JPH07143877A - 新規なｔ−ＰＡ類似体 - Google Patents
新規なｔ−ＰＡ類似体Info
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- JPH07143877A JPH07143877A JP6197635A JP19763594A JPH07143877A JP H07143877 A JPH07143877 A JP H07143877A JP 6197635 A JP6197635 A JP 6197635A JP 19763594 A JP19763594 A JP 19763594A JP H07143877 A JPH07143877 A JP H07143877A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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Abstract
(57)【要約】
【構成】ｔ−ＰＡのアミノ酸配列中、天然型のｔ−ＰＡ
のアミノ酸配列の２８０位から３０４位に相当するアミ
ノ酸配列の全部又は一部が対応関係を有するＵＫのアミ
ノ酸配列に置換されており、かつその置換領域が天然型
のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２９４位から２９８位に対
応するＵＫの１７７位から１８０位のアミノ酸配列；Ｔ
ｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ（配列番号：１）を少な
くとも含むアミノ酸配列からなることを特徴とする、ｔ
−ＰＡ類似体。 【効果】本発明のｔ−ＰＡ類似体は、フィブリン特異性
が上昇した新規なｔ−ＰＡ類似体であり、全身性の出血
傾向というｔ−ＰＡの副作用を減じた血栓症治療剤とし
ての利用が期待される。
のアミノ酸配列の２８０位から３０４位に相当するアミ
ノ酸配列の全部又は一部が対応関係を有するＵＫのアミ
ノ酸配列に置換されており、かつその置換領域が天然型
のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２９４位から２９８位に対
応するＵＫの１７７位から１８０位のアミノ酸配列；Ｔ
ｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ（配列番号：１）を少な
くとも含むアミノ酸配列からなることを特徴とする、ｔ
−ＰＡ類似体。 【効果】本発明のｔ−ＰＡ類似体は、フィブリン特異性
が上昇した新規なｔ−ＰＡ類似体であり、全身性の出血
傾向というｔ−ＰＡの副作用を減じた血栓症治療剤とし
ての利用が期待される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規な組織プラスミノ
ーゲン活性化因子（以下、ｔ−ＰＡと略す）の類似体に
関する。更に詳しくは、ｔ−ＰＡのアミノ酸配列中、天
然型のｔ−ＰＡの２８０位から３０４位に相当するアミ
ノ酸配列の全部又は一部が、尿プラスミノーゲン活性化
因子（以下、ＵＫと略す）の対応するアミノ酸配列に置
換されており、かつその置換領域が天然型のｔ−ＰＡの
アミノ酸配列の２９４位から２９８位に対応するＵＫの
１７７位から１８０位のアミノ酸配列；Ｔｙｒ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ−Ｈｉｓ（配列番号：１）を少なくとも含むア
ミノ酸配列よりなることにより、フィブリン特異性が向
上した新規なｔ−ＰＡ類似体に関するものである。
ーゲン活性化因子（以下、ｔ−ＰＡと略す）の類似体に
関する。更に詳しくは、ｔ−ＰＡのアミノ酸配列中、天
然型のｔ−ＰＡの２８０位から３０４位に相当するアミ
ノ酸配列の全部又は一部が、尿プラスミノーゲン活性化
因子（以下、ＵＫと略す）の対応するアミノ酸配列に置
換されており、かつその置換領域が天然型のｔ−ＰＡの
アミノ酸配列の２９４位から２９８位に対応するＵＫの
１７７位から１８０位のアミノ酸配列；Ｔｙｒ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ−Ｈｉｓ（配列番号：１）を少なくとも含むア
ミノ酸配列よりなることにより、フィブリン特異性が向
上した新規なｔ−ＰＡ類似体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】天然型のｔ−ＰＡは、血漿中に存在する
不活性型酵素前駆体であるプラスミノーゲンを加水分解
することによって活性型酵素であるプラスミンに変換す
る。プラスミンは、血管内に種々の原因によって生じた
フィブリン塊（血栓）を分解する。ＵＫやストレプトキ
ナーゼなどの既存の血栓溶解剤がフィブリン特異性を全
く有していないのに対し、ｔ−ＰＡは比較的高いフィブ
リン特異性を有している。このためフィブリン、ひいて
は血栓を特異的に溶解する性質を有し、そして出血等の
副作用の少ない血栓溶解剤として注目されてきた。
不活性型酵素前駆体であるプラスミノーゲンを加水分解
することによって活性型酵素であるプラスミンに変換す
る。プラスミンは、血管内に種々の原因によって生じた
フィブリン塊（血栓）を分解する。ＵＫやストレプトキ
ナーゼなどの既存の血栓溶解剤がフィブリン特異性を全
く有していないのに対し、ｔ−ＰＡは比較的高いフィブ
リン特異性を有している。このためフィブリン、ひいて
は血栓を特異的に溶解する性質を有し、そして出血等の
副作用の少ない血栓溶解剤として注目されてきた。
【０００３】しかしながら、実際ｔ−ＰＡを臨床に用い
た場合、閉塞冠動脈の再開通には予想されていたよりも
遙かに多量の投与量が必要であることが明らかとなっ
た。例えば冠状動脈の再開通のためには患者あたり100
〜150mg という多量の投与量が必要であるとも言われて
いる（文献１）。現実には患者当たり100mg 程度以下の
量で用いられているが、それにしてもこの大量投与の結
果、ｔ−ＰＡはフィブリン特異的であるとはいえ若干は
血液中のフィブリノーゲンをも分解してしまうため、結
局全身性の出血傾向が生じてしまうことが今もって無視
できない問題である。
た場合、閉塞冠動脈の再開通には予想されていたよりも
遙かに多量の投与量が必要であることが明らかとなっ
た。例えば冠状動脈の再開通のためには患者あたり100
〜150mg という多量の投与量が必要であるとも言われて
いる（文献１）。現実には患者当たり100mg 程度以下の
量で用いられているが、それにしてもこの大量投与の結
果、ｔ−ＰＡはフィブリン特異的であるとはいえ若干は
血液中のフィブリノーゲンをも分解してしまうため、結
局全身性の出血傾向が生じてしまうことが今もって無視
できない問題である。
【０００４】この様な観点から、より高い血栓特異性の
付与を目的としたｔ−ＰＡ改変体の作製も行われ、多数
の報告（文献２〜12）がなされているが、未だ目的を充
分に達成したものはない。
付与を目的としたｔ−ＰＡ改変体の作製も行われ、多数
の報告（文献２〜12）がなされているが、未だ目的を充
分に達成したものはない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、フィブリン
特異性が向上した新規なｔ−ＰＡ類似体を提供するもの
である。さらに詳しくは、フィブリノーゲン存在下では
プラスミノーゲン活性化活性が非常に低いが、フィブリ
ン存在下ではプラスミノーゲン活性化活性を発現し、そ
れゆえフィブリン特異性が向上した新規なｔ−ＰＡ類似
体を提供するものである。
特異性が向上した新規なｔ−ＰＡ類似体を提供するもの
である。さらに詳しくは、フィブリノーゲン存在下では
プラスミノーゲン活性化活性が非常に低いが、フィブリ
ン存在下ではプラスミノーゲン活性化活性を発現し、そ
れゆえフィブリン特異性が向上した新規なｔ−ＰＡ類似
体を提供するものである。
【０００６】本発明のｔ−ＰＡ類似体は、血液中を循環
している時はプラスミノーゲンの活性化およびそれに引
き続くフィブリノーゲンの分解を引き起こし難く、フィ
ブリンの存在する血栓局所に到達して初めてプラスミノ
ーゲン活性化活性を発現して血栓を溶解するので、天然
型のｔ−ＰＡに比べてフィブリン特異性が高く、従って
血栓特異性が高く、全身性の出血傾向という副作用を生
じ難いことが予想される。従って本発明は、治療用血栓
溶解剤として安全性の高い新規な血栓溶解剤を提供する
ものである。
している時はプラスミノーゲンの活性化およびそれに引
き続くフィブリノーゲンの分解を引き起こし難く、フィ
ブリンの存在する血栓局所に到達して初めてプラスミノ
ーゲン活性化活性を発現して血栓を溶解するので、天然
型のｔ−ＰＡに比べてフィブリン特異性が高く、従って
血栓特異性が高く、全身性の出血傾向という副作用を生
じ難いことが予想される。従って本発明は、治療用血栓
溶解剤として安全性の高い新規な血栓溶解剤を提供する
ものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは最近、ｔ−
ＰＡのアミノ酸配列中、天然型のｔ−ＰＡの２７６位か
ら３０６位に相当するアミノ酸配列の少なくとも一部が
対応するＵＫのアミノ酸配列に置換されたｔ−ＰＡ類似
体が、優れたフィブリン特異性を示すことを見いだして
いる（ＷＯ９３／２０１９４）。さらに研究を継続した
結果、ｔ−ＰＡのアミノ酸配列中、天然型のｔ−ＰＡの
２８０位から３０４位に相当するアミノ酸配列の全部又
は一部が、対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換
されており、かつ、該置換領域が、天然型のｔ−ＰＡの
２９４位から２９８位に対応するＵＫの１７７位から１
８０位のアミノ酸配列（配列番号：１）を少なくとも含
むことにより、フィブリン特異性の優れた新規なｔ−Ｐ
Ａ類似体が得られることを見いだした。
ＰＡのアミノ酸配列中、天然型のｔ−ＰＡの２７６位か
ら３０６位に相当するアミノ酸配列の少なくとも一部が
対応するＵＫのアミノ酸配列に置換されたｔ−ＰＡ類似
体が、優れたフィブリン特異性を示すことを見いだして
いる（ＷＯ９３／２０１９４）。さらに研究を継続した
結果、ｔ−ＰＡのアミノ酸配列中、天然型のｔ−ＰＡの
２８０位から３０４位に相当するアミノ酸配列の全部又
は一部が、対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換
されており、かつ、該置換領域が、天然型のｔ−ＰＡの
２９４位から２９８位に対応するＵＫの１７７位から１
８０位のアミノ酸配列（配列番号：１）を少なくとも含
むことにより、フィブリン特異性の優れた新規なｔ−Ｐ
Ａ類似体が得られることを見いだした。
【０００８】すなわち、本発明の要旨は、（１） 組織
プラスミノーゲン活性化因子（以下、ｔ−ＰＡと略す）
のアミノ酸配列中、天然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の
２８０位から３０４位に相当するアミノ酸配列の全部又
は一部が、下記に示すような対応関係を有する尿プラス
ミノーゲン活性化因子（以下、ＵＫと略す）のアミノ酸
配列に置換されており、かつその置換領域が天然型のｔ
−ＰＡのアミノ酸配列の２９４位から２９８位に対応す
るＵＫの１７７位から１８０位のアミノ酸配列；Ｔｙｒ
−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ（配列番号：１）を少なくと
も含むアミノ酸配列からなることを特徴とする、ｔ−Ｐ
Ａ類似体、
プラスミノーゲン活性化因子（以下、ｔ−ＰＡと略す）
のアミノ酸配列中、天然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の
２８０位から３０４位に相当するアミノ酸配列の全部又
は一部が、下記に示すような対応関係を有する尿プラス
ミノーゲン活性化因子（以下、ＵＫと略す）のアミノ酸
配列に置換されており、かつその置換領域が天然型のｔ
−ＰＡのアミノ酸配列の２９４位から２９８位に対応す
るＵＫの１７７位から１８０位のアミノ酸配列；Ｔｙｒ
−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ（配列番号：１）を少なくと
も含むアミノ酸配列からなることを特徴とする、ｔ−Ｐ
Ａ類似体、
【０００９】
【化２】
【００１０】（なお、アミノ酸配列において対応関係と
は、天然型のｔ−ＰＡの２８０位がＵＫの１６３位に対
応し、以下順次上段の配列が下段の配列に対応する関係
を示す。また、上記の配列表示における−は、ＵＫのア
ミノ酸配列への置換においてアミノ酸が欠失した状態で
対応するものとする。）（２） 置換領域が、天然型の
ｔ−ＰＡの２８０位から２９８位に対応するＵＫの１６
３位から１８０位のアミノ酸配列；Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔ
ｈｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒ
ｏ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ
−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ（配列番号：２）を含むアミ
ノ酸配列からなることを特徴とする、前記（１）記載の
ｔ−ＰＡ類似体、（３） 置換領域が、天然型のｔ−Ｐ
Ａの２９４位から３０４位に対応するＵＫの１７７位か
ら１８６位のアミノ酸配列；Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−
Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔ
ｈｒ（配列番号：３）を含むアミノ酸配列からなること
を特徴とする、前記（１）記載のｔ−ＰＡ類似体、
（４） 置換領域が、天然型のｔ−ＰＡの２９４位から
３０２位に対応するＵＫの１７７位から１８４位のアミ
ノ酸配列；Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号：４）を含むアミノ
酸配列からなることを特徴とする、前記（１）記載のｔ
−ＰＡ類似体、（５） 置換領域が、天然型のｔ−ＰＡ
