JP3778588B2 - プロテインｃの分解を阻害する方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は酵素学、具体的には活性化プロテインＣの分解を阻害する方法に関する。
【０００２】
プロテインＣはセリンプロテアーゼであり、凝固カスケードにおいて活性化因子ＶaおよびＶIIIaにより止血を調節する役割を果す抗凝血物質を天然に発生させる。ひとプロテインＣはインビボ、主として肝臓中で４６１個のアミノ酸の単一のポリペプチドとして製造される。この前駆体分子は、１）４２個のアミノ酸シグナル配列の開裂；２）１本鎖チモーゲンから１５５位でのリシン残基および１５６位でのアルギニン残基の蛋白分解的切除による分子の２本鎖状分子形成（すなわち、２６２個のアミノ酸残基のセリンプロテアーゼ含有重鎖にジスルフィド架橋を介して結合した１５５個のアミノ酸残基の軽鎖）；３）９−ガンマ−カルボキシグルタミン酸残基を生じる、軽鎖の最初の４２個のアミノ酸内で同一群をなす９個のグルタミン酸残基のビタミンＫ−依存性−カルボキシル置換；および４）４つの部位（軽鎖で１つおよび重鎖で３つ）での炭水化物結合を含む多部位翻訳後修正を受ける。重鎖はＡsp２５７、Ｈis２１１およびＳer３６０の十分に確立されたセリンプロテアーゼ三構造（トリアド）を含む。最終的には、循環する２本鎖チモーゲンはカルシウムイオンの存在下ホスホリピド表面のトロンビンによりインビボで活性化される。活性化は重鎖のＮ−末端のドデカペプチドの切除を生じさせ、酵素活性を有する活性化プロテインＣ（ａＰＣ）を製造する。
【０００３】
ａＰＣを大量および高濃度で作用させると、重鎖の３０８位でのリジン残基でタンパク分解的切除が観察された。この切除により生成した新規なＮ−末端配列はＧlu−Ａla−Ｌysで始まり、重鎖のＣ−末端から「ＥＡＫフラグメント」と称される１１１個のアミノ酸フラグメントを得た。ＥＡＫフラグメントは、ジスルフィド結合を通じて軽鎖または重鎖のＮ−末端部に共有結合的に結合しない。ＥＡＫフラグメントはまた、セリンプロテアーゼの活性部位セリンを含むが、ＡspまたはＨis残基ではない。すなわち、ＥＡＫフラグメントを有するプロテインＣ製剤は抗凝血活性を変化させることが判明した。本発明は、変性剤中または極端な塩濃度において、低いｐＨで分子を維持することによってプロテインＣ分子の分解を阻害するかまたは最小にするための方法を含む。
【０００４】
本発明のために、この明細書中に開示され記載される場合、下記の用語は次のように定義される。
ａＰＣ− 活性化ひとプロテインＣ
ＡＰＴＴ− 活性化部分的トロンボプラスチン時間
ＡＵ− アミド分解単位
ＢＭＥ− β−メルカプトエタノール
ＣＨＥＳ− ２−［Ｎ−シクロヘキシルアミノ］エタンスルホン酸
ＥＡＫフラグメント− プロテインＣの重鎖の３０８位での切除から生じる１１１個のアミノ酸フラグメント
ＥＤＴＡ− エチレンジアミン４酢酸
ＨＥＰＥＳ− Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ'−２−エタンスルホン酸
ＨＰＣ− ひとプロテインＣチモーゲン
ＭＥＡ− ２−アミノエタノール
ＭＥＳ− ２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸
新生タンパク質− 翻訳後修正より以前に、ｍＲＮＡ転写の翻訳時に産生したポリペプチド。しかしながら、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化およびアスパラギン酸残基のヒドロキシル化のような翻訳後修正が生じ始めた後、タンパク質はｍＲＮＡ転写物から十分に翻訳され得る。
