JPH07502892A - アポリポ蛋白質の分子変異体の２量体およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 アポリボ蛋白質の分子変異体の２量体およびその製造方法 技術分野 本発明はアポリボ蛋白質Ａ１−ミラノ　（Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／　Ａ　ｐ　ｏ　Ａ 　１−Ｍ）のほぼ純粋な２量体およびこの２量体を含有する製剤組成物に関する ものである。本発明はまた組換え型技術ならびに血漿からの分離による２量体の 製造方法に関するものである。生産品はアテローム性動脈硬化症および心臓血管 疾患の治療とＡｐ。

Ａ　ｌ−Ｍの遅延処方として使用することができる。

背見 血清コレステロールの高レベルと冠状動脈性心臓病（ＣＨＤ）の進展との間の明 瞭な相互関係が長期的な疫学的研究を基礎にして、繰り返し確認された。しかし 、血漿中のコレステロール移送の複雑なメカニズムの定義はＣＨＤの危険を決定 することにおける循環リボ蛋白質の選択的な機能の認知を与えた。

事実上、４つの主要な循環リボ蛋白質、すなわち、キロミクロン（ＣＭ）、非常 に低い密度ＣＶＬＤＬ）、低い密度（ＬＤＬ）および高い密度（ＨＤＬ）リボ蛋 白質がある。ＣＭが腸脂肪吸収の一時的な成果を構成する一方、ＶＬＤＬおよび 、とくに、ＬＤＬは、例えば動脈壁を含む組織へのコレステロール移送を引き受 ける。これに対して、ＨＤＬは「逆コレステロール移送Ｊ　（ＲＣ；Ｔ）として 知られるメカニズムにより、肝臓または他のリボ蛋白質へコレステロールを運び 返す周辺組織からコレステロールな除去するのに直接関係している。

ＨＤＬの「保護」の役割は多くの研究において確認された（例えば、ミラー氏等 著のランセット、１９７７年、第９６５頁乃至第９６８頁およびホエイン氏等著 の、アテローム性動脈硬化症、１９８］年、第３９巻、第４１１頁乃至第４１９ 頁）。これらにおいて、ＶＬＤＬはどでなく、ＬＤＬの高レベルが心臓血管の危 険の増加に明らかに関連すると思われ、それに反してＨＤＬの高レベルは心臓血 管保護を授与すると思われる。ＨＤＬの保護の役割はラビットに対するＨＤＬ点 滴がコレステロール誘起の動脈障害の発生（バデモン氏等著の実験室研究論文、 第６０巻、第４５５頁乃至第４６１頁、１９８９年）を妨げおよび／または動脈 障害の退行を誘起する（バデモン氏等著の臨床研究論文、第８５巻、第１２３４ 頁乃至第１２４１頁、１９９０年）ことを示す生体外研究によりさらに強力に支 持されている。

）（ＤＬの保護メカニズムの研究における最近の関心はアポリボ蛋白質Ａｌ　（ Ａｐｏ　Ａｌ）、ＨＤＬの主要成分に集中している。Ａｐｏ　Ａｌの高い血漿レ ベルは減少されたＣ　ＨＤの危険および冠状動脈障害の存在に関連している（マ シエイコ氏等著のニューイングランド医療ジャーナル、１９８３年、第３０９巻 、第３８５頁乃至３８９頁、セドリス氏等著のサーキュレーション、１９８６年 、第７３巻、第９７８頁乃至第９８４頁）。

血漿Ａｐｏ　Ａｌはその最初のシーケンスが知られている２４３個のアミノ酸の 単一ボペプチド鎖である（ブリュワー氏等著の生化学及び生物理研究通信、１９ ７８年、第８０巻、第６２３頁乃至第６３０頁）。Ａｐ。

Ａｌは細胞内の２６７アミノ酸先駆物質として合成されている。このプレープロ ーアボリ蛋白質は１８個のアミノ酸が失われる場合にまず細胞内でＮ−末端分裂 によりかつ次いで特殊なプロテアーゼの活性により血漿またはリンパ液中の６個 のアミノ酸のさらに他の分裂により処理されている。

Ａｐｏ　Ａ１分子の主要な構造的要件は両親媒性螺旋形態で存在すると確信され ており、１１または２２個のアミノ酸の反復ユニットの存在であると想定されて いる（シーブレスト氏等著の熱病学、１９７４年、第３８巻、第２４７頁乃至第 ２５３頁）。この構造はＡｐｏ　Ａｌの主要な生物学的活性、すなわち脂質結合 およびレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）活性を考 慮する。

Ａｐｏ　ＡＬの他の最近記載された活性はその抗ウィルス活性である。これは生 体内研究から報告されかつヘルペスウィルス菌株（スリニバス・アール・ヴイ氏 等著のウィルス学、第１７５６巻、第４８頁乃至第５７頁、１９９０年）に対し てかつまたヒト免疫不全ウィルス、ＨＩＶ（オウ氏等著の臨床研究論文、第８６ 巻、第１１４２頁乃至第１１５０頁、１９９０年）に対して作用する。この活性 はＡｐｏ　Ａｌの両親媒性螺旋部分とウィルスの外被グリコ蛋白質との間の相互 作用によって作用されるものと思われている。

生体内研究はＡｐＯＡＩおよびレシチンの複合体が培養された動脈平滑筋細胞か らの自由なコレステロールの流出を促進することを示す（シュタイン氏等著のジ オケミカル及びビオフィジカル　アクタ、１９７５年、第３８０巻、第１０６頁 乃至第１１８頁）。このメカニズムにより）（ＤＬはまたこれらの細胞の増殖を 減少し得る（ヨシダ氏等著の微分子病理学解説、１９８４年、第４１巻、第２５ ８頁乃至第２６６頁）。

より最近、実験動物中に対してＡｐｏＡ、ｌまたはＨＤＬの点滴は顕著な生物学 的変化を発揮しならびにアテローム性動脈硬化障害の範囲および苦しさを低減す ることが示された。マシエイコおよびマオ（アテローム性動脈硬化症、１９８２ 年、第２巻、第４０７ａ頁）による最初の報告後、バデイモン等（２つの上記引 用研究参照）はそれらが、１−（ＤＬ　（ｄ＝１．０６３−１．．３２５ｇ／ｍ 　ｌ　）を点滴することにより、コレステロール供給ラビット中のアテローム動 脈硬化障害の範囲（−４５％）およびそれらのコレステロールエステル含量（− ５８，５％）を顕著に減少し得ることを見出した。彼らはまたＨＤＬの点滴が確 立された障害のおよそ５０％の退行となることを見出した。また、示されること ができた（エスパー氏等著のアテローム性動脈硬化症、１９８７年、第７巻、第 ５２３ａ頁）ことは、ＨＤＬの点滴が早期の動脈障害を発生する遺伝により受け 継がれたコレステロール過剰血症を持つワタナベラビットの血漿リポ蛋白質を著 しく変更し得るということである。これらにおいて、ＨＤＬ点滴は保護ＨＤＬと アテロ・−ム発生ＬＤＬとの間の比率を二倍以上にすることができる。

動物モデル中の動脈疾患を防止するためのＨＤＬの潜在力はＡｐｏ　Ａｌが生体 内で繊維素溶解活性を働かし得る（サク氏等著、トロンビンの研究論文、１９８ ５年、第３９巻、第１頁乃至第８頁）という観察によりさらに刺激された。ロン ネバーガー（１９８７年、シトニーの第１０回国際薬理学会議、９９０頁）は抽 出可能なＡｐｏ　Ａｌがピーグル犬およびカニクイザルにおいて繊維素溶解を増 加できることを示した。同様な活性生体内でヒト血漿に関して認められ得る。こ の著者はＡｐｏ　Ａ１治療動物中の脂質堆積および動脈血小板形成の減少を確認 することができた。

アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノ（Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ）はヒトＡｐｏ　Ａｌの最初に 記載された分子変異体である（フランセシー二氏等著、臨床研究論文、１９８０ 年、第６６巻、第８２９頁乃至第９００頁）。それはＣｙｓによるＡｒｇ１７３ の置換により特徴付けられる（ワイスグレーバー氏等著、生物学化学論文、１９ ８３年、第２５８巻、第２５０８頁乃至第２５１３頁）。突然変異のアポ蛋白質 は常染色体の優性形質特性として伝達されかつキャリヤの８個の発生が認められ た（グアラントリ氏等著、Ａｍ　Ｊ　Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ　１９８４年、第３４ 巻、第１０８３頁乃至第１０９７頁）。

ＡｐｏＡｌ−Ｍキャリヤ個体の状態はＨＤＬ、コレステロールレベルの顕著な減 少により特徴付けられる。これにも拘わらず、冒された被験者は増大する動脈疾 患の危険を明瞭に示さず、実際に、系統樹の検査によりこれらの被験者がアテロ ーム性動脈硬化症から「保護」され得ると思われる。

キャリヤ中のＡｐｏＡｌ−Ｍの考え得る保護作用のメカニズムは、１つのアルフ ァーヘリックスの損失による突然変異アポリポ蛋白質の構造における変更および 増大される疏水性残留物の露出に関連付けられる（フランシエシー二氏等著、生 物学化学論文、１９８５年、第２６０巻、第１６３２頁乃至第１６３５頁）。多 数のアルファーヘリックスの緊密な構造の損失は、通常のＡＩに比して、脂質と より容易に関連する分子の順応性の増加となる。さらに、アポリボ蛋白質／脂質 複合体はより変性を受け易く、かくして脂質供給はまた突然変異の場合に改善す ることを示唆する。

アポリポ蛋白質ＡｐｏＡｌ−Ｍの治療上の使用は十分な量および適切な計上にお いて前記アポリボ蛋白質を製造させる方法が無いことにより現在制限されている 。

ＡｐｏＡｌ−Ｍの他の非常に特殊な特徴は、両方の場合においてＣｙｓ残留物の 存在のため、それによる２量体およびＡｐｏ　Ａｌｌによる複合体を形成する能 力である。アポリポ蛋白質の混合物を含有する血液部分の研究から、循環中の２ 量体および複合体の存在が臨床研究に最近記載されたキャリヤ中のこれらの除去 半減期の増加に責任があることを示す徴候があった（ブレツブ氏等著、ヒトアポ リボ蛋白質突然変異に関するＮＡＴＯＡＲＷ　：遺伝子構造から共通の表現型を 持つ個体群表現へ、リモネＳＧ、１９８８年）。

Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ２２量（Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐ。

Ａ　ｌ−Ｍ）は生体内でＨＤＬ粒子の相互変換において禁止要員として作用する （フランセシー二氏等著、生物学化学ジャーナル、１９９０年、第２６５巻、第 １２２２４頁乃至第１２２３１頁）。

２量体を含有する混合物の早期の研究はＡｐｏ　Ａｌ−Ｍを有する人間からの自 然血液から分離されたＡｐ。

Ａｌ−Ｍに基礎が置かれ、それはしたがって少量においてのみ得ることができた 。

血漿分別からＡｐｏ　ＡｌかっとくにＡｐｏＡｌ−Ｍを製造する困難はかなり重 要である（フランセシー二氏等著、生物学化学ジャーナル、１９８５年、第２６ ０巻、第１６３２１頁乃至第１６３２５頁）。分離および製造は少量の原材料の みが利用し得るとき大規模になされることができない。さらに、感染病原体によ る汚染のごとき血漿分別製品に関連付けられる幾つかの危険がある。これが回避 されることが必須である。

組換え型ＤＮＡ技術によって、ヒトＡｐｏ　Ａｌを製造することが試みられた。

ヨーロッパ特許公開第０２６７７０３号明細書にはＥ、ｃｏｌｉからのＡｐｏ　 Ａｌの製造が記載されている。該方法はＡｐｏ　Ａ１半分がベータガラクトシダ ーゼのＮ末端アミノ酸残留物にまたは蛋白質への１またはそれ以上のＩｇＧ−結 合領域にまたはヒトＡｐｏ　Ａｌのプロシーケンスに溶融される場合のキメラポ リペプチドを記載している。

