JP2942578B2 - 新しい結合特性を有する超酸化物不均化酵素類縁体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 説 明 技術分野 本発明は、タンパク質化学、遺伝子工学および薬学の
分野に関する。より詳しくは、本発明は、超酸化物不均
化酵素（スーパーオキサイド・ディスムターゼ）（SO
D）類縁体を、超酸化物不均化酵素治療が要求される部
位に局在させ得るような、および／またはその体内での
寿命を延ばし得るような結合特性を有するように修飾さ
れた、超酸化物不均化酵素類縁体に関する。

背景技術 SODは、超酸化物イオンの破壊を触媒する一群の酵素
である。SODは、鉄、またはマンガン、銅、および亜鉛
であり得る、各金属イオンによってそれぞれ特徴づけら
れる金属タンパク質である。超酸化物イオンの破壊を触
媒するSODの能力は、再潅流による傷害を減少させた
り、炎症を治療するような様々な治療的状況において有
用となり得る。ヒトCu/Zn SODのアミノ酸配列は、Jabus
chら、Biochemistry（1980） 19:2310−2316に開示され
ている。ヒトCu/Zn SODのクローニングおよび配列決定
ならびにヒトCu/Zn SODの細菌および酵母における生産
は、EPA84111416.8（第0138111号として1985年４月24日
に公開された）において開示されている。ヒトCu/Zn SO
Dは、通常、疎水的相互作用によって結合した２つの鎖
からなるホモダイマーである。このホモダイマーは、約
32kdの分子量を有する。

ヒトMn SODの一次構造は、Barraら、J.B.C.（1984）2
59:12595−12601によって開示されている。ヒトMn SOD
のクローニングおよび配列決定、および、ヒトMn SODの
組換えによる生産は、ベルギー特許第905,796号に開示
されている。

SODの治療における可能性を達成するためには、
（１）SODは作用する標的組織へ接近しなければならな
い、（２）SODが移行する間に、および作用部位におい
て、SODの分子はそのままの状態で保持されなければな
らない、（３）血液循環からあまり迅速には除去されて
しまってはならない。先行技術におけるSODの修飾は、
上記の必要条件のうち、後者の２つのみに重点を置いて
いた。例えば、共同所有のEPA 8830224は、共有結合に
より結合されたSODダイマーから構成されるSOD重合体を
開示している。そのSODは、天然型のSODほど迅速には血
液循環から除去されない。Res.Commun.in Chem.path.＆
Pharmacol.（1980）29:113−120およびProc.Nat'l Aca
d. Sci. USA（1980）77:1159−1163は、野生型SODに比
べて血液循環における半減期が増大した、SODとポリエ
チレングリコールのような高分子との複合体を開示して
いる。J.Clin.Invect.（1984）73:87−95は,SODをタン
パク質分解からまもるために、および、その血中除去時
間を延長するためにリポソームに包まれたSODを開示し
ている。

他方、本発明は、作用する標的組織へより容易に接近
し得るように、および／または、その体内寿命が延びる
ようにSODを修飾することを第一義的な目的としてい
る。これは、超酸化物不均化酵素治療が望まれる部位に
存在する一部分へ、または、その部位そのものへ結合す
る非相同的ペプチド・ドメインを含むように、SODのア
ミノ酸配列を修飾することにより達成される。このよう
なドメインは、以下時々本文中では、「接着性ペプチド
シグナル」と呼ばれる。

先行発明者は、SOD治療が望まれ得る部位に共通して
存在する細胞または顆粒または分子に結合する種々のタ
ンパク質の接着性ペプチドシグナルを同定している。フ
ィブリノーゲン、フィブロネクチンおよびフォンヴィレ
ブランド因子に対するシグナルは、Nature（1984）309:
31−33;Proc.Nat'l Acad.Sci.USA（1984）81:4935−493
9;Cell（1987）48:867−873に開示されている。ラミニ
ンに対するシグナルは、Science（1987）に、細胞外超
酸化物不均化酵素（EC−SOD）に対するシグナルはPNAS
（1987）84:6340に、血小板由来成長因子（PDGF）に対
するシグナルはNature（1986）320:695に、組織プラス
ミノーゲンアクテベーター（tPA）に対するシグナル
は、“Thrombosisand Haemosasis Volume 58,Abstract
s"第11回国際会議、ブリュッセル、ベルギー、1987年７
月の要旨1141,1144,1043および1587に、および、走化性
因子に対するシグナルは、PNAS（1987）84:9233に開示
されている。アンチトロンビンIIIに対するシグナル
は、前掲書の要旨543−545、および、J.Biol.Chem.（19
87）262:8061,11964.17356にそれぞれ開示されている。
抗血小板 GP II b/III aレセプター抗体および抗内皮
細胞GP II b/III aレセプター抗体については、上記の
“Thrombosis and Haemostasis,Volume 58,Abstracts"
の要旨15,715,901および908に考察されている。ビトロ
ネクチンに対するシグナルは同書の要旨15−17および56
4に、ウロキナーゼに対するシグナルは同書の要旨1140
に、トロンビンインヒビターに対するシグナルは同書の
要旨649に開示されている。走化性インヒビターに対す
るシグナルはScience（1979）203:461に、走化性アゴニ
ストに対するシグナルはPNAS（1987）84:7964に開示さ
れている。血小板因子−４に対するシグナルはBlood（1
978）53:604およびBiochem.J.（1980）191:769に、ガン
マI P10に対するシグナルはNature（1985）315:672に開
示されている。

