JPH04144682A - 新規なｔ―ＰＡ類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、組織プラスミノーゲン活性化因子（以下、ｔ
−ＰＡ）の新規な類似体に関する。

更に詳しくは、ｔ−ＰＡのアミノ酸配列中、天然のｔ−
ＰＡの２７６位から３０６位に相当する部分のアミノ酸
配列か尿プラスミノーゲン活性化因子由来のアミノ酸配
列の一部で置換されることにより、プラスミノーゲン活
性化因子阻害因子による阻害に対して抵抗性を有し、か
つｔ−ＰＡとしての特性を保持するｔ−ＰＡ類似体に関
するものである。

〔従来の技術〕

ｔ−ＰＡは初め、コレン（ＣｏＩｌｅｎ’）等によって
天然のものか単離された（下記文献１））。ｔ−ＰＡは
血漿中に存在する不活性型酵素前駆体であるプラスミノ
ーゲンを限定的加水分解することによって活性型酵素で
あるプラスミンに変換する。プラスミンは血管内に生し
たフィブリン塊を分解する作用をもち、種々の原因によ
って生した血栓を溶解する（線溶）。プラスミノーゲン
の全身的な活性化を防ぐために、数種のｔ−ＰＡ阻害因
子か血漿中等に存在する。中でも、ブラスミノーゲンア
クチヘーターインヒビター１　　（ＦＡＩ−１）（下記
文献２）、３）、４））はｔ−ＰＡとの反応速度か大き
いこと（＞ｌ０７Ｍ　”ｓ　−’　）　　（下記文献５
）、６））、および血管内皮細胞上等に多く存在してい
ることか報告されており（下記文献７））、最も重要な
ｔ−ＰＡ阻害因子である。

ｌ）欧州特許出願公開　Ｎα００４１７６６　Ａ２２）
エル、ニー、エリクソン　エトアル１．ブロノシ、ナシ
ョル、アカト、サイ、ニーニスニー８２　８７１０−８
７１４　　（＋９８５）（Ｌ、Ａ、Ｅｒ１ｃｋｓｏｎ　
ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、　　ＵＳＡ　　８２　８７１０−８７１４　（＋９８
５））３）ジュー。ニー、ヴイ　モウリンク　エトアル
１．シエー、ハイオル、ケミストリー　　２５９１（Ｊ
、Ａ、Ｖ、Ｍｏｕｒｉｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ
、ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５９１４９１４−１４９２１
　（１９８４：Ｌ）４）ティー、ニー　エトアル１．プ
ロツシ、ナンヨル、アカド、サイ、ニーニスニー　８３
　６７７６−６（Ｔ、Ｎｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　８３５）シ
ー、ヘックマン　エトアル１．アーク、バイオケム、バ
イオフィズ　２６２　１９９−２１０　　（１９８８）
（Ｃ，Ｈｅｋｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ａｒｃｈ、ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　２６６）デイ−、コレ
ン２．スロンブ、ヘモシタシス（Ｄ、ＣｏＩｌｅｎ、、
Ｔｈｒｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、　　５６４１５
−４１６（＋９８６’）） ７）ワイ、サカタ　エトアル３．シュー。パイオル　ケ
ミストリー　２６３　１９６０−１９６９　（＋９８８
’）（Ｙ、５ａｋａｔａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ
、ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６３　１９６０−＋９６９　
（１９８８）） 現在、ｔ−ＰＡは初期ポーラス投与とそれに弓き続いた
持続投与かなされている。患者当たりのｔ−ＰＡ投与量
は３０−１５０ｍｇと非常に多い。これは投与されたｔ
−ＰＡか、■）肝細胞により循環血液からの浄化され（
下記文献８））、また、２）血漿中や血小板、血管内皮
細胞上等に存在する高濃度のｔ−ＰＡ阻害因子により不
活化（下記文献９）、１０）　、１１）　、前記文献３
））されるために大量の投与が必要となることによる。

８）フックス　エトアル９．ブラッド　６５５３９−５
４４　（＋９８５） （Ｆｕｃｈｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｌｏｏｄ　６５５３９
−５４４　（１９８５））９）ジェー、クミーレウス力
　エトアル０．スロンブ、レス　３６４２７−４３６　
（１９８３）（Ｊ、Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋａ　ｅｔ　　
ａｌ、、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、３６　４２７−４３６
　　（１９８３’）’） １０’）ノー、エル、ルコレ　エトアル１．サーキュレ
ーション　７７６６０−６６９　（＋９８８）（Ｃ，Ｌ
、Ｌｕｃｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏ
ｎ　　７７６６０−６６９１１）シェー、エイチ、ヘル
ヘイジェン　エトアル０．スロンブ、ヘモシタンス　５
１３９２−３９５（＋９８４）（Ｊ、Ｈ，Ｖｅｒｈｅｉ
ｊｅｎ、、Ｔｈｒｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、５１
３９２−３ｔ−ＰＡを投与した患者の生体内のＦＡＩ−
１濃度は、投与後数時間は低値であったか、翌日には２
〜３倍に上昇していた（下記報告１２））。これはＦＡ
Ｉ−１かｔ−ＰＡに対する即時制反応蛋白（下記文献１
３））で、ＦＡＩ−１−ｔ−ＰＡの複合体か内皮細胞に
作用してＦＡＩ−１の産生ないし放出を上昇させること
によるものであり、この上昇か血栓溶解後の再閉塞の主
な原因の１つとも考えられる。また、ＦＡＩ−１は心筋
梗塞患者の血漿の線溶能低下の原因として示唆されてい
る（前記文献１０）、下記文献１４））。

