PL180703B1

PL180703B1 - Sposób wytwarzania wodnego roztworu aktywowanego bialka C oraz srodek farmaceutyczny PL PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL180703B1
Application number: PL95306671A
Authority: PL
Inventors: Walter F Prouty; Josephine Secnik
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1994-01-05
Filing date: 1995-01-03
Publication date: 2001-03-30
Also published as: KR950032287A; NZ270271A; NO2006006I1; RU2167936C2; EP1087011A3; ES2156190T3; YU295A; ZA9514B; HU9500021D0; LU90992I2; LU90993I2; CN1109891A; FI950044A0; IL112236A; SI0662513T1; GR3036277T3; AU1003195A; CA2139468C; CZ1395A3; EP0662513A1

Abstract

1. Sposób wytwarzania wodnego roztworu aktywowanego bialka C, zwlaszcza do le- czenia schorzen naczyniowych, znamienny tym, ze sporzadza sie roztwór aktywowanego bialka C o pH od 6,3 do 7,0 i o stezeniu soli wybranej z grupy skladajacej sie z chlorku potasu, chlorku wapnia i chlorku sodu, wynoszacym ponizej 0,050 M lub powyzej 0,40 M. 11. Srodek farmaceutyczny zwlaszcza do leczenia schorzen naczyniowych zawierajacy aktywowane bialko C, znam ienny tym, ze zawiera aktywowane bialko C w roztworze o pH od 6,3 do 7,0 i sól wybrana z grupy skladajacej sie z chlorku potasu, chlorku wapnia i chlorku sodu w stezeniu ponizej 0,050 M lub powyzej 0,40 M. PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wodnego roztworu aktywowanego białka C oraz środek farmaceutyczny.

Białko C jest proteazą serynową i występującym w naturze środkiem pręeciwzakozsa3wym, który odgrywa rolę w regulacji hemostazy przez aktywowanie czynników Va i VHla w kaskadzie krzepnięcia. Ludzkie białko C jest in vivo produkowane głównie przez wątrobę w postaci pojedynczego p3hasptydu złożonego z 461 aminokwasów. Ta cząsteczka aoskursorowa ulega licznym modyfikacjom aotransalantacyjnym, w tym 1) odczepieniu sekwencji sygnałowej o długości 41 aminokwasów; proteolitycznemu usunięciu z jednego łańcucha zymogenu reszty lizynowej w pozycji 155 i argininowej w pozycji 156 z utworzeniem 2-łańcuchowsj formy cząsteczki (to jest łańcucha lekkiego o długości 155 reszt aminokwasów, połączonego poprzez mostek disiarczkowy z zawierającym proteazę serynową łańcuchem ciężkim, składającym się z 262 reszt aminokwasów); 3) zależnej od witaminy K karboksylacji dziewięciu reszt kwasu glutaminowego, zgrupowanych w pierwszych 42 aminokwasach łańcucha lekkiego, w wyniku czego powstaje 9 reszt kwasu gamma-karboksyglutaminowego; i 4) przyłączeniu węglowodanu w czterech miejscach (jedno w łańcuchu lekkim i trzy w łańcuchu ciężkim). Łańcuch ciężki zawiera dobrze poznaną triadę proteazy serynowej: Asp 257, His 211 i Ser 360. Na końcu cyrkulacja

180 703

2-łańcuchowego zymogenu jest aktywowana in vivo przez trombinę na powierzchni fosfolipidowej w obecności jonów wapnia. Aktywacja jest skutkiem usunięcia dodekapeptydu na N-końcu łańcucha ciężkiego, w wyniku czego tworzy się zaktywowane białko C (aPC), posiadające aktywność enzymatyczną.

Przy pracy z dużymi ilościami i wysokimi stężeniami aPC zaobserwowano proteolityczne rozszczepienie przy reszcie lizynowej w pozycji 308 łańcucha ciężkiego. W wyniku tego od C-końca łańcucha ciężkiego odszczepia się fragment o długości 111 aminokwasów, zwany „fragment EAK”, którego N-koniec rozpoczyna się od sekwencji Glu-Ala-Lys. Fragment EAK nie jest przyłączony kowalencyjnie do łańcucha lekkiego lub N-końcowej części łańcucha ciężkiego przez wiązania disiarczkowe. Fragment EAK zawiera również aktywne miejsca serynowe proteazy serynowej, ale nie zawiera reszt Asp lub His. Odkryto zatem, że preparaty białka C zawierające fragment EAK mają zmienioną czynność przeciwzakrzepową. Wynalazek umożliwia zapobieganie degradacji białka C lub jej minimalizowanie przez utrzymywanie cząsteczki białka C przy obniżonym pH wobec środka denaturującego lub wobec ekstremalnych stężeń soli.