これらの接着性ドメインあるいはシグナルのいずれか
を他のポリペプチド中へ挿入し、これに結合活性を付与
するというような試みはいまだ知られていない。

発明の開示 本発明の一側面は不均化活性を有するSOD類縁体であ
り、そのアミノ酸配列は、SOD治療が要求される身体上
の部位に局在する部分に結合する能力をその類縁体に付
与する非相同性ペプチドドメインを含むものである。

かかるSOD類縁体をコードするDNA配列、かかるDNA配
列を含む発現ベクター、かかるベクターによりトランス
フォームされた細胞および、かかるトランスフォームさ
れた細胞を生育させることにより本類縁体をつくるため
の工程は本発明のもう一つ別の側面である。

本発明のさらに別の側面は、本類縁体を含む薬剤組
成、および本類縁体を用いる治療方法である。

図の簡単な説明 図において、 第１図は、部分的に合成されたヒトCu/Zn SOD cDNAの
ヌクレオチド配列およびこれに基づくヒトCu/Zn SODの
アミノ酸配列である。

第２図は、ヒトCu/Zn SODの３次構造の模式図であ
る。

第３図は、酵母の発現ベクターpYSOD−AS−Ｔ−２を
構築するための図式を示す作業工程図である。

第４図は、pYSOD−AS−Ｔ−２の構築において用いら
れた挿入部分のDNA配列を示す。

第５図は、酵母の発現ベクターpYSOD−AS−Ｔ−８を
構築するための図式を示す作業工程図である。

第６図は、pYSOD−AS−Ｔ−８の構築において用いら
れた挿入部分のDNA配列を示す。

第７図は、酵母の発現ベクターpYSOD−Ｈ−Ｔ−８を
構築するための図式を示す作業工程図である。

第８図は、プラスミドpNco5AHSODmの地図である。

第９図は、pNcoAHSODmを構築するための図式を示す作
業工程図である。

第10図は、プラスミドpGAPXSSHSODmの地図である。

第11図は、pPGAPXSSHSODmを構築するための図式を示
す作業工程図である。

発明の実施態様 A.定 義 用語“SOD"は、天然型の細胞内超酸化物不均化酵素の
アミノ酸配列を有するポリペプチドおよびその断片、な
らびに類縁体、あるいは、本質的には相同なアミノ酸配
列であるが、１個あるいはそれ以上のアミノ酸において
置換、あるいは付加、ないしは欠損（本発明で目的とさ
れる以外のもの）に起因する変異体であり、しかも天然
型の超酸化物不均化酵素の酵素活性を保持するものを意
味する。この類縁体の例は、共同所有のEPA 883002941
に開示されている。EPA 88302244に開示されているよう
なSODの重合体は、この用語に包含されることを意味す
る。この用語は、また、種々の哺乳類のSODも包含す
る。ヒトSODは、人に対して用いることが好ましい。ヒ
トCu/Zn SODおよびヒトMn SODは、本発明に基づく修飾
に好ましいSOD種である。用語“本質的に相同な”は、
上述のように、アミノ酸配列において少なくとも約75
％、通常約85％の同一性を意味する。

“レプリコン”は、細胞内でポリヌクレオチド複製の
自律的な単位として挙動する、すなはち自身の制御のも
とに複製が可能なあらゆる遺伝的要素（たとえば、プラ
スミド、染色体、ウイルス）のことである。

“ベクター”は、別のポルヌクレオチド断片が接着し
たレプリコンのことであり、このことにより接着した断
片の複製および／または発現を引き起こす。

“発現ベクター”は、自律的複製あるいは自律的統合
を行なうベクターのことであり、適当な宿主においてSO
D類縁体DNAの転写および翻訳を指令する制御配列を含有
する。

“コード配列”は、転写され、または／およびポリペ
プチドへ翻訳されるポリヌクレオチドのことである。

“プロモーター配列”は、RNAポリメラーゼに結合し
得る、そしてコード配列に沿って（たとえば、３′方向
に）の転写を開始し得るDNA調節領域のことである。

コード配列は、細胞内で、コード配列の転写がRNAポ
リメラーゼの結合からプロモーター配列になるときプロ
モーター配列の“制御下に”ある。次に、mRNAに至る翻
訳はコード配列内へコードされたポリペプチドになる。

“操作的に結合された”は構成要素が通常の機能をは
たすように配列された並列状態を意味する。故に、コー
ド配列に操作的に結合された制御配列は、コード配列の
発現に影響し得る。