の２９０位から２９８位に対応するＵＫの１７３位から
１８０位のアミノ酸配列；Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉ
ｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ（配列番号：
５）を含むアミノ酸配列からなることを特徴とする、前
記（１）記載のｔ−ＰＡ類似体、（６） 置換領域が、
天然型のｔ−ＰＡの２９０位から３０２位に対応するＵ
Ｋの１７３位から１８４位のアミノ酸配列；Ｐｈｅ−Ａ
ｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉ
ｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号：６）
を含むアミノ酸配列からなることを特徴とする、前記
（１）記載のｔ−ＰＡ類似体、（７） 置換領域が、天
然型のｔ−ＰＡの２９４位から３０１位に対応するＵＫ
の１７７位から１８３位のアミノ酸配列；Ｔｙｒ−Ａｒ
ｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番
号：７）を含むアミノ酸配列からなることを特徴とす
る、前記（１）記載のｔ−ＰＡ類似体、（８） 置換領
域が、天然型のｔ−ＰＡの２９０位から３０１位に対応
するＵＫの１７３位から１８３位のアミノ酸配列；Ｐｈ
ｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号：８）を
含むアミノ酸配列からなることを特徴とする、前記
（１）記載のｔ−ＰＡ類似体、（９） 置換領域が、天
然型のｔ−ＰＡの２９４位から３００位に対応するＵＫ
の１７７位から１８２位のアミノ酸配列；Ｔｙｒ−Ａｒ
ｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号：９）
を含むアミノ酸配列からなることを特徴とする、前記
（１）記載のｔ−ＰＡ類似体、（１０） 置換領域が、
天然型のｔ−ＰＡの２９０位から３００位に対応するＵ
Ｋの１７３位から１８２位のアミノ酸配列；Ｐｈｅ−Ａ
ｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉ
ｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号：１０）を含むアミノ酸
配列からなることを特徴とする、前記（１）記載のｔ−
ＰＡ類似体、（１１） 形質転換された原核性生物細胞
または真核性生物細胞において、前記（１）〜（１０）
いずれかに記載のｔ−ＰＡ類似体をコードしているＤＮ
Ａを発現させ得る組換え発現ベクター、（１２） 前記
（１１）記載の組換え発現ベクターで形質転換された原
核性生物細胞または真核性生物細胞、（１３） 前記
（１）〜（１０）いずれかに記載のｔ−ＰＡ類似体を有
効成分として含有することを特徴とする血栓症治療剤、
に関する。
は、天然型のｔ−ＰＡの２８０位がＵＫの１６３位に対
応し、以下順次上段の配列が下段の配列に対応する関係
を示す。また、上記の配列表示における−は、ＵＫのア
ミノ酸配列への置換においてアミノ酸が欠失した状態で
対応するものとする。）（２） 置換領域が、天然型の
ｔ−ＰＡの２８０位から２９８位に対応するＵＫの１６
３位から１８０位のアミノ酸配列；Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔ
ｈｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒ
ｏ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ
−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ（配列番号：２）を含むアミ
ノ酸配列からなることを特徴とする、前記（１）記載の
ｔ−ＰＡ類似体、（３） 置換領域が、天然型のｔ−Ｐ
Ａの２９４位から３０４位に対応するＵＫの１７７位か
ら１８６位のアミノ酸配列；Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−
Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔ
ｈｒ（配列番号：３）を含むアミノ酸配列からなること
を特徴とする、前記（１）記載のｔ−ＰＡ類似体、
（４） 置換領域が、天然型のｔ−ＰＡの２９４位から
３０２位に対応するＵＫの１７７位から１８４位のアミ
ノ酸配列；Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号：４）を含むアミノ
酸配列からなることを特徴とする、前記（１）記載のｔ
−ＰＡ類似体、（５） 置換領域が、天然型のｔ−ＰＡ
の２９０位から２９８位に対応するＵＫの１７３位から
１８０位のアミノ酸配列；Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉ
ｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ（配列番号：
５）を含むアミノ酸配列からなることを特徴とする、前
記（１）記載のｔ−ＰＡ類似体、（６） 置換領域が、
天然型のｔ−ＰＡの２９０位から３０２位に対応するＵ
Ｋの１７３位から１８４位のアミノ酸配列；Ｐｈｅ−Ａ
ｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉ
ｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号：６）
を含むアミノ酸配列からなることを特徴とする、前記
（１）記載のｔ−ＰＡ類似体、（７） 置換領域が、天
然型のｔ−ＰＡの２９４位から３０１位に対応するＵＫ
の１７７位から１８３位のアミノ酸配列；Ｔｙｒ−Ａｒ
ｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番
号：７）を含むアミノ酸配列からなることを特徴とす
る、前記（１）記載のｔ−ＰＡ類似体、（８） 置換領
域が、天然型のｔ−ＰＡの２９０位から３０１位に対応
するＵＫの１７３位から１８３位のアミノ酸配列；Ｐｈ
ｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号：８）を
含むアミノ酸配列からなることを特徴とする、前記
（１）記載のｔ−ＰＡ類似体、（９） 置換領域が、天
然型のｔ−ＰＡの２９４位から３００位に対応するＵＫ
の１７７位から１８２位のアミノ酸配列；Ｔｙｒ−Ａｒ
ｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号：９）
を含むアミノ酸配列からなることを特徴とする、前記
（１）記載のｔ−ＰＡ類似体、（１０） 置換領域が、
天然型のｔ−ＰＡの２９０位から３００位に対応するＵ
Ｋの１７３位から１８２位のアミノ酸配列；Ｐｈｅ−Ａ
ｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉ
ｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号：１０）を含むアミノ酸
配列からなることを特徴とする、前記（１）記載のｔ−
ＰＡ類似体、（１１） 形質転換された原核性生物細胞
または真核性生物細胞において、前記（１）〜（１０）
いずれかに記載のｔ−ＰＡ類似体をコードしているＤＮ
Ａを発現させ得る組換え発現ベクター、（１２） 前記
（１１）記載の組換え発現ベクターで形質転換された原
核性生物細胞または真核性生物細胞、（１３） 前記
（１）〜（１０）いずれかに記載のｔ−ＰＡ類似体を有
効成分として含有することを特徴とする血栓症治療剤、
に関する。
【００１１】本発明において、天然型のｔ−ＰＡのアミ
ノ酸配列とは、Ｐｅｎｎｉｃａらにより既に報告された
５２７個のアミノ酸からなる配列をいう（文献１３）。
また、ＵＫのアミノ酸配列とはＨｏｌｍｅｓらにより既
に報告された４１１個のアミノ酸からなる配列をいう
（文献２３）。
ノ酸配列とは、Ｐｅｎｎｉｃａらにより既に報告された
５２７個のアミノ酸からなる配列をいう（文献１３）。
また、ＵＫのアミノ酸配列とはＨｏｌｍｅｓらにより既
に報告された４１１個のアミノ酸からなる配列をいう
（文献２３）。
【００１２】本発明のｔ−ＰＡ類似体は、天然型のｔ−
ＰＡのアミノ酸配列の２８０位から３０４位に相当する
アミノ酸配列の全部又は一部が、下記の対応関係を有す
るＵＫのアミノ酸配列に置換されている。ここに言う天
然型のｔ−ＰＡの２８０位に対応するＵＫのアミノ酸配
列とは、ＵＫの１６３位を指し、以下順次上段のｔ−Ｐ
Ａのアミノ酸配列が下段のＵＫのアミノ酸配列に対応す
る関係を指し、以下単に「対応関係」と略す場合があ
る。また、本発明でいう対応関係を有するＵＫにおける
アミノ酸配列は、天然型のｔ−ＰＡの置換領域における
アミノ酸配列よりアミノ酸が１個少なく、天然型のｔ−
ＰＡの２９５位に対応するＵＫのアミノ酸（配列表示に
おける−で示される部分）は、ＵＫのアミノ酸配列への
置換においてアミノ酸が欠失した状態で対応するものと
する。従って、本発明において天然型のｔ−ＰＡの２８
０位から３０４位に対応するＵＫのアミノ酸配列とは、
ＵＫの１６３位から１８６位のアミノ酸配列を指す。本
明細書において、このような天然型のｔ−ＰＡの２８０
位から３０４位までの間のアミノ酸置換の領域につい
て、「置換領域」と称する場合がある。
ＰＡのアミノ酸配列の２８０位から３０４位に相当する
アミノ酸配列の全部又は一部が、下記の対応関係を有す
るＵＫのアミノ酸配列に置換されている。ここに言う天
然型のｔ−ＰＡの２８０位に対応するＵＫのアミノ酸配
列とは、ＵＫの１６３位を指し、以下順次上段のｔ−Ｐ
Ａのアミノ酸配列が下段のＵＫのアミノ酸配列に対応す
る関係を指し、以下単に「対応関係」と略す場合があ
る。また、本発明でいう対応関係を有するＵＫにおける
アミノ酸配列は、天然型のｔ−ＰＡの置換領域における
アミノ酸配列よりアミノ酸が１個少なく、天然型のｔ−
ＰＡの２９５位に対応するＵＫのアミノ酸（配列表示に
おける−で示される部分）は、ＵＫのアミノ酸配列への
置換においてアミノ酸が欠失した状態で対応するものと
する。従って、本発明において天然型のｔ−ＰＡの２８
０位から３０４位に対応するＵＫのアミノ酸配列とは、
ＵＫの１６３位から１８６位のアミノ酸配列を指す。本
明細書において、このような天然型のｔ−ＰＡの２８０
位から３０４位までの間のアミノ酸置換の領域につい
て、「置換領域」と称する場合がある。
【００１３】
【化３】
【００１４】本発明のｔ−ＰＡ類似体の好ましい例とし
ては、たとえば次のようなものが挙げられる。 (1) 天然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２９４位から２
９８位までが、対応するＵＫの１７７位から１８０位の
アミノ酸配列；Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ（配列
番号：１）に置換されているｔ−ＰＡ類似体、(2) 天然
型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２８０位から２９８位ま
でが、対応するＵＫの１６３位から１８０位のアミノ酸
配列；Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌ
ｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ
（配列番号：２）で置換されているｔ−ＰＡ類似体、
(3) 天然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２９４位から３
０４位までが、対応するＵＫの１７７位から１８６位の
アミノ酸配列；Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒ
ｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（配列番
号：３）で置換されているｔ−ＰＡ類似体、(4) 天然型
のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２９４位から３０２位まで
が、対応するＵＫの１７７位から１８４位のアミノ酸配
列；Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号：４）で置換されているｔ
−ＰＡ類似体、(5) 天然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の
２９０位から２９８位までが、対応するＵＫの１７３位
から１８０位のアミノ酸配列；Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ（配列番
号：５）で置換されているｔ−ＰＡ類似体、(6) 天然型
のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２９０位から３０２位まで
が、対応するＵＫの１７３位から１８４位のアミノ酸配
列；Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
（配列番号：６）で置換されているｔ−ＰＡ類似体、
(7) 天然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２９４位から３
０１位までが、対応するＵＫの１７７位から１８３位の
アミノ酸配列；Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒ
ｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号：７）で置換されている
ｔ−ＰＡ類似体、(8) 天然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列
の２９０位から３０１位までが、対応するＵＫの１７３
位から１８３位のアミノ酸配列；Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌ
ａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号：８）で置換されているｔ
−ＰＡ類似体、(9) 天然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の
２９４位から３００位までが、対応するＵＫの１７７位
から１８２位のアミノ酸配列；Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号：９）で置換され
ているｔ−ＰＡ類似体、(10)天然型のｔ−ＰＡのアミノ
酸配列の２９０位から３００位までが、対応するＵＫの
１７３位から１８２位のアミノ酸配列；Ｐｈｅ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−
Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号：１０）で置換されているｔ
−ＰＡ類似体、(11)天然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の
２８０位から３０４位までが、対応するＵＫの１６３位
から１８６位のアミノ酸配列；Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ
−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−
Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅ
ｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（配列番号：３８）で置換されてい
るｔ−ＰＡ類似体。
ては、たとえば次のようなものが挙げられる。 (1) 天然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２９４位から２
９８位までが、対応するＵＫの１７７位から１８０位の
アミノ酸配列；Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ（配列
番号：１）に置換されているｔ−ＰＡ類似体、(2) 天然
型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２８０位から２９８位ま
でが、対応するＵＫの１６３位から１８０位のアミノ酸
配列；Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌ
ｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ
（配列番号：２）で置換されているｔ−ＰＡ類似体、
(3) 天然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２９４位から３
０４位までが、対応するＵＫの１７７位から１８６位の
アミノ酸配列；Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒ
ｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（配列番
号：３）で置換されているｔ−ＰＡ類似体、(4) 天然型
のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２９４位から３０２位まで
が、対応するＵＫの１７７位から１８４位のアミノ酸配
列；Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号：４）で置換されているｔ
−ＰＡ類似体、(5) 天然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の
２９０位から２９８位までが、対応するＵＫの１７３位
から１８０位のアミノ酸配列；Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ（配列番
号：５）で置換されているｔ−ＰＡ類似体、(6) 天然型
のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２９０位から３０２位まで
が、対応するＵＫの１７３位から１８４位のアミノ酸配
列；Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
（配列番号：６）で置換されているｔ−ＰＡ類似体、
(7) 天然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２９４位から３
０１位までが、対応するＵＫの１７７位から１８３位の
アミノ酸配列；Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒ
ｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号：７）で置換されている
ｔ−ＰＡ類似体、(8) 天然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列
の２９０位から３０１位までが、対応するＵＫの１７３
位から１８３位のアミノ酸配列；Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌ
ａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号：８）で置換されているｔ
−ＰＡ類似体、(9) 天然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の
２９４位から３００位までが、対応するＵＫの１７７位
から１８２位のアミノ酸配列；Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号：９）で置換され
ているｔ−ＰＡ類似体、(10)天然型のｔ−ＰＡのアミノ
酸配列の２９０位から３００位までが、対応するＵＫの
１７３位から１８２位のアミノ酸配列；Ｐｈｅ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−
Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号：１０）で置換されているｔ
−ＰＡ類似体、(11)天然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の
２８０位から３０４位までが、対応するＵＫの１６３位
から１８６位のアミノ酸配列；Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ
−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−
Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅ
ｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（配列番号：３８）で置換されてい
るｔ−ＰＡ類似体。
【００１５】本発明のｔ−ＰＡ類似体は、前記のような
置換領域を少なくとも有するものであり、置換領域以外
のアミノ酸配列については特に限定されない。即ち、天
然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列と同一であってもよく、
あるいは本発明のｔ−ＰＡ類似体の特性に影響を与えな
い範囲で他のアミノ酸に置換され、あるいは欠失など変
異していてもよい。
置換領域を少なくとも有するものであり、置換領域以外
のアミノ酸配列については特に限定されない。即ち、天
然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列と同一であってもよく、
あるいは本発明のｔ−ＰＡ類似体の特性に影響を与えな
い範囲で他のアミノ酸に置換され、あるいは欠失など変
異していてもよい。
【００１６】本発明のｔ−ＰＡ類似体の調製は、例えば
天然型のｔ−ＰＡの２８０位から３０４位に対応するア
ミノ酸配列の全部又は一部を、対応関係を有するＵＫの
アミノ酸配列からなるペプチドと置換することによって
行うことができる。
天然型のｔ−ＰＡの２８０位から３０４位に対応するア
ミノ酸配列の全部又は一部を、対応関係を有するＵＫの
アミノ酸配列からなるペプチドと置換することによって
行うことができる。
【００１７】具体的に置換を行うにあたり、さまざまな
方法が可能であるが、例えばｔ−ＰＡの当該領域のアミ
ノ酸配列をコードするｃＤＮＡの一部（例えば、天然型
のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２９４位から２９８位をコ
ードするｃＤＮＡ）を、対応関係を有するＵＫのアミノ
酸配列をコードする合成ＤＮＡ断片と置換し、適当な発
現ベクターと連結してこれを宿主内に導入し、本発明の
最終目的であるｔ−ＰＡ類似体タンパクを発現・生産さ
せることにより行うことができる。以下、その詳細につ
いて述べる。
方法が可能であるが、例えばｔ−ＰＡの当該領域のアミ
ノ酸配列をコードするｃＤＮＡの一部（例えば、天然型
のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２９４位から２９８位をコ
ードするｃＤＮＡ）を、対応関係を有するＵＫのアミノ
酸配列をコードする合成ＤＮＡ断片と置換し、適当な発
現ベクターと連結してこれを宿主内に導入し、本発明の
最終目的であるｔ−ＰＡ類似体タンパクを発現・生産さ
せることにより行うことができる。以下、その詳細につ
いて述べる。
【００１８】本発明のｔ−ＰＡ類似体の製造には、通常
天然型のｔ−ＰＡをコードするｃＤＮＡを用いることが
できる。天然型のｔ−ＰＡをコードするｃＤＮＡは、た
とえばボーズメラノーマ細胞からのクローニングによっ
て、たとえば文献13に記載されているように既に取得さ
れており、従ってそのｃＤＮＡ配列、アミノ酸配列も知
られている。また、天然型のｔ−ＰＡを改変すべく例え
ば半減期を長くしたｔ−ＰＡ類似体（文献14、 15等）の
ｃＤＮＡ配列、アミノ酸配列も知られており、これらも
用いることができる。
天然型のｔ−ＰＡをコードするｃＤＮＡを用いることが
できる。天然型のｔ−ＰＡをコードするｃＤＮＡは、た
とえばボーズメラノーマ細胞からのクローニングによっ
て、たとえば文献13に記載されているように既に取得さ
れており、従ってそのｃＤＮＡ配列、アミノ酸配列も知
られている。また、天然型のｔ−ＰＡを改変すべく例え
ば半減期を長くしたｔ−ＰＡ類似体（文献14、 15等）の
ｃＤＮＡ配列、アミノ酸配列も知られており、これらも
用いることができる。
【００１９】プラスミド中にクローニングされ、その配
列も知られているｃＤＮＡの特定の配列を置換する操作
は、既に自由に行える状況になっている（文献16) 。本
発明においても同様の操作により、たとえば天然型のｔ
−ＰＡの２９４位から２９８位に対応するアミノ酸配列
を、対応関係を有するＵＫのアミノ配列に容易に置換す
ることができる。
列も知られているｃＤＮＡの特定の配列を置換する操作
は、既に自由に行える状況になっている（文献16) 。本
発明においても同様の操作により、たとえば天然型のｔ
−ＰＡの２９４位から２９８位に対応するアミノ酸配列
を、対応関係を有するＵＫのアミノ配列に容易に置換す
ることができる。
【００２０】置換の方法としては、天然型のｔ−ＰＡの
ｃＤＮＡを利用する場合、本発明における置換領域周辺
には合成ＤＮＡ断片の挿入による置換に都合の良い適当
な制限酵素部位がないので、ｔ−ＰＡの２７４位〜２７
６位（ＴＴＣＧＣＡ）及び３０９位〜３１１位（ＧＣＡ
ＴＡＣ）のアミノ酸の位置に、これらのアミノ酸を変化
させることなくＮｓｐＶ（ＴＴＣＧＡＡ）、ＡｃｃＩ
（ＧＴＡＴＡＣ）という制限酵素の認識部位を部位特異
的変異により導入したｐＨＳＧＢ−０００ＮＡ（文献2
4）のようなプラスミドを出発材料として利用すること
が好ましい。このような部位特異的変異導入法の手法に
ついては、ゾラー及びスミスらの方法が参照される（文
献17）。ｐＨＳＧＢ−０００ＮＡは、制限酵素ＮｓｐＶ
あるいはＡｃｃＩにより唯一カ所のみが切断されるの
で、これら両酵素で切断することによりｔ−ＰＡ配列を
切り出し、代わりに目的の配列を含む合成ＤＮＡ断片を
この部位に連結（ライゲーション）させることができ
る。
ｃＤＮＡを利用する場合、本発明における置換領域周辺
には合成ＤＮＡ断片の挿入による置換に都合の良い適当
な制限酵素部位がないので、ｔ−ＰＡの２７４位〜２７
６位（ＴＴＣＧＣＡ）及び３０９位〜３１１位（ＧＣＡ
ＴＡＣ）のアミノ酸の位置に、これらのアミノ酸を変化
させることなくＮｓｐＶ（ＴＴＣＧＡＡ）、ＡｃｃＩ
（ＧＴＡＴＡＣ）という制限酵素の認識部位を部位特異
的変異により導入したｐＨＳＧＢ−０００ＮＡ（文献2
4）のようなプラスミドを出発材料として利用すること
が好ましい。このような部位特異的変異導入法の手法に
ついては、ゾラー及びスミスらの方法が参照される（文
献17）。ｐＨＳＧＢ−０００ＮＡは、制限酵素ＮｓｐＶ
あるいはＡｃｃＩにより唯一カ所のみが切断されるの
で、これら両酵素で切断することによりｔ−ＰＡ配列を
切り出し、代わりに目的の配列を含む合成ＤＮＡ断片を
この部位に連結（ライゲーション）させることができ
る。
【００２１】置換されるべきＵＫの塩基配列を含むＤＮ
Ａ断片の作製は、ホスホアミダイト法（文献18）により
合成されたオリゴヌクレオチドをリン酸化し、アニーリ
ングして二本鎖状にする方法が便利である。なお、必要
に応じて短い合成オリゴヌクレオチドを複数本作製し、
これらをつなぎ合わせる手法もとることができる。
Ａ断片の作製は、ホスホアミダイト法（文献18）により
合成されたオリゴヌクレオチドをリン酸化し、アニーリ
ングして二本鎖状にする方法が便利である。なお、必要
に応じて短い合成オリゴヌクレオチドを複数本作製し、
これらをつなぎ合わせる手法もとることができる。
【００２２】また、目的とする置換、あるいは挿入され
たＤＮＡ配列を確認するためには、ジデオキシ法（文献
25）の原理を用い、例えばＴａｑポリメラーゼを利用し