Dla celów niniejszego opisu zdefiniowano następujące określenia. aPC - aktywowane ludzkie białko C

APTT - aktywowany częściowy czas tromboplastyny

AU - jednostki amidolliyczne

BME - beta-merkaptoetanol

CHES - kwas 2-[N-cykloheksyloamino]etanosulfonowy

Fragment EAK - ffaagnent o dłłu^to^ci 111 aminokwasów. powstający w wyniku rozszczepienia łańcucha ciężkiego białka C w pozycji 308.

EDTA - kwas etylenodiaminotetraoctowy

HEPES - kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowy

HPC - zymogen ludzkiego białka C

MEA - 2-aminoetanol

MES - kwas 2-(N-morfolino)-etanosulfonowy

Białko powstające - polipeptyd wytwarzany po translacji transkryptu mRNA przedjakimikolwiek modyfikacjami potrantlacyjnymi. Jednakże modyfikacje potranslacyjne, takie jak gamma-karboksylowanie reszt kwasu glutaminowego i hydroksylowanie reszt kwasu asparaginowego mogą rozpoczynać się przed zakończeniem translacji białka z transkryptu mRNA.

Aktywność białka C - wszelka właściwość ludzkiego białka C odpowiedzialna za aktywności proteolityczne, amidolityczne, esterolityczne i biologiczne (przeciwzakrzepowe lub profibrynolityczne). Sposoby badania aktywności przeciwzakrzepowej białek są dobrze znane w stanie techniki, patrz na przykład Grinnell i współpr., 1987, Bio/Technology 5: 1189-1192.

rHPC - wytworzony metodami rekombinacyjnymi zymogen ludzkiego białka C.

Zymogen - nieaktywny enzymatycznie prekursor enzymu proteolitycznego. Stosowane tu określenie zymogen białka C odnosi się do wydzielanych, nieaktywnych form białka C, zarówno jednołańcuchowych jak i dwułańcuchowych.

Wszystkie skrótowe oznaczenia aminokwasów stosowane w tym opisie są skrótami zaakceptowanymi przez Urząd Patentów i Znaków Towarowych USA.

Według wynalazku sposób wytwarzania wodnego roztworu aktywowanego białka C zwłaszcza do leczenia schorzeń naczyniowych, charakteryzuje się tym, że sporządza się roztwór aktywowanego białka C o pH od 6,3 do 7,0 i o stężeniu soli wybranej z grupy składającej się z chlorku potasu, chlorku wapnia i chlorku sodu, wynoszącym poniżej 0,050 M lub powyżej 0,40 M.

Korzystnie sporządza się roztwór o stężeniu soli poniżej 0,050 M.

W kolejnym korzystnym rozwiązaniu sporządza się roztwór o stężeniu soli poniżej 0,010 M.

Jako sól korzystnie stosuje się chlorek sodu.

Roztwór wodny aktywowanego białka C korzystnie zawiera środek denaturujący, będący mocznikiem, w stężeniu 3 M.

W innym korzystnym rozwiązaniu sporządza się roztwór o pH od 6,3 do 6,5.

180 703

W kolejnych korzystnych rozwiązaniach sporządza się roztwór o pH 6,3 lub o pH 6,4, lub o pH 6,5.

Korzystne stężenie soli w roztworze sporządzanym według wynalazku wynosi powyżej 0,40 M. ,

Przedmiotem wynalazku jest również środek farmaceutyczny - preparat aPC, w którym aPC jest utrzymywane w niskim pH, wobec środka denaturującego lub wobec ekstremalnych stężeń soli.

Według wynalazku środek farmaceutyczny zwłaszcza do leczenia schorzeń naczyniowych, charakteryzuje się tym, że zawiera aktywowane białko C w roztworze o pH od 6,3 do 7,0 zawierającym sól wybraną z grupy składającej się z chlorku potasu, chlorku wapnia i chlorku sodu w stężeniu poniżej 0,050 M lub powyżej 0,40 M.

Korzystnie środek według wynalazku zawiera roztwór wodny aktywowanego białka C o pH od 6,3 do 6,5 oraz sól w stężeniu poniżej 0,05 M.

