JPS63119675A - 変形組織プラスミン活性化剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規な変形組織プラスミノーゲン活性化剤、
その調製方法および該変形ｔ　−ＰＡ’ｓを含有する医
薬組成物に関する。

以下余白 〔従来技術〕 デリケートな酵素のメカニズムは血液の流動性を制御す
る。凝固因子は、血漿フィブリノーゲンを不溶性フィブ
リンに変換することにより損傷牛血液の急速な凝固を確
保する。線維製溶解酵素は、すでに形成されたフィブリ
ン凝固の正常な除去に対し確実である。もしこれらのメ
カニズムが混乱すると、凝固が脈管床内で不適当に形成
する。このことは、血液の局所流を損いかつ組織不調を
もたらし、その後壊死を作り庖痕組織に変化する。

損傷の部位に応じて、損傷を受けたヒトは、心筋梗塞、
深静脈血栓、肺塞栓症および発作（これらの全ては重大
な公衆の健康上の問題である）を含めてた多様の状態の
一つについて苦しむことになるであろう。

組織損傷は、血流の障害によっては即座に発生せず、む
しろ数時間後に発達する。従って、死滅しそうな領域へ
の血液供給の急速な回復は損傷パーセンテージを最少に
する。次の内容は通常受は入れられる。すなわち、数時
間以内に閉塞した血管の再開口を確保する治療により、
死亡者および不興者の数を際立って減少する可能性があ
り、更にこのような技術を求めた研究において多大の努
力が投入されてきている。

このような問題に対する一つのアプローチは、天然の線
維製溶解酵素の形成を刺激することであった。身体の主
な線維製溶解酵素、プラスミンは、プロ酵素プラスミノ
ーゲンとして血液中を循環し、それからプラスミノーゲ
ン活性化剤、例えば組織プラスミノーゲン活性化剤ｔ−
ＰＡ　（１−２）の作用によりＡ　ｒｇ　（５６０）と
Ｖ　ａｔ　（５６１）間の１個のペプチド結合のタンパ
ク分解開裂によりそれが形成される。プラスミノーゲン
はフィブリンクロットに対する高い親和性をもって結合
し、更にプラスミんに変換されるとフィブリンを分解し
可溶性フラグメントとする。従って、プラスミノーゲン
活性化は線維製溶解治療において理論的概念である。

しかし、プラスミンは非特異性プロテアーゼであり、そ
してもしそれが循環血液中に形成されると、フィブリノ
ーゲン、および凝固因子■および壇を含めて多様の血漿
タンパクを分解する。これらの反応は、初期にはα−２
抗プラスミン、すなわち、血漿中に存在するプラスミン
の高度に有効な化学量論的阻害剤により部分的に抑制さ
れる。

阻害剤が減少と、プラスミンの全身的効果が発生する。

フィブリノーゲンおよび凝塊因子の分解並びに不活性フ
ィブリノーゲン分裂生成物の蓄積は血液を非能率的に凝
固させ、これは重大な出血エピソードを作りうる。従っ
て、プラスミンの総体的活性化は危険である。これは、
線維製溶解治療の中心的問題点である：同時に患者を全
体的線維溶解状態に置くことなく、有効なプラスミノー
ゲン活性化および閉塞部位でのフィブリン除去を得るた
めにはどのようにしたら可能であろうか？数種のプラス
ミノーゲン活性化剤が、線維素溶解剤として病院でテス
トされた。ストレプトキナーゼは、β溶血性レンサ球菌
から誘導されたタンパクであり、これはプラスミノーゲ
ンに結合する。

形成された錯体は活性化酵素であり、これはプラスミノ
ーゲンをプラスミンに変換する。換言すれば、ストレプ
トキナーゼは、プラスミノーゲンを自己賦活酵素とする
。ストレプトキナーゼ作用は、フィブリンクロットの存
在に独立であるのでストレプトキナーゼの全身的副作用
はきわ立っている。

更に、ストレプトキナーゼは細菌タンパクであるので、
該ストレプトキナーゼは重要な免疫応答を誘発する。先
の治療の結果として又は過去のレンサ球菌の感染のため
成る患者はそれに対し抗体を持っている。

ウロキナーゼは、ヒトの尿中に自然に発生するセリンプ
ロテアーゼである。これは、ジスルフィド結合で結合さ
れた２本鎖ペプチドから構成される。ウロキナーゼは、
プラスミノーゲンの有効な活性剤である。これはまたク
リングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）として知られた構造を含み
、このクリングルは一般にフィブリンに対する親和性を
分子に付与する。

しかるに、ウロキナーゼ活性はフィブリンに対する結合
には依存せず、しかもウロキナーゼは試験管内又は生体
内でクロット分解に対する特異性の増加は何ら実証しな
いが、ストレプトキナーゼからの多くの全身副作用を再
生産する。

プロウロキナーゼは、ウロキナーゼのチモーゲン形であ
り、ここにおいてウロキナーゼの２本鎖は未だペプチド
結合によって結合されている。この分子は本質的に酵素
活性を有しない。この分子は、ウロキナーゼそれ自身に
関し増加したクロット特異性を有するであろう。恐らく
、この特異性は、活性ウロキナーゼに対する変換が主に
クロットについて発生することに起因する。メカニズム
は不明である。と言うのは、プロウロキナーゼそれ自身
フィブリンに対し親和性が低いからである。

分子の臨床的価値は未だ不明である。

組織プラスミノーゲン活性剤（ｔ−ＰＡ）はまた、セリ
ンプロテアーゼであり、これは自然の環境のもとでプラ
スミノーゲンを活性化する。更に、フィブリンの存在は
、ｔ−ＰＡ、プラスミノーゲンおよびフィブリン（３，
４およびその中の文献）間の第三番目の活性化複合体の
形成を示す活性化速度の１０００倍までの増加をもたら
すであろう。

ｔ−ＰＡは６５．０００ダルトンのグリコプロティンで
あり、これは２種の五つの形態で、すなわち、１本鎖分
子として、さらに２本鎖がジスルフィド結合により共に
保持されている２本鎖分子としての形態である。これら
の鎖は酵素のＮ末端部分から始まるポリペプチドに対し
Ａ鎖と呼び、酵素のＣ末端部分からのポリペプチドに対
しＢ鎖と呼ぶ（３）。シグナルペプチドおよびブロー配
列を含むヒト前躯体ｔ−ＰＡタンパクの図形式２次元モ
デルを第１図に示す（２０）。このモデルは次のように
推定している。すなわち、Ａ鎖（重鎮）はフィンカード
メイン、増殖因子−様ドメインおよび２個のクリングル
構造（Ｋｌおよびに２）を含む。

