PL172168B1

PL172168B1 - Sposób wytwarzania dimeru Apolipoproteiny Al-Milano PL PL PL

Info

Publication number: PL172168B1
Application number: PL92314896A
Authority: PL
Inventors: Cesare Cirtori; Guido Franceschini; Lars Abrahmsen; Erik Holmgren; Mats Lake; Bjoern Nilsson; Joanna Chmielewska; Peter Lind
Original assignee: Kabi Pharmacia Ab
Priority date: 1991-12-13
Filing date: 1992-12-11
Publication date: 1997-08-29
Also published as: IL103956A; NO315076B1; CA2103996A1; IL103956A0; BG61451B1; US5876968A; PL300262A1; DE69233092T2; ATE242269T1; CZ158993A3; FI933557A0; AU703283B2; PT571602E; PL172544B1; NO932866L; NZ280516A; FI933557A; HUT70270A; RU2134696C1; AU3175593A

Abstract

1. Sposób wytwarzania dimeru Apolipoproteiny Al-Milano o czystosci co najmniej 90%, znamienny tym, ze zbiera sie osocze od nosicieli Apolipoproteiny Al-Milano, oczyszcza sie monomer przez wprowadzenie roztworu zawierajacego Apolipoproteine Al-Milano do kolumny Thiopropyl-Sepharose i eluowanie 2-merkaptoetanolem i nastepnie oczyszczony monomer przeprowadza sie w dimer i dimer oczyszcza sie konwencjonalnymi metodami. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania czystego dimeru Apolipoproteiny AlMilano (Apo Al-M/Apo Al-M). Produkt można stosować do leczenia miażdżycy tętnic i chorób sercowo-naczyniowych, również jako środek zawierający Apo Al-M o opóźnionym działaniu.

Wyraźna zależność pomiędzy podwyższonym poziomem cholesterolu i rozwojem choroby wieńcowej serca (CHD) była wielokrotnie potwierdzona w oparciu o badania epidemiologiczne i przekrojowe. Jednak określenie złożonych mechanizmów transportu cholesterolu w osoczu pozwoliło na rozpoznanie selektywnej funkcji cyrkulujących lipoprotein w określeniu ryzyka zachorowania na CHD.

Są cztery główne cyrkulujące lipoproteiny: chylomikrony (CM), lipoproteiny o bardzo małej gęstości (VLDL), lipoproteiny o małej gęstości (LDL) i lipoproteiny o dużej gęstości (HDL). Podczas gdy CM są krótkotrwałym produktem jelitowej absorpcji tłuszczu, VLDL a zwłaszcza LDL są odpowiedzialne za transport cholesterolu do tkanek, w tym np. do ścianek tętnic. Przeciwnie HDL są włączone bezpośrednio w usuwanie cholesterolu z tkanek obwodo-wych i przenoszenie go z powrotem do wątroby albo do innych lipoprotein poprzez mechanizm znany jako “odwrotny transport cholesterolu” (RCT).

“Ochronna” rola HDL została potwierdzona w kilku badaniach (np. Miller i in., Lancet, 1977,965-9681 Whayne i in. Atherosclerosis, 1981,39,411-419). Na podstawie tych badań wydaje się, że podwyższone poziomy LDL w mniejszym stopniu niż VLDL są wyraźnie związane ze zwiększonym ryzykiem zagrożenia chorobą sercowo-naczyniową, natomiast wysoki poziom HDL chroni przed tymi chorobami. Ochronna rola HDL została mocno poparta badaniami m vivo, wykazującymi, że infiizja HDL królikom może hamować rozwój uszkodzeń tętnic wywołanych cholesterolem (Badimon i in., Lab. Invest. 60,455-61,1989) i lub wywoływać ich regresję (Badimon i in., J. Clin. Invest. 85, 1234-41, 1990).

Ostatnie zainteresowania w badaniu mechanizmu(ów) ochronnych HDL skupiły się na apolipoproteinie Al (Apo Al), głównym składniku HDL. Wysoki poziom Apo Al w osoczu jest związany z obniżonym ryzykiem CHD i obecnością uszkodzeń wieńcowych (Maciejko i in., N.Engl. J.Med. 1983; 309:385-389; Sedlis i in., Circulation, 1986; 73 i 978-981).

Apo Al w osoczu jest pojedynczym łańcuchem polipeptydowym o 243 aminokwasach, których główna sekwencja jest znana (Brower i in., Biochem Biophys Res. Commun., 1978; 80:623-630). Apo Al jest syntetyzowana w komórce jako prekursor o 267 aminokwasach. Prepro-apolipoproteina najpierw podlega N-końcowemu rozszczepieniu wewnątrzkomórkowo, gdzie traci 18 aminokwasów, a następnie dalszemu odszczepieniu 6 aminokwasów w osoczu lub limfie dzięki aktywności specyficznych proteaz.

172ί 168

Uważa się, że główną strukturalną cechą cząsteczki Apo Al jest obecność powtarzalnych jednostek 11 lub 22 aminokwasów, które, przypuszcza się, że występuj ąw amfipatycznej konformacji helisy (Segrest i in. FEBS Lett. 1974; 38:247-253). Ta struktura stanowi o głównych aktywnościach biologicznych Apo Al, tj. wiązaniu lipidów i aktywowaniu acylotransferazy lecytynocholesterolowej (LCAt).

Inną, ostatnio opisaną właściwością Apo Al jestjej czynność przeciwwirusowe. Wynika to z badań in vitro, a czynność jest skierowana zarówno wobec szczepów wirusa Herpes (R. V. Srinivas i in. Virology, 1756, 48-57, 1990) jak i wobec ludzkiego wirusa upośledzenia odporności, HIV, (Owe i in., J. Clin. Invest. 86, 1142-50, 1990).

Wydaje się, że taka czynność działa przez interakcję między amfipatycznymi helikalnymi częściami Apo Al i glikoproteinami otoczki wirusów.

Badania in vitro wskazują, że kompleksy Apo Al i lecytyny mogą pobudzać wypływ wolnego cholesterolu z hodowanych komórek mięśni gładkich tętnicy (Stein i in., Biochem. Biophys. Acta, 1975; 380:106-118). Według tego mechanizmu HDL mogą także zmniejszać proliferację tych komórek (Yoshida i in., Exp. Mol. Pathol. 1984; 41:258-266).

