JPH07206704A - プロテインｃの分解を阻害する方法 - Google Patents
プロテインｃの分解を阻害する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は活性化プロテインＣの自己分解を
阻害または最小化する方法を提供することを目的とす
る。 【構成】 活性化プロテインＣの分解を最小化する方法
であって、上記方法が上記活性化プロテインＣをｐＨが
約６.３および約７.０の間の溶液中に維持することを特
徴とする方法。
阻害または最小化する方法を提供することを目的とす
る。 【構成】 活性化プロテインＣの分解を最小化する方法
であって、上記方法が上記活性化プロテインＣをｐＨが
約６.３および約７.０の間の溶液中に維持することを特
徴とする方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は酵素学、具体的には活性
化プロテインＣの分解を阻害する方法に関する。
化プロテインＣの分解を阻害する方法に関する。
【０００２】プロテインＣはセリンプロテアーゼであ
り、凝固カスケードにおいて活性化因子ＶaおよびＶIII
aにより止血を調節する役割を果す抗凝血物質を天然に
発生させる。ひとプロテインＣはインビボ、主として肝
臓中で４６１個のアミノ酸の単一のポリペプチドとして
製造される。この前駆体分子は、１）４２個のアミノ酸
シグナル配列の開裂；２）１本鎖チモーゲンから１５５
位でのリシン残基および１５６位でのアルギニン残基の
蛋白分解的切除による分子の２本鎖状分子形成（すなわ
ち、２６２個のアミノ酸残基のセリンプロテアーゼ含有
重鎖にジスルフィド架橋を介して結合した１５５個のア
ミノ酸残基の軽鎖）；３）９−ガンマ−カルボキシグル
タミン酸残基を生じる、軽鎖の最初の４２個のアミノ酸
内で同一群をなす９個のグルタミン酸残基のビタミンＫ
−依存性−カルボキシル置換；および４）４つの部位
（軽鎖で１つおよび重鎖で３つ）での炭水化物結合を含
む多部位翻訳後修正を受ける。重鎖はＡsp２５７、Ｈis
２１１およびＳer３６０の十分に確立されたセリンプロ
テアーゼ三構造（トリアド）を含む。最終的には、循環
する２本鎖チモーゲンはカルシウムイオンの存在下ホス
ホリピド表面のトロンビンによりインビボで活性化され
る。活性化は重鎖のＮ−末端のドデカペプチドの切除を
生じさせ、酵素活性を有する活性化プロテインＣ（ａＰ
Ｃ）を製造する。
り、凝固カスケードにおいて活性化因子ＶaおよびＶIII
aにより止血を調節する役割を果す抗凝血物質を天然に
発生させる。ひとプロテインＣはインビボ、主として肝
臓中で４６１個のアミノ酸の単一のポリペプチドとして
製造される。この前駆体分子は、１）４２個のアミノ酸
シグナル配列の開裂；２）１本鎖チモーゲンから１５５
位でのリシン残基および１５６位でのアルギニン残基の
蛋白分解的切除による分子の２本鎖状分子形成（すなわ
ち、２６２個のアミノ酸残基のセリンプロテアーゼ含有
重鎖にジスルフィド架橋を介して結合した１５５個のア
ミノ酸残基の軽鎖）；３）９−ガンマ−カルボキシグル
タミン酸残基を生じる、軽鎖の最初の４２個のアミノ酸
内で同一群をなす９個のグルタミン酸残基のビタミンＫ
−依存性−カルボキシル置換；および４）４つの部位
（軽鎖で１つおよび重鎖で３つ）での炭水化物結合を含
む多部位翻訳後修正を受ける。重鎖はＡsp２５７、Ｈis
２１１およびＳer３６０の十分に確立されたセリンプロ
テアーゼ三構造（トリアド）を含む。最終的には、循環
する２本鎖チモーゲンはカルシウムイオンの存在下ホス
ホリピド表面のトロンビンによりインビボで活性化され
る。活性化は重鎖のＮ−末端のドデカペプチドの切除を
生じさせ、酵素活性を有する活性化プロテインＣ（ａＰ
Ｃ）を製造する。
【０００３】ａＰＣを大量および高濃度で作用させる
と、重鎖の３０８位でのリジン残基でタンパク分解的切
除が観察された。この切除により生成した新規なＮ−末
端配列はＧlu−Ａla−Ｌysで始まり、重鎖のＣ−末端か
ら「ＥＡＫフラグメント」と称される１１１個のアミノ
酸フラグメントを得た。ＥＡＫフラグメントは、ジスル
フィド結合を通じて軽鎖または重鎖のＮ−末端部に共有
結合的に結合しない。ＥＡＫフラグメントはまた、セリ
ンプロテアーゼの活性部位セリンを含むが、Ａspまたは
Ｈis残基ではない。すなわち、ＥＡＫフラグメントを有
するプロテインＣ製剤は抗凝血活性を変化させることが
判明した。本発明は、変性剤中または極端な塩濃度にお
いて、低いｐＨで分子を維持することによってプロテイ
ンＣ分子の分解を阻害するかまたは最小にするための方
法を含む。
と、重鎖の３０８位でのリジン残基でタンパク分解的切
除が観察された。この切除により生成した新規なＮ−末
端配列はＧlu−Ａla−Ｌysで始まり、重鎖のＣ−末端か
ら「ＥＡＫフラグメント」と称される１１１個のアミノ
酸フラグメントを得た。ＥＡＫフラグメントは、ジスル
フィド結合を通じて軽鎖または重鎖のＮ−末端部に共有
結合的に結合しない。ＥＡＫフラグメントはまた、セリ
ンプロテアーゼの活性部位セリンを含むが、Ａspまたは
Ｈis残基ではない。すなわち、ＥＡＫフラグメントを有
するプロテインＣ製剤は抗凝血活性を変化させることが
判明した。本発明は、変性剤中または極端な塩濃度にお
いて、低いｐＨで分子を維持することによってプロテイ
ンＣ分子の分解を阻害するかまたは最小にするための方
法を含む。
【０００４】本発明のために、この明細書中に開示され
記載される場合、下記の用語は次のように定義される。 ａＰＣ− 活性化ひとプロテインＣ ＡＰＴＴ− 活性化部分的トロンボプラスチン時間 ＡＵ− アミド分解単位 ＢＭＥ− β−メルカプトエタノール ＣＨＥＳ− ２−［Ｎ−シクロヘキシルアミノ］エタン
スルホン酸 ＥＡＫフラグメント− プロテインＣの重鎖の３０８位
での切除から生じる１１１個のアミノ酸フラグメント ＥＤＴＡ− エチレンジアミン４酢酸 ＨＥＰＥＳ− Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ'−２−エタンスルホン酸 ＨＰＣ− ひとプロテインＣチモーゲン ＭＥＡ− ２−アミノエタノール ＭＥＳ− ２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸 新生タンパク質− 翻訳後修正より以前に、ｍＲＮＡ転
写の翻訳時に産生したポリペプチド。しかしながら、グ