アテローム性動脈硬化症および心臓血管疾患の治療におけるイースト菌および製 造された成分の使用中のＡｐｏ　ＡｌおよびＡｐｏＡｌ−Ｍの表現は国際特許出 願公表第Ｗ０９０／１２８７９号公報に開示されている。

Ａｐｏ　ＡｌおよびＡｐｏＡｌ−Ｍを記号に変える遺伝子はイーストを認知し得 る分泌を記号に換えかつ完全に分化した蛋白質に関して遺伝子の上流で溶融され る信号を処理するＤＮＡシーケンスを備えた。最後の残留物がＨｉｓＧｌｙＳｅ ｒＬｅｕＡｓｐＬｙｓＡｒｇであった変性ＭＦ−アルファー１−リーダーシーケ ンスが使用された。

発明の開示 今や意外にも、純化された２量体Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／ＡｐｏＡｌ−Ｍが単量体Ａ ｐｏＡｌ−Ｍに比して長い血漿半減期を有し、さらに通常のＡｐｏＡｌに比して 顕著に改善された繊維素溶解刺激特性、例えばプラスミノゲン（通常のＡｐｏ　 Ａｌでない）を直接活性化するようなその能力、生物学的重要からなるかも知れ ない観察、かつまたＡｐｏＡｌ−Ｍ用の前駆薬（プロドラッグ）として作用する ような可能性を有することを見い出した。それはまたＡｐｏＡｌ−ＭまたはＡｐ ＯＡｌを含有する組換え型ＨＤＬ粒子に見い出されない独特の大きさのＨＤＬ（ 高密度リポ蛋白質）粒子を形成する。

本発明は、まず血漿から分離されかつ血漿から特徴付けられそしてまた組換え型 方法により製造された少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９８％の純度を 有するアポリポ蛋白質、以下Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａ１−Ｍと呼ばれるほ ぼ純粋の２量体に関する。本発明はまた任意に安定剤例えば燐脂質および／また はキャリヤのごとき安定脂質化合物とともに、Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／ＡｐｏＡｌ− Ｍからなる製剤組成物に関するものである。

製剤組成物はまた脂質低下剤および／またはヘパリン、ヘパリン部分、およびヘ パリン部片または脂質低下剤のごときアテローム性動脈硬化症および心臓血管疾 患の治療において既に知られている他の薬剤を含み得る。

アポリボ蛋白質ＡｐｏＡｌ−Ｍは ａ）Ｅ　ｃｏｌｉ中の細胞内溶融蛋白質として組換え型技術によりアポリボ蛋白 質Ａ１−ミラノを製造し、ギ酸によりアポリボ蛋白質ＡＩ−ミラノから分裂しか つその後存在する単量体を２量体に変換することによるかまたは ｂ）アポリポ蛋白質ＡＩ−ミラノ、単量体および２量体がＥ　ｃｏｌｉおよび２ 量体にその後変換される存在する単量体中の表現系統においてバクテリア培養媒 体へ分泌される組換え型技術によりアポリボ蛋白質を製造し、そして２量体をほ ぼ純粋な形状に純化することにより製造され得る。

ａ）によればＡｐｏＡｌ−Ｍはバクテリア中で細胞内に溶融蛋白質として製造さ れる。溶融パートナ−は蛋白質Ａからの変性ＩｇＧ結合領域であり、そしてギ酸 用の分裂場所が溶融パートナ−とＡｐｏＡｌ−Ｍとの間に予定されている。バク テリアの溶解後、溶融蛋白質は不動ＩｇＧで純化されかつギ酸により分裂ぞれた 。ＡｐｏＡｌ−Ｍおよび２量体の存在がＳＤＳゲル電気泳動についてのウェスタ ン吸い取り技術により示された。

例３には、処理されたＡｐｏＡｌ−Ｍが組換え型Ｅ。

ｃｏｌｉにおいて製造されることができかつ２量体が形成されることが示されて いる。しかしながらギ酸の使用はそのＮ末端において２つのアミノ酸により先端 が切られた生産品を付与する。この先端切断はＡｐｏ　Ａ１．−Ｍ分子の活性を 変更するとは考えられない。

ｂ）にしたがった系統が例４に示され、この例では完全に正しい分子が形成され ている。

要求されるＡｐｏ　ＡＩＭの２量体はまた、Ｃ）アポリポ蛋白質ＡＩ−ミラノキ ャリャから血漿を集め、ＨＤＬアポリボ蛋白質を分離し、幾つかの段階において 、クロマトグラフィの使用により、例えば、セフアクリルグロマトグラフイによ り２量体を分離するかまたは ｄ）アポリボ蛋白質Ａ１−ミラノキャリャから血漿を集め、単量体を純化しかつ その後２魚体に変換しそして２量体をほぼ純粋な形状に純化することにより得ら れる。

Ｃ）による分離は幾つかの段階においてかつ好ましくは３００　ｃ　ｒｎのごと き長いコラム上で行うことが重要である。

単量体が存在するならば、それは常に、以下の例に示されるように、２量体の形 状に変換されるべきである。

本発明はアテローム性動脈硬化症および心臓血管疾患の治療方法および薬剤の製 造への２量体の使用を含む。

２量体はまたアテローム性動脈硬化症および心臓血管疾患の治療用の単量体の前 駆薬として作用することが可能である。

この薬剤はアテローム性動脈硬化症および心臓血管疾患の治療および心筋梗塞、 不安定なアンギナ、急性周辺血管閉鎖および冠状血管形成術後のレステノシスの ごとき主要な心臓循環器系の病気の防止および治療に使用することができる。慢 性の動脈の病気が治療されるとき、閉塞性血小板により特徴付けられる冠状およ び周辺動脈の両方が治療される。２量体は血小板からの脂肪の除去を誘起する目 的でそれ自体点滴でかつ任意にヘパリン、ヘパリン部分、およびヘパリン部片お よび／またはアテローム発生リボ蛋白質の循環レベルを低減する薬剤の使用のご ときアテローム性動脈硬化症および心臓血管疾患の確立された治療に関連して使 用する。

２量体を含有する薬剤は種々の臨床状況において血栓症の防止および治療に使用 することができかつ繊維素溶解の刺激に使用することができる。

両親媒性構造はＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ２２量中に高い範囲で存在しかつ２量体は抗ウ ィルス作用を有すると考えられている。

次にまず、本発明の使用により、２量体を９０％以上のかつ９８％以上に、実質 上純粋な形状において製造しかつまたこの生産品が以下の例７〜１０に示された Ａｐｏ　Ａｌに比して生物学的系統に驚くべき良好な作用を有することを示すこ とができる。

図面の簡単な説明 第１図および第２図は蛋白質濃度について１％に依存する収量を示すグラフ図（ 例２ｂ））である。

第３図は２４時間中のＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａ１−Ｍの形成の運動を示す グラフ図（例１ｂ２））である。

第４図は合成リンカ−を示す説明図（例３ａ））である。

第５図はプラスミドを示す説明図（例３ａ））である。

第６図は溶解蛋白質の分裂後のウェスタン分析を示す説明図（例３ｄ））である 。

第７図はＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−ＭのＵＶスペクトルを示すグラフ図 （例５）である。

第８図、第９図および第１０図は第２の誘導ＵＶスペクトルを示すグラフ図（例 ５）である。

第１１図は蛍光分光測定を示すグラフ図（例５）である。

第１２図はＣＤ分光測定を示すグラフ図（例５）である。

第１３図はＡｐｏ　Ａｌ、Ａｐｏ　Ａｌ−ＭおよびＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　 Ａｌ−Ｍを含有するｒＨＤＬを示すグラフ図（例６）である。

■ 例１　血漿からの２量体の分離 ａ）アポリボ蛋白質の製造 絶食血液サンプルが種々のアポリボ蛋白質Ａｐｏ　Ａ１−ＭキャリヤからＮ　ａ 　２　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（１ｒｎ　ｇ　／　ｒｎ　１　）に集められ、そして血 漿が４℃で低速遠心分離により調製された。血漿高密度リボ蛋白質（ＨＤＬ、ｄ ＝１．　０６３−１．２１ｇ／ｍｌ）が５０．２Ｔｉロータを備えたベックマン Ｌ５−５０Ｂ超遠心分離機中で連続超遠心分離（ハベル・アールジエイ、エダー ・エッチニー、プラグトン・ジエイエツチ、ヒト血清における超遠心分離で分離 されたリボ蛋白質の分布および化学的組成、臨床研究論文、１９５５年、第３４ 巻、第１３４５頁乃至第１３５４頁）により分離された。４℃で４０．ＯＯＯｒ ｐｍでの４８時間の超遠心分離後、ＨＤＬを含有する頂部部分が０．１５ＭＮａ Ｃ１，０，０１％Ｎａ２　ＥＤＴＡ、ＫＢｒ溶液（ｐＨ７，４，ｄ＝１．２１ｇ ／ｍｌ）により１：１に希釈されそして４８時間、４℃で４０゜０００ｒｐｍに おいて再び遠心分離された。ＨＤＬは５ｍＭＮＨ＝　ＨＣＯ、、０，０１％Ｎａ ｚ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，４に対して徹底的に透析され、凍結乾燥されそしてジ エチルエーテル／ＥｔＯＨ（３：　１　ｖ／ｖ）により脱脂された。

ｂ）Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍの分離Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａ ｌ−Ｍを分離するために、例１ａ）からのＨＤＬアポリポ蛋白質は、６Ｍガニジ ンＨＣ１（Ｇｄ　ｎ−ＨＣ１）を含有する０、１Ｍトリス−ＨＣｌ、０．０４％ Ｎ　ａ２Ｅ　Ｄ　ＴＡ、０．　０１％ＮａＮ３．ｐＨ７，４中に可溶性にされた 。アポリボ蛋白質は４Ｍ　Ｇｄｎ−ＨＣｌを含有する０、１Ｍトリス−ト（Ｃ１ ，０、０４％Ｎａ−ＥＤＴＡ、　０．　０１　％ＮＡＮ３　ｐＨ７，４で釣り合 わせられたセファクリル５−３００　）−Ｉ　Ｒニアラム（２，６Ｘ３００ｃｍ ）に加えられた。

アポリボ蛋白質は１．５ｍｌ／分の流量で、同一の緩衝剤により流出されｌｏｍ ｌの部分が集められた。Ａｐ。

Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍを含有するプールされた部分が真空下で濃縮されか つ同一コラムに再び加えられた。純粋なＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍを 含有する部分がプールされ、５　ｍ　Ｍ　Ｎ　ＨａトＩＧＯ３、０，０１％Ｎ　 ａ　２　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　、ｐ　Ｈ７、４に対して透析され、凍結乾燥されそし て３ＭＧｄｎ−ＨＣｌを含有する０゜１Ｍトリス−ＨＣｌ、０，０４％Ｎ　ａ　 ｐ、　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　、０　。

０１％ＮａＮ３．ｐＨ７，４中に一２０℃で貯蔵された。

Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ調製品は、非減少条件下で高性能サイズ除 外クロマトグラフィ（ＨＰ　Ｓ　ＥＣ）および５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル 電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によりチェックされたように〉９８％純粋であっ た。