プロテインＣ活性− タンパク分解、アミド分解、エステロール分解および生物学的（抗凝血またはプロフィブリノール分解的）活性に関与するひとプロテインＣのすべての性質。プロテインＣ抗凝血およびアミド分解活性のための試験方法は当分野で公知である（Grinnellら、1987, Bio/Technology 5:1189-1192参照）。
ｒＨＰＣ− 組換え産生ひとプロテインＣチモーゲン。
チモーゲン− タンパク分解酵素の酵素不活性前駆体。この明細書中で使用される場合、１本鎖であるか２本鎖であるかにかかわらず、プロテインＣの分泌された不活性形態を表す。
【０００５】
本記載に使用したアミノ酸の略語のすべては、３７Ｃ.Ｆ.Ｒ§1.822(b)(2)(1990)に規定され、アメリカ合衆国特許庁により容認されている。
【０００６】
本発明は活性化プロテインＣの自己分解を阻害するか、または最小にするための方法に関する。本発明は低いｐＨ、例えば、ｐＨ約６.３からｐＨ約７.０での活性化プロテインＣのプロセッシング、精製および／または貯蔵を行うことにより最も良く例示される。ａＰＣの自己分解はまた、３Ｍウレア中、または極端な塩濃度の存在下ａＰＣをインキュベートすることにより最小化し得る（ａＰＣ活性の完全な回収は変性剤の除去後に得られる）。ここにいう極端な塩濃度とは、約０.４モル濃度より高いかまたは約０.０５モルより低い塩濃度を意味する。本発明はまた、変性剤中か、または極端な塩濃度で、低いｐＨにａＰＣを維持するａＰＣ製剤を含む。
【０００７】
止血を維持するプロテインＣの役割は、広範囲にわたる種々の血管系疾患のための治療剤としてこの化合物に強い関心を引き付けるものである。工業的規模でのひとプロテインＣの高含量および高濃度での製造は、分子が抗凝血活性の減少につながる自己分解を受け得るという事実を明らかにした。ａＰＣの自己分解は重鎖のＣ−末端から「ＥＡＫフラグメント」と称される１１１個のアミノ酸フラグメントの生成をもたらす。ＥＡＫフラグメントはジスルフィド結合を介して軽鎖または重鎖のＮ−末端部に共有結合的に結合していない。ＥＡＫフラグメントはまた、ＡspまたはＨis残基ではない、セリンプロテアーゼの活性部位セリン残基を含む。すなわち、ＥＡＫフラグメントを含むプロテインＣ製剤はタンパク分解的切除の存在によって抗凝血活性を変化させた。
【０００８】
ＥＡＫフラグメントの生成を誘導する自己分解を減少または阻害するために、完全な活性化プロテインＣ分子は、約６.３および約７.０間のｐＨで維持され得る。この分子はすべての精製および活性化工程中および最後の製剤溶液中この範囲にｐＨを保つことができる。多種類の緩衝液系が溶液のｐＨを維持するために使用され得る。代表的な緩衝液系は、トリス−酢酸塩、クエン酸ナトリウム、クエン酸塩−グリシンおよびリン酸ナトリウムを含む。当業者には多くの他の緩衝液系が入手可能で、本発明の方法に用い得ることが理解するであろう。
【０００９】
本発明の態様は、極端な塩濃度の溶液中に活性化プロテインＣ分子を維持することによりＥＡＫフラグメントの生成の阻害または減少に関する。例えば、リン酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ７.０で、緩衝液中に塩が存在しない時に、ＥＡＫフラグメントの生成は最小である。しかしながら、リン酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ７.０で、緩衝液中塩化ナトリウム約０.４Ｍの濃度であるとき、ＥＡＫフラグメントの生成はまた最小である。これらの２つの塩濃度間で、ＥＡＫフラグメント生成が種々の割合で起こる；しかし、当業者は塩濃度を０.０５Ｍより低いかまたは塩濃度を０.４Ｍより高く維持することが、最も容易にＥＡＫフラグメントの生成を阻害または最小にすることが理解するであろう。０.０５Ｍより低い他の塩濃度（例えば、０.０１Ｍまたは０.００５Ｍ）がより好ましいが、溶液のｐＨが溶液に塩を加えないでｐＨ約７.０に維持される場合に、最良の医薬製剤が調製される。当業者は種々の塩が製薬工程および製剤化に使用し得ることが理解するであろう。本発明で使用され得る代表的な塩は、塩化カリウム、塩化カルシウムおよび、最も好ましくは塩化ナトリウムを含む。
