PT87083B - Processo para a preparacao de uma proteina anticoagulante vascular, de adn que codifica para esta proteina e de composicoes farmaceuticas que a contem - Google Patents

Description

Memória descritiva referente à patente de invenção de BOEHRINGER INGELHEIM INTERNACIONAL, GMBH, ale ma, industrial e comercial, com se de em D-6507 Ingelheim am Rhein, República Federal Alema, (inventores! Dr. Rudolf Hauptmann, Dra· Ingrid Maurer-Fogy, Prof. Dr.Gerhard Bodo, Prof. Dr. Peter Swetly, Dr. Christian Stratowa e Diplom Ing. Dr. Edgar Falkner, residentes na Áustria e Dr. Christian Ma ria Peter Reutelingsperger, residente na Holanda), para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA PROTEÍNA ANTICOAGULANTE VASCULAR, DE ADN QUE CODIFICA PARA ESTA PROTEÍNA E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE A CONTÊM.

MEMÓRIA DESCRITIVA objecto da presente invenção ê um processo para a preparaÇao de proteínas biologicamente activas e de moléculas de ADN que codificam para essas proteínas.

Na maioria dos mamíferos existem proteínas que apresentam propriedades de inibição da coagulaçao do sangue. Estas propriedades podem ser classificadas em três grupos, dependendo esta classificação dos diferentes mecanismos de acçao.

i t

Proteinas que formam um complexo com o factor de coagulaçao

A» e tornam deste modo o factor de coagulaçao inactivo. A esta classe pertencem as proteínas!

3· a )

b)

c)

d)

e) antitrombina-III (Thromb. Res. £, 439-452 (1974)) inibidor de protease (Ann. Rev. Biochem. 52 ? 655-7θ9 (1983)) macroglobulina (Ann. Rev. Biochem. 52, 655-709 (1983)) inibidor C^ (Biochemistry 20, 273&“2745 (1981)) a protease nexina (J. Biol. Chem aos pedaços por o desactivam em

258, 10439-10444, 19831 via proteolítica o faconsequência. A única

Proteínas que cortam ctor de coagulaçao e proteína deste tipo descrita até agora é a proteúa C (J Biol. Chem. 251, 355-363, (1976)).

Protejhis que criam uma blindagem e/ou hidrolisam os fosfolí pidos carregados negativamente de forma a que as do mecanismo da coagulaçao do sangue dependentes lípidos sao inibidas folipases isoladas a partir de diferentes tipos de de serpentes (Eur. J. Biochem. 112, 25-32 (1980)).

reacçoes dos fosfoAté agora apenas foram descritas fosvenenos diveranos. Ê sistema de coagulaçao que decorre em sas fases tem sido estudado intensivamente nos últimos considerado como um sistema de diversas fases que se reforçam constituído por diferentes reacçoes proteolíticas ligadas entre si, nas quais uma enzima» o zimogénio, se transforma na forma activa (ver Jackson C. M., Nemerson Y., Ann Rev. Biochem 49, 765-8II, (I98O)). A velocidade desta reacçao é amplificada de modo decisivo pela presença de fosfolípidos e de outros cofactores, como o factor Va e o factor VlIIa. In vivo as reacΛ, Ar A# çoes de procoagulaçao sao reguladas por meio de diferentes mecanismos de inibição que evitam um trauma trombôtico explosivo apôs uma pequena activaçao da sucessão de reacçoes de coagulaÇao.

Os mecanismos de anticoagulaçao podem ser cias

sificados do seguinte modo (Rosenberg, R. D. , Rosenberg, J. S. , J. Clin. Invest. 21» 1-6 (1984)):

1. 0 factor X de protease de serina e a trombina sao inacti- a

vados em seguida à respectiva ligaÇao à antitrombina III ou ao complexo antitrombina/heparina. Tanto a activaçao da protrombina como também a formaÇao da fibrina podem ser des te modo inibidas. Além da antitrombina III existem ainda diferentes outros inibidores de proteases do plasma,como por exemplo a macroglobulina Ag e a antitripsina, cuja acti vidade é dependente do tempo.