この方法によりＡｐｏＡｌ−Ｍの純粋な２量体がキャリヤからの血漿から分離さ れた。

例２　血漿からの単量体の純化およびその後の２量体への変換 ａ）ＡｐｏＡｌ−Ｍの純化 ＡｐｏＡｌ−Ｍ単量体を純化するために、例１ａ）からのＨＤＬアポリボ蛋白質 が６ＭＧｄｎ−ＨＣｌおよび１％２−メルカプトエタノールを含有するＯ、１Ｍ ｈリスーＨＣｌ、０．０４％Ｎａ２　ＥＤＴＡ、０．０１％ＮａＮ３．ｐＨ７， ４中に可溶性にされた。３７℃での定温放置の４時間後に、還元されたアポ−Ｈ ＤＬは４Ｍ　Ｇｄｎ−ＨＣｌおよびＯ，１％２−メルカプトエタノールを含有す る０、１Ｍトリフ！、−ＨＣｌ、０，０４％Ｎａｚ　ＥＤＴＡ、Ｏ，Ｏｆ％Ｎ− Ｎｓ　ｐＨ７，４で釣す合わせられたセファクリルＳ−２００コラム（２，６ｘ １５０ｃｍ）に加えられた。アポリボ蛋白質は１．０ｍｌ／分の流量で、同一の 緩衝剤により流出され５ｍｌの部分か集められた。Δ１＋ａｐｏ　ΔＩ−Ｍに対 応するプールされた部分が５ｍＭＮＨ４ＨＣＯ３，０，０１％Ｎ　ａ　７．　Ｅ 　Ｄ　Ｔ　Ａ　、ｐ　Ｈ７、４に対して透析され、凍結乾燥された。アポリボ蛋 白質は６ＭＧ　ｄ　ｎ−ＨＣ１および１％２−メルカプトエタノールを含有する Ｏ、１Ｍトリス−）（Ｃ１，０，０４％Ｎａ２　ＥＤＴＡ、０，０１％ＮａＮ３ ．ｐＨ７，４中に溶解された。２５℃ての４時間の定温放置後に、２−メルカプ トエタノールはセファデックスＧ　２５クロマトグラフイにより除去されかつア ポリボ蛋白質は直ちに４　Ｍ　Ｇ　ｄ　ｎ　−）ｉ　Ｃ１を含有する０、１Ｍト リス−Ｉ（ＣＩ、０，０４％Ｎａ２　ＥＤＴＡ、０，０１％ＮＡＮ３　ｐＨ７， ４で釣り合わせられたチオプロピル−セファローゼコラム（ＩＸｌｏｃｍ）に加 えられた。　−晩低い流量（０，１５ｍ１／分）で再び循環した後、通常のＡｐ ｏ　Ａｌが４ＭＧｄｎ−ＨＣ］を含有するＯ、ＩＭ）リス−ＨＣｌ、０．０４％ Ｎａ、＋。

−ＥＤ］”Ａ、０．０１％ＮａＮ３．ｐＨ７，４により流出された。ΔｐｏＡ１ −Ｍは次いで４Ｍ　Ｇｄｎ−Ｔ−ＩＣ１および１％２−メルカプトエタノールを 含有する同一の緩衝剤により流出された。ΔｐｏＡ１−Ｍを含有する部分がプー ルされ、５　ｍＭ　Ｎ　Ｈ４ＨＣＯ２，０，０１％Ｎａ２−ＥＤＴＡ、ｐ）−（ ７，４に対して透析され、凍結乾燥されそして３ＭＧｄｎ−ＨＧＩおよび０．１ ％２−メルカプトエタノールを含有するＯ、１Ｍトリス−ＨＣｌ、０．０４％Ｎ ａｚ　ＥＤＴＡ、０．０１％ＮａＮ、、ｐ＋−（７，４中に一２０℃で貯蔵され た。Ａｐ。

Δｌ−Ｍ調製品はＩＩＰＳＥＣ，５ＤＳ−ＰＡＧＥによりチェックされたように 、〉９８％純粋であった。

ｂ）Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ合成ＡｐｏＡｌ−Ｍ溶液は２５ｍＭ） リス−ＨＣｌ緩衝剤、ｐＨ９，０に対して透析された。還元されたＡｐ。

Ａｌ−Ｍは還元されたグルタチオン（ＧＳＨ）（１−５ｍ　Ｍ　）を含有する２ 　５　ｒｎＭ　トリス−１（にｌ緩衝剤により所望の最終濃度（３，６〜５３． ６μＭ）に希釈されそして５分間２５℃で予備定温放置された。酸化は酸化され たグルタチオン（ＧＳＳＧ）（０，１〜１０．ＯｍＭ）の添加により開始されか つ２４時間同一温度で密閉された管で行われた。酸化は５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（前 記参照）により監視された。汚れを付けかつ汚れを除いた後、ゲルはＬＫＢウル トラスキャンＸＬレーザ濃度計により走査されそして個々の蛋白質帯域の百分率 分布がＬＫＢ２４００ゲルスキャンＸＬソフトウェアにより計算された。

２量体の合成を最適にするために追加の酸化実験がＧＳ　Ｈ／　Ｇ　Ｓ　Ｓ　Ｇ 　十Ｇ　ｄ　ｎ　ＨＣｌおよびＧＳＨ／Ｇ５５Ｇ＋チオレドキシンの存在におい て実施された（ピジート・ヴ、イピー氏等著、プロセス　ナショナル　アカデミ ツク　サイエンス、ＵＳＡＩ９８６年、第８３巻、第７６４３頁乃至第７６４７ 頁）。

Ａｐｏ　Ａ１．−Ｍの酸化は還元／酸化グルタチオン（Ｇ　Ｓ　Ｈ／Ｇ　Ｓ　Ｓ 　Ｇ）の可変濃度の存在において、閉鎖管中で実施された。２Ｊｉ体の反応収量 は蛋白質濃度（第１図、表１）およびＧ　Ｓ　Ｈ／Ｇ　Ｓ　Ｓ　Ｇ濃度／比率（ 第２図、表１）両方に依存した。８．９μＭから５３．６μＭへ濃度を増加する ことにより、Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／ＡｐｏＡ１−Ｍの百分率は２６％〜５１％（第 １図、表１）まで上昇した。１／２から１／１６までのＧｓＨ／Ｇ５５Ｇモル比 の減少は収量の４３％の減少を生じ、他方で、一定（７）ＧＳＨ／Ｇ５５Ｇ−ｔ ｌ−ル比により、ＧＳＨ／Ｇ５５Ｇ濃度の上昇はＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａ ｌ−Ｍ形成の４２％までの増加に関連していた（第２図、表１）。反応温度およ び蛋白質変性剤（Ｇｄｎ−ＨＣＩ）の存在は両方共にＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ 　Ａｌ−Ｍの発生の程度に影響を及ぼさなかった。ＡｐｏＡｌ−Ｍ／ＡｐｏＡｌ −Ｍの顕著な形成はまた０、２ｍＭチオレドキシン（表１）の存在においてＧＳ Ｈ／Ｇ５５Ｇを有するＡｐｏＡｌ−Ｍの定温放置により達成された。

酸化反応の運動は分析ＨＰＳＥＣにより監視された。

単量および２量ＡｐｏＡｌ−Ｍはそれぞれ１０．８および１２．７の保持時間に より異なるピークを付与した。

Ａ　Ｉ　−Ｍ／Ａ　Ｉ−Ｍ合成（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ２ｍＭ／４ｍＭ、Ａｌ−Ｍ濃 度８．９μ）が３時間後はぼ完成され、２４時間までの定温放置の延長はさらに Ａ　ｌ　−Ｍ／Ａ　１−Ｍ形成を増加しなかった（第３図）。

表ＩＡｐｏＡｌ−Ｍ酸化 蛋白質　ＧＳＨＧ５５Ｇ　収量　備考 μＭ　ｍＭ　ｍＭ　％ ３．６　１，０　０．１　３４．８　チオレドキシン０．２ｍＭ ８．９　１．０　２，０　９．１ ８．９　１．０　２．０　９．９　４℃８．９　１．０　４，０　７，２ ８．９　１．０　４，０　７．７　４℃８．９　１，０　８，０　６．６ ８．９　１．０　１６，０　５．２ ８．９　２，０　４，０　１９．６ ８．９　４．０　８，０　１８，７ ８．９　５，０　１０，０　２３，９ ８、　９　１．　０　２．０　９．　８　Ｇｄｎ−ＨＣｌ４Ｍ１７．９　２．０ 　４，０　２３．３ １７．９　４．０　８．０　２５，５ １７、　９　５．　０　１０．　０　２７．５３５．７　２．０　４，０　２５ ，９ ３５．７　４．０　８．０　２７，７ ３５、　７　５．０　１０．　０　２７．　９５３．６　２．０　４．０　２５ ．４ ５３．６　４．０　８．０　３０．４ 反応条件：緩衝剤ニドリスー１−１Ｇ１２５ｍＭ、ｐＨ９，０温度：２５°Ｃ 時間＝２４時間 ａ）表現ベクトルｐ　Ｋ　Ｐ　６４４　ノ構造アポリボ蛋白質Ａｌ−Ｍを記号に 変えるｃＤＮＡを含有するバクテリオファージＭ１３ｍｐ１８の複製形状（シャ ープ・シーアール氏等著、核酸研究、第１２巻、第９号、３９１７ページ、１９ ８４年およびチョング・エムシー氏等著、生化学及び生物環アクタ、第９６０巻 、第７３頁乃至８２貞、１９８８年）が制限酵素Ｂ　ａ　ｍ　Ｈｌにより蒸解さ れそして低ゲル化温度（ＬＧＴ）アガロースゲル電気泳動により純化された。Ａ ｐｏ　Ａｌ〜Ｍ遺伝子に対応する８２２ｂｐ断片が摘出されかつＢ　ａ　ｍＨｌ により以前に蒸解されかつ子牛の腸内フォスフオシエステラーゼにより処理され たプラスミドｐＵｃ９に連結される。

連結混合物は反応能を有するＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ８３を転換するのに使用されそ してホワイトコロニーがアンピシリン、Ｘ、−ＧａｌおよびＩ　ＰＴＧを含有す る寒天板から採集された。プラスミド−ＤＮＡが調製されかつ製造の推薦にした がってキアジーンコラム（キアジーン社、アメリカ合衆国９１３１１、カルフォ ルニア、チャツツワース、イートン・アヴエニュー９２５２）上で純化された。

ｐＵｃ／ΔｐｏＡｌ−Ｍと呼ばれる、誘導プラスミドがＥｃｏＲｌおよびＮｃｏ ｌにより蒸解された。

蒸解混合物の部分標本が正しい方向付けを確認するためにアガロース電気泳動に より分析された。他の部分標本が合成リンカ−「ΔＡｐｏＡ１−ＥＣＯＪ　（第 ４図）を、７２４ｂｐからなる遺伝子ΔＡｐｏＡｌを発生するためにＡｐｏ　Ａ 、ｌ　−Ｍ遺伝子の５′一端部に連結するのに使用された。ΔＡｐｏＡｌ−Ｍシ ーケンスはギ酸による分裂を容易にする記号化された蛋白質のＮ末端においてＡ ｓｐ−Ｐｒｏ部位を発生する。反応能を有するＥ、　Ｃｏ１１　ＪＭ８３は連結 混合物により転換されかつ誘導プラスミド（ｐＵｃ／ΔＡｐｏＡｌ−Ｍと呼ばれ る）が上記のようにギアジーンコラム上で分離された。

プラスミドｐＵｃ／ΔＡｐｏＡｌ−Ｍおよび表現ベクトルｐＥＺＺＪｔＥｃｏＲ １およびＢａｍＨｌにより蒸解され、ＬＧＴアガロース電気泳動により純化され 、そしてｐＵｃ／ΔＡｐｏＡｌ−Ｍの７９９ｂｐ断片が２７６３ｂｐ断片ｐｆ　 ｐＥＺＺに連結された。連結混合物は反応能を有するＥ、ｃｏｌｉ　ＲＶ３０８ を変換するのに使用されそしてプラスミドＤＮＡが上記のように調製された。

実験手順に関しては、サムプルツク・ジエイ、フリッシュ・イー・エフおよびマ ニアテイス・ティー、　（１９８９年）モレキュラー・クローニンゲス；ア・ラ ボラトリ−・マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラト リ−、ニューヨーク、コールド・ハーバ−・スプリング参照。誘導プラスミドは ｐＫＰ６４４と命名された（第５図）。