Ｂ鎖（軽鎖）はセリンプロテアーゼ活性に対する活性部
位を含む。

１本鎖から２本鎖ｔ−ＰＡへの変換はプラスミンにより
触媒化され、さらにアミノ酸Ａ　ｒｇ　（２７５）およ
びＩ　１ｅ（２７６）間の１個のペプチド結合の開裂か
ら成る（５〜８）。この開裂はプラスミンが通常存在す
るフィブリンの表面上で有効に発生する（以後、ペニカ
等のナンバー系が！＜（８））。

画形の分子は酵素的に活性であるが、２本鎖形は幾分よ
り高い特異活性を有する。２本鎖形への変換の際の活性
化因子は、分析システムにより変化する。構造の他の変
化はまた、ｔ−ＰＡに存する。

例えば、成るｔ−ＰＡ分子は５ｅｒ（１）で始まり、一
方他の分子はＧｌｙ（−３）で始まり、さらに約３００
０ダルトン分子量の変化はＡｓｎ（１８４）に対するグ
リコジル化の存在又は非存在を反映する。

フィブリンがｔ−ＰＡと結合し更にこの活性剤によりプ
ラスミノーゲンの活性化を刺激する能力が強いため、血
栓崩壊治療におけるｔ−ＰＡの使用はプラスミンの全身
活性化から生じる問題を減少するように期待されてきた
。動物における初期の実験並びに血栓症および心筋梗塞
の患者の初期治療はこの考えを支持していると思われた
（９）。

しかし、精力的臨床実験より、以下の内容が判明した。

すなわち、重大な血栓症を示すに必要な極めて高い用量
はしばしば副作用を生じさせる。たとえそれらがストレ
プトキナーゼよりもたらされたものよりもより少なく発
現したとしても、遊離フィブリノーゲンの実質的量がプ
ラスミンに変換する。これは、血漿フィブリノーゲンの
減少を与えかつ患者は出血エピソードを患う。

問題はｔ−ＰＡの固有の酵素活性から生じ、これは循環
ｔ−ＰＡがフィブリン結合前に全身的に作用せしめる。

それはｔ−ＰＡの幾つかの他の性質によって悪化される
。第一に、生体内の血漿中のｔ−ＰＡの半減期は短かく
、そのため、導入された分子の非常に小さい部分のみが
フィブリンクロットに達する。第二に、ｔ−ＰＡの阻害
剤は血漿および組織中に存在しかつ活性ｔ−ＰＡが意図
した標的に達する機会を更に減少する。

今日では、３種のＰＡ−阻害剤が知られており、一つば
内皮細胞（ＦＡＩ−１）から単離されたものであり（Ｆ
ＡＩ−１）、二番目は胎盤からのものであり（ＦＡＩ−
２）、三番目は尿からのものである（ＦＡＩ−３）。

ＦＡＩ−１は、ｔ−ＰＡおよびウロキナーゼの双方を阻
害するのに非常に強力であり、ＦＡＩ−２は１本鎖ｔ−
ＰＡよりもより効果的に二本鎖ｔ−ＰＡを阻害する。ｔ
−ＰＡ阻害剤の高い血漿レベルが急性心筋梗塞（２１）
の患者並びに血栓症の疾患（２２）の患者において見出
された。これらの双方の患者のグループはｔ−ＰＡ治療
に対し標的グループであるので、１種又はそれ以上のこ
れらの阻害剤に対し低い親和性を示す変形ヒ）ｔ−ＰＡ
を有することが望ましいであろう。

〔発明の構成および効果〕

本発明の目的は、プラスミノーゲン活性剤を提供するこ
とであり、これは実質的に全身作用の減少、フィブリン
沈着に対する優先的に局所効果、天然ｔ−ＰＡ阻害剤に
対する親和性の減少および循環血液中の生存時間の増加
を特徴とする。

本発明は次の驚くべき知見に基づ（。すなわち、上述の
特性を有する変形ヒトｔ−ＰＡは１本鎖ヒ）　ｔ−ＰＡ
をｔ−ＰＡ分子中の一定領域中でタンパク質分解的に開
裂するとき得られる。

このような変性ｔ−ＰＡは、好ましくはプロテアーゼ、
例えばキモトリプシン、影罰助工肛旦ｕｓ　Ｖ８プロテ
アーゼ、ペプシンおよびＡｒｍｅｌｌａｒｉａ　ｍｅｌ
ｌｅａプロテアーゼにより１本積ヒトｔ−ＰＡのタンパ
・り分解処理により得ることができる。ｔ−ＰＡはまた
適当な化学的処理により変形される。

本発明中の１本ｉＪ　ｔ　−Ｐ　Ａは適当な源、例えば
ヒト、例えばヒト組織、血液、血清および細胞培養から
得られる。例えば、ｔ−ＰＡはヒトの子宮組織から又は
ヒトメラノーマ細胞系から産生される（ヨーロッパ特許
出願第００４１７６６参照）。ｔ−ＰＡ源はまた例えば
ヨー口・ツバ特許出願第００９３６１９に記載される如
く組換えＤＮＡ−手法により調製できる。

本発明は、更に例えばＰＣＴ特許出願ｔｌｓ８５１０６
１３（ＷＯ番号８６１０１５３８）およびＥＰ特許出願
１９６，９２０および２０７　、５８９に開示される如
く、変性１本鎖ｔ−ＰＡの使用を含む。ＷＯ特許出願８
６１０１５３８において、１本鎖ｔ−ＰＡが開示され、
ここにおいてＬ　ｙｓ　（２７７）は他のアミノ酸、例
えばＩ’ｌｅにより置換される。ＥＰ特許出願１９６，
９２０は、クリングル２に接続した完全なり一鎖を含む
変形ｔ　−ＰＡ’ｓを開示し、ＥＰ特許出Ｈ２０？、５
８９は増殖因子ドメイン内で又はこのドメインを欠く変
形ｔ−ＰＡを開示する。本明細書で用いたｔ−ＰＡは前
述の形の全てを含むものである。

本発明によるタンパク分解の開裂を受けやすい１本鎖領
域のｔ−ＰＡ分子内の領域は、ヒ）１−ＰＡのＢ坑内で
Ｃｙｓ　（４０９）からＣｙｓ　（４４１）に延びてい
る。

本発明によれば、Ｃｙｓ（４０９）−Ｃｌ３（４４１）
　Ｍ域内で分解するであろう分解剤（例えばプロテアー
ゼ）は使用できるであろう。適当な分解は、配列の分析
により又は分解したｔ−ＰＡが本発明方法に機能するか
を試験することのいずれかにより決定できる。