2. A descoberta da proteína C levou à revelaÇao de um outro mecanismo de anticoagulaçao. Uma vez a proteína C activada, actua como anticoagulante por meio da proteôlise selectiva dos factores proteicos factor V e factor VIII , através dos quais sao inactivadas a protrombinase e a enzima que transforma o factor X.

3- A plasmina cinde a fibrina 1 monomérica, um produto da acçao da protrombina sobre o íibrinogénio, evitando deste mo do a formaÇao de uma fibrina insolúvel (Nossel, H.L. , Natu re,

Das proteínas naturais intervenientes no processo da coagulaçao até agora apenas a antitrombina III se en contra em uso clínico. Na utilizaÇao desta proteína tem sido salientado no entanto como inconveniente principal a ocorrência dum aumento da predisposição para uma hemorragia.

Todos os agentes utilizados até agora como an ticoagulantes, sejam naturais ou sintéticos, tornam de qualquer modo os factores de coagulaçao inactivos e conduzem em | A / ** !

consequência a efeitos secundários que podem ter uma acçao in I conveniente sobre o processo da coagulaçao.

Surpreendentemente foi agora possível isolar

além dessas proteínas substâncias naturais que apresentam as propriedades pretendidas de inibição da coagulaçao do sangue em condiçoes particulares mas que nao aumentam o perigo de he morragia· Em hemorragias importantes estas proteínas perdem “| as suas propriedades inibidoras da coagulaçao do sangue e a | A* ATI sua utilização nao prejudica nestas casos os processos de coa| gulaçao necessários à sobrevivência. Uma vez que estas proteí ; nas foram isoladas pela primeira vez a partir de tecidos fortemente vascularizados foram designadas como proteínas anticoagulantes vasculares ou abreviadamente por ACV, também desi gnadas por proteínas VAC (Vascular Anticoagulating Proteind').

As proteínas isoladas a partir de tecidos for A* temente vascularizados, como os vasos do cordão umbilical e a 3 placenta, apresentam pesos moleculares de cerca de 70x10 , cer 3 3 3 ~ ca de 60x10 , cerca de 34x1o·⁷ e cerca de 32x10 , das quais as substâncias com os pesos moleculares respectivamente de 34 e de 32xlO^J sao compostas de uma única cadeia polipeptídica. A caracterizaçao pormenorizada destas proteínas bem como os pro cessos para o seu isolamento e para a sua purificação encontram-se descritos em EP-A-0 181 465 de 21 de Maio de 1986.

As proteínas com actividade ACV representam substâncias inibidoras da coagulaçao do sangue naturais que

A ***** intervem em duas ocasioes na cascata de reacçoes da coagulaçao do sangue.

Em primeiro lugar inibem a activaçao do factor X a X catalisada pelos factores IX e VIII e em segundo lua ~ a aj gar impedem a cisão da protrombina para dar lugar a trombina, í processo mediado pelos factores X e V . Ambas as fases de ac a a— tivaÇao tem em comum o facto de necessitarem de ioes cálcio e de fosfolípidos. Ê evidente que as proteínas ACV podem igualmente intervir em acçoes de permuta com fosfolípidos e por meio desta ligaçao bloquear as fases de activaçao dos factores de coagulaçao.

As suas propriedades tornam as proteínas subs tâncias activas interessantes e de extremo valor farmacológico. No entanto, a fim de ter à disposição estas proteínas em quantidades suficientes sob forma de alta pureza torna-se necessário outro processo para alem da via da purificaÇao das proteínas a partir de tecidos naturais. Para este fim é adequado o método da manipulaçao genética» objectivo da presente invenção e, por conseguinte, a preparaÇao por via de manipulaçao genética de pro l teínas com actividade ACV.