１２）鎮目研吾らによる報告　第５１回　日本血液学会
総会（＋９８９） １３）エム、コルシ　エトアル１．ンエー、ラブ。

タリン、メッド　１０８５３−５９　（１９８６）（Ｍ
、Ｃｏ１ｕｃｃｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、ｌａｂ、ｃｌｉ
ｎ、Ｍｅｄ、　　１０８５３１４）ニー、ハンステン　
エトアル１．ニュー、イングル、ソニー２　メット　３
１３　１５５７−１５６３　（１９８５）（Ａ、Ｈａｎ
ｓｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅ
ｄ、　３１３　１５５一方、尿プラスミノーゲン活性化
因子（以下、ＵＫ）は、ヒト尿より分離され、その構造
はｔ−ＰＡと相同的であり（下記文献１５）　、１６乃
、増殖因子（Ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）　、クリン
グル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）及び活性（Ａｃｔｉｖｅ）ドメ
インからなりたっている。現在、ＵＫは幅広く臨床的に
使用されているか、大量に投与した場合に全身性出血傾
向をきたすなとのいくつかの問題をもっている。また、
ＵＫには前駆体かあり、ＵＫのペプチド鎖か２本である
のに対して、ペプチド鎖か１本のＵＫ（ｓｃｕ−ＰＡ）
か尿中に存在する（下記文献１７い。この５Ｃｕ−ＦＡ
の特徴として、それ自身では酵素活性かほとんとない（
下記文献＋８）　、１９’）　、２０）、２１））。

又、５ｃｕ−ＰＡはＰＡＩ−１によって強く不活化され
るという報告例は見当たらない。

１５）ジー、ソニー、ステフエンズ　エトアル、７ホツ
ペーセイラーズ　グイ−。フィシオル　ケム（Ｇ、Ｊ、
５ｔｅｆｆｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙ
ｌｅｒ’ｓ　Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、ｃｈｅｍ、　３６３
　１０４３−１０５８　（１９８２）’）１６）ダブル
、ニー、グンズラー　エトアル０．ホッペーセイラーズ
　グイ−。フィシオル　、ケム（Ｗ、Ａ、Ｇｕｎｚｌｅ
ｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ
、Ｐｈｙｓｉｏｌ、ｃｈｅｍ、３６３　１１５５−１１
６５　（１９８２））１７）デイ−、シー　スタンプ　
エトアル１．ジエバイオル、ケミストリー　２６１　１
２６　７−１２７３（Ｄ、Ｃ，Ｓｔｕｍｐ　ｅｔ　ａｌ
、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　２６１　１
２６７−１２７３　　（１９８６）’）１８）エル　ニ
ス、ネイルセン　エトアル、ハイオケム　２＋　６４１
０−６４１５　（１９８２’）（Ｌ、Ｓ、Ｎｅ１ｌｓｅ
ｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、２１６４１０−６
４１５１９）エル、スクライバ−エトアル１．ヨールソ
ニー、バイオケム１２４４０９−４１４（１９８２）　
　（Ｌ、５ｋｒ−ｉｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｅｕｒ、Ｊ
、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　＋２４４０９−４１４（１９８
２））２０）ティー、シー、リン　エトアル０．ソニー
パイオル、ケミストリー２５７７２６７−７２６８　　
（１９８２）（Ｔ−Ｃ，Ｗｕｎ、　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　２５７７２６７−７２６８
２１）ヴイ、グレウインチ　エトアル９．シェークリン
、インベスト　７３１７３１−１７３９　（１９８４）
（Ｖ、Ｇｕｒｅｗｉｃｈ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、ｃｌ
ｉｎ、［ｎｖｅｓｔ、　　７３　１７３１−最近、ＦＡ
Ｉ−１に対して抵抗性を示すｔ−ＰＡ類似体の開発か試
みられている。しかしなから、下記文献２２）記載のｔ
−ＰＡ類似体はいずれもプラスミノーゲン活性化活性か
殆と検出されず、また、下記文献２３）　、２４）記載
のｔ−ＰＡ類似体は、実施例５て後述するように、フィ
ブリン塩を溶解する活性か極めて低いことが、本発明と
同時になされた研究結果から判明した。