本発明によれば、以下の内容が見出された。すなわち、
分解剤、好ましくはキモトリプシンによる１本鎖ｔ−Ｐ
Ａの処理はアミトリシス活性およびプラスミノーゲン活
性化の双方の著るしい減少をもたらす。Ａ　ｒｇ　（２
７５）で分解させるためプラスミンでキモトリプシン分
解１本鎖ｔ−ＰＡを処理することにより、２回分解した
分子のアミトリシス活性は大きく復活した。更に２本鎖
ｔ−ＰＡ（すなわちプラスミン分解１本鎖ｔ−ＰＡ）は
、８３ｍ内の同ＨＭ内でのキモトリプシン分解後そのア
ミトリシス活性およびプラスミノーゲン活性化作用の双
方を保持し、従って２回分解１本鎖ｔ−ＰＡは同様にそ
のプラスミノーゲン活性化作用を回復することを裏付け
る。すなわち、１本鎖を−ＰＡのキモトリプシン処理は
不活性ｔ−ＰＡ、すなわち実質的に減少した全身活性を
有する変形ｔ−ＰＡを発生させ、これはプラスミンです
なわちフィブリンの表面で活性化されることができ従っ
てフィブリン沈着に対する優先的局所効果を示す。

ｔ−ＰＡ活性は、それぞれアミトリシス活性およびプラ
スミノーゲン活性化作用としてしばしば測定される。ア
ミトリシス活性、すなわち全体の触媒活性は、ｔ−ＰＡ
によって直接開裂され更にアミトリシス活性の好都合の
比色測定を与える発色原の低分子量の基質Ｄ　−Ｉ　ｌ
ｅ　−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ　−ｐＮＡ　（Ｓ　−２２８８
）を含む分析によって測定できる。

プラスミノーゲン活性化作用は、プラスミンによって開
裂される発色原基質Ｄ　−Ｖａｔ　−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ　
−ｐＮＡおよびプラスミノーゲンを含む分析により直接
決定できる。この分析において、色の展開はプラスミン
が沈積するにつれて加速する放物線に従う。加速定数は
ｔ−ＰＡ活性に比例する。

この分析は天然の基質プラスミノーゲンについてｔ−Ｐ
Ａのタンパク分解活性を決定するので、それは線維素溶
解効果により密接に関係する。１−ＰＡ酵素活性のその
刺激を研究するため、フィブリンを含むことは可能であ
る。考慮している目的のため、ｔ−ＰＡの活性又は不活
性は次の分析に従って測定されるであろう。

最も広い面において、本発明は線維素溶解剤として使用
するための新規ｔ−ＰＡを提供することにあり、これは
ｔ−ＰＡ分子中でＣｙｓ　（４０９）からＣｙｓ　（４
４１）に延びるペプチド配列中の１個又はそれ以上の位
置で開裂されかつプラスミンの存在下で活性化され得る
ことを特徴とする。

本発明は、（４０９）　−（４４１）　Ｈ域中で開裂し
た全ての変形ｔ−ＰＡ分子を包み、これは実質的にはｔ
−ＰＡよりも活性が少ないが、プラスミン、特にフィブ
リンと結合したプラスミンの存在下でそれらの活性を復
活又は増加する。

本発明による変形ｔ−ＰＡは好ましくはヒト起源のもの
である。

変形ｔ−ＰＡはＡ鎖中、すなわち上記の如くフィブリン
結合ドメイン中で更に変形される。但し、そのようなさ
らに変形は、本発明によれば実質的効果は存しないこと
を条件とする。そのような更に変形はフィンガーおよび
／又は増殖因子配列および／又はタリングル１又は２の
変形の除去および（又は）変形を含む。

本発明の好ましい態様によれば、変形ｔ−ＰＡはペプチ
ド結合４２０−４２１および／又は４２３−４２４で開
裂される。

本発明に係る変形ｔ−ＰＡは、Ｃｙｓ　（４０９）に結
合したｎ個のアミノ酸残基を含むペプチド配列並びにＣ
ｙｓ　（４４１）に結合したｍ個のアミノ酸残基を含む
ペプチド配列を含むことを特徴とする：但し、ｎおよび
ｍはＯないし約５０の整数である。好ましくは、Ｈ＋ｍ
く５０であり、更に好ましくはｎ＋ｍ＜　３１である。

より詳しくは、変形ｔ−ＰＡはペプチド配列■ニーＧｌ
ｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−＾１ａ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−
Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ−ＧＬｕ−八ｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅ
ｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−３ｅｒ−Ａｒｇ−、（Ｉ
ｆ　） のＮ末端からｎ個のアミノ酸残基を含んで成るＣ　ｙｓ
　（４０９）に結合したペプチド配列並びに該ペプチド
配列■のＣ末端からのｍ個のアミノ酸残基から成るＣ　
ｙｓ　（４４１）に結合したペプチド配列を含有し、ｎ
＋ｍはＯないし３１の整数であり、更にｎ１ｍく３１で
ある。

第１図に示される如き二次元構造を参照すると、本発明
に係る変形ｔ−ＰＡは 一般式■： （式中、Ｘｎはｎ個のアミノ酸残基を含んで成るペプチ
ド配列であり、Ｙｍはｍ個のアミノ酸残基を含んで成る
ペプチド配列であり、ｎおよびｍは０ないし約５０の整
数であり、ＱはＧ−１ｙ（−３）又は５ｅｔ（１）から
Ｇｌｕ（４０８）のヒトｔ−ＰＡ配列、又はそれらのタ
ンパク分解様分解生成物を含むこれらの配列の変形であ
り、ＲはＣｙｓ　（４４１）からＶ　ａ　ｌ　（４８３
）までのヒトｔ−ＰＡ配列であり、さらにＺはＬ　ｅｕ
　（４８５）からＰ　ｒｏ　（５２７）までのヒトｔ−
ＰＡ配列又はそのタンパク分解様分解生成物である（そ
のような分解はプラスミンの存在下変形ｔ−ＰＡの酵素
特性に実質的に影響しない））によって表わすことがで
きる。