たサイクルシークエンスの手法により行うことができ
る。そのためには、アプライドバイオシステムズ社のモ
デル３７３Ａ ＤＮＡシークエンサーが有効に用いられ
る。
たＤＮＡ配列を確認するためには、ジデオキシ法（文献
25）の原理を用い、例えばＴａｑポリメラーゼを利用し
たサイクルシークエンスの手法により行うことができ
る。そのためには、アプライドバイオシステムズ社のモ
デル３７３Ａ ＤＮＡシークエンサーが有効に用いられ
る。
【００２３】その他、後述の実施例に記載されているよ
うな制限酵素によるＤＮＡの切断、あるいは連結等の遺
伝子操作は全て公知であり、主として文献16が参照され
る。
うな制限酵素によるＤＮＡの切断、あるいは連結等の遺
伝子操作は全て公知であり、主として文献16が参照され
る。
【００２４】このようにして得られたｔ−ＰＡ類似体を
コードするｃＤＮＡは、ＣＤＭ８（ｏｒｉ- ）等、周知
の発現ベクターに連結された後、適当な宿主に導入され
ることにより、本発明の最終目的物質であるｔ−ＰＡ類
似体タンパクを発現・生産することができる。宿主とし
ては、細菌等の原核性生物細胞、酵母又は哺乳動物細胞
等の真核性生物細胞のいずれでもよく、例えば大腸菌株
や動物細胞株は、とくに記載のない限り既に広く普及し
ており入手は容易である。例えば動物細胞宿主として
は、ＣＯＳ−１，ＣＨＯ細胞が挙げられる。発現ベクタ
ーの宿主への導入方法は、電気パルス法（文献19) が効
率的である。形質転換された細胞の培養上清は、適当な
希釈によりそのまま種々の活性測定に使用され得る程度
のｔ−ＰＡ類似体を含んでいる。
コードするｃＤＮＡは、ＣＤＭ８（ｏｒｉ- ）等、周知
の発現ベクターに連結された後、適当な宿主に導入され
ることにより、本発明の最終目的物質であるｔ−ＰＡ類
似体タンパクを発現・生産することができる。宿主とし
ては、細菌等の原核性生物細胞、酵母又は哺乳動物細胞
等の真核性生物細胞のいずれでもよく、例えば大腸菌株
や動物細胞株は、とくに記載のない限り既に広く普及し
ており入手は容易である。例えば動物細胞宿主として
は、ＣＯＳ−１，ＣＨＯ細胞が挙げられる。発現ベクタ
ーの宿主への導入方法は、電気パルス法（文献19) が効
率的である。形質転換された細胞の培養上清は、適当な
希釈によりそのまま種々の活性測定に使用され得る程度
のｔ−ＰＡ類似体を含んでいる。
【００２５】培養上清中に産生されたｔ−ＰＡ類似体
は、亜鉛キレートアガロース、コンカナバリンＡアガロ
ース、セファデックスＧ−１５０等を用いる公知の方法
（文献20）等によって、容易に精製することができる。
は、亜鉛キレートアガロース、コンカナバリンＡアガロ
ース、セファデックスＧ−１５０等を用いる公知の方法
（文献20）等によって、容易に精製することができる。
【００２６】このようにして得られた本発明のｔ−ＰＡ
類似体は、高いフィブリン特異性を有するので、血栓症
治療剤として生体内に投与された場合、天然型のｔ−Ｐ
Ａと比較して全身性の出血傾向という副作用が減少した
血栓症治療剤の有効成分とすることができる。本発明の
ｔ−ＰＡ類似体は、常法により容器に必要量分注し、凍
結乾燥を行うことにより製剤として極めて容易に得るこ
とができる。この凍結乾燥品は、製剤学的に容認される
キャリアー物質、例えば生理食塩水に溶解し、静脈内ま
たは動脈または心臓内への注射によって投与される。投
与量については、現在臨床で用いられている天然型のｔ
−ＰＡの投与量程度でも良いが、本発明のｔ−ＰＡ類似
体は副作用が少ないので該投与量よりも多く使用するこ
とも可能である。投与方法は、持続静注あるいは投与予
定量の一部を最初に静注し残りを持続静注するなどの通
常のｔ−ＰＡの投与方法で行われる。
類似体は、高いフィブリン特異性を有するので、血栓症
治療剤として生体内に投与された場合、天然型のｔ−Ｐ
Ａと比較して全身性の出血傾向という副作用が減少した
血栓症治療剤の有効成分とすることができる。本発明の
ｔ−ＰＡ類似体は、常法により容器に必要量分注し、凍
結乾燥を行うことにより製剤として極めて容易に得るこ
とができる。この凍結乾燥品は、製剤学的に容認される
キャリアー物質、例えば生理食塩水に溶解し、静脈内ま
たは動脈または心臓内への注射によって投与される。投
与量については、現在臨床で用いられている天然型のｔ
−ＰＡの投与量程度でも良いが、本発明のｔ−ＰＡ類似
体は副作用が少ないので該投与量よりも多く使用するこ
とも可能である。投与方法は、持続静注あるいは投与予
定量の一部を最初に静注し残りを持続静注するなどの通
常のｔ−ＰＡの投与方法で行われる。
【００２７】
【実施例】以下に、本発明の一例として実施例を示す
が、本発明はこれに限定されるものではない。なお、以
下の実施例で引用されるＣＳ１とは、天然型のｔ−ＰＡ
の２７６位から３０６位のアミノ酸配列が対応関係を有
するＵＫの１５９位から１８８位のアミノ酸配列（配列
番号：１１）に置換された公知のｔ−ＰＡ類似体であ
り、ＷＯ９３／２０１９４においてＣＳＴＵ（文献24）
からＣＳ１に改称されたものである。
が、本発明はこれに限定されるものではない。なお、以
下の実施例で引用されるＣＳ１とは、天然型のｔ−ＰＡ
の２７６位から３０６位のアミノ酸配列が対応関係を有
するＵＫの１５９位から１８８位のアミノ酸配列（配列
番号：１１）に置換された公知のｔ−ＰＡ類似体であ
り、ＷＯ９３／２０１９４においてＣＳＴＵ（文献24）
からＣＳ１に改称されたものである。
【００２８】実施例１ 天然型のｔ−ＰＡの２９４位から２９８位のアミノ酸配
列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換された
ＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１３）を哺乳類細胞
で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１３の構築 基本的には、文献13に開示される天然型のｔ−ＰＡの２
７６位から３０６位に相当するアミノ酸配列を有してお
り、その配列中の２９４位から２９８位に相当するアミ
ノ酸配列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列（配列
番号：１）に置換されたアミノ酸配列をコードする４種
のオリゴヌクレオチド（ＣＳ４Ｍ（配列番号：１２），
ＣＳ４Ｒ（配列番号：１３），ＣＳ６Ｍ（配列番号：１
４）及びＣＳ６Ｒ（配列番号：１５））を合成した。こ
れらの合成オリゴヌクレオチドを５’末端のリン酸化後
アニールさせ、これと文献 24 により公知のｐＨＳＧＢ
−０００ＮＡをＮｓｐＶ及びＡｃｃI で消化したものと
をライゲートさせた。これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株
を形質転換させることにより、２９４位から２９８位の
アミノ酸配列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に
置換されたＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ全長をコードす
るプラスミドｐＨＳＧＢ−ＣＳ１３を得た（図１）。
列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換された
ＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１３）を哺乳類細胞
で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１３の構築 基本的には、文献13に開示される天然型のｔ−ＰＡの２
７６位から３０６位に相当するアミノ酸配列を有してお
り、その配列中の２９４位から２９８位に相当するアミ
ノ酸配列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列（配列
番号：１）に置換されたアミノ酸配列をコードする４種
のオリゴヌクレオチド（ＣＳ４Ｍ（配列番号：１２），
ＣＳ４Ｒ（配列番号：１３），ＣＳ６Ｍ（配列番号：１
４）及びＣＳ６Ｒ（配列番号：１５））を合成した。こ
れらの合成オリゴヌクレオチドを５’末端のリン酸化後
アニールさせ、これと文献 24 により公知のｐＨＳＧＢ
−０００ＮＡをＮｓｐＶ及びＡｃｃI で消化したものと
をライゲートさせた。これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株
を形質転換させることにより、２９４位から２９８位の
アミノ酸配列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に
置換されたＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ全長をコードす
るプラスミドｐＨＳＧＢ−ＣＳ１３を得た（図１）。
【００２９】哺乳類細胞においてＣＳ１３を発現させる
ためのベクターには、ｐＣＤＭ８（ＢｇｌII）を利用し
た。本ベクターはＣＤＭ８（ｏｒｉ- ）のＣＭＶプロモ
ーター下流のスタッファー配列を除いてＢｇｌIIサイト
を導入したものである（文献21）。ｐＣＤＭ８（Ｂｇｌ
II）をＢｇｌIIで消化後、５’末端を脱リン酸化したも
のと、ｐＨＳＧＢ−ＣＳ１３をＢａｍＨI で消化したも
のとをライゲートさせ、大腸菌ＭＣ１０６１／ｐ３を形
質転換させることにより、２９４位から２９８位のアミ
ノ酸配列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換
したＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１３）を哺乳類
細胞で発現させ得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１３を
得た（図２）。ＣＳ１３の２７６位から３０６位のアミ
ノ酸配列は配列番号：２８に示す通りである。
ためのベクターには、ｐＣＤＭ８（ＢｇｌII）を利用し
た。本ベクターはＣＤＭ８（ｏｒｉ- ）のＣＭＶプロモ
ーター下流のスタッファー配列を除いてＢｇｌIIサイト
を導入したものである（文献21）。ｐＣＤＭ８（Ｂｇｌ
II）をＢｇｌIIで消化後、５’末端を脱リン酸化したも
のと、ｐＨＳＧＢ−ＣＳ１３をＢａｍＨI で消化したも
のとをライゲートさせ、大腸菌ＭＣ１０６１／ｐ３を形
質転換させることにより、２９４位から２９８位のアミ
ノ酸配列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換
したＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１３）を哺乳類
細胞で発現させ得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１３を
得た（図２）。ＣＳ１３の２７６位から３０６位のアミ
ノ酸配列は配列番号：２８に示す通りである。
【００３０】実施例２ 天然型のｔ−ＰＡの２８０位から２９８位のアミノ酸配
列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換された
ＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１２）を哺乳類細胞
で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１２の構築 実施例１におけるＣＳ４Ｍ及びＣＳ４Ｒの代わりにＣＳ
１２Ｍ（配列番号：１６）及びＣＳ１２Ｒ（配列番号：
１７）を用いたことの他は実施例１と同様にして、２８
０位から２９８位のアミノ酸配列が対応関係を有するＵ
Ｋのアミノ酸配列（配列番号：２）に置換されたアミノ
酸配列を有するＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１
２）を発現させ得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１２を
得た。ＣＳ１２の２７６位から３０６位のアミノ酸配列
は配列番号：２９に示す通りである。
列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換された
ＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１２）を哺乳類細胞
で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１２の構築 実施例１におけるＣＳ４Ｍ及びＣＳ４Ｒの代わりにＣＳ
１２Ｍ（配列番号：１６）及びＣＳ１２Ｒ（配列番号：
１７）を用いたことの他は実施例１と同様にして、２８
０位から２９８位のアミノ酸配列が対応関係を有するＵ
Ｋのアミノ酸配列（配列番号：２）に置換されたアミノ
酸配列を有するＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１
２）を発現させ得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１２を
得た。ＣＳ１２の２７６位から３０６位のアミノ酸配列
は配列番号：２９に示す通りである。
【００３１】実施例３ 天然型のｔ−ＰＡの２９４位から３０４位のアミノ酸配
列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換された
ＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１１）を哺乳類細胞
で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１１の構築 実施例１におけるＣＳ６Ｍ及びＣＳ６Ｒの代わりにＣＳ
１１Ｍ（配列番号：１８）及びＣＳ１１Ｒ（配列番号：
１９）を用いたことの他は実施例１と同様にして、２９
４位から３０４位のアミノ酸配列が対応関係を有するＵ
Ｋのアミノ酸配列（配列番号：３）に置換されたアミノ
酸配列を有するＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１