Środek według wynalazku korzystnie zawiera bufor wybrany z grupy składającej się z Tris-octanu, cytrynianu sodu, cytrynianu glicyny i fosforanu sodu.

Sposób zapobiegania lub minimalizowania autodegradacji aktywowanego białka C według wynalazku polega na przeprowadzeniu dojrzewania, oczyszczania i/lub przechowywania aktywowanego białka C przy niskim pH, na przykład pH około 6,3 do około 7,0. Autodegradacja aPC może być również zminimalizowana przez inkubację aPC w 3M moczniku (całkowite odzyskanie aktywności aPC uzyskuje się po usunięciu środka denaturującego) lub przez inkubację aPC w obecności ekstremalnych stężeń soli. Dla celów wynalazku ekstremalne stężenie soli oznacza stężenia soli powyżej około 0,4 molowego lub poniżej około 0,05 molowego.

Rola białka C w utrzymywaniu hemostazy spowodowała duże zainteresowanie tym związkiem jako środkiem leczniczym do szeregu schorzeń naczyniowych. Wytwarzanie dużych ilości i wysokich stężeń ludzkiego białka C na skalę przemysłową odsłoniło fakt, że cząsteczka może ulegać autodegradacji prowadzącej do zmniejszonej aktywności przeciwzakrzepowej. Skutkiem autodegradacji aPC jest powstawanie z N-terminalnego końca łańcucha ciężkiego fragmentu o długości 111 aminokwasów, zwanego fragmentem EAK.

W celu zmniejszenia lub zapobieżenia autodegradacji prowadzącej do powstawania fragmentu EAK aktywowana cząsteczka białka C może być przetrzymywana w pH między około 6,3 a około 7,0 . Cząsteczka może być trzymana w pH w tym zakresie podczas całego procesu oczyszczania i aktywacji; jak również w roztworze, w preparacie końcowym. Do utrzymywania pH roztworu można użyć różnych układów buforowych. Do reprezentatywnych układów buforowych należątris-octan, cytrynian sodu, cytrynian glicyny i fosforan sodu. Dla specjalisty będzie oczywiste, że dostępnych jest wiele innych układów buforowych, które również mogą być użyte w sposobie według wynalazku.

Następny aspekt wynalazku dotyczy zapobiegania lub zmniejszania powstawania fragmentu EAK przez utrzymywanie cząsteczki aktywowanego białka C w roztworze o ekstremalnym stężeniu soli. Na przykład przy pH 7,0 w buforze na bazie fosforanu sodu tworzenie fragmentu EAK jest minimalne gdy bufor nie zawiera soli. Jednakże przy pH 7,0 w buforze na bazie fosforanu sodu tworzenie fragmentu EAK jest również minimalne gdy stężenie chlorku sodu w buforze jest równe 0,4 M. Między tymi dwoma stężeniami soli tworzenie fragmentu EAK zachodzi z różną szybkością, ale specjalista uzna, że utrzymywanie stężeń soli poniżej 0,05 M lub powyżej 0,4 M najlepiej zapobiega lub minimalizuje tworzenie fragmentu EAK. Korzystne są inne stężenia soli poniżej 0,05 M (na przykład 0,01M lub 0,005 M, jakkolwiek najlepszy preparat farmaceutyczny uzyskuje się, gdy pH roztworu jest utrzymywane na wartości około 7,0 bez dodatku soli do roztworu. W sposobie według wynalazku oraz w środku farmaceutycznym według wynalazku można użyć wielu różnych soli. Do reprezentatywnych soli należą chlorek potasu, chlorek wapnia, a najbardziej korzystnie chlorek sodu.

Następnym aspektem wynalazku jest sposób zapobiegania lub minimalizacji autodegradacji aktywowanego białka C przez przeprowadzenie oczyszczania i/lub wytwarzania środka

180 703 farmaceutycznego w obecności środka denaturującego. Można zastosować wiele różnych środków denaturujących, ale najbardziej korzystnym środkiemjest mocznik w stężeniach około 3 M.