式（１）において、好ましくはｎ＋ｍ＜　５０であり、
更に好ましくはｎ＋ｍ＜３１である。

好ましくは、Ｘｎは、ペプチド配列■ニーＧｌｕ−Ｌｅ
ｕ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−１１ｉ
ｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ
−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−
ＧＬｕ−へ１ａ−１１ｉｓ−Ｖａｌ−八ｒｇ−Ｌｅｕ−
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−３ｅｒ−Ａｒｇ−、（ＩＩ　
） のＮ末端からｎ個のアミノ酸残基を含んで成るペプチド
配列であり、ＹＩＩＩはペプチド配列■のＣ末端からｍ
個のアミノ酸残基を含んで成るペプチド配列である：こ
こで、ｎおよびｍは０〜３１の整数であり、ｎ＋ｍ１３
１である。

上記式（１）において、ｎおよびｍはそれぞれ好ましく
は１１および２０　、１４および１７又は１１および１
７である。更に、ｎが１の場合、ｍは３０゜２２　、１
４又は１０でよい。又はｎが９の場合、ｍは２２゜１４
又は１０でよく、ｎが１７であると、ｍは１４又は１０
でよく更にｎが２１の場合、ｍは１０でよい。

配列■は、分子の利用の実質的損失を伴うことなく１個
の又は数個のアミノ酸置換を有することができ、本発明
はこのような置換形を含む。

前記式Ｉにおいて、配列Ｑは上述の如く変形できる。こ
れらの変形はフィンガーおよび／又は増殖因子配列およ
び／又はクリングル１又は２の除去および／又は変形を
含む。

キモトリプシン処理によるアミトリシスおよび線維素分
解活性の同時減少は、キモトリプシンの開裂が１本領ｔ
−ＰＡの活性部位又は活性部位−関連領域に影響を与え
ることを示している。キモトリプシン処理１本鎖ｔ−Ｐ
Ａを減少させる条件下での５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動は、２対の新たな結合が表われたことを示
しており、それぞれ約４５１５０，０００および約１７
／２０，０００のＭｒを有する。Ｎ末端配列分析により
、ｔ−ＰＡのＢ鎖中、ペプチド結合４２０−４２１およ
び４２３−４２４で開裂部位を同定した。これらの開裂
はその酵素活性が失われるような方法でＢ鎖のコンホメ
ーシヨンを混乱させるようである。

プラスミンによる、キモトリプシン−消化１本鎖活性剤
のサンプルの処理がアミトリシス活性を大きく復活させ
るので、結合４２０−４２１並びに４２３−４２４を開
裂することによるキモトリプシンは活性１本鎖活性剤ｔ
−ＰＡを「不活性」チモーゲン（変形ｔ−ＰＡ）に変換
するようであり、従ってこれはＡ　ｒｇ　（２７５）で
プラスミン開裂により再び活性化され得る。

この特許出願に対する一部において基礎となっている、
キモトリプシンの研究に続く第三者によって得られた確
認結果は以下の内容を実証した。

すなわち、５ｔａｐｈ、ａｕｒｅｕｓ　Ｖ８プロテアー
ゼにより４０９−４４１領域（４１８−４１９又は４２
６−４２７で）開裂される、ｔ−ＰＡがプラスミンを用
いた処理により活性化される。

本発明は、開裂剤（好ましくはプロテアーゼ）の使用を
含み、これはこの領域で開裂して不活性ｔ−ＰＡを与え
、これはプラスミンの存在下、特にフィブリンと関連す
る特定のプラスミンの存在下、すなわちフィブリンクロ
ットの場所で活性化する。

残りのｔ−ＰＡ分子の少しのタンパク分解様分解が更に
起こるであろう。このことが本発明の目的に存置な作用
をもたらさない限り、このようなわずかな別途の改変ｔ
−ＰＡは本発明の範囲内にあるものと考えられる。

その第二の面によれば、本発明は変形ｔ−ＰＡの調製方
法を提供するものであり、この方法によれば、対応する
１本領ｔ−ＰＡはＢ鎖中のＣｙｓ（４０９）からＣｙｓ
　（４４１）に延びるペプチド配列中のタンパク分解様
開裂に委ねられる。

本発明の好ましい態様によれば、タンパク分解様開裂は
適当なプロテアーゼ、好ましくはキモトリプシン、５ｔ
ａｐｈ、ａｕｒｅｕｓ　Ｖ８プロテアーゼ又はベブチン
を用いて行なわれる。キモトリプシン開裂は固定化酵素
を用いｐ１１７．５〜８．５でかつ２０〜３０°Ｃで好
ましく行うことができる。いかなる起源のキモトリプシ
ンも使用できる。セファロースに結合させたキモトリプ
シンは、Ｎ−ｐ−トシル−Ｌ−リジンクロモメチルケト
ンを用いた処理によりトリプシン活性が殆どないのが好
ましい。開裂は、１ｍｇのｔ　−Ｐ　Ａ　（０，０１％
のトウィーン８０を含むｐＨ，ｉの０．１８Ｍ　Ｎ）１
．Ｈｃ（ｈ　２０　ｍｊに溶解）を２０■のセファロー
ス誘導体（４０肩のキモトリプシン）と共に約８時間２
５℃でインキュベーションすることにより行うことがで
きる。

ペプシンおよび５ｔａｐｈ、ａｕｒｅｕｓ　Ｖ８プロテ
アーゼにより開裂は遊離酵素を用い、酸性ｐＨ１好まし
くはそれぞれｐＨ２およびｐＨ４で行うことができる。

本発明の第三の面によれば、本発明に係る変形ｔ−ＰＡ
の有効量を含む線維素熔解医薬製剤が提供される。

このような製剤は、好ましくは適当な医薬として許容さ
れ得る担体および賦形剤を含有する緩衝溶液である。水
溶液は、例えば、細胞微生物を保持するため十分に小さ
い孔径を有する膜フィルターに溶液を通して口過するこ
とにより殺菌される。

医薬製剤は通常のｔ−ＰＡと同様の方法でかつそれより
も少ない用量範囲で使用できかつ投与される。

本発明の第四の面によれば、心臓疾患を有する患者の治
療方法が提供されこの方法は上述の如き変形ｔ−ＰＡの
有効量を患者に投与することから成る。

〔実施例〕

例 天然の１本鎖ヒト組織プラスミノーゲン活性剤（ｔ−Ｐ
Ａ）をイムノ　アフィニティ　クロマトグラフィーおよ
びゲル口過により精製した（６）。

二本ｇｔ　−Ｐ　Ａに対し低い親和性を有するセファロ
ース結合モノクローナル抗体は、免疫吸着工程において
用いられた（１　：　３　　Ｃ：　５．　ＢｉｏＰｏｏ
ｌＡＢ　、　Ｕｍｅ５、スウェーデンからＰＡＭＩとし
て入手可能）。