Este objectivo foi alcançado por determinação da sequência de ácidos aminados de fracçoes das proteínas com actividade ACV (EP-A-0 181 465) isoladas a partir de tecidos fortemente vascularizados após purificação em alto grau, preparaÇao de sondas de ADN sintéticas a partir destas sequências e exame com estas sondas de bancos de ADNc apropriados. Após isolamento dos ADNc que hibridam com as sondas, determinação

A *** das respectivas sequências bem como manipulaçao adequada, estes ADNc foram integrados e expressos em sistemas hospedeiros apropriados# por exemplo em bactérias, leveduras ou céliilas I de mamíferos.

Uma das proteínas purificadas foi cindida enzimaticamente por tripsina» Os peptídeos resultantes foram se parados e fragmentoÉ seieccionados foram sequenciados. No entanto, a sequência da extremidade N-terminal nao pode ser ana lisada directamente uma vez que o primeiro ácido aminado aparentemente está bloqueado.

Μ W M

As informações da sequenciaçao sao apresentadas na Figura 0.1.

Para a preparaÇao de sondas de ADN apropriadas sao fundamentalmente possíveis três vias. Se se conhece ' uma secção mais comprida da proteína, de cerca de 30 ácidos

aminados ou mais, existe a possibilidade, tendo em atençao a preferencia de utilizaÇao dos codoes pelos mamíferos, de dispor de uma sequência mais provável para a correspondente secção do ARNm. Uma sonda como esta é, no pior dos casos, homólo ga num grau de 66% com a sequencia em questão. Este facto es- j tá na base da exigência de que a sonda seja relativamente lon ga a fim de se poder hibridar em condiçoes nao críticas.

A segunda possibilidade baseia-se na síntese de oligonucleôtidos de todas as variações possíveis para- uma secção curta do peptideo, de cerca de seis a sete ácidos amimdos de comprimento. Quando se usam estas misturas complexas no escrutínio de bancos de ADNc, ê possível isolar relativamente muitos clones positivos falsos” que reagem. Alêm disso o sinal de hibridaçao torna-se muito fraco, uma vez que o 6ni co oligonucleétido que corresponde apenas está presente numa fracçao reduzida.

A terceira via nao depende da variabilidade de uma sonda de oligonucleótido mas sim da selecçao de um trifos | fato nucleodídico especial (ITP) de modo a que todas as molécuias da sonda se possam ligar ao ADNc pretendido (ou também ao falso). Deste modo sintetizaram-se por meio do trifosfato de inosina oligocucleôtidos de 23 bases de comprimento ada ptados ao peptideo triptico ‘P30/I&.

Conforme já mencionado, as proteínas ACV podem ser isoladas a partir de tecidos fortemente vascularizados. Os tecidos preferidos sao os vasos do cordão umbilical e a placenta· Para este fim₅ e uma vez que se sabe que na placenta, ao contrário de outros tecidos, quase todos os genes sao expressos, usaram-se as sondas acima mencionadas a fim de escrutinar um banco' de ADNc placentário, preparado a partir de tecido placentario de modo conhecido, para detecçao de moléculas de ADNc que codificam para as proteínas ACV.

A fim de investigar o banco de ADNc para dete

cçao de ADNc que codifique para proteínas ACV sintetizaram-se dois oligonucleútidos correspondentes à sequência do peptídeo P16/II e um correspondente à sequência do peptídeo Ataph A P20/I/6 (Fig. 1). Estes oligonucleútidos sao compostos em qual quer dos casos por uma mistura de todos os variantes tendo em

A» A» atençao todas as possibilidades de codificação do correspondente ARNm. 0 oligonucleútido EBI-386 apresenta 512 variações com um comprimento de cadeia de 20 nucleútidos e corresponde ao peptídeo Ataph A P2O/I/6. A fim de conseguir um número mais baixo de variações no oligonucleútido para o peptídeo tríptico P16/II foram sintetizados dois oligonucleútidos (de 20 bases).’ EBI-387·* 128 variações_} EBI-388: 64 variações.