ルタミン酸残基のγ−カルボキシル化およびアスパラギ
ン酸残基のヒドロキシル化のような翻訳後修正が生じ始
めた後、タンパク質はｍＲＮＡ転写物から十分に翻訳さ
れ得る。プロテインＣ活性− タンパク分解、アミド分
解、エステロール分解および生物学的（抗凝血またはプ
ロフィブリノール分解的）活性に関与するひとプロテイ
ンＣのすべての性質。プロテインＣ抗凝血およびアミド
分解活性のための試験方法は当分野で公知である（Grin
nellら、1987, Bio/Technology 5:1189-1192参照）。 ｒＨＰＣ− 組換え産生ひとプロテインＣチモーゲン。 チモーゲン− タンパク分解酵素の酵素不活性前駆体。
この明細書中で使用される場合、１本鎖であるか２本鎖
であるかにかかわらず、プロテインＣの分泌された不活
性形態を表す。
記載される場合、下記の用語は次のように定義される。 ａＰＣ− 活性化ひとプロテインＣ ＡＰＴＴ− 活性化部分的トロンボプラスチン時間 ＡＵ− アミド分解単位 ＢＭＥ− β−メルカプトエタノール ＣＨＥＳ− ２−［Ｎ−シクロヘキシルアミノ］エタン
スルホン酸 ＥＡＫフラグメント− プロテインＣの重鎖の３０８位
での切除から生じる１１１個のアミノ酸フラグメント ＥＤＴＡ− エチレンジアミン４酢酸 ＨＥＰＥＳ− Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ'−２−エタンスルホン酸 ＨＰＣ− ひとプロテインＣチモーゲン ＭＥＡ− ２−アミノエタノール ＭＥＳ− ２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸 新生タンパク質− 翻訳後修正より以前に、ｍＲＮＡ転
写の翻訳時に産生したポリペプチド。しかしながら、グ
ルタミン酸残基のγ−カルボキシル化およびアスパラギ
ン酸残基のヒドロキシル化のような翻訳後修正が生じ始
めた後、タンパク質はｍＲＮＡ転写物から十分に翻訳さ
れ得る。プロテインＣ活性− タンパク分解、アミド分
解、エステロール分解および生物学的（抗凝血またはプ
ロフィブリノール分解的）活性に関与するひとプロテイ
ンＣのすべての性質。プロテインＣ抗凝血およびアミド
分解活性のための試験方法は当分野で公知である（Grin
nellら、1987, Bio/Technology 5:1189-1192参照）。 ｒＨＰＣ− 組換え産生ひとプロテインＣチモーゲン。 チモーゲン− タンパク分解酵素の酵素不活性前駆体。
この明細書中で使用される場合、１本鎖であるか２本鎖
であるかにかかわらず、プロテインＣの分泌された不活
性形態を表す。
【０００５】本記載に使用したアミノ酸の略語のすべて
は、３７Ｃ.Ｆ.Ｒ§1.822(b)(2)(1990)に規定され、ア
メリカ合衆国特許庁により容認されている。
は、３７Ｃ.Ｆ.Ｒ§1.822(b)(2)(1990)に規定され、ア
メリカ合衆国特許庁により容認されている。
【０００６】本発明は活性化プロテインＣの自己分解を
阻害するか、または最小にするための方法に関する。本
発明は低いｐＨ、例えば、ｐＨ約６.３からｐＨ約７.０
での活性化プロテインＣのプロセッシング、精製および
／または貯蔵を行うことにより最も良く例示される。ａ
ＰＣの自己分解はまた、３Ｍウレア中、または極端な塩
濃度の存在下ａＰＣをインキュベートすることにより最
小化し得る（ａＰＣ活性の完全な回収は変性剤の除去後
に得られる）。ここにいう極端な塩濃度とは、約０.４
モル濃度より高いかまたは約０.０５モルより低い塩濃
度を意味する。本発明はまた、変性剤中か、または極端
な塩濃度で、低いｐＨにａＰＣを維持するａＰＣ製剤を
含む。
阻害するか、または最小にするための方法に関する。本
発明は低いｐＨ、例えば、ｐＨ約６.３からｐＨ約７.０
での活性化プロテインＣのプロセッシング、精製および
／または貯蔵を行うことにより最も良く例示される。ａ
ＰＣの自己分解はまた、３Ｍウレア中、または極端な塩
濃度の存在下ａＰＣをインキュベートすることにより最
小化し得る（ａＰＣ活性の完全な回収は変性剤の除去後
に得られる）。ここにいう極端な塩濃度とは、約０.４
モル濃度より高いかまたは約０.０５モルより低い塩濃
度を意味する。本発明はまた、変性剤中か、または極端
な塩濃度で、低いｐＨにａＰＣを維持するａＰＣ製剤を
含む。
【０００７】止血を維持するプロテインＣの役割は、広
範囲にわたる種々の血管系疾患のための治療剤としてこ
の化合物に強い関心を引き付けるものである。工業的規
模でのひとプロテインＣの高含量および高濃度での製造
は、分子が抗凝血活性の減少につながる自己分解を受け
得るという事実を明らかにした。ａＰＣの自己分解は重
鎖のＣ−末端から「ＥＡＫフラグメント」と称される１
１１個のアミノ酸フラグメントの生成をもたらす。ＥＡ
Ｋフラグメントはジスルフィド結合を介して軽鎖または
重鎖のＮ−末端部に共有結合的に結合していない。ＥＡ
Ｋフラグメントはまた、ＡspまたはＨis残基ではない、
セリンプロテアーゼの活性部位セリン残基を含む。すな
わち、ＥＡＫフラグメントを含むプロテインＣ製剤はタ
ンパク分解的切除の存在によって抗凝血活性を変化させ
た。
範囲にわたる種々の血管系疾患のための治療剤としてこ
の化合物に強い関心を引き付けるものである。工業的規
模でのひとプロテインＣの高含量および高濃度での製造
は、分子が抗凝血活性の減少につながる自己分解を受け
得るという事実を明らかにした。ａＰＣの自己分解は重
鎖のＣ−末端から「ＥＡＫフラグメント」と称される１
１１個のアミノ酸フラグメントの生成をもたらす。ＥＡ
Ｋフラグメントはジスルフィド結合を介して軽鎖または
重鎖のＮ−末端部に共有結合的に結合していない。ＥＡ
Ｋフラグメントはまた、ＡspまたはＨis残基ではない、
セリンプロテアーゼの活性部位セリン残基を含む。すな
わち、ＥＡＫフラグメントを含むプロテインＣ製剤はタ
ンパク分解的切除の存在によって抗凝血活性を変化させ
た。
【０００８】ＥＡＫフラグメントの生成を誘導する自己
分解を減少または阻害するために、完全な活性化プロテ
インＣ分子は、約６.３および約７.０間のｐＨで維持さ
れ得る。この分子はすべての精製および活性化工程中お
よび最後の製剤溶液中この範囲にｐＨを保つことができ
る。多種類の緩衝液系が溶液のｐＨを維持するために使
用され得る。代表的な緩衝液系は、トリス−酢酸塩、ク
エン酸ナトリウム、クエン酸塩−グリシンおよびリン酸
ナトリウムを含む。当業者には多くの他の緩衝液系が入