【００１０】
本発明の別の態様は、変性剤の存在下精製および／または製剤化を行うことにより活性化プロテインＣの自己分解を阻害または減少させることに関する。多くの異なった変性剤が使用され得るが、最も好ましい試剤は約３Ｍの濃度のウレアである。
【００１１】
本発明は、活性化プロテインＣが製造され得る方法に限定されるものではない。組み換ＤＮＡ技術を用いて活性化プロテインＣ分子を製造することが最も有効であるが、大規模タンパク質精製における最近の進歩は、ひと血清からかなりの活性化プロテインＣを分離することを可能にした。このような大量のプロテインＣを得ることは、高濃度の活性化プロテインＣを一度に処理することを可能にした。上記のように、発明者は約５０マイクログラム／ミリリットル濃度より高い活性化プロテインＣの濃度の低下とともに、抗凝血活性における活性化プロテインＣ分子の自己分解を示すことを知った。最も重要なことに、活性化プロテインＣの濃度が減少するにつれて溶液中で自己分解の割合が増大した。工業的レベルでは、非常に低濃度のタンパク質の大規模な精製工程を実施するのは効果的ではない。
【００１２】
活性化プロテインＣ生産の産業上および製薬的利用において、５０マイクログラムをはるかに超える濃度の分子の処理が必要であり、本発明は生成物活性における著しい減少を伴わず大量の生成物の製造を当業者に可能とする。本発明の処方化は、さらに当分野で公知のものより長期間の安定な活性化プロテインＣ溶液の貯蔵を可能にする。
【００１３】
本発明を当業者が実施すれば、本発明の方法が自己分解による生成物損失を受ける恐れなく、かつて用いられた濃度より高濃度で大量の活性化プロテインＣを製造させることが理解するであろう。さらに、本発明の安定医薬製剤は、容易にTaylor，Jr.ら、アメリカ特許第５,００９,８８９号に記載された（その全ての記載をここに引用してこの明細書の記載とする）身体的疾患にかかっている患者を処置するために使用され得る。
【００１４】
以下の実施例は本発明の方法を具体的に説明するものであるが、これらに限定されるものではない。
実施例１
ひとプロテインＣの製造
組換えひとプロテインＣ（ｒＨＰＣ）を、Yan，アメリカ特許第４,９８１,９５２号に記載された（その全ての記載をここに引用してこの明細書の記載とする）当業者に公知の技術によりひと腎臓２９３細胞中で製造した。遺伝子をコードしたひとプロテインＣは、Bangら、アメリカ特許第４,７７５,６２４号（その全ての記載をここに引用してこの明細書の記載とする）に開示され、特許されている。２９３細胞にひとプロテインＣを発現するために用いられたプラスミドは、Bangら、アメリカ特許第４,９９２,３７３号に記載（その全ての記載をここに引用してこの明細書の記載とする）のプラスミドｐＬＰＣである。プラスミドｐＬＰＣの構築はまた、ヨーロッパ特許公開０ ４４５ ９３９号、およびGrinnellら、1987，Bio/Technology 5:1189-1192中に記載（それらの全ての記載をここに引用してこの明細書の記載とする）されている。要約すれば、このプラスミドは２９３細胞に形質転換され、ついで安定な形質転換細胞を血清−無含有培地中で同定し、継代培養および生長させた。発酵後、細胞−無含有培地を限外濾過により得た。