Ostatnio wykazano, że infuzje Apo Al lub HDL robione zwierzętom doświadczalnym wywołują istotne zmiany biochemiczne, jak również zmniejszają zasięg i powagę uszkodzeń miażdżycowych w tętnicach. Po początkowym doniesieniu Maciejki i Mao (Arteriosclerosis, 1982; 2:407a) Badimon i in. (patrz dwa cytowane powyżej badania) stwierdzili, że można znacznie zmniejszyć zakres uszkodzeń miażdżycowych 0-45%) i zawartość estru cholesterolu (58,5%) u karmionych cholesterolem królików, przez infuzję HDL (d = 1,063 - 1,325 g/ml). Stwierdzili także, że infuzje HDL prowadzą do prawie 50% regresji istniejących uszkodzeń.

Wykazano także (Esper i in. Arteriosclerosis, 1987; 7:523a), że infuzje HDL mogą znacznie zmieniać skład lipoprotein w osoczu u królików Watanabe z dziedziczną hipercholesterolemią, która powoduje wczesne uszkodzenia tętnic. W tym przypadku infuzje HDL mogą więcej niż podwoić stosunek między ochronnymi HDL i miażdżycorodnymi LDL.

Potencjalne działanie HDL w zapobieganiu chorobie tętnic u zwierząt modelowych potwierdzono jeszcze przez obserwację, że Apo Al może mieć aktywność fibrynolityczną in vitro (Saku i in., Thromb Res. 1985; 39:1-8). Ronneberger (X Międzynarodowy Kongres Farmakol., Sidney 1987, str. 990) wykazał, że ekstrakcyjna Apo Al może zwiększać fibrynolizę u psów gończych i małp. Cynomologous. Podobną aktywność można zauważyć in vitro na ludzkim osoczu. Autor ten mógł potwierdzić zmniejszenie osadzania się lipidów i tworzenia się płytek tętniczych u zwierząt, którym podaje się Apo Al.

Apolipoproteina Al-Milano (Apo Al-M) jest pierwszym opisanym molekularnym wariantem ludzkiej Apo Al (Franceschin i in. J. Clin. Invest. 1980; 66-892-900). Charakteryzuje się tym, że Arg 173 jest zastąpiona Cys (Weisgraber i in., J. Biol. Chem., 1983; 258:2508-2513). Zmutowana apoproteina jest przenoszona jako autosomalna cecha dominująca i zidentyfikowano 8 pokoleń nosicieli (Gualandri i in. Am. J. Hum. Genet. 1984; 37:1083-1097).

Stan osobnika nosiciela Apo 1 -M charakteryzuje znaczne obniżenie poziomu cholesteroluHDL. Mimo tego, badani osobnicy najwyraźniej nie wykazujązwiększonego ryzyka choroby tętnic; faktycznie, z badania drzewa genealogicznego wynika, że osobnicy ci są “zabezpieczeni” przed miażdżycą tętnic.

Wydaje się, że mechanizm możliwego ochronnego działania Apo Al-M u nosicieli jest związany z modyfikacjąw strukturze zmutowanej apolipoproteiny polegającąna utracie jednego alfa-heliksu i zwiększonej ekspozycji reszt hydrofobowych (Francheschini i in., J. Biol. Chem. 1985; 260: 1632-1635). Utrata sztywnej struktury kilku alfa-heliksów prowadzi do zwiększonej elastyczności cząsteczki, która łatwiej łączy się z lipidami, w porównaniu z normalną Al. Ponadto, kompleksy apolipoproteina/lipid są bardziej podatne na denaturację, co sugeruje, że w przypadku mutanta poprawione jest także dostarczanie lipidów.

Lecznicze zastosowanie mutanta apolipoproteiny Apo Al-M jest obecnie ograniczone przez brak metody pozwalającej na wytwarzanie tych apolipoprotein w wystarczającej ilości i w odpowiedniej postaci.

172 168

Innąbardzo specyficznącechą Apo Al-Mjest zdolność do tworzenia dimerów ze sobąi kompleksów z Apo Al, w obu przypadkach, dzięki obecności reszty Cys. Z badań frakcji krwi zawierających mieszaninę Apolipoprotein wynikały wskazania, że obecność dimerów i kompleksów w obiegu może być odpowiedzialna za zwiększony okres ich połowiczego wydalania u przenosicieli, ostatnio opisanych w badaniach klinicznych (Gregg i in., NATO ARW on Human Apolipoprotein Mutants: From Gene Strukture to Phenotypic Expression, Limone SG, 1988).

Dimery Apo Al-M (Apo Al-M/Apo Al-M) działająjako czynnik hamujący w inter-konwersji cząstek HDL in vitro (Franceschini i in. J.Biol. Chem. 1990; 265:1224-12231).

Wcześniejsze badania mieszanin zawierających dimer są oparte na Apo Al-M wydzielonym z naturalnej krwi od osób z Apo Al-M, którą można było otrzymać tylko w małej ilości.

Trudności w wyprodukowaniu Apo Al, a zwłaszcza Apo Al-M z frakcji osocza są bardzo poważne (Franceschini in., J. Biol. Chem. 1985; 260:16321-16325). Wydzielenia i produkcji nie można przeprowadzić na dużą skalę, ponieważ dostępnajest tylko mała ilość surowca. Ponadto, z produktami frakcjonowania osocza związane jest ryzyko, między innymi takie, jak zanieczyszczenie czynnikami zakaźnymi. To jest główny powód ich unikania.

Usiłowano wyprodukować ludzką Apo Al na drodze rekombinacji DNA. W publikacji europejskiego patentu nr 0 267 703 jest opisany sposób otrzymywania Apo Al w E.coli. Jest tam opisany chimeryczny polipeptyd, w którym reszta Apo Al jest połączona z N-końcowymi resztami aminokwasowymi beta-galaktozydazy lub z jedną lub więcej domenami wiążącymi IgG Proteiny A lub z pro-sekwencją ludzkiej Apo Al.