手可能で、本発明の方法に用い得ることが理解するであ
ろう。
分解を減少または阻害するために、完全な活性化プロテ
インＣ分子は、約６.３および約７.０間のｐＨで維持さ
れ得る。この分子はすべての精製および活性化工程中お
よび最後の製剤溶液中この範囲にｐＨを保つことができ
る。多種類の緩衝液系が溶液のｐＨを維持するために使
用され得る。代表的な緩衝液系は、トリス−酢酸塩、ク
エン酸ナトリウム、クエン酸塩−グリシンおよびリン酸
ナトリウムを含む。当業者には多くの他の緩衝液系が入
手可能で、本発明の方法に用い得ることが理解するであ
ろう。
【０００９】本発明の態様は、極端な塩濃度の溶液中に
活性化プロテインＣ分子を維持することによりＥＡＫフ
ラグメントの生成の阻害または減少に関する。例えば、
リン酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ７.０で、緩衝液中に塩
が存在しない時に、ＥＡＫフラグメントの生成は最小で
ある。しかしながら、リン酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ
７.０で、緩衝液中塩化ナトリウム約０.４Ｍの濃度であ
るとき、ＥＡＫフラグメントの生成はまた最小である。
これらの２つの塩濃度間で、ＥＡＫフラグメント生成が
種々の割合で起こる；しかし、当業者は塩濃度を０.０
５Ｍより低いかまたは塩濃度を０.４Ｍより高く維持す
ることが、最も容易にＥＡＫフラグメントの生成を阻害
または最小にすることが理解するであろう。０.０５Ｍ
より低い他の塩濃度（例えば、０.０１Ｍまたは０.００
５Ｍ）がより好ましいが、溶液のｐＨが溶液に塩を加え
ないでｐＨ約７.０に維持される場合に、最良の医薬製
剤が調製される。当業者は種々の塩が製薬工程および製
剤化に使用し得ることが理解するであろう。本発明で使
用され得る代表的な塩は、塩化カリウム、塩化カルシウ
ムおよび、最も好ましくは塩化ナトリウムを含む。
活性化プロテインＣ分子を維持することによりＥＡＫフ
ラグメントの生成の阻害または減少に関する。例えば、
リン酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ７.０で、緩衝液中に塩
が存在しない時に、ＥＡＫフラグメントの生成は最小で
ある。しかしながら、リン酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ
７.０で、緩衝液中塩化ナトリウム約０.４Ｍの濃度であ
るとき、ＥＡＫフラグメントの生成はまた最小である。
これらの２つの塩濃度間で、ＥＡＫフラグメント生成が
種々の割合で起こる；しかし、当業者は塩濃度を０.０
５Ｍより低いかまたは塩濃度を０.４Ｍより高く維持す
ることが、最も容易にＥＡＫフラグメントの生成を阻害
または最小にすることが理解するであろう。０.０５Ｍ
より低い他の塩濃度（例えば、０.０１Ｍまたは０.００
５Ｍ）がより好ましいが、溶液のｐＨが溶液に塩を加え
ないでｐＨ約７.０に維持される場合に、最良の医薬製
剤が調製される。当業者は種々の塩が製薬工程および製
剤化に使用し得ることが理解するであろう。本発明で使
用され得る代表的な塩は、塩化カリウム、塩化カルシウ
ムおよび、最も好ましくは塩化ナトリウムを含む。
【００１０】本発明の別の態様は、変性剤の存在下精製
および／または製剤化を行うことにより活性化プロテイ
ンＣの自己分解を阻害または減少させることに関する。
多くの異なった変性剤が使用され得るが、最も好ましい
試剤は約３Ｍの濃度のウレアである。
および／または製剤化を行うことにより活性化プロテイ
ンＣの自己分解を阻害または減少させることに関する。
多くの異なった変性剤が使用され得るが、最も好ましい
試剤は約３Ｍの濃度のウレアである。
【００１１】本発明は、活性化プロテインＣが製造され
得る方法に限定されるものではない。組み換ＤＮＡ技術
を用いて活性化プロテインＣ分子を製造することが最も
有効であるが、大規模タンパク質精製における最近の進
歩は、ひと血清からかなりの活性化プロテインＣを分離
することを可能にした。このような大量のプロテインＣ
を得ることは、高濃度の活性化プロテインＣを一度に処
理することを可能にした。上記のように、発明者は約５
０マイクログラム／ミリリットル濃度より高い活性化プ
ロテインＣの濃度の低下とともに、抗凝血活性における
活性化プロテインＣ分子の自己分解を示すことを知っ
た。最も重要なことに、活性化プロテインＣの濃度が減
少するにつれて溶液中で自己分解の割合が増大した。工
業的レベルでは、非常に低濃度のタンパク質の大規模な
精製工程を実施するのは効果的ではない。
得る方法に限定されるものではない。組み換ＤＮＡ技術
を用いて活性化プロテインＣ分子を製造することが最も
有効であるが、大規模タンパク質精製における最近の進
歩は、ひと血清からかなりの活性化プロテインＣを分離
することを可能にした。このような大量のプロテインＣ
を得ることは、高濃度の活性化プロテインＣを一度に処
理することを可能にした。上記のように、発明者は約５
０マイクログラム／ミリリットル濃度より高い活性化プ
ロテインＣの濃度の低下とともに、抗凝血活性における
活性化プロテインＣ分子の自己分解を示すことを知っ
た。最も重要なことに、活性化プロテインＣの濃度が減
少するにつれて溶液中で自己分解の割合が増大した。工
業的レベルでは、非常に低濃度のタンパク質の大規模な
精製工程を実施するのは効果的ではない。
【００１２】活性化プロテインＣ生産の産業上および製
薬的利用において、５０マイクログラムをはるかに超え
る濃度の分子の処理が必要であり、本発明は生成物活性
における著しい減少を伴わず大量の生成物の製造を当業
者に可能とする。本発明の処方化は、さらに当分野で公
知のものより長期間の安定な活性化プロテインＣ溶液の
貯蔵を可能にする。
薬的利用において、５０マイクログラムをはるかに超え
る濃度の分子の処理が必要であり、本発明は生成物活性
における著しい減少を伴わず大量の生成物の製造を当業
者に可能とする。本発明の処方化は、さらに当分野で公
知のものより長期間の安定な活性化プロテインＣ溶液の
貯蔵を可能にする。
【００１３】本発明を当業者が実施すれば、本発明の方
法が自己分解による生成物損失を受ける恐れなく、かつ
て用いられた濃度より高濃度で大量の活性化プロテイン
Ｃを製造させることが理解するであろう。さらに、本発
明の安定医薬製剤は、容易にTaylor，Jr.ら、アメリカ