ｂ）溶解蛋白質２２−ΔＡｐｏＡｌ−Ｍの表現５０　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌのカナ マイシンによりＬＢ中において３０℃で成長させ、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＲＶ３０８／ ｐＫＰ６４４の一晩培養の４０ｍ１が０．２ｇ／ｌのカサミノ酸、ｌ　ｍＭ　Ｍ 　ｇ　Ｓ　０４　、０　、　２５％グルコースおよび５０ｍｇ／ｍｌのカナマイ シンの添加とともに２Ｘ５００ｍｌの最小媒体Ａ　（Ｍｏ１．Ｂｉｏｌにおける Ｃｕ　ｒ　ｒ。

Ｍｅｔｈ）に接種された。培養は活発な攪拌下で２４時間３７℃で定温放置され た。

ｃ）ＡｐｏＡｌ−Ｍの初期純化 記載されたプラスミドを含有するＥ、ｃｏｌｉ培養（ＲＶ３０８／ｐＫＰ６４４ ）の１．０１が遠心分離されそしてベレット化された細胞が３０ｍ１のｌ　ＸＴ Ｓ（２５ｒｎＭトリスＨＣＩ、０．２ＭＮａＣ１，１ｍＭＥＤＴＡ）および６Ｍ ＧｄｎＨＣｌ中に再び懸濁されかっ１０００ｐｓｉの作動圧力でフレンチプレス （ＳＬＭインストウルメンツ社）を介して単一通路により均質化された。結果と して生じる懸濁液が１時間の穏やかな攪拌により室温で定温放置されかつ遠心分 離された。上清が次いでＩＭ（すなわち６倍）のＧｄｎＨＣｌの最終濃度に希釈 されかつＩＸ”ｌ’Ｓにより釣り合わされた１５ｍ１セフアロース・ファストフ ローＩｇＧのコラム上で負荷された。負荷後、コラムは流出物のｐＨが５．４１ 達するまで２０ｍＭアンモニウムアセテートｐＨ５，４により追随されるＩＸＴ Ｓの５コラム容量により洗浄された。

結合された材料は２５ｍ１の０．２ＭＨＡｃにより溶出されかつ２８０　ｎ、ｍ 　（Ａ２１１゜）での吸収度が観察された。

ＩＬ培養からの収量はＡ２．。値を基礎にして１．　９ｍｇであった。

ｄ）溶解蛋白質の分裂 流出物は部分標本にされ、凍結乾燥されそしてそれぞれ７５％、５０％および２ ５％のギ酸中に再び懸濁された。溶液は３７℃で２８時間定温放置されそしてそ の後ギ酸を除去するために凍結乾燥された。分裂製品はウェスタン分析により追 随される５ＤＳ−ＰＡＧＥを使用して評価された。はぼ５ｍｇの合計蛋白質が非 還元状態下で５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル勾配８〜２５％で負荷された。

サンプルが全く同一に処理された。１つのゲルがコーマシー（Ｇｏ　ｏｍａ　ｓ 　ｉ　ｅ）で汚されかつ１つのゲルがウェスタン分析に使用された。結果は第６ 図に示した。分裂製品の１つが純化された自然のＡｐｏ　Ａｌとともに移行しか つウェスタン分析において信号に生起する。ウェスタン分析はセイヨウワサビペ ルオキシダーゼ（ザ・パインディング・サイト社；英国ケンブリッジ）と結合さ れた多クローン抗体を使用して実施されそして標準の手順を使用して目視化され た。

第６図は溶解蛋白質の分裂後結果として生じる蛋白質の分析を示す。パネルＡ； コーマシーで汚した５ＤＳ−Ｐ　Ｚ　Ｇ　Ｅゲル（８〜２５％）。レーン＝２５ ％ギ酸、レーン２：５０％ギ酸；レーン３ニア５％ギ酸；レーン４：純化された 自然のＡｐｏＡｌ（シグマ）およびレーン５　：　ＬＭＷマーカ（ファーマシア ）。パネルＢ：複製ゲルのウェスタン分析。レーン１：純化された自然のＡｐｏ Ａｌ（シグマ）；レーン２ニア５％ギ酸；レーン３：５０％ギ酸およびレーン４ ：２５％ギ酸。ウェスタン分析でのＡｐｏＡｌ−Ｍの分子量の２倍での帯域の存 在はＡｐｏ　ＡＩ　Ｍの２量体が存在したことを示した。

桝−４−ノ８イジ（リアクーター中で郵ｐｏ　Ａｌ−ジ化の製造ベリプラスミッ ク空間および成長媒体へのＡｐｏ　Ａ１−Ｍの直接分泌に関するベクトルの構造 。

菌株およびベクター。使用されたエシェリキアｃｏｌｉ　Ｋ］２菌株はＨＢＩＯ ＩＦ　、ｈｓｄｓ２０（ｒＢ−。

ｍＢ−）ｓｕｐＥ４４．ｈｂｌｏｌＦ−、ｈｓｄｓ２０（ｒＢ−、ｍＢ’−）、 ５ｕｐＥ４４．ａｒａ１４．ｌ−。

ｇａｌＫ２，１ａｃＹ１．ｐｒｏＡ２．ｒｓｐＬ２０゜ｚｙｌ、−５，ｍｔ、ｌ −１，ｒｅｃＡｌ３．ｒＢ　、ｒｎＢ−’。

ｍｃ　ｒＡ　（＋）　、ｒｎｃ　ｒ　Ｂ　（−）　（ボイヤー等、１９６９年、 Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　４１　：　４５９−４７２）　、　ＤＨ５ａＦ　、Ｆ８ ０ＤｌａｃＺＤＭ１５．Ｄ　（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９．　ｒｅｃＡ ｌ、ｅｎｄＡｌ、ｇｙｒＡ、ｌ　、ｔｈｉ−１，ｈｓｄＲ１７，（ｒｈ−、ｍｈ −）、５ｕｐＥ４４．ｒｅｌＡｌ、（ＢＲＬ　ＵＳＡ）。ＲＶ３０８　ＤＩａｃ Ｘ７４．ｇａｌＯＰ：　：　ｌｓ２　（ｇａｌＯＰ３０８）、５ｔｒＡ、ｌ−（ モアラー等、１９８０年、ＪＭｏｌＢｉｏｌ、１３９：１４７−１６１）および Ｂｅ２Ｏｘｙｌ−７，ａｒａ−１４，ｔ４−ｒ、１−０菌株ＨＢ　１０１６およ びＤＨ５ａはＤＮＡ部片のサブコルニングに使用された。プラスミドｐＵｃ９　 （ビエイリア等、１９８２年、遺伝子、１９　：　２５９−６８）がニス・シト リ（ミラノ）から得られたヒトＡｐｏ　ＡｌのｃＤＮＡ複製の８２１．ｂｐ　Ｂ ａｍ　８１部片のサブクローニングに使用された。ヌクレオチドシーケンスが受 入れ番号Ｘ０２１６２により遺伝子銀行から得ることができる（セイルハンマー 等、１９８４年、ＤＮＡ、第３巻、第３０９頁乃至第３１７頁）。このベクトル はｐＫＰ５７５と指定された。また、ヒトＡｐｏＡｌ−ＭＤＮＡ　（ニス・シト リから得られたｃＤＮＡ複製）の８５６ｂｐＥｃｏ　ＲＩ−Ｐｓｔ　Ｉ部片がプ ラスミドｐＵｃ９にサブコルニングされた。この誘導体はｐＫＰ５７６と指定さ れた。プラスミドｐＫＰ６８３およびｐＫＰ７６４はプラスミドｐＴｒｃ９９（ アマン氏等著、１９８８年、遺伝子、６９巻、第３０１頁乃至第３１４頁）の誘 導体でありそしてトランスポゾン（Ｔｎ９０３）によるｐＵｃ誘導体がｐＵｃ４ −Ｋ　（ビエイリア氏等著、１９８２年、遺伝子、１９巻、第２５９頁乃至第２ ６８頁およびオカ氏等著、１９８１年、Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ、第１４７巻、第 ２１７頁）からカナマイシン抵抗マーカーをそしてｐｔＪＥＸ２（ブレラサン氏 等著、１９８７年、核酸研究、第１５巻、第１００５６頁）からバクテリオファ ージｆｄの書き換え終了暗号（ＴＩＴ２）を引き出した。

使用された方法。バクテリア菌株はプラスミドＤＮＡの調製のためかつ小規模表 現分析のためアンピリジン（Ａｐ）５０μｇ／ｍｌまたはカナマイシン（Ｋｍ） ７０　／Ｌｇ　／　ｍ　ｌを有するルリアベルタニ媒体（ＬＢ）またはイースト トリプトン媒体（２ｘＹＴ）中で成長させられた（サンプルツク等、１９８９年 、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−・プレス）。Ａｐ５０μｇ／ ｍまたはＫｍ７０μｇ　／　ｍ　ｌで補完されたトリプトース血液寒天ベース（ デフイコ、アメリカ合衆国）が寒天板上に細胞を成長させるのに使用された。組 換え型ＤＮＡ技術が（サンプルツク等、１９８９年、コールド・スプリング・ハ ーバ−・ラボラトリ−・プレスにしたがって）実施された。制限エンドヌクレア ーゼおよび′ｌ゛４１）ＮＡリガーゼがボーリンガ−・マンハイム（ドイツ）、 二ニー・イングランド・バイオラプス（ビハリー、アメリカ合衆国）またはファ ーマシア（ウプサラ、スエーデン）から得られた。イソプロピル−し−ガラクト シド（ＩＩ）”１”Ｇ）がシグマ（アメリカ合衆国）から得られた。

低ゲル化および溶融温度のアガロース（ヌシーブＧＴＧ。

ＦＭＣバイオプロダクツ、アメリカ合衆国）がＤＮＡ部片を分離するのに使用さ れた。ＰＣＲ増幅がパーキン−エルマー／シータスイントウルメンツ（ノーウオ ーク、アメリカ合衆国）からのＤＮＡ熱サイクラ−およびＴａｑ　ＤＮＡポリメ ラーゼを使用して実施された。オリゴヌクレオチドリンカーおよびプライマーが 固体組上で亜燐酸塩トリエステル方法を使用してファーマシア（ウプサラ、スエ ーデン）からのファーマシア＝ＬＫＢジーン・アセンブラ−・プラス上で合成さ れた。ヌクレオチドシーケンス測定が、アプライド・バイオシステム（アメリカ 合衆国）からのツク・ダイデオキシ（商標）・ターミネータ・サイクル・シーケ ンシング・キットを使用して、アプライド・バイオシステム３７３ＡＤＮＡシー ケンサ−で実施された。

使用されたＤＮＡコンピュータプログラム。マツキントラシュ・プログラム・プ ラスミドアーティスト（バージョン１．２）（クロンチック、アメリカ合衆国） がプラスミド・マツプを引き出すのに使用されそしてＧＣＧシーケンス・アナリ シス・ソフトウェア・パッケージ（ジエネテイツクス・コンピュータ・グループ 社、ウィスコンシン州マジソン、アメリカ合衆国）がデジタル■ＡＸコンピュー タ上でＤＮＡシーケンスを取り扱うのに使用された。

バクテリア中のＡｐｏＡｌ−Ｍの構造、表現および分泌。

ベクター構造の目的は成長媒体中に分泌された非常に高いレベルのＡｐｏＡｌ− Ｍを有するＥ、ｃｏｌｉ中でＡｐｏＡＩ−Ｍ用の製造分泌系を得ることであった 。

２つのオリゴヌクレオチドがＡｐｏ　ＡｌおよびＡｐＯＡ　ｌ　−Ｍ　ｃ　Ｉ） ＮＡ複製をバクテリア信号シーケンスを記号に変える１つＮＡ部片へ溶融するた めに合成された。１４ｂｐ　Ｅｃｏ　ＲＩおよびＮｃｏ　１部片およびｐ　Ｋ　 Ｐ　５７５の４０ｂｐ　Ｎｃｏ　Ｉ部片がｐＫＰ５８０と指定されたプラスミド へ合成３７ｂｐ　Ｅｃ。