Em seguida foram sintetizados dois oligonucle ótidos correspondentes ao peptídeo ACV tríptico P30/I por meio

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de utilização de desoxiinosina para base em posição de balanço (wobble) (Fig. 2): EBI-118 e EBI-119. Esta substituição foi descrita por E. Ohtsuka et al. , J. Biol. Chem. 260/5 (1985)5 pp. 2605-2608, bem como por Y. Takahashi et al., Proc. Nat. Acad. Sei. (1985)5 PP· 1931-1935· A inosina emparelha-se bem a» com a citosina mas distorce ligeiramente a formaÇao da dupla hélice quando se introduzem como par outros nucleútidos.

Depois de ter marcado por meio de isútopos ra dioactivos de forma conhecida estes oligonucleútidos, híbrida ram-se com eies réplicas de placas fágicas de acordo com méto dos conhecidos.

A partir da hibridaçao com EBI-386, EBI-387 e EBI-388 resultaram os fagos lambda-Pll/3» lambda-P6/5 e lambda-P6/6. A hibridaçao com EBI-118 e EBI-119 deu como resulta do os fagos Iambda-Nrl5? Iambda-Nrl9 ® lambda—Nr22.

i

Os ADNs isolados a partir dos fagos foram cor ί tadoe com EcoRI e os fragmentos correspondentes foram isola- | dos. As inserções de ADNc dos clones lambda-Pll/35 lambda-Pó/5 e lambda-P6/6 tinham dimensões de cerca de 1300 a 1400 pb. Por

rw A análise de sequenciaçao verificou-se que os tres clones eram todos derivados de um só ARNm. A extremidade 5' do ARNm falta va no entanto nos ADNc's. As inserções dos lagos Iambda-Nrl5» Iambda-Nrl9 θ Iambda-Nr22 tinham comprimentos de cerca de 1600 1100 e 1000 pb. Por análise de sequenciaçao foi possível dedu zir um ADNc integral aproximado.

Os ADNc's dos dois grupos de fagos lambda-Pll/3, lambda-P6/5 e lambda-P6/6 por um lado e Iambda-Nrl5» lambda-Nr-19 e Iambda-Nr22 por outro sao derivados de dois ARNm's diferentes» conforme se conclui por análise de sequenciaçao. As inserções de EcoRI dos três clones lambda-Pll/3» lambda-P6/5 e lambda-P6/6 foram isoladas e ligadas no vector Bluescri.be M13⁺ cortado com EcoRI (Vector cloning Systems» 377θ Tansy Street, San Diego» CA 92121). Os clones resultantes foram designados por pPó/5» pP6/6 e pPll/3·

As inserções de EcoRI dos três clones lambda-Nrl5» lambda-Nr-19 e Iambda-Nr22 foram isoladas e ligadas no vector Bluescribe M13⁺ cortado com EcoRI. Os clones resultantes foram designados por pRH201» pRH202 e pRH203·

A fim de obter outros clones de ADNc» escruti nou-se mais uma vez o banco lambda-gtlO placentário humano» desta vez utilizando como sonda a inserção de pPll/3 marcada por isótopos radioactivos.

No total foram obtidos 69 clones reactivos po sitivos (lambda-VACl a lambda—VAC69)· >

j i i destes clones foram preparados em pequena ; escala conforme acima descrito, as inserções de ADNc foram li bertadas com EcoRI e foram isoladas. Como resultados destas operaçoes verificou-se que a inserção do clone Íambda-VACIO contêm o quadro de leitura integral que codifica para proteínas ACV. Para a caracterizaçao dos ADNc's que codificam para ACV-beta foram realizadas uma experiência de análise por man8

cha de Northern, análises de sequenciaçao e uma análise deman cha de Southern genómica· resultado é apresentado na Fig· 3· 0 ADNc do clone pPll/3 hibridou com um ARNm de cerca de 17θ0 bases (”ACV-alfa”) e o ADNc do clone pRH2O3 com um ARNm com a dimensão de cerca de 2200 bases (”ACV-beta”).