特許第５,００９,８８９号に記載された（その全ての記
載をここに引用してこの明細書の記載とする）身体的疾
患にかかっている患者を処置するために使用され得る。
法が自己分解による生成物損失を受ける恐れなく、かつ
て用いられた濃度より高濃度で大量の活性化プロテイン
Ｃを製造させることが理解するであろう。さらに、本発
明の安定医薬製剤は、容易にTaylor，Jr.ら、アメリカ
特許第５,００９,８８９号に記載された（その全ての記
載をここに引用してこの明細書の記載とする）身体的疾
患にかかっている患者を処置するために使用され得る。
【００１４】以下の実施例は本発明の方法を具体的に説
明するものであるが、これらに限定されるものではな
い。実施例１ ひとプロテインＣの製造 組換えひとプロテインＣ（ｒＨＰＣ）を、Yan，アメリ
カ特許第４,９８１,９５２号に記載された（その全ての
記載をここに引用してこの明細書の記載とする）当業者
に公知の技術によりひと腎臓２９３細胞中で製造した。
遺伝子をコードしたひとプロテインＣは、Bangら、アメ
リカ特許第４,７７５,６２４号（その全ての記載をここ
に引用してこの明細書の記載とする）に開示され、特許
されている。２９３細胞にひとプロテインＣを発現する
ために用いられたプラスミドは、Bangら、アメリカ特許
第４,９９２,３７３号に記載（その全ての記載をここに
引用してこの明細書の記載とする）のプラスミドｐＬＰ
Ｃである。プラスミドｐＬＰＣの構築はまた、ヨーロッ
パ特許公開０ ４４５ ９３９号、およびGrinnellら、19
87，Bio/Technology 5:1189-1192中に記載（それらの全
ての記載をここに引用してこの明細書の記載とする）さ
れている。要約すれば、このプラスミドは２９３細胞に
形質転換され、ついで安定な形質転換細胞を血清−無含
有培地中で同定し、継代培養および生長させた。発酵
後、細胞−無含有培地を限外濾過により得た。
明するものであるが、これらに限定されるものではな
い。実施例１ ひとプロテインＣの製造 組換えひとプロテインＣ（ｒＨＰＣ）を、Yan，アメリ
カ特許第４,９８１,９５２号に記載された（その全ての
記載をここに引用してこの明細書の記載とする）当業者
に公知の技術によりひと腎臓２９３細胞中で製造した。
遺伝子をコードしたひとプロテインＣは、Bangら、アメ
リカ特許第４,７７５,６２４号（その全ての記載をここ
に引用してこの明細書の記載とする）に開示され、特許
されている。２９３細胞にひとプロテインＣを発現する
ために用いられたプラスミドは、Bangら、アメリカ特許
第４,９９２,３７３号に記載（その全ての記載をここに
引用してこの明細書の記載とする）のプラスミドｐＬＰ
Ｃである。プラスミドｐＬＰＣの構築はまた、ヨーロッ
パ特許公開０ ４４５ ９３９号、およびGrinnellら、19
87，Bio/Technology 5:1189-1192中に記載（それらの全
ての記載をここに引用してこの明細書の記載とする）さ
れている。要約すれば、このプラスミドは２９３細胞に
形質転換され、ついで安定な形質転換細胞を血清−無含
有培地中で同定し、継代培養および生長させた。発酵
後、細胞−無含有培地を限外濾過により得た。
【００１５】ひとプロテインＣをYan，アメリカ特許第
４,９８１,９５２号記載（その全ての記載をここに引用
してこの明細書の記載とする）の方法を適用することに
より培養液から分離した。澄明な媒体をＥＤＴＡ中４ｍ
Ｍ濃度で調製した後、陰イオン交換樹脂（Fast−Flow
Ｑ、Pharmacia）に吸着させた。カラムの４倍量の２０
ｍＭトリス、２００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７.４および２
０ｍＭトリス、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７.４のカラ
ムの２倍量で洗浄後、結合した組み換ひとプロテインＣ
チモーゲンを２０ｍＭトリス、１５０ｍＭＮａＣｌ、１
０ｍＭＣａＣｌ2、ｐＨ７.４で溶出した。溶出したタン
パク質は、溶出後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド分解ゲ
ル電気泳動により測定すると、純度９５％より大であっ
た。
４,９８１,９５２号記載（その全ての記載をここに引用
してこの明細書の記載とする）の方法を適用することに
より培養液から分離した。澄明な媒体をＥＤＴＡ中４ｍ
Ｍ濃度で調製した後、陰イオン交換樹脂（Fast−Flow
Ｑ、Pharmacia）に吸着させた。カラムの４倍量の２０
ｍＭトリス、２００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７.４および２
０ｍＭトリス、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７.４のカラ
ムの２倍量で洗浄後、結合した組み換ひとプロテインＣ
チモーゲンを２０ｍＭトリス、１５０ｍＭＮａＣｌ、１
０ｍＭＣａＣｌ2、ｐＨ７.４で溶出した。溶出したタン
パク質は、溶出後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド分解ゲ
ル電気泳動により測定すると、純度９５％より大であっ
た。
【００１６】さらにタンパク質の精製を、ＮａＣｌ中に
タンパク質３Ｍに調製、続いて２０ｍＭトリス、３ＭＮ
ａＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ2、ｐＨ７.４中で平衡化させ
た疎水性相互作用樹脂（Toyopearl phenyl ６５０Ｍ、T
osoHaas）に吸着させることにより行った。ＣａＣｌ2を
含まないカラムの２倍容量の平衡化緩衝液で洗浄後、組
み換ひとプロテインＣを、２０ｍＭトリス、ｐＨ７.４
で溶出させた。溶出したタンパク質を残留カルシウムの
除去による活性化のために調製した。組み換ひとプロテ
インＣをカルシウムを除去するために金属親和性カラム
（Chelex−１００、Bio-Rad）を通過させ、再度陰イオ
ン交換体（Fast Flow Ｑ、Fharmacia）に結合させた。
これらのカラムの両方を直列に配列し、２０ｍＭトリ
ス、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７.４
中で平衡化させた。タンパク質を充填後、Chelex−１０