１）を発現させ得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１１を
得た。ＣＳ１１の２７６位から３０６位のアミノ酸配列
は配列番号：３０に示す通りである。
列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換された
ＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１１）を哺乳類細胞
で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１１の構築 実施例１におけるＣＳ６Ｍ及びＣＳ６Ｒの代わりにＣＳ
１１Ｍ（配列番号：１８）及びＣＳ１１Ｒ（配列番号：
１９）を用いたことの他は実施例１と同様にして、２９
４位から３０４位のアミノ酸配列が対応関係を有するＵ
Ｋのアミノ酸配列（配列番号：３）に置換されたアミノ
酸配列を有するＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１
１）を発現させ得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１１を
得た。ＣＳ１１の２７６位から３０６位のアミノ酸配列
は配列番号：３０に示す通りである。
【００３２】実施例４ 天然型のｔ−ＰＡの２９４位から３０２位のアミノ酸配
列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換された
ＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１４）を哺乳類細胞
で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１４の構築 実施例１におけるＣＳ６Ｍ及びＣＳ６Ｒの代わりにＣＳ
９Ｍ（配列番号：２０）及びＣＳ９Ｒ（配列番号：２
１）を用いたことの他は実施例１と同様にして、２９４
位から３０２位のアミノ酸配列が対応関係を有するＵＫ
のアミノ酸配列（配列番号：４）に置換されたアミノ酸
配列を有するＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１４）
を哺乳類細胞で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ
１４を得た。ＣＳ１４の２７６位から３０６位のアミノ
酸配列は配列番号：３１に示す通りである。
列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換された
ＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１４）を哺乳類細胞
で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１４の構築 実施例１におけるＣＳ６Ｍ及びＣＳ６Ｒの代わりにＣＳ
９Ｍ（配列番号：２０）及びＣＳ９Ｒ（配列番号：２
１）を用いたことの他は実施例１と同様にして、２９４
位から３０２位のアミノ酸配列が対応関係を有するＵＫ
のアミノ酸配列（配列番号：４）に置換されたアミノ酸
配列を有するＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１４）
を哺乳類細胞で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ
１４を得た。ＣＳ１４の２７６位から３０６位のアミノ
酸配列は配列番号：３１に示す通りである。
【００３３】実施例５ 天然型のｔ−ＰＡの２９０位から２９８位のアミノ酸配
列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換された
ＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１５）を哺乳類細胞
で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１５の構築 実施例１におけるＣＳ４Ｍ及びＣＳ４Ｒの代わりにＣＳ
１５Ｍ（配列番号：２２）及びＣＳ１５Ｒ（配列番号：
２３）を用いたことの他は実施例１と同様にして、２９
０位から２９８位のアミノ酸配列が対応関係を有するＵ
Ｋのアミノ酸配列（配列番号：５）に置換されたアミノ
酸配列を有するＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１
５）を哺乳類細胞で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−
ＣＳ１５を得た。ＣＳ１５の２７６位から３０６位のア
ミノ酸配列は配列番号：３２に示す通りである。
列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換された
ＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１５）を哺乳類細胞
で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１５の構築 実施例１におけるＣＳ４Ｍ及びＣＳ４Ｒの代わりにＣＳ
１５Ｍ（配列番号：２２）及びＣＳ１５Ｒ（配列番号：
２３）を用いたことの他は実施例１と同様にして、２９
０位から２９８位のアミノ酸配列が対応関係を有するＵ
Ｋのアミノ酸配列（配列番号：５）に置換されたアミノ
酸配列を有するＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１
５）を哺乳類細胞で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−
ＣＳ１５を得た。ＣＳ１５の２７６位から３０６位のア
ミノ酸配列は配列番号：３２に示す通りである。
【００３４】実施例６ 天然型のｔ−ＰＡの２９０位から３０２位のアミノ酸配
列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換された
ＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１６）を哺乳類細胞
で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１６の構築 実施例４におけるＣＳ４Ｍ及びＣＳ４Ｒの代わりにＣＳ
１５Ｍ（配列番号：２２）及びＣＳ１５Ｒ（配列番号：
２３）を用いたことの他は実施例４と同様にして、２９
０位から３０２位のアミノ酸配列が対応関係を有するＵ
Ｋのアミノ酸配列（配列番号：６）に置換されたＵＫハ
イブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１６）を哺乳類細胞で発現
し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１６を得た。ＣＳ１
６の２７６位から３０６位のアミノ酸配列は配列番号：
３３に示す通りである。
列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換された
ＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１６）を哺乳類細胞
で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１６の構築 実施例４におけるＣＳ４Ｍ及びＣＳ４Ｒの代わりにＣＳ
１５Ｍ（配列番号：２２）及びＣＳ１５Ｒ（配列番号：
２３）を用いたことの他は実施例４と同様にして、２９
０位から３０２位のアミノ酸配列が対応関係を有するＵ
Ｋのアミノ酸配列（配列番号：６）に置換されたＵＫハ
イブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１６）を哺乳類細胞で発現
し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１６を得た。ＣＳ１
６の２７６位から３０６位のアミノ酸配列は配列番号：
３３に示す通りである。
【００３５】実施例７ 天然型のｔ−ＰＡの２９４位から３０１位のアミノ酸配
列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換された
ＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１８）を哺乳類細胞
で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１８の構築 実施例１におけるＣＳ６Ｍ及びＣＳ６Ｒの代わりにＣＳ
１６Ｍ（配列番号：２４）及びＣＳ１６Ｒ（配列番号：
２５）を用いたことの他は実施例１と同様にして、２９
４位から３０１位のアミノ酸配列が対応関係を有するＵ
Ｋのアミノ酸配列（配列番号：７）に置換されたアミノ
酸配列を有するＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１
８）を哺乳類細胞で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−
ＣＳ１８を得た。ＣＳ１８の２７６位から３０６位のア
ミノ酸配列は配列番号：３４に示す通りである。
列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換された
ＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１８）を哺乳類細胞
で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１８の構築 実施例１におけるＣＳ６Ｍ及びＣＳ６Ｒの代わりにＣＳ
１６Ｍ（配列番号：２４）及びＣＳ１６Ｒ（配列番号：
２５）を用いたことの他は実施例１と同様にして、２９
４位から３０１位のアミノ酸配列が対応関係を有するＵ
Ｋのアミノ酸配列（配列番号：７）に置換されたアミノ
酸配列を有するＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１
８）を哺乳類細胞で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−
ＣＳ１８を得た。ＣＳ１８の２７６位から３０６位のア
ミノ酸配列は配列番号：３４に示す通りである。
【００３６】実施例８ 天然型のｔ−ＰＡの２９０位から３０１位のアミノ酸配
列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換された
ＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１９）を哺乳類細胞
で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１９の構築 実施例７におけるＣＳ４Ｍ及びＣＳ４Ｒの代わりにＣＳ
１５Ｍ（配列番号：２２）及びＣＳ１５Ｒ（配列番号：
２３）を用いたことの他は実施例７と同様にして、２９
０位から３０１位のアミノ酸配列が対応関係を有するＵ
Ｋのアミノ酸配列（配列番号：８）に置換されたアミノ
酸配列を有するＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１
９）を哺乳類細胞で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−
ＣＳ１９を得た。ＣＳ１９の２７６位から３０６位のア
ミノ酸配列は配列番号：３５に示す通りである。
列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換された
ＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１９）を哺乳類細胞
で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１９の構築 実施例７におけるＣＳ４Ｍ及びＣＳ４Ｒの代わりにＣＳ
１５Ｍ（配列番号：２２）及びＣＳ１５Ｒ（配列番号：
２３）を用いたことの他は実施例７と同様にして、２９
０位から３０１位のアミノ酸配列が対応関係を有するＵ
Ｋのアミノ酸配列（配列番号：８）に置換されたアミノ
酸配列を有するＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ１
９）を哺乳類細胞で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−
ＣＳ１９を得た。ＣＳ１９の２７６位から３０６位のア
ミノ酸配列は配列番号：３５に示す通りである。
【００３７】実施例９ 天然型のｔ−ＰＡの２９４位から３００位のアミノ酸配
列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換された
ＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ２０）を哺乳類細胞
で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ２０の構築 実施例１におけるＣＳ６Ｍ及びＣＳ６Ｒの代わりにＣＳ
１７Ｍ（配列番号：２６）及びＣＳ１７Ｒ（配列番号：
２７）を用いたことの他は実施例１と同様にして、２９
４位から３００位のアミノ酸配列が対応関係を有するＵ
Ｋのアミノ酸配列（配列番号：９）に置換されたアミノ
酸配列を有するＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ２
０）を哺乳類細胞で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−
ＣＳ２０を得た。ＣＳ２０の２７６位から３０６位のア
ミノ酸配列は配列番号：３６に示す通りである。
列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換された
ＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ２０）を哺乳類細胞
で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ２０の構築 実施例１におけるＣＳ６Ｍ及びＣＳ６Ｒの代わりにＣＳ
