CZ338799A3

CZ338799A3 - Terapeutický přípravek, nádržka s dávkovou jednotkou tohoto přípravku a aktivovaný protein C

Info

Publication number: CZ338799A3
Application number: CZ19993387A
Authority: CZ
Inventors: Brian William Grinnell; Daniel Charles Howey; Charles Van Jackson
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 1998-03-24
Filing date: 1998-03-24
Publication date: 2000-05-17

Abstract

Je popsán terapeutický přípravek pro léčbu vaskulámí okluzní a arteriální trombolické poruchy u lidskýchpacientů, kteiý obsahuje aktivovaný protein C, dále nádržka s dávkovači jednotkou, která obsahuje od 5 do 20 mg aktivovaného proteinu C a konečně aktivovaný protein Cjako takový, pro použitíjako léčivo při léčbě vaskulámích okluzních a arteriálních tromboembolických poruch.

Description

Vynález se týká lékařství, a to léčby vaskulárních poruch prostřednictvím aktivovaného proteinu C. Je popsán terapeutický přípravek pro léčbu vaskulární okluzní a arteriální tromboembolické poruchy u lidských pacientů, který obsahuje aktivovaný protein C, dále nádržka s dávkovači jednotkou, která obsahuje od 5 do 20 mg aktivovaného proteinu C a konečně aktivovaný protein C jako takový, pro použití jako léčivo při léčbě vaskulárních okluzních a arteriálních tromboembolických poruch v dávkách asi 0,01 mg/kg/h až asi 0,05 mg/kg/h.

Dosavadní stav techniky

Protein C je serinová proteáza a přirozeně se vyskytující antikoagulant, který má svou úlohu v regulaci homeostázy prostřednictvím deaktivování faktorů V_a a VIII_av koagulační kaskádě. Lidský protein C je vytvářen in vivo převážně v játrech jako jednoduchý polypeptid složený z 461 aminokyseliny. Tato molekula prekurzoru podléhá vícenásobným posttranslačním modifikacím, které zahrnují:

1) odštěpení signální sekvence složené z 42 aminokyselin;

2) proteolytické ods-tranění lysinového zbytku v pozici 155 a argininového zbytku v pozici 156 z jednoho řetězce zymogenu za účelem vytvoření dvouřetězcové formy molekuly, (t.j. lehký řetězec složený ze 155 aminokyselinových zbytků je připojen přes disulfidový můstek k serinové proteáze, která obsahuje těžký řetězec složený z 262 aminokyselinových zbytků;

asm·

- la ·· 9 · · ♦ · · · · · • · · ·· · · · · * • 9 · · · 9 · Φ · · · · « · · · · · · · · · ·· ·« ·· ···· ·· 9*

3) vitamin K-dependentní karboxylaci devíti zbytků kyseliny glutamové seskupených v prvních 42 aminokyselinách lehkého řetězce, jejímž výsledkem je vznik devíti zbytků kyseliny gamma-karboxyglutamové; a

4) vazbu uhlovodíků na 4 místech (na jednom místě na lehkém řetězci a na třech místech na těžkém řetězci). Těžký řetězec obsahuje dobře známou serinovou proteázovou triádu složenou z • · • 4

4 4 4 β 4 4 4

444 444

4

4 4 4 · · 4 4 4 • · 4 4

44444 <

4 4 «444 4 444 4

Asp 257, His 211 a Ser 360. Cirkulující 2-řetězcový zymogen je konečně aktivován in vivo prostřednictvím thrombinu na fosfolipidovém povrchu v přítomnosti vápenatého iontu. Aktivace probíhá odstraněním dodekapeptidu z N-konce těžkého řetězce, čímž vzniká aktivovaný protein C (aPC), který má enzymovou aktivitu.

Společně s jinými proteiny působí protein C jako snad nejdůležitější down-regulátor krevní koagulace. Jinými slovy, enzymový systém proteinu C představuje hlavní fyziologický mechanismus antikoagulace.

Koagulační systém je nejlépe znázorněn jako řetězová reakce zahrnující postupnou aktivaci zymogenů na aktivní serinové proteázy, které v konečné fázi produkují enzym, thrombin, který přes limitovanou proteolýzu přeměňuje plazmový fibrinogen na nerozpustný gel, fibrin. Dvěma klíčovými body v koagulační kaskádě je přeměna srážecího faktoru X na Xa prostřednictvím srážecího faktoru IXa a přeměna prothrombinu na thrombin prostřednictvím srážecího faktoru Xa. K oběma těmto reakcím dochází na povrchu buňky, obzvláště povrchu krevních destiček. Obě tyto reakce vyžadují kofaktory. Hlavní kofaktory, faktory V a VIII, cirkulují v systému jako relativně inaktivní prekurzory, ale když je vytvořeno prvních několik molekul trombinu, thrombin působí zpětně a aktivuje kofaktory přes limitovanou proteolýzu. Aktivované kofaktory, Va a Vlila, urychlují jak přeměnu prothrombinu na thrombin, tak také přeměnu faktoru X na faktor Xa rychlostí přibližně pěti řádů. Aktivovaný protein C jednoznačně preferuje dva plazmové proteinové substráty, které hydrolyzuje, a tím nevratně ničí. Těmito plazmovými proteinovými substráty jsou aktivované formy srážecích ¢kofaktorů, Va a Vlila. Aktivovaný protein C pouze minimálně degraduje neaktivní prekurzory, srážecí faktory V a VIII.