Ekspresja Apo Al i Apo Al-M w szczepach drożdży i zastosowanie wytworzonych składników w leczeniu chorób miażdżycowych tętnic i chorób sercowo-naczyniowych są ujawnione w WO 90/12879. Geny kodujące Apo Al i Apo Al-M są połączone z sekwencjami DNA kodującymi sygnały sekrecyjne i obróbki białka rozpoznawalne przez drożdże i podłączonymi przed genem kodującym dojrzałe białko. Stosowano modyfikowaną sekwencję MF-alfa-1-lidera, w której ostatnimi resztami były HisGlySerLeuAspLysArg.

Stwierdziliśmy nieoczekiwanie, że oczyszczony dimer Apo Al-M/Apo Al-M ma przedłużony półokres trwania w porównaniu z monomerem Apo Al-M, poza tym, że ma wyraźnie lepszą właściwość stymulowania fibrynolizy w porównaniu z normalną Apo Al, np. zdolność do bezpośredniego aktywowania plazminogenu (którego normalna Apo Al nie aktywuje) oraz, że może być biologicznie ważny i może działać jako pro-lek dla Apo Al-M. Tworzy także rekonstytuowane cząstki HDL (lipoproteiny o dużej gęstości) o wyjątkowej wielkości, jakich nie znaleziono w rekombinacyjnych cząstkach HDL zawierających Apo Al-M lub Apo Al.

Sposobem według wynalazku wytwarza się zasadniczo czyste dimery apolipoproteiny AlMilano, dalej określane jako Apo Al-M/Apo Al-M, o czystości co najmniej 90%, korzystnie co najmniej 98%.

Sposób według wynalazku polega na tym, że zbiera się osocze od nosicieli Apolipoproteiny AlMilano, oczyszcza się monomer przez wprowadzenie roztworu zawierającego Apolipoproteinę AlMilano do kolumny Thiopropyl-Sepharose i eluowanie 2-merkaptoetanolem i następnie oczyszczony monomer przeprowadza się w dimer i dimer oczyszcza się konwencjonalnymi metodami.

Korzystnie monomer przeprowadza się w dimer przez utlenianie glutationem lub tioredoksyną, szczególnie korzystnie utlenionym glutationem.

Dimer Apo Al-M/Apo Al-M służy do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych i jest w nich obecny, ewentualnie razem z czynnikiem stabilizującym, np. stabilizującym związkiem lipidowym, takim jak fosfolipid i/lub z nośnikiem.

Kompozycje farmaceutyczne mogą także zawierać czynnik obniżający poziom lipidów i/lub inny lek, już znany w leczeniu miażdżycy tętnic i chorób sercowo-naczyniowych, taki jak heparyna i fragmenty heparyny lub czynniki obniżające lipidy.

Środki te można stosować do leczenia miażdżycy tętnic i chorób sercowo-naczyniowych i do zapobiegania i leczenia głównych schorzeń sercowo-krążeniowych, takich jak zawał serca, dusznica bolesna niestabilna, ostre zamknięcie naczyń obwodowych i nawrót zwężenia po plastyce naczyń wieńcowych.

172 168

Gdy leczy się przewlekłe choroby tętnic, wówczas leczy się zarówno tętnice wieńcowe, jak i obwodowe, które charakteryzują się obecnością płytki okluzyjnej. Dimery będą stosowane do infuzji jako takie w celu wywołania usuwania tłuszczu z płytek lub ewentualnie razem z tradycyjnym leczeniem miażdżycy tętnic i chorób sercowo-naczyniowych, takim jak za pomocą heparyny, frakcji heparyny i fragmentów heparyny i/lub leków zmnieszających poziom miażdżycorodnych lipoprotein w obiegu.

Lek zawierający dimer można stosować do zapobiegania lub leczenia trombozy w różnych klinicznych warunkach i można go stosować do stymulacji fibrynolizy.

Dimer może także działać jako pro-lek dla monomeru w leczeniu miażdżycy tętnic i chorób sercowo-naczyniowych.

W dimerze Apo Al-M występująw szerokim zakresie struktury amfipatyczne i dimer przypuszczalnie ma działanie przeciwwirusowe.

Teraz, po raz pierwszy, przez wykorzystanie niniejszego wynalazku, możliwe jest wy-tworzenie dimeru w zasadniczo czystej postaci, więcej niż 90% i nawet powyżej 98% i możliwe jest także wykazanie, że produkt ten ma zadziwiająco lepszy wpływ na układy biologiczne w porównaniu z Apo Al, co przedstawiono w przykładach poniżej.

Przykład I. Oczyszczanie monomeru z osocza i następnie konwersja do dimeru a) Oczyszczanie Apo Al-M

Próbki krwi pobrane na czczo od różnych nosicieli apolipoproteiny Apo Al-M zebrano na Na2-EDTA (1 mg/ml) i uzyskano osocze przez wirowanie z niską prędkością w 4°C. Z osocza wyodrębniono lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL, d = 1,063 - 1,21 g/ml) przez kolejne ultrawirowanie (RJ. Havel, H.A. Eder, J.H. Bragdon. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J. Clin. Invest. 1995; 34: 13451354), w ultrawirówce Beckmana L5-50B wyposażonej w wirnik 50,2 Ti. Po 48 godzinach wirowania z prędkością 40 000 obr./min. w 4°C, górną frakcję zawierającą HDL rozcieńczono 1: 1 0,15 M NaCl, 0,01% Na2-EDTA, roztworem KBr (pH 7,4, d = 1,21 g/ml) i znów wirowano z prędkością 40 000 obr./min. w 4°C przez 48 godzin.

HDL poddano wyczerpującej dializie do 5 mM NH4HCO3, 0,1% Na2-EDTA, pH 7,4, liofilizowano i odlipidowano za pomocąmieszaniny eter etylowy/EtOH (3:1 obj./obj.). Stężenie białka mierzono albo przez analizę aminokwasów albo metodąLowry i in. (O.H. Lowry, N J. Rosengrough, A.L. Farr, R. J. Randall. Protein measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem., 1951, 193:265-275).