【００１５】
ひとプロテインＣをYan，アメリカ特許第４,９８１,９５２号記載（その全ての記載をここに引用してこの明細書の記載とする）の方法を適用することにより培養液から分離した。澄明な媒体をＥＤＴＡ中４ｍＭ濃度で調製した後、陰イオン交換樹脂（Fast−Flow Ｑ、Pharmacia）に吸着させた。カラムの４倍量の２０ｍＭトリス、２００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７.４および２０ｍＭトリス、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７.４のカラムの２倍量で洗浄後、結合した組み換ひとプロテインＣチモーゲンを２０ｍＭトリス、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ₂、ｐＨ７.４で溶出した。溶出したタンパク質は、溶出後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド分解ゲル電気泳動により測定すると、純度９５％より大であった。
【００１６】
さらにタンパク質の精製を、ＮａＣｌ中にタンパク質３Ｍに調製、続いて２０ｍＭトリス、３ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ₂、ｐＨ７.４中で平衡化させた疎水性相互作用樹脂（Toyopearl phenyl ６５０Ｍ、TosoHaas）に吸着させることにより行った。ＣａＣｌ₂を含まないカラムの２倍容量の平衡化緩衝液で洗浄後、組み換ひとプロテインＣを、２０ｍＭトリス、ｐＨ７.４で溶出させた。溶出したタンパク質を残留カルシウムの除去による活性化のために調製した。組み換ひとプロテインＣをカルシウムを除去するために金属親和性カラム（Chelex−１００、Bio-Rad）を通過させ、再度陰イオン交換体（Fast Flow Ｑ、Fharmacia）に結合させた。これらのカラムの両方を直列に配列し、２０ｍＭトリス、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７.４中で平衡化させた。タンパク質を充填後、Chelex−１００カラムを、カラムと同容量の緩衝液で洗浄した後、このカラムを直列から切り離した。陰イオン交換カラムは、カラムの３倍量の平衡化した緩衝液で洗浄した後、０.４ＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−酢酸塩、ｐＨ６.５でタンパク質を溶出させた。組み換ひとプロテインＣおよび組換え活性化プロテインＣ溶液のタンパク質濃度を、それぞれＵＶ２８０ｎｍ吸光度を測定し、それぞれＥ（０.１％）＝１.８５または１.９５であった。
【００１７】
実施例２
組換えひとプロテインＣの活性化
ウシのトロンビンを、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳの存在下、ｐＨ７.５、４℃にて活性化したＣＨ−セファロース４Ｂ（Ｐharmacia）に結合させた。およそ５０００単位トロンビン／ｍｌ樹脂を用いてカラムに充填した樹脂上で結合反応させた。トロンビン溶液をおよそ３時間、カラムの中を循環させた後、循環溶液０.６ｍｌ／ｌの濃度でＭＥＡを加えた。ＭＥＡ−含有溶液はさらに１０−１２時間循環させ、樹脂上の未反応アミンを確実に完全に封鎖した。封鎖後、トロンビン−結合樹脂をカラムの１０倍容量の１ＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリス、ｐＨ６.５で洗浄し、非特異的結合タンパク質をすべて除去し、活性化緩衝液中で平衡化した後活性化反応に用いた。