ＲＩ　Ｎ　ｃ　ｏ　Ｉ部片により置き換えられた。この合成りＮＡ部片において Ｂｂｓ　Ｉ分裂部位はバクテリア信号シーケンスを記号に変える種々の部片のク ローニングを容易にするＭ　Ｌ　ＬＪ　Ｉと同一の分裂部位を付与する。プラス ミドｐＫＩ）６３］かｐＫＰ５７５　（Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ）の７０２ｂｐＮｃｏ ｌ−Ｉ）ｒａ　Ｉ　Ｉ　１部片によりｐ　Ｋ　Ｐ５７５　（Ａｐｏ　Ａｌ）の７ ０２ｂｐＮｃｏ１．Ｉ−ＤｒａＩ１１部片を置き換えることにより構成された。

プラスミドｐＫＰ６３１から８２０ｂｐ　Ｂｂｓｌ−Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ部片 が分離されかつｐ　Ｋ　Ｐ　６８２と指定されたプラスミドベクターのＭ］ｕＩ およびＨｉｎｄＩＩＩにおいて挿入された。このベクターはｔ、ａｃ−促進剤（ Ｐｔ、ａｃ）、ｏｍｐＡ信号シーケンスの誘導体、２つの書き換えターミネータ −およびカナマイシン抵抗マーカーを含有する。１５０１ｂｐ　ＮｒｕＩ　−Ｎ ｒｕＩ部片がｐＫＰ６８２から分離されかつ同様なベクターに挿入されたがＰｔ ａｃとともにＰｔｒｃ促進剤により置き換えられた。この表現ベクターはｐＫＰ ６８３と指定された。

プラスミドｐ　Ｋ　Ｐ　７６４が、強力な書き換えターミネータ−を含有しかつ ３°端部を突出するＤｒａＩＩＩの端部においてＡの導入によりＤｒａＩ１１部 位を破壊する、１４　ｂｐ合成りＮＡ部片によりｐ　Ｋ　Ｐ　６８３の５ｓｂｐ ＤｒａＩ　Ｉ　ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉを置き換えることにより構成された。

Ｅ、ｃｏｌｉ菌株の変換は（サンプルツク氏等著、１９８９年、コールド・スプ リング・ハーバ−・ラボラトリ−・プレス）に記載されたように実施された。

表現実験およびＡｐｏＡｌ−Ｍの製造に使用されるプラスミド構造は制限酵素マ ツピングを使用して分析されかつＡｐｏＡｌ−Ｍの構造的遺伝子はヌクレオチド シーケンス測定により確認された。バイオリアクター中での成長に使用される適 切なプラスミドを有するＥ、ｃ。

１１菌株が以下のように調製された。細胞は３０℃で攪拌フラスコ中でＫｍによ り補完されたＬＢまたはＺｘＹＴ中で一晩成長させた。遠心分離後細胞はガーゲ ン氏等著、１９７９年、核酸研究、第７巻、第２１１５頁にしたがって１／２容 量の深い凍結貯蔵媒体中で再び懸濁された。部分標本が１ｍｌのクライオバイヤ ル中に分配されかつ使用されるまで一７５℃で貯蔵された。

バイオリアクター中で成長させられた細胞用の成長媒体。媒体Ａ：１６ｇ／ｌの トリプトン（ディフィコ、アメリカ合衆国）、８ｇ／ｌのイースト抽出物（ディ フィコ、アメリカ合衆国）、５ｇ／ｌのＮａＣ１、および０゜０５ｇ／ｌのカナ マイシン。媒体Ｂ：２．５ｇ／ｌ　（ＮＨ，）ｚ　Ｓｏ、　、３ｇ／ｌのＫＨ２ ＰＯ４，２ｇ／ｌのＫｚ　ＨＰ　０４．０　、　５　ｇ　／　ｌのＮａ３−クエ ン酸、５ｇ／ｌイースト抽出物（ディフィコ、アメリカ合衆国）。

殺菌後媒体はｌｏｇ／ｌの初期グルコース、０．０５ｇ／ｌのカナマイシン、１ ｇ／ｌのＭｇＳｏ４Ｘ７Ｈ２０および０．０７ｇ／ｌのチアミン塩酸塩により補 完された。微量元素溶液（ｌ　ｍ　ｌ　／　ｌ　）およびビタミン溶液（０，６ ５ｍ１／ｌ）が添加された。微量元素溶液は２７ｇ／ｌのＦｅＣ１ａ　ｘｅＨｚ 　０１４ｇ／ｌのＺ　ｎ　Ｓ　ＯａＸ７Ｈ２０，７ｇ／ｌのＣｏ　Ｃｌ　２　Ｘ 　６　Ｈａ　０１７ｇ／ｌのＮａｇ　ＭＯＯ４Ｘ２Ｈ２０，８ｇ／ｌのＣｕ５Ｏ 。

Ｘ５Ｈ２０，２ｇ／ｌのＨｓ　Ｂ　０３．５　ｇ／　ｌのＭｎＳｏｚＸ４Ｈｚｏ 、１１　ｇ／ｌＣａＧ１２Ｘ２１１２０および５０　ｍ　ｌ　／　ｌのＨＣＩを 含有した。ビタミン溶液は０゜５ｇ／ｌのカルシウムパントテン酸塩、０．５ｇ ／ｌの葉酸、１ｇ／ｌのイノシトール、０．５ｇ／ｌのニコチンアミド、０．５ ｇ／Ｌのピリドキシン塩酸塩、０．０抗発泡剤として使用された。必要なとき、 さらに他の抗開泡剤の添加が培養中に行われた。

３．５リツトルのバイオリアクター中でのＲＶ３０８／　ｐ　Ｋ　Ｐ　６８３の 培養。深い凍結貯蔵培養が５００ｍ１の媒体Ａを定温放置するのに使用されそし て８〜１０時間３０℃で２１の調節されたエルシンマイヤーフラスコ中で予備培 養された。バイオリアクター作動容量の１０％に対応する接種物容量がバイオリ アクターに転換された。溶媒は２．５リツトルの作動容量を有する３、５リツト ルのバイオリアクター（ベラ−シュ・アーベー、ス工−デン）中で実施された。

温度は誘導前の成長相中３０℃でかつ次いで３７℃に上昇した。ｐＨは２５％ア ンモニアの溶液により７．　Ｏに維持された。通気量は１ｖＶｍに保持されかつ 溶解酸素均衡（Ｄ、　Ｏ，Ｔ、　）はインペラ速度を調整することにより３０％ に保持された。

初期グルコースが消費された後、グルコース供給バッチがグルコースの６０％溶 液を供給することにより装置をグルコース限界に保持して開始された。初期供給 量、０゜０４ｇ／分が３時間保持されかつ次いで徐々に３時間中に０．４ｇ／分 に増加された。細胞成長は光学濃度（ＯＤ）を追跡することにより監視された。

上清中のＡｐ。

Ａｌ−Ｍの濃度が放射免疫検定法（アポリポ蛋白質ＡＩ　ＲＩＡ１００キット、 商品番号１０９１５’２−０１、カビ・ファーマシア、スエーデン）により測定 された。

５８のＯＤにおいて、１６時間の培養後、蛋白質合成が０．５ｍＶＩＰＴＧを添 加することにより誘起されかつ温度は３７℃に増加した。誘起後４時間ＡｐｏＡ ｌ−Ｍの濃度は２．３ｇ／ｌでありそして追加の２時間後部度は２．５ｇ／ｌで あった。

３．５リツトルのバイオリアクター中のＢ　Ｃ５０／　ｐＫＰ７６４の培養。

培養は、カナマイシンがバイオリアクター媒体に添加されなかったことを除いて 、上記のごと〈実施された。６０のＯＤにおいて、１５時間後、ＩＩ）ＴＧが添 加されそして温度が上昇された。１０時間後上清中のＡｐｏ　Ａ１−Ｍの濃度は ３．７ｇ／ｌでかつ誘起後２２時間で、濃度は４．４ｇ／ｌであった。

３００リツトルのバイオリアクター中でのＢｅ　５０／ｐＫＰ７６４の培養。

１８０リツトルの作動容量を有する３００リツトルのバイオリアクター（ケモフ エルム・アーベー、スエーデン）が使用された。接種物は、攪拌フラスコ中の予 備培養時間が１４時間であったこと以外、３．５リツトルのバイオリアクター中 のＲＶ３０８／ｐＫ））６８３の成長のために上述されたごとく調製された。接 種物が１８リツトルの作動容量を有する５０リツトルのシードバイオリアクター に転換された。攪拌フラスコならびにバイオリアクター中で使用された溶媒は媒 体Ａてあった。シードバイオリアクター媒体は５ｇ／ｌのグルコースで補完され かつ温度は３０’Ｃであった。ｐ　Ｈおよび通気は３．５リツトルのバイオリア クター中でのＲＶ　３０８　／　ｐ　Ｋ　Ｐ　６８３の成長に関して上述したと 同様でかつり、　０．　’ｌ’。

は決して３０％以下ではなかった。培養が４のＯＤに達したとき、シードバイオ リアクターの内容物は３００リツトルのバイオリアクターに転換された。このバ イオリアクターにおいて媒体の温度、ｐＨおよび通気は３．５リツトルのバイオ リアクター中のＲＶ３０８／ｐＫＰ６８３の成長に関して上述されたと同様であ った。誘起の前にり、　Ｏ，”Ｉ’、はその最大までインペラ速度を増加するこ とによりかつその後空気圧を増加することにより３０％にまたはそれ以上に保持 された。誘起後４時間は】−５〜２０％のり、　Ｏ，Ｔ、　を生じる２バールに 上昇された。バイオリアクター中での１６時間の培養後培養が５１のＯＤを有し たとき、Ｉ　ＰＴＧが添加されかつ温度が３７℃に上昇された。

単量体および２量体としてのＡｐｏＡｌ−Ｍの濃度は、誘起後５時間で１．３ｇ ／ｌでありそして次の時間中、バイオリアクターは冷却される一方、ａｐｏ　Ａ ｌ−Ｍは１．５ｇ／ｌに上昇した。

存在する単量体は２量体に変換されかつ通常の方法により純化された。

ＮＥｆｉ−血漿からのＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａ！−Ｍｌ−Ｍが過負荷され た、非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて単一帯域を付与した。分析５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥにおいて、蛋白質の明らかな分子量は期待されたように５６ｋＤであった 。Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐ−ｏ　Ａｌ−Ｍは非還元の変性■ＥＦゲルにおいて、 ５．３〜５．６ｐｌ範囲に、少なくとも６個の異なる蛋白質帯域の存在により特 徴付けられる複雑な同形状パターンを示した。

Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ　（１，１ｍｇ／ｍ１）ＵＶスペクトルは ２９０．２ｎｍでの肩部により、２８０ｎｍで代表的な吸収度最大を示した（第 ７図）。

２８０　ｎ　ｍでの計算された蛋白質Ｅ（１ｃｍ、１％）は１６．９であった。

Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ　−Ｍ中のチロシン残留物の露出を評価するた めに、ＵＶスペクトルの第２誘導体分析がラゴーン氏等著、第２誘導体分光測定 による蛋白質中のチロシン露出の測定、バイオケミストリー、１９８４年、第２ ３巻、第１８７１頁乃至第１８７５頁に記載されたように実施された。第２誘導 体Ｕ■スペクトルは代表的にほば２８３および２９０．５ｎｍに中心が置かれた ２つの最小、およびほぼ２８７および２９５ｎｍに中心が置かれた２つの最大を 示した（第８図ないし第１０図）。自然のＡｐｏＡｌ−Ｍ／ＡｐｏＡｌ−Ｍおよ びＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐ。