Bylo prokázáno, že aktivovaný protein C u psů velmi zvyšuje oběhové hladiny hlavního fyziologického fibrinolytického enzymu, tkáňového plazminogenového aktivátoru (tPA) . Bylo prokázáno, že aktivovaný protein C in vitro zvyšuje lýzu fibrinu v neseparované lidské krvi. Aktivovaný protein C tudíž představuje důležitý doplněk k in vivo fibrinolýze u člověka.

V dnešní době je k dispozici málo účinných léčebných postupů k léčbě vaskulárních okluzí, včetně trombotické mrtvice. Léčba pomocí tPA, jestliže je podán do 3 hodin od počátku mrtvice, byla nedávno schválena FDA. Léčba mrtvice pomocí heparinu nebo orálními antikoagulanty, ačkoliv je občasně úspěšná, přináší vysoké riziko krvácení do infarktem postižené části mozku.

Použití rekombinantního aPC (r-aPC) k léčbě trombotické okluze nebo tromboembolie v modelu s paviány bylo popsáno v Griffin a kol. U.S. patentový spis č. 5 084 274. Griffin nárokuje dávkování v rozsahu koncentrací od 0,2 mg/kg/h do 1,1 mg/kg/h pro léčbu trombotické okluze. Přihlašovatelé však zjistili, že toto dávkování je v oblasti významně nad toxikologickou hladinou r-aPC. Například předklinické toxikologické studie na primátech (mimo člověka) ukazují, že bezpečnost r-aPC při podávání 96 hodin je omezena na nej vyšší dávku kolem 0,05 mg/kg/h. Nejnižší dávkování předložené Griffinem a kol·., tj. 0,2 mg/kg/h, jsou tudíž na úrovni čtyřikrát vyšší, než je toxická dávka pro člověka stanovená přihlašovatelem. Dokonce i nejnižší dávkování předložené Griffinem by sebou tedy neslo vysoké riziko krvácení do • ·

y. Wo infarktem postižené .části mozku, a tim by zhoršovalo neurologický deficit doprovázející mrtvici. I s ohledem na to, co předložil Griffin a kol., je třeba určit efektivní léčbu tvorby arteriálních thrombů u lidí prostřednictvím aPC.

Na rozdíl od zjištění dřívějších badatelů původci zjistili, že pouze léčba nízkými dávkami r-aPC je vhodná při léčbě trombotické mrtvice. Podávání aPC je také prospěšné k zabránění lokálních rozšíření mikrovaskulárních a makrovaskulárních okluzí arteriálních thrombů, čímž snižuje neurologický deficit, který by způsobila mrtvice.

Podstata vynálezu

Předložený vynález poskytuje terapeutický přípravek pro léčbu vaskulární okluzní a arteriální tromboembolické poruchy u lidských pacientů, který obsahuje aktivovaný protein.C.

Tento vynález také poskytuje formu dávkovači jednotky vhodnou pro podávání prostřednictvím kontinuální infúze, která zahrnuje nádobku dávkovači jednotky obsahující asi 5 mg až asi 20 mg aktivovaného proteinu C vhodného pro podávání dávky v rozsahu koncentrací od asi 0,01 mg/kg/h do asi 0,05 mg/kg/h.

Tento vynález tak umožňuje způsob léčby lidských pacientů s vaskulární okluzí a arteriálními tromboembolickými poruchami, který zahrnuje podávání aktivovaného proteinu C těmto pacientům v rozsahu koncentrací od asi 0,01 mg/kg/h do asi 0,05 mg/kg/h.

Pro účely předloženého vynálezu jsou dále definovány následující pojmy.

aPC nebo aktivovaný protein C označuje protein C, ať je rekombinantní nebo odvozený z plazmy. aPC je pokud možno

- 4¾ • «

···· · · · ♦ · · · • · ·» ·· · · · · · · ·· lidským proteinem C,. ačkoliv aPC může také zahrnovat jiné druhy nebo deriváty mající aktivity proteinu C: proteolytickou, amidolytickou, esterolytickou a biologickou um

- 5 5 (antikoagulační nebo pro-fibrinolytickou). Příklady derivátů proteinu C jsou popsány v; Gerlítz a kol., U.S. patentový spis č. 5 453 373, a Foster a kol., U.S. patentový spis č. 5

516 650, na které se tímto odkazuje.

APTT - čas aktivovaného parciálního thromboplastinu.

AU - amidolytické jednotky.

HPC - zymogen lidského proteinu C.