特異活性をクロット−溶解分析により測定しく５）、匈
１１０国際ｔ−ＰＡ基準と比較し８５０，０００車位／
ｇであることが見出された。二本鎖活性剤は１零鎖活性
剤をプラスミン−セファロースで消化することにより調
製した（６）。

プラスミノーゲンを、新たに凍結した血漿からアフィニ
ティ　クロマトグラフィーにより調製した（１０−１２
）。プラスミンは、セファロース−ウロキナーゼ処理に
より産生じた（５）。フィブリノーゲンを新たに凍結し
たシトレート化ヒト血禁から調製しく１３）、次いでセ
ファロース−リシンカラムに通し微量のプラスミノーゲ
ンを除去した（１４）　、フィフ゛リンＩモノマー（ｄ
ｅｓＡＡフィフ゛リンモノマー）を記述の如く調製した
（１２）。

プラスミン（Ｈ−Ｄ　−Ｖａｌ　−Ｐｈｅ　−Ｌｙｓ−
ｐＮＡ。

Ｓ−２３９０）　、キモトリプシン（Ｍｅｏ　−Ｓｕｅ
　−Ａｒｇ−Ｐｒｏ　−Ｔｙｒ−ｐＮＡ、　ｓ　−２５
８６）　、トリプシン（Ｂｅｎｚｏｙｌ　−１１ｅ　−
Ｇｌｕ　−Ｇｌｙ　−Ａｒｇ−ｐＮＡ、　Ｓ　−２２２
２）およびｔ−ＰＡ　（Ｈ−Ｄ　−１ｉｅ−Ｐｒｏ　−
Ａ　ｒｇ　−ｐＮＡ、　Ｓ　−２２８８）に対する発色
原ペプチド基質を、カビピクトラム（ストックホルム、
スウェーデン）から購入した。基質を蒸留水に溶解し５
ｍＭの濃度とした。

ＴｏｓＬｙｓ　ＣＨ２Ｃｊ！処理キモトリプシン、精製
モノクローナル抗体、およびプラスミンをＣＮＢｒ法に
よりセファロース−４Ｂ（ファルマシ、スウェーデン）
に結合させた。タンパクの導入はセファロース−１ｇＧ
に対しゲル１ｇ当たり２■であり、セファロース−プラ
スミンに対し１ｇ当たり１．５■であり、さらにセファ
ロース−キモトリプシンに対しゲル１ｇ当たり２■であ
ることが見出された。

キモトリプシンの特異活性を、キモトリプシン特異基質
（Ｓ　−２５８６）を用いて測定した。基質濃度は２＊
−であった。活性はゲル１ｇ当たり８０１Ｊに相当した
。

Ｎ＆−１）−）シル−し一リジンクロモメチルケトンを
用いた付加的処理を用いセファロース−キモトリプシン
中に尚、存する極かなトリプシン活性を除去した。１ｇ
のセファロース−キモトリプシンを０．１５Ｍの炭酸水
素アンモニウム１５ｍ７に分散させ、１．２　ｍｌのＴ
ｏｓＬｙｓ　ＣＨ２Ｃｊ２溶液（メタノール中３■／ｍ
りを添加した。混合物を８時間＋４℃でインキュベート
し、引き続き０．１５Ｍの炭酸水素アンモニウムで洗浄
し、蒸留水で更に０．０４％のアジ化ナトリウムで洗浄
した。次いでゲルを吸引乾燥し、＋４℃で保存した。

本発明の明細書中成の略号を用いる。

ｔ−ＰＡ：　　　組織プラスミノーゲン活性剤ＤＦＰ　
：　　　　ジイソプロピルフルオロホスフェート ＳＤＳ　：　　　　　ドデシルスルホン酸ナトリウムＴ
ｏｓＬｙｓＣＨｚＣｊ！　　：　Ｎ　−ｐ　−ｔｏｓｙ
ｌ　−Ｌ−リジンクロロメチルケトン 以下余白 ＴｏｓＰｈｅＣＨｚｌＪ！　：　Ｎ　−ｐ　−ｔｏｓｙ
ｌ　−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン 緩衝液Ａ　？　　　０．０６Ｍ　）リス緩衝液、ＨＣｌ
でｐＨ６，８に８周製、１２％グリセーロ ル、１．２％ＳＯＳおよび０．１％ブ ロモフェニルブルー染料を含有 Ｎａ（Ｊ　／Ｐｉ　：　　ホスフェート緩衝食塩水；５
０ｍＭホスフェート、１００ｍＭ　ＮａＣ１（１＝０．
１５）　、０．１　ｇ／ｌ　　ｔ−リドンｘ−ｉｏｏで
ｐＨ７，３ 例１ 理 キモトリプシンによるｔ−ＰＡの消化のため、貯蔵溶液
をＩＭの炭酸水素アンモニウムで希釈し、０．０１％の
トウィーン８０を含有する蒸留水中１：５．５に更に希
釈し、約５０硝／ｍ１の最終濃度を得た。出発物質を代
表するアリコートをとり出し、次いで１００鱈のタンパ
ク当たりセファロース−キモトリプシン（２■）を添加
した。反応混合物を連続エンド−オーバーエンド回転中
、室温でインキュベートした。１５分、３０分、１時間
、２時間、４時間、８時間および２４時間後、インキュ
ベーション容器を遠心分離し、次いでアリコートを取出
し、更に０．４５如７　イＪＬ／ター（ＨＶ　４　、　
Ｍｉｌｌｉ−ｐｏｒｅ）を通した。２５ｍのアリコート
２種の各々を５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
用に凍結乾燥し、次いで残りの物質を一９０℃で保存し
た。

クロモトリプシン処理ｔ−ＰＡのアミトリシス活性を、
基質−Ｈ−Ｄ　−１１ｅ　−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ−ｐＮＡ
（Ｓ−２２８８）で測定した。消化実験からのサンプル
をＮａＣ１／Ｐｉ中各々１：２０および１：４０に希釈
し、次いで１００Ｉ１７の希釈サンプルをマイクロティ
タープレートのウェル中１００４の０．８ｍＭのＳ−２
２８８と混合した。フィブリンの存在下での分析用に、
２μｌのフィブリン■モノマー（最終濃度０．３禮）を
ウェルに添加した（１７）。フローラボラリ−からのテ
ィタテーク　マルチイスカン（ＴｉｔｅｒｔｅｋＭｕｌ
ｔｉｓｋａｎ）を分光光度測定用に用いた。４０５鱈ｍ
で並びにフィブリンによって引きおこされる濁り度を矯
正するため４９２鱈ｍでの吸光度を１０分毎に測定した
。濁り度の矯正吸光度Ａ４゜Ｓ　　ａ４ｑｚを計算し、
これからアミトリシス活性７分を測定した。