１７Ｍ（配列番号：２６）及びＣＳ１７Ｒ（配列番号：
２７）を用いたことの他は実施例１と同様にして、２９
４位から３００位のアミノ酸配列が対応関係を有するＵ
Ｋのアミノ酸配列（配列番号：９）に置換されたアミノ
酸配列を有するＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ２
０）を哺乳類細胞で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−
ＣＳ２０を得た。ＣＳ２０の２７６位から３０６位のア
ミノ酸配列は配列番号：３６に示す通りである。
【００３８】実施例１０ 天然型のｔ−ＰＡの２９０位から３００位のアミノ酸配
列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換された
ＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ２１）を哺乳類細胞
で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ２１の構築 実施例９におけるＣＳ４Ｍ及びＣＳ４Ｒの代わりにＣＳ
１５Ｍ（配列番号：２２）及びＣＳ１５Ｒ（配列番号：
２３）を用いたことの他は実施例９と同様にして、２９
０位から３００位のアミノ酸配列が対応関係を有するＵ
Ｋのアミノ酸配列（配列番号：１０）に置換されたアミ
ノ酸配列を有するＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ２
１）を哺乳類細胞で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−
ＣＳ２１を得た。ＣＳ２１の２７６位から３０６位のア
ミノ酸配列は配列番号：３７に示す通りである。
列が対応関係を有するＵＫのアミノ酸配列に置換された
ＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ２１）を哺乳類細胞
で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ２１の構築 実施例９におけるＣＳ４Ｍ及びＣＳ４Ｒの代わりにＣＳ
１５Ｍ（配列番号：２２）及びＣＳ１５Ｒ（配列番号：
２３）を用いたことの他は実施例９と同様にして、２９
０位から３００位のアミノ酸配列が対応関係を有するＵ
Ｋのアミノ酸配列（配列番号：１０）に置換されたアミ
ノ酸配列を有するＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡ（ＣＳ２
１）を哺乳類細胞で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−
ＣＳ２１を得た。ＣＳ２１の２７６位から３０６位のア
ミノ酸配列は配列番号：３７に示す通りである。
【００３９】実施例１１ 本発明の血栓溶解タンパク質のＣＯＳ−１細胞での発
現、分泌及び精製 コントロールとして天然型ｔ−ＰＡを発現するｐＣＤＭ
８−０００（文献２１）、及び天然型ｔ−ＰＡの２７６
位から３０６位のアミノ酸配列が対応関係を有するＵＫ
のアミノ酸配列に置換されたＣＳ１を発現するｐＣＤＭ
８−ＣＳ１、そして本発明のｔ−ＰＡ類似体を発現する
ｐＣＤＭ８−ＣＳ１１〜１６、及びｐＣＤＭ８−ＣＳ１
８〜２１を用いて既述の電気パルス法によりＣＯＳ−１
細胞を形質転換した。リジンセファロースクロマト処理
した牛胎児血清１０％およびアプロチニン１０μｇ／ｍ
ｌを含有するＤＭＥＭ培地で２４時間培養後、培地を無
血清かつアプロチニン無含有ＤＭＥＭ培地に交換し、さ
らに９６時間培養を継続した。培養液を遠心後その上清
を回収し、これに１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有
ＤＭＥＭ培地を１／９量添加し、凍結保存した。以下、
このサンプルを培養上清サンプルと称す。
現、分泌及び精製 コントロールとして天然型ｔ−ＰＡを発現するｐＣＤＭ
８−０００（文献２１）、及び天然型ｔ−ＰＡの２７６
位から３０６位のアミノ酸配列が対応関係を有するＵＫ
のアミノ酸配列に置換されたＣＳ１を発現するｐＣＤＭ
８−ＣＳ１、そして本発明のｔ−ＰＡ類似体を発現する
ｐＣＤＭ８−ＣＳ１１〜１６、及びｐＣＤＭ８−ＣＳ１
８〜２１を用いて既述の電気パルス法によりＣＯＳ−１
細胞を形質転換した。リジンセファロースクロマト処理
した牛胎児血清１０％およびアプロチニン１０μｇ／ｍ
ｌを含有するＤＭＥＭ培地で２４時間培養後、培地を無
血清かつアプロチニン無含有ＤＭＥＭ培地に交換し、さ
らに９６時間培養を継続した。培養液を遠心後その上清
を回収し、これに１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有
ＤＭＥＭ培地を１／９量添加し、凍結保存した。以下、
このサンプルを培養上清サンプルと称す。
【００４０】精製は、この凍結保存した培養上清サンプ
ルを融解後、１００μｌの抗ｔ−ＰＡ抗体ゲルによるカ
ラムクロマト処理により行った。なお、抗ｔ−ＰＡ抗体
ゲルの調製は、ｔ−ＰＡをウシに免疫して得られた抗血
清より精製された抗ｔ−ＰＡ抗体をセファロース樹脂に
固定化することにより行った。０．１Ｍクエン酸バッフ
ァー（ｐＨ２．３）で溶出後、直ちに０．１％Ｔｗｅｅ
ｎ８０を含有する０．１５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．３）で中和した。得られたサンプルをＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ後、銀染色を行ったところ、ｔ−ＰＡに相当するサ
イズの位置にほぼ単一のバンドが検出された。以下、こ
のサンプルを精製サンプルと称す。
ルを融解後、１００μｌの抗ｔ−ＰＡ抗体ゲルによるカ
ラムクロマト処理により行った。なお、抗ｔ−ＰＡ抗体
ゲルの調製は、ｔ−ＰＡをウシに免疫して得られた抗血
清より精製された抗ｔ−ＰＡ抗体をセファロース樹脂に
固定化することにより行った。０．１Ｍクエン酸バッフ
ァー（ｐＨ２．３）で溶出後、直ちに０．１％Ｔｗｅｅ
ｎ８０を含有する０．１５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．３）で中和した。得られたサンプルをＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ後、銀染色を行ったところ、ｔ−ＰＡに相当するサ
イズの位置にほぼ単一のバンドが検出された。以下、こ
のサンプルを精製サンプルと称す。
【００４１】ｔ−ＰＡの二本鎖化は、凍結保存した培養
上清サンプルにプラスミンを最終濃度が１０ｎＭとなる
ように添加後、３７℃で１時間インキュベートするか、
又は精製サンプルをプラスミンセファロースで処理後、
遠心によりセファロース樹脂を除去することにより行っ
た。これらの二本鎖化された培養上清サンプル或いは精
製サンプルをｔ−ＰＡ試料と称し、以後の評価に用い
た。
上清サンプルにプラスミンを最終濃度が１０ｎＭとなる
ように添加後、３７℃で１時間インキュベートするか、
又は精製サンプルをプラスミンセファロースで処理後、
遠心によりセファロース樹脂を除去することにより行っ
た。これらの二本鎖化された培養上清サンプル或いは精
製サンプルをｔ−ＰＡ試料と称し、以後の評価に用い
た。
【００４２】実施例１２ 蛋白量の定量 前記の培養上清サンプルおよび精製サンプルの蛋白量
は、市販のキット（バイオプール社製）を用いた酵素免
疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定された。
は、市販のキット（バイオプール社製）を用いた酵素免
疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定された。
【００４３】実施例１３ 培養上清サンプルのフィブリン特異性の評価 発色性合成基質Ｓ−２２５１を用いるｔ−ＰＡのプラス
ミノーゲン活性化活性測定系にフィブリン或いはフィブ
リノーゲンを添加し、培養上清サンプルのフィブリン特
異性の評価を行った。
ミノーゲン活性化活性測定系にフィブリン或いはフィブ
リノーゲンを添加し、培養上清サンプルのフィブリン特
異性の評価を行った。
【００４４】１）フィブリン系 まず、９６穴プレートのウェル中に６０国際単位／ｍｌ
のトロンビン（０. ０１％Ｔｗｅｅｎ ８０含有ＰＢ
Ｓ）１０μl を添加した。次に０. ０１％Ｔｗｅｅｎ
８０含有ＰＢＳで２００ｎｇ／ｍｌに希釈された各ｔ−
ＰＡ試料２２５μｌに１０ｎＭのプラスミン２５μｌを
添加し、３７℃で１時間インキュベートすることにより
二本鎖化したｔ−ＰＡ試料２０μｌを添加し、さらに反
応混合液〔プラスミノーゲン１３５ｎＭ、フィブリノー
ゲン１００μｇ／ｍｌ、Ｓ−２２５１ ３７８μＭ
（０. ０９％(v/v) Ｔｗｅｅｎ ８０及び４．４ｍｇ／
ｍｌゼラチン含有０．１３Ｍトリス塩酸ｐＨ７．８溶
液）〕２００μｌを添加した。３７℃でインキュベート
を開始後、プレートリーダーを用いて４０５nmにおける
吸光度（ＯＤ405 ）を経時的に測定した。同時にフィブ
リンによる濁度の影響を補正するため、４９０nmにおけ
る吸光度（ＯＤ490 ）を測定し、各時間でそのＯＤ490
値をＯＤ405 値から差し引いた。
のトロンビン（０. ０１％Ｔｗｅｅｎ ８０含有ＰＢ
Ｓ）１０μl を添加した。次に０. ０１％Ｔｗｅｅｎ
８０含有ＰＢＳで２００ｎｇ／ｍｌに希釈された各ｔ−
ＰＡ試料２２５μｌに１０ｎＭのプラスミン２５μｌを
添加し、３７℃で１時間インキュベートすることにより
二本鎖化したｔ−ＰＡ試料２０μｌを添加し、さらに反
応混合液〔プラスミノーゲン１３５ｎＭ、フィブリノー
ゲン１００μｇ／ｍｌ、Ｓ−２２５１ ３７８μＭ
（０. ０９％(v/v) Ｔｗｅｅｎ ８０及び４．４ｍｇ／
ｍｌゼラチン含有０．１３Ｍトリス塩酸ｐＨ７．８溶
液）〕２００μｌを添加した。３７℃でインキュベート
を開始後、プレートリーダーを用いて４０５nmにおける
吸光度（ＯＤ405 ）を経時的に測定した。同時にフィブ
リンによる濁度の影響を補正するため、４９０nmにおけ
る吸光度（ＯＤ490 ）を測定し、各時間でそのＯＤ490
値をＯＤ405 値から差し引いた。
【００４５】スタンダードとして種々の濃度に希釈した
天然型のｔ−ＰＡ（培養上清サンプル）を同様の方法で
測定し、濃度に対する一定時間後の吸光度（ＯＤ405 −
ＯＤ490 ）値をプロットした検量線を作製し、この検量
線をもとに天然型のｔ−ＰＡに対する各ｔ−ＰＡ類似体
試料（ＣＳ１２、ＣＳ１３）の相対活性を決定した。ま
た、対照としてＣＳ１についても同様に相対活性を決定
した。
天然型のｔ−ＰＡ（培養上清サンプル）を同様の方法で
測定し、濃度に対する一定時間後の吸光度（ＯＤ405 −
ＯＤ490 ）値をプロットした検量線を作製し、この検量
線をもとに天然型のｔ−ＰＡに対する各ｔ−ＰＡ類似体
試料（ＣＳ１２、ＣＳ１３）の相対活性を決定した。ま
た、対照としてＣＳ１についても同様に相対活性を決定
した。
【００４６】２）フィブリノーゲン系 フィブリン系と同様に行った。ただし、トロンビンの代
わりに０．０１％Ｔｗｅｅｎ ８０含有ＰＢＳを用い
た。フィブリン系においては反応３０分後、フィブリノ
ーゲン系においては反応２時間後の吸光度（ＯＤ405 −
ＯＤ490 ）を評価に用いて相対活性を決定した。フィブ
リン特異性は、「フィブリン系における相対活性」／
「フィブリノーゲン系における相対活性」の比で表し
た。表１に培養上清サンプルを用いた場合の各ｔ−ＰＡ
類似体試料の天然型のｔ−ＰＡに対する相対活性及びフ
ィブリン特異性を示す。
わりに０．０１％Ｔｗｅｅｎ ８０含有ＰＢＳを用い
た。フィブリン系においては反応３０分後、フィブリノ
ーゲン系においては反応２時間後の吸光度（ＯＤ405 −
ＯＤ490 ）を評価に用いて相対活性を決定した。フィブ
リン特異性は、「フィブリン系における相対活性」／
「フィブリノーゲン系における相対活性」の比で表し
た。表１に培養上清サンプルを用いた場合の各ｔ−ＰＡ
類似体試料の天然型のｔ−ＰＡに対する相対活性及びフ
ィブリン特異性を示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】表中のスティミュレーターの表示において
は、Ｆｇはフィブリノーゲン系、Ｆｎはフィブリン系を
示す。また、Ｆｎ／Ｆｇは「フィブリン系における相対
活性」／「フィブリノーゲン系における相対活性」の比
を示す。表１より、本発明のｔ−ＰＡ類似体は、天然型
のｔ−ＰＡと比較して高いフィブリン特異性を有してい
ることが明らかとなった。
は、Ｆｇはフィブリノーゲン系、Ｆｎはフィブリン系を
示す。また、Ｆｎ／Ｆｇは「フィブリン系における相対
活性」／「フィブリノーゲン系における相対活性」の比
を示す。表１より、本発明のｔ−ＰＡ類似体は、天然型
のｔ−ＰＡと比較して高いフィブリン特異性を有してい
ることが明らかとなった。
【００４９】実施例１４ 精製サンプルのフィブリン特異性の評価 １）フィブリン系 培養上清サンプルと同様の方法で測定を行った。但し、
測定には、５０〜１０００ｎｇ／ｍｌの範囲で希釈され
たｔ−ＰＡ試料を用いた。スタンダードとして種々の濃
度に希釈した天然型の標準精製ｔ−ＰＡ（５５±１．６
×１０4 ＩＵ／ｍｇ）を同様の方法で測定した。
測定には、５０〜１０００ｎｇ／ｍｌの範囲で希釈され
たｔ−ＰＡ試料を用いた。スタンダードとして種々の濃
度に希釈した天然型の標準精製ｔ−ＰＡ（５５±１．６
×１０4 ＩＵ／ｍｇ）を同様の方法で測定した。
【００５０】吸光度（ＯＤ405 −ＯＤ490)値を時間の二
乗に対してプロットし、最小自乗法により算出される直
線部分の勾配を活性の指標とした。標準精製ｔ−ＰＡの
濃度に対する勾配の値をプロットした検量線を作製し、
この検量線をもとに各ｔ−ＰＡ類似体試料および天然型
ｔ−ＰＡ試料の活性を決定した。活性をＥＬＩＳＡによ
り得られた蛋白量で除すことにより、各ｔ−ＰＡ類似体
試料及び天然型ｔ−ＰＡ試料の比活性を算出した。
乗に対してプロットし、最小自乗法により算出される直
線部分の勾配を活性の指標とした。標準精製ｔ−ＰＡの
濃度に対する勾配の値をプロットした検量線を作製し、