Otrzymanąjak wyżej apolipoproteinę HDL solubilizowano w 0,1M Tris-HCl, 0,04% Na2EDTA, 0,01% NaN₃, pH 7,4, zawierającym 6 M Gdn-HCl i 1% 2-merkaptoetanol. Po 4 godzinach inkubacji w 37°C, zredukowane apo-HDL naniesiono na kolumnę Sephacryl S-200 (2,6 x 150 cm) zrównoważoną 0,1 M Tris-HCl, 0,04% Na2-EDTA, 0,01% NaN₃, pH 7,4, zawierającym 4 M Gdn-HCl i 0,1% 2-merkaptoetanolu. Apoliproteiny eluowano tym samym buforem przy niskiej prędkości 1,0 ml/ml; zebrano frakcje 5-mililitrowe. Połączone frakcje odpowiadające apo Al + apo Al-M dializowano do 5 mM NH4HCO3, 0,01% Na2-EDTA, pH 7,4 i liofilizowano. Apolipoproteiny rozpuszczono w 0,1 M Tris-HCl, 0,04% Na2-EDTA, 0,01% NaN3, pH 7,4 zawierającym 6 M Gdn-HCl i 1% 2-merkaptoetanol. Po 4 godzinach inkubacji w 25°C usunięto 2-merkaptoetanol przez chromatografię na Sephadexie G25 i apolipoproteiny naniesiono od razu na kolumnę Thiopropyl-Sepharose (1x10 cm) zrównoważoną 0,1 M Tris-HCl, 0,04% Na2EDTA, 0,01% NaN3, pH 7,4 zawierającym 4 M Gdn-HCl. Po całonocnym obiegu z niskąprędkościąprzepływu (0,15 ml/min), normalną Apo Al eluowano 0,1M Tris-HCl, 0,04% Na2-EDTA, 0,01% NaN3, pH 7,4 zawierającym 4 M Gdn-HCl. Następnie eluowano Apo Al-M takim samym buforem zawierającym 4 M Gdn-HCl i 1% 2-merkaptoetanol. Frakcje zawierające Apo Al-M połączono i poddano dializie do 5 mM NH4HCO3, 0,01% Na2-EDTA, pH 7,4, liofilizowano i przechowywano w -20°C w 0,1 M Tris-HCl, 0,04% Na2-EDTA, 0,01% NaN3, pH 7,4, zawierającym 3 M Gdn-HCl i 0,1 % merkaptoetanol. Preparat Apo Al-M miały czystość>98%, co sprawdzono za pomocą HPSEC, SDS-PAGE i izoelektryczne ogniskowanie.

172 168

b) Synteza Apo Al-M/Apo Al-M

Roztwory Apo Al-M dializowano do 25 mM buforu Tris-HCl, pH 9,0. Zredukowaną Apo Al-M rozcieńczono do żądanego stężenia końcowego (3,6 - 53,6 uM) 25 mM buforem Tris-HCl zawierającym zredukowany glutation (GSH) (1-5 mM) i inkubowano wstępnie w 25°C przez 5 nma. Utlenianie zzpoccątkowano dddatkiem utlenionegg glutationn ( GSSG) )00,- 10,0 mM) i prowadzono je dalej w szczelnie zamkniętych probówkach w tej samej temperaturze przez 24 godziny. Utlenianie monitorowano za pomocą SDS-PAGE (patrz powyżej). Po wybarwieniu i odbarwieniu żele przeszukiwano densytometrem laserowym LKB Ultroscan XL i obliczono procentowy rozdział pasm poszczególnych białek stosując program LKB 2400 Gedscan XL. Kinetykę utleniania śledzono za pomocą HPSEC.

W celu zoptymalizowania syntezy dimeru przeprowadzono dodatkowe doświadczenia na utlenianie w obecności GSH/GSSG + Gdn-HCl i GSH/GSSG + tioredoxin (V.P. Pigiet i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986; 83:7643-7647).

Utlenianie Apo Al-M prowadzono w zamkniętych probówkach, w obecności różnych stężeń glutationu zredukowanego) utlenionego (GSH/GSSG). Wydajność reakcji wytwarzania dimeru była zależna zarówno od stężenia białka (fig. 1, tabela 1), jak i stosunku stężeń GSH/GSSG (fig. 2, tabela

2). Przez zwiększenie stężenia białka z 8,9 uM do 53,6 uM, ilość Apo Al-M/Apo Al-M wzrosła o 26%-51%(fig. 1 tabela 1). Zmoiejsągoig stosunku molowego GSH/GSSG z 1/2 do 1/16 prowadzi do 43% zmniejszenia wydajności; z drugiej strony wzrost stężenia GSH/GSSG przy stałym stosunku molowym GSH/GSSG był związany z do 42% wzrostem ilości wytworzonego Apo Al-M/Apo Al-M (fig.2, tabela 1). Ani temperatura reakcji, ani obecność czynnika denaturującego białko (Gao-HCl) nie wpłynęły na stopień tworzenia się Apo Al-M/Apo Al-M. Wytworzono znaczną ilość Apo AlM/Apo Al-M przez inkubację Apo Ml-M z GSH/GSSG w obecności 0,2 mM tinrgdoxiou (tabela 1).

Kinetykę reakcji utleniania śledzono za pomocą analitycznej HPSEC. Dimeryczna i monomeryczna Apo Al-M dawała wyraźne piki z czasami retencji 10,8 i 12,7 min., odpowiednio. Synteza Al-M/Al-M (GSH/GSSG 2 mM/4 mM, stężenie Al-M 8,9 mM) była prawie całkowita po 3 godzinach; przedłużenie inkubacji do 24 godzin nie zwiększyło już tworzenia się Al-M/Al-M (fig. 3).