“制御配列”は、そのコード配列の転写および／また
は翻訳を制御する配列を意味する。これらは、プロモー
ター配列、転写開始および終止配列、ならびに翻訳開始
および終止配列を包含し得るが、これらに限定されるも
のではない。さらに、“制御配列”は、コード配列内に
コードされたポリペプチドの一連の作用を制御する配列
を意味するが、分泌、プロテアーゼ分解、およびポリペ
プチドのグリコシル化を制御する配列に限定されない。

“形質転換”は、宿主細胞に外部から加えたポリヌク
レオチドを挿入することである。その外部から加えたポ
リヌクレオチドはプラスミドとして保持され得るか、あ
るいは、選択的にその宿主染色体に結合され得る。

B.SOD類縁体の性質 本発明のSOD類縁体のアミノ酸配列は、アミノ酸置
換、欠損、付加またはこれらの組合せにより、１個ある
いはそれ以上の非相同性のペプチドドメインを含むよう
に変化を受けたSODのアミノ酸配列であり、この変化に
より、この類縁体はSOD治療が要求される身体部位（た
とえば、フィブリン性血栓が接着する内皮壁）に存在す
る部分に結合する能力を賦与される。これらの類縁体の
結合活性は、血液循環からの除去されやすさを低減す
る。従って、類縁体の体内での半減期は、典型的な天然
型SODより大きく、要求される部位における類縁体の濃
度は天然型SODに比較してより高いレベルに維持され
る。

類縁体がドメインを介して結合し得る部分はドメイン
の性質に依存し、たとえば、食細胞（phagocytes）（マ
クロファージ、好中球）のような細胞、フィブロブラス
トおよび内皮細胞、血小板のような非細胞性顆粒、ある
いはグリコサミノグリカン（ヘパリン）、フィブリンお
よびトロンビンのようなタンパク質性あるいは非タンパ
ク質性の分子を列挙できる。ある場合には、これらの部
分は、SOD治療が望まれる部位（たとえば、血小板、好
中球）に局在していたり、あるいは、このような部位に
局在する細胞（たとえば、内皮細胞）であったりする。

この変化の性質と局在化は、ドメインがこのような部
位と相互作用し、および結合することができるが、類縁
体の持つ超酸化物不均化酵素活性を消失させない類のも
のである。従って、このドメインは、天然型SODの３次
構造において露出している部位、たとえば、親水性ルー
プあるいはアミノ末端やカルボキシ末端の様な部位に位
置し、このドメインのサイズ、電荷、親水性／疎水性は
超酸化物不均化酵素活性を消失させるような形でこの分
子に変化（たとえば、３次構造の変化あるいは電荷分
布）を及ぼさないものである。このドメインは、結合活
性にとって必須の修飾とは別に無害の付加的なアミノ酸
修飾を含む。これらの付加的修飾はスペーサーとしての
機能を果たす、また一方ではこのドメインが部位へ接近
することを高めるのに、あるいは類縁体の酵素活性を維
持するのに役立つ。一般に、本発明により目的とされる
アミノ酸変化の個数は約40個を越えないし、普通、約30
個を越えず、好ましくは約20個を越えない。

代表的なドメインは、上記の技術背景の項に開示され
ている。加えて、結合性活性を賦与するに適当なドメイ
ンは、天然型SOD配列において特定の部位（たとえば、
親水性ループや、アミノあるいはカルボキシ末端）での
アミノ酸のランダムな変化を起こし、さらに、得られた
類縁体について酵素活性と結合活性をスクリーニングす
ることにより同定できる。好ましいドメインは、RGDXテ
トラペプチド（Nature（1984）309:30 および U.S.Pa
tent No.4,578,079），このRGDXテトラペプチドに続い
て位置するこのテトラペプチドのカルボキシおよび／ま
たはアミノ末端側に全体で15ないし20残基までを伴うペ
プチド、フィブリノーゲンのカルボキシ末端に見いださ
れたデカペプチドLGGAKQAGDV、および天然型フィブリノ
ーゲン配列に見いだされるデカペプチドに続いて位置す
る（カルボキシおよび／またはアミノ末端に）約10残基
までを伴うペプチドである。RGDXの“x"は、そのドメイ
ンの結合性を消失しないアミノ酸を示している。

技術背景の項で開示されているドメインをSODへ挿入
することにより、あるいは、SOD配列をランダムに変化
させることにより作成し得る多くの類縁体は酵素活性を
欠如しており、および／または望ましい結合活性を欠如
しており、それゆえに、本発明の範囲に入らないと言う
ことを認識すべきである。本発明の範囲に入る類縁体は
酵素活性および結合活性の日常的なスクリーニングによ
って同定され得る。酵素活性はピロガロールアッセイで
されるし、結合活性は（標的部位に依存するが）、技術
背景の項に開示されたドメインの同定に用いる種々の方
法（たとえば、PNAS（1981）78:2403−2406およびNatur
e（1984）309:3033）に従って測定できる。