Ａｍ−Ｍ＋ＤＭＰＣに関して計算されたチロシン露出（アルファ）の相対的な度 合いはそれぞれ０．７５および０．４９であった（表２）。

表２　Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ蛋白質の特性ＡｐＯＡｌ−Ｍ／Ａｐ ｏ　Ａｌ−Ｍ 分子量（ｋＤ）　５６．０ 等電点　５．３〜５．６′ ＵＶ分光測定： Ｅ（１ｃｍ、１％）　１６．９” チロシン露出（アルファ）０．７５２　０．４９２蛍光測定： Ｅｘｃ波長最大（ｎｍ）　２８０　２８０Ｅｍ波長最大（ｎｍ）　３４４　３３ ８ＣＤ分光測定 アルファーヘリックス％　５２，２’　６６．１３２　高い値が増加したチロシ ン露出を示す３　蛋白質濃度：　Ｏ，１ｍｇ／ｍ１ ４　蛋白質濃度：　１．１ｍｇ／ｍ１ Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ　（０，１ｍｇ／ｍｌ）励起および放出の 両蛍光スペクトルか記録された。

Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ中のトリプトファノール残留物の最大励起 波長は２８０ｎｍであり、そしてＤＭＰＣとの次の関係を変化しなかった。放出 スペクトル（２８０ｎｍにおいて励起）は３４４ｎｍの波長最大（第１１図）を 示し、１）ＭＰＣとの関係は最大で蛍光強度の２４％増加と関連しているこの最 大（３３８ｎｍ）の青に向かって移動を誘起した。

Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｉ−Ｍ遠ＵＶ　ＣＤスペクトルは２０８および２ ２２　ｎ　ｍでの代表的な最小およびほば１９５ｎｍの最大により特徴付けられ た（第１２図）。アルファーへリツクス内容物はＯ，１ｍｇ／ｍｌから１　、　 １　ｒｎ　ｇ　／　ｍ　ｌへ蛋白質濃度を上昇するにつれて著しく増加したく第 １２図、表２）。ＤＭＰＣとのＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ　（０，１ ｍｇ／ｍｌ）の関係は蛋白質アルファー螺旋構造のさらに他の上昇を誘起した（ 第１２図、表２）。

生産品の特徴付は方法 燐脂質１こよる定温放置 秤量された量のジミリストイルフオスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）がエタノー ルＮ、により蒸発された溶媒中に溶解され、残りの溶媒が２時間真空下で除去さ れた。

２０ｍＭ燐酸塩緩衝剤、ｐＨ７，４中のＤＭＰＣの分散は１００：ＩＤＭＰＣ／ Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａ１−Ｍモル比でＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ −Ｍ（０，１ｍｇ／ｍｌ最終）と混合された。

塩緩衝剤、ｐ）４７．４に対して透析されそして所望の蛋白質濃度に同一の緩衝 剤により希釈された。

Ａｐｏ　Ａ１．−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−ＭおよびＡｐ。

ＡＩ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ＋ＤＭＰＣ溶液の通常および第２誘導体Ｕ■スペク トルが、１．ｃｍ石英セルを使用して、２５℃でジャスコ・ニービデツク−６１ ０およびパーキン・エルマー・ラムダ−２分光計により記録された。チロシン残 留物のトポグラフ位置がラゴーン等（ラゴーン・アール、コロナ・ジー、パレス トリエリ・シー、セルピロ・エル、イレース・ジー著、第２誘導体分光測定によ る蛋白質中のチロシン露出の測定、バイオケミストリー１９８４年、第２３巻、 第１８７１頁乃至第１８７５頁）の等式にしたがって調査された。

アルファ＝　（ｒ、−ｒ、）／　（ｒ、−ｒ、）ここでアルファは溶媒に対する チロシン露出の度合い、ｒｏおよびｒｕはそれぞれ自然のおよび広げられていな い（６ＭＧｄｎ−ＨＣＩ）　Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐ。

Ａ　ｌ−Ｍに関する誘導体ピーク比であり、モしてｒ、はＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａ ｐｏ　Ａｌ−Ｍ中のモル比と同一のモル比において混合された自由チロシンおよ びトリプトファンを含有する溶液の第２誘導体ピーク比率である。

Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−ＭおよびＡｐ。

Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ±ＤＭＰＣ溶液の固有の蛍光スペクトルが２５℃で ジャスコＦＰ−５５０分光蛍光計上に記録された。

Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ＋ＤＭＰＣ溶液の円偏光二色性（ＣＤ）ス ペクトルが２５℃でジャスコＪ５００Ａ分光偏光計により記録された。平均残留 物楕同率値（ＴＨＥＹＡ）が度Ｘｃｍ”　Ｘｄ’ｍｏ　１　””　において表さ れかつ式、 ［ＴＨＥＹＡ）Ｘ　Ｉ　Ｏ６ により計算され、ここで（ＴＨＥＹＡ）は観察された楕円率（度）、１０６は蛋 白質の平均残留分子量、■は通路長さくｃｍ）、およびＣは蛋白質濃度（ｇ／ｒ ｎｌ）である。パーセントアルファーヘソックスは式、（ＴＨＥＹＡ）　２０８ ．、、、．４．０００％アルファーヘリックス＝−−一一−−−−−−−−−− −３３，０００−４，０００ により計算された（グリーンフィールド・エヌ、ファスマン・ジーディー著、蛋 白質確認の評価用の計算された円偏光二色性スペクトル、バイオケミストリー、 １９６９年、第８巻、第４１０８頁乃至第４１１６頁）。

凪笈迷壓 分析等電焦点合わせおよび５ＤＳ−’ＰＡＧＥが前述されたように実施された（ フランセシーニ・ジー、ジルトリ・エム、シャンフランセシ・ジー、ジルトリ・ シーアール著、Ａｌ−Ｍ異常による主題のＨＤＬアポ蛋白質とＡｌイソ蛋白質と の間の関係、メタボリズム、１９８１年、第３０巻、第５０２頁乃至第５０９頁 ）。

等電焦点合わせは６Ｍ尿素および４％アンフォリン（ｐＨ４〜６）を含有する１ ０％アクリルアミドゲルにおいて実施された。−晩の焦点合わせ後、ゲルは固化 されかつ酢酸／イソプロピルアルコール中でコーマシー・ブリリアント・ブルー Ｒ−２５０により汚された。未知の蛋白質帯域の等電点（ｐｉ）はそれぞれの移 動距離に対して既知の蛋白質（バイオ−ラドおよびアポＨＤＬからの標準）のｐ ｉをプロットすることにより計算された。

５ＤＳ−ＰＡＧＥに関して、０．１％ＳＤＳを含有する１４％アクリルアミドゲ ルが使用された。ゲルは記載されたように処理されかつ未知の蛋白質の分子量は 蛋白質標準（カビーファーマシア）対移動距離のｌｏｇＭＷのプロットから計算 した。

高性能サイズ除外クロマトグラフィ 分析ＨＰＳＥＣ分離が１０μｍのＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷコラム（７，５Ｘ３０ ０ｍｍ）を備えたジャスコ液体グロマトグラフイを使用して実施された。ＨＰＳ ＥＣコラムは均衡されかつ、８Ｍ尿素を含有する００１Ｍ燐酸塩緩衝剤、Ｏ，Ｌ Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ７，２により流出された。蛋白質は０．５ｍｌ／分の流量で 流出され、そして読み取りは２２０ｎｍで行われた。ピーク区域はＨＰ−３３９ ０積分器を使用して積分された。

再構成された高密度リボ蛋白質粒子（ｒ　］−（Ｄ　Ｌ　）がニコルス・エーヴ イ等著、ビオケミカル　ビオフィジカルアクタ、第７５０巻、第３５３頁乃至第 ３６４頁（１９８３年）およびマツツ・シーイー等著、ビオロギックケミカル　 ジャーナル、第２５７巻、第４５３５頁乃至第４５４１頁（１９８２年）により 提示された技術を使用して製造された。

組換え型Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ２量体（例４から）およびヒト血漿から純化された通 常のＡｐｏ　Ａｌが、６ｍｇ／　ｒｎ　ｌの濃度で４Ｍ　Ｇｄｎ−ＨＣｌを含有 する１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、０．１５Ｍ　Ｎａ１ｌ、０．０１％ＥＤＴＡ、 ０．００６％Ｎ　ａ　Ｎ　ｓ　ｒ　ｐ　Ｈ８、０（緩衝剤Ａ）中に溶解された。

比較のために、ＡｐｏＡｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ　−Ｍの幾つかの二硫化結合が緩 衝剤Ａ＋Ｇｄｎ−ＨＣｌへの２０ｍＭ　ＤＴＴの添加により還元された。蛋白質 は緩衝剤へに対して広範囲に透析され、そして同一の緩衝剤により５．２ｍｇ／ ｍｌに希釈された。

燐脂質、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）またはバルミトイルオレイルホスフ ァチジルコリン（ＰＯＰＣ）がＣ）ＩＣｌ３中に溶解され、Ｎ２により乾燥され そして真空下で一晩保持された。ナトリウムコール酸塩が０゜５５（ｗ／ｗ）ノ コール酸塩／ＰＣ比で添加され、混合物は室温で３分間激しく攪拌され、そして ４℃で２時間定温放置された。蛋白質は次いで２．１７　（ＰＯＰＣ）または２ ．４７　（ＥＰＣ）のＰＣ／蛋白質重量比で添加され、そして混合物が室温で３ 分間攪拌されかつ４℃で一晩定温放置された。５日間緩衝剤Ａに対する透析後、 混合物はベックマン・マイクロフユージ中で５分間１１゜０００ｒｐｍで遠心分 離されかつ上清が集められた。

ｒＨＤＬが非変性ポリアクリルアミン・グラジェント・ゲル電気泳動（ＧＧＥ） により分離され、そして粒子サイズがニコルス・エーヴイ等著、酵素学、第１２ ８巻、第４１７頁乃至第４３１頁（１９８６年）により前述されたように測定さ れた。

試験されたすべてのアポリボ蛋白質は、ＧＧＥゲル上で脂質の無いアポリボ蛋白 質の非常に小さいピークにより示されるように、記載した手順後脂質とほぼ完全 に関連付けられた。ｒＨＤＬ中の蛋白質の回収は１０個の異なる調製において６ ８％ないし１００％の間で変化した。

再構成されたＨＤＬ粒子のＧＧＥ外観は第１３図に示されている。Ａｐｏ　Ａｌ およびＥＰＣにより再構成されたＨＤＬ９．６ｎｍの直径により、ＧＧＥ上で大 きなピークを付与し、より大きいかつより小さいサイズの小さい成分がまた検出 可能であった。ＥＰＣおよびＡｐ。

Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍを含有するｒＨＤＬは２つの大きなく直径：８．６ および１２．９ｎｍ）および２つの小さな（直径７．９および１０．８ｎｍ）成 分（第１３図）からなり、同一の粒子サイズがＡｐｏ　Ａ１−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ −ＭがＰＯＰＰＣにより再構成されたとき得られた。

全部で３つのアポリボ蛋白質が異なるｒＨＤＬ粒子すイズ、分布および組成によ り安定な脂質−蛋白質にほぼ完全に組み込まれた。とくに、組換え型Ａｐ。

Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍにより作られたｒＨＤＬは２つの大きな成分からな り、大きい方の成分はＡｐ。

Ａ１含有ｒ　ＨＤ　Ｌのグループ中で独特である。

Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍの生物学的評価２量体は以下のヒト運動研 究に示された計算において延長された永続性を表示する。

健康なボランティアが静脈内に“２８　１−を付したＡｐｏ　Ａｌ−ＭまたはＡ ｐｏＡｌ−Ｍを受容した。表３に示されるように、血漿βＬｌ／２　（ｈ）は２ つの異なるモデル、ならびに分別異化量（ＦＣＲ）により計算した。