２２）ンエー、ノー、モンケ　エトアル０．ンエーヒー
、シー　２６４　＋０９２２−１０９２５　（＋９８９
’）　　（Ｊ、Ｃ，Ｍｏｎｇｅｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂ
、Ｃ，２６４１０９２２−１０９２５（１９８！Ｉ））
２３）イー、エル、マシソン　エトアル１．ネイチャー
３３９７２１−７２４　（１９８！Ｊ）（Ｅ、Ｌ、Ｍａ
ｄｉｓｏｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｎａｔｕｒｅ　　
３３９　７２１−７２４　　（１２４）イー　エル　マ
シノン　エトアル９．プロツン、ナショル、アカト　サ
イ、ニーニスニー　８７（Ｅ、Ｌ、Ｍａｄｉｓｏｎ　ｅ
ｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、　ＵＳＡ８７３５３０−３５３３　（＋９９０’））
〔発明か解決しようとする課題〕 本発明は、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子による
阻害に対して抵抗性を有し、天然の１−ＰＡと同レベル
またはそれ以上の生物活性を保持しているｔ−ＰＡの新
規類似体を提供しようとするものである。本明細書に記
載のｔ−ＰＡ類似体は、ＦＡＩ−１による阻害を受けに
くいので、天然型ｔ−ＰＡと比較して生体内で不活化さ
れにくいことか予想され得る。従って、天然型ｔ−ＰＡ
に比較して低い投与量又は全量ホーラス投与の可能性か
大てあり、治療用血栓溶解剤として天然のｔ−ＰＡに比
較して著しい利点を提供し得るものである。また、治療
用血栓溶解剤として投与した後の再閉塞を防止する可能
性か高いｔ−ＰＡ類似体を提供する。

〔課題を解決するだめの手段〕

本発明者らは、ｔ−ＰＡのアミノ酸配列中、天然のｔ−
ＰＡの２７６位から３０６位に相当する部分のアミノ酸
配列をＵＫ由来のアミノ酸配列の一部で置換することに
より、驚くべきことにプラスミノーゲン活性化因子阻害
因子による阻害に対して抵抗性を有し、かつ天然のｔ−
ＰＡと同しヘルまたはそれ以上の生物活性を保持してい
る生物活性を保持しているｔ−ＰＡの新規類似体か得ら
れることを見出した。

具体的には、特に好ましい態様として、ｔ−ＰＡのアミ
ノ酸配列の前記置換部分か、ＵＫ由来のアミノ酸配列Ｉ
ｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈ
ｒ−Ｔｈｒｌ　１ｅ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ａｓｎ−Ｇ　Ｉｎ−
Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａ　１ａ−Ａ　ｌａ−Ｉｌｅ
−ＴｙｒＡ　ｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉ　ｓ−Ａｒｇ−Ｇ　１
ｙ−Ｇ　ｌ　ｙ−３ｅ　ｒ−Ｖａ　ｌ　−Ｔｈｒ−Ｔｙ
　ｒ−Ｖａ　１て置換されているｔ−ＰＡ類似体か挙げ
られる。

本発明のｔ−ＰＡ類似体の調製は、例えば１−ＰＡの前
記置換領域をアミノ酸残基をＵＫ由来のアミノ酸配列か
らなるペプチドと置換することによって行うことかでき
る。この置換は、例えは、ＵＫの一部のアミノ酸配列を
コードする遺伝子あるいはｃＤＮＡあるいは合成オリゴ
ヌクレオチドを用いて、ｔ−ＰＡの当該領域のアミノ酸
配列をコードするｃＤＮＡと置換させ、適当なプラスミ
ド又は発現ベクターと連結させ宿主内て発現させればよ
い。目的の部位に置換を育するｔ−ＰＡ類似体をコード
するｃＤＮＡは、適当なプラスミド又は発現ベクターと
連結させ宿主内で増幅させる等、本発明の最終目的物質
の発現及び生産のために利用される。この際使用する発
現ベクターの例として、ＣＤ　Ｍ　８　（ｏｒｉ−’）
を挙げることかできる。

また、宿主としては細菌等の原核性生物及び哺乳動物細
胞、酵母等の真核性生物のいずれも用いることかでき、
例えば動物細胞の宿主としてはＣＯ３−１細胞等が使用
され得る。

このようにして得られたｔ−ＰＡ類似体は、プラスミノ
ーゲン活性化因子阻害因子による阻害に対して抵抗性を
有するので、血栓溶解剤として生体内に投与された場合
、天然型ｔ−ＰＡに比較して低投与量で効果を発揮する
医薬組成物の有効成分とすることかできる。

なお、ｔ−ＰＡに関する文献は多数発表されており、例
えばポウズメラノーマ（Ｂｏｗｅｓ　ｍｅｌａｎｏｍａ
）細胞から分離されたｔ−ＰＡの記載（前記文献１）の
他、下記文献２５）〜４７）等に記載されている。