Wynalazek nie jest ograniczony przez sposób wytwarzania białka C. Jakkolwiek najbardziej efektywnym sposobem wytwarzania cząsteczek aktywowanego białka C jest sposób z użyciem technologii rekombinacji DNA, to ostatnie osiągnięcia w oczyszczaniu białek na dużą skalę pozwoliły na wyizolowanie dużych ilości aktywowanego białka C z ludzkiej surowicy. Otrzymywanie takich dużych ilości białka C umożliwiło prowadzenie jednocześnie dojrzewania wysokich stężeń białka C. Jak wspomniano powyżej, odkryto obecnie, że przy stężeniach aktywowanego białka C powyżej poziomu 50 mikrogramów na milimetr następuje autodegradacja cząsteczki aktywowanego białka C zjednoczesnym spadkiem jego czynności przeciwzakrzepowej. Co najważniejsze, szybkość autodegradacji wzrasta wraz ze wzrostem stężenia aktywowanego białka C w roztworze. W przemyśle nie jest efektywne prowadzenie procesów oczyszczania na dużą skalę przy niskich stężeniach białka.

Ponieważ przemysłowe i farmaceutyczne zastosowania aktywowanego białka C stwarzająkonieczność przeprowadzania dojrzewania cząsteczki w stężeniach dalece przewyższających 50 mikrogramów, sposób według wynalazku pozwala na wytwarzanie przez specjalistę dużych ilości produktu bez znaczącej utraty jego aktywności. Środek według wynalazku pozwala ponadto na przechowywanie stabilnych roztworów aktywowanego białka C przez dłuższy okres czasu niż okres czasu znany dotychczas ze stanu techniki.

Sposób według wynalazku pozwala na wytworzenie większych objętości aktywowanego białka C i w wyższych stężeniach niż były dostępne dotychczas bez obawy pogorszenia produktu z powodu autodegradacji. Ponadto stabilny środek farmaceutyczny według wynalazku może być łatwo stosowany do leczenia pacjentów cierpiących na schorzenia fizyczne opisane przez Taylora i współpr. w opisie patentowym USA nr 5009889.

Poniższe przykłady zamieszczono w celu zilustrowania wynalazku. Nie należy ich rozumieć jako ograniczenia wynalazku.

Przykład I. Wytwarzanie ludzkiego białka C

Rekombinacyjne ludzkie białko C (rHPC) wytwarzano w komórkach nerki ludzkiej 293 za pomocą technik znanych specjalistom, takich jak techniki przedstawione w opisie patentowym USA nr 4981952. Gen kodujący ludzkie białko C został ujawniony w opisie patentowym USA nr 4775624. Do ekspresji ludzkiego białka C w komórkach 293 użyto plazmidu pLPC, ujawnionego w opisie patentowym USA nr 4992373. Konstrukcja plazmidu pLPC jest również opisana w publikacji patentu europejskiego nr 445939 oraz w artykule Grinnella i współpr. w Bio/Technology 5: 1189-1192 (1987). W skrócie, plazmid transfekowano do komórek 293, następnie stabilne transformanty identyfikowano, wytwarzano podhodowle i namnażano w pożywce bez surowicy. Po fermentacj i pożywkę wolnąod komórek otrzymywano przez mikrofiltrację.

Ludzkie białko C wydzielano z płynu hodowlanego za pomocą technik opisanych w opisie patentowym USA nr 4981952. Sklarowaną pożywkę rozcieńczano do stężenia 4 mM za pomocą EDTA, po czym absorbowano ją na żywicy anionowymiennej (Fast-Flow Q, Pharmacia). Po przemyciu 4 objętościami kolumny roztworu 20 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7,4 i 2 objętościami kolumny roztworu 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4 związany zymogen ludzkiego rekombinacyjnego białka C eluowano za pomocą roztworu 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4. Jak stwierdzono za pomocą elektroforezy na żelu poliakryloamidowym SDS, czystość eluowanego białka była wyższa niż 95%.

Dalsze oczyszczanie białka przeprowadzono przez rozcieńczenie białka do stężenia 3 M za pomocąNaCl, a następnie adsorpcję na żywicy hydrofobowej (Toyopearl Phenyl 650 M, TosoHaas), zrównoważonej roztworem 20 mM Tris, 3 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4. Po przemyciu 2 objętościami kolumny roztworu równowagującego bez CaCl2, ludzkie rekombinacyjne białko C eluowano roztworem 20 mM Tris, pH 7,4. Eluowane białko C przygotowano do aktywacji przez usunięcie resztek wapnia. Rekombinacyjne ludzkie białko C przepuszczono przez kolumnę powinowactwa do usuwania metali (Chelex-100, Bio-Rad) w celu usunięcia wapnia i ponownie związano na żywicy anionowymiennej (Fast-Flow Q, Pharmacia). Obie te kolumny zestawiono