MEA - 2-aminoethanol.

tPA - tkáňový plazminogenový aktivátor.

r-HPC - zymogen rekombinatního lidského proteinu C.

r-aPC - rekombinatní aktivovaný protein C, který je vytvářen aktivací zymogenu proteinu C in vitro nebo in vivo nebo přímým vylučováním aktivovaných forem proteinu C z prokaryotických buněk, eukaryotických vylučování zymogenu z tkáňových kultur lidských ledvin 293, přičemž zymogen je potom čištěn a aktivován pracovními postupy dobře známými odborníkům v oboru a popsanými v Yan, U.S. patentový spis č.

981 952 a Cottingham WO 97/20043, na které se tímto odkazuj e.

Kontinuální infúze - souvislé podstatně nepřerušované zavádění roztoku do cév po určitou dobu.

Bolusová injekce - injekce léku v definovaném množství (nazývaném bolus) po určitý časový interval, který může dosáhnout až asi 120 minut.

Vhodná forma pro podávání - kompozice nebo roztok, výhodně připravené z lyofilizovaného aPC, které jsou vhodné pro podávání jako léčebný prostředek.

Zymogen - enzymaticky inaktivní prekurzor proteolytického enzymu. Zymogen proteinu C, jak je zde uváděn, označuje • · • · · » * · · · « • ·

- β vylučované inaktivní formy proteinu C buď jednořetězcové nebo dvouřetězcové.

Přihlašovatelé zjistili, že předklinické toxikologické studie u primátů (mimo člověka) ukázaly, že při podávání infúze po časové období 96 hodin je bezpečnost proteinu C omezena na nejvyšší dávku kolem 0,05 mg/kg/h. Tyto výsledky jsou neočekávané ve srovnání se stavem techniky. Dávkování r-aPC pro lidi, které bylo založeno na dřívějších předklinických a klinických studiích, je ve skutečnosti nad toxikologickým rozsahem, který byl stanovený ve výše uvedených toxikologický studiích.

Předkládaný vynález popisuje způsob léčby lidských pacientů s vaskulární okluzí a arteriálními tromboembolickými poruchami, který zahrnuje podávání aktivovaného proteinu C těmto pacientům v koncentračních dávkách od asi 0,01 mg/kg/h do asi 0,05 mg/kg/h. Podávání aktivovaného proteinu C v nízkých dávkách je prospěšné při léčbě trombotické mrtvice bez průvodních jevů krvácení, které mohou být spojovány s vysokými dávkami. Předkládaný vynález dále ukazuje použití rekombinantního lidského proteinu C (r-aPC) v klinickém pokusu na lidech ke stanovení koncentrace r-aPC v krevní plazmě (příklad 1).

Předkládaný vynález také ukazuje vliv intravenózního podávání r-aPC na reperfúzi úplně okludovaných věnčitých (koronárních) tepen v modelu se psy týkající se okluzivní trombózy věnčitých tepen (příklad 2). U pěti ze šesti zvířat ošetřených r-aPC překvapivě nastala cévní reperfúze, ve srovnání s tím u žádného ze 6 kontrolních zvířat k cévní reperfúzi nedošlo.

• t fefe • · · · · · fefefe· fe·· · · · · · fe • · fefefe fe « fe « ··fe fefefe • · · · fefe fe·»· · fefefe « · · fefe fefe

Předkládaný vynález se týká léčby vaskulárních okluzí nebo arteriálních tromboembolických poruch včetně trombotické mrtvice, periferní arteriální trombózy, embolie vznikající v srdečních nebo periferních arteriích, akutního infarktu myokardu a koronárních arteriálních nemocí pomocí aktivovaného proteinu C.

Protein aPC může být zapracován známými způsoby přípravy do farmaceuticky vhodných kompozic. Protein aPC je výhodně podáván parenterálně, k zajištění jeho dodání do krevního řečiště v účinné formě, injekcí vhodné dávky ve formě kontinuální infúze po dobu od asi 1 hodiny do asi 48 hodin. Výhodněji bude vhodná dávka aPC podána kontinuální infúzí po dobu asi od 4 hodin do asi 36 hodin. Ještě výhodněji bude vhodná dávka aPC podána kontinuální infúzí po dobu asi od 12 hodin do asi 24 hodin. Nejvýhodnější bude, když vhodná dávka aPC bude podána kontinuální infúzí po dobu asi 24 hodin. Podávání aPC začne co nejdříve po diagnostikování mrtvice.

Množství podávaného aPC je od asi 0,01 mg/kg/h do asi 0,05 mg/kg/h, což je ekvivalent od asi 20 mg/70 kg/24 hodin do asi 84 mg/70 kg/24 hodin. Přestože dávkované množství je uvedeno jako specifické množství na 24 hodin, odborníkovi v oboru je zřejmé, že jde o určení dávkovaného množství, které není nezbytně omezeno na 24 hodinovou infúzi, ale může zahrnovat i kontinuální infúzi, která může trvat různě dlouho, například od asi 1 hodiny do asi 48 hodin. Zvláště výhodně je podávané množství aPC v rozsahu od asi

0,01 mg/kg/h do asi 0,04 mg/kg/h (od asi 20 mg/70 kg/24 h do asi 67 mg/70 kg/24 h). Ještě výhodněji bude množství » · · · do asi podávaného aPC v rozsahu od asi 0,01 mg/kg/h do asi 0,03 mg/kg/h (od asi 20 mg/70 kg/24 h do asi 50 mg/70 kg/24 h). Nejvýhodnější množství podávaného aPC je asi 0,024 mg/kg/h (asi 40 mg/70 kg/24 h).