２５）欧州特許出願公開　覧００９３６１９　Ａｌ２６
）ペニカ　エトアル６．ネイチャー３０１　２１４−２
（Ｐｅｎｎｉｃａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　　
３０１　２１４−２２１　（＋９８２７）ニー　ンエー
　ブイ　ゾンネへルト　エトアル１．プロツノ、ナンヨ
ル　アカト　サイ、ニーニスニー　８３４６７０−４６
７４　（１９８６）（Ａ、Ｊ、Ｖ、Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ
　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８３４６７０−４６７４　（１９
８６））２８）ケー　ピー　ツユ　エトアル４．スロン
ホノス　リサーチ　５０３３−４１　（１９８８）（Ｋ
、Ｐ、Ｆｕ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　５０３２９）エル　ンー、ピータ
ーソン　エトアル１．バイオキム　バイオフィシ、アク
タ９５２（Ｌ、Ｃ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、
　Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ３０）ソ
ー。アール、ラーセン　エトアル１．ジエバイオル、ケ
ミストリー２６３１０２３−１０２９　（１９（Ｇ、Ｒ
，Ｌａｒｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６３１３１）エヌ　ケー、カリャ
ン　エトアル９．シェーバイオル、ケミストリー２６３
３９７１−３９７８　（＋９８８）（Ｎ、に、Ｋａｌｙ
ａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　２６３３９７３２）国際公開　Ｎ［ｌ　８７０３
９０６３３）欧州特許出願公開　Ｎｉ１２３３０１３３
４）特開昭６１−２３３６３０号公報３５）特開昭６２
−２２４号公報 ３６）特開昭６２−４８３７８号公報 ３７）特開昭６２−１３０６９０号公報３８）特開昭６
２−１９２３２３号公報３９）特開昭６２−１９８６２
３号公報４０）特開昭６２−２６９６８８号公報４１）
特開昭６２−２７２９７６号公報４２）特開昭６２−２
８２５８２号公報４３）特開昭６３−１３３９８８号公
報４４）特開昭６３−２３００８３号公報４５）特開昭
６３−２３００８４号公報４６）特開昭６４−８５０７
８号公報 ４７）特開昭６４−８５０７９号公報 ここで、本発明を説明するにあたって、本明細嘗て用い
られるいくつかの用語について、以下に定義っけを行う
。

天然型ｔ−ＰＡ　　本発明において、天然の１−ＰＡの
２７６位から３０６位に相当する部分のアミノ酸配列か
天然ｔ−ＰＡのそれを育するｔ−ｐＡをさす。

ｃＤＮＡ　：　ｍＲＮＡ鋳型内の配列を元に酵素的に合
成されたＤＮＡ分子又はＤＮＡ配列、あるいはかかる分
子のクローン。

ＤＮＡ組み換え体、自然界に存在しない形で組み合わさ
れ並列させれたＤＮＡ配列を含むよう人為的に変更され
た、ＤＮＡ分子またはかかる分子のクローン。

プラスミド又はベクター−細胞内に存在し、あるいは宿
主細胞内導入されたとき、自律的にあるいは宿主ゲノム
内に組み込まれた形で複製し得るための遺伝情報を含む
ＤＮＡ分子。特に「発現ベクター」は宿主細胞内で発現
されるへき遺伝子の発現を容易にするだめのプロモータ
ー、転写開始配列および転写終結配列等の配列を含んで
いる。

生物活性　インビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）およびインヒド
ロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）において１分子あるいは会合分
子により行われる生物学的機能。蛋白質の生物活性は、
触媒活性の他、エフェクター活性をも包含する。

例えばｔ−ＰＡの場合、エフェクター活性とは、フィブ
リンとの結合による触媒活性（比活性）の上昇をもたら
す性質を指す。

次に本発明のｔ−ＰＡ類似体の生産方法について説明す
る。

先ず本発明のｔ−ＰＡ類似体を生産するために必要なｔ
−ＰＡをコードするｃＤＮＡは、前記文献２５）　、２
６）　、３２）　、３３）　、３４）　、３６）　、３
７）、３８）　、４０）　Ｖ４１）　、４３）　、４４
）　、に記載の手法を用いて取得することか出来る。該
ｃＤＮＡは他のプラスミドあるいは発現ベクターと連結
することにより、ｔ−ＰＡ発現に必要なｃＤＮＡ領域を
カセットとして容易に出し入れてきるようなプラスミド
あるいはｔ−ＰＡを発現可能なプラスミドを構築して利
用することかてきる。前述のプラスミドは、該ｃＤＮＡ
の発現プラスミド構築用とする他、ｍＲＮＡの取得源と
しても利用出来る。例えばＴ７プロモーターを有するｐ
ＴＺベクターにｔ−ＰＡｃＤＮＡ配列を前述の様なカセ
ットとして出し入れてきる形て組み込んたプラスミドを
用意し、さらにこのプラスミドを用い、該プロモーター
よりｍＲＮＡをインビトロで合成し、それをアフリカッ
メガエル卵母細胞内に注入し蛋白質を合成させることも
可能である。ｐＴＺＢ−０００はその様にして得られた
プラスミドの一例であり、その構築方法は下記文献４８
）に記載されている。