【００１８】
精製ｒＨＰＣをＥＤＴＡ（残留カルシウムをキレート化するために）中で５ｍＭに調製し、２０ｍＭトリス、ｐＨ７.４または２０ｍＭトリス−酢酸塩、ｐＨ６.５で２ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。これを５０ｍＭＮａＣｌおよび２０ｍＭトリス、ｐＨ７.４または２０ｍＭトリス−酢酸塩、ｐＨ６.５のどちらかで３７℃にて平衡化したトロンビンカラムを通過させた。流速はｒＨＰＣおよびトロンビン樹脂の間の接触時間がおよそ２０分間であるように調節した。溶出物を集め、直ちにアミド分解活性を検定した。ａＰＣの標準曲線と比較して、物質が比活性（アミド分解）を有さない場合、ｒＨＰＣの活性化を完成させるためにトロンビンカラム上で再循環させた。その後、次の工程までの間、７.４または６.５のいずれかのｐＨで上記と同じ２０ｍＭ緩衝液で物質の１：１希釈を行い、ａＰＣを低濃度に保ち、次の処理工程に用いた。
【００１９】
物質ａＰＣから浸出したトロンビンの除去は、１５０ｍＭＮａＣｌを含む活性化緩衝液（２０ｍＭトリス、pＨ７.４または２０ｍＭトリス−酢酸塩、pＨ６.５のいずれか）中で平衡化された陰イオン交換樹脂（Fast Flow Ｑ、Pharmacia）にａＰＣを結合させることにより行った。トロンビンはこれらの条件下で陰イオン交換樹脂と相互作用しないが、カラムを通過させ、試料用溶出液とする。ａＰＣをカラムに充填すると、カラムの２−６倍の容量の２０ｍＭ平衡化した緩衝液で洗浄し、５ｍＭトリス−酢酸塩、pＨ６.５または２０ｍＭトリス、pＨ７.４のいずれか中０.４ＭＮａＣｌを用いる工程溶出液で結合ａＰＣを溶出させた。カラムの多量の洗浄はドデカペプチドのより完全な除去を容易にした。このカラムから溶出された物質を凍結溶液（−２０℃）中または凍結乾燥した粉末としてのいずれかで貯蔵した。
【００２０】
ａＰＣのアミド分解活性（ＡＵ）を、ベックマンＤＵ−７４００ダイオード配列分光光度計を用いてカビ・ビトラム社製合成基質Ｈ−Ｄ−Ｐhe−Ｐip−Ａrg−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２３８）からのｐ−ニトロアニリンの遊離により測定した。活性化プロテインＣの一単位を、９６２０Ｍ^-1ｃｍ^-1の４０５ｎｍでのｐ−ニトロアニリンの吸光係数を用いて、１分間に、２５℃、ｐＨ７.４にてｐ−ニトロアニリン１μモルを遊離させるのに必要な酵素量として定義した。
【００２１】
活性化プロテインＣの抗凝血活性を、活性化部分トロンボプラスティン時間（ＡＰＴＴ）凝血検定法における凝血時間の延長を測定することにより決定した。標準曲線は、１２５−１０００ｎｇ／ｍｌからプロテインＣ濃度の範囲に及ぶ希釈緩衝液（１ｍｇ／ｍｌラジオイムノアッセイグレイドＢＳＡ、２０ｍＭトリス、ｐＨ７.４、１５０ｍＭＮａＣｌ、０.０２％ＮａＮ₃）にて作成し、一方、試料はこの濃度範囲のいくつかの希釈で調製した。それぞれ試料キュベットに、冷却した馬の血漿および再製活性化半トロンボプラスティン時試薬（reconstituted activated partial thromboplastin：ＡＰＴＴ試薬、Ｓigma）を加え、３７℃で５分間インキュベートした。インキュベート後、適当な試料または標準液５０μｌを各キュベットに加えた。希釈緩衝液を試料または標準液の代わりに用いて基底凝血時間を測定した。フィブロメーターのタイマー（ＣｏＡスクリーナー止血装置、American Labor）を、それぞれ試料または標準液に３０ｍＭＣａＣｌ₂を５０μｌ、３７℃にて加えた後直ちに始動させた。試料中の活性化プロテインＣ濃度を標準曲線の線形回帰方程式から計算した。ここに記載の凝血時間は標準曲線試料を含むそれぞれ３個の最小値の平均値である。