180 703 w szereg i zrównoważono roztworem 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7,4. Po załadowaniu białka kolumnę Chelex-100 przemyto jedną objętością kolumny tego samego buforu, po czym odłączono jąod szeregu. Kolumnę anionowyimeinnąprzemyto 3 objętościami buforu równowagującego, po czym eluowano białko roztworem 0,4 M NaCl, 20 mM Tris-octanu, pH 6,5. Stężenia rekombinacyjnego ludzkiego białka C i rekombinacyjnego aktywowanego białka C w roztworach mierzono za pomocąekstynkcji UV przy 280 nm, odpowiednio E°’^1% = 1,85 lub 1,95.

Przykład II. Aktywacja rekombinacyjnego ludzkiego białka C

Trombinę bydlęcą sprzęgano z aktywowaną CH-Sepharose 4B (Pharmacia) w obecności roztworu 50 mM HEPES, pH 7,5 w 4°C. Reakcję sprzęgania przeprowadzono na żywicy już załadowanej do kolumny, stosując około 5000 jednostek trombiny na ml żywicy. Roztwór trombiny cyrkulowano przez kolumnę przez około 3 godziny, po czym dodano MEA do stężenia w roztworze cyrkulującym 0,6 ml/l. Roztwór zawierający MEA cyrkulowano przez następne 10-12 godzin w celu zapewnienia całkowitego zablokowania nieprzereagowanych amin z żywicy. Po zablokowaniu żywicę sprzężoną z trombinąprzemyto 10 objętościami kolumny roztworu 1 M NaCl, 20 mM Tris, pH 6,5 w celu usunięcia wszystkich nieswoiście związanych białek, zrównoważono buforem aktywującym i stosowano ją do reakcji aktywacji.

Do oczyszczonego rHPC dodano EDTA do stężenia rHPC 5 mM (w celu schelatowania całego resztkowego wapnia) i rozcieńczono roztworem 20 mM Tris, pH 7,4 lub 20 mM Tris-octan, pH 6,5 do stężenia 2 mg/ml. Materiał ten przepuszczono przez kolumnę z trombiną, zrównoważoną w 37°C roztworem 50 mM NaCl oraz albo roztworem 20 mM Tris, pH 7,4 albo roztworem 20 mM tris-octan, pH 6,5. Szybkość przepływu ustawiono tak, aby zapewnić czas kontaktu między rHPC a żywicą trombinową około 20 minut. Odciek zbierano i natychmiast oznaczano w nim aktywność amidolityczną. Jeśli materiał nie miał specyficznej aktywności (amidolitycznej) porównywalnej z uznanym wzorcem aPC, zawracano go przez kolumnę trombinową w celu zakończenia aktywacji rHPC. Następnie rozcieńczano materiał w stosunku 1:1 20 mM buforem takim jak powyżej, o pH albo 7,4 albo 6,5 w celu utrzymania niższych stężeń aPC podczas oczekiwania na następny etap obróbki.

Usunięcie wypłukanej trombiny z materiału aPC przeprowadzono przez związanie aPC na żywicy anionowymiennej (Fast Flow Q, Pharmacia), zrównoważonej buforem aktywującym (albo 20 mM Tris, pH 7,4 albo 20 mM Tris-octan. pH 6,5) z 150 mM NaCl. Trombiną w tych warunkach nie oddziaływuje z żywicą anionowymienną, ale przechodzi przez kolumnę do odcieku. Po aładowaniu aPC na kolumnę przemywa się ją2-6 objętościami kolumny 20 mM buforu równowagującego, po czym eluuje związane aPC etapowo, stosując 0,4 NaCl w roztworze 5 mM Tris, pH 6,5 albo w roztworze 20 mM Tris, pH 7,4. Użycie większych objętości roztworu przemywającego kolumnę ułatwia bardziej kompletne usunięcie dodekapeptydu. Eluat z tej kolumny przechowywano albo w postaci zamrożonego roztworu (-20°C) albo w postaci liofilizowanego proszku.

Aktywność amidolityczną (AU) aPC oznaczano poprzez pomiar uwalniania p-nitroaniliny z syntetycznego substratu H-D-Phe-Pip-Arg-p-nitroanilid (S-2238), dostarczanego przez Kabi Vitrum, stosując spektrofotometr z macierzą diodowąBeckmann dU-7400. Jednąjednostkę aktywowanego białka C zdefiniowano jako ilość enzymu, wymaganą do uwolnienia w ciągu 1 minuty w 25°C 1 pmola p-nitroaniliny przy pH 7,4, przy zastosowaniu współczynnika ekstynkcji dla p-nitroaniliny przez 405 nm równego 9620 M_cm'1.

