JPH03109399A - ＰＰ４―δ、その調製および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皮盃ユ１ 本発明は、ＰＰ４−δ（ｄｅｌｔａ）、その調製および
使用に間する。タンパク質ＰＰ４−δは、Ｃ末端におい
て１３Ｍのアミノ酸が切断されており、驚いたことに、
トロンボプラスチン（ｔｈｒｏｍｈｏ−ｐｌａｓｔｉｎ
）阻害試験において初めのタンパク質よりも高い活性を
有するＰＰ４である。

１又ｍ逝 互いに密接に関連している止血（ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ
）の生理学および免疫防御の両方は、血液細胞の活性化
とともに、最近集中的に研究されてきた。それによると
、血液の異質面（ｆｏｒｅｉｇｎ　５ｕｒｆａｃｅ）と
の接触によってまたは細胞損傷の後のトロンボプラスチ
ンの放出（ｒｅｌｅａｓｅ）によって、血づｄ凝固は始
まる。これは、原則的には酵素−基質反応によって起き
ろ。すなわち、個々の凝固因子が、階段状（ｃａｓｃａ
ｄｅ）反応で前酵素（ｐｒｏｅｎｚｙｍｅ）型から活性
型へ限定的タンパク分解によって変換される。

この変換は、血液の細胞性情成成分、主に血小板、の関
与で進行し、これは、その燐脂質二重層とともに、血１
固のための反応表面を提供する。止血プロセスの速度は
、カルシウムおよび促進因子タンパク質によってかなり
速められる。

止血プロセスの機能性の調節因子は、活性化された凝固
酵素と安定で不活性の複合物を形成する（例えば°トロ
ンビンまたは因子ＸａとＡＴＩＩＩ）プロテアーゼ阻害
因子、およびタンパク分解によってＶａおよびＶ　ｍ　
ａ因子を不活性化するタンパク質Ｃのようなタンパク分
解酵素、の両方である。

凝固プロセスは、促進因子であるこれらの二つの因子の
不活性化によって大きく減速される。

凝固プロセスに必須の燐脂質に結合することができるタ
ンパク質は、別の調節原理を表す（Ｒｅｕｔｅｌ　ｉｎ
ｇｓｐｅｒｇｅｒ、　Ｃ，Ｐ、Ｍ、ら：　Ｅｕｒ、　Ｊ
。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２５１．６２５−６２９．１９８５
）。

この型のタンパク質は、Ｂ　Ｏｈ　１１ら（Ａｒｃｈ。

Ｇｙｎａｅｋｏｌ、　２３６．２２５−２３３．１９８
５）によって、最近記述されたｒＶＡｃＪタンパク質（
Ｍａｕｒｅｒ−Ｆｏｇｙら：　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、　１７４．５８３−５９２．１９８８）と同
一であるタンパク質ＰＰ４のかたちで最初に単離された
。

■　　　　、・Ｂ ＰＰ４またはＰＰ４−δの抗凝固作用は、これらタンパ
ク質が血小板凝集（第一次止血）および血づπ凝固プロ
セスの段階の両方を阻害することに由来し、ここでは燐
脂質およびカルシウムが関与する。抗炎症作用は、大体
においてフォスフォリパーゼＡ２の阻害に起因する。

Ｐ　Ｐ　４　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｇｒｕｎｄｍａｎｎら
：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８訳３７０８−３７１２．１９
８８　）のクローニングおよび配列決定のために、胎盤
から単離されたタンパク質の部分的アミノ酸配列からオ
リゴヌクレオチドプローブを推断して、ヒト胎盤からの
ｍ　ＲＮ　Ａから調製したｃＤＮＡバンクをスクリーニ
ングに供した。その結果、ＰＰ４クローンのみならず、
それらのｃＤＮＡが、ＰＰ４に匹敵する生理的活性を有
するＰ　Ｐ　４−Ｘ　（Ｇｒｕｎｄｍａｎｎら：前出と
称されるＰＰ４と構造的に関連するタンパク質をコード
するクローンが発見された。