類縁体のＮ末端は（天然型のヒトCu/Zn SODのよう
に）アセチル化され得るし、あるいは、その類縁体を生
産する生物体に依存してアセチル化を欠如し得る。細菌
で生産された類縁体はこのアセチル化を欠如している
が、PEA 0138111に開示されている方法を用いる酵母に
より生産された類縁体はアセチル化されている。動物細
胞でつくられる類縁体もまたアセチル化される。このよ
うなアセチル化された類縁体は好ましい。同様に、類縁
体は、生産される生物体や生産に伴うシグナル配列に依
存してグリコシル化や脱グリコシル化を受ける。

C.SOD類縁体の合成 ヒトCu/Zn SODの類縁体をコードする遺伝子は、第１
図に示されているDNA配列のオリゴヌクレオチド合成や
ライゲーション、部位特異的変異、および／または、望
ましいアミノ酸の修飾をコードする合成DNA断片を、ヒ
トCu/Zn SODをコードするDNA配列へ挿入することにより
作成される。Mn SODのような他のSODの類縁体をコード
する遺伝子は同様の方法で作成できる。部位特異的変異
技術は、よく知られた方法である。たとえば、SmithとG
illiam、Gilliam in Genetic Engineering Principles
and Methods,Plenum press（1981） 3:1−32;Zoller and Smith,Nucleic Acids Res,（198
2） 10:6487−6500;Brakeら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
（1984）81:4642−4646を参照せよ。遺伝子は、適当な
原核性あるいは真核性ベクターに挿入され得る、得られ
る発現ベクターは適当な宿主生物あるいは細胞に取り込
まれ、変異体の組かえ生物または細胞は、変異体遺伝子
の発現をもたらす条件で増殖する。この類縁体は、組か
え型ヒトCu/Zn SODを生産するために前述のEPA 0138111
に記載されたのと同様の技術を用いて、宿主から、ある
いは、もし分泌されるのであれば培養液から単離でき
る。そのEPAの開示をここで参照文献として挙げてお
く。酵素活性に要求される金属イオンは、イオンを添加
された培地中での組かえ型宿主の増殖により、あるいは
イオンを含む溶液に対して類縁体の溶液を透析すること
により賦与される。発現ベクターを作成するにおいて、
変異体の配列は、適当な制御DNA配列と共にベクターに
存在させられる。このDNA配列は、プロモーター、リポ
ソーム結合部位、および転写や翻訳の終止コードンであ
る。制御配列に対してコーデング配列の位置および配列
は、この制御配列の制御のもとで、コーデング配列が転
写される形のものである。制御配列に、宿主の増殖に対
してhSOD類縁体遺伝子の発現の調節を司る調節配列を加
えることが望ましい。

D.SOD類縁体の形成および用途 本発明のSOD類縁体はSODと同じ目的で用い得る。本類
縁体は、ヒトあるいは家畜の医療において種々の症状の
処置（たとえば、治療、軽減、予防）に用い得る。これ
らは、抗炎症剤、発ガンや腫瘍の進行を予防する化学予
防剤、抗ガン剤の細胞毒性および心臓毒性を低減あるい
は虚血性組織を保護する保護剤として有用である。SOD
を用いる医学的症状の治療は、“SOD治療”と呼ばれて
いる。天然型SODのように、その類縁体は、超酸化物ラ
ジカルを過酸化水素と分子状酸素とへの不均化を触媒
し、それ故に、虚血に伴う潅流傷害の低減、切開して取
り出された移植臓器の生存率の延長、臓器移植あるいは
脊髄虚血に伴う潅流傷害の低減、心筋梗塞の大きさの低
減、脊髄傷害の低減、および気管支・肺形成傷害の低減
に用い得る。

治療への応用において、類縁体は経口的または非経口
的に、錠剤、カプセルおよび注射剤のような種々の投与
形態で患者に投与される。インビトロでの組織の処理に
用いられるとき、類縁体は潅流液や培養液に加えられ
る。類縁体はまぜものなしのままで、あるいは薬学的に
受け入れられる固形、半固形あるいは液状の賦形剤、た
とえば、アルブミン、グロブリン、デキストラン、フィ
コール・ポリマー、糖、デンプンおよびルポソームと共
に有効量を混合して投与され得る。好ましくは、SOD類
縁体は糖と、普通はシュークロースと、通常1:2w/wの比
で混合し、一緒に凍結乾燥して便利に保存し得る。凍結
乾燥した酵素は特定の用途に応じて適当な希釈液に便利
に溶解できる。たとえば、関節の炎症を治療するため、
SOD類縁体は関節内投与に便利な量の生理食塩水に溶解
し得る。