Uma vez que, em primeiro lugar, a quantidade de radioactividade utilizada e a quantidade de ARNm utilizado por vestígio eram aproximadamente iguais, e, em segundo lu gar, a hibridaçao de um genoma na mesma solução deu bandas de igual intensidade com ambos os ADNc* s (ver em seguida) deverá concluir-se que o ARNm curto (ACV-alfa) se encontra na placenta em maior quantidade do que o ARNm mais longo (ACV-be— i ta”) na placenta. j i

Para análise da sequência do ADNc da ACV-alfa I

I sequenciaram-se totalmente os clones de ADNc pP6/5, pP6/6 e ! pPll/3, e parcialmente os dos clones lambda-VACl a lambda-VAC- | 12. 0 resultado está representado na Fig. 4. Globalmente se- ! quenciaram-se 1465 bases. 0 ADNc apresenta um longo quadro de | leitura livre que pode codificar para 320 ácidos aminados. Se j a sequência de ADN se traduz numa sequência de ácidos aminados, todos os peptídeos sequenciados dos fragmentos trípticos podem ser acomodados nesta sequência (Fig. 5)· Trata-se por conseguinte nestes ADNc de cada um dos correspondentes ARNm para ptoteínas ACV. Uma vez que a sequência do segundo ADNc isolado codifica para uma proteína similar mas diferente esta foi designada com o nome ACV-alfa.

i primeiro codao ATG (bases 35 a 37) precede i no mesmo quadro de leitura um codao de paragem. As bases 3θ a 3o estão razoavelmente de acordo com a regra de Kozak (M. Ko~ zak, Nature 3θθ (1984), pp. 241-246), que indica a sequência de consenso na vizinhança do codao de início de traduçao com • CC(A/G)CCAUGG, sendo a sequência correspondente neste caso

TCGCTATGG. A região 3’ nao traduzida tem um comprimento de 471

A, bases. 15 bases antes do início da secção poli-A encontra-se j a sequência de poliadenilaçao AATAAA (N.J. Proudfoot et al. , t Nature 263 (1976)? PP· 211-214). Quando a cadeia conta com 150 I a 200 bases para a secção poli-A do ARNm, o comprimento to- j tal do ARNm é de 1600 a I65O bases em virtude da sequência de ΐ ADNc. Uma vez que na experiência de mancha de Northern tinha sido determinado um valor superior» a região 5’ nao traduzida I nao contém todos os ADNc's completos. j i

ADNc do clone pPo/5 apresenta em oposição a I a» todos os outros clones de ADNc na posição 100 C em vez de A. Deste modo o tripleto 98—100 (22° codao) seria transformado de GAA em GAC e codificaria para Asp em vez de para Glu. Esta al teraÇao pode ter vários motivos: a) a transcritase reversa in corpora um nucleétido errado» b) trata-se de dois alelos na transcrição de genes diferentes neste local ou c) existem dois genes nao alélicos que sao diferentes nesta posição.

longo quadro de leitura codifica para uma

I proteina com 320 ácidos aminados de que provavelmente foi eli minada a Met-1 e a alanina seguinte no grupo amina foi bloque ! ada possivelmente por acilaçao. 0 peso molecular calculado foi · de 35 896 D e é superior ao valor de acordo com SDS—PAGE. No entanto, a fracçao de écidos aminados carregados (Asp, Glu, 1 Lys, Arg e His) com 3O»6% (98/320) é em média alta em compara j çao com o valor médio de 25»!%· Deste modo explica-se o dife- j rente dimensionamento da proteína por SDS-PAGE. De entre os | ácidos aminados fortemente carregados sobressaiem os ácidos j aminados de carácter ácido (Asp e Glu) com 54 em comparaçao !

com os de carácter básico (Lys e Arg) com 41. Este facto explica o ponto isoeléctrico ácido da proteína ACV-alfa (pl=4,4 a 4,8). A proteína ACV-alfa contém apenas um tripleto que codifica para a cisteína (ácido aminado na posição 3X6)J nao existe um local de N-glicosilaÇao típico (Asn-XXX-Ser/Thr).