ＰＰ４およびＰＰ４−Ｘはともに、リボコルチン（ｌ１
ｐｏｃｏｒｔｉｎｓ、グルココルチコイド−誘発フォス
フォリバーセ阻害タンパク質、ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃ
ｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｌ　１ｐａｓ
ｅ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｎ、ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ。

Ｃ１ｒｉｎｏ　Ｇ、　　ら：　Ｏｒ、　Ｊ、　Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌ、　９２．５２１．１９８７）またはカルバ
クチン（ｃａｌｐａｃｔｉｎｓ、カルシウム依存性燐脂
質−およびアクチン−結合タンパク質、ｃａｌｃｉｕｍ
−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ−ａ
ｎｄａｃｔｉｒ＋−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ
％Ｋｒ１ｓｔｅｎｓｅｎ、　Ｔ、　　ら：Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ　２５．４４９７−４５０３．１９８６）
と呼ばれるタンパク質グループに属している。これらの
タンパク質、例工ｉ！ＰＰ４、ＰＰ４−Ｘ：Ｆ；Ｊ：び
ＰＰ４−δの他にリボコルチンｒおよび■は、抗凝固作
用を有する他に、フォスフォリバーゼＡ２を阻害する作
用を有する。

この科（Ｆａｍｉ　ｌｙ）のものは、−次構造に高度の
類似性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ’）を示し、これは中央の四
つの反復配列でとくに顕著である。これらの反復は、カ
ルシウム結合部位として機能すると考えられ、明かに燐
脂質の結合に関与すると考えられる。これとは対照的に
、末端配列はより多様で、アミノ末端領域は明かに生理
的活性の調節に役立っている。カルバクチンＩについて
示されたように、燐脂質の親和性は、Ｎ末端の近くのチ
ロシンおよび／またはセリン残基の燐酸化によって著し
く低減される。これとは対照的に、今までのところいか
なる機能的性質もカルボキシ末端領域に帰することは不
可能であった。

切断されたＰＰ４　（ＰＰ４−８と称する）を、ＰＰ４
の１３個のＣ末端アミノ酸をコードする領域を欠失させ
て、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）にて発現させることによ
って調製したが、驚いたことに、非欠失ＰＰ４よりも高
い抗凝固活性を示す。

抗炎症活性を有するタンパク質として、リボコルチンは
原形質膜の内側に位置し、例えば敗血症において活性化
され、プロスタグランジン−およびロイコトリエン−型
炎症メジエータ−の合成のための出発材料である膜脂質
アラキドン酸分子から遊離する酵素フオスフオリバーゼ
Ａ２を阻害する。

アスピリンまたはインドメタシン （ｉ　ｎｄｏｍｅｔｈａｃ　ｉ　ｎ）などの近年使用さ
れている抗炎症活性を有する医薬物のほとんどは、プロ
スタグランジン合成の酵素であるシクロオキシゲナーゼ
（ｅｙｅ　Ｉｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）を阻害し、それに
よって７ラキドン酸を炎症のメジエータ−に変換させる
可能な反応の一つを阻害する。これとは対照的に、グル
ココルチコイドは、膜脂質からのアラキドン酸の放出を
、おそらくリボコルチン科のタンパク質の合成の活性化
または刺激によって、阻害する。

しかし、多くの追加の反応、例えば高血糖症または高脂
血症、が炎症性疾患の治療において起きるかもしれない
ことが知られている。ＰＰ４、ＰＰ４−Ｘまたは、好ま
しくはＰＰ４−δ産生物の直接投与によって、これらの
望ましくない影響をさけることができよう。

敗血症において、マクロファージおよび単球（ｍｏｎｏ
ｃｙｔｅｓ）の他に、脂質分解的（ｌ　１ｐｏｌｙｔｉ
ｃ）系の活性化もあり、これに関連して、炎症のメジエ
ータ−の合成があるので、道篤な止血障害が起きる可能
性がある。これらは、トロンボプラスチンの暴露および
血管内放出に関係しており、これによフて播種住血管内
凝固（Ｄ　［Ｃ）　（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ。

