužený z materiálu aPC, se odstraní vázáním aPC na anexovou pryskyřici (Past Plov Q, Pharmacia) vyváženou v aktivačním pufru Chuď 20 mM Tris, hodnota pH 7,4 nebo 20 mM Tris-acetátu, hodnota pH 6,5) 150 mM chloridem sodným. K interakci thrombinu s anexovou pryskyřicí za těchto podmínek nedochází, ale thrombin přechází sloupcem do vzorku výtoku. Když se aPC nanese na sloupec, provede se promytí dvěma až šesti objemy sloupce 20 mM vyrovnávacího pufru před eluovánín vázaného aPC a eluuje se 0,4 M chloridem sodným buď v 5 mM Tris-acetátu, hodnota pH 6,5, nebo ve 20 mM Tris, hodnota pH 7,4. Promytí sloupce větším objemem usnadní dokonalejší odstranění dodekapept i du. Produkt, el učívaný z tohoto sloupce se ukládá buď ve zmrazeném roztoku <-20 C) nebo jak o 1 y o l i 1 i z o v a ny z-· r a s e κ,
Amidolytická aktivita <AU) aPC se zjišťuje uvolňováním p-nitrosnalinu ze syntetického substrátu H-D-Fhe-Pip-Arg-p-nitroani1 i du CS-2238), obchodního produktu společnosti Kabi Vitrun za použití spektrofotometru Beckman DU-7400 s diodovou řadou. Jedna jednotka aktivovaného proteinu C se definuje jako množství enzymu potřebné k uvolnění 1 ymolu ρ-nitroani 1 i nu za 1 minutu při teplotě 25 C, hodnotě pH 7,4 za použití ext inkčního koeficientu pro p-nitroani I in při 405 na f‘620 Μ^οΓ1.
Protisrášlivá aktivita a mořením prodloužení doby sr aktivovaného parciálního t,h k ř i v k a s e p ř i řádu R'-,S ,ivovar.ého proteinu C se zjišťuje :ení při zkoušce doby srážení nboplastinu CAPTT). Standardní fru <1 no/ml radioinunotestu 4. 150 mM chloridu sodného.
připraví rozředěním pu 0 nM Tris, hodnota pH 7
0,02 % nitridu sodného) s koncentracemi proteinu C 125
1000 nn/ml. přičemž vzorky se připravují v několika zředěních v tonho každé vzorkovací kyvety přidá 50 ni studené koňské plasmy a 50 pl rekonstituovaného časového reakčn hrombomlastir.u cent, Signa) a inkubuje se po dobu 5 minut při teplotě 37 C. Po inkubaci se do každé kyvety přidá 50 μΐ příslušného vzorku nebo standardu. Místo vzorku nebo standardu se ke zjištění doby srážení přidá ředicí pufr. Bezprostředně po přidání 50 μΐ 30 M chloridu vápenatého při teplotě 37 O do každého vzorku nebo standardu se spustí stopky fibrometru <CoA Screener Henostatic Analyser, Anerican Labor). Koncentrace aktivovaného proteinu O ve vzorcích se vypočte z lineární regresní rovnice standardní křivky. Doby srážení zde uváděné jsou průměrem nejméně ze tří opakování, včetně vzorků standardní křivky.
K přípravě vzorků pro porovnávací studie bylo dosaženo úplného saBočinného odbourání aPC <7,3 mg/ml ve 20 mM Tris, 150 mM chloridu sodném) po 24 hodinách inkubace při taplotě 25 C nebo po koncentraci anexové pryskyřice CFFQ Pharmacia), hodnota pH 7,4 při teplotě 4 C. Tesly amidolytické aktivity HPLC, sekvence N-zakončení a SDS-PAGE se provádějí kvantifikaci rozsahu samočinné tepem v am i:
Stati 1
V ?
i i v OociííO v r.Of noci ani' ;ty aktivovaného proteinu C raci i ce ?cn i π
PC ie zkoíieí s I edovánín AU. Po otavení podnínok hodnch pH G ÍU3) vánoc1 ó nM každého 2t? 1 . _ UndrcU ph v .o až C Cd t a CH >. AkClvovany ·ideky pretetn C se zředí .4 ng/nl puíren příslušné Hodnoty pH a p ir.kubuje před nořenív aktivity. Vzorky oase a po ?0 hodinách při teplote 4 C p stu prováděných při inknt-aoi pH. Tato r-ěř
- 3 < -, ·, — - 7 4 » - - »·^ I # -* · i » (* 4- < -- - ·\, V” t — j — - ěchto testů jso?.’ sestaveny v tabulce I10
Tabulka I
Amidolytické rychlosti <111/mg aPC)
PH 0 hodin 30 hodin
6, 0 4 r 1,53
6,6 4,00 4,63
7,2 9, 16 6,63
r» ο í ,-t'« 11,26 9,26
3,4 7,05 5,16
9,0 3,53 o c-*-»
Maximální aktivita pro aPC je při pH 7,4, zatímco extrémní hodnoty pH 6 a 9,3 ukazují značně sníženou aktivitu. Ačkoli se jeví, že aPC si uchovává určitou amidolytickou aktivitu při extrémních hodnotách pH, naznačují tyto hodnoty, že samočinné odbourávání se sníží, vyhnutím se stavům hodnot pH, kdy aPC má maximální aktivitu.