プラスミノーゲン活性化作用を、発色原基質分析により
測定した（１８）。ミクロティタープレートのウェル中
、１００μｆのサンプル（ＮａＣ１／Ｐｉ中、それぞれ
１：４０および１　：　３２０，０００に希釈）を、２
戸のＧｌｕ−プラスミノーゲンおよび１ｍＭのＨ−Ｄ　
−Ｖａｌ　−Ｐｈｅ　−Ｌｙｓ−ｐＮＡ（ｓ−２３９０
）を含有する、１００Ｉｌｌの試剤と混合した。フィブ
リンの存在下で測定するため、２Ｉのフィブリン■モノ
マーを添加した。濁り度矯正吸光度を上述の如く測定し
た。アッセイの線状範囲内での測定を確保するため、０
．１５〜０．４の間の吸光度を選択した。プラスミノー
ゲン活性化の平均速度を、吸光度を時間の平方のそれで
割ることにより計算した（Ａ／ｈ”）（１８）。

アミノ酸配列の分析は、エレクトロイルージョンコンセ
ントレータ−（Ｃ，Ｂ、Ｓ、サイエンティフィック　カ
ンパニー、Ｉｎｃ、デルウニ、ＵＳＡ）を用い、ポリア
クリルアミドゲルから溶出したペプチドフラグメントに
ついて行った。溶出用緩衝液は、０、１％ＳＯＳを含む
０．０５Ｍの炭酸水素アンモニウムであった。０．２〜
１ｎモルのペプチドを有するサンプル（０，５〜２ｍ１
）を、口過し、窒素下で濃縮し次いで製造者の指示に従
いプログラムされた、アプライドバイオシン上シス４フ
０Ａガス相シークエンサーに５０ｍアリコートとして充
てんした。フェニルチオヒダントイン誘導体を高速液体
クロマトグラフィーで分析した（７　、１９）。

キモトリプシン処理は第２図に示すようにアミトリシス
活性の連続的減少をもたらし、この第２図において、出
発物質中のそのパーセントとして現われた残留活性がキ
モトリプシン消化の時間に対しプロットされる。２時間
の消化後、活性は５０％に減少し、８時間後アミトリシ
ス活性の１０％が残存した。フィブリンの存在および非
存在下で測定したプラスミノーゲン活性化作用は同様に
減少した。１本鎖ｔ　−Ｐ　Ａをキモトリプシンなしで
同様の条件で８時間インキュベートすると、アミトリシ
ス活性又はプラスミノーゲン活性化のいずれにおいても
著るしい変化は認められなかった。

キモトリプシン処理ｔ−ＰＡの５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を還元後に行った。Ｍｒ４５１５０、
０００に相当する二重バンドが、それぞれ約１７．００
０および２０．０００のＭｒを有する新しい２個のバン
ドと共に１５分後に検出された。更に消化後、完全な１
本鎖活性剤に相当するバンドが消失した。

主バンドに相当するフラグメントがポリアクリルアミド
ゲルから溶出し、Ｎ−末端アミノ酸配列分析に委ねた。

少なくとも１０個の残基は各フラグメントに対し同定さ
れた。４５１５０，０００フラグメントは天然のタンパ
クのＮ末端部を有する。１７／２０．０００フラグメン
トがＢ　ＩＮからの起源であることが見出されさらにこ
れらのフラグメントのＮ末端配列は天然プロティンのＴ
ｙｒ（４２’４）で出発した。

小部分、１７，０００フラグメントの約１５％は５ｅｔ
（４２１）で出発した。

キモトリプシン消化１本鎖ｔ−ＰＡのプラスミン処理は
、０．０１％トウィーン８０を含有する０、１５Ｍ炭酸
水素アンモニウムに１：１０で希釈した３０μ！のアリ
コートを用いて行った。セファロース−プラスミン（６
■）を添加し次いで４５分間室温でエンド−オーバーエ
ンド回転後、ＬｏｏＩＪｌのインキュベーション？容液
を０．４５−フィルターで口過した。ＮａＣｊ！　／Ｐ
ｉ中に希釈後、アミトリシス活性を直ちに分析した。

プラスミンによるキモトリプシン消化１本鎖ｔ−ＰＡの
処理は、第３図に示すようにアミトリシス活性の著るし
い増加をもたらす：第３図中、プラスミン処理前（暗色
領域）およびプラスミン処理後（明色領域）のサンプル
（１：２０に希釈）のアミトリシス活性を非処理出発物
質のアミトリシス活性のパーセントとして表わす。上方
のわくの上の数字は各サンプルに対する相対的増加を示
す。８時間のキモトリプシン消化後でさえ、プラスミン
処理後のアミトリシス活性は出発物質（キモトリプシン
処理前）のそれに相当するレベルに増加した。

従って、プラスミン処理は「不活性」の変形ｔ−ＰＡを
再度活性化しうる能力があることを実証した。

例２ ２　　ｔ”ｔ−ＰＡのキモト１プシン几２本鎖ｔ−ＰＡ
を、例■の１本鎖ｔ−ＰＡに対すると同様の処理条件の
もとキモトリプシンで消化した。キモトリプシン処理２
本鎖ｔ　−Ｐ　Ａのアミトリシス活性およびプラスミノ
ーゲン活性を、フィブリンの存在下および非存在下で測
定した。

アミトリシス活性の測定に対し、サンプルを１：１２０
に希釈した。プラスミノーゲン活性に対し、サンプルを
それぞれ１：２００および１　：　３２０，０００に希
釈した。結果を第４図に示す。図中、出発物質中の残留
活性の％として表わされた残留活性を、キモトリプシン
消化の時間に対しプロットする。

１本鎖ｔ−ＰＡとの著るしい差異が見出された。

アミトリシス活性は、８時間後でさえも裔いま＼であっ
た。１本鎖ｔ−ＰＡをキモトリプシンで処理した場合、
プラスミノーゲン活性化作用は相当に高いま−であった
。

電気泳動分析によれば、先に述べた１７／２０，０００
フラグメントが又、２本領ｔ−ＰＡをキモトリプシンで
処理することによって形成されることが分った。かくし
て、２本領ｔ−ＰＡのキモトリプリプシン処理により、
キモトリプシン変形１本鎖ｔ−ＰＡのプラスミン処理と
同じ分子が得られる。