Alternativně bude aPC podáván injekcí části vhodné dávky odpovídajícího množství na 1 hodinu ve formě bolusové injekce v časovém intervalu od asi 5 minut do asi 30 minut, poté bude následovat kontinuální infúze vhodné dávky v časovém intervalu od asi 23 hodin do asi 47 hodin, což odpovídá vhodné dávce podávaní v časovém intervalu od 24 hodin do 48 hodin.

Jak bylo zmíněno dříve, dávkovaná množství aPC, jak byla uvedena výše, jsou v protikladu k těm, která prezentoval Griffin a kol. Griffin nárokoval dávky v rozsahu od 0,2 mg/kg/h do 1,1 mg/kg/h pro léčbu trombotické okluze. Dávkovaná množství uváděná v předkládaném vynálezu naopak odpovídají desetině této dávky a jsou v rozsahu od asi 0,01 mg/kg/h do asi 0,05 mg/kg/h. Nejvýhodnější dávkované množství aPC podávané při léčbě trombotické okluze, jak je zde popsáno, bude asi 0,024 mg/kg/h. Je třeba poznamenat, že nejvýhodnější dávkované množství 0,024 mg/kg/h, jak je zde popsáno, je osmkrát menší než nejnižší dávkované množství nárokované Griffinem a 44 krát menší než nejvyšší dávkované množství nárokované Griffinem.

Příprava č. 1

Příprava lidského proteinu C

Rekombinantní lidský protein C (rHPC) je produkován tkáňovou kulturou z lidských ledvin 293 postupy dobře známými odborníkovi v oboru, jako jsou uvedeny v Yan, U.S. patentový • · ·· » * * · « e · _a • · · · « · • · · · a · a · »· · ·« «« spis č. 4 981 952, na který se tímto odkazuje. Genetické kódování lidského proteinu C bylo popsáno a nárokováno v Bang a kol. U.S. patentový spis č. 4 775 624, na který se tímto odkazuje. Plazmídem užitým k expresi lidského proteinu C u buněk tkáňové kultury z lidských ledvin 293 byl plazmid pLPC, který je popsán v Bang a kol. , U.S. patentový spis č. 4 992 373, na který se tímto odkazuje. Struktura plazmidu pLPC je také popsána v evropském patentovém spise č. 0 445 939 a v Grinnell a kol., 1987, Bio/Technology 5: 1189 - 1192, na který se tímto odkazuje. Stručně, plazmid byl transfektován do buněk tkáňové kultury 293, potom byly identifikovány stabilní transformované buňky, které byly přeneseny a kultivovány v bezsérovém médiu. Po fermentaci bylo pomocí mikrofiltrace získáno bezbuněčné médium.

Lidský protein C byl separován z kultivačního média upravenými postupy podle Yan, U.S. patentový spis č. 4 981 952, na který se tímto odkazuje. Čiré médium bylo upraveno na koncentraci 4 mM přidáním EDTA, poté byl vzorek absorbován na anexové koloně (Fast-Flow Q, Pharmacia). Po promytí 4 objemy kolony roztokem 20 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7,4 a 2 objemy kolony roztokem 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4, navázaný zymogen rekombinatního lidského proteinu C byl eluován roztokem 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4. Eluovaný protein po eluci měl čistotu vyšší než 95 %, jak bylo stanoveno elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu.

Další přečištění proteinu bylo provedeno úpravou koncentrace proteinu v roztoku NaCl na 3 M, po které následovala adsorpce vzorku na pryskyřici s hydrofobní interakcí (Toyopearl Phenyl 650M, TosoHaas). Kolona byla ekvílíbrována roztokem 20 mM Tris, 3 M NaCl, 10 mM CaCl2, • · β i

- 10 ρΗ 7,4. Po promytí 2 objemy kolony ekvilibračního pufru. bez CaCl2, byl eluován rekombinantní lidský protein C roztokem 20 mM Tris , pH 7,4.

Eluovaný protein byl připraven na aktivaci odstraněním zbytkového vápníku. Vzorek s rekombinantním lidským proteinem C byl přečištěn na koloně s afinitou ke kovům (Chelex-100, Bio-Rad), aby byl odstraněn vápník, a vzorek byl opět navázán na anexové koloně (Fast Flow Q, Pharmacia). Obě tyto kolony byly zapojeny v sérii a byly ekvilibrovány roztokem 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 6,5. Po nanesení vzorku byla kolona Chelex-100 promyta jedním objemem kolony stejného pufru, a poté byla odpojena ze série. Anexová kolona byla promyta 3 objemy kolony ekvilibračního pufru, a poté byl protein eluován roztokem 0,4 M NaCl, 20 mM Tris-acetátu, pH 6,5. Proteinová koncentrace rekombinantního lidského proteinu C a rekombinantního aktivovaného proteinu C v roztocích byla stanovena spektrofotometricky měřením extinkce v UV oblasti při 280 nm £0,1% = 1,85 resp. 1,95.