Ｃ，Ｒ，ら：　Ｃ１１ｎ、　ｌｌａｅｍａｔｏ！、　　
１４．４１３−４４２．１９８５）が開始されるかもし
れない。実質的に、この高凝固的（ｈｙｐｅｒｃｏａｇ
ｕ　１ａｔｏｒｙ）状態を抑えるための、トロンボプラ
スチンの中和による二つの方法が記述されている。

第一は、酵素「トロンボプラスチナーゼ」（Ｇｏｌｌｕ
ｂ、　Ｓ、ら：　Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｄｉａｔｈ、　Ｈａ
ｅｍｏｒｈ、　７．４７０−４７９．１９６２）の投与
による治療的方法であって、これはその脂質分解活性の
ために、組織因子を不活性化するが、加えて、細胞膜上
に損傷効果をもたらすかもしれない。

第二に、治療的方法、すなわちトロンボプラスチンアポ
タンパク質（Ｃａｒｓｏｎ、　Ｓ、０．ら：　Ｂｌｏｏ
ｄ　６６．１５２−１５６．１９８５）に対するモノク
ローナル抗体の使用があるが、これは最近の技術では、
この型の抗体がヒト以外の生物からしか得られないとい
う欠点がある。

これとは対照的に、ＰＰ４、ＰＰ４−Ｘまたは、好まし
くはＰＰ４−δを投与して、同種の（ｒｔｏｍｏｌｏｇ
ｏｕｓ＞系で凝固因子の消費またはタンパク分解的不活
性化したが）て出血することなく、治療を行うことが可
能である。

したがって、本発明は、ＰＰ４−δ、遺伝子操作による
その調製および医薬物、好ましくは止血剤としてのその
使用に間する０本発明は、例および特許請求の範囲にさ
らに記述される通りである。

例！−１３個のＣ末端アミノ酸を切断したＰＰ４タンパ
ク質（ｒＰＰ４−δ」）の構築 Ｇｒｕｎｄｍａｎｎら（前出）によって記述された５２
３５塩基対の大きざのプラスミドｐＭｃ５−８−ＰＰ４
−Ｎ　ｃ　ｏ　Ｉを、既知のギャップドデュブレックス
法（ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ　ｍｅｔｈｏｄ％Ｋｒ
ａｍｅｒら：Ｎｕｃ１．　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２
．９４４１−９２５６．１９８４）による突然変異誘導
（ｍｕ　ｔａｇｅｎｅｓ　ｉ　ｓ）のための出発プラス
ミドとして用いた。突然変異誘導のために、ｐＭｃ５−
８−ＰＰ４−Ｎｃｏ　Ｉプラスミドを含む細菌コロニー
から出発して、先ずＤＮＡ−末鎖を組換えＦ１細菌ファ
ージのかたちで単離した。この環状−木鎖分子を、次い
で突然変異誘導用ベクター　ｐ　Ｍ　ａ　−５−８の適
当な消化の後に作出された３７６５塩基対の大きさのＥ
ｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ断片と連結させてから単離して、次
のオリゴデオキシヌクレオチドを用いる既知のギャップ
トデュブレックス法の突然変異誘導段階に供した。

５’　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　３’突然変異誘導が起きた後、アンピシリ
ン耐性コロニーを、Ｆ１バクテリオファージで感染させ
てから一本鎖ＤＮＡを単離して、突然変異ＤＮＡ区分を
次の配列決定用ブライマーを用いてジデオキシ配列決定
法（Ｓａｎｇｅｒら：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４．５４６３−５４６７．１９７
７）によって配列決定した。