患者に投与されるSOD類縁体量は、処方される患者の
状態、処理の方法および処理される条件に依存する。一
般に投与される量は、処置が要求される部位において変
異体の酵素としての有効量を与えるに十分であらねばな
らない。この点において、類縁体が全身的に投与される
とき、類縁体が処置を要求する部位へ局部的に投与され
るときに比べて、投与量は通例多くなる。一例として、
関節の炎症のあるヒトの患者に、週に１回、その炎症の
ある関節へ、炎症を低減するのに有効な量のSOD類縁体
の希釈溶液を、通常は1mgないし10mg,さらに好ましく
は、2mgないし6mgを関節内投与される。この注入は週に
１回、炎症が低減するのに十分な期間、通常は２週から
８週間、さらに好ましくは４週から６週間なされる。虚
血後の組織の障害を最小限にとどめるために用いられる
ときは、ヒトの患者には、虚血反応がある間は、適当な
希釈溶液中のSOD類縁体は10mgから1000mg、さらに好ま
しくは50mgから500mgが投与される。患者に疾患による
虚血があるときは、その溶液は、静脈内あるいは動脈内
へ大きい投与量であるいは連続的な注入で投与される。
このような場合には、SOD類縁体はウロキナーゼあるい
はストレプトキナーゼ、もしくは組織プラスミノーゲン
アクテイベーター（tPA）のような繊維素分解剤とあわ
せて投与され得る。虚血が外科手術に基づくときは、SO
D類縁体は、手術の間中投与される。このような応用
は、SODが組織の再洗浄に先だって優先的に投与される
場合、臓器移植手術においてことに有用であり、およ
び、心臓切開手術のような臓器への血流が妨害去れる手
術においても有用であることが見いだされている。

F.実施例 本発明は、次の実施例により実証される。これらの実
施例は、決して本発明だけに限定されるものではない。

実施例1:SOD−AS−Ｔ−２を生産する発現ベクターの構
築 この実施例は、ループIIのなかに４個のアミノ酸置換
基を持ち、且つ２個のアミノ酸欠損のあるSOD類縁体を
生産する発現ベクターを開示する（図２参照）。その置
換基は下記に示すものである（一文字の残基表示は、残
基の位置番号（天然型Cu/Zn SODの番号）に従う。−は
１個の欠損を示す）。

その類縁体はSOD−AS−Ｔ−２を意味し、ならびに類
縁体の生産に用いられる細菌および酵母の発現ベター
は、それぞれpSOD−AS−２およびpYSOD−AS−Ｔ−２を
意味する。

プラスミドpSOD−AS−Ｔ−２およびpYSOD−AS−２の
構築は図３に表示されている。アンピシリン耐性プラス
ミドp6610SC4は、プラスミドpNco5AHSODmのNco IとSal
Iとの間に、図１に示される遺伝子断片を挿入て作られ
る。図８に図式が、および図９に構築が示されている。
個々のオリゴマーをリン酸化し、ならびにアニーリング
（等モル溶液を70℃から25℃まで徐々に冷却する）する
ことによって、Ｔ−２（ｕ）（78）およびＴ−２（１）
（82）を意味する合成オリゴマーから調製された合成遺
伝子断片は、p6610SC4のApa IとStu Iとの間に挿入され
てプラスミドpSOD−AS−Ｔ−２をつくる。プラスミドpS
OD−AS−２は、次に、Nco IとSal Iとで処理され、その
消化されたところは、NcolとSal Iとで消化され、アル
カリフォスファターゼで処理された、カナマイシン耐性
でアンピシリン感受性のベクターpPGAPXSSB−bovineを
用いて結合（ライゲーション）された。ライゲーション
および形質転換に引き続いて、プラスミドpPGAPXSSB−S
OD−AS−Ｔ−２は、カナマイシンで選択された。上で使
用されたpPGAPXSSB−bovineの構築は、次のようであっ
た。pPGKPXSSHSODm（第10図および第11図を参照）のNco
lとSal Iとの間にウシCu/Zn SODをコードする断片を挿
入された。カナマイシン耐性は、Pst Iの部位に、PUC−
4K（Pharmacia）のPst I消化から得られたカナマイシン
−耐性因子を担持する約1200bp断片を挿入することによ
って得られた。pPAKPXSSB−SOD−AS−Ｔ−２のSac I消
化物は、つぎに、アンピシリン耐性ベクターpC1/1XSSの
ホスファターゼ処理されたSac I消化と結合された。そ
の結果得られたプラスミドpYSOD−AS−Ｔ−２は、アン
ピシリンで選択された。

プラスミドpNco5AHSODm、pPGAPXSSHSODm、およびpC1/
1XSSの構築は次のようであった。

プラスミドpNco5HSODmは、第９図に示されたように構
築された。プレ−ヒトMn SODからコードするラムダクロ
ーンからの約850bpからなるのEcoR I断片は、EcoR Iの
消化により切り出され、そして、アガロースゲル電気泳
動により精製された。この断片は、前もってEcoR Iによ
り消化されたptac5（hallewellら、NucleicAcids Res
（1985）13:2017）へ結合された。このEcoR I部位は、p
tac5のポリリンカー中に存在する。この結合混物は、E.
coli.の形質転換に用いられた。アンピシリン−Ｌ培地
中で選択された数種の形質転換体（形質転換体）コロニ
ーは、制限分析によってスクリーニングされた。適切な
配向（ポリリンカー上のSal I部位近くの３′−末端）
を有する一つのコロニー（ptac5HSODm）は、さらに操作
を続けることにより得られた。プラスミドptac5HSOD
は、アミノ酸12−13をコードするMnSOD cDNA配列にて切
るNarZにより消化された。