０カラムを、カラムと同容量の緩衝液で洗浄した後、こ
のカラムを直列から切り離した。陰イオン交換カラム
は、カラムの３倍量の平衡化した緩衝液で洗浄した後、
０.４ＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−酢酸塩、ｐＨ６.５
でタンパク質を溶出させた。組み換ひとプロテインＣお
よび組換え活性化プロテインＣ溶液のタンパク質濃度
を、それぞれＵＶ２８０ｎｍ吸光度を測定し、それぞれ
Ｅ（０.１％）＝１.８５または１.９５であった。
タンパク質３Ｍに調製、続いて２０ｍＭトリス、３ＭＮ
ａＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ2、ｐＨ７.４中で平衡化させ
た疎水性相互作用樹脂（Toyopearl phenyl ６５０Ｍ、T
osoHaas）に吸着させることにより行った。ＣａＣｌ2を
含まないカラムの２倍容量の平衡化緩衝液で洗浄後、組
み換ひとプロテインＣを、２０ｍＭトリス、ｐＨ７.４
で溶出させた。溶出したタンパク質を残留カルシウムの
除去による活性化のために調製した。組み換ひとプロテ
インＣをカルシウムを除去するために金属親和性カラム
（Chelex−１００、Bio-Rad）を通過させ、再度陰イオ
ン交換体（Fast Flow Ｑ、Fharmacia）に結合させた。
これらのカラムの両方を直列に配列し、２０ｍＭトリ
ス、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７.４
中で平衡化させた。タンパク質を充填後、Chelex−１０
０カラムを、カラムと同容量の緩衝液で洗浄した後、こ
のカラムを直列から切り離した。陰イオン交換カラム
は、カラムの３倍量の平衡化した緩衝液で洗浄した後、
０.４ＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−酢酸塩、ｐＨ６.５
でタンパク質を溶出させた。組み換ひとプロテインＣお
よび組換え活性化プロテインＣ溶液のタンパク質濃度
を、それぞれＵＶ２８０ｎｍ吸光度を測定し、それぞれ
Ｅ（０.１％）＝１.８５または１.９５であった。
【００１７】実施例２ 組換えひとプロテインＣの活性化 ウシのトロンビンを、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳの存在下、
ｐＨ７.５、４℃にて活性化したＣＨ−セファロース４
Ｂ（Ｐharmacia）に結合させた。およそ５０００単位ト
ロンビン／ｍｌ樹脂を用いてカラムに充填した樹脂上で
結合反応させた。トロンビン溶液をおよそ３時間、カラ
ムの中を循環させた後、循環溶液０.６ｍｌ／ｌの濃度
でＭＥＡを加えた。ＭＥＡ−含有溶液はさらに１０−１
２時間循環させ、樹脂上の未反応アミンを確実に完全に
封鎖した。封鎖後、トロンビン−結合樹脂をカラムの１
０倍容量の１ＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリス、ｐＨ６.５
で洗浄し、非特異的結合タンパク質をすべて除去し、活
性化緩衝液中で平衡化した後活性化反応に用いた。
ｐＨ７.５、４℃にて活性化したＣＨ−セファロース４
Ｂ（Ｐharmacia）に結合させた。およそ５０００単位ト
ロンビン／ｍｌ樹脂を用いてカラムに充填した樹脂上で
結合反応させた。トロンビン溶液をおよそ３時間、カラ
ムの中を循環させた後、循環溶液０.６ｍｌ／ｌの濃度
でＭＥＡを加えた。ＭＥＡ−含有溶液はさらに１０−１
２時間循環させ、樹脂上の未反応アミンを確実に完全に
封鎖した。封鎖後、トロンビン−結合樹脂をカラムの１
０倍容量の１ＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリス、ｐＨ６.５
で洗浄し、非特異的結合タンパク質をすべて除去し、活
性化緩衝液中で平衡化した後活性化反応に用いた。
【００１８】精製ｒＨＰＣをＥＤＴＡ（残留カルシウム
をキレート化するために）中で５ｍＭに調製し、２０ｍ
Ｍトリス、ｐＨ７.４または２０ｍＭトリス−酢酸塩、
ｐＨ６.５で２ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。これを５
０ｍＭＮａＣｌおよび２０ｍＭトリス、ｐＨ７.４また
は２０ｍＭトリス−酢酸塩、ｐＨ６.５のどちらかで３
７℃にて平衡化したトロンビンカラムを通過させた。流
速はｒＨＰＣおよびトロンビン樹脂の間の接触時間がお
よそ２０分間であるように調節した。溶出物を集め、直
ちにアミド分解活性を検定した。ａＰＣの標準曲線と比
較して、物質が比活性（アミド分解）を有さない場合、
ｒＨＰＣの活性化を完成させるためにトロンビンカラム
上で再循環させた。その後、次の工程までの間、７.４
または６.５のいずれかのｐＨで上記と同じ２０ｍＭ緩
衝液で物質の１：１希釈を行い、ａＰＣを低濃度に保
ち、次の処理工程に用いた。
をキレート化するために）中で５ｍＭに調製し、２０ｍ
Ｍトリス、ｐＨ７.４または２０ｍＭトリス−酢酸塩、
ｐＨ６.５で２ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。これを５
０ｍＭＮａＣｌおよび２０ｍＭトリス、ｐＨ７.４また
は２０ｍＭトリス−酢酸塩、ｐＨ６.５のどちらかで３
７℃にて平衡化したトロンビンカラムを通過させた。流
速はｒＨＰＣおよびトロンビン樹脂の間の接触時間がお
よそ２０分間であるように調節した。溶出物を集め、直
ちにアミド分解活性を検定した。ａＰＣの標準曲線と比
較して、物質が比活性（アミド分解）を有さない場合、
ｒＨＰＣの活性化を完成させるためにトロンビンカラム
上で再循環させた。その後、次の工程までの間、７.４
または６.５のいずれかのｐＨで上記と同じ２０ｍＭ緩
衝液で物質の１：１希釈を行い、ａＰＣを低濃度に保
ち、次の処理工程に用いた。
【００１９】物質ａＰＣから浸出したトロンビンの除去
は、１５０ｍＭＮａＣｌを含む活性化緩衝液（２０ｍＭ
トリス、ｐＨ７.４または２０ｍＭトリス−酢酸塩、ｐ
Ｈ６.５のいずれか）中で平衡化された陰イオン交換樹
脂（Fast Flow Ｑ、Pharmacia）にａＰＣを結合させる
ことにより行った。トロンビンはこれらの条件下で陰イ
オン交換樹脂と相互作用しないが、カラムを通過させ、
試料用溶出液とする。ａＰＣをカラムに充填すると、カ
ラムの２−６倍の容量の２０ｍＭ平衡化した緩衝液で洗
浄し、２０ｍＭトリス−酢酸塩、ｐＨ６.５または２０