Tabela 1

Utlenianie Apo Al-M

Białko uM	GSH mM	GSSG mM	Wydajność %	Uwagi
3,6	1,0	0,1	34,8	tioredoxin 0,2 mM
8,9	1,0	2,0	9,1
8,9	1,0	2,0	9,9	4°C
8,9	1,0	4,0	7,2
8,9	1,0	4,0	7,7	4°C
8,9	1,0	8,0	6,6
8,9	1,0	16,0	5,2
8,9	2,0	4,0	19,6
8,9	4,0	8,0	18,7
8,9	5,0	10,0	23,9
8,9	1,0	2,0	9,8	Gdn-HCl 4 M
17,9	2,0	4,0	23 ,3
17,9	4,0	8,0	25,5
17,9	5,0	10,0	27,5
35,7	2,0	4,0	25,9
35,7	4,0	8,0	27,7
35,7	5,0	10,0	27,9
53,6	2,0	4,0	25,4
53,6	4,0	8,0	30,5
53,6	8,0	10,0	36,1

Warunki reakcji: Bufor: Tris-HCl 25 mM, pH 9,0 Temperatura: 25°C Czas: 24 godziny

172 168

METODY CHARAKTERYZOWANIA PRODUKTU

Inkubacja z fosfolipidami

Odważone ilości dimirystoilofosfatydylocholiny (DMPC) rozpuszczono w etanolu i odparowano rozpuszczalnik pod N2; pozostały rozpuszczalnik usunięto pod próżnią w ciągu 2 godzin. Dyspersje DMPC w 20 nM buforu fosforanowego, pH 7,4, zmieszano Apo Al-M/Apo Al-M (0,1 mg/ml - stężenie końcowe) w stosunku molowym DMPC/Apo Al-M/Apo Al-M 100:1.

Spektroskopia

Roztwory Apo Al-M/Apo Al-M dializowano do 20 mM buforu fosforanowego, pH 7,4, i rozcieńczono tym samym buforem do żądanego stężenia białka.

Normalne widma UV i drugie pochodne widm roztworów Apo Al-M/Apo Al-M i Apo AlM/Apo Al-M + DMPC otrzymano za pomocą spektrometrów Jasco Uvidec-610 i Perkin Elmer Lambda-2 w 25°C, stosując 1 cm pryzmat kwarcowy. Topograficzne umiejscowienie reszt tyrozyny badano zgodnie z równaniem Ragone i in. (R. Ragone, G. Colonna, C. Balestrieri, L. Servillo, G. Irace, Determination of tyrosine exposure in proteins by second-derivative spectroscopy. Biochemistry, 1984, 23: 1871-1875):

alfa = (rn - ra)/(ru - ra) w którym alfa oznacza stopień ekspozycji tyrozyny na rozpuszczalnik, rn i ru oznaczają stosunki pików pochodnej (a/b) dla natywnego i nierozcieńczonego (w 0 M Gdn-HCl) Apo AlM/Apo Al-M, odpowiednio, a ra oznacza stosunek pików drugiej pochodnej roztworu zawierającego wolną tyrozynę i tryptofan zmieszane w takim samym stosunku molowym jak w Apo Al-M/Apo Al-M.

Wewnętrzne widma fluorescencyjne roztworów Apo Al-M/Apo Al-M i Apo Al-M/Apo Al-M + DMPC otrzymano na spektrofluorometrze Jasco FP-550 w 25°C.

Widma dichroizmu kołowego (CD) roztworów Apo Al-M/Apo Al-M i Apo AlM/ApoAAl-M + DMPC otrzymano na spektropolarymetrze Jasco J500A w 25°C. Średnie wartości eliptyczności reszty [THEYA] wyrażono w stopniach x cm2 x dmol'¹ i obliczono z równania:

[THEYA] [THEYA] x 106 10χI xc w którym [THEYA] oznacza zaobserwowaną eliptyczność w stopniach, 106 jest średnim resztkowym ciężarem cząsteczkowym białka, I oznacza długość ścieżki w cm, a c oznacza stężenie białka w g/ml. Procent struktury alfa-helisy obliczono z równania:

% alfa - helisy = [THEYĄ]2_08Mn - 4000 33000-4000 (N. Greenfield, G.D. Fasman. Computed circular dichroism spectra for tbe evaluation of protein conformation. Biochemistry 1969; 8:4108-4114).

Elektroforeza

Analityczne izoelektryczne ogniskowanie i SDS-PAGE prowadzono jak uprzednio opisano (G. Franceschini, M. Sirtori, G. Gianfranceschi, C.R. Sirtori. Relation between the HDL apoproteins and Al isoproteins in subject with the Al-M abnormality. Metabolism 1981; 30:502-509).

Izoelektryczne ogniskowanie prowadzono w 10% żelach akrylamidowych, zawierających 6 M mocznika i 4% amfoliny (pH 4-6). Po całonocnym ogniskowaniu żele utrwalano i barwiono błękitem Coomassie Brilliant Blue R-250 w mieszaninie kwasu octowego i alkoholu izopropylowego. Punkt izoelektryczny (pl) pasm nieznanego białka obliczono przez wykreślenie pl znanych białek (wzorce z Bio-Rad i apo-HDL) w funkcji odpowiedniej odległości migracji.

172 168

Do SDS-PAGE stosowano 14'% żele akryloamidowe zawierające 0,1% SDS. Żele traktowano jak opisano, a ciężar cząsteczkowy nieznanych białek obliczono z wykresu 10 g MW wzorcowych białek (KABI-Pharmacia) w funkcji odległości migracji.

Wysokosprawna chromatografia ekskluzyjna

Rozdzielanie metodą analitycznej HPSEC prowadzono stosując ciekły chromatograf Jasco wyposażony w 10 pm kolumnę TSK-G3000 SW (7,5 x 300 mm). Kolumnę HPSEC zrównoważono i eluowano 0,1 M buforem fosforanowym, 0,1M NaCl, pH 7,2, zawierającym 8 M mocznik. Białka eluowano przy szybkości przepływu 0,5 ml/min. i robiono odczyty przy 220 nm. Powierzchnie pików były scałkowane za pomocą urządzenia całkującego HP-3390.

BIOLOGICZNA OCENA Apo Al-M/Apo Al-M

Przykład II. Zachowanie kinetyczne dimeru Apo Al -M w porównaniu z monomerem Apo Alu normalnych biorców.

Dimery wykazują przedłużoną trwałość obiegu, co zostało przedstawione poniżej w badaniach kinetycznych na ludziach.

Zdrowi ochotnicy otrzymali dożylnie Apo Al-M lub Apo Al-M Apo Al-M znakowane ¹²⁵J. Jak przedstawiono w tabeli 2, t_1Q (h) osocza oraz frakcyjnąszybkość kataboliczną(FCR) obliczano według dwóch różnych modeli. Obydwa potwierdzająwyraźnie zmniejszony katabolizm dimeru w porównaniu z monomerem .