Ke zjištění, zda je závislost amidolytické aktivity aPC na p.H funkcí vytváření EAK frsgnč-r.tS. se irikubují vzorky a PC při hodnotě pH 6,0, 7,5 a 9,0, 1,5 nc/nl při teplotě 4 C po dobu 13 hodin- Měří se množství vytvořených EAK integrací plochy pod vrcholy EAK HPLC stejně jako kvalitativním sledováním pásu EAK na SDS-PAGE. Tato data neukazují nárůst tvoření EAK v průběhu inkubace při hodnotě pH 6.U. zatímco re přibližme řež. nárůst při uounotě pH 7,5 a 50¾ nárůst při hodnotě pH 9,0. Přes zvýšené úrovně EAK fraonentfl ve vzorcích s hodnotou pH 7.5 a 9.0, ná prostředek stále vysokou AU aktivitu, je-li zkoušen při hodnotě pH 7.,4. Vytváření EAK fragmentu tudíž nutně nesouvisí se ztrátou anidolytické aktivity. Spíše musí EAK fragment zůstat dostatečně spojován se zbytkem těžkého řetězce aPC k zachování funkčnosti serinové proteázy. Při nejmenŠím vyšší obsah EAK fra-jsentu souvisí s vyšší amidolytickou aktivitou.
Eragment EAK obsahuje serin aktivního místa (zbytek 360) katalytické triády (včetně His 211 a Asp 257 nacházejících se v lízá konc ení t ez. κ e n o re řeze e ? . ·.. n ; - i i ρ i ,,, ,ί.,i . .- n. ....
vázán ke zbyt ku těžkého řei.ézce, může tento pro teo 1 yti ký střih vést ke snížené enzymatické aktivitě. K vyšetření dopadu různých množství EAK na aktivitu antikoagulantu se připraví několik rušných dávek aPC, lak popsáno v předchozích příkladech 1 a 2. Amydolitické testy se provedou s koncentracemi substrátu 22 až 199 uM ltS-2233, s končen traceni a PC 1,6 až 3,3 nM <75 až 150 ng/nl) 20 mM Tris, hodnota pH 7,4, 150 mM chloridu sodného. Výsledky testů jsou uvedeny v tabulce II.
Tabulka II
Percentuelní obsah EAK v závislosti na specifické aktivitě měi amidolytickými a antikoagulačními aktivitami
Specií ická aktivita
Číslo vzorku
EAK
AU /mg 1, 13 1,45 1,52 1,64
APTT/mg 2,11 1,70 3.37
1,90 0,73
Závislosti odbourávání na hodnotě pH je využito k vytvoření vzorků aPC, lež obsahují různé množství EAK- Tyto vzorky se připraví způsobem popsaným v příkladě 1 a 2. Vzorky s různým obsahem EAK řmagnetu se porovnají s nedotčeným aPC '<.3%· EAK iraznetn).Oro áou z těchto dávek se změří amide iyl.icke k i u*včet-ně hodnot- Em, ·9.·' a Vaaz, při *řech různý enzvmu a iso·; shrnuty v d-z 1 ce i·· hi ou i. ,r, n --.ba
V-^r.-r-cP : 20¾ >
[ aPC] na/ml i' -; ’
113 tm < m!i > 0,12 0.12
Vn -Z
91.02
3634
O-; < /rj i r.
150
113
*.l 75 0,1.3 9930 7,6
3 ¢100¾) 150 0,16 13142 10, 1
3 113 0,14 2337 1,3
«> 75 0, 13 316 0,2
Hodnoty Kra pro tri vzorky aPC jsou stejné v experimentálním kolísání a vykazují průměrnou hodnotu 0,16 raM substrátu. To naznačuje, že afinita vůči substrátu S-2233 není u degradovaného aPC přerušena. S překvapením má degradovaný materiál stále ještě AU aktivitu v podstatě podobnou jako nedotčený aPC.
Aktivovaný protein C může mít nedotčenou funkčnost vůči tripeptidovému substrátu CttS-2233) i při vysokém obsahu EAK fragmentu. In vivo může být protisráž1ivá aktivita měřena testem APTT. S překvapením neodpovídá vysoká AU aktivita protisrážlivé aktivitě. Zatímco AU aktivita s rostoucím obsahem EAK vzrůstá, APTT aktivita s rostoucím obsahem EAK klesá.
Účinek koncentrace soli na tvoření EAK fraonetu a na stabilitu aktivovaného proteinu C studuje inkubováníra vzorků aktipiOtdťiuu í.r pi i ;. '.itbiíy li, pak měřením procenta tvoření EAK fragnetu za hodinu. Koncentrace proteinu C při testech je 4 až 5 miligramu na nililit.r.· Všechny testy se provádějí v 5 až 2.Q mři fosfátovém pufru. Jako sůl přítomna;
soli je pcužit.f.» chloridu sodného (byla-li testy probíhají při teplotě 25 O. Procento tvoření EAK fragnetu sa hrdinu se měří integrací HPLC. Výsledky těchto testů jsou o tabulce IV.
-Γ - i- „IU ... Ό 1 i -tl iJ U i O 1_ V
Vliv koncentrace soli na tvoření EAK fragnetu
í 5 ‘ 'S koncentrace sol i % EAK vy tv r.iřen
6 - 4 430 íí 0,094
7 , ff 490 mM 0,145
6 - 4 59 mM 0,292
/ f * ‘ do rdi υ, 0 65
o 0,033
í i 9 0,092
t-d inu
Průmys 1 ová vy už i te 1 nost
Způsob k zabránění samočinnému odbourávání aktivovaného proteinu C taPCi nebo k jeho minimalizaci je využitelný při přípravě, čistění a nebo skladování aktivovaného proteinu C při nízkém r->H. například 6,3 az pH 7,0, inkubací aktivovaného proteinu C ve 3M močovině (úplného zotavení aktivity aktivovaného proteinu C se dosáhne po odstranění denaturantu) nebo inkubovánín aPC v p’řítomnosti extrémních koncentrací solí- Aktivovaný protein C je vhodný pro přípravu farmaceutických prostředků obsahujících aPC při nízkém pH, v denaturantu, nebo při extrémních koncentracích soli.