第９図に示されている配列の合成リンカーは、線状の
ptac5HSODへ結合された。そのリンカーは、Nco Iで切れ
た部分、リポソーム結合のためのShine−Dalgarno配列
を包含する４個のアミノ酸にたいするミニジーンコーデ
イング、終止シグナル、ヒトMn SODに対する第一番目の
翻訳出発メチオニンコードに対するATG、およびヒトMn
SODの10個のアミノ酸をコードする配列を備えている。

成熟タンパク質中の最初の２個のアミノ酸は合成リン
カーの中に含まれていない。一方、成熟タンパク質中の
３番目（Ser）の残基は、リンカー配列中のMetに接続し
ている。この選択は、細菌および酵母が、セリンに続く
メチオニンの後で切断することに基づいている（Tsunas
awaら、J.B.C.（1985）260:5382）。それ故に、成熟ヒ
トMnSODは、Ｎ−末端メチオニンなしに得られる。開始
メチオニンがリヂンに続く場合は、最初の成熟タンパク
質の残基であるメチオニンは切除されない。この場合に
は、Ｎ−末端メチオニンが含有されているのでヒトに対
する抗原となり得るメチオニル−ヒトMn SODが得られ
る。

リンカーが結合したptac5HSODmは、Nco IとSal Iとで
（挿入の３′−末端の後で切る）消化された。そのNco
I−Sal I断片（約715bp）は、ゲルにより精製された。
この断片は、Nco I−Sal I−消化pSODNco5AからpNco5AH
SODにクローニングされた。

プラスミドpNco5ASODは、ヒトCu/Zn SODに対するpBR3
22−由来細菌発現プラスミドである。このプラスミド
は、EcoR IとSal Iとの間にpBR322配列を置換するEcoR
I−Sal I挿入として、tacプロモーターおよびヒトCu/Zn
SODを含有する。tacプロモーターは、EcoR I部位の近
傍にあり、翻訳の方向は右回りである。pSODNco5Aのtac
プロモーターおよびヒトCu/Zn SOD cDNA挿入は、pNco5A
SODから得られる（前述、Hallewellら）。

pPGAPXSSHSODmの構築に用いられるプラスミドpPGAPXS
SはpPGAP（EPO 164 556）の誘導体であり、次のリンカ
ーがGAPプロモーターおよび／またはGAP終止配列とベク
ター配列との分岐部分に挿入されている。

このリンカーは、GAPプロモーター配列の５′−末端
およびGAP終止配列の３′末端とに近傍して、Sac I,Sac
II,Xho IおよびBamH Iを備えている。pPGAPエンドおよ
びリンカーからそれぞれ由来しているBamH IとBgl IIと
の両方の部位は、再構築されていない。

ポリＡ配列は、Pvu Iによりプラスミドを消化するこ
とによってpNco5AHSODmからはずされ、これはポリＡ領
域から上流を切ることである。切れた部分は、DNAポリ
メラーゼＩのKlenowフラグメントを用いて架橋された。
このプラスミドは、引き続いてNco Iにより消化され
た。hSODm cDNAを包含する615bpフラグメントは、ゲル
により精製され、pNco5AHSODへ再挿入され、E.coli.MC1
061の変換の後、Nco IおよびSma I（Sal Iの隣をきる、
第１図に示されたように）とを消化されてpNco5AHSOD−
PAとなる。

プラスミドpNco5AHSODm−PAは、Nar Iにより線状化さ
れ、下記の合成DNAリンカーに結合される。リンカーの
下側の配列は、ライゲーション中にフォスフォリル化さ
れた。

ライゲーションに引き続いて、プラスミドはSal Iに
より切断され、Sal I断片にたいする約720bpのリンカー
は、調製用のアガロースゲル電機泳動により単離され
た。この断片は、Nco Iの存在の下に、Nco I−およびSa
l I−cut pPGAPXSSHSODmへ結合された。MC1061の形質転
換後、リコンビナントプラスミド pPGAPXSSHSODを含有
するコロニーが得られた。

プラスミド pC1/1（EPO 116 201）は、BamH Iにより
線状化され、ならびにフォスファターゼ分解された。下
記に示す合成DNAリンカーは、BamH I相補末端およびSac
I,SAc IIおよびXho Iに対する制限エンドヌクレアーゼ
部位が、T4 ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化
された。キナーゼの除去後、線状化されたpC1/1に結合
された。BamH Iは、このリンカーのライゲーションによ
っては再構築されない。

E.coli株MC1061の形質転換後、リコンビナントプラスミ
ド、pC1/1xssが得られた。それはBmaH I部位に挿入され
たリンカーを含有していた。Sac I,Sac IIおよびXho I
はpC1/1XSSの中にあるユニークな部位である。

実施例2:SOD−AS−Ｔ−８を生産する発現ベクターの構
築 この実施例は、Ｃ−末端フィブリノーゲン接着性ドメ
イン延長を有するSOD類縁体を生産するための発現ベク
ターの調製を開示する。その延長配列は、次のようであ
った。