これら両方は２量体対単量体の顕著に減少した異化作用を確認する。Ａｐｏ　Ａ ｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍの非常に遅い異化作用はこれらの分子がリポ蛋白質変 換を損ないかつ多分ＡｐｏＡｌ−Ｍ用の有効な先駆物質として作用することを示 す。この方法においてＡｐｏ　Ａｔ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍの注入により２量体 が延長された期間にわたって血漿中に残留することができ、かくしてリポ蛋白質 異化作用および繊維素溶解系と直接相互作用すると予測することができる。

Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ　Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍモノ指数モード　βｔ ｌ／２　１．６．　０７　５２．　０４ＭＲＴ　２３．１９　７５．０９ （ｈ） パイ指数モード　βｔｌ／２　２２，６１　７０．２９（’ｈ） ＭＲＴ　２８，９７　８９．１６ （ｈ） ＦＯＲ２，３％／時間　１．１％／時間（ｈ） 繊維素溶解系についてのＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／ＡｐｏＡｌ−Ｍの作用 序文 繊維素溶解系は血管壁上への繊維素堆積に対する主要な防御手段でありそして血 栓症を防止するメカニズムの間で重要な役割を演する。

繊維素の溶解を引き受ける酵素はプラスミンである。

プラスミンは特殊な活性体（組織プラスミノーゲン活性体、ｔ−ＰＡおよびウロ キナーゼ、ｕＰＡ）の作用により不活性先駆物質プラスミノーゲンから形成され ている。

活性方法およびプラスミンの作用双方が特殊な禁止剤−それぞれ、プラスミノー ゲン活性体禁止剤１　（ＰＡＬ）およびアルファ２−アンチプラスミンにより調 整される。

繊維素溶解系の概要は以下に示されている。

プラスミノーゲン 活性体 繊維素　ＦＤＰ ＦＤＰ＝繊維素減成生成物 例７〜９の本調査の目的はＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ２２量がヒト繊維素溶解系にどのよ うに影響を及ぼすかを見い出すことであった。プラスミノーゲンの自己賦活およ びＵＰＡおよびし−ＰＡによるその活性がＡｐｏＡｌ−Ｍ／ＡｐＯＡｌ−Ｍの存 在および不存在において研究された。血漿から分離されたヒトＡｐｏ　Ａｌは制 御剤（シグマ、製品番号Ａ９２８４）として使用された。

繊維素溶解系の活性は発色体基板の助けにより測定された。これらの基板はプラ スミンの作用により基板分子から分裂させることができるバラニトロアニリンの 発色団を含有する。自由なｐ−ＮＡは４０５ｎｍの波長で容易に追随され得る強 い黄色を有する。解放されたｐ−ＮＡの量は発生された酵素活性の量に直接比例 する。すべての測定は、アメリカ合衆国、カリフォルニア、メン口・パークのモ レキュラー・デバイスイズのソフトマックス（商標）・プログラム・バージョン ２．０１により制御されたテルモマックス・マイクロプレート・リーダーを使用 して得られた。

これらの研究において使用されたバッチは例４にしたがって組換え型で製造され た。純化はその後に超濾過および凍結乾燥−すべで通常の生物学的方法がおこな われたイオン交換、疏水性物質相互作用およびゲル濾過グロマトグラフイを含ん だ。調査されたすべてのバッチは、逆転位相のＨＰＬＣにより示されるように、 ２量体形状の≧９０％を含有した。濃度はカビ・ファーマシア・アポリポ単量体 ＡＩ　ＲＩＡ１００試薬を使用して測定された。

３つの調剤Ａ、ＢおよびＣが調査された。

例８　Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／ＡｐＯＡ１−Ｍおよ臥１ｏＡｌの存在におけるプラス ミノーゲンの自己賦活Ｇｌｕｌブースミノーゲン（９４μｇ　／　ｍ　Ｌ、最終 濃度）が０．ｌｏｌ／Ｌのトリス緩衝剤ｐＨ７，６中で３７°Ｃで３時間定温放 置された。プラスミン発生器は、クロモジエエックス・アーベー、スエーデン国 ムルンダルにより得られた、Ｓ−２２５１発色体基板（Ｈ−Ｄ−Ｖａ　１−Ｌ− Ｌｅｕ−Ｌ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ）により追跡された。それは０．６ｍｍｏｌ／Ｌの 最終濃度で使用された。これらの分析評価に適用されたプラスミノーゲンはクロ モジエエックス・アーベーまたばＩ　Ｍ　ＣＯ社、スエーデン国ストックホルム から得られた。

Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ　（最終濃度３゜９〜７５μｇ／ｍＬ）の バッチがこの分析評価において試験されそしてそれらの存在において発生された プラスミンの量がＡｐｏ　Ａｌ　（１２５μｇ／ｍＬ最終濃度）の存在において 発生されたプラスミンの量および添加物（制御剤）の不存在において発生された プラスミンの量と比較された（表４）。

Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍがプラスミノーゲン活性体の不存在におい てプラスミノーゲン活性を高め得ることが意外にも見い出された。血漿誘導Ａｐ 。

Ａ１はとにかくプラスミノーゲン分子に影響を及ばさなＡ　ｐ　ｏ　Ａ　１−Ｍ ＬＡ　ｐ　ｏ　Ａ１４ｇよびＡｐｏ　Ａｌのイ個里ユノ１０５ｎ１０５ｎとして 表されるプラスミン活性。

サンプル　Ａｐｏ最終濃度　ＯＤ４０５ｎｍ制御剤　０　０．０５２ ＋ＡｐｏＡ１　１２５　０．０４９ ＋Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−ＭＡ　７５　０，２８８ Ｂ　３１，５　０．３２５ Ｂ　１５．６　０，１５３ Ｂ　７．　８　０．　１０４ Ｂ　３．９　０，０６７ 観察された活性はＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ、’Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍに帰せられる得る。し かしながら、これらのデータを基礎にして、Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ− Ｍがプラスミノーゲンを活性化し得る幾つかの蛋白質分解酵素により汚染される ことは無視し得ない。実験はこの可能性を排除するために行われた。

繊維素溶解分析評価に使用されるすべてのＡｐｏ　Ａ１−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ 調剤がプラスミン場活性に感応する発色体基板Ｓ−２２５１（Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ− Ｌ　−Ｌｅ　ｕ−Ｌ−Ｌｙ　ｓ　−ｐＮＡ）およびＡｒｇ−特殊プロテアーゼに 感応するＳ−２２８８（Ｈ−Ｄ　−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）により試 験された。基板はグロモジエエックス・アーベーから得られた。分析評価におけ るＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍの最終濃度は繊維素溶解分析評価におい て使用された濃度と同一でありかつしたがって異なるバッチ間で可変であった。

分析評価：　２５μＬ　Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ最終濃度６０〜７ ０μｇ／ｍＬ １５０μＬ　Ｏ，１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝剤ｐＨ７，８５０μＬ　Ｓ−２２５１ ０，６ｍｍｏｌ／ＬまたはＳ−２２８８１，０ｍｍｏｌ／Ｌ 緩衝剤および基板のみを含有するサンプルが特殊でない基板加水分解用制御剤と して使用された。すべてのサンプルは全く同一に分析評価された。

マイクロタイター（微小滴定濃度）板が３７℃で定温放置されかつ吸収度が時間 的間隔で読み取られた。

Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ　基板Ｓ−２２５１Ａ　０，０２３　０， ０２２Ｂ　０．０２２ Ｓ−２２８８Ａ　０．０３７　０．０３４Ｂ　Ｏ，０３７ 他のシリーズの実験においてＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ　−Ｍは血清プロ テアーゼの不可逆性禁止剤−ジイソプロピルフルオロフォスフェート、ＤＦＰ　 （シグマ製品番号ＤＯ７８９）により処理された。０．２ｍｏｌ／Ｌ　ＫＨＣ○ ３ｐＨ７，６中のＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／ＡｐｏＡ１−Ｍの最終濃度はほぼ７５μｇ ／ｍＬであった。Ｉ）　Ｆ　Ｐ、１２３ｍｍｏｌ／Ｌ、最終濃度がこの溶液に添 加された。４時間後定温放置サンプルはカーボネート緩衝剤の２つの変化に対し て一晩透析された。

以前に記載されたと同一の条件を使用する、活性測定はＤ　Ｆ　Ｐ処理Ａｐｏ　 Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍおよび未処理のＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ− Ｍについて行われた。プラスミノーゲンおよびＳ−２２５１による３時間後、４ ０５ｎｍでのＯＤはＤＦＰ処理Ａｐ。

ＡＩ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍを含有するサンプルに関して０，２０９、未処理Ａ ｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍを含有するサンプルに関して０．２３４そし てプラスミノーゲンのみを有するサンプルに関して０．０３０であった。

かくして、観察されたプラスミノーゲン活性作用がＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　 Ａｌ−Ｍの存在と直接関連付けられかつ潜在蛋白質分解汚染物質によらないと結 論付けることができる。

ウロキナーゼ（ｕＰＡ）および組織プラスミノーゲン活性体（ｔ−ＰＡ）は両方 ともプラスミノーゲン分子中の単一ペプチド結合Ａｒｇ５６０−Ｖａ１５６１の 蛋白質分解分裂によりプラスミノーゲンをプラスミンに変換する。２つの鎖のウ ロキナーゼがプラスミノーゲンを直接活性化し得る一方、ｔ−ＰＡはプラスミノ ーゲンのその最適な活性化に関して繊維素の存在を要求する。１−ＰＡおよびプ ラスミノーゲンとともに３成分の複合体を形成する触媒量の繊維素の存在はｔ− ＰＡの酵素効率をほぼ６００倍に増加する。

ｔ−ＰＡによるプラスミノーゲンの活性化はバイオブール・アーベー（スエーデ ン国ウメ−）からの市場で入手可能なキット、スペクトロリゼ（商標）（繊維素 ）ｔ−ＰＡ／ＰＡＬを使用して研究された。

この分析評価においてプラスミノーゲンは発色体基板、Ｄ−Ｂｕ　ｔ−ＣＨＴ− Ｌｙｓ−ｐＮＡおよび活性刺激剤として作用するｄｅｓＡＡフィブリノーゲン（ 繊維素単量体）の存在においてｔ−ＰＡにより定温放置される。

発生されたプラスミンは、ｐＮＡを解放して、基板を分裂する。

Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍがこの系に添加されそしてシグマからのＡ ｐｏ　Ａｌ調剤と比較された。

両アポリポ蛋白質の作用は繊維素の存在および不存在両方において系中で試験さ れた。

分析評価系のサンプル： ２５μＬ　スペクトロリゼ緩衝剤 ２５μＬ　Ａｐｏ調剤または緩衝剤 ２０μＬ　ｔ−ＰＡ　（＝１，７１Ｕ／ｍＬ、最終濃度）］、　５０μＬ　スペ クトロリゼＰＡＲ試薬（＝プラスミノーゲンおよび基板の混合物） １０μＬ　Ｄｅｓａ　ｆｉｂ　（＝繊維素単量体）または１０μＬ　緩衝剤 サンプルは３時間３７℃で微小滴定濃度板上で定温放置された。

未６　繊維素の存在および不存在におけるｔ、−ＰＡによるプラスミノーゲン活 性についてのＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／人ｐｏＡＬ−ＭおよびＡｐｏ　Ａ１の作用。結 果は４０５ｎｍにおいて３７℃で３時間後の、○Ｄとして表されている。

サンプル　Ａｐｏ　Ａｌ最終濃度ＯＤ４０５ｎｍ　ＯＤ４０５ｎｍ＋Ａｐｏ　Ａ ｌ　５４　１．０５０　０．０６６＋Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／ＡｐｏＡｌ−Ｍ Ａ　６５　１．６６５　０．４４６ Ｂ　５４　２．３６６　０．２２５ プラスミノーゲン活性の顕著な刺激は繊維素の存在および不存在双方において、 Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐ。