Claims (1)

  1. PATENTOVÉ N A R O K Y j 1- Způsob nininalizace odbourávání aktivovaného proto inu Č vyznačující se tím, že se aktivovaný protein C udržuje v rozteku s hodnotou pH 6,3 až 7,0.
    Ϊ. Způsob podle nároku 1, v y c. n a c u j i c í se t,
    -pl V f pr·: {· 7 ,-* pa C* ϊ 7 tv7 “i & T/O,'^ O 0*^0 M <J Η O Z??-' M
    Způsob podle nároku 2, v y z n a č u j í c í :e koncentrace soli v roztoku je pod 0,050 M.
    s e tím,
    4. Způsob podle nároku 2, vyznač se t ΐ ία :e koncentrace soli v uvedeném roztoku je pod 0,010 M.
    Způsob podle nároku 2, v y z n a č u j í c í solí v roztoku je chlorid sodný r' -- · vyznačuj i c udržuje v roztoku ob t ί η , že se aktivovaný protein C n denaturační či ni dlo.
    Stabilni farmaceutický prostředek vyznačujíc: ί m . že obsahuje akt iv -váný protein 0 třipravitelný zrfi· • .•cit nároku i až 6 v roztoku s h·-dr.· ! .-u pH 6-3 až 7,0.
    aci ΓΌΠ
    -ký prostředék podle nároku 7 , v yr: . že či.II.· obsahuje sul v kun.·! u0,050 M nebo nad 0,4 Mz n a c u ί rod 0 - 05 M-kati tni fanaaceutický prostředek podle nároku 8 ící se tím, že obsahuje sůl lít Stabilní farmaceutický prostředek pndle nároku 7 , v y znační í c í s e k ί π , že paťr je volen ze sonl.ru n za hrnujív-í Trie-aceLát. citrát sodný, citrát-alyrin a fosát sodný.
CZ9513A 1994-01-05 1995-01-03 Minimization method of activated protein c degradation and pharmaceutical preparation containing the activated protein c CZ1395A3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17783294A 1994-01-05 1994-01-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ1395A3 true CZ1395A3 (en) 1995-07-12

Family

ID=22650141

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ9513A CZ1395A3 (en) 1994-01-05 1995-01-03 Minimization method of activated protein c degradation and pharmaceutical preparation containing the activated protein c

Country Status (29)