ｍＭトリス、ｐＨ７.４のいずれか中０.４ＭＮａＣｌを
用いる工程溶出液で結合ａＰＣを溶出させた。カラムの
多量の洗浄はドデカペプチドのより完全な除去を容易に
した。このカラムから溶出された物質を凍結溶液（−２
０℃）中または凍結乾燥した粉末としてのいずれかで貯
蔵した。
は、１５０ｍＭＮａＣｌを含む活性化緩衝液（２０ｍＭ
トリス、ｐＨ７.４または２０ｍＭトリス−酢酸塩、ｐ
Ｈ６.５のいずれか）中で平衡化された陰イオン交換樹
脂（Fast Flow Ｑ、Pharmacia）にａＰＣを結合させる
ことにより行った。トロンビンはこれらの条件下で陰イ
オン交換樹脂と相互作用しないが、カラムを通過させ、
試料用溶出液とする。ａＰＣをカラムに充填すると、カ
ラムの２−６倍の容量の２０ｍＭ平衡化した緩衝液で洗
浄し、２０ｍＭトリス−酢酸塩、ｐＨ６.５または２０
ｍＭトリス、ｐＨ７.４のいずれか中０.４ＭＮａＣｌを
用いる工程溶出液で結合ａＰＣを溶出させた。カラムの
多量の洗浄はドデカペプチドのより完全な除去を容易に
した。このカラムから溶出された物質を凍結溶液（−２
０℃）中または凍結乾燥した粉末としてのいずれかで貯
蔵した。
【００２０】ａＰＣのアミド分解活性（ＡＵ）を、ベッ
クマンＤＵ−７４００ダイオード配列分光光度計を用い
てカビ・ビトラム社製合成基質Ｈ−Ｄ−Ｐhe−Ｐip−Ａ
rg−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２３８）からのｐ−ニ
トロアニリンの遊離により測定した。活性化プロテイン
Ｃの一単位を、９６２０Ｍ-1ｃｍ-1の４０５ｎｍでのｐ
−ニトロアニリンの吸光係数を用いて、１分間に、２５
℃、ｐＨ７.４にてｐ−ニトロアニリン１μモルを遊離
させるのに必要な酵素量として定義した。
クマンＤＵ−７４００ダイオード配列分光光度計を用い
てカビ・ビトラム社製合成基質Ｈ−Ｄ−Ｐhe−Ｐip−Ａ
rg−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２３８）からのｐ−ニ
トロアニリンの遊離により測定した。活性化プロテイン
Ｃの一単位を、９６２０Ｍ-1ｃｍ-1の４０５ｎｍでのｐ
−ニトロアニリンの吸光係数を用いて、１分間に、２５
℃、ｐＨ７.４にてｐ−ニトロアニリン１μモルを遊離
させるのに必要な酵素量として定義した。
【００２１】活性化プロテインＣの抗凝血活性を、活性
化部分トロンボプラスティン時間（ＡＰＴＴ）凝血検定
法における凝血時間の延長を測定することにより決定し
た。標準曲線は、１２５−１０００ｎｇ／ｍｌからプロ
テインＣ濃度の範囲に及ぶ希釈緩衝液（１ｍｇ／ｍｌラ
ジオイムノアッセイグレイドＢＳＡ、２０ｍＭトリス、
ｐＨ７.４、１５０ｍＭＮａＣｌ、０.０２％ＮａＮ3）
にて作成し、一方、試料はこの濃度範囲のいくつかの希
釈で調製した。それぞれ試料キュベットに、冷却した馬
の血漿および再製活性化半トロンボプラスティン時試薬
（reconstituted activated partial thromboplastin：
ＡＰＴＴ試薬、Ｓigma）を加え、３７℃で５分間インキ
ュベートした。インキュベート後、適当な試料または標
準液５０μｌを各キュベットに加えた。希釈緩衝液を試
料または標準液の代わりに用いて基底凝血時間を測定し
た。フィブロメーターのタイマー（ＣｏＡスクリーナー
止血装置、American Labor）を、それぞれ試料または標
準液に３０ｍＭＣａＣｌ2を５０μｌ、３７℃にて加え
た後直ちに始動させた。試料中の活性化プロテインＣ濃
度を標準曲線の線形回帰方程式から計算した。ここに記
載の凝血時間は標準曲線試料を含むそれぞれ３個の最小
値の平均値である。
化部分トロンボプラスティン時間（ＡＰＴＴ）凝血検定
法における凝血時間の延長を測定することにより決定し
た。標準曲線は、１２５−１０００ｎｇ／ｍｌからプロ
テインＣ濃度の範囲に及ぶ希釈緩衝液（１ｍｇ／ｍｌラ
ジオイムノアッセイグレイドＢＳＡ、２０ｍＭトリス、
ｐＨ７.４、１５０ｍＭＮａＣｌ、０.０２％ＮａＮ3）
にて作成し、一方、試料はこの濃度範囲のいくつかの希
釈で調製した。それぞれ試料キュベットに、冷却した馬
の血漿および再製活性化半トロンボプラスティン時試薬
（reconstituted activated partial thromboplastin：
ＡＰＴＴ試薬、Ｓigma）を加え、３７℃で５分間インキ
ュベートした。インキュベート後、適当な試料または標
準液５０μｌを各キュベットに加えた。希釈緩衝液を試
料または標準液の代わりに用いて基底凝血時間を測定し
た。フィブロメーターのタイマー（ＣｏＡスクリーナー
止血装置、American Labor）を、それぞれ試料または標
準液に３０ｍＭＣａＣｌ2を５０μｌ、３７℃にて加え
た後直ちに始動させた。試料中の活性化プロテインＣ濃
度を標準曲線の線形回帰方程式から計算した。ここに記
載の凝血時間は標準曲線試料を含むそれぞれ３個の最小
値の平均値である。
【００２２】比較研究のための試料を調製するために、
ａＰＣ（２０ｍＭトリス中７.３ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍ
ＭＮａＣｌ）の完全な自己分解は２５℃で４４時間イン
キュベート後または陰イオン交換樹脂（ＦＦＱ、Pharma
cia）上でｐＨ７.４、４℃にて濃縮後に終了させた。ア
ミド分解活性測定法、ＨＰＬＣ、Ｎ−末端配列およびＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥを試料について行い、自己分解量および
アミノ酸配列上の開裂部位を確認および定量分析した。
ａＰＣ（２０ｍＭトリス中７.３ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍ
ＭＮａＣｌ）の完全な自己分解は２５℃で４４時間イン
キュベート後または陰イオン交換樹脂（ＦＦＱ、Pharma
cia）上でｐＨ７.４、４℃にて濃縮後に終了させた。ア
ミド分解活性測定法、ＨＰＬＣ、Ｎ−末端配列およびＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥを試料について行い、自己分解量および
アミノ酸配列上の開裂部位を確認および定量分析した。
【００２３】実施例３ 活性化プロテインＣ安定化定量分析 ａＰＣの活性上のｐＨ効果をＡＵを観察することにより
実験した。３つの緩衝液系を、ＭＥＳ（ｐＨ５.５−