この検量線をもとに各ｔ−ＰＡ類似体試料および天然型
ｔ−ＰＡ試料の活性を決定した。活性をＥＬＩＳＡによ
り得られた蛋白量で除すことにより、各ｔ−ＰＡ類似体
試料及び天然型ｔ−ＰＡ試料の比活性を算出した。
【００５１】２）フィブリノーゲン系 フィブリン系と同様に行った。ただし、トロンビンの代
わりに０．０１％Ｔｗｅｅｎ ８０含有ＰＢＳを用い
た。フィブリン特異性は、「フィブリン系における比活
性」／「フィブリノーゲン系における比活性」比で表し
た。表２に精製サンプルを用いた場合の天然型のｔ−Ｐ
Ａの比活性を１．０とした時の各ｔ−ＰＡ類似体試料の
相対比活性及びフィブリン特異性を示す。
わりに０．０１％Ｔｗｅｅｎ ８０含有ＰＢＳを用い
た。フィブリン特異性は、「フィブリン系における比活
性」／「フィブリノーゲン系における比活性」比で表し
た。表２に精製サンプルを用いた場合の天然型のｔ−Ｐ
Ａの比活性を１．０とした時の各ｔ−ＰＡ類似体試料の
相対比活性及びフィブリン特異性を示す。
【００５２】
【表２】
【００５３】表中のスティミュレーターの表示において
は、Ｆｇはフィブリノーゲン系、Ｆｎはフィブリン系を
指す。また、Ｆｎ／Ｆｇは「フィブリン系における比活
性」／「フィブリノーゲン系における比活性」の比を示
す。表２より、本発明のｔ−ＰＡ類似体は、天然型のｔ
−ＰＡと比較して高いフィブリン特異性を有しているこ
とが明らかとなった。これは培養上清サンプルを用いた
実施例１３と同様の結果であった。
は、Ｆｇはフィブリノーゲン系、Ｆｎはフィブリン系を
指す。また、Ｆｎ／Ｆｇは「フィブリン系における比活
性」／「フィブリノーゲン系における比活性」の比を示
す。表２より、本発明のｔ−ＰＡ類似体は、天然型のｔ
−ＰＡと比較して高いフィブリン特異性を有しているこ
とが明らかとなった。これは培養上清サンプルを用いた
実施例１３と同様の結果であった。
【００５４】実施例１５ 培養上清サンプルの血漿塊特異性の評価 実施例１３においてフィブリン特異性の最も優れていた
ＣＳ１３について、さらにヒト血漿中及び血漿塊中にお
けるプラスミノーゲン活性化活性を、発色性合成基質Ｓ
−２２５１を用いた反応系で測定し、血漿塊特異性の評
価を行った。方法は文献 22 に示されている方法に準じ
て行った。
ＣＳ１３について、さらにヒト血漿中及び血漿塊中にお
けるプラスミノーゲン活性化活性を、発色性合成基質Ｓ
−２２５１を用いた反応系で測定し、血漿塊特異性の評
価を行った。方法は文献 22 に示されている方法に準じ
て行った。
【００５５】１）血漿塊系 まず、９６穴プレートのウェル中に６０国際単位／ｍｌ
のトロンビン（０. ０１％Ｔｗｅｅｎ ８０含有ＰＢ
Ｓ）１０μｌを添加した。次に０. ０１％Ｔｗｅｅｎ
８０含有ＰＢＳで２００ｎｇ／ｍｌに希釈されたｔ−Ｐ
Ａ試料（ＣＳ１３）２２５μｌに１０ｎＭのプラスミン
２５μｌを添加し、３７℃で１時間インキュベートする
ことにより二本鎖化したｔ−ＰＡ試料４０μｌを添加
し、さらに反応混合液〔血漿９０μｌ、Ｓ−２２５１
９. １ｍＭ（０. ０１％(v/v) Ｔｗｅｅｎ ８０含有Ｐ
ＢＳ）１０μｌ〕１００μｌを添加した。３７℃でイン
キュベートを開始後、プレートリーダーを用いて４０５
nmにおける吸光度（ＯＤ405 ）を経時的に測定した。同
時にフィブリンによる濁度の影響を補正するため、４９
０nmにおける吸光度（ＯＤ490 ）を測定し、各時間でそ
のＯＤ490 値をＯＤ405値から差し引いた。
のトロンビン（０. ０１％Ｔｗｅｅｎ ８０含有ＰＢ
Ｓ）１０μｌを添加した。次に０. ０１％Ｔｗｅｅｎ
８０含有ＰＢＳで２００ｎｇ／ｍｌに希釈されたｔ−Ｐ
Ａ試料（ＣＳ１３）２２５μｌに１０ｎＭのプラスミン
２５μｌを添加し、３７℃で１時間インキュベートする
ことにより二本鎖化したｔ−ＰＡ試料４０μｌを添加
し、さらに反応混合液〔血漿９０μｌ、Ｓ−２２５１
９. １ｍＭ（０. ０１％(v/v) Ｔｗｅｅｎ ８０含有Ｐ
ＢＳ）１０μｌ〕１００μｌを添加した。３７℃でイン
キュベートを開始後、プレートリーダーを用いて４０５
nmにおける吸光度（ＯＤ405 ）を経時的に測定した。同
時にフィブリンによる濁度の影響を補正するため、４９
０nmにおける吸光度（ＯＤ490 ）を測定し、各時間でそ
のＯＤ490 値をＯＤ405値から差し引いた。
【００５６】スタンダードとして種々の濃度に希釈した
天然型ｔ−ＰＡを同様の方法で測定し、濃度に対する一
定時間後の吸光度（ＯＤ405 −ＯＤ490 ）値をプロット
した検量線を作製し、この検量線をもとに天然型のｔ−
ＰＡに対するｔ−ＰＡ類似体試料（ＣＳ１３）の相対活
性を決定した。
天然型ｔ−ＰＡを同様の方法で測定し、濃度に対する一
定時間後の吸光度（ＯＤ405 −ＯＤ490 ）値をプロット
した検量線を作製し、この検量線をもとに天然型のｔ−
ＰＡに対するｔ−ＰＡ類似体試料（ＣＳ１３）の相対活
性を決定した。
【００５７】２）血漿系 血漿塊系と同様に行った。ただし、トロンビンの代わり
に０．０１％Ｔｗｅｅｎ ８０含有ＰＢＳを用いた。血
漿塊系においては反応１時間後、また血漿系においては
反応５時間後における吸光度（ＯＤ405 −ＯＤ490 ）を
評価に用いて相対活性を決定した。血漿塊特異性は、
「血漿塊系における相対活性」／「血漿系における相対
活性」比で表した。表３にＣＳ１３の培養上清サンプル
を用いた場合の天然型ｔ−ＰＡに対する相対活性及び血
漿塊特異性を示す。
に０．０１％Ｔｗｅｅｎ ８０含有ＰＢＳを用いた。血
漿塊系においては反応１時間後、また血漿系においては
反応５時間後における吸光度（ＯＤ405 −ＯＤ490 ）を
評価に用いて相対活性を決定した。血漿塊特異性は、
「血漿塊系における相対活性」／「血漿系における相対
活性」比で表した。表３にＣＳ１３の培養上清サンプル
を用いた場合の天然型ｔ−ＰＡに対する相対活性及び血
漿塊特異性を示す。
【００５８】
【表３】
【００５９】表中のスティミュレーターの表示において
は、Ｐは血漿、Ｐｃは血漿塊を指す。また、Ｐｃ／Ｐは
「血漿塊系における相対活性」／「血漿系における相対
活性」の比である。表３より、本発明のｔ−ＰＡ類似体
（ＣＳ１３）は、天然型のｔ−ＰＡと比較して高い血漿
塊特異性を有していることが明らかとなった。
は、Ｐは血漿、Ｐｃは血漿塊を指す。また、Ｐｃ／Ｐは
「血漿塊系における相対活性」／「血漿系における相対
活性」の比である。表３より、本発明のｔ−ＰＡ類似体
（ＣＳ１３）は、天然型のｔ−ＰＡと比較して高い血漿
塊特異性を有していることが明らかとなった。
【００６０】実施例１６ 精製サンプルの血漿塊特異性の評価 １）血漿塊系 培養上清サンプルと同様の方法で測定を行った。但し、
測定には、１０００〜８０００ｎｇ／ｍｌの範囲で希釈
されたｔ−ＰＡ試料を用いた。スタンダードとして種々
の濃度に希釈した実施例１４記載の標準精製ｔ−ＰＡを
同様の方法で測定した。
測定には、１０００〜８０００ｎｇ／ｍｌの範囲で希釈
されたｔ−ＰＡ試料を用いた。スタンダードとして種々
の濃度に希釈した実施例１４記載の標準精製ｔ−ＰＡを
同様の方法で測定した。
【００６１】吸光度（ＯＤ405 −ＯＤ490)値を時間の二
乗に対してプロットし、最小自乗法により算出される直
線部分の勾配を活性の指標とした。標準精製ｔ−ＰＡの
濃度に対する勾配の値をプロットした検量線を作製し、
この検量線をもとに各ｔ−ＰＡ類似体試料および天然型
ｔ−ＰＡ試料の活性を決定した。活性をＥＬＩＳＡによ
り得られた蛋白量で除すことにより、各ｔ−ＰＡ類似体
試料及び天然型ｔ−ＰＡ試料の比活性を算出した。
乗に対してプロットし、最小自乗法により算出される直
線部分の勾配を活性の指標とした。標準精製ｔ−ＰＡの
濃度に対する勾配の値をプロットした検量線を作製し、
この検量線をもとに各ｔ−ＰＡ類似体試料および天然型
ｔ−ＰＡ試料の活性を決定した。活性をＥＬＩＳＡによ
り得られた蛋白量で除すことにより、各ｔ−ＰＡ類似体
試料及び天然型ｔ−ＰＡ試料の比活性を算出した。
【００６２】２）血漿系 血漿塊系と同様に行った。ただし、トロンビンの代わり
に０．０１％Ｔｗｅｅｎ ８０含有ＰＢＳを用いた。血
漿塊特異性は、「血漿塊系における比活性」／「血漿系
における比活性」比で表した。表４に精製サンプルを用
いた場合の天然型のｔ−ＰＡの比活性を１．０とした時
の各ｔ−ＰＡ試料の相対比活性及び血漿塊特異性を示
す。
に０．０１％Ｔｗｅｅｎ ８０含有ＰＢＳを用いた。血
漿塊特異性は、「血漿塊系における比活性」／「血漿系
における比活性」比で表した。表４に精製サンプルを用
いた場合の天然型のｔ−ＰＡの比活性を１．０とした時
の各ｔ−ＰＡ試料の相対比活性及び血漿塊特異性を示
す。
【００６３】
【表４】
【００６４】表中のスティミュレーターの表示において
は、Ｐは血漿系、Ｐｃは血漿塊系を指す。また、Ｐｃ／
Ｐは「血漿塊系における比活性」／「血漿系における比
活性」の比を示す。表４より、本発明のｔ−ＰＡ類似体
は、天然型のｔ−ＰＡと比較して高い血漿塊特異性を有
していることが明らかとなった。これは培養上清サンプ
ルを用いた実施例１５と同様の結果であった。
は、Ｐは血漿系、Ｐｃは血漿塊系を指す。また、Ｐｃ／
Ｐは「血漿塊系における比活性」／「血漿系における比
活性」の比を示す。表４より、本発明のｔ−ＰＡ類似体
は、天然型のｔ−ＰＡと比較して高い血漿塊特異性を有
していることが明らかとなった。これは培養上清サンプ
ルを用いた実施例１５と同様の結果であった。
【００６５】1 ）The TIMI study group : N. Engl. J.
Med., 320, 618-627, 1989. 2 ）欧州特許出願公開 No.0351246 A2 3 ）欧州特許出願公開 No.366091 4 ）国際公開No.8909266 5 ）国際公開No.9000600 6 ）国際公開No.9002798 7 ）国際公開No.9004635 8 ）特開昭60-252422 号公報 9 ）特開昭62-253380 号公報 10）L. C. Petersen et al.: Biochemistry, 29, 3451-
3457, 1990. 11）J. C. Monge et al. : J. B. C., 264, 10922-1092
5, 1989. 12）E. L. Madison et al. : Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A., 87, 3530-3533,1990. 13）Pennica et al. : Nature, 301, 214-221, 1983. 14）特表昭63-501335 号公報 15）S. Yoshitake et al. ： Thromb. Haemostasis, 6
2, 542-543, 1989. 16）T. Maniatis et al. : Molecular Cloning, A Labo
ratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory, 1982. 17）M.J.Zoller et al. ： Methods in Enzymology, 10
0, 468, 1983. 18）S. L. Beaucage et al. : Tetrahedron Letters, 2
2(20), 1859, 1981. 19）高山伸一郎、細胞工学 6, 771, 1987. 20）D. C. Rijken et al.: Biochemica Biophysica Act
a, 580, 140-153, 1979. 21）特願平2-87005 号 22）国際公開No.9002798 23）Holmes et al. ：BIO/TECHNOLOGY, 3, 923, 1985. 24）特開平4-144682号公報 25）F. Sanger et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.
A., 74, 5463, 1977.
Med., 320, 618-627, 1989. 2 ）欧州特許出願公開 No.0351246 A2 3 ）欧州特許出願公開 No.366091 4 ）国際公開No.8909266 5 ）国際公開No.9000600 6 ）国際公開No.9002798 7 ）国際公開No.9004635 8 ）特開昭60-252422 号公報 9 ）特開昭62-253380 号公報 10）L. C. Petersen et al.: Biochemistry, 29, 3451-
3457, 1990. 11）J. C. Monge et al. : J. B. C., 264, 10922-1092
5, 1989. 12）E. L. Madison et al. : Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A., 87, 3530-3533,1990. 13）Pennica et al. : Nature, 301, 214-221, 1983. 14）特表昭63-501335 号公報 15）S. Yoshitake et al. ： Thromb. Haemostasis, 6
2, 542-543, 1989. 16）T. Maniatis et al. : Molecular Cloning, A Labo
ratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory, 1982. 17）M.J.Zoller et al. ： Methods in Enzymology, 10
0, 468, 1983. 18）S. L. Beaucage et al. : Tetrahedron Letters, 2
2(20), 1859, 1981. 19）高山伸一郎、細胞工学 6, 771, 1987. 20）D. C. Rijken et al.: Biochemica Biophysica Act
a, 580, 140-153, 1979. 21）特願平2-87005 号 22）国際公開No.9002798 23）Holmes et al. ：BIO/TECHNOLOGY, 3, 923, 1985. 24）特開平4-144682号公報 25）F. Sanger et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.