Příprava č. 2

Aktivace rekombinatního lidského proteinu C

Hovězí thrombin byl nanesen na aktivovanou CH-Sepharosu

4B (Pharmacia) v roztoku s 50 mM HEPES, pH 7,5 při teplotě 4 °C. Vysycovací reakce byla prováděna na pryskyřici již naplněné do kolony za použití přibližně 5 000 jednotek thrombinu/ml pryskyřice. Kolona byla promývána thrombinovým roztokem přibližně 3 hodiny, poté byl přidán MEA k cirkulujícímu roztoku v množství 0,6 ml na litr tohoto roztoku. Tímto roztokem byla kolona dále promývána 10 až » « • · * · • «4 · « · « · « « φ • 9 * · · · hodin, aby byla zajištěna kompletní blokace nezreagovaných aminů na pryskyřici. Po vysyceni byla pryskyřice s navázaným thrombinem promyta 10 objemy kolony roztoku 1 M NaCl, 20 mM Tris, pH 6,5, aby byl odstraněn nespecificky navázaný protein, a byla užita pro aktivační reakce po ekvilibraci aktivačním pufrem.

Z čištěného rHPC byl připraven roztok o koncentraci 5 mM (do roztoku byla přidána EDTA, aby odstranila zbytky vápníku) a ten byl zředěn na koncentraci 2 mg /ml roztokem 20 mM Tris, pH 7,4, nebo 20 mM Tris-acetátu, pH 6,5. Tento materiál byl nanášen na thrombinovou kolonu ekvilibrovanou při teplotě 37 °C roztokem 50 mM NaCl, a buď 20 mM Tris o pH 7,4 nebo 20 mM Tris-ačetátu o pH 6,5. Průtok byl nastaven tak, aby dovoloval přibližně 20 minutový kontakt mezi rHPC a thrombinovou pryskyřicí. Eluát byl sbírán a okamžitě zkoušen na amidolytickou aktivitu. Jestliže materiál neměl specifickou aktivitu (amidolytickou) srovnatelnou se stanoveným standardem aPC, byl znovu recyklován na thrombinové koloně, aby aktivace rHPC byla dokončena. Poté následovalo zředění materiálu v poměru 1 : 1 20 mM pufrem, jak je uvedeno výše, s pH někde mezi 7,4 nebo 6,0 (nižší pH je výhodné, neboť zabraňuje autodegradaci), aby koncentrace aPC dosahovala nižších hodnot před dalším zpracováním.

Odstranění uvolněného thrombinu z aPC materiálu bylo dokončeno navázáním aPC na anexovou pryskyřici (Fast Flow Q, Pharmacia) ekvilibrovanou aktivačním pufrem (buď 20 mM Tris, pH 7,4, nebo výhodně 20 mM Tris-acetátem, pH 6,5) se 150 mM NaCl. Thrombin prochází kolonou a vymývá se 20 mM ekvilibračním pufrem v rozmezí mezi 2.-6. objemem kolony. Navázaný aPC je eluován krokovým gradientem za použití 0,4 M

NaCI v buď 5 mM Tris-acetátu, pH 6,5, nebo 20 mM Tris, pH 7,4. Vyšší promývací objemy umožnily kompletnější odstranění dodekapeptidu. Eluovaný materiál z kolony byl skladován bud ve zmrazeném roztoku (- 20 °C) nebo jako lyofilizovaný prášek.

Amidolytická aktivita (AU) aktivovaného proteinu C byla určena z přírůstku p-nitroanilinu, který vznikal ze syntetického substrátu H-D-Phe-Pip-Arg-p-nitroanilidu (S-2239), který byl zakoupen od firmy Kabi Vitrum. Stanovení bylo prováděno na spektrofotometru DU-7400 s diodovým polem od firmy Beckman. Jedna jednotka aktivovaného proteinu C byla definována jako množství enzymu vyžadovaného na uvolnění 1 pmol p-nitroanilinu za 1 minutu při teplotě 25 °C , pH 7,4, za použití extinkčního koeficientu 9620 M^-^cm“l pro p-nitroanilin při 405 nm.

Antikoagulační aktivita aktivovaného proteinu C byla stanovena měřením prodloužení doby srážení ve srážecím testu s parciálně aktivovaným thromboplastinem (APTT) („activated partial thromboplastin time). Standardní křivka byla připravena v ředícím pufru (1 mg/ml BSA, čistoty pro radioimmunoassay, 20 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCI, 0,02%

NaNg) v koncentračním rozsahu proteinu C 125 - 1000 ng/ml, přičemž vzorky byly připraveny v několika ředěních v tomto koncentračním rozsahu. Do každé kyvety se vzorkem bylo přidáno 50 μΐ chladné koňské plazmy a 50 μΐ rekonstituovaného parciálně aktivovaného thromboplastinového činidla (APTT činidlo, Sigma) a poté byla prováděna inkubace při teplotě 37 °C po dobu 5 minut. Po inkubaci bylo přidáno do každé kyvety 50 μΐ vzorku nebo standardu. Ředící pufr byl použit místo vzorku nebo standardu ke stanovení bazální srážecí « ·

9 • 0 ♦ 9 • 0 0 9 0 0 0 doby. Stopky fibrometru (CoA Screener Hemostasis Analyzer, American Labor) byly spuštěny po přidáni 50 μΐ 30 mM CaCl2 o teplotě 37 °C ke každému vzorku nebo standardu. Koncentrace aktivovaného proteinu C ve vzorcích se vypočte pomocí lineární regresní rovnice standardní křivky. Zde uvedené srážecí časy jsou průměrem minimálně 3 měření, stejným způsobem bylo postupováno i u vzorků standardní křivky.