５′３Ｆ Ｆｌの一本鎖分析によって所望の突然変異な示す細菌ク
ローンを増殖させて、プラスミドＤＮＡを既知の方法に
て単離した。このプラスミド（ｐＭａ−５−８−ＰＰ４
−Ｎｅｏ　Ｉ−δと称する）を、Ｎｃｏ　ＩおよびＨｉ
ｎｄＩＩＩで消化して、１３０７塩基対の大きさの断片
を単離して、同じ酵素で処理した発現ベクター１）　Ｔ
　ｒ　ｃ　９９Ａ　（Ａｍａｎｎら：Ｇｅｎｅ　６９．
３０１−３１５．１９８８）中に連結させた。得られる
プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−ＰＰ４−δは、１３個のア
ミノ酸が切断されたＰＰ４タンパク質を産生ずることが
でき、ＰＰ４およびＰＰ４−δのＣ末端をコードするＤ
ＮＡ配列の比較は、次のようになる。

Ｐ」工Ａニー Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　？ｙｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｊ
ｕａ　Ｉ４ｕ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌ
ｙ　ＧｌｕＡｓｐ　Ａｓｐ停止 ＴＣＴ　ＧＧＧ　ＧＡＣＴＡＴ　ＭＧ　ＡＡＡ　ＧＣＴ
　Ｃ？！’　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＣＴＣＴＧＴ　ＧＱＡ　
Ｇ入ＡＧＡＴ　　ＧＡＣＴＡＡ Ｐ二ａＩＬ二改 Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｇｐ停止 ＴＣＴ　ＧＧＧ　ＧＡＣＴＡＡ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＧＣ
Ｔ　ＣＴＴ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＣＴＣＴＧＴαスω１Ｃ
ＡＴ　ＧＡＣＴＡＡ 新たなプラスミド１）ＴＩ・ｃ９９Ａ−ＰＰ４−８は、
プラスミドｐ　Ｔ　ｒ　ｃ　９９　Ａ−Ｐ　Ｐ　４　（
Ｇｒｕｎｄｍａｎｎら：前出）と全く同様に、５４２７
塩基対からなるが、挿入されたＴＡＡ停止コードンのた
めに、ｔ　ｒ　ｃブローモーターの誘導後に、１３個の
アミノ酸が切断されたＰＰ４タンパク質を発現する。Ｐ
Ｐ４−δと称されるこの新タンパク質は、ウェスタンプ
ロットおよびＰ　Ｐ　４に対する抗血清を用いる免疫沈
降試験において反応し、ＰＰ４の精製法と同様にして調
製することができる。二つのタンパク質の分子量の違い
が、ＰＰ４およびＰＰ４−δのゲル電気泳動による分画
およびクマシーブルー（Ｃｏｏ慣ａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ
）染色の後に観察することができる（ＰＰ４：約３２ｋ
Ｏ１ＰＰ４−δ：約３０ｋＤ）。

大腸菌細胞抽出物から二つのタンパク質を精製してトロ
ンボプラスチン阻害試験に供したところ、ＰＰ４よりも
ＰＰ４−δの方が高い比活性を有することが今や見出さ
れた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、トロンボプラスチン阻害試験においてＰＰ４よりも
   高い活性を有しておりＣ末端アミノ酸に欠失を有してい
   る、タンパク質ＰＰ４−δ。 ２、１３個のＣ末端アミノ酸を欠失している、請求項１
   に記載のタンパク質ＰＰ４−δ。３、医薬物としての、
   請求項１または２に記載のタンパク質ＰＰ４−δ。 ４、請求項１または２に記載のタンパク質ＰＰ４−δお
   よび不活性担体を含んでなる、治療用組成物。 ５、タンパク質ＰＰ４−δをコードするｃＤＮＡを発現
   系に導入すること、およびそれを発現系において発現さ
   せることを含む、請求項１または２に記載のタンパク質
   ＰＰ４−δの調製法。 ６、凝固障害の治療のための医薬物の調製のための、請
   求項１または２に記載のタンパク質ＰＰ４−δの使用。