【００２２】
比較研究のための試料を調製するために、ａＰＣ（２０ｍＭトリス中７.３ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍＭＮａＣｌ）の完全な自己分解は２５℃で４４時間インキュベート後または陰イオン交換樹脂（ＦＦＱ、Pharmacia）上でｐＨ７.４、４℃にて濃縮後に終了させた。アミド分解活性測定法、ＨＰＬＣ、Ｎ−末端配列およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを試料について行い、自己分解量およびアミノ酸配列上の開裂部位を確認および定量分析した。
【００２３】
実施例３
活性化プロテインＣ安定化定量分析
ａＰＣの活性上のｐＨ効果をＡＵを観察することにより実験した。３つの緩衝液系を、ＭＥＳ（ｐＨ５.５−７）、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６.８−８.２）、およびＣＨＥＳ（ｐＨ８.６−１０）を各５０ｍＭ用いて、６−９.３（ｐＨ単位増加分０.３にて）の範囲でｐＨ条件を設定して用いた。ａＰＣを適当なｐＨ緩衝液を用いて０.４ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるように希釈し、この濃度でインキュベートした後活性の測定をした。インキュベーションｐＨにてアミド検定法を用いて４℃にて初期時間および４℃にて３０時間後の両方で試料を検定した。これらの測定はアミド分解活性のためのつりがね型のｐＨ依存性を示した。これらの定量の結果を以下の表１に示す。
【表１】

ａＰＣの最大活性はｐＨ７.４であるが、両極端の６および９.３のｐＨ値は大きく減少した活性を示す。ａＰＣは極端なｐＨで何らかのアミド分解活性を保持することが明らかであり、このデータは、ａＰＣが最大活性を有するｐＨ条件を避けることにより自己分解が減少することを示している。
【００２４】
ａＰＣのアミド分解活性ｐＨ依存性がＥＡＫフラグメント生成の関数であるかどうか決定するために、ａＰＣ試料をｐＨ６.０、７.５および９.０、１.５ｍｇ／ｍｌで、４℃にて１８時間インキュベートした。生成したＥＡＫ量をＥＡＫ ＨＰＬＣピーク下の面積の積算およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のＥＡＫバンドの定量的観察により測定した。これらのデータはｐＨ６.０でインキュベート中のＥＡＫ生成において増加を示さなかったが、ｐＨ７.５でおよそ３０％の増加およびｐＨ９.０でおよそ５０％の増加であった。ｐＨ７.５および９.０の試料中ＥＡＫフラグメントの高濃度にもかかわらず、ｐＨ７.４で測定した場合に製剤はなお高いＡＵ活性を有した。すなわち、ＥＡＫフラグメントの発生はアミド分解活性の損失と必ずしも関係しているとは限らない。むしろ、ＥＡＫフラグメントはａＰＣの重鎖の残余部分と十分に関係して存在しているにちがいなく、セリンプロテアーゼ機能を維持している。どちらかと言えば、より高いＥＡＫフラグメント含有量は、より高いアミド分解活性と関係しているといえる。
【００２５】
ＥＡＫフラグメントは触媒的三構成（トリアド）（重鎖のＮ−末端部中に見られるＨis２１１およびＡsp２５７を含む）の活性部位セリン（残基３６０）を含む。それゆえに、もしＥＡＫフラグメントが重鎖の残部に共有的に結合していない場合、このタンパク質切除は酵素活性の減少をもたらし得る。抗凝血活性に対するＥＡＫの種々の量の効果をみるために、ａＰＣのいくつかの異なったロットを、上述の実施例１および２に記載と同様にして製造した。アミド分解検定を、２２−１９８ｕＭ ＃Ｓ−２２３８の範囲の基質濃度、１.６−３.３ｎＭ（７５−１５０ｎｇ／ｍｌ）、２０ｍＭトリス、ｐＨ７.４、１５０ｍＭＮａＣｌの範囲のａＰＣ濃度で行った。この検定の結果を下記の表２に示す。