Výše uvedený popis umožní odborníkovi v oboru připravit aPC pro použití při léčbě trombotické mrtvice.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Koncentrace aPC v lidské plazmě

Šest lidských pacientů dostalo i.v. infúzi s aPC při mg/m^/h nebo asi 0,024 mg/kg/h v časovém intervalu hodin. Podávaný aPC byl ve formě lyofilizované kompozice obsahující 10 mg aPC, 5 mM Tris-acetátového pufru a 100 mM NaCl rekonstituované s 2 ml vody a pH bylo upraveno na 6,5.

Koncentrace aPC v plazmě byly měřeny použitím „Immunocapture-Amidolytic Assay. Vzorky krve byly po odběru skladovány v přítomnosti citrátového antikoagulantu a benzamidinu, reverzibilního inhibitoru aPC. Enzym byl vychytán z plazmy pomocí aPC specifické myší monoklonální protilátky, C3, která byla imobilizována na mikrotitračních destičkách. Inhibitor byl odstraněn promytím a amidolytická aktivita nebo aPC byla měřena pomocí oligopeptidového chromogenního substrátu. Po inkubaci trvající 16 - 20 hodin při teplotě 37 °C, byla měřena absorbance při 405 nm a výsledky byly analyzovány algoritmem vážené lineární regrese

Koncentrace aPC byly určeny ze standardní křivky v koncentračním rozsahu 0 - 100 ng/ml. Mez stanovitelnosti této metody byla 1,0 ng/ml. Dávkovaná množství aPC a koncentrace v plazmě byly měřeny po asi 24 hodinách. Koncentrace v plazmě jsou v rozsahu od 2 ng/ml do méně než 100 ng/ml. Výhodný rozsah koncentrace v plazmě je od asi 20 ng/ml do asi 80 ng/ml. Ještě výhodnější rozsah koncentrace je od asi 30 ng/ml do asi 60 ng/ml, ještě výhodnější je kolem 50 ng/ml. Dávka 0,024 mg/kg/h poskytuje nejvýhodnější koncentraci v plazmě 50 ng/ml při 24 hodinové léčbě trombotické mrtvice bez průvodních projevů krvácení, které provázejí vyšší dávky.

Příklad 2

Indukovaná reperfúze v modelu se psy s okluzivní koronární arteriální trombózou

Dvanácti psům (17 - 22 kg, obou pohlaví, Butler Farms) byla dána narkóza pomocí pentobarbitalu sodného (30 mg/kg, i.v.) a byli ventilováni okolním vzduchem. Kanyly byly zavedeny tak, aby mohl být měřen krevní tlak, mohla být podávána léčiva a odebírány vzorky krve z karotidní (krční) tepny, femorální (stehenní) žíly a jugulární (hrdelní) žíly. Byla provedena levá torakotomie, srdce bylo zavěšeno v perikardiálním vaku a 2cm úsek levé okružní věnčité (circumflex) tepny (LCCA) byl izolován proximálně prvnímu hlavnímu diagonálnímu větvení. Do LCCA byla zavedena elektromagnetická průtoková sonda, stimulační elektroda a vnější okluder pro měření koronárního průtoku krve, k vytvoření cévního poškození a k vyvolání kritické stenózy (zúžení). Cévní poškození bylo vyvoláno přiložením stimulační elektrody (anody) na vnitřní stěnu cévy a stimulací anody » · ·

9

999 • 9 « · « ·

9 9

9 9 99 ·

···· «

100 μΑ stejnosměrného proudu (okruh byl uzavřen vložením katody do podkožního místa). Proud způsobující poškození byl zaváděn 60 minut, po této době bylo zavádění proudu ukončeno, ať byla céva okludovaná nebo ne. U cév bylo dosaženo úplné okluze přibližně po 60 minutách od zahájení poškozování cévy. Třicet minut po úplné okluzi cévy (stanoveno jako nulový průtok koronární krve po časový interval 30 minut) byla zaváděna po dobu 2 hodin kontinuální intravenózní infúze obsahující 2,0 mg/kg/h aPC nebo infúze s 20 ml Tris pufru, pH 7,4 (kontrolní skupina). Pokusy byly sledovány po časové období 4 hodin od počátku poškozování LCCA. Údaje o arteriálním krevním tlaku, srdeční frekvenci a koronárním průtoku krve byly shromažďovány a analyzovány. V různých časových intervalech během pokusu byly odebírány vzorky krve, aby mohly být stanoveny doby srážení celé krve (Hemochron 801), a byly stanoveny doby krvácení otisku na dásni (template bleeding time) pomocí zařízení Simplate II. Druhá sada krevních vzorků (s citrátem) byla shromažďována během pokusu pro stanovení plazmového plazminogenového aktivátoru inhibitoru-1 (PAI-1). Koncentrace plazmového PAI-1 byly stanoveny pomocí IMUBIND™ plazma PAI-1 ELISA sady (American Diagnostica). Všechna data (vyjádřena jako průměr ± směr. odchylka) byla analyzována na určení statistické odchylky pomocí jednoduché metody ANOVA a poté Student-NeumanKeulsovou analýzou pro stanovení významnosti na hladině pravděpodobnosti p < 0,05. Rozsah reperfúze a průchodnost byly analyzovány pomocí Fischerova exaktního testu na hladině pravděpodobnosti p < 0,05.