Ａ　ｌ−Ｍにより観察された。Ａｐｏ　Ａｌは繊維素の存在においてより少ない 度合いに活性を刺激した。繊維素の不存在においてＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　 Ａｌ−ＭはＡｐｏ　Ａｌによる非常に小さい刺激に比して非常に明白にされた。

Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−ＭはまたプラスミノーゲンがｕＰＡにより活 性化されるとき顕著な薬効増強作用を有した。これらの分析評価に使用されたウ ロキナーゼはカルビオケムから得られた高分子量調剤であった。

ウロキナーゼ（２，５１Ｕ／ｍＬ　最終濃度）がプラスミノーゲン（９４μｇ　 ／　ｍ　Ｌ　最終濃度）および発色体基板Ｓ−２２５１（０，６ｍｍｏ　１／Ｌ 　最終濃度）と混合された。このサンプルにＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／ＡｐｏＡｌ−Ｍ が７５または６２μｇ／ｍＬ　最終濃度で添加された。反応はＯ，１ｍｏｌ／Ｌ ）リス緩衝剤、ｐＨ７，６中で実施された。

ｔ−ＰＡと同様に、ウロキナーゼによるプラスミン発生の潜在力刺激は、Ａｐｏ 　Ａｌ−Ｍ／ΔｐｏＡ１−Ｍが分析評価に添加されたとき観察された（表７）。

表１−−−毘」八によ擾プラス宋ソーゲン活性←２いてのへｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａ ｐｏ　Ａｌ−Ｍの作用。結果は４０Ａｐｏ　Ａ１．−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍサン プル　最終濃度　○Ｄ４０５ｎｍ μｇ　／　ｍ　Ｌ ｕＰＡ制御体　０　０．３２５ ＋Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−ＭＡ　７５　１．２６３ Ｂ　６２　１．８６８ 繊維素溶解についてのこの薬効増強作用はまたＡｐ。

Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍがキャリヤとともに薬剤組成に調合されたとき持続 した。潜在的なキャリヤとしてフオスファチジルコリン゛、ＰＣ（Ｌ　２ｒｎｇ ／ｍＬ）からなるリポソームが使用された。リポソーム中のＡｐ。

ＡＩ　Ｍ／Ａｐｏ　ＡＩ　Ｍ（バッチＣ）の濃度は３゜６ｍｇ／丁ｎ　１．、で あった。

ｕＰＡ　（２，５１Ｕ／ｍＬ　最終濃度）によるプラスミノーゲン（９４μｇ　 ／　ｍ　Ｌ　最終濃度）の活性化がＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ充填リ ポソームの存在において試験されかつ蛋白質の無いリポソームの存在において行 われた活性化と比較された。サンプルはＳ−２２５１により３７℃で４時間定温 放置されかつプラスミン発生が連続して追随した。

サンプル　ＯＤ４０５　ｎｍ ｕＰＡ＋プラスミノーゲン　０，２２１＋蛋白質の無いリポソーム　０．４９９ ２５０μｇ／ｍＬ’　ＰＣ リポソーム、２５０μｇ　／　ｍ　Ｌ中のＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ ７５μｇ／ｍＬ　ＰＣ１，０８４ リポソームの存在はほぼ２倍にプラスミノーゲン活性化を単に刺激した。リポソ ームへのＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／ＡｐｏＡ１−Ｍの添加はウロキナーゼ活性体のみを 含有するサンプルに比してこの作用を５倍に増加した。

単鎖のウロキナーゼ（ｓｃｕＰＡ）は２つの鎖のウロキナーゼ（ｕＰＡ）の先駆 物質である。ｕＰＡに対して５ｃｕＰＡは小さい合成基板に向かって非常に低い アミド分解活性のみを有する。アミド分解活性はｕＰＡの活性のほぼ０．４％で ある。しかしながら、５ｃｕＰＡは、プロ酵素であるにも拘わらず、プラスミノ ーゲンをプラスミンに活性化する能力を有する。プラスミノーゲンおよび５ｃｕ ＰＡの混合物において３つの反応のシーケンスがプラスミンへのプラスミノーゲ ンの活性化に伴われることが提案された。

１）ｓｃｕＰＡ＋プラスミノーゲンー−＊５ｃｕＰＡ＋プラスミン ２）プラスミン＋５ｃｕＰＡ−−１プラスミン＋ｕＰＡ３）ｕＰＡ＋プラスミノ ーゲン−→ｕＰＡ＋プラスミンプラスミノーゲンの存在においてｕＰＡへのｓ　 ｃｕＰＡの変換に至る反応のシーケンスを研究した。ウロキナーゼ活性はウロキ ナーゼ特殊発色体基板Ｓ−２４４４（ｐ　ｙ　ｒ　ｏ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　ｌ　ｙ −Ａ　ｒ　ｇ　−ｐＮＡ、クロモゲエックス・アーベー）の助けにより検出され た。Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−ＭおよびＡｐｏ　Ａｌのバッチが系に添 加されかつ活性と比較される発生されたｕＰＡ活性の量がアポリボ蛋白質添加な しのサンプル中に得られた。これらの分析評価に使用された単鎖のウロキナーゼ はドイツ、アーヘンのグリュネンタール・ゲーエムベーハーから得られた組換え 型製品（ロット番号００８８８０８）であった。

２５μＬ　Ａｐｏまたは緩衝剤 ０．１ｍｏｌ／Ｉ　ＮａＣ１および０．０２％ツイーン８０を含有する、７５μ Ｌ　０，０５ｍｏｌ／ＬトリスｐＨ７，６ ５０μＬ　Ｓ−２４４４，１ｍｍｏｌ／１　最終濃度２５μＬ　プラスミノーゲ ン、５２．１ｎｍｏｌ／Ｌ最終濃度 サンプルは９０分間３７℃で定温放置された。発生されたｕＰＡＯ量を測定する 、光学濃度の増加は定温放置の最後の３０分の間中連続して記録された。

表９　ｕＰＡへの５ｃｕＰＡの変換についてのＡｐ。

Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍの作用。結果は４０５ｎｍでｍ　ＯＤ　／分として 表されている。

サンプル　Ａｐｏ最終濃度　ｍＯＤ／分＋プラスミノーゲン　０　１３．２ ＋ＡｐｏＡ１　６２　１１．８ ＋ＡｐｏＡｌ−Ｍ／ＡｐｏＡｌ−Ｍ Ｂ　６２　２０．Ｏ Ａ　７５　２４．０ プラスミノーゲンの存在においてｕＰＡへのｓ　ｃｕＰＡの変換はＡｐｏ　Ａｌ −Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍにより刺激され、これに反して血漿から分離されたＡｐ ｏ　Ａ１はこの系において顕著な作用を持たなかった。

これらの研究に使用された繊維素溶解分析評価についてのＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａ ｐｏ　Ａｌ−Ｍの観察された作用は血漿から分離されたＡｐｏ　Ａｌにより見ら れた作用に比して高められた。Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐ。

Ａ　ｌ−ＭはＡｐｏ　Ａｌを超える繊維素溶解活性を刺激するような潜在能力を 有する。Ａｐｏ　Ａｌを超えるＡｐｏ　Ａｌ−Ｍ／Ａｐｏ　Ａｌ−Ｍのこの高め られた作用はまた生体外で見い出されると思われる。

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ＤＫ、ＥＳ、ＰＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ 、ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ。

Ｃ３，ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　Ｌ Ｕ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　ＮＯ、ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、Ｒ○、　Ｒ Ｕ、ＳＤ、ＳＥ、　ＵＡ。

（７２）発明者　ホルムグレン　エリックスウェーデン国、ニス−１８１４１リ デンゴ、ロヨバーゲン　３ ＦＩ Ａ６１Ｋ　３７／２２　ＡＢＮ ＤＮ （７２）発明者　ラーク　マッツ スウェーデン国、ニス−１８１４１リデンゴ、トレガータン　１７ （７２）発明者　ミルソン　ポールン スウェーデン国、ニス−１９１７３ソレンチナ、トルキルス　バッグ　９ （７２）発明者　ケミエレウスカ　ヨアンナスウェーデン国、ニス−１１２６４ ストックホルム、エクナスバーゲン　４　ニー（７２）発明者　リント　ピータ ー スウェーデン国、ニス−７５２２７ウプサラ、リンガ−タン　４７　シー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ほぼ純粋な形状におけるアポリポ蛋白質−Ａ１ミラノの２量体。 ２）少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９８％の純度を有することを特徴 とする請求の範囲第１項に記載のアポリポ蛋白質−Ａｌミラノの２量体。 ３）血漿から引き出すことを特徴とする請求の範囲第１項に記載のアポリポ蛋白 質−Ａ１ミラノの２量体。 ４）組換え型で製造されたことを特徴とする請求の範囲第１項に記載のアポリポ 蛋白質−Ａ１ミラノの２量体。 ５）キヤリヤとともに請求の範囲第１項に記載の２量体からなることを特徴とす る薬剤組成物。 ６）任意にキヤリヤを有する安定化剤とともに請求の範囲第１項に記載の２量体 からなることを特徴とする薬剤組成物。 ７）脂質低下剤およびキヤリヤとともに請求の範囲第５項または第６項に記載の 薬剤組成物。 ８）任意に脂質低下剤と任意にキャリヤとを有する安定脂質化合物とともに２量 体からなることを特徴とする請求の範囲第５項に記載の薬剤組成物。 ９）任意に脂質低下剤と任意にキヤリヤとを有する、燐脂質を有することを特徴 とする請求の範囲第５項に記載の薬剤組成物。 １０）（ａ）Ｅｃｏｌｉ中の細胞内溶融蛋白質として組換え型技術によリアポリ ポ蛋白質Ａ１−ミラノを製造し、ギ酸によリアポリポ蛋白質Ａ１−ミラノから分 裂しかつその後存在する単量体を２量体に変換することによるかまたは （ｂ）アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノ、単量体および２量体がＥｃｏｌｉおよび２ 量体にその後変換される存在する単量体中の表現系統においてバクテリア培養媒 体に分泌される組換え型技術によリアポリボ蛋白質を製造するかまたは （ｃ）アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノキャリヤから血漿を集め、ＨＤＬアポリポ蛋 白質を分離し、幾つかの段階において、クロマトグラフィの使用により、例えば 、セフアクリルクロマトグラフイによリ２量体を分離するかまたは （ｄ）アポリポ蛋白質Ａ１−ミラノキャリヤから血漿を集め、単量体を純化しか つその後２量体に変換しそして２量体をほぼ純粋な形状に純化することにより得 られることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の２量体の製造方法。 １１）アテローム性動脈硬化症および心臓血管疾患の治療のための２量体からな る薬剤の製造における請求の範囲第１項に記載の２量体の使用。 １２）単量体用のアテローム性動脈硬化症および心臓血管疾患の治療用の前駆薬 として作用する２量体からなる薬剤の製造における請求の範囲第１項に記載の２ 量体の使用。 １３）心筋梗塞、不安定なアンギナ、急性周辺血管閉鎖および冠状血管形成術後 のレステノシスのごとき主要な心臓循環器系の病気の防止および治療のための請 求の範囲第１１項または第１２項に記載の使用。 １４）慢性の動脈の病気の治療のための請求の範囲第１１項または第１２項に記 載の使用。 １５）血栓症の防止および治療のための請求の範囲第１１項または第１２項に記 載の使用。 １６）繊維素溶解の刺激のための請求の範囲第１５項に記載の使用。 １７）前記薬剤がまた脂質低下剤を含有することを特徴とする請求の範囲第１１ 項または第１２項に記載の使用。 １８）任意に治療に積極的な量において添加されたキヤリヤ、安定化脂質化合物 および／または脂質低下剤とともに治療に積極的な量において請求の範囲第１項 に記載の２量体を投与することを特徴とするアテローム動脈硬化症および心臓血 管疾患の治療方法。