４８）特願平２−８７００５号 本発明のｔ−ＰＡ類似体をコードするｃ　ＤＮＡの調製
のためには、シラー及びスミス（Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍ
ｉ　ｔｈ）等による部位特異的突然変異誘発（Ｓｉｔｅ
ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）が育効に
利用される（下記文献４９）参照）。即ち、ｔ−ＰＡの
アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡをＭ１３系のファー
シベクターに組み込み、その結果、得られる二本鎖形Ｎ
４１３Ｄ　Ｎ　Ａて形質転換した大腸菌の培養液から一
本鎖形Ｍ　１３Ｄ　Ｎ　Ａを調製し、これに変異誘発用
の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてアニリン
グ後相補鎖合成反応を行い変異を誘発させればよい。こ
のような、部位特異的突然変異誘発（Ｓ＋ｔｅ−ｄｉｒ
ｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ’）システムとし
て、例えば、宝酒造■のＭｕｔａｎ”−Ｇシステムを用
いて行うことかできる。

４９）エム、シュー。シラー　エトアル１．メソノズ　
イン　エンサイモロジー１００４６８（＋９８３）（Ｍ
、Ｊ、Ｚｏｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙｌｏｏ　４６８　（１９８
３）） 合成オリゴヌクレオチドのホスホアミダイト法による合
成は、下記文献５０’）に示される原理によるアブライ
トバイオシステムズ社のモデル３８１ＡＤＮＡノンセサ
イサーを用いて行うことができる。

５０）ニス　エル、ビューケージ　エトアル３．テトラ
ヘドロン　　レタージー２２（２０）１８５９（１９８
１）（Ｓ、Ｌ、Ｂｅａｕｃａｇｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｅ
ｔｒａｈ、ｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ２２（２０）１
８５９　（１９８１’））ｔ−ＰＡ類似体をコードする
ｃＤＮＡを含む二本鎖形Ｍ１３ＤＮＡからｃＤＮＡ部分
を切り出しプラスミド或いは発現ベクターと連結するの
は、下記文献５１）に従って行うことかできる。またそ
の様にして得られる発現プラスミドを用い適当な宿主を
形質転換するには、下記文献５２）に示される電気パル
ス法を用いることかできる。

５１）ティー、マニアティス　エトアル６．モレキュラ
ークローニング、ア　ラホラトリー　マニュアル、コー
ルドプリング　バーバーラボラトリ−（Ｔ、Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒ−ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、
Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ５２）高山慎一部、細胞工学６７７１　（１９
８７）例えば、ＵＫハイブリッド型ｔ−ＰＡｃＤＮＡを
含む発現プラスミドｐＣＤＭ８〜Ｃ５ＴＵを用い電気パ
ルス法によりＣＯ５−１細胞を形質転換することができ
る。形質転換された細胞の培養上清は、適当な希釈によ
りそのままｔ−ＰＡの活性測定に使用され得る程度のｔ
−ＰＡを含んている。

生産のための各過程で用いられる各種へフタ−ＤＮＡ　
（あるいはプラスミドＤＮＡ）及びそれらの宿主となる
大腸菌株や動物細胞株の入手は特に記載のない限り既に
広く普及しており入手は容易であり、例えばベクターＤ
ＮＡ及び大腸菌は宝酒造■又は東洋紡績■より、又動物
細胞株は大日本製薬■より容易に入手可能である。

本明細嘗て示す発現ベクターＣＤ　Ｍ　８　（ｏｒビ）
は原核性および真核性生物の宿主細胞内で用いることの
できるシャトルベクターである。このベクターの使用に
適した宿主原核性生物としては、大腸菌ＭＣ１０６１／
ｐ３をはじめとした宿主細胞内にサプレッサー（ｓｕｐ
Ｆ）で復帰される様なアンバー変異を含むマーカー遺伝
子を存する微生物株が育効である。また真核性の宿主細
胞として有用なものにはＣＯ５−１，ＣＯ５−７，Ｃ０
ＰＳ、　ＷＯＰおよびチャイニーズ・ハムスター・卵巣
（ＣＨＯ）セルライン等の動物培養細胞株か含まれる。

この様にして得られた本発明のｔ−ＰＡ類似体は、常法
により容器に必要量分注し、凍結乾燥を行うことにより
製剤として極めて容易に得ることかできる。この凍結乾
燥品は、製剤学的に容認されるキャリアー物質、例えば
生理食塩水に溶解し、静脈内又は動脈又は心臓内への注
射によって投与される。投与方法は、持続静注あるいは
投与予定量の一部を最初に静注し残りを持続静注する等
の方法で行われる。

本発明の一例として以下に実施例を示すか、本発明はこ
れに限定されるものではない。

〔実施例〕

ｔ−ＰＡのｃＤＮＡはＢｏｗｅｓ　ｍｅｌａｎｏｍａ細
胞より取得された。該ｃＤＮＡをプラスミドｐＴＺＢ　
＜後述）に組み込むことによりプラスミドｐＴＺＢ−０
００を得た。

プラスミドｐＴＺＢは市販プラスミドｐＴＺＩ８Ｒ（東
洋紡■社製）のＢａｍ旧以外のマルチクローニングサイ
ト部分を全て除去した形のプラスミドてあり、プラスミ
ドｐＴＺＢ−０００はｐＴＺＢのＢａｍＨ［サイトにｔ
−ＰＡ翻訳領域を完全に含むＢａｍＨ［フラグメント（
ＢａｍＨ［カセット）を挿入した形で得られたく第１図
、前記文献４８）参照）。