Kontinuální infúze 2,0 mg/kg/h aPC způsobila 6-násobné prodloužení doby srážení celé krve v APTT testu do 2 hodin od (náhradní strana) počátku podávání infúze. APTT se začal vracet k normálním hodnotám na konci experimentu. V pokusu nebyl pozorován žádný vliv na dobu srážení thrombinu nebo na dobu krvácení otisku. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

·· · • · · • ·· • · ·· · • · * ··· ···

- ι7 (náhradní strana)

Tabulka 1

Vliv aPC na koagulaci a na dobu krvácení otisku (templátový čas) u psů v narkóze

Ošetření	Parametr	Před infúzí	60 min. infúze	120 min. infúze	Konec
vehikulum³(n = 6)	doba srážení thrombinu (s)	36 ± 1	38 ± 4	33 ± 1	34 ± 1
	APTT (s)	100 ± 6	95 ± 5	89 ± 10	91 ± 10
	doba krvácení otisku (s)	132 ± 15	182 ± 14	152 ± 15	159 ± 13

aPC^a doba 331 341 341 341 thrombinu (s)

APTT (s)	96 ± 6	573 ± 237 670 ±	209	138 ± 13
		*		*
doba krvácení otisku (s)	199 ± 41	272 ± 84 204 ±	20	193 ± 39
Dávkovači režim	užitý pro	kontrolní skupinu	s	vehikulem

byl následující: 20 ml Tris - NaCl pufr, doba infúze 2 h a podávání aPC (2,0 mg/kg/h, doba 2 h) začalo 30 minut po úplné okluzi cév.

* Označuje statistické odchylky na hladině pravděpodobnosti p <0,05 oproti kontrolní skupině s vehikulem. Každá hodnota představuje průměr ± směrodatná odchylka.

• · • 9 · • ···· ·

(náhradní strana)

Tabulka 2 objasňuje vliv nitrožilního podávání aPC na reperfúzi úplně okludovaných koronárních arterií (tepen).

Doba potřebná k úplné trombotické okluzi koronárních arterií byla obdobná u obou skupin; 66 ± 7 a 62 ± 6 minut u kontrolní skupiny s vehikulem a skupiny ošetřené aPC. U pěti ze 6 cév ve skupině ošetřené aPC došlo k reperfúzi, zatímco u kontrolní skupiny, které bylo podáno pouze vehikulum nedošlo v žádném ze 6 případů k reperfúzi. Čas potřebný k reperfúzi ve skupině ošetřené aPC dosáhl 128 ± 17 min. Průtok koronární krve u skupiny ošetřené aPC byl významně větší než u odpovídající kontrolní skupiny, které bylo podáno pouze vehikulum; průtok u skupiny ošetřené aPC dosáhl

13,7 ±2,7 ml/min. během reperfúze a objem proteklé krve byl 1069 ± 623 ml (to představuje obnovení průtoku koronární krve přibližně ze 60 až 70 % oproti'stavu před trombózou u této skupiny). Tři z 5 cév, které byly vystaveny aPC, byly nicméně průchodné na konci 4-hodinového experimentu. Tyto údaje prokazují, že aPC je efektivní při léčbě okluzivní koronární arteriální trombózy v modelu se psy.

Tabulka 2

Vliv aPC na obnovení průtoku koronární krve u modelu se psy majícími koronární arteriální trombózu

Parametr Vehikulum (n = 6)aPC (n = 6)

Doba potřebná k okluzi 66 ± 7 62 ± 6 (min)

Hmotnost sraženiny (mg)

10,8 ± 2,1

8,2 ± 1,2 • ·

	- 19 - “·· ^:	• · ··· ···	• · ·· ··
Výskyt reperfúze	0	5 ze	6 *
Doba potřebná k reperfúzi (min)	0	128 ±	17 *
Průchodnost cév na konci experimentu	0 ze 6	3 z	5
Průtok koronární krve během reperfúze (ml/min)	0	13,7 ±	2,7 *
Reperfúzní objem (ml)	0	1069 ±	623

* Označuje statistické odchylky na hladině pravděpodobnosti p < 0,05 oproti kontrolní skupině s vehikulem. Každá hodnota představuje průměr ± směrodatná odchylka.