Bardzo powolny katabolizm Apo Al-M/Apo Al-M wskazuje, że te cząsteczki mogą szkodzić konwersji lipoprotein i prawdopodobnie działająjako skuteczny prekursor Apo Al-M. W ten sposób, przez iniekcję Apo Al-M/Apo A-M, przypuszczalnie dimer może pozostać w osoczu przez przedłużony okres, oddziaływując bezpośrednio na metabolizm lipoprotein i układ fibrynolityczny.

Tabela 2

Zachowanie kinetyczne Apo Al-M/Apo Al-M w porównaniu z monomerem Apo Al u normalnych biorców (n = 2)

	Apo Al-M	Apo Al-M/Apo Al-M
Sposób jednowykładrnczy	t1/2 (h)	16,07	52,04
Sposób biwykładniczy	MRT (h)	23,19	75,09
	t1/2 (h)	22,61	70,29
	MRT (h)	28,97	89,16
	FCR	2,3% na godzinę	1,1% na godzinę

Wpływ Apo Al-M/Apo Al-M na układ fibrynolityczny

Wprowadzenie

Układ fibrynolityczny stanowi główną obronę przed osadzaniem fibryny na ściankach naczyń i jako taki odgrywa ważną rolę w mechanizmach, które zapobiegają zakrzepicy.

Enzymem odpowiedzialnym za lizę fibryny jest plazmina. Plazmina tworzy się z nieaktywnego prekursora-plazminogenu przez działanie specyficznych aktywatorów (tkankowy aktywator plazminogenu, t-PA i urokinaza, uPA). Zarówno proces aktywacji, jak i działanie plazminy regulują specyficzne inhibitory - inhibitor aktywatora plazminogenu 1 (PAI) i alfa-2-antyplazmina, odpowiednio. Schemat układu fibrynolitycznego jest przedstawiony poniżej.

172 168

PLAZMINOGEN

AKTYWATORY i--PAI

PLAZMINOGEN-►PLAZMINA '--a₂ ANTYPLAZMINA

FE3RYNA-KFDP

FDP = Produkt degradacji fibryny

Celem badania w przykładach 7-9 było stwierdzenie jak dimer Apo Al-M działa na ludzki układ fibrynolityczny^. Autoaktywację plazminogenu i jego aktywację za pomocą uPA i t-PA badano w obecności i nieobecności Apo Al-M/Apo Al-M. Ludzką Apo Al wyizolowaną z osocza stosowano jako materiał kontrolny (produkt Sigmy nr A 9284).

Aktywację układu fibrynolitycznego mierzono stosując substraty chromogeniczne. Te substraty zawierają chromoforowe grupy p-nitroaniliny, które mogąbyć odszczepione z cząsteczki substratu przez działanie plazminy. Wolna p-NA ma intensywny żółty kolor, który można łatwo śledzić przy długości fali 405 nm. Ilość uwolnionej p-NA jest wprost proporcjonalna do ilości wytworzonej aktywności enzymatycznej.

Wszystkie pomiary przeprowadzono stosując czytnik mikropłytkowy THERMOmax kontrolowany przez program SOFTmax™ wersja 2,01 firmy Molecular Devices, Menlo Par, CA, USA.

Materiały stosowane w tych badaniach były wytworzone metodą rekombinacji według przykładu 4. Oczyszczanie obejmowało wymianę jonową, interakcję hydrofobową i chromatografię żelową i następnie ultrafiltrację i odparowywanie ze stanu zamrożenia - wszystkie konwencjonalne metody biochemiczne.

Wszystkie badane materiały zawierały 90% formy dimerycznej, jak wykazała HPLC z odwróconymi fazami. Stężenie oznaczano w próbie Kabi Pharmacia apolipoproteina Al RIA 100. Badano trzy preparaty, A, B i C.

Przykładni. Autoaktywacja plazminogenu w obecności Apo Al-M/Apo Al-M i Apo Al.

Glu-Plazminogen (94 pg/ml - stężenie końcowe) inkubowano przez 3 godziny w 37°C w 0,1 mol/l buforze Tris, pH 7,6. Tworzenie się plazminy śledzono obserwując chromogeniczny substrat S-2251 (H-D-Val-L-Leu-Lys-pNA), z firmy Chromogenix AB, Mólndal, Szwecja. Stoso-wano go w końcowym stężeniu 0,6 nmol/1. Plazminogeny otrzymane w tych próbach pochodziły z firmy Chromogenix AB lub IMCO Inc. Sztokholm, Szwecja.

W próbach tych badano partie Apo Al-M/Apo Al-M (stężenie końcowe 3,9 75 pg/ml) i porównywano ilość plazminy wytworzonej w ich obecności z ilością plazminy wytworzonej w obecności Apo Al (stężenie końcowe 125 pg/ml) oraz z ilością plazminy wytworzonej w nieobecności tych dodatków (kontrolna) (tabela 3).

Nieoczekiwanie okazało się, że Apo Al-M/Apo Al-M może zwiększyć aktywację plazminogenu w nieobecności aktywatorów plazminogenu. Apo Al pochodząca z osocza nie działała na cząsteczkę plazminogenu.

172 168

Tabela 3

Samorzutne powstawanie aktywności plazminy w plazminogenie.

Wpływ Apo Al-M/Apo Al-M i Apo Al. Aktywność plazminy wyrażona jako OD przy 405 nm

Próbka	Stężenie końcowe Apo pg/ml	OD 405 nm
Kontrolna	0	0,052
+ ApoAl	125	0,049
+ ApoAl-M/ApoAl-M
A	75	0,288
B	31,3	0,325
B	15,6	0,153
B	7,8	0,104
B	3,9	0,067

Obserwowaną aktywność można przypisać Apo Al-M/Apo Al-M. Jednak na podstawie tych danych nie można wykluczyć, że Apo Al-M/Apo Al-M był zanieczyszczony jakimś enzymem (enzymami) proteolitycznym, który mógł aktywować plazminogen. Przeprowadzono doświadczenia w celu wykluczenia takiej możliwości.

Wszystkie preparaty Apo Al-M/Apo Al-M stosowane w próbach fibrynolitycznych były badane z substratami chromogenicznymi: S-2251 (H-D-Val-L-Leu-L-Lys-pNA), wrażliwym na aktywność podobną do plazminy i S-2288 (H-D-Ile-Pro-Arg-pNA), wrażliwym na Argspecyficzne proteazy. Substraty pochodziły z firmy Chromagenix AB. Stężenie końcowe Apo Al-M/Apo Al-M w próbach było takie samo jak stężenie stosowane w próbach fibrynohtycznych, mogło zatem być różne w różnych partiach.