プラスミドＩ）ＨＳＧ３９８　（宝酒造■社製）はクロ
ラムフェニコール耐性遺伝子をマーカーとしてもつ市販
プラスミドて（第２−Ａ図）、プラスミドｐＨ５ＧＢは
このｐＨ５Ｇ３９８のマルチクローニングサイト部分を
合成りＮＡリンカ−（第２−Ｂ図）で置き換えＥｃｏＲ
［、Ｓａｃ［等の制限酵素サイトを除去した形のプラス
ミドである。　ｐｉ（ＳＧＢのＢａｍＨＩサイトにｐＴ
ＺＢ−０００から得たＢａｍ旧カ上カセツト入すること
によりｐＨ３Ｇ−０００を構築した（第３図）。

合成りＮＡリンカ−は以下のようにして作製した。まず
、第２Ｂ図に示した配列ａのオリゴヌクレオチドを合成
した。合成にはアブライトハイオシステムズ（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製３８１Ａ型ＤＮＡ
合成装置を用い、その精製は同社のＯＰＣカートリッツ
を用いて行った。この合成オリゴヌクレオチドをアニー
ルさせ２本鎖としく第２−Ｂ図、配列ｂ）、これをＦｏ
ｋｌ及びＨｉｎｄＩ［Ｉて消化し、合成りＮＡリンカ−
（第２Ｂ図、配列Ｃ）をポリアクリルアミドゲルから標
準的手法により単離精製した。この合成りＮＡリンカ−
とｐＨ３Ｇ３９８をＨｉｎｄＩ［及びＥｃｏＲＩて消化
し５′末端を脱リン酸化したものとをライケートさせ、
これて大腸菌８８１０１株を形質転換して、プラスミド
ｐＨ５ＧＢを得た。

このｐＨ３ＧＢをＢａｍＨｌて消化し５゛末端を脱リン
酸化したものと、ｐＴＺＢ〜０００をＢａｍＨで消化し
ポリアクリルアミドケルから単離して得たフラグメント
（Ｂａｍ旧カ上カセツトをライゲートさせ、大腸菌８８
１０１株（宝酒造■社製）を形質転換して、プラスミド
　ｐＨ３ＧＢ−０００を得た。

２、ＵＫ配列挿入のためのプラスミドｐＨ３ＧＢ−００
ＯＮＡの組み立て ｔ−ＰＡ配列の一部をＵＫ配列に置換するために、ｐＨ
３ＧＢ−０００のｔ−ＰＡ翻訳領域内にＮ５ｐＶ及びＡ
ｃｃ　［認識配列を含むｐＨ５ＧＢ−００ＯＮＡを作製
した。合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的突然
変異誘発の手法を用いた。その組み立て模式図を第４図
に示した。

部位特異的突然変異誘発のための鋳型として一本鎖形Ｍ
　１３ｔｖ１９ＥＥを前記文献４８）に記載された方法
に従って得た。このＭ　１３ｔｖ１９ＥＥは天然のｔ−
ＰＡのアミノ酸２０５から３６２番目に対するコドンを
含んでいる。

Ｍ　１３ｍｐ　１９ＥＥＮＡは一本鎖形Ｍ１３ｔｖ１９
ＥＥを鋳型として、第５図に示した合成オリゴヌクレオ
チドＰ−ＮｓｐＶ及びＰ−Ａｃｃ　［とアニールさせ、
既述のＭｕｔａｎＴＭ−Ｇソステムを用いて得られた。

これらの合成オリゴヌクレオチドは先に記載した方法と
同様の方法により合成・精製して得た。

このＭ　１３ｍｐ１９ＥＥＮＡをＥｃｏＲ［て消化して
生ずる４７２塩基対フラグメント（フラグメントεＥＮ
Ａ）をポリアクリルアミドゲルより標準的手法により単
離した。このフラグメントＥＥＮＡとＩ）ＨＳＧＢ−０
００をＥｃ。

Ｒ１て消化し５末端を脱リン酸化したものとをライゲー
トさせ、大腸菌８８１０１株を形質転換してｐＨ３ＧＢ
−００ＯＮＡを得た。

ＵＫの部分配列を含むオリゴヌクレオチドを合成した。

その配列は第６図に示す。これらの４種の合成オリゴヌ
クレオチドをアニールさせ、これとｐＨ３ＧＢ−００Ｏ
ＮＡをＮ５ｐＶ及びＡｃｃ　Ｉて消化し５゛末端を脱リ
ン酸化したものとをライゲートさせた。これて大腸菌８
８１０１株を形質転換させ、ＵＫハイブリット型ｔ−Ｐ
Ａを含むプラスミドｐＨ８ＧＢ−Ｃ３ＴＵ　（第７図）
を得た。