この延長上のGQQHHは、フィブリノーゲン−由来スペ
ーサー配列であり、残りのデカペプチドは接着性ドメイ
ンである。

この類縁体はSOD−AS−Ｔ−８を意味し、それを生産
するのに用いられる発現プラスミドは細菌に対するpSOD
−AS＝Ｔ−８および酵母に対するpYSOD−AS−Ｔ−８を
意味する。

プラスミドpYSOD−AS−Ｔ−８の構築は、第５図に示
される。個々のオリゴマーをフォスフォリル化およびア
ニーリング（等モル溶液を70℃から20℃まで徐々に冷却
して）することによって、Ｔ−８（ｕ）（87）およびＴ
−８（１）（87）を意味する合成オリゴマーから調製さ
れた遺伝子断片は、p6610SC4のBamH IとSal I部位との
間に挿入され、プラスミドpSOD−AS−Ｔ−８を得た。プ
ラスミドpSOD−AS−Ｔ−８は、次に、Nco IおよびSal I
により処理され、その消化物は、まずはじめにNco Iお
よびSal Iならびにアルカリンフォスファターゼによっ
て処理されたカナマイシン耐性、アンピシリン感受性ベ
クター、pPGAPXSSB−bovineと結合された。形質転換に
引続き、プラスミドpPGAPXSSB−SOD−AS−Ｔ−８は、カ
ナマイシンで選択された。pPGAPXSSB−SOD−AS−Ｔ−８
のSac I消化物は、次に、アンピシリン耐性ベクター、p
C1/1XSSのフォスファターゼ処理されたSac I消化物と結
合された。得られたプラスミドpYSOD−AS−Ｔ−８は、
アンピシリンで選択された。

実施例 3:SOD−Ｈ−T8生産のための発現ベクターの構
築 この実施例は、実施例２に開示されたフィブリノーゲ
ン接着性ドメイン延長を包含するSODポリマーの類縁体
を生産するための酵母発現ベクターの調製を開示する。
この類縁体は、SOD−Ｈ−Ｔを意味し、ならびに、それ
を生産するのに用いられる発現プラスミドはpYSOD−Ｈ
−T8を意味する。

プラスミドpPGAHSODHA1−met（EPA88302244に開示さ
れている）は、Apa IおよびSal Iにより消化され、つい
で、アルカリフォスファターゼにより処理された。大き
いほうのベクター断片は、次に、ゲルにより単離され
た。hSOD−AS−Ｔ−８遺伝子コーデイングの一部分を担
持するApa I−Sal Iカセットが、Apa IおよびSal Iによ
るpYSOD−AS−Ｔ−８の消化により、ついで、ca.500bp
断片のゲル単離によって調製さた。このフラグメント
は、上記のpPGAPSOD−Ｈ−T8ベクターヘクローニングさ
れた。次に、プラスミドpPGAPSOD−Ｈ−T8は、BamH Iに
よって部分的に消化され、ならびにca.2443 bpゲル単離
された断片は、BamH I消化およびアルカリフォスファタ
ーゼ処理によるpC1/1から誘導されたベクターヘクロー
ニングされた。プラスミドpYSOD−Ｈ−T8が得られた。

実施例 4:SOD−AS−Ｔ−2,SOD−AS−Ｔ−８およびSOD
−Ｈ−T8の発現 E.coli株MC1061はプラスミドpSOD−AS−Ｔ−２あるい
はpSOD−AS−Ｔ−８により形質転換され、ならびにアン
ピシリンで選択された。軽質転換体は、100mg/mlのアン
ピシリンおよび1.0mMの硫酸銅を含有したＬ−培地の1.5
ml中で、37℃において一晩培養された。超遠心分離によ
り得られた細胞片に、リシスバッファー（50mM トリ
ス、pH8.0,1.0mMフェニルメチルスルフォリルフロライ
ド、2.0mM 硫酸銅）60μｌおよびガラスビーズ50μｌ
が加えられた。その混合物は、10秒間撹拌され、振とう
（30分間、エッペンドルフミキサー5432）された。遠心
分離（7min）によりえられた上清の20ulは、サンプルの
６倍量のバッファー（30％グリセロールおよび染料）の
7ulと混合された、10％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動にかけられた。酵素活性用のゲル染色は、Beauchamp
およびFridovich（Analyt.Biochem.（1971）44:276−18
7）に従って行われた。両者とも活性があった。

S.cevesiae,株 PO17、は、pYSOD−AS−Ｔ−2,pYSOD
−AS−Ｔ−８あるいはpYSOD−Ｈ−T8により形質転換さ
れた。形質転換体は成長させられ、EPA 0138111に開示
されている方法に従って細胞内再結合体SOD活性が確か
められた。各々の類縁体には酵素活性があった。

上記の酵母形質転換体を細胞培地の10Lで培養した。
細胞は存在し、SOD−AS−Ｔ−2,SOD−AS−Ｔ−８および
SOD−Ｈ−T8は、前記EPA 0131811の再結合体 Cu/Zn SO
Dについての開示に従って精製された。

実施例5:インビトロ血小板結合試験 類縁体の血小板結合能力は下記のように決定できる。
テスト用SOD類縁体あるいはrhSOD（再結合ヒトCu/Zn SO
D）の30mgに対して3/10mgを、ヘパリン化されたあるい
はヘパリン化されていない血液の1.0ml中、および、ヘ
パリン化されたまたはヘパリン化されていない血液から
調製されたプラズマ断片の1.0ml中に加える。15分間イ
ンクベーションした後、その全血を遠心分離し、上清の
SOD活性を決定する（ピロガロール試験）。酵素活性は
また、SODないしその類縁体を同様に加えて、プラズマ
断片に対しても決定できる。rhSOD処理された分画（す
なわち、コントロール）に由来する酵素活性の比率に比
較して、全血上清の酵素活性の処理されたプラズマに対
する酵素活性の比率の減少は、被検類縁体の血小板結合
性の上昇がrhSODのそれを上回っていることを反映して
いる。

この技法を用いた予備実験においては、SOD−AS−Ｔ
−２は、rhSODに関する前記の比率の減少を示したが、S
OD−AS−Ｔ−８はrhSODとほぼ同じ比率を示した。

出願人はSOD−AS−Ｔ−２、SOD−AS−Ｔ−８およびSO
D−Ｈ−Ｔ−８に加えて、接着性ペプチドシグナルは含
有するが酵素活性は示さない、他のSDS類縁体を細菌中
で調製する試みをなしもしくはすでに調製してきた。こ
れらの類縁体のいくつかは下記の表に報告されている。

タンパク質化学、遺伝子工学、製薬学、医薬および関
連分野の技術であることが明らかである本発明を実施す
るための、上記に開示された態様の改変は、下記に続く
請求の範囲にはいる。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/44 Ａ６１Ｋ 37/50 (72)発明者 バレンズエラ，パブロ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94117 サンフランシスコ，アッパー テラス ナンバー ３ 455 (56)参考文献 特開 昭60−137286（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．，ＵＳＡ，84（1987），Ｐ．6340− 6344 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，259（20) （1984），Ｐ．12595−12601 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/72 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＲＥＧ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】不均化酵素活性を有する超酸化物不均化酵
   素類縁体であって、そのアミン酸配列が非相同のペプチ
   ドドメインを包含し、該ペプチドドメインが、超酸化物
   不均化酵素治療が要求される身体の部位に局在している
   かもしくは局在する、一部に結合する能力を該類縁体に
   付与し、該ドメインが、任意に約20個までの隣接残基を
   もつRGDXテトラペプチド（Ｘはこのドメインの結合特性
   を失わないアミノ酸を示す）を含むか、あるいは、任意
   に約10個までの隣接残基をもつLGGAKQAGDVを含む、超酸
   化物不均化酵素類縁体。
2. 【請求項２】超酸化物不均化酵素が、ヒトCu/Zn超酸化
   物不均化酵素、ヒトMn超酸化物不均化酵素、もしくは超
   酸化物不均化酵素ポリマーであるところの、請求項１の
   類縁体。
3. 【請求項３】前記ドメインが、該超酸化物不均化酵素の
   親水性ループ中に、または、該超酸化物不均化酵素のカ
   ルボキシ末端に位置しているところの、請求項１もしく
   は請求項２の類縁体。
4. 【請求項４】前記超酸化物不均化酵素がヒトCu/Zn超酸
   化物不均化酵素であり、そしてヒトCu/Zn超酸化物不均
   化酵素の天然型配列の23から28までのアミノ酸が下記の
   ように、該RGDXテトラペプチドを含有するように修飾さ
   れており、 天然型配列:K²³E²⁴S²⁵N²⁶G²⁷P²⁸ 変異体配列:R²³G²⁴D²⁵− − T²⁶ ここで−はアミノ酸欠損を示すか、あるいは、非相同ペ
   プチドドメインがLGGAKQAGDVを含有し、そして該ドメイ
   ンが天然型ヒトCu/Zn超酸化物不均化酵素配列のカルボ
   キシ末端の延長であるかのいずれかである、請求項１の
   類縁体。
5. 【請求項５】薬学的に許容されうる非経口の賦形剤と混
   合された、請求項１から４のいずれかの類縁体を含有す
   る、超酸化物不均化酵素治療を提供する調剤組成物。
6. 【請求項６】請求項１から４のいずれかの超酸化物不均
   化酵素類縁体をコードする、DNA。
7. 【請求項７】請求項６のDNAを生物内で発現するための
   発現ベクターであって、該ベクターは生物内において該
   DNAの発現を可能とするDNAに作動可能に接続された請求
   項６のDNAを含有する。
8. 【請求項８】前記生物による類縁体の発現を許す請求項
   ７のベクターを含有する、宿主生物。
9. 【請求項９】請求項１から４のいずれかの超酸化物不均
   化酵素類縁体の製法であり、該製法が、該類縁体をコー
   ドする該DNAの発現および該類縁体の生産を結果的にな
   しうる条件下で適当な生育培地で、請求項８の生物を生
   育させることを包含する、製法。
10. 【請求項１０】SOD−AS−Ｔ−２と称される、請求項４
    の欠失した態様を示す超酸化物不均化酵素類縁体。