Próba: 25 pl Apo Al-M/Apo Al-M, stężenie końcowe 60 - 70 pg/ml 150 pl 0,1 mol/l buforu Tris pH 7,8 pl S-2251, 0,6 mmol/1 lub S-2288 1,0 mmol/1.

Próbki zawierające tylko bufor i substrat stosowano jako kontrolne dla niespecyficznej hydrolizy substratu. Wszystkie próbki badano podwójnie. Płytkę do mikromianowania inkubowano w 37°C i co godzinę odczytywano absorbancję.

Tabela 4

Amidolityczna aktywność dwóch partii Apo Al-M/Apo Al-M (A i B) po 4 godzinach inkubacji w 37°C (OD przy 405 nm)

	Apo Al-M/Apo Al-M	Substrat
S-2251	A	0,023	0,022
	B	0,022
S-2288	A	0,037	0,034
	B	0,037

W innej serii doświadczeń Apo Al-M/Apo Al-M traktowano nieodwracalnym inhibitorem proteazy seryny - fluorofosforanem diizopropylu, DFP (produkt Sigma nr D 0789). Stężenie końcowe Apo Al-M/Apo Al-M w 0,2 mol·! buforu KHCO3, pH 7,6, wynosiło około 75 pg/ml. Do tego roztworu dodano DFP do końcowego stężenia 123 mmole/1. Po 4 godzinach próbkę do inkubacji dializowano przez noc do dwóch zmian buforu węglanowego.

Oznaczenie aktywności, w warunkach takich samych, jak opisane wcześniej, prowadzono na Apo Al-M/Apo Al-M traktowanym DFP i Apo Al-M/Apo Al-M nietraktowanym. Po 3 godzinach inkubacji z plazminogenem i S-2251, OD przy 405 nm wynosiło 0,209 dla próbek zawierających ApoAl-M/ApoAl-M traktowanych DFP, 0,234 dla próbek zawierających nietraktowany ApoAlM/ApoAl-M i 0,030 dla próbek tylko z plazminogenem.

Można zatem wyciągnąć wniosek, że obserwowane aktywowanie plazminogenujest bezpośrednio związane z obecnością ApoAl-M/ApoAl-M, a nie z potencjalnymi zanieczyszczeniami proteolitycznymi.

172 168

Przykład IV. Wpływ ApoAl-M/ApoAl-M na aktywację plazminogenu aktywatorami plazminogenu t-Pa i uPA.

Zarówno urokinaza (uPA) jak i tkankowy aktywator plazminogenu (t-PA) przekształcają plazminogen w plazminę przez proteolityczne rozszczepienie jednego wiązania peptydowego Arg 560-Val 561 w cząsteczce plazminogenu. Podczas, gdy dwułańcuchowa urokinaza może aktywować plazminogen bezpośrednio, t-PA wymaga obecności fibryny dla optymalnej aktywacji plazminogenu. Obecność katalitycznych ilości fibryny, która razem z t-PA i plazminogenem, tworzy trzeciorzędowy kompleks, zwiększa wydajność enzymatyczną t-PA około 600-krotnie.

Aktywację plazminogenu przez t-PA badano stosując handlowo dostępny zestaw Spectrolyse (fibryna) t-PA/PAI firmy Biopool, Umea, Szwecja.

W tej próbie plazminogen inkubuje się z t-PA w obecności substratu chromogenicznego DBut-CHT-Lys-pNA i desAA fibrynogenu (monomeru fibryny), który działa jako stymulator aktywacji. Wytworzona plazmina rozszczepia substrat uwalniając pNA.

Do tego układu dodano ApoAl-M/ApoAl-M i porównano z preparatem ApoAl firmy Sigma. Badano działanie obu apolipoprotein w układzie zarówno w obecności jak i nieobecności fibryny.

Przykład układu do próby:

μΐ buforu Spectrolyse μΐ preparatu Apo lub buforu μΐ t-PA (= 1,7 IU/ml - stężenie końcowe)

150 μΐ odczynnika Spectrolyse PAR (= mieszanie plazminogenu i substratu) μΐ Desa fib (= monomer fibryny) lub 10 μ buforu.

Próbki inkubowano na płytkach do mikromianowania w 37°C przez 3 godziny.

Tabela 5

Wpływ ApoAl-M/ApoAl-M i Apo Al na aktywację plazminogenu przez t-Pa w obecności i nieobecności fibryny. Wyniki są wyrażone jako OD przy 405 nm po 3 godzinach inkubacji w 37°C

Próbka	Apo, stężenie końcowe Mg/ml	OD 405 nm + fibryna	OD 405 nm - fibryna
t-PA kontrolna	0	0,656	0,048
+ ApoAl	54	1,050	0,066
+ ApoAl-M/ApoAl-M A	65	1,665	0,446
B	54	2,366	0,225

Z ApoAl-M/ApoAl-M obserwowano znaczną stymulację aktywności plazminogenu, zarówno w obecności jak i nieobecności fibryny. ApoAl stymulowała aktywację w mniejszym stopniu w obecności fibryny. W nieobecności fibryny stymulacja przez ApoAl-M/ApoAl-M była bardzo wyraźna w porównaniu z bardzo małą stymulacją przez ApoAl.

ApoAl-M/ApoAl-M wywierał także znaczne wzmagające działanie, gdy plazminogen był aktywowany przez uPA. Stosowana w tych próbach urokinaza była preparatem o wysokim ciężarze cząsteczkowym firmy Calbiochem.

Urokinazę (stężenie końcowe 2,5 IU/ml) mieszano z plazminogenem (stężenie końcowe 94 μg/ml) i substratem chromogenicznym S-2251 (stężenie końcowe 0,6 mmola/1). Do tej próbki dodano ApoAl-M/ApoAl-M do końcowego stężenia 75 lub 62 μg/ml. Reakcję prowadzono w 0,1 mol/l buforze Tris, pH 7,6. Podobnie do t-PA, obserwowano silną stymulację tworzenia plazminy przez urokinazę, gdy do próby dodano ApoAl-M/ApoAl-M (tabela 6).