A., 74, 5463, 1977.
【００６６】
【発明の効果】本発明のｔ−ＰＡ類似体は、フィブリン
特異性が上昇した新規なｔ−ＰＡ類似体であり、全身性
の出血傾向というｔ−ＰＡの副作用を減じた血栓症治療
剤としての利用が期待される。
特異性が上昇した新規なｔ−ＰＡ類似体であり、全身性
の出血傾向というｔ−ＰＡの副作用を減じた血栓症治療
剤としての利用が期待される。
【００６７】
配列番号：１ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００６８】配列番号：２ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala Ala Ile Tyr Arg 1 5 10 15 Arg His
【００６９】配列番号：３ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００７０】配列番号：４ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００７１】配列番号：５ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００７２】配列番号：６ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００７３】配列番号：７ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００７４】配列番号：８ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００７５】配列番号：９ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００７６】配列番号：１０ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００７７】配列番号：１１ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala 1 5 10 15 Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val 20 25 30
【００７８】配列番号：１２ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列 CGC ATC AAA GGA GGG CTC TTC GCC GAC ATC GCC TCC CAC CCC TGG CAG 48 GC 50
【００７９】配列番号：１３ 配列の長さ：５３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 T GGC CGC CTG CCA GGG GTG GGA GGC GAT GTC GGC GAA GAG CCC TCC 46 TTT GAT G 53
【００８０】配列番号：１４ 配列の長さ：５２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列 G GCC ATC TAC AGG AGG CAC CGG TCG CCC GGA GAG CGG TTC CTG TGT 46 GGA GGC 52
【００８１】配列番号：１５ 配列の長さ：４９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 AT GCC TCC ACA CAG GAA CCG CTC TCC GGG CGA CCG GTG CCT CCT GTA 47 GA 49
【００８２】配列番号：１６ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列 CGC ATC AAA GGT GGA GAA TTC ACC ACC ATC GAG AAC CAG CCC TGG TTT 48 GC 50
【００８３】配列番号：１７ 配列の長さ：５３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 T GGC CGC AAA CCA GGG CTG GTT CTC GAT GGT GGT GAA TTC TCC ACC 46 TTT GAT G 53
【００８４】配列番号：１８ 配列の長さ：５２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列 G GCC ATC TAC AGG AGG CAC CGA GGT GGC TCT GTC ACC TTC CTG TGT 46 GGA GGC 52
【００８５】配列番号：１９ 配列の長さ：４９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列： AT GCC TCC ACA CAG GAA GGT GAC AGA GCC ACC TCG GTG CCT CCT GTA 47 GA 49
【００８６】配列番号：２０ 配列の長さ：５２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列： G GCC ATC TAC AGG AGG CAC CGA GGT GGC TCT GAG CGG TTC CTG TGT 46 GGA GGC 52
【００８７】配列番号：２１ 配列の長さ：４９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列： AT GCC TCC ACA CAG GAA CCG CTC AGA GCC ACC TCG GTG CCT CCT GTA 47 GA 49
【００８８】配列番号：２２ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列： CGC ATC AAA GGT GGA CTC TTC GCC GAC ATC GCC TCC CAC CCC TGG TTT 48 GC 50
【００８９】配列番号：２３ 配列の長さ：５３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列： T GGC CGC AAA CCA GGG GTG GGT GGC GAT GTC GGC GAA GAG TCC ACC 46 TTT GAT G 53
【００９０】配列番号：２４ 配列の長さ：５２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列： G GCC ATC TAC AGG AGG CAC CGA GGT GGC GGA GAG CGG TTC CTG TGT 46 GGA GGC 52
【００９１】配列番号：２５ 配列の長さ：４９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列： AT GCC TCC ACA CAG GAA CCG CTC TCC GCC ACC TCG GTG CCT CCT GTA 47 GA 49
【００９２】配列番号：２６ 配列の長さ：５２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列： G GCC ATC TAC AGG AGG CAC CGA GGT CCC GGA GAG CGG TTC CTG TGT 46 GGA GGC 52
【００９３】配列番号：２７ 配列の長さ：４９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列： AT GCC TCC ACA CAG GAA CCG CTC TCC GGG ACC TCG GTG CCT CCT GTA 47 GA 49
【００９４】配列番号：２８ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala 1 5 10 15 Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu 20 25 30
【００９５】配列番号：２９ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ile Lys Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala 1 5 10 15 Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu 20 25 30
【００９６】配列番号：３０ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala 1 5 10 15 Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Phe Leu 20 25 30
【００９７】配列番号：３１ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala 1 5 10 15 Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Glu Arg Phe Leu 20 25 30
【００９８】配列番号：３２ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Phe Ala 1 5 10 15 Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu 20 25 30
【００９９】配列番号：３３ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Phe Ala 1 5 10 15 Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Glu Arg Phe Leu 20 25 30
【０１００】配列番号：３４ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala 1 5 10 15 Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Gly Glu Arg Phe Leu 20 25 30
【０１０１】配列番号：３５ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Phe Ala 1 5 10 15 Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Gly Glu Arg Phe Leu 20 25 30
【０１０２】配列番号：３６ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala 1 5 10 15 Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Pro Gly Glu Arg Phe Leu 20 25 30
【０１０３】配列番号：３７ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Phe Ala 1 5 10 15 Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Pro Gly Glu Arg Phe Leu 20 25 30
【０１０４】配列番号：３８ 配列の長さ：２４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala Ala Ile Tyr Arg 1 5 10 15 Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr 20
【図１】図１は、プラスミドｐＨＳＧＢ−ＣＳ１３の構
築の概念図を示す。
築の概念図を示す。
【図２】図２は、プラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１３の構
築の概念図を示す。
築の概念図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 15/09 ＺＮＡ //(Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9050−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (13)
- 【請求項１】 組織プラスミノーゲン活性化因子（以
下、ｔ−ＰＡと略す）のアミノ酸配列中、天然型のｔ−
ＰＡのアミノ酸配列の２８０位から３０４位に相当する
アミノ酸配列の全部又は一部が、下記に示すような対応
関係を有する尿プラスミノーゲン活性化因子（以下、Ｕ
Ｋと略す）のアミノ酸配列に置換されており、かつその
置換領域が天然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２９４位
から２９８位に対応するＵＫの１７７位から１８０位の
アミノ酸配列；Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ（配列
番号：１）を少なくとも含むアミノ酸配列からなること
を特徴とする、ｔ−ＰＡ類似体。 【化１】 （なお、アミノ酸配列において対応関係とは、天然型の
ｔ−ＰＡの２８０位がＵＫの１６３位に対応し、以下順
次上段の配列が下段の配列に対応する関係を示す。ま
た、上記の配列表示における−は、ＵＫのアミノ酸配列
への置換においてアミノ酸が欠失した状態で対応するも
のとする。） - 【請求項２】 置換領域が、天然型のｔ−ＰＡの２８０
位から２９８位に対応するＵＫの１６３位から１８０位
のアミノ酸配列；Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｉ
ｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｈ
ｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
−Ｈｉｓ（配列番号：２）を含むアミノ酸配列からなる
ことを特徴とする、請求項１記載のｔ−ＰＡ類似体。 - 【請求項３】 置換領域が、天然型のｔ−ＰＡの２９４
位から３０４位に対応するＵＫの１７７位から１８６位
のアミノ酸配列；Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａ
ｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（配列
番号：３）を含むアミノ酸配列からなることを特徴とす
る、請求項１記載のｔ−ＰＡ類似体。 - 【請求項４】 置換領域が、天然型のｔ−ＰＡの２９４
位から３０２位に対応するＵＫの１７７位から１８４位
のアミノ酸配列；Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａ
ｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号：４）を含む
アミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１記載
のｔ−ＰＡ類似体。 - 【請求項５】 置換領域が、天然型のｔ−ＰＡの２９０
位から２９８位に対応するＵＫの１７３位から１８０位
のアミノ酸配列；Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔ
ｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ（配列番号：５）を含む
アミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１記載
のｔ−ＰＡ類似体。 - 【請求項６】 置換領域が、天然型のｔ−ＰＡの２９０
位から３０２位に対応するＵＫの１７３位から１８４位
のアミノ酸配列；Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔ
ｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｓｅｒ（配列番号：６）を含むアミノ酸配列からな
ることを特徴とする、請求項１記載のｔ−ＰＡ類似体。 - 【請求項７】 置換領域が、天然型のｔ−ＰＡの２９４
位から３０１位に対応するＵＫの１７７位から１８３位
のアミノ酸配列；Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａ
ｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号：７）を含むアミノ酸
配列からなることを特徴とする、請求項１記載のｔ−Ｐ
Ａ類似体。 - 【請求項８】 置換領域が、天然型のｔ−ＰＡの２９０
位から３０１位に対応するＵＫの１７３位から１８３位
のアミノ酸配列；Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔ
ｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ（配列番号：８）を含むアミノ酸配列からなることを
特徴とする、請求項１記載のｔ−ＰＡ類似体。 - 【請求項９】 置換領域が、天然型のｔ−ＰＡの２９４
位から３００位に対応するＵＫの１７７位から１８２位
のアミノ酸配列；Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａ
ｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号：９）を含むアミノ酸配列から
なることを特徴とする、請求項１記載のｔ−ＰＡ類似
体。 - 【請求項１０】 置換領域が、天然型のｔ−ＰＡの２９
０位から３００位に対応するＵＫの１７３位から１８２
位のアミノ酸配列；Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−
Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配
列番号：１０）を含むアミノ酸配列からなることを特徴
とする、請求項１記載のｔ−ＰＡ類似体。 - 【請求項１１】 形質転換された原核性生物細胞または
真核性生物細胞において、請求項１〜１０いずれかに記
載のｔ−ＰＡ類似体をコードしているＤＮＡを発現させ
得る組換え発現ベクター。 - 【請求項１２】 請求項１１記載の組換え発現ベクター
で形質転換された原核性生物細胞または真核性生物細
胞。 - 【請求項１３】 請求項１〜１０いずれかに記載のｔ−
ＰＡ類似体を有効成分として含有することを特徴とする
血栓症治療剤。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6197635A JPH07143877A (ja) | 1993-10-01 | 1994-07-29 | 新規なｔ−ＰＡ類似体 |
| PCT/JP1994/001629 WO1995009908A1 (fr) | 1993-10-01 | 1994-09-30 | Nouvel analogue de l'activateur du plasminogene tissulaire |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5-269983 | 1993-10-01 | ||
| JP26998393 | 1993-10-01 | ||
| JP6197635A JPH07143877A (ja) | 1993-10-01 | 1994-07-29 | 新規なｔ−ＰＡ類似体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07143877A true JPH07143877A (ja) | 1995-06-06 |
Family
ID=26510481
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6197635A Pending JPH07143877A (ja) | 1993-10-01 | 1994-07-29 | 新規なｔ−ＰＡ類似体 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07143877A (ja) |
| WO (1) | WO1995009908A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6201104B1 (en) * | 1998-12-04 | 2001-03-13 | Entremed, Inc. | Angiogenesis—inhibiting protein binding peptides and proteins and methods of use |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2043610T3 (es) * | 1986-01-31 | 1994-01-01 | Sagami Chem Res | Procedimiento para la produccion de un polipeptido hibrido del tipo activador de plasminogeno. |
| FI100106B (fi) * | 1986-12-05 | 1997-09-30 | Novartis Ag | Menetelmä plasminogeenin yksisäikeisen yhdistelmäaktivaattorin valmist amiseksi |
| JPH04144682A (ja) * | 1990-10-05 | 1992-05-19 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | 新規なｔ―ＰＡ類似体 |
-
1994
- 1994-07-29 JP JP6197635A patent/JPH07143877A/ja active Pending
- 1994-09-30 WO PCT/JP1994/001629 patent/WO1995009908A1/ja active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1995009908A1 (fr) | 1995-04-13 |
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