Uma análise estrutural da sequência de ácidos

aminados (modificada segundo Pustell, J et al. , Nucleic Acids Res. 10 (1982)_} pp 4765-4782) dá uma repetição quádrupla de uma sequência com 67 ácidos aminados de comprimento (Fig· 6), ** A seguidamente chamada repetição”. No interior desta sequencia estão 7 ácidos aminados (10,4%) que se conservam em todas as quatro repetições, 15 ácidos aminados (22,4%) ocorrem em tres das quatro repetições e em 28 posiçoes (41,8%) duas repetições contem os mesmos ácidos.

Uma comparaçao com literatura publicada (M.J. Geisow, FEBS Letters 203 (1986), pp 99-103, M.J. Geisow et al, TIBS 11 (1986), pp. 420-423) revelou surpreendentemente que a proteína ACV-alfa pertencia a um grupo maior de proteínas com ' ligações a fosfolípidos dependentes de Ca⁺⁺. Foi descrita uma sequência de consenso (Lys-Gly-fob-Gly-Thr-Asp-Glu-var-var- ; -Leu-Ile-fil-Ile-Leu—Ala-fob—Argj fob=hidrófobo, filehidrofílico, var»variável) que pode estar implicada na ligaçao de Ca⁺⁺ (M. J. Geisow et al. , Nature 320 (1986), pp. 636-638). Es ta sequência encontra-se em todas as quatro sub-sequências de 67 ácidos aminados de comprimento das proteínas da presente invenção (Fig. 6). , ί

Ê também surpreendente a secção de 6 ácidos aminados de comprimento na extremidade de cada repetição que se compõe quase exclusivamente de ácidos aminados hidréfobos ; (000000” na Fig. 6).

A análise da sequência dos clones Nrl5, Nrl9 e Nr22 dá para o ADNc da proteína ACV-beta 1940 pb, que passam por uma secção poli-A (Fig. 7)· 16 bases antes desta secção poli-A encontra-se o sinal de poliadenilaçao AATAAA. Efectiva

A ** ;

mente esta sequencia de consenso ocorre nas posiçoes dos nu- ;

I cleótidos 1704-1709· Nao se sabe se esta sequência nao é usa*v A da como sinal de poliadenilaçao. A sequencia adicional necessária no lado 3’ da sequencia AATAAA, YGTGTTYY (Gill A. et al, | Nature 312 (1984), pp. 473-474), sé ocorre relativamente afas tada (TGTGTTAT, posição 1735-1742)5 é possível que este facto

AZ Α* Λ seja a causa da nao aceitaçao desta primeira sequencia de poliadenilaçao.

ADNc contém um longo quadro de leitura que se estende desde o início do ADNc até à posição 1087· Ê abran gido um potencial de codificação para 3&2 ácidos aminados. Em virtude da analogia com·a proteína ACV-alfa e com base no fac to de que também ocorre uma proteína de 34 000 D na purificação da proteína ACV (ver E.P.A. 181 465) tomou-se o primeiro codao para a metionina (ATG, posição 107-109) como início da

AZ AZ _ A» traduçao. A regra de Konzak nao e aqui tao bem verificada como para a proteína ACV-alfa (AAGAGATGG) na posição 102—110). A proteína resultante (ACV-beta) tem um comprimento de 327 áci dos aminados. Contém 4 resíduos de cisteína (posiçoes de ácidos aminados 161, 206, 250 e 293) © um local de N-glicosilaÇao potencial (Asn-Lys-Ser, posiçoes de ácidos aminados 225-227)· 0 peso molecular calculado é de 36 837 (Fig· 9)· Também na proteína ACV-beta há em média muitos resíduos carregados: 97/327 (29,6 %), sendo preponderantes os ácidos aminados de carácter ácido (Asp+Glu: 49) em relaçao aos de carácter bá sico (Lys+Arg: 42); este facto pode explicar o menor peso molecular determinado por SDS-PAGE.