Aktywność przeciwzakrzepową aktywowanego białka C oznaczono przez zmierzenie wydłużenia czasu krzepnięcia w teście aktywowanego częściowego czasu tromboplastyny (APTT). Krzywąwzorcową sporządzono stosując bufor do rozcieńczania (BSA o stężeniu 1 mg/ml, o czystości do oznaczeń radioimmunologicznych, 20 mM Tns, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,02% NaN₃) i zakres stężeń białka C 125-1000 ng/ml, jako że próbki przygotowano w kilku rozcieńczeniach w tym zakresie stężeń. Do każdej kuwety z próbką dodawano 50 pl zimnej surowicy końskiej i 50 pl roztworzonego reagenta do oznaczania czasu aktywowanej częściowej tromboplastyny (reagent APTT, Sigma) i inkubowano w 37°C przez 5 minut. Po inkubacji do każdej kuwety dodawano 50 pl odpowiednich próbek lub wzorców. W celu ustalenia podstawowego czasu krzepnięcia zamiast

180 703 próbki lub wzorca stosowano bufor do rozcieńczeń. Miernik czasu fibrometru (CoA Screener Hemostasis Analyzer, American Labor) włączano bezpośrednio po dodaniu do każdej próbki lub wzorca 50 pl 30 mM CaCl2 o temperaturze 37°C. Stężenie aktywowanego białka C w próbkach obliczano z równania regresji liniowej krzywej wzorcowej. Podawane tu czasy krzepnięcia, w tym dla próbek krzywej wzorcowej, są średnią z minimum trzech powtórzeń.

W celu przygotowania próbek do badań porównawczych przeprowadzono całkowitą autodegradację aPC (7,3 mg/ml w 20 mM Tris, 150 mM NaCl) przez 44-godzirmąinkubację, w 25°C lub przez zatężenie na żywicy anionowymiennej (FFQ. Pharmacia), pH 7,4, w 4°C. Próbki poddano badaniom aktywności amidolitycznej, HPLC, N-końcowemu sekwencjonowaniu i SDS-PAGE w celu potwierdzenia i ilościowego zmierzenia autodegradacji oraz oznaczenia miejsc rozszczepienia w sekwencji aminokwasów.

Przykład III. Badania stabilizacji aktywowanego białka C

Wpływ pH na aktywność aPC badano przez monitorowanie AU. Do ustalenia warunków pH w zakresie 6-9,3 (w odstępach pH co 0,3) użyto układu trzech buforów, każdy po 50 mM MES (pH 5,5-7), HEPeS (pH 6,8-8,2) i CHES (pH 8,6-10). aPC rozcieńczono do stężenia końcowego 0,4 mg/ml za pomocą buforu o odpowiednim pH i inkubowano w tym stężeniu, po czym mierzono aktywność. Próbki badano zarówno na początku jak i po 30 godzinach w 4°C, stosując testy amidolityczne, przeprowadzane w pH inkubacji. Pomiary te wykazały dobrze ukształtowanązależność aktywności amidolitycznej od pH. Wyniki tych oznaczeń przedstawiono poniżej w tabeli 1.

Tabela 1

Szybkości amidolizy (j/mg aPC)

pH	0 godzin	30 godzin	pH	0 godzin	30 godzin
6,0	1,63	1,58	7,8	11,26	9,26
6,6	4,0	4,63	8,4	7,05	5,16
7,2	9,16	6,68	9,0	3,53	3,53

Maksymalną aktywność aPC zaobserwowano przy pH 7,4, natomiast przy ekstremalnych wartościach pH równych 6 i 9,3 aktywność była znacznie zmniejszona. Chociaż wydaje się, że aPC zachowuje pewną aktywność amidolitycznąprzy ekstremalnych pH, to dane te sugerują że autodegradacja jest zmniejszona dzięki unikaniu takich warunków pH, w których aPC ma najwyższą aktywność.