従って、証拠により以下の内容が明らかにされる。すな
わち、キモトリプシン変形１本鎖を−ＰＡのプラスミン
処理は又、プラスミノーゲン活性化を回復すべく機能し
得る。

文献 １、　　Ｃｏ１１ｅｎ、Ｄ、（１９８０）　Ｔｈｒｏｍ
、Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、４３＋７７−８９゜２、　　Ｗ
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Ｂｅｒｇｓｄｏｒｆ、Ｎ、、Ｗａｌｌｅｎ＋Ｐ、　＆　
Ｊ８ｒｎｗａｌｌ、Ｈ，（１９８４）　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　２３＋３７０Ｌ３７０７゜ ８、　　Ｐｅｎｎ１ｃａ、Ｄ、、Ｈｏｌｍｅｓ、Ｗ、Ｂ
、＋Ｋｏｈｒ＋Ｗ、Ｊ、、Ｈａｒｋｆｎｓ＋Ｒ，Ｎ、、
Ｖｅｈａｒ、Ｇ、Ａ、、ｗａｒｄ、Ｃ，Ａ、Ｂｅｎｎｅ
ｔ、Ｗ、Ｐ、　＆　Ｃｏ−１１ｅｎ、０．（１９８３）
　Ｎａｔｕｒｅ　３０１，２１４−２２１゜９、　　Ｖ
ａｎ　ｄｅ　Ｗｅｒｆ　ｅｔａｌ、（１９８４）、Ｎｅ
ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　３１０　（
１９８４）、６０９−６１３゜１０、　Ｄｅｕｔｓｃｈ
、Ｄ、Ｇ、　＆　Ｍｅｒｔｚ、Ｅ、Ｔ、（１９７０）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ１７０　、　１０９５−１０９６゜ １１、　Ｗｉｍａｎ＋Ｂ、　＆　Ｗａｌｌｅｎ、Ｐ、（
１９７３）　Ｅｕｒ、Ｊ、８ｉｏｃｈｅｍ。

皿、２５−３１゜ １２、　ＷａｌＬ６ｎ、Ｐ、　＆　Ｗｉｍａｎ、Ｂ、（
１９７２）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏ−ｐｈｙｓ、　Ａ
ｃｔａ二針ユ、　１２２−１３４゜１３、　Ｂｌｏｍｂ
ａｃｋ、Ｂ、　＆　Ｂｌｏｍｂａｃｋ、Ｍ、（１９５６
）　Ａｒｋ、Ｋｅｍｉ。

１０、４１５−４４３゜ １４、’　Ｍａｔｓｕｄａ＋Ｐ１．、Ｉｗａｎａｇａ、
Ｓ、　＆　Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｓ、（１９７２）Ｔｈｒ
ｏｍｂ、Ｒｅｓ、土、６１９−６３０゜１５、　Ｎｏｒ
ｒｍａｎ、Ｂ、、Ｗａｌ１６ｎ、Ｐ、　＆　ＲＭｎｂｙ
、Ｍ、（１９８５）Ｅｕｒ。

Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１士し、　１９３−２００゜１
６、　Ａｘ６ｎ、Ｒ，、Ｐｏｒａｔｈ、Ｊ、　＆　Ｅｒ
ｎｂａｃｋ、ｓ、（１９６７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ
、）　２１４．１３０２−１３０４゜１７、　ＲＡｎｂ
ｙ、Ｍｚｐ　５ｕｅｎｓｅｎ、Ｅ、＋Ｂｅｒｇｓｄｏｒ
４＋Ｎ、＋Ｎｏｒｒｍａｎ。

Ｂ、　＆　Ｗａｌｌｅｎ、Ｐ、（１９８３）　Ｐｒｏｇ
、Ｐｉｂｒｉｎｏｌｙｓ、　　６゜１８２−１８４゜ １８、　ＲＭｎｂｙ、Ｍ、、Ｎｏｒｒｍａｎ、Ｂ、　＆
　Ｗａｌｌ＠ｎ、Ｐ、（１９８２）Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅ
ｓ、　２７，７４３−７４９゜１９、　Ｚｉｍｍｅｒｍ
ａｎ＋Ｃ，Ｌ、Ａｐｐｅｌｌａ＋Ｅ、　＆　Ｐ：５ａｎ
ｏ、Ｊ、Ｊ。

（１９７７）　Ａｎａｌ、Ｂｆｏｃｈｅｍ、７７．５６
９−５７３゜２０、　　（Ｎｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８Ｈ１９８
４）５３５８）　。

２１、　　Ｈａｍｓｔｅｎ、Ａ、、Ｗｉｍａｎ、Ｂ、、
ｄｅ　Ｆａｉｒｅ、Ｕ、ａｎｄ　Ｂｌｏｍ−ｂ：ｉｃｋ
、Ｍ、：Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｐｌａｓｍａ　１ｅｖｅ
ｌｓ　ｏｆ　ａ　ｒａｐｉｄｉｎｈｔｂｉｔｏｒ　ｏｆ
　　ｔｉｓｓｕｅ　ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉ
ｖａｔｏｒｉｎ　ｙｏｕｎｇ　５ｕｒｖｉｖｏｒｓ　ｏ
ｆ　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　　１ｎｆａｒｃｔｉｏｎ。

Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、　３１３　（１９８５）１
５５７−６３゜２２、Ｎｉ１ｓｓｏｎ、１．Ｍ、、Ｌｊ
ｕｎｇｎ６ｒ＋Ｈ，ａｎｄ　Ｔｅｎｇｂｏｒｎ、Ｌ、：
Ｔｗｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　
　ｉｎ　ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ　ｆｉｂ−ｒｉｎｏｌｙｓ
ｉｓ：Ｉｏｗ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｊｏｎ　ｏｆ　ｐ
ｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｒ　１ｎ
ｃｒｅａｓｅｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆｐ
ｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　１ｎｈｉ
ｂｉｔｏｒ、Ｂｒ１ｔ、Ｍｅｄ。