【表２】

【００２６】
分解のpＨ依存性は種々の量のＥＡＫを含むａＰＣ試料を作成するために利用した。これらの試料は上述の実施例１および２に記載と同様にして製造した。種々の含有量のＥＡＫフラグメントを含む試料は完全なａＰＣ（＜３％ＥＡＫフラグメント）と比較した。Ｋm、ＫcatおよびＶmax値を含むアミド分解速度論的パラメーターを３つの異なる酵素濃度で各３つのロットについて測定し、それを表３に要約する。
【表３】

３つのａＰＣ試料のＫm値は実験誤差の範囲で同じと思われ、基質０.１６ｍＭの平均値を示した。これは基質Ｓ−２２３８の親和性が分解したａＰＣに中断されていないことを示している。驚くべきことに、分解物質は完全なａＰＣのものと本質的に同様のＡＵ活性をいまだ有していた。
【００２７】
活性化プロテインＣは完全なアミド分解機能を有するのに対してトリペプチド物質（＃Ｓ−２２３８）でさえ高ＥＡＫフラグメント含量を有している。インビトロ抗凝血活性はＡＰＴＴ検定法で測定され得る。意外にも高ＡＵ活性は抗凝血活性と相関関係がなかった。一方、ＡＵ活性は増加するＥＡＫ含有量の増加とともに増大し、ＡＰＴＴ活性はＥＡＫ含有量の増加とともに減少した。
【００２８】
ＥＡＫフラグメント生成および活性化プロテインＣ安定性に対する塩濃度の効果が、種々のｐＨ値および塩濃度で活性化プロテインＣの試料をインキュベートし、ついで、１時間当たりのＥＡＫフラグメント生成のパーセントを測定することにより検討された。検定法におけるプロテインＣの濃度はミリリットル当たり４−５ミリグラムの間であった。すべての検定はリン酸緩衝液５−２０ｍＭ中で行われた。塩化ナトリウムを塩（塩が存在する場合）として使用し、すべての検定は２５℃で行った。１時間当たりのＥＡＫフラグメント生成のパーセントをＨＰＬＣ積算により測定した。これらの検定の結果を下記の表４に示す。
【表４】

Claims (16)

1. 活性化プロテインＣの分解を最小化する方法であって、上記方法が上記活性化プロテインＣをpＨが約６.３および約７.０の間の溶液中に維持することを特徴とする方法。
2. 上記溶液が約０.０５０Ｍより低いかまたは約０.４０Ｍより高い塩濃度である、請求項１記載の方法。
3. 上記溶液が約０.０５０Ｍより低い塩濃度である、請求項２記載の方法。
4. 上記溶液が約０.０１０Ｍより低い塩濃度である、請求項２記載の方法。
5. 溶液中の塩が塩化ナトリウムである、請求項２記載の方法。
6. 約６.３および約７.０のpＨの間の溶液中に活性化プロテインＣを含む、安定化抗−血栓製剤。
7. さらに約０.０５０Ｍより低いかまたは約０.４Ｍより高い濃度の塩を含む、請求項６記載の製剤。
8. 塩濃度が約０.０５Ｍより低い、請求項７記載の製剤。
9. 緩衝液がトリス−酢酸塩、クエン酸ナトリウム、クエン酸塩−グリシンおよびリン酸ナトリウムを含む群から選ばれる、請求項６記載の製剤。
10. 上記pＨが、６.３および６.５の間である、請求項１記載の方法。
11. 上記pＨが、６.３である、請求項１記載の方法。
12. 上記pＨが、６.４である、請求項１記載の方法。
13. 上記pＨが、６.５である、請求項１記載の方法。
14. 上記溶液が、０.４０Ｍより高い塩濃度である、請求項１１記載の方法。
15. ６.３および６.５の間のpＨで活性化プロテインＣを含むことを特徴とする、活性化プロテインＣの水性溶液。
16. さらに、上記溶液を凍結乾燥する、請求項１記載の方法。