W celu ustalenia, czy zależność aktywności amidolitycznej aPC od pH jest funkcją tworzenia fragmentu EAK, próbki aPC inkubowano w 4°C przez 18 godzin w pH 6,0,7,5 i 9,0, przy stężeniu 1,5 mg/ml. Ilość utworzonego EAK mierzono przez całkowanie pola pod pikiem EAK na chromatogramie HPLC, jak również przez obserwację ilościową pasma EAK na SDS-PAGE. Dane te wykazująbrak wzrostu tworzenia EAK podczas inkubacji przy pH 6,0, podczas gdy przy pH 7,5 obserwowano wzrost w przybliżeniu 30%, a przy pH 9,0 wzrost około 50%. Mimo zwiększonych poziomów fragmentu EAK w próbkach inkubowanych w pH 7,5 i 9,0, preparat nadal miał wysoką aktywność AU przy pomiarze w pH 7,4. Zatem tworzenie fragmentu EAK nie łączy się koniecznie z utratą aktywności amidolitycznej. Dla utrzymania funkcji proteazy serynowej fragment EAK musi raczej pozostawać wystarczająco zasocjowany z resztą ciężkiego łańcucha aPC. Jeślijuż, to wyższa zawartość fragmentu EAK łączy się z wyższą aktywnościąamidolityczną.

Fragment EAK zawiera aktywne miejsce serynowe (reszta 360) z triady katalitycznej (z His 211 i Asp 257, występujących w N-końcowej części łańcucha ciężkiego). Zatem jeśli fragment EAK nie jest związany kowalencyjnie z resztą łańcucha ciężkiego, to rozszczepienie proteolityczne może spowodować zmniejszenie aktywności enzymatycznej. W celu zaprezentowania wpływu różnych ilości EAK na aktywność przeciwzakrzepową, przygotowano kilka różnych partii aPC w sposób opisany powyżej w przykładach I i II. Oznaczenia amidolityczne przeprowadzono przy stężeniach substratu w zakresie 22-198 pM S-2238, stężeniach aPC w

180 703 zakresie 1,6-3,3 nM (75-150 ng/ml), 20 Tris, pH 7,4,150 mM NaCl. Wynik tych oznaczeń przedstawiono poniżej w tabeli 2.

Tabela 2

Wpływ procentu zawartości EAK na specyficzną aktywność amidolityczną i przeciwzakrzepową.

Numer próbki	% EAK	Aktywność specyficzna	Numer próbki	% EAK	Aktywność specyficzna
AU/mg	APTT/mg	AU/mg	APTT/mg
1	3	1,13	2,11	4	51	1,64	1,00
2	19	1,35	1,7	5	67	1,68	0,78
3	35	1,52	1,37

Zależność degradacji od pH wykorzystano do sporządzenia próbek aPC, zawierających różne ilości EAK. Próbki te przygotowano w sposób opisany powyżej w przykładach I i II. Próbki o różnych zawartościach EAK porównano z aPC nie podanym degradacji (<3% fragmentu EAK). Dla każdej z tych partii zmierzono parametry kinetyczne amidolizy, w tym wartości Km, Kcat i Vmax, przy trzech różnych stężeniach enzymu. Wartości tych parametrów zestawiono w tabeli 3.

Tabela 3 Dane kinetyczne

Nr próbki (% EAK)	[aPC] ng/ml	Km (nm)	Vmax (ąml/ml/min)	Kcat (1/sek)
1 (20%)	150	0,12	9102	7
1	113	0,12	8634	6,6
1	75	0,19	8713	6,7
2 (67%)	150	0,18	10672	8,2
2	113	0,18	9729	7,5
2	75	0,18	9930	7,6
3 (100%)	150	0,16	13142	10,1
3	113	0,14	2337	1,8
3	75	0,18	316	0,2

Km - stała Michaelisa

Vmax - maksymalnaszybkość reakcji

Kcat - π^ζ^μΙ^ szybkośa kataliSkszaaenzymów

Wartość Km dla trzech próbek aPC były takie same w granicach błędu doświadczalnego i wynosiły średnio 0,16 mM substratu. Sugeruje to, że powinowactwo do substratu S-2238 nie ulega w zdegradowanym aPC zniszczeniu. Nieoczekiwanie materiał zdegradowany miał nadal aktywność AU zbliżoną do aktywności nienaruszonego aPC.