７）、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６.８−８.２）、およびＣＨＥ
Ｓ（ｐＨ８.６−１０）を各５０ｍＭ用いて、６−９.３
（ｐＨ単位増加分０.３にて）の範囲でｐＨ条件を設定
して用いた。ａＰＣを適当なｐＨ緩衝液を用いて０.４
ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるように希釈し、この濃度で
インキュベートした後活性の測定をした。インキュベー
ションｐＨにてアミド検定法を用いて４℃にて初期時間
および４℃にて３０時間後の両方で試料を検定した。こ
れらの測定はアミド分解活性のためのつりがね型のｐＨ
依存性を示した。これらの定量の結果を以下の表１に示
す。
実験した。３つの緩衝液系を、ＭＥＳ（ｐＨ５.５−
７）、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６.８−８.２）、およびＣＨＥ
Ｓ（ｐＨ８.６−１０）を各５０ｍＭ用いて、６−９.３
（ｐＨ単位増加分０.３にて）の範囲でｐＨ条件を設定
して用いた。ａＰＣを適当なｐＨ緩衝液を用いて０.４
ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるように希釈し、この濃度で
インキュベートした後活性の測定をした。インキュベー
ションｐＨにてアミド検定法を用いて４℃にて初期時間
および４℃にて３０時間後の両方で試料を検定した。こ
れらの測定はアミド分解活性のためのつりがね型のｐＨ
依存性を示した。これらの定量の結果を以下の表１に示
す。
【表１】アミド分解率（ＩＵ／ｍｇ ａＰＣ） ｐＨ ０時間 ３０時間 ６.０ １.６３ １.５８ ６.６ ４.００ ４.６３ ７.２ ９.１６ ６.６８ ７.８ １１.２６ ９.２６ ８.４ ７.０５ ５.１６ ９.０ ３.５３ ３.５３ ａＰＣの最大活性はｐＨ７.４であるが、両極端の６お
よび９.３のｐＨ値は大きく減少した活性を示す。ａＰ
Ｃは極端なｐＨで何らかのアミド分解活性を保持するこ
とが明らかであり、このデータは、ａＰＣが最大活性を
有するｐＨ条件を避けることにより自己分解が減少する
ことを示している。
よび９.３のｐＨ値は大きく減少した活性を示す。ａＰ
Ｃは極端なｐＨで何らかのアミド分解活性を保持するこ
とが明らかであり、このデータは、ａＰＣが最大活性を
有するｐＨ条件を避けることにより自己分解が減少する
ことを示している。
【００２４】ａＰＣのアミド分解活性ｐＨ依存性がＥＡ
Ｋフラグメント生成の関数であるかどうか決定するため
に、ａＰＣ試料をｐＨ６.０、７.５および９.０、１.５
ｍｇ／ｍｌで、４℃にて１８時間インキュベートした。
生成したＥＡＫ量をＥＡＫＨＰＬＣピーク下の面積の積
算およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のＥＡＫバンドの定量的観
察により測定した。これらのデータはｐＨ６.０でイン
キュベート中のＥＡＫ生成において増加を示さなかった
が、ｐＨ７.５でおよそ３０％の増加およびｐＨ９.０で
およそ５０％の増加であった。ｐＨ７.５および９.０の
試料中ＥＡＫフラグメントの高濃度にもかかわらず、ｐ
Ｈ７.４で測定した場合に製剤はなお高いＡＵ活性を有
した。すなわち、ＥＡＫフラグメントの発生はアミド分
解活性の損失と必ずしも関係しているとは限らない。む
しろ、ＥＡＫフラグメントはａＰＣの重鎖の残余部分と
十分に関係して存在しているにちがいなく、セリンプロ
テアーゼ機能を維持している。どちらかと言えば、より
高いＥＡＫフラグメント含有量は、より高いアミド分解
活性と関係しているといえる。
Ｋフラグメント生成の関数であるかどうか決定するため
に、ａＰＣ試料をｐＨ６.０、７.５および９.０、１.５
ｍｇ／ｍｌで、４℃にて１８時間インキュベートした。
生成したＥＡＫ量をＥＡＫＨＰＬＣピーク下の面積の積
算およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のＥＡＫバンドの定量的観
察により測定した。これらのデータはｐＨ６.０でイン
キュベート中のＥＡＫ生成において増加を示さなかった
が、ｐＨ７.５でおよそ３０％の増加およびｐＨ９.０で
およそ５０％の増加であった。ｐＨ７.５および９.０の
試料中ＥＡＫフラグメントの高濃度にもかかわらず、ｐ
Ｈ７.４で測定した場合に製剤はなお高いＡＵ活性を有
した。すなわち、ＥＡＫフラグメントの発生はアミド分
解活性の損失と必ずしも関係しているとは限らない。む
しろ、ＥＡＫフラグメントはａＰＣの重鎖の残余部分と
十分に関係して存在しているにちがいなく、セリンプロ
テアーゼ機能を維持している。どちらかと言えば、より
高いＥＡＫフラグメント含有量は、より高いアミド分解
活性と関係しているといえる。
【００２５】ＥＡＫフラグメントは触媒的三構成（トリ
アド）（重鎖のＮ−末端部中に見られるＨis２１１およ
びＡsp２５７を含む）の活性部位セリン（残基３６０）
を含む。それゆえに、もしＥＡＫフラグメントが重鎖の
残部に共有的に結合していない場合、このタンパク質切
除は酵素活性の減少をもたらし得る。抗凝血活性に対す
るＥＡＫの種々の量の効果をみるために、ａＰＣのいく
つかの異なったロットを、上述の実施例１および２に記
載と同様にして製造した。アミド分解検定を、２２−１
９８ｕＭ ＃Ｓ−２２３８の範囲の基質濃度、１.６−
３.３ｎＭ（７５−１５０ｎｇ／ｍｌ）、２０ｍＭトリ
ス、ｐＨ７.４、１５０ｍＭＮａＣｌの範囲のａＰＣ濃
度で行った。この検定の結果を下記の表２に示す。
アド）（重鎖のＮ−末端部中に見られるＨis２１１およ
びＡsp２５７を含む）の活性部位セリン（残基３６０）
を含む。それゆえに、もしＥＡＫフラグメントが重鎖の
残部に共有的に結合していない場合、このタンパク質切
除は酵素活性の減少をもたらし得る。抗凝血活性に対す
るＥＡＫの種々の量の効果をみるために、ａＰＣのいく
つかの異なったロットを、上述の実施例１および２に記
載と同様にして製造した。アミド分解検定を、２２−１
９８ｕＭ ＃Ｓ−２２３８の範囲の基質濃度、１.６−
３.３ｎＭ（７５−１５０ｎｇ／ｍｌ）、２０ｍＭトリ
ス、ｐＨ７.４、１５０ｍＭＮａＣｌの範囲のａＰＣ濃
度で行った。この検定の結果を下記の表２に示す。