５０％３０　（１９８５）１４５３−５６゜

【図面の簡単な説明】

第１図は、シグナルペプチドおよびブロー配列を含むヒ
ト前駆体の図式的二次元モデルを示す模式図であり、 第２図は、キモトリプシン消化１本鎖ｔ−ＰＡのアミト
リシス活性およびプラスミノーゲン活性化作用を示すグ
ラフであり、 −第３図はプラスミノーゲン処理前および処理後のキモ
トリプシン消化１本ｔＭ　ｔ　−Ｐ　Ａのアミトリシス
活性を示すグラフであり、 第４図はキモトリプシン処理２本鎖ｔ　−Ｐ　Ａのアミ
トリシス活性およびプラスミノーゲン活性化作用を示す
グラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｃｙｓ（４０９）からＣｙｓ（４４１）までの配列
   中の１個又はそれ以上の位置で開裂され、本質的に線維
   素溶解的に不活性であるが、プラスミンの存在下で活性
   化される能力のあることを特徴とする、線維素溶解剤と
   して使用するための変形ｔ−ＰＡ。 ２、変形ｔ−ＰＡがヒト起源である、特許請求の範囲第
   １項記載の変形ｔ−ＰＡ。 ３、フィブリン結合ドメインで更に変形されている、特
   許請求の範囲第２項記載の変形ｔ−ＰＡ。 ４、フィンガードメインで更に変形されている特許請求
   の範囲第３項記載の変形ｔ−ＰＡ。 ５、フィンガーおよび増殖因子配列を欠いている、特許
   請求の範囲第３項記載の変形ｔ−ＰＡ。 ６、更にクリングル１を欠いている、特許請求の範囲第
   ３項記載の変形ｔ−ＰＡ。 ７、増殖因子配列中で変形されているか又は該増殖因子
   配列を欠いている特許請求の範囲第３項記載の変形ｔ−
   ＰＡ。 ８、ペプチド結合４２０−４２１および／又は４２３−
   ４２４で開裂されている、特許請求の範囲第１項から第
   ７項までのいずれか１項に記載の変形ｔ−ＰＡ。 ９、Ｃｙｓ（４０９）に結合したｎ個のアミノ酸残基並
   びにＣｙｓ（４４１）に結合したｍ個のアミノ酸残基（
   ここで、ｎおよびｍは０ないし約５０の整数である）を
   含んでなるペプチド配列を含有する、特許請求の範囲第
   １項から第７項までのいずれか１項に記載の変形ｔ−Ｐ
   Ａ。 １０、ｎ＋ｍ≦５０である、特許請求の範囲第９項記載
   の変形ｔ−ＰＡ。 １１、ｎ＋ｍ≦３１である、特許請求の範囲第１０項記
   載の変形ｔ−ＰＡ。 １２、Ｃｙｓ（４０９）に結合したペプチド配形が、ペ
   プチド配列II： 【アミノ酸配列があります】（II） のＮ末端からｎ個のアミノ酸残基から成り、更にＣｙｓ
   （４４１）に結合したペプチド配列がペプチド配列IIの
   Ｃ末端からｍ個のアミノ酸残基から成る（ここでｎおよ
   びｍは０〜３１の整数であり、ｎ＋ｍ≦３１である）、
   特許請求の範囲第９項記載の変形ｔ−ＰＡ。 １３、一般式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｘｎはｎ個のアミノ酸残基を含んで成るペプチ
   ド配列であり、Ｙｍはｍ個のアミノ酸残基を含んで成る
   ペプチド配列であり、ｎおよびｍは０ないし約５０の整
   数であり、ＱはＧｌｙ（−３）又はＳｅｒ（１）からＧ
   ｌｕ（４０８）のヒトｔ−ＰＡ配列、又はそれらのタン
   パク分解様分解生成物を含むこれらの配列の変形であり
   、ＲはＣｙｓ（４４１）からＶａｌ（４８３）までのヒ
   トｔ−ＰＡ配列であり、さらにＺはＬｅｕ（４８５）か
   らＰｒｏ（５２７）までのヒトｔ−ＰＡ配列又はそのタ
   ンパク分解様分解生成物である）を有する、特許請求の
   範囲第１項から第７項までのいずれか１項に記載の変形
   ｔ−ＰＡ。 １４、ｎ＋ｍ≦５０である、特許請求の範囲第１３項記
   載の変形ｔ−ＰＡ。 １５、ｎ＋ｍ≦３１である、特許請求の範囲第１３項記
   載の変形ｔ−ＰＡ。 １６、Ｘｎが、ペプチド配列II： 【アミノ酸配列があります】（II） のＮ末端から、ｎ個のアミノ酸残基を含んで成るペプチ
   ド配列であり、Ｙｍがペプチド配列IIのＣ末端からｍ個
   のアミノ酸残基を含んで成るペプチド配列である（ここ
   で、ｎおよびｍは０〜３１の整数であり、ｎ＋ｍ≦３１
   である）、特許請求の範囲第１３項記載の変形ｔ−ＰＡ
   。 １７、ｎが１１であり、ｍが２０である、特許請求の範
   囲第１２項又は第１６項記載の変形ｔ−ＰＡ。 １８、ｎが１４であり、ｍが１７である、特許請求の範
   囲第１２項又は第１６項記載の変形ｔ−ＰＡ。 １９、ｎが１１であり、ｍが１７である、特許請求の範
   囲第１２項又は第１６項記載の変形ｔ−ＰＡ。 ２０、ｎが１であり、ｍが３０、２２、１４又は１０で
   ある、特許請求の範囲第１２項又は第１６項記載の変形
   ｔ−ＰＡ。 ２１、ｎが９であり、ｍが２２、１４又は１０である、
   特許請求の範囲第１２項又は第１６項記載の変形ｔ−Ｐ
   Ａ。 ２２、ｎが１７であり、ｍが１４又は１０である、特許
   請求の範囲第１２項又は第１６項記載の変形ｔ−ＰＡ。 ２３、ｎが２１であり、ｍが１０である、特許請求の範
   囲第１２項又は第１６項記載の変形ｔ−ＰＡ。 ２４、線維素溶解組成物の調製における、特許請求の範
   囲第１項から第２３項までのいずれか１項に記載の変形
   ｔ−ＰＡの使用。 ２５、対応する１本鎖ｔ−ＰＡを、Ｃｙｓ（４０９）か
   らＣｙｓ（４４１）に延びるペプチド配列中での開裂に
   委ねることを含んで成る特許請求の範囲第１項から第２
   ３項までのいずれか１項に記載の変形ｔ−ＰＡの調製方
   法。 ２６、１本鎖ｔ−ＰＡがヒト７本鎖ｔ−ＰＡである、特
   許請求の範囲第２５項記載の方法。 ２７、開裂がプロテアーゼを用いて行なわれる、特許請
   求の範囲第２５項又は第２６項記載の方法。 ２８、プロテアーゼがキモトリプシンである、特許請求
   の範囲第２７項記載の方法。