ＣＤＭＳ−０００は天然Ｗｔ−ＰＡを発現させるための
プラスミドて前記文献４８）記載の方法を用いて得た。

ｐＣＤＭＳ−０００をＢｇｌＩＩ及びＢａ１ｌて消化後
５゛末端を脱リン酸化したものと、既述のプラスミドｐ
Ｈ３ＧＢ−Ｃ３ＴＵをＢｇｌｎ及びＢａ１ｌて消化した
ものとをライゲートさせた。これて大腸菌ＭＣ１０６１
／ｐ３　（フナコン薬品■社製）を形質転換させ、目的
とするＵＫハイブリット型ｔ−ＰＡを発現させるための
ブラスミ）”　ｐＣＤＭＳ−ＣＳＴＵを得た。

本発明のｔ−ＰＡ類似体と比較するために、前記文献２
３）で記載されているｔ−ＰＡ類似体（Ｒ３０４Ｅ型ｔ
−ＰＡ　　天然のｔ−ＰＡのＮ末から３０４番目のアミ
ノ酸であるアルギニン（Ａｒｇ　）をグルタミン酸（Ｇ
ｌｕ　）に置換したもので、ＦＡＩ−１抵抗性を示すこ
とか該文献に記載）を作成するために、これを発現させ
るプラスミドｐＣＤＭ８−Ｒ３０４Ｅを構築した。部位
特異的突然変異誘発の手法を用いて、第９図に示した手
順に従って構築した。

Ｍ１３ｔｖ１９ＥＥを鋳型として、第５図に示した合成
オリゴヌクレオチドＰ−ＲＥをアニールさせ、既述のＭ
ｕｔａｎＴＭ−Ｇシステムを用いてＭ１３ｍｐ１９ＥＥ
（Ｒ３０４Ｅ）を得た。これらの合成オリゴヌクレオチ
ドは先に記載した方法と同様の方法により合成・精製し
て得た。

Ｍ１３ｍｐ１９ＥＥ（Ｒ３０４Ｅ）をＥｃｏＲ［消化し
て生ずる４７２塩基対フラグメント（フラグメントＥＥ
（Ｒ３０４Ｅ））をポリアクリルアミドゲルより標準的
手法により単離した。このフラグメントＥＥ（Ｒ３０４
Ｅ乃とｐＣＤＭＳ−０００をＥｃｏＲ［て消化し５′末
端を脱リン酸化したものとをライゲートさせ、大腸菌Ｍ
Ｃ１０６１／ｐ３株を形質転換してｐＣＤＭ８〜Ｒ３０
４Ｅを得た。

プラスミド　ｐＣＤＭＳ−０００、ｐｃＤＭ８−ＣＳＴ
Ｕ及びｐＣＤＭ８Ｒ３０４Ｅを用い、ＣＯ３−１細胞を
形質転換させた。例えは、高山ら前記文献５１）のエレ
クトロポレーンヨレ法ヲ用イ、　ｐＣＤＭＳ−０００，
ｐＣＤＭＳ−Ｃ３Ｔｔｌ及ｖ　ｐＣＤＭＳ−Ｒ３０４Ｅ
によりＣＯ３−１細胞を形質転換させることかできる。

すへての場合において、上記の様にして形質転換された
細胞の培養液中には以後の研究に必要な量のｔ−ＰＡか
分泌されていた。

５、測定（アッセイ）法 ＵＫハイブリット型ｔ−ＰＡ　（Ｃ３ＴＵ）　、Ｒ３０
４Ｅ壓ｔ−ＰＡ　（Ｒ３０４Ｅ）及びｔ−ＰＡ（天然の
配列を有するｔ−ＰＡ）は、前記の様に、それらをコー
ドするｃＤＮＡを含む発現プラスミドにより形質転換さ
れた細胞の培養液中に分泌される。活性及びＦＡＩ−１
抵抗性の測定にはこの様なｔ−ＰＡ類を含む培養液の遠
心分離後の上清か用いられた。

１）ｔ−ＰＡのプラスミノーゲン活性化活性ｔ−ＰＡの
プラスミノーゲン活性化活性は下記文献５２）に示され
る方法に準したフィブリン−オーバーレイアッセイによ
り確認され、さらに下記文献５３）に示される方法に基
づきプラスミンに特異的なカヒ（Ｋａｂｉ’）社製の合
成トリペプチド色素原基質Ｓ−２２５１（Ｈ−Ｄ−Ｖａ
ｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ　・２ＨＣ１−Ｒ２０）を
用いて定量的に測定された。

５２）ンエー、エイチ、ケンテン　エトアル０．ディー
エヌエ−５２５７（１９８６） （Ｊ、　Ｈ，にｅｎｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、ＤＮＡ５２
５７　（１９８６）５３）ソニー　エイチ、ベルへイシ
エン　エトアル０．トロンホ、ヘモスト、　４８２６６
（１９８２）（Ｊ、Ｈ，Ｖｏｎｈｅｉｊｅｎ　ｅｔ　ａ
ｌ、、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔ、　４８２Ｓ−２
２５１を用いた測定は希釈した試料２０μｌを反応混合
液〔プラスミノーゲン１１．６ｕ　ｇ／ｍｌ　Ｓ−２２
５１０、１９ｍｇ／ｍｌ、及びフィブリンフラグメント
６ｍｇ／ｍ１（０，０８８％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０
含有０．１３ｍＭ　トリスｐＨ７，８溶液））　２００
μｌと混合し、３７°Ｃてインキュベートし、一定時間
後に４０５１ｍにおける吸収を測定した。