【表２】 ＥＡＫ含有量％対アミド分解および抗凝血活性により測定された比活性 比活性 試料番号 ＥＡＫ％ ＡＵ／ｍｇ ＡＰＴＴ／ｍｇ １ ３ １.１３ ２.１１ ２ １９ １.３５ １.７ ３ ３５ １.５２ １.３７ ４ ５１ １.６４ １.００ ５ ６７ １.６８ ０.７８
【００２６】分解のｐＨ依存性は種々の量のＥＡＫを含
むａＰＣ試料を作成するために利用した。これらの試料
は上述の実施例１および２に記載と同様にして製造し
た。種々の含有量のＥＡＫフラグメントを含む試料は完
全なａＰＣ（＜３％ＥＡＫフラグメント）と比較した。
Ｋm、ＫcatおよびＶmax値を含むアミド分解速度論的パ
ラメーターを３つの異なる酵素濃度で各３つのロットに
ついて測定し、それを表３に要約する。
むａＰＣ試料を作成するために利用した。これらの試料
は上述の実施例１および２に記載と同様にして製造し
た。種々の含有量のＥＡＫフラグメントを含む試料は完
全なａＰＣ（＜３％ＥＡＫフラグメント）と比較した。
Ｋm、ＫcatおよびＶmax値を含むアミド分解速度論的パ
ラメーターを３つの異なる酵素濃度で各３つのロットに
ついて測定し、それを表３に要約する。
【表３】 速度データ 試料番号 [ａＰＣ] Ｋm Ｋcat Ｖmax (EAK％) ng/ml (mM) (umol/ml/min) (1/sec) １(２０％) １５０ ０.１２ ９１０２ ７ １ １１３ ０.１２ ８６３４ ６.６ １ ７５ ０.１９ ８７１３ ６.７ ２(６７％) １５０ ０.１８ １０６７２ ８.２ ２ １１３ ０.１８ ９７２９ ７.５ ２ ７５ ０.１８ ９９３０ ７.６ ３(１００％) １５０ ０.１６ １３１４２ １０.１ ３ １１３ ０.１４ ２３３７ １.８ ３ ７５ ０.１８ ３１６ ０.２ ３つのａＰＣ試料のＫm値は実験誤差の範囲で同じと思
われ、基質０.１６ｍＭの平均値を示した。これは基質
Ｓ−２２３８の親和性が分解したａＰＣに中断されてい
ないことを示している。驚くべきことに、分解物質は完
全なａＰＣのものと本質的に同様のＡＵ活性をいまだ有
していた。
われ、基質０.１６ｍＭの平均値を示した。これは基質
Ｓ−２２３８の親和性が分解したａＰＣに中断されてい
ないことを示している。驚くべきことに、分解物質は完
全なａＰＣのものと本質的に同様のＡＵ活性をいまだ有
していた。
【００２７】活性化プロテインＣは完全なアミド分解機
能を有するのに対してトリペプチド物質（＃Ｓ−２２３
８）でさえ高ＥＡＫフラグメント含量を有している。イ
ンビトロ抗凝血活性はＡＰＴＴ検定法で測定され得る。
意外にも高ＡＵ活性は抗凝血活性と相関関係がなかっ
た。一方、ＡＵ活性は増加するＥＡＫ含有量の増加とと
もに増大し、ＡＰＴＴ活性はＥＡＫ含有量の増加ととも
に減少した。
能を有するのに対してトリペプチド物質（＃Ｓ−２２３
８）でさえ高ＥＡＫフラグメント含量を有している。イ
ンビトロ抗凝血活性はＡＰＴＴ検定法で測定され得る。
意外にも高ＡＵ活性は抗凝血活性と相関関係がなかっ
た。一方、ＡＵ活性は増加するＥＡＫ含有量の増加とと
もに増大し、ＡＰＴＴ活性はＥＡＫ含有量の増加ととも
に減少した。
【００２８】ＥＡＫフラグメント生成および活性化プロ
テインＣ安定性に対する塩濃度の効果が、種々のｐＨ値
および塩濃度で活性化プロテインＣの試料をインキュベ
ートし、ついで、１時間当たりのＥＡＫフラグメント生
成のパーセントを測定することにより検討された。検定
法におけるプロテインＣの濃度はミリリットル当たり４
−５ミリグラムの間であった。すべての検定はリン酸緩
衝液５−２０ｍＭ中で行われた。塩化ナトリウムを塩
（塩が存在する場合）として使用し、すべての検定は２
５℃で行った。１時間当たりのＥＡＫフラグメント生成
のパーセントをＨＰＬＣ積算により測定した。これらの
検定の結果を下記の表４に示す。
テインＣ安定性に対する塩濃度の効果が、種々のｐＨ値
および塩濃度で活性化プロテインＣの試料をインキュベ
ートし、ついで、１時間当たりのＥＡＫフラグメント生
成のパーセントを測定することにより検討された。検定
法におけるプロテインＣの濃度はミリリットル当たり４
−５ミリグラムの間であった。すべての検定はリン酸緩
衝液５−２０ｍＭ中で行われた。塩化ナトリウムを塩
（塩が存在する場合）として使用し、すべての検定は２
５℃で行った。１時間当たりのＥＡＫフラグメント生成
のパーセントをＨＰＬＣ積算により測定した。これらの
検定の結果を下記の表４に示す。
【表４】 ＥＡＫフラグメント生成の塩濃度の効果 ｐＨ 塩濃度 生成ＥＡＫ％／時間 ６.４ ４００ ｍＭ .０９４ ７.０ ４００ ｍＭ .１４５ ６.４ ５０ ｍＭ .２９２ ７.０ ５０ ｍＭ .３６５ ６.４ ０ .０３８ ７.０ ０ .０９２
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/47 8318−4Ｈ (72)発明者 ジョゼフィーン・セクニック アメリカ合衆国46143インディアナ州グリ ーンウッド、ラ・レフォルマ・ドライブ 404番
Claims (10)
- 【請求項１】 活性化プロテインＣの分解を最小化する
方法であって、上記方法が上記活性化プロテインＣをｐ
Ｈが約６.３および約７.０の間の溶液中に維持すること
を特徴とする方法。 - 【請求項２】 上記溶液が約０.０５０Ｍより低いかま
たは約０.４０Ｍより高い塩濃度である、請求項１記載
の方法。 - 【請求項３】 上記溶液が約０.０５０Ｍより低い塩濃
度である、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 上記溶液が約０.０１０Ｍより低い塩濃
度である、請求項２記載の方法。 - 【請求項５】 溶液中の塩が塩化ナトリウムである、請
求項２記載の方法。 - 【請求項６】 活性化プロテインＣの分解を最小化する
方法であって、上記方法が、変性剤を含む溶液中に上記
活性化プロテインＣを維持することを特徴とする方法。 - 【請求項７】 約６.３および約７.０のｐＨの間の溶液
中に活性化プロテインＣを含む、安定化抗−血栓製剤。 - 【請求項８】 さらに約０.０５０Ｍより低いかまたは
約０.４Ｍより高い濃度の塩を含む、請求項７記載の製
剤。 - 【請求項９】 塩濃度が約０.０５Ｍより低い、請求項
８記載の製剤。 - 【請求項１０】 緩衝液がトリス−酢酸塩、クエン酸ナ
トリウム、クエン酸塩−グリシンおよびリン酸ナトリウ
ムを含む群から選ばれる、請求項７記載の製剤。
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