Country Link
EP (2) EP1087011A3 (cs)
JP (1) JP3778588B2 (cs)
KR (1) KR950032287A (cs)
CN (1) CN1109891A (cs)
AT (1) ATE201045T1 (cs)
AU (1) AU1003195A (cs)
BR (1) BR9500017A (cs)
CA (1) CA2139468C (cs)
CO (1) CO4600680A1 (cs)
CZ (1) CZ1395A3 (cs)
DE (2) DE10299053I2 (cs)
DK (1) DK0662513T3 (cs)
ES (1) ES2156190T3 (cs)
FI (1) FI115635B (cs)
GR (1) GR3036277T3 (cs)
HU (1) HUT70465A (cs)
IL (1) IL112236A (cs)
LU (2) LU90993I2 (cs)
NL (1) NL300108I2 (cs)
NO (2) NO320157B1 (cs)
NZ (1) NZ270271A (cs)
PE (1) PE43995A1 (cs)
PL (1) PL180703B1 (cs)
PT (1) PT662513E (cs)
RU (1) RU2167936C2 (cs)
SI (1) SI0662513T1 (cs)
UA (1) UA39178C2 (cs)
YU (1) YU295A (cs)
ZA (1) ZA9514B (cs)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1557463A1 (en) * 1997-04-28 2005-07-27 Eli Lilly &amp; Company Improved methods for processing activated protein C
US6630137B1 (en) 1997-04-28 2003-10-07 Eli Lilly And Company Activated protein C formulations
UA55448C2 (uk) * 1997-04-28 2003-04-15 Елі Ліллі Енд Компані Стійка ліофілізована лікарська форма з активованим білком с (варіанти) та виріб, який її містить
US7204981B2 (en) 2000-03-28 2007-04-17 Eli Lilly And Company Methods of treating diseases with activated protein C
CA2410567A1 (en) 2000-05-24 2001-11-29 Eli Lilly And Company Formulations and use of activated protein c and protein c zymogen for treating hypercoagulable states

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT402262B (de) * 1991-06-20 1997-03-25 Immuno Ag Arzneimittel enthaltend aktiviertes protein c

Also Published As

Publication number Publication date
ATE201045T1 (de) 2001-05-15
JPH07206704A (ja) 1995-08-08
PT662513E (pt) 2001-08-30
IL112236A0 (en) 1995-03-30
FI950044A (fi) 1995-07-06
FI950044A0 (fi) 1995-01-04
PL180703B1 (pl) 2001-03-30
NO950018D0 (no) 1995-01-03
KR950032287A (ko) 1995-12-20
FI115635B (fi) 2005-06-15
NO950018L (no) 1995-07-06
LU90993I2 (fr) 2003-02-18
EP0662513B1 (en) 2001-05-09
EP0662513A1 (en) 1995-07-12
NO2006006I1 (no) 2006-05-15
CO4600680A1 (es) 1998-05-08
HUT70465A (en) 1995-10-30
DE10299053I2 (de) 2004-04-01
YU295A (sh) 1997-09-30
DK0662513T3 (da) 2001-05-28
PL306671A1 (en) 1995-07-10
ES2156190T3 (es) 2001-06-16
LU90992I2 (fr) 2003-02-18
CA2139468C (en) 2007-08-21
PE43995A1 (es) 1995-12-15
CN1109891A (zh) 1995-10-11
EP1087011A3 (en) 2002-02-06
NO320157B1 (no) 2005-11-07
NL300108I2 (nl) 2003-06-02
JP3778588B2 (ja) 2006-05-24
DE69520844T2 (de) 2001-11-08
AU1003195A (en) 1995-07-13
ZA9514B (en) 1996-07-03
IL112236A (en) 1999-12-31
SI0662513T1 (en) 2001-10-31
RU95100178A (ru) 1997-03-27
CA2139468A1 (en) 1995-07-06
NZ270271A (en) 1996-07-26
HU9500021D0 (en) 1995-03-28
GR3036277T3 (en) 2001-10-31
NL300108I1 (nl) 2003-02-03
BR9500017A (pt) 1995-10-03
DE69520844D1 (de) 2001-06-13
UA39178C2 (uk) 2001-06-15
EP1087011A2 (en) 2001-03-28
DE10299053I1 (de) 2003-05-22
RU2167936C2 (ru) 2001-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10883097B2 (en) Factor IX variants with clotting activity in absence of their cofactor and their use for treating bleeding disorders
CA2287267C (en) Improved methods for processing activated protein c
US6110721A (en) Polypeptides and coagulation therapy
EP0383417B1 (en) Vampire bat salivary Plasminogen activator vPA-alpha 1
CZ1395A3 (en) Minimization method of activated protein c degradation and pharmaceutical preparation containing the activated protein c
MX2007011961A (es) Inhibidores de neurotripsina.
US7060484B1 (en) Polypeptides and coagulation therapy
Ninjoor et al. Partial purification and characterization of an alkaline proteinase from the rabbit testis
AU769144B2 (en) Improved methods for processing activated protein C
Fock-Nüzel et al. Werner Müller-Esterl, Hans Fritz
EP1557463A1 (en) Improved methods for processing activated protein C
HRP20000826A2 (en) Human protein c polypeptide
CZ373799A3 (cs) Zlepšené způsoby zpracování aktivovaného proteinu C

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic