PL171907B1

PL171907B1 - Sposób wytwarzania dimeru Apolipoproteiny AL-Milano PL PL PL

Info

Publication number: PL171907B1
Application number: PL92300262A
Authority: PL
Inventors: Cesare Cirtori; Guido Franceschini; Lars Abrahmsen; Erik Holmgren; Mats Lake; Bjoern Nilsson; Joanna Chmielewska; Peter Lind
Original assignee: Pharmacia & Upjohn Ab
Priority date: 1991-12-13
Filing date: 1992-12-11
Publication date: 1997-06-30
Also published as: IL103956A; NO315076B1; CA2103996A1; IL103956A0; BG61451B1; US5876968A; PL300262A1; PL172168B1; DE69233092T2; ATE242269T1; CZ158993A3; FI933557A0; AU703283B2; PT571602E; PL172544B1; NO932866L; NZ280516A; FI933557A; HUT70270A; RU2134696C1

Abstract

1. Sposób wytwarzania dimeru Apolipoproteiny Al-Milano o czystosci co najmniej 90%, znamienny tym, ze komórki E. coli transformuje sie wektorem ekspresyjnym obejmu- jacym gen kodujacy Apolipoproteine Al-Milano, prowadzi sie hodowle stransformowanych E. coli, po czym bakterie poddaje sie lizie i otrzymane bialko fuzyjne oczyszcza sie na immobilizowanej IgG, odszczepia sie Apolipoproteine A1 -Milano za pomoca kwasu mrówkowego, po czym monomer obecny w otrzymanej mieszaninie, skladajacej sie glównie z dimeru i niewielkich ilosci monomeru, przeprowadza sie w dimer i nastepnie oczyszcza sie dimer konwencjonalnymi metodami. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania czystego dimeru apolipoproteiny A1-Milano (Apo A1-M/Apo A1-M). Produkt można stosować do leczenia miażdżycy tętnic i chorób sercowo-naczyniowych, również jako środek zawierający Apo A1-M o 'opóźnionym działaniu.

Wyraźna zależność pomiędzy podwyższonym poziomem cholesterolu i rozwojem choroby wieńcowej serca (CHD) była wielokrotnie potwierdzona w oparciu o badania epidemiologiczne i przekrojowe. Jednak określenie złożonych mechanizmów transportu cholesterolu w osoczu pozwoliło na rozpoznanie selektywnej funkcji cyrkulujących lipoprotein w określeniu ryzyka zachorowania na CHD.

Są cztery główne cyrkulujące lipoproteiny: chylomikrony (CM), lipoproteiny o bardzo małej gęstości (VLDL), lipoproteiny o małej gęstości (LDL) i lipoproteiny o dużej gęstości (HDL). Podczas gdy CM są krótkotrwałym produktem jelitowej absorpcji tłuszczu, VLDL a zwłaszcza LDL są odpowiedzialne za transport cholesterolu do- tkanek, w tym np. do ścianek tętnic. Przeciwnie HDL są włączone bezpośrednio w usuwanie cholesterolu z tkanek obwodowych i przenoszenie go z powrotem do wątroby albo do innych lipoprotein poprzez mechanizm znany jako odwrotny transport cholesterolu (RCT).

Ochronna rola HDL została potwierdzona w kilku badaniach (np. Miller i in., Lancet, 1977, 965-968 i Whayne i in. Atherosclerosis, 1981, 39, 411-419). Na podstawie tych badań wydaje się, że podwyższone poziomy LDL w mniejszym stopniu niż VLDL są wyraźnie związane ze zwiększonym ryzykiem zagrożenia chorobą sercowo-naezyniową, natomiast wysoki poziom HDL chroni przed tymi chorobami. Ochronna rola HDL została mocno poparta badaniami in vivo, wykazującymi, że infuzja HDL królikom może hamować rozwój uszkodzeń tętnic wywołanych cholesterolem (Badimon i in., Lab. Invest. 60,455-61, 1989) i/lub wywoływać ich regresję (Badimon i in., J. Clin. Invest. 85, 1234-41, 1990).

Ostatnie zainteresowania w badaniu mechanizmu(ów) ochronnych HDL skupiły się na apolipoproteinie A1 (Apo A1), głównym składniku HDL. Wysoki poziom Apo A1 w osoczu jest związany z obniżonym ryzykiem CHD i obecnością uszkodzeń wieńcowych (Maciejko i in., N.

Engl. J. Med. 1983; 309:385-389; Sedlis i in., Circulation, 1986; 73 i 978-981).

Apo A1 w osoczu jest pojedynczym łańcuchem polipeptydowym o 243 aminokwasach, których główna sekwencja jest znana (Brewer i in., Biochem Biophys Res. Commun., 1978; 80:623-630). Apo A1 jest syntetyzowana w komórce jako prekursor o 267 aminokwasach. Pre-pro-apolipoproteina najpierw podlega N-końcowemu rozszczepieniu wewnątrzkomórkowo, gdzie traci 18 aminokwasów, a następnie dalszemu odszczepieniu 6 aminokwasów w osoczu lub limfie dzięki aktywności specyficznych proteaz.

Uważa się, że główną strukturalną cechą cząsteczki Apo A1 jest obecność powtarzalnych jednostek 11 lub 22 aminokwasów, które, przypuszcza się, że występują w amfipatycznej konformacji helisy (Segrest i in. FEBS Lett. 1974; 38:247-253). Ta struktura stanowi o głównych aktywnościach biologicznych Apo A1, tj. wiązaniu lipidów i aktywowaniu acylotransferazy lecytynocholesterolowej (LCAT).

Inną, ostatnio opisaną właściwością Apo A1jest jej czynność przeciwwirusowa. Wynika to z badań in vitro, a czynność jest skierowana zarówno wobec szczepów wirusa Herpes (R.V. Srinivas i in. Virology, 1756, 48-57, 1990) jak i wobec ludzkiego wirusa upośledzenia odporności, HIV (Owe i in., J. Clin. Invest. 86,1142-50,1990). Wydaje się, że taka czynność działa przez interakcję między amfipatycznymi helikalnymi częściami Apo A1 i glikoproteinami otoczki wirusów.

Badania in vitro wskazują, że kompleksy Apo A1 i lecytyny mogą pobudzać wypływ wolnego cholesterolu z hodowanych komórek mięśni gładkich tętnicy (Stein i in., Biochem. Biophys. Acta, 1975; 380:106-118). Według tego mechanizmu HDL mogą także zmniejszać proliferację tych komórek (Yoshida i in., Exp. Mol. Pathol. 1984; 41:258-266).

Ostatnio wykazano, że infuzje Apo A1 lub HDL robione zwierzętom doświadczalnym wywołują istotne zmiany biochemiczne, jak również zmniejszają zasięg i powagę uszkodzeń miażdżycowych w tętnicach. Po początkowym doniesieniu Maciejki i Mao (Arteriosclerosis, 1982; 2:407a) Badimon i in. (patrz dwa cytowane powyżej badania) stwierdzili, że można znacznie zmniejszyć zakres uszkodzeń miażdżycowych (-45%) i zawartość estru cholesterolu (-58,5%) u karmionych cholesterolem królików, przez infuzję HDL (d = 1,063 - 1,325 g/ml). Stwierdzili także, _x że infuzje HDL prowadzą do prawie 50% regresji istniejących uszkodzeń.

Wykazano także (Esper i in., Arteriosclerosis, 1987; 7:523a), że infuzje HDL mogą znacznie zmieniać skład lipoprotein w osoczu u królików Watanabe z dziedziczną hiporcholosterolemią, która powoduje wczesne uszkodzenia tętnic. W tym przypadku infuzje HDL mogą więcej niż podwoić stosunek między ochronnymi HDL i miażdżycorodnymi LDL.

Potencjalne działanie HDL w zapobieganiu chorobie tętnic u zwierząt modelowych potwierdzono jeszcze przez obserwację, że Apo Al może mieć aktywność fibrynolityczną in vitro (Saku i in., Thromb Res. 1985; 39:1-8). Ronneberger (X Międzynarodowy Kongres Farmakol., Sidney 1987, str. 990) wykazał, że ekstrakcyjna Apo A1 może zwiększać fibrynolizę u psów gończych i małp Cynomologous. Podobną aktywność można zauważyć in vitro na ludzkim osoczu. Autor ten mógł potwierdzić zmniejszenie osadzania się lipidów i tworzenia się płytek tętniczych u zwierząt, którym podaje się Apo A1.

Apolipoproteina A1-Milano (Apo A1-M) jest pierwszym opisanym molekularnym wariantem ludzkiej Apo A1 (Franceschini i in. J. Clin. Invest. 1980; 66:892-900). Charakteryzuje się tym, że Arg 173 jest zastąpiona Cys (Weisgraber i in., J. Biol. Chem., 1983; 258:2508-2513). Zmutowana apoproteinajest przenoszona jako autosomalna cecha dominująca i zidentyfikowano 8 pokoleń przonosicieli (Gualandri i in. Am. J. Hum. Genet. 1984; 37:1083-1097).

Stan osobnika przenosiciela Apo A1-M charakteryzuje znaczne obniżenie poziomu cholesterolu-HDL. Mimo tego, badani osobnicy najwyraźniej nie wykazują zwiększonego ryzyka choroby tętnic; faktycznie, z badania drzewa genealogicznego wynika, że osobnicy ci są zabezpieczeni przed miażdżycą tętnic.

Wydaje się, że mechanizm możliwego ochronnego działania Apo A1-M u przenosicmU jest związany z modyfikacją w strukturze zmutowanej apolipoproteiny polegającą na utracie jednego alfa-heliksu i zwiększonej ekspozycji reszt hydrofobowych (Francheschini i in., J. Biol.

Chem. 1985; 260:1632-1635). Utrata sztywnej struktury kilku alfa-heliksów prowadzi do zwiększonej elastyczności cząsteczki, która łatwiej łączy się z lipidami, w porównaniu z normalną A1. Ponadto, kompleksy apolipoproteina/lipid są bardziej podatna na denaturację, co sugeruje, że w przypadku mutanta poprawione jest także dostarczanie lipidów.

Lecznicze zastosowanie mutanta apolipoproteiny Apo A1-M jest obecnie ograniczone przez brak metody pozwalającej na wytwarzanie tych apolipoprotein w wystarczającej ilości i w odpowiedniej postaci.

Inną bardzo specyficzną cechą Apo A1-M jest zdolność do tworzenia dimerów ze sobą i kompleksów z Apo A1, w obu przypadkach, dzięki obecności reszty Cys. Z badań frakcji krwi zawierających mieszaninę Apolipoprotein wynikały wskazania, że obecność dimerów i kompleksów w obiegu może być odpowiedzialna za zwiększony okres ich połowicznego wydalania u przenosicieli, ostatnio opisanych w badaniach klinicznych (Gregg i in., NATO ARW on Human Apolipoprotein Mutants: From Gene Structure to Phenotypic Expression, Limone SG, 1988).

Dimery Apo A1-M (Apo A1-M/Apo A1-M) działają jako czynnik hamujący w interkonwersji cząstek HDL in vitro (Franceschini i in. J. Biol. Chem. 1990; 265:1224-12231).

Wcześniejsze badania mieszanin zawierających dimer są oparte na Apo A1-M wydzielonym z naturalnej krwi od osób z Apo A1-M, którą można było otrzymać tylko w małej ilości.

Trudności w wyprodukowaniu Apo A1 a zwłaszcza Apo A1-M z frakcji osocza są bardzo poważne (Franceschini i in., J. Biol. Chem. 1985; 260:16321-16325). Wydzielenia i produkcji nie można przeprowadzić na dużą skalę, ponieważ dostępna jest tylko mała ilość surowca. Ponadto, z produktami frakcjonowania osocza związane jest ryzyko, między innymi takie, jak zanieczyszczenie czynnikami zakaźnymi. To jest główny powód ich unikania.

Usiłowano wyprodukować ludzką Apo A1 na drodze rekombinacji DNA. W publikacji europejskiego patentu nr 0 267 703 jest opisany sposób otrzymywania Apo A1w E. coli. Jest tam opisany chimeryczny polipeptyd, w którym reszta Apo A1 jest połączona z N-końcowymi resztami aminokwasowymi beta-galaktozydazy lub zjedną lub więcej domenami wiążącymi IgG Proteiny A lub z pro-sekwencją ludzkiej Apo A1.

Ekspresja Apo A1 i Apo A1-M w szczepach drożdży i zastosowanie wytworzonych składników w leczeniu chorób miażdżycowych tętnic i chorób sercowo-naczyniowych są ujawnione w W090/12879. Geny kodujące Apo A1 i Apo A1-M są połączone z sekwencjami DNA kodującymi sygnały sekrecyjne i obróbki białka rozpoznawalne przez drożdże i podłączonymi przed genem kodującym dojrzałe białko. Stosowano modyfikowaną sekwencję MF-alfa1-lidera, w której ostatnimi resztami były HisGlySerLeuAspLysArg.

NINIEJSZY WYNALAZEK

Stwierdziliśmy nieoczekiwanie, że oczyszczony dimer Apo A1-M/Apo A1-M ma przedłużony półokres trwania w porównaniu z monomerem Apo A1-M, poza tym, że ma wyraźnie lepszą właściwość stymulowania fibrynolizy w porównaniu z normalną Apo A1, np. zdolność do bezpośredniego aktywowania plazminogenu (którego normalna Apo A1 nie aktywuje) oraz, że może być biologicznie ważny i może działać jako pro-lek dla Apo A1-M. Tworzy także rekonstytuowane cząstki HDL (lipoproteiny o dużej gęstości) o wyjątkowej wielkości, jakich nie znaleziono w rekombinacyjnych cząstkach HDL zawierających Apo A1-M lub Apo A1.

Sposobem według wynalazku wytwarza się zasadniczo czyste dimery apolipoproteiny A1-Milano, dalej określane jako Apo A1-M/Apo A1-M, o czystości co najmniej 90%, korzystnie co najmniej 98%.

Sposób według wynalazku polega na tym, że komórki E. coli transformuje się wektorem ekspresyjnym obejmującym gen kodujący Apolipoproteinę A1-Milano, prowadzi się hodowlę stransformowanych E. coli, po czym bakterie poddaje się lizie i otrzymane białko fuzyjne oczyszcza się na immobilizowanej IgG, odszczepia się Apolipoproteinę A1-Milano za pomocą kwasu mrówkowego, po czym monomer obecny w otrzymanej mieszaninie, składającej się głównie z dimeru i niewielkich ilości monomeru, przeprowadza się dimer i następnie oczyszcza się dimer konwencjonalnymi metodami.

Partnerem fuzji jest zmodyfikowana domena wiążąca IgG z białka A, a miejsce rozszczepienia przez kwas mrówkowy jest zaprojektowane między partnerem fuzji i Apo A1-M. Po lizie bakterii białko fuzyjne było oczyszczane na unieruchomionej IgG i rozszczepione za pomocą kwasu mrówkowego. Obecność Apo A1-M i dimeru wykazano metodą western blotting z użyciem elektroforezy w żelu SDS.

W przykładzie I wykazano, ze Apo A1-M wytwarzana w rekombinowanej E. coli ulega obróbce i że tworzą się dimsry. Jednak zastosowanie kwasu mrówkowego daje produkt skrócony o 2 aminokwasy od koóca N. Takie skróeenie nie zmienia aktywności czącteczld Apo Al-M.

Białko fuzyjne rozszczepia się między resztą asparaginy i proliny. Korzystnie monomer przeprowadza się w dimer przez utlenianie glutationu lub tioredoksyny, szczególnie korzystnie za pomocą utlenionego glutationu. Korzystne stężenie utlenionego glutationu jest w zakresie od 0,1 do 10,0 mM.

Dimer Apo A1-M/Apo A1-M służy do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych i jest w nich obecny, ewentualnie razem z czynnikiem stabilizującym, np. stabilizującym związkiem lipidowym, takim jak fosfolipid i/lub z nośnikiem.

Kompozycje farmaceutyczne mogą także zawierać czynnik obniżający poziom lipidów i/lub inny lek, już znany w leczemu miażdżycy tętnic i chorób sercowo-naczyniowych, taki jak heparyna i fragmenty heparyny lub czynniki obniżające lipidy.

Środki te można stosować do leczenia miażdżycy tętnic i chorób sercowo-naczyniowych i do zapobiegania i leczenia głównych schorzeń sercowo-krążeniowych, takich jak zawał serca, dusznica bolesna niestabilna, ostre zamknięcie naczyń obwodowych i nawrót zwężenia po plastyce naczyń wieńcowych.

Gdy leczy się przewlekłe choroby tętnic, wówczas leczy się zarówno tętnice wieńcowe, jak i obwodowe, które charakteryzują się obecnością płytki okluzyjnej. Dimery będą stosowane do infuzji jako takie w celu wywołania usuwania tłuszczu z płytek lub ewentualnie razem z tradycyjnym leczeniem miażdżycy tętnic i chorób sercowo-naczyniowych, takim jak za pomocą heparyny, frakcji heparyny i fragmentów heparyny i/lub leków zmniejszających poziom miażCżycorodnynh lipoprotein w obiegu.

Lek zawierający dimer można stosować do zapobiegania lub leczenia trombozy w różnych klinicznych warunkach i można go stosować do stymulacji fibrynolizy.

Dimer może także działać jako pro-lek dla monomeru w leczeniu miażdżycy tętnic i chorób sercowo-naczyniowych.

W dimerze Apo A1-M występują w szerokim zakresie struktury kmfipatyczne i dimer przypuszczalnie ma działanie przeniwwirusowe. Teraz, po raz pierwszy, przez wykorzystanie niniejszego wynalazku, możliwe jest wytworzenie dimeru w zasadniczo czystej postaci, o stopniu czystości powyżej 90% i nawet powyżej 98% i możliwe jest także wykazanie, że produkt ten ma zadziwiająco lepszy wpływ na układy' biologiczne w porównaniu z Apo A1, co przedstawiono w przykładach poniżej.

Załączone są następujące figury:

Fig. 1 przedstawiająca syntetyczny linker (przykład Ia), fig 2 - plazmid (przykład Ia), fig 3 - ilustrująca analizę metodą western blotting po rozszczepieniu białka fuzyjnego (przykład Id), fig. 4 i fig. 5 - zależność wydajności dimeru w % od stężenia białka, fig. 6 - kinetykę tworzenia się Apo A1-M w ciągu 24 godzin.

Wynalazek ilustrują następujące przykłady.

Przykład I. Produkcja Apo A1-M/Apo A1-M metodą rekombinacji

a) Konstruowanie wektora ekspresji pKP644

Replikacyjną formę bakteriofaga M13mp 18 zawieraj ącą cDkA koduj ący Apolipoproteinę A1-M (C.R. Sharpe i in. kucleic Acids Research, vol. 12, nr 9, str. 3917,1984 i M.C. Cheung i in. Biochem. Biophys. Acta960, str. 73-82, 1988) trawiono enzymem restrykcyjnym BamHI i oczyszczano przez elektroforezę w żelu agarozowym o niskiej temperaturze żelowania (LGT) i odcięto fragment o długości 822 par zasad odpowiadający genowi Apo A1-M i zligowano z plazmidem pUC9, uprzednio trawionym BamHI i potraktowano fosfodiesterazą zjelit cielęcych.

Mieszaninę z ligacji zastosowano do transformacji kompetentnych E. coli JM83 i zebrano białe kolonie z płytek agarowych zawierających ampicylinę, X-Gal i IPTG. Przygotowano DkA plazmidowe i oczyszczono cakolumcknh QuiaGene (QuiaGene Inc., 9259 Eton ave., Chatsworth

Cal. 91311 USA) zgodnie z zaleceniami producenta. Uzyskany plazmid, określony jako pUC/Apo A1-M, trawiono EcoRI i kcoI. Próbkę mieszaniny z trawienia analizowano metodą

171 907 elektroforezy w agarozie w celu potwierdzenia prawidłowej orientacji. Inną próbkę wykorzystano do zligowania syntetycznego linkera AApo A1-Eco (fig. 1) z 5'-końcem genu Apo A1-M w celu utworzenia genu ApoA1, składającego się 724 par zasad. Sekwencja AApo A1-M generuje miejsce Asp-Pro przy N końcu kodowanego białka, które ułatwia rozszczepianie przez kwas mrówkowy. Kompetentne E. coli JM83 transformowano mieszaniną z ligacji i wyizolowano uzyskany plazmid (oznaczany jako pUC/AApo A1-M) na kolumnach QuiaGene jak powyżej.

Plazmid pUC/AApo A1-M i wektor ekspresji pEZZ trawiono EcoRI i bamHI, oczyszczano przez elektroforezę w agarozie LGT i fragment pUC/AApo A1-M o długości 799 par zasad zligowano z fragmentem pf pEZZ o długości 2763 par zasad. Mieszaninę z ligacji zastosowano do stransformowania kompetentnych E. coli RV308 i wytworzono plazmidowy DNA jak powyżej.

Procedury doświadczalne opisane są w pracy J. Sambrook, E.F. Fritsch i T. Maniatis (1989) Molecular Clonings; A laboratory manuał, 2 wyd. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

Otrzymany plazmid oznaczono jako pKP644 (fig. 2).

b) Ekspresja białka fuzyjnego ZZAApo A1-M ml całonocnej hodowli E. coli RV308/pKP644 wzrastającej w 30°C w LB z 50 mg/ml kanamycyny, zaszczepiono na 2 x 500 ml pożywce mimalnej A (Curr. Meth. in Mol. Biol.) z dodatkiem 0,2 g/l kwasów kazaminowych, 1 mM MgSO4, 0,25% glukozy i 50 mg/ml kanamycyny. Hodowlę inkubowano w 37°C przez 24 godziny przy intensywnym wytrząsaniu.

c) Początkowe oczyszczanie Apo A1-M

1,0 l hodowli E. coli (RV308/pKP644) zawierającej opisany plazmid odwirowano i zebrane komórki zawieszono w 30 ml 1 x TS (25 mM Tris HC1, 0,2 M NaCl, 1 mM EDTA) i 6 M GdnHCl zhomogenizowano przez jednokrotne przepuszczenie przez prasę francuską (SLM Instruments Inc.) pod ciśnieniem roboczym 6895 MPa. Wytworzoną zawiesinę inkubowano w temperaturze pokojowej z łagodnym wytrząsaniem w ciągu 1 godziny i odwirowano. Następnie rozcieńczono supematant do końcowego stężenia GdnHCl 1M (tj. sześciokrotnie) i załadowano na kolumnę 15 ml Sepharose FastFlow IgG zrównoważoną 1 x TS. Po załadowaniu kolumnę przemyto 5 objętościami kolumny 1 x TS, następnie 20 mM octanu amonu pH 5,4 aż do osiągnięcia pH eluatu 5,4. Związany materiał eluowano 25 ml 0,2 M HAc i zanotowano absorbancję przy 280 nm (A280)· Wydajność z 11 hodowli wynosiła 1,9 mg w oparciu o wartość A₂g0.

d) Rozszczepienie białka fuzyjnego . Eluat podzielono na próbki, liofilizowano i zawieszono w 75%, 50% i 25% kwasie mrówkowym, odpowiednio. Roztwory inkubowano w 37°C przez 28 godzin, po czym liofilizowano w celu usunięcia kwasu mrówkowego. Produkty rozszczepienia badano stosując SDS-PAGE, następnie analizę Westerna. Około 5 mg całego białka załadowano na żel sDS-PAGE z gradientem 8-25% w nieredukujących warunkach. Próbki analizowano podwójnie. Jeden żel barwiono błękitem Coomassie a jeden wykorzystano do analizy Westerna. Wyniki są przedstawione na Fig. 3. Jeden z produktów rozszczepienia migruje razem z oczyszczoną natywną Apo Al i jest przyczyną sygnału w analizie Westerna. Analizę Westerna przeprowadzono stosując poliklonalne przeciwciała sprzęgnięte z peroksydazą chrzanową (The Binding site Ltd; Cambridge, Anglia) i uwidoczniono stosując standardowe procedury.

Figura 3 przedstawia analizę wytworzonych protein pojozszczepieniu białka fuzyjnego. Płytka A: żel SDS-PAGE (8% - 25%) barwiony Coomassie. Ścieżka 1: 25% kwas mrówkowy, ścieżka 2: 50% kwas mrówkowy; ścieżka 3: 75% kwas mrówkowy; ścieżka 4: oczyszczona natywna Apo Al (Sigma) i ścieżka 5: znacznik LMW (Pharmacia). Płytka B: analiza Westerna podwójnego żelu. Ścieżka 1: oczyszczona natywna Apo A1 (Sigma); ścieżka 2: 75% kwas mrówkowy; ścieżka 3: 50% kwas mrówkowy i ścieżka 4: 25% kwas mrówkowy. Obecność pasma przy Apo A1-M o podwójnym ciężarze cząsteczkowym w analizie Westerna wykazała obecność dimerów Apo Al-M.

e) Synteza Apo Al-M/Apo Al-M

Roztwory Apo A1-M dializowano do 25 mM buforu Tris-HCl, pH 9,0. Zredukowaną Apo A1-M rozcieńczono do żądanego stężenia końcowego (3,6 - 53,6 uM) 25 mM buforem Tris-HCl zawierającym zredukowany glutation (GSH) (1-5 mM) i inkubowano wstępnie w 25°C przez 5 min.

Utlenianie zapoczątkowano dodatkiem utlenionego glutationu (GSSG) (0,1 - 10,0 mM) i prowadzono je dalej w szczelnie zamkniętych probówkach w tej samej temperaturze przez 24 godziny. Utlenianie monitorowano za pomocą SDS-PAGE (patrz powyżej). Po wybarwieniu i odbarwieniu żele przeszukiwano densytometrem laserowym LKB Ultroscan XL i obliczono procentowy rozdział pasm poszczególnych białek stosując program LKB 2400 Gelscan XL. Kinetykę' utleniania śledzono za pomocą HPSEC.

W celu zoptymalizowania syntezy dimeru przeprowadzono dodatkowe doświadczenia na utlenianie w obecności GSH/GSSG + Gdn-HCl i GSH/GSSG + tioredoxin (V.P. Pigiet i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986; 83:7643-7647).

Utlenianie Apo A1-M prowadzono w zamkniętych probówkach, w obecności różnych stężeń glutationu zredukowanego/utlenionego (GSH/GSSG). Wydajność reakcji wytwarzania dimeru była zależna zarówno od stężenia białka (fig. 4, Tabela 1), jak i stosunku stężeń GSH/GSSG (fig. 5, Tabela 1). Przez zwiększenie stężenia białka z 8,9 uM do 53,6 uM, ilość Apo A1-M/Apo A1-M wzrosła o 26%-51% (fig. 4, Tabela 1). Zmniejszenie stosunku molowego GSH/GSSG z 1/2 do 1/16 prowadzi do 43% zmniejszenia wydajności; z ' drugiej strony wzrost stężenia GSH/GSSG przy stałym stosunku molowym GSH/GSSG był związany z do 42% wzrostem ilości wytworzonego Apo A1-M/Apo A1-M (fig. 5, Tabela 1). Ani temperatura reakcji, ani obecność czynnika denaturującego białko (Gdn-HCl) nie wpłynęły na stopień tworzenia się Apo A1-M/Apo A1-M. Wytworzono znaczną ilość Apo A1-M/Apo A1-M przez inkubację Apo Al-M z GSH/GSSG w obecności 0,2 mM tioredoxinu (Tabela 1).

Kinetykę reakcji utleniania śledzono za pomocą analitycznej HPSEC. Dimeryczna i monomeryczna Apo Al-M dawała wyraźne piki z czasami retencji 10,8 i 12,7 min., odpowiednio. Synteza A1-M/A1-M /GSH/GSSG 2 mM/4 mM, stężenie A1-M 8,9 mM/ była prawie całkowita po 3 godzinach; przedłużenie inkubacji do 24 godzin nie zwiększyło już tworzenia się A1-M/A1-M (fig. 6).

Tabela 1 Utlenianie Apo A1-M.

Białko uM	GSH mM	GSSG mM	Wydajność %	Uwagi
3,6	1,0	0,1	34,8	tioredoxin 0,2 mM
8,9	1,0	2,0	9,1
8,9	1,0	2,0	9,9	4°C
8,9	1,0	4,0	7,2
8,9	1,0	4,0	7,7	4°C
8,9	1,0	8,0	6,6
8,9	1,0	16,0	5,2
8,9	2,0	4,0	19,6
8,9	4,0	8,0	18,7
8,9	5,0	10,0	23,9
8,9	1,0	2,0	9,8	Gdn-HCl 4M
17,9	2,0	4,0	23 ,3
17,9	4,0	8,0	25,5
17,9	5,0	10,0	27,5
35,7	2,0	4,0	25,9
35,7	4,0	8,0	27,7
35,7	5,0	10,0	27,9
53,6	2,0	4,0	25,4
53,6	4,0	8,0	30
53,6	8,0	10,0	36,1

Warunki reakcji: Bufor: Tris-HCl 25 mM, pH 9,0 Temperatura: 25°C Czas: 24 godziny

METODY CHARAKTERYZOWANIA PRODUKTU

Inkubacja z fosfolipidami

Odważone ilości dimirystoilofosfatydylochołiny (DMPC) rozpuszczono w etanolu i odparowano rozpuszczalnik pod N 2; pozostały rozpuszczalnik usunięto pod próżnią w ciągu 2 godzin. Dyspersje DMPC w 20 nM buforu fosforanowego, pH 7,4, zmieszano Apo A1-M/Apo A1-M (0,1 mg/ml - stężenie końcowe) w stosunku molowym DMPC/Apo A1-M/Apo A1-M 100:1.

Spektroskopia

Roztwory Apo A1-M/Apo A1-M dializowano do 20 mM buforu fosforanowego, pH 7,4, i rozcieńczono tym samym buforem do żądanego stężenia białka.

Normalne widma UV i drugie pochodne widm roztworów Apo A1-M/Apo A1-M i Apo A1-M/Apo A1-M + DMPC otrzymano za pomocą spektrometrów Jasco Uvidec-610 i Perkin Elmer Lambda-2 w 25°C, stosując 1 cm pryzmat kwarcowy. Topograficzne umiejscowienie reszt tyrozyny badano zgodnie z równaniem Ragone i in. (R. Ragone, G. Colonna, C. Balestrieri, L. Servillo, G. Irace, Determination of tyrosine exposure in proteins by second-dervative spectroscopy. Biochemistry, 1984, 23: 1871-1875):

alfa = (r„ - ra)/(r_u - ra) w którym alfa oznacza stopień ekspozycji tyrozyny na rozpuszczalnik, γ„ i r_u oznaczają stosunki pików pochodnej (a/b) dla natywnego i nierozcieńczonego (w 6 M Gdn-HCl) Apo A1-M/Apo A1-M, odpowiednio, a ra oznacza stosunek pików drugiej pochodnej roztworu zawierającego wolną tyrozynę i tryptofan zmieszane w takim samym stosunku molowym jak w Apo A1-M/Apo A1-M.

Wewnętrzne widma fluorescencyjne roztworów Apo A1-M/Apo A1-M i Apo A1-M/Apo A1-M + DMPC otrzymano na spektrofluorometrze Jasco FP-550 w 25°C.

Widma dichroizmu kołowego (CD) roztworów Apo A1-M/Apo A1-M i Apo A1-M/ApoA1-M +DMPC otrzymano na spektropolarymetrze Jasco J500A w 25°C. Średnie wartości eliptyczności reszty [THEYE] wyrażono w stopniach x cm x dmol·¹ i obliczono z równania:

[THEYĄ] = [TEEYA] · 1 06 10-I-c w którym [THEYE oznacza zaobserwowaną eliptyczność w stopniach, 106 jest średnim resztkowym ciężarem cząsteczkowym białka, I oznacza długość ścieżki w cm, a c oznacza stężenie białka w g/ml. Procent struktury alfa-helisy obliczono z równania:

% alfa - helisy ΕΉΕΥΑΒο^-⁴⁰⁰⁰

33000-4000 (N. Greenfield, G.D. Fasman. Computed circular dichroism spectra for the evaluation of protein conformation. Biochemistry 1969; 8:4108-4114).

Elekroforeza

Analityczne izoelektryczne ogniskowanie i SDS-PEGE prowadzono jak uprzednio opisano (G. Franceschini, M. Sirtori, G. Gianfranceschi, C.R. Sirtori. Relation between the HDL apoproteins and A1 isoproteins in subject with the A1-M abnormality. Metabolism 1981; 30:502-509).

Izoelektryczne ogniskowanie prowadzono w 10%o żelach akrylamidowych, zawierających 6 M mocznika i 4% amfoliny (pH 4-6). Po całonocnym ogniskowaniu żele utrwalano i barwiono błękitem Coomassie Brilliant Blue R-250 w mieszaninie kwasu octowego i alkoholu izopropylo171 907 wego. Punkt izoelektryczny (pl) pasm nieznanego białka obliczono przez wykreślenie pl znanych białek (wzorce z Bio-Rad i apo-HDL) w funkcji odpowiedniej odległości migracji.

Do SDS-PAGE stosowano 14% żele akryloamidowe zawierające 0,1% SDS. Żele traktoo nO^Anc ^aotamltnczk łCołbla ekli/bymzio TT wwlnkrrn 1ί1σ MM^W

W Clii U V£J±oCtliU₅ Cl V1^’ZjCU. ν£4θΐυνω\νη J iii VUlluii j V11 ϋιαινιί vujLłvŁviiv aj Wjjnvuv» x w x»x »» wzorcowych białek (KABI-Pharmacia) w funkcji odległości migracji.

Wysokosprawna chromatografia ekskluzyjna

Rozdzielanie metodą analitycznej HPSEC prowadzono stosując ciekły chromatograf Jasco wyposażony w 10 μm kolumnę TSK-G3000 SW (7,5 x 300 mm). Kolumnę HPSEC zrównoważono i eluowano 0,1M buforem fosforanowym, 0,1M NaCl, pH 7,2, zawierającym 8 M mocznik. Białka eluowano przy szybkości przepływu 0,5 ml/min. i robiono odczyty przy 220 nm. Powierzchnie pików były scałkowane za pomocą urządzenia całkującego HP-3390.

BIOLOGICZNA OCENA Apo A1-M/Apo A1-M

Przykład II. Zachowanie kinetyczne dimeru Apo A1-M w porównaniu z monomerem Apo A1 u normalnych biorców.

Dimery wykazują przedłużoną trwałość obiegu, co zostało przedstawione poniżej w badaniach kinetycznych na ludziach.

Zdrowi ochotnicy otrzymali dożylnie Apo A1-M lub Apo A1-M/Apo A1-M znakowane 1²⁵J. Jak przedstawiono w Tabeli 2, 1 (h) osocza oraz frakcyjną szybkość kataboliczną (FCR) obliczano według dwóch różnych modeli. Obydwa potwierdzają wyraźnie zmniejszony katabolizm dimeru w porównaniu z monomerem.

Bardzo powolny katabolizm Apo A1-M/Apo A1-M wskazuje, że te cząsteczki mogą szkodzić konwersji lipoprotein i prawdopodobnie działają jako skuteczny prekursor Apo A1-M. W ten sposób, przez iniekcję Apo A1-M/Apo A1-M, przypuszczalnie dimer może pozostać w osoczu przez przedłużony okres, oddziaływując bezpośrednio na metabolizm lipoprotein i układ fibrynolityczny.

Tabela 2

Zachowanie kinetyczne Apo A1-M/Apo A1-M w porównaniu z monomerem Apo A1 u normalnych biorców (n = 2).

	Apo A1-M	Apo A1-M/Apo A1-M
Sposób jednowykładniczy t1/2	16,07	52,04
(h) MRT	23,19	75,09
(h) Sposób biwykładniczy tl/2	22,61	70,29
(h) MRT	28,97	89,16
(h) FCR	2,3% na godzinę	1,1% na godzinę

Wpływ Apo A1-M/Apo A1-M na układ fibrynolityczny

Wprowadzenie

Układ fibrynolityczny stanowi główną obronę przed osadzaniem fibryny na ściankach naczyń i jako taki odgrywa ważną rolę w mechanizmach, które zapobiegają zakrzepicy.

Enzymem odpowiedzialnym za lizę fibrynyjest plazmina. Plazmina tworzy się z nieaktywnego prekursora-plazminogenu przez działanie specyficznych aktywatorów (tkankowy aktywator plazminogenu, t-PA i urokinaza, uPA). Zarówno proces aktywacji, jak i działanie plazminy

171 907 regulują specyficzne inhibitory - inhibitor aktywatora plazminogenu 1 (PAI) i alfa-2-antyplazmina, odpowiednio. Schemat układu fibrynolitycznego jest przedstawiony poniżej.

PLAZMINOGEN

AKTYWATORY ,--PAI

PLAZMINOGEN-»PLAŻ MINA i--a₂ ANTYPLAZMINA

FIBRYNA-> FDP

FDP = Produkt degradacji fibryny

Celem badania w przykładach II-IV było stwierdzeniejak dimer Apo A1-M działa na ludzki układ fibrynolityczny. Autoaktywację plazminogenu i jego aktywację za pomocą uPA i t-PA badano w obecności i nieobecności Apo A1-M/Apo A1-M. Ludzką Apo A1 wyizolowaną z osocza stosowano jako materiał kontrolny (produkt Sigmy nr A 9284).

Aktywację układu fibrynolitycznego mierzono stosując substraty chromogeniczne. To substraty zawierają chromoforowe grupy p-nitroaniliny, które mogą być odszczepione z cząsteczki substratu przez działanie plazminy. Wolna p-NA ma intensywny żółty kolor, który można łatwo śledzić przy długości fali 405 nm. Ilość uwolnionej p-NA jest wprost proporcjonalna do ilości wytworzonej aktywności enzymatycznej.

Wszystkie pomiary przeprowadzono stosując czytnik mikropłytkowy THERMOmax kontrolowany przez program SOFTmax™ wersja 2,01 firmy Molecular Devices, Menlo Par, CA, USA.

Materiały stosowane w tych badaniach były wytworzone metodą rekombinacji DNA. Oczyszczanie obejmowało wymianę jonową, interakcję hydrofobową i chromatografię żelową i następnie ultrafiltrację i odparowywanie ze stanu zamrożenia - wszystkie konwencjonalne metody biochemiczne.

Wszystkie badane materiały zawierały 90% formy dimerycznej, jak wykazała HPLC odwróconymi fazami. Stężenie oznaczano w próbie Kabi Pharmacia apolipoproteina A1 RIA 100. Badano trzy preparaty, A, B i C.

Przykład ILI. Autoaktywacja plazminogenu w obecności Apo A1-M/Apo A1-M i Apo A1.

Glu-Plazminogen (94 gg/ml - stężenie końcowe) inkubowano przez 3 godziny w 37°C w 0,1 mol/l buforze Tris, pH 7,6. Tworzenie się plazminy śledzono obserwując chromogeniczny substrat S-2251 (H-D-Val-L-Leu-Lys-pNA), z firmy Chromogenix AB, Molndal, Szwecja. Stosowano go w końcowym stężeniu 0,6 nmol/l. Plazminogeny otrzymane w tych próbach pochodziły z firmy Chromogenix AB lub IMCO Inc. Sztokholm, Szwecja.

W próbach tych badano partie Apo A1-M/Apo A1-M (stężenie końcowe 3,9 - 75 gg/ml) i porównywano ilość plazminy wytworzonej w ich obecności z ilością plazminy wytworzonej w obecności Apo A1 (stężenie końcowe 125 gg/ml) oraz z ilością plazminy wytworzonej w nieobecności tych dodatków (kontrolna) (Tabela 3).

Nieoczekiwanie okazało się, że Apo A1-M/Apo A1-M może zwiększyć aktywację plazminogenu w nieobecności aktywatorów plazminogenu. Apo A1 pochodząca z osocza nie działała na cząsteczkę plazminogenu.

171 907

Tabela 3

Samorzutne powstawanie aktywności plazminy w plazminogenie.

Wpływ Apo A1-M/Apo A1-M i Apo A1. Aktywność plazminy wyrażona jako OD przy 405 nm.

Próbka	Stężenie końcowe Apo gg/ml	OD 405 nm
Kontrolna	0	0,052
+ ApoA1	125	0,049
+ ApoA1-M/ApoA1-M A	75	0,288
B	31.3	0,325
B	15.6	0,153
B	7.8	0,104
B	3.9	0,067

Obserwowaną aktywność można przypisać Apo A1-M/Apo A1-M. Jednak na podstawie tych danych nie można wykluczyć, że Apo A1-M/Apo A1-M był zanieczyszczony jakimś enzymem (enzymami) proteolitycznym, który mógł aktywować plazminogen. Przeprowadzono doświadczenia w celu wykluczenia takiej możliwości.

Wszystkie preparaty Apo A1-M/Apo A1-M stosowane w próbach fibrynolitycznych były badane z substratami chromogenicznymi: S-2251 (H-D-Val-L-Leu-L-Lys-pNA), wrażliwym na aktywność podobną do plazminy i S-2288 (H-D-Ile-Pro-Arg-pNA), wrażliwym na Arg-specyficzne proteazy. Substraty pochodziły z firmy Chromagenix AB. Stężenie końcowe Apo A1M/Apo A1-M w próbach było takie samo jak stężenie stosowane w próbach fibrynolitycznych, mogło zatem być różne w różnych partiach. Próba: 25 gl Apo A1-M/Apo A1-M, stężenie końcowe 60 - 70 gg/ml

150 gl 0,1 mol/1 buforu Tris pH 7,8 gl S-2251, 0,6 mmol/l lub S-2288 1,0 mmol/l.

Próbki zawierające tylko bufor i substrat stosowano jako kontrolne dla niespecyficznej hydrolizy substratu. Wszystkie próbki badano podwójnie. Płytkę do mikromianowania inkubowano w 37°C i co godzinę odczytywano absorbancję.

Tabela 4

Amidolityczna aktywność dwóch partii Apo A1-M/Apo A1-M (A i B) po 4 godzinach inkubacji w 37°C (OD przy 405 nm).

	Apo A1-M/Apo A1-M	Substrat
S-2251 A	0,023	0,022
B	0,022
S-2288 A	0,037	0,034
B	0,037

W innej serii doświadczeń Apo A1-M/Apo A1-M traktowano nieodwracalnym inhibitorem proteazy seryny - fluorofosforanem diizopropylu, DFP (produkt Sigma nr D 0789). Stężenie końcowe Apo A1-M/Apo A1-M w 0,2 mol/l buforu KHCO3, pH 7,6, wynosiło około 75 gg/ml. Do tego roztworu dodano DFP do końcowego stężenia 123 mmole/l. Po 4 godzinach próbkę do inkubacji dializowano przez noc do dwóch zmian buforu węglanowego.

Oznaczenie aktywności, w warunkach takich samych, jak opisane wcześniej, prowadzono na Apo A1-M/Apo A1-M traktowanym DFP i Apo A1-M/Apo A1-M nietraktowanym. Po 3 godzinach inkubacji z plazminogenem i S-2251, OD przy 405 nm wynosiło 0,209 dla próbek zawierających Apo A1-M/Apo A1-M traktowanych DFP, 0,234 dla próbek zawierających nietraktowany Apo A1-M/Apo A1-M i 0,030 dla próbek tylko z plazminogenem.

171 907

Można zatem wyciągnąć wniosek, że obserwowane aktywowanie plazminogenu jest bezpośrednio związane z obecnością Apo A1-M/Apo A1-M, a nie z potencjalnymi zanieczyszczeniami proteolitycznymi.

P — ad i J W Ί ł^TWU^p Aa1 M Λ1 K/n 4kVyvurc/nA sby/natorami riAjKldU IV. W ™ ζ-νΐ'ΐνχζ Λρυ ζΑχ~ιτχ ii<a tlKlj ττ w. j «» -νν! a*!** plazminogenu t-Pa i uPA.

Zarówno urokinaza (uPA) jak i tkankowy aktywator plazminogenu (t-PA) przekształcają plazminogen w plazminę przez proteolityczne rozszczepienie jednego wiązania peptydowego Arg 560-Val 561 w cząsteczce plazminogenu. Podczas gdy dwulańcuchowa urokinaza może aktywować plazminogen bezpośrednio, t-PA wymaga obecności fibryny dla optymalnej aktywacji plazminogenu. Obecność katalitycznych ilości fibryny, która razem z t-PA i plazminogenem, tworzy trzeciorzędowy kompleks, zwiększa wydajność enzymatyczną t-PA około 600-krotnie.

Aktywację plazminogenu przez t-PA badano stosując handlowo dostępny zestaw Spectrolyse (fibryna) t-PA/PAI firmy Biopool, Umea, Szwecja.

W tej próbie plazminogen inkubuje się z t-PA w obecności substratu chromogenicznego D-But-CHT-Lys-pNA i desAA fibrynogenu (monomeru fibryny), który działa jako stymulator aktywacji. Wytworzona plazmina rozszczepia substrat uwalniając pNA.

Do tego układu dodano Apo A1-M/Apo A1-M i porównano z preparatem Apo A1 firmy Sigma. Badano działanie obu apolipoprotein w układzie zarówno w obecności jak i nieobecności fibryny. Przykład układu do próby:

gl buforu Spectrolyse gl preparatu Apo lub buforu gl t-PA (= 1,7 IU/ml - stężenie końcowe)

150 gl odczynnika Spectrolyse PAR (= mieszanie plazminogenu i substratu) gl Desa fib (= monomer fibryny) lub 10 gl buforu. Próbki inkubowano na płytkach do mikromianowania w 37°c przez 3 godziny.

Tabela 5

Wpływ Apo A1-M/Apo A1-M i Apo A1 na aktywację plazminogenu przez t-PA w obecności i nieobecności fibryny. Wyniki są wyrażone jako OD przy 405 nm po 3 godzinach inkubacji w 37°C.

Próbka	Apo, stężenie końcowe gg/ml	OD 405 nm +fibryna	OD 405 nm -fibryna
t-PA kontrolna	0	0,656	0,048
+Apo Al	54	1,050	0,066
+Apo A1-M/Apo A1-M
A	65	1.665	0,446
B	54	2,366	0,225

Z Apo A1-M/Apo A1-M obserwowano znaczną stymulację aktywności plazminogenu, zarówno w obecności jak i nieobecności fibryny. Apo A1 stymulowała aktywację w mniejszym stopniu w obecności fibryny. W nieobecności fibryny stymulacja przez Apo A1-M/Apo A1-M była bardzo wyraźna w porównaniu z bardzo małą stymulacją przez ApoA1.

Apo A1-M/Apo A1-M wywierał także znaczne wzmagające działanie, gdy plazminogen był aktywowany przez uPA. Stosowana w tych próbach urokinaza była preparatem o wysokim ciężarze cząsteczkowym firmy Calbiochem.

Urokinazę (stężenie końcowe 2,5 IU/ml) mieszano z plazminogenem (stężenie końcowe gg/ml) i substratem chromogenicznym S-2251 (stężenie końcowe 0,6 mmola/l). Do tej próbki dodano Apo A1-M/Apo A1-M do końcowego stężenia 75 lub 62 gg/ml. Reakcję prowadzono w

0,1 mol/l buforze Tris, pH 7,6. Podobnie do t-PA, obserwowano silną stymulację tworzenia plazminy przez urokinazę, gdy do próby dodano Apo A1-M/Apo A1-M (Tabela 6).

Tabela 6

Wpływ Apo A1-M/Apo A1-M na aktywację plkzmicogecu przez uPA. Wyniki są wyrażone jako OD przy 405 nm, po 4 godzinach inkubacji w 37°C.

Próbka	Apo A1-M/Apo A1-M stężenie końcowe gg/ml	OD 405 nm
uPA kontrolna	0	0,325
+ Apo A1-M/Apo A1-M
A	75	1,263
B	62	1,868

Takie zwiększone ' oddziaływanie na fibrynolizę występuje także, gdy Apo A1-M/Apo A1-M przygotowano w postaci kompozycji farmaceutycznej razem z nośnikiem. Jako potencjalny nośnik stosowano liposomy składające się z fosfatydylocholiny, PC (12 mg/ml). Stężenie Apo A1-±MApo A1-M (partia C) w liposomach wynosiło 3,6 mg/ml.

Aktywację plkzmicogecu (stężenie końcowe 94 gg/ml) przez uPA (stężenie końcowe 2,5 IU/ml) badano w obecności liposomów wypełnionych ApoA1-M/ApoA1-M i porównywano z aktywacją w obecności liposomów wolnych od białek. Próbki ickubowkco przez 4 godziny w 37°C z S-2251 i śledzono w sposób ciągły tworzenie się plazminy.

Tabela 7

Aktywacja plazmicogecu przez uPA. Wpływ Apo A1-M/Apo A1-M, seria C, w liposomach. Wyniki są wyrażone jako OD przy 405 nm.

Próbka	OD 405 nm
uPA + plkzmicogec	0,221
+ liposomy wolne od białka	0,499
250 gg/ml PC
+ Apo A1-M/Apo A1-M 75 gg/ml
w liposomach, 250 gg/ml PC	1,084

Obecność samych liposomów stymulowała aktywację plazminogenu około dwukrotnie. Dodatek do liposomów Apo A1-M/Apo A1-M zwiększał ten efekt pięciokrotnie w porównaniu z próbką zawierającą tylko urokinazę jako aktywator.

Przykład V. Wpływ Apo A1-M/Apo A1-M na konwersję jedcołαńcuchowej urokinazy w dwułańcuchową urokinazą

Jedno^^^owa urokinaza (scuPA) jest prekursorem urokinazy Cwułańcuchowej (uPA). W przeciwieństwie do uPA scuPA ma tylko bardzo niską aktywność amidolityczną wobec małych syntetycznych substratów. Aktywność amidolityczna stanowi najwyżej 0,4% aktywności uPA. Jednak scuPA, mimo iż jest proenzymem, ma zdolność aktywowania plazminogenu do plazminy. Proponowano sekwencję trzech reakcji w mieszaninach plazminogenu i scuPA, które zachodzą w aktywowaniu plazminogenu do plazminy:

1) scuPA + plazminogen — scuPA + plazmina

2) plazmina + scuPA — plazmina + uPA

3) uPA + plazminogen — uPA + plazmina

Badaliśmy sekwencję reakcji prowadzących do konwersji scuPA do uPA w obecności plazminogenu. Aktywność urokinazy wykryto za pomocą chromogenicznego substratu specyficznego wobec urokinazy S-2444 (piro-Glu-Gly-Arg-pkA, Chromogenix AB). Do układu dodawano partie Apo A1-M/Apo A1-M i Apo A1 i porównywano ilość wytworzonego aktywności uPA z aktywnością otrzymaną w próbkach bez dodatku apolipoproteiny. Stosowana w tych próbach jeCnołańcunhowa urokinaza była produktem firmy Grilcecthal GmbH, Aachen, Niemcy (partia nr 0088808).

171 907 gl Epo lub bufor gl 0,05 mola/l Tris, pH 7,6, zawierającego 0,1 mola/l NaCl i 0,02% Tween 80 25 gl scuPE, 454 pmoli/l - stężenie końcowe 50 gl S-2444, 1 mmol/l - stężenie końcowe 25 g plaaminogenu, 52,1 nmoh/1 - stężeme koócowe

Próbki inkubowano w 37°C przez 90 minut. Przez ostatnie 30 minut inkubacji notowano w sposób ciągły wzrost gęstości optycznej mierząc ilości wytworzonej uPA.

Tabela 8

Wpływ Epo E1-M/Epo E1-M na konwersję scuPA do uPA. Wyniki są wyrażone jako mOD/min. przy 405 nm.

Próbka	Epo, stężenie końcowe gg/ml	mOD/min
scuPA	0	0,073
+ plazminogen	0	13,2
+ Epo E1	62	11,8
+ Apo E1-M/Apo A1-M
B	62	20,0
A	75	24,0

Apo A1-M/Apo E1-M stymulował konwersję scuPA do uPA w obecności plazminogenu, natomiast Apo A1 wydzielona z osocza nie miała znaczącego działania w tych układzie.

Zaobserwowane działanie Apo E1-M/Apo A1-M na układ fibrynolityczny w tym badaniu było większe niż działanie Apo A1 wyizolowanej z osocza. Apo E1-M/Apo E1-M ma dużą zdolność do stymulowania aktywności fibrynolitycznej, przewyższającą taką właściwość Apo E1.

Podobnie stwierdzono, też zwiększony wpływ Apo A1-M/Apo A1-M w stosunku do Apo A1 in vivo.

FIG. 2

171 907

8,9

53.6

Stężenie białka (μΜ)

FIG. 4

FIG. 5

171 907

FIG. 6

Linker- A Apo Ai-Eco

Długość linkero Δ ApoAi-Eco (kołowy): 28pz;

Prosto restrykcja	od:	1 do: 28;
X ΑναΙΙ	X	Banli
	X	Bspl286
X EcoRI	X	Dsal
	X	EcoTUl
	X	NcoS
	X	Nspll
	X	Styl

GAAHCGGAC CCACCGCAGA GCCCATGG AsnSerAsp ProProGInSerGreTrp

20 Pro 28

DApoAi-Eco-5 : 22 bp; + 1 przy 1;

5’-AATTCGGACC CACCGCAGAG CC 10 20 22

DApoAI-Eco-3 : 22 pz; + 1 prxy 1;

5’-CATGGGCTCT GCGGTGGGTC CG 10 20 22

FIG. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania dimeru Apolipoproteiny Al-Milano o czystości co najmniej 90%, znamienny tym, że komórki E. coli transformuje się wektorem ekspresyjnym obejmującym gen kodujący Apolipoproteinę Al-Milano, prowadzi się hodowlę stransformowanych E. coli, po czym bakterie poddaje się lizie i otrzymane białko fuzyjne oczyszcza się na immobilizowanej IgG, odszczepia się Apolipoproteinę Al-Milano za pomocą kwasu mrówkowego, po czym monomer obecny w otrzymanej mieszaninie, składającej się głównie z dimeru i niewielkich ilości monomeru, przeprowadza się w dimer i następnie oczyszcza się dimer konwencjonalnymi metodami.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że białko fuzyjne rozszczepia się między resztą asparaginy i proliny.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że monomer przeprowadza się w dimer przez utlenianie za pomocą glutationu lub tioredoksyny.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że monomer przeprowadza się w dimer przez utlenianie za pomocą utlenionego glutationu.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się utleniony glutation w stężeniu od 0,1 do 10,0 mM.