172 168

Tabela 6

Wpływ ApoAl-M/ApoAl-M na aktywację plazminogenu przez uPa. Wyniki są wyrażone jako OD przy 405 nm, po 4 godzinach inkubacji w 37°C.

Próbka	ApoAl-M/ApoAl-M stężenie końcowe pg/ml	OD 405 nm
uPa kontrolna	0	0,325
+ ApoAl-M/ApoAl-M A	75	1,263
B	62	1,868

Takie zwiększone oddziaływanie na fibrynolizę występuje także, gdy ApoAl-M/ApoAl-M przygotowano w postaci kompozycji farmaceutycznej razem z nośnikiem. Jako potencjalny nośnik stosowano liposomy składające się z fosfatydylocholiny, PC (12 mg/ml). Stężenie ApoAl-M/ApoAl-M (partia C) w liposomach wynosiło 3,6 mg/ml.

Aktywację plazminogenu (stężenie końcowe 94 pg/ml) przez uPA (stężenie końcowe 2,5 IU/ml) badano w obecności liposomów wypełnionych ApoAl-M/ApoAl-M i porównywano z aktywacją w obecności liposomów wolnych od białek. Próbki inkubowano przez 4 godziny w 37°C z S-2251 i śledzono w sposób ciągły tworzenie się plazminy.

Tabela 7

Aktywacja plazminogenu przez uPA. Wpływ ApoAl-M/ApoAl-M, seria C, w liposomach.

Wyniki są wyrażone jako OD przy 405 nm.

Próbka	OD 405 nm
uPa + plazminogen	0,221
+ liposomy wolne od białka	0,499
250 pg/ml PC
+ ApoAl-M/ApoAl-M 75 pg/ml
w liposomach, 250 pg/ml PC	1,084

Obecność samych liposomów stymulowała aktywację plazminogenu około dwukrotnie. Dodatek do liposomów ApoAl-M/ApoAl-M zwiększał ten efekt pięciokrotnie w porównaniu z próbką zawierającą tylko urokinazę jako aktywator.

PrzykładV. Wpływ ApoAl-M/ApoAl-M na konwersję jednołańcuchowej urokinazy w dwułańcuchową urokinazę.

Jednołańcuchowa urokinaza (scuPA) jest prekursorem urokinazy dwułańcuchowej (uPA). W przeciwieństwie do uPA scuPA ma tylko bardzo niską aktywność amidolityczną wobec małych syntetycznych substratów. Aktywność amidolityczna stanowi najwyżej 0,4% aktywności uPA. Jednak scuPA, mimo iż jest proenzymem, ma zdolność aktywowania plazminogenu do plazminy. Proponowano sekwencję trzech reakcji w mieszaninach plazminogenu i scuPA, które zachodzą w aktywowaniu plazminogenu do plazminy:

1) scuPA + plazminogen - scuPA + plazmina

2) plazmina + scuPA - plazmina + uPA

3) uPA + plazminogen - uPA + plazmina

Badaliśmy sekwencję reakcji prowadzących do konwersji scuPA do uPA w obecności plazminogenu. Aktywność urokinazy wykryto za pomocą chromogenicznego substratu specyficznego wobec urokinazy S-2444 (piro-Glu-Gly-Arg-pNA, Chromogenix AB). Do układu dodawano partie ApoAl-M/ApoAl-M i ApoAl i porównywano ilość wytworzonej aktywności uPA z aktywnością otrzymaną w próbkach bez dodatku apolipoproteiny. Stosowana w tych próbachjednołańcuchowa urokinaza była produktem firmy Grunenthal GmbH, Aachen, Niemcy (partia nr 0088808).

pl Apo lub bufor pl 0,05 mola/l Tris, pH 7,6, zawierającego 0,1 mola/l NaCl i 0,02% Tween 80

172 168 μΐ scuPA, 454 pmoli/1 - stężenie końcowe pl S-2444, 1 mmol/1 - stężenie końcowe pl plazminogenu, 52,1 nmoh/1 - stężenie końcowe

Próbki inkubowano w 37°C przez 90 minut. Przez ostatnie 30 minut inkubacji notowano w sposób ciągły wzrost gęstości optycznej mierząc ilości wytworzonej uPA.

Tabela 9

Wpływ ApoAl-M/ApoAl-M na konwersję scuPA do uPA.

Wyniki są wyrażone jako mOD/min. przy 405 nm

Próbka	Apo, stężenie końcowe pg/ml	mOD/min
scuPA	0	0,073
+ plazminogen	0	13,2
+ ApoAl	62	11,8
+ ApoAl-M/ApoAl-M
B	62	20,0
A	75	24,0

ApoAl-M/ApoAl-M stymulował konwersję scuPA do uPA w obecności plazminogenu, natomiast ApoAl wydzielona z osocza nie miała znaczącego działania w tym układzie.

Zaobserwowane działanie ApoAl-M/ApoAl-M na układ fibrynolityczny w tych badaniach było większe niż działanie ApoAl wyizolowanej z osocza. ApoAl-M/ApoAl-M ma dużą zdolność do stymulowania aktywności fibrynolitycznej, przewyższającą taką właściwość ApoAl.

Podobnie stwierdzono, też zwiększony wpływ ApoAl-M/ApoAl-M w stosunku do ApoAl in vivo.

172 168

FIG. 3

172 168

GSH / GSSG (mM / mM)

FIG. 2

172 168

Stężenie białka (μΜ)

FIG. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania dimeru Apolipoproteiny Al-Milano o czystości co najmniej 90%, znamienny tym, że zbiera się osocze od nosicieli Apolipoproteiny Al-Milano, oczyszcza się monomer przez wprowadzenie roztworu zawierającego Apolipoproteinę Al-Milano do kolumny Thiopropyl-Sepharose i eluowanie 2-merkaptoetanolem i następnie oczyszczony monomer przeprowadza się w dimer i dimer oczyszcza się konwencjonalnymi metodami.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że monomer przeprowadza się w dimer przez utlenianie glutationem lub tioredoksyną.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że monomer przeprowadza się w dimer przez utlenianie za pomocą utlenionego glutationu.