Aktywowane białko C może mieć nienaruszoną funkcję amidklitzczną w stosunku do substratu tripeptydowego (#S-2238) nawet przy wysokiej zawartości fragmentu EAK. Aktywność przeciwzakrzepowa in vitro może być zmierzona w teście APTT. Nieoczekiwanie okazało się, że wysoka aktywność AU nie jest skorelowana z aktywnością przeciwzakrzepową. Podczas gdy aktywność AU zwiększała się wraz ze wzrostem zawartości EAK, to aktywność APTT zmniejszała się przy wzroście zawartości EAK.

180 703

Wpływ stężenia soli na tworzenie fragmentu EAK i trwałość aktywowanego białka C badano inkubując próbki aktywowanego białka C przy różnych wartościach pH i stężeniach soli, a następnie mierząc procent tworzenia fragmentu EAK na godzinę. Stężenia białka C w teście były równe między 4-5 miligramów na mililitr. Wszystkie testy przeprowadzono w buforze fosforanowym 5 do 20 mM. Jako sól stosowano chlorek sodu (gdy sól była obecna) i wszystkie testy przeprowadzono w 25°C. Procent tworzenia fragmentu EAK na godzinę zmierzono przez całkowanie HPLC. Wyniki tych badań przedstawiono poniżej w tabeli 4.

Tabela 4

Wpływ stężenia soli na tworzenie fragmentu EAK

pH	Stężenie soli	% utworzonego EAK na godzinę	pH	Stężenie soli	% utworzonego EAK na godzinę
6,4	400 mM	0,94	7,0	50 mM	0,365
7,0	400 mM	0,145	6,4	0	0,038
6,4	50 mM	0,292	7,0	0	0,092

1. Sposób wytwarzania wodnago roztworu aktywowanego białka C, zwłaszcza do leczenia schorzeń naczyniowych, znamienny tym, ze sporządza się roztwór aktywowanego białka C o pH od 6,3 do 7,0 i o stężeniu soli wybranej z grupy składającej się z chlorku potasu, chlorku wapnia i chlorku sodu, wynoszącym poniżej 0,050 M lub powyżej 0,40 M.

11. Środek rarmafautyccny nwłaszcaa do kazenle schonOń nazzymowyah zawierałacy aktywowane białko C, znamienny tym, że zawiera aktywowane białko C w roztworze o pH od 6,3 do 7,0 i sól wybranąz grupy składającej się z chlorku potasu, chlorku wapnia i chlorku sodu w stężeniu poniżej 0,050 M lub powyżej 0,40 M.

180 703

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz

Cena 2,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania wodnego roztworu aktywowanego białka C, zwłaszcza do leczenia schorzeń naczyniowych, znamienny tym, ze sporządza się roztwór aktywowanego białka C o pH od 6,3 do 7,01 o stężeniu soli wybranej z grupy składającej się z chlorku potasu, chlorku wapnia i chlorku sodu, wynoszącym poniżej 0,050 M lub powyżej 0,40 M.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sporządza się roztwór o stężeniu soli poniżej 0,050 M.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sporządza się roztwór o stężeniu soli poniżej 0,010 M.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako sól stosuje się chlorek sodu.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór wodny aktywowanego białka C zawiera środek denaturujący będący mocznikiem w stężeniu 3 M.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sporządza się roztwór o pH od 6,3 do 6,5.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sporządza siz rozatwór o pw (5,3.
8. Sposób według zastrz. 1, znamimnny tym, ż, spοι^κ^ί! się roęatwór o pw <5,4.
9. Sposób według zastrz. 1, zn^mwni^jr tym, ż, sp00^5^1 się roztwęr o pw 6.o.
10. Sposób według zastrz. 1, z namiennn tym, ż e sporządza sts ęcolzt^ór o otężemu s oli p pwyżej 0,40 M.
11. Środek farmaceutyczny zwłaszcza do leczenia schorzeń naczyniowych zawierający aktywowane białko C, znamienny tym, że zawiera aktywowane białko C w roztworze o pH od 6,3 do 7,Q i sól wybranąz grupy składającej się z chlorku potasu, chlorku wapnia i chlorku sodu w stężeniu poniżej 0,050 M lub powyżej 0,40 M.
12. Środek według zastrz. 11, znamienny tym, że zawiera roztwór wodny aktywowanego białka C o pH od 6,3 do 6,5.
13. Środek według zastrz. 11, znamienny tym, że zawiera sól o stężeniu poniżej 0,05 M.
14. Środek według zastrz. 11, znamienny tym, że zawiera bufor wybrany z grupy składającej się z Tris-octanu, cytrynianu sodu, cytrynianu glicyny i fosforanu sodu.