Vzorky krve analyzované během celého experimentu ukázaly, že existuje významná korelace mezi nitrožilní infúzí a oběhovou koncentrací plazminogenového aktivátoru inhibitoru-1 (PAI-1). Do konce nitrožilní infúze aPC klesla koncentrace plazmového PAI-1 o 80 %. Po zastavení infúze aPC se začala koncentrace plazmového PAI-1 vracet na své původní hodnoty.

Ačkoliv dávkovaná množství v tomto modelu se psy se zdají být vyšší než nárokované dávky pro lidi. Přihlašovatelé zjistili, že pes je obzvláště necitlivý k lidskému aktivovanému proteinu C, a tudíž nárokované dávky jsou vhodné pro lidi.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Terapeutický přípravek pro léčbu vaskulární okluzní a arteriáiní tromboembolické poruchy u lidských pacientů, vyznačující se tím, že obsahuje aktivovaný protein C.
2. Terapeutický přípravek podle nároku 1, pro léčbu vaskulární okluzní a arteriáiní tromboembolické poruchy, kterou je trombotická mrtvice, u lidských pacientů, vyznačující se tím, že obsahuje aktivovaný protein C.
3. Terapeutický přípravek podle nároku 2, pro léčbu vaskulární okluzní a arteriáiní tromboembolické poruchy, kterou je trombitická mrtvice, u lidských pacientů, vyznačující se tím, že obsahuje aktivovaný protein C v dávce umožňující podávání asi 0,01 mg/kg/h do asi 0,03 mg/kg/h aktivovaného proteinu C.
4. Terapeutický přípravek podle nároku 3, pro léčbu vaskulární okluzní a arteriáiní tromboembolické poruchy, kterou je trombitická mrtvice, u lidských pacientů, vyznačující se tím, že obsahuje aktivovaný protein C v dávce umožňující podávání asi 0,024 mg/kg/h aktivovaného proteinu C.
5. Terapeutický přípravek podle nároku 4, pro léčbu vaskulární okluzní a arteriáiní tromboembolické poruchy, • · ···· · · kterou je trombitická. mrtvice, u lidských pacientů, vyznačující se tím, že jako aktivovaný protein C obsahuje lidský aktivovaný protein C.
6. Terapeutický přípravek podle nároku 1, pro léčbu vaskulární okluzní a arteriální tromboembolické poruchy u lidských pacientů, vyznačující se tím, že obsahuje aktivovaný protein C pro podávání kontinuální infúzí.
7. Terapeutickýpřípravek podle nároku 6, pro léčbu vaskulární okluzní a arteriální tromboembolické poruchy u lidských pacientů, vyznačující se tím, že obsahuje aktivovaný protein C pro podávání kontinuální infúzí po dobu asi 12 hodin až asi 36 hodin.
8. Terapeutický přípravek podle nároku 7, pro léčbu vaskulární okluzní a arteriální tromboembolické poruchy u lidských pacientů, vyznačující se tím, že obsahuje aktivovaný protein C pro podávání kontinuální infúzí po dobu asi 24 hodin.
9. Terapeutický přípravek podle nároku 8, pro léčbu vaskulární okluzní a arteriální tromboembolické poruchy u lidských pacientů, vyznačující se tím, že jako aktivovaný protein C obsahuje lidský aktivovaný protein

C.
10. Terapeutický přípravek podle nároku 9, pro léčbu vaskulární okluzní a arteriální tromboembolické poruchy u • ·

9 · lidských pacientů, vyznačující se tím, že obsahuje aktivovaný protein C v dávce umožňující podávání asi 0,024 mg/kg/h aktivovaného proteinu C.
11. Terapeutický přípravek podle nároku 1, pro léčbu vaskulární okluzní a arteriální tromboembolické poruchy u lidských pacientů, vyznačující se tím, že obsahuje aktivovaný protein C ve formě bolusové injekce.
12. Terapeutický přípravek podle nároku 11, pro léčbu vaskulární oklužní a arteriální tromboembolické poruchy u lidských pacientů, vyznačující se tím, že obsahuje aktivovaný protein C ve formě bolusové injekce, po které následuje kontinuální infúze.
13. Nádržka s dávkovači jednotkou, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje od 5 do 20 mg aktivovaného proteinu

C.
14. Nádržka podle tím, že v ní je nároku 13, vyzná aktivovaný protein C čující se lyofilizovaný.
15. Nádržka podle nároku 13, vyzná tím, že v ní je aktivovaný protein C sterilním roztoku vhodném pro podávání mg/kg/h do 0,05 mg/kg/h.

čující s rozpuštěný ve v dávce od 0,01
16. Nádržka podle nároku 13, vyznačující se tím, že podávání se děje pomocí kontinuální infúze po dobu od asi 1 hodiny do asi 48 hodin.

• · · ··· · · · · * · · * ·· ···· ·· ··
17. Aktivovaný protein C pro použití jako léčivo při léčbě vaskulárních okluzních a arteriálních tromboembolických poruch v dávkách asi 0,01 mg/kg/h až asi 0,05 mg/kg/h.