ｔ−ＰＡ活性は活性が既知のｔ−ＰＡ（デュテブラーセ
：住友製薬株式会社）を同様の方法で測定し、濃度に対
する吸収度値をプロットした検量線を作成し、その検量
線を参照して決定された。

培養上清中の各ｔ−ＰＡ濃度は酵素免疫測定法（ＥＬ　
ｌ５Ａ）により測定され、上記活性測定の結果と合わせ
て一定蛋白質量当たりの活性（比活性）か決定された（
表１）。

その結果、Ｃ３ＴＵは表１に示す様な活性（比活性）を
保持していたか、Ｒ３０４Ｅ（前記文献２３）参照）は
比活性はｔ−ＰＡに比へて非常に低値てあった。

２）ＦＡＩ−１抵抗性の測定 ＦＡＩ−１抵抗性は前記文献２３）に示される方法に準
して測定された。即ち、一定蛋白質量（ｌ、４ｏｇ／２
５μｌ）のｔ−ＰＡ試料とＯ〜６０ｆｍｏｌｅｓ／　ｌ
θμｌのＰＡＩ−１を室温で２０分間反応させ、そのう
ち２０μｌを既述のＳ−２２５１反応混合液２００μｌ
と混合し、３７°Ｃでインキュベートし、一定時間後に
４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。ＦＡＩ−１１１
！度に対する吸光度値を、各ｔ−ＰＡのＦＡＩ−１無添
加時の４０５ｎｍにおける吸光度値を１００％とした時
の割合でプロットした（第１０図）。５０％阻害に要す
るＦＡＩ−１濃度（＋Ｄｓｏ）を表２に示した。尚、Ｒ
３０４Ｅは比活性か低値のため、ＦＡＩ−１無添加時の
４０５ｎｍにおける吸光度値か低く、プロ、。

１−　Ｌなかった。

表１ 比活性（ｌＪｎｉｔ／’ｎｇ） Ｒ３０４Ｅ ０゜ 表２ ■　Ｄ　５ｏ（口Ｍ） ０内はｔ−ＰＡの値を１とした時の割合〔以下余白〕

【図面の簡単な説明】

第１図は、ブラスミｌ”　ｐＴＺＢ−０００の制限酵素
切断地図を表す模式図である。 第２　　Ａ図は、ブラスミ）”　ｐ　Ｈ３ＧＢの組立模
式図および制限酵素認識部位を示している。 ！Ｅ２−Ｂ図は、プラスミドｐ　Ｈ３ＧＢ作成のための
合成オリゴヌクレオチドの配列と、合成りＮＡリンカ−
の組立模式図である。 第３図は、プラスミド１）　Ｈ５ＧＢ−０００の組立模
式図である。 第４図は、プラスミドｐ　Ｈ３ＧＢ−００ＯＮＡの組立
模式第５図は、部位特異的突然変異誘発に用いた合成オ
リゴヌクレオチドの配列である。 第６図は、ＵＫの部分配列を含む合成オリゴヌクレオチ
ドの配列である。 第７図は、プラスミドｐ　Ｈ３ＧＢ−Ｃ３ＴＩｊの組立
模式第８図は、プラスミドｐ　ＣＤＭ８−Ｃ３ＴＵの組
立模式図である。 第９図は、 プラスミ ドｐ　ＣＤＭ８−Ｒ３０４Ｅの組立模式ＢａｍＨＩ　Ｂ
ｇ” 第 図 第 図 Ｅｃｏ　Ｒ１ 第 図 Ｂａｒｎ）（＋ 第 図 第 図 第 図

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）ｔ−ＰＡのアミノ酸配列中、天然のｔ−ｐＡの２
   ７６位から３０６位に相当する部分のアミノ酸配列が尿
   プラスミノーゲン活性化因子由来のアミノ酸配列の一部
   で置換された、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子に
   よる阻害に対して抵抗性を有することを特徴とするｔ−
   ＰＡ類似体。
2. （２）尿プラスミノーゲン活性化因子由来のアミノ酸配
   列の一部がＩｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−
   Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇ
   ｌｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌ
   ｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
   −Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｌま
   たはその部分配列である請求項（１）記載のｔ−ＰＡ類
   似体。
3. （３）プラスミノーゲン活性化因子阻害因子がＰＡＩ−
   １である請求項（１）記載のｔ−ＰＡ類似体。
4. （４）形質転換された細菌、酵母または哺乳動物細胞中
   において、請求項（１）、（２）または（３）記載のｔ
   −ＰＡ類似体をコードしているＤＮＡを発現させ得る組
   み換え発現ベクター。
5. （５）請求項（４）記載の組み換え発現ベクターで形質
   転換された細菌、酵母または哺乳動物細胞。
6. （６）請求項（１）、（２）または（３）記載のｔ−Ｐ
   Ａ類似体を有効成分として含有することを特徴とする血
   栓症治療剤。