Também a proteína ACV-beta apresenta uma repe tição interna de uma sequencia de 67 ácidos aminados (Fig. 8). No interior desta sequência estão 7 ácidos aminados (10,4 %) que se conservam em todas as quatro repetições, 17 ácidos ami nados (25,4 %) ocorrem em três das quatro repetições e em 25 posiçoes (37,7 %) duas repetições contêm os mesmos ácidos ami nados. Também a proteína ACV-beta apresenta boa concordância com a sequência de consenso de 17 ácidos aminados de comprimento. As características para a proteína ACV-alfa sao válidas de modo análogo para a proteína VAC-beta. Por meio de mutagénese dirigida neste domínio é possível experimentar alterações na actividade biológica das proteínas· De acordo com a

AZ AZ presente invenção consideram-se por exemplo mutações de substituição integral ou parcial do domínio que codifica para os

ácidos aminados da região conservada.

Na comparaçao das proteínas verifica-se que as diferenças mais acentuadas entre as proteínas se situam nos peptídeos N-terminais. As modificações de acordo com a presen te invenção preveem portanto a permuta recíproca destes peptí deos N-terminais. Ê possível preparar estas proteínas modificadas por meio da preparaçao das moléculas de ADN que codificam para estes peptídeos N-terminais» por exemplo por síntese de oligonucleótidos de modo conhecido em si» e da ligaÇao com o resíduo de ADN que codifica para as repetições restantes e ** A» para a secção do adaptador. Pode ser provocada a expressão de

A/ vectores de expressão munidos deste ADN de modo conhecido em organismos hospedeiros adequados} a proteína expressa ê isola da e purificada.

A análise de ADN cromossomal a partir de placenta humana de acordo com Southern mostra um quadro complexo. 0 ADN foi cortado com EcoRI, HindIII, BamHI e PstI. Apóstrans ferência para nitrocelulose o ADN foi hibridado com um ADN de ACV-alfa (pPll/3) e também com um ADN de ACV-beta (pRH2O3). Se

A* bem que a lavagem do filtro se tenha realizado sob condiçoes críticas» foram obtidas sempre em todas as digestões muitas bandas (Fig. 10). A comparaçao das duas analises de manchamos tram que nestas condiçoes é de excluir uma reacçao cruzada en tre o ADN de ACV-alfa e de ACV-beta. 0 grande número de bandas deverá ser antes explicado pela existência de genes semelhantes ao gene da ACV-alfa ou da ACV-beta ou então trata-se de um único gene interrompido por muitos introes e/ou por introes de grande dimensão.

Na Figura 11 apresenta-se uma comparaçao das sequências de ácidos aminados de proteína ACV-alfa com a proteína ACV-beta. As estruturas repetidas podem ser ordenadas

A» de igual modo nas duas proteínas. Os peptídeos composto sao igualmente de igual comprimento com excepçao do entre a 2^â e a 3^ft repetição. Neste peptldeo composto deve introduzir-se na

proteína ACV-alfa uma lacuna a fim de permitir um ajustamento óptimo das duas sequências. 0 peptídeo N-terminal das duas pro teínas tem comprimento diferente, 19 ácidos aminados na ACV— -alfa e 25 ácidos aminados na ACV-beta. Este peptídeo apresen ta também a homologia mais reduzida. As duas proteínas sao idênticas em 176 de 320 posiçoes de ácidos aminados, o que cor responde a um grau de homologia de 55>θ )·

Neste local deverá ser introduzida também a comparaÇao das sequências de nucleótidos dos ADNc's das proI teínas ACV-alfa e VAC-beta. Se se comparam dois genes e os respectivos produtos entre si verifica-se a existência nos ADN (eARN) de uma maior homologia do que ao nível dos ácidos aminados, o que se pode explicar pelo facto de nos dois ácidos nucleicos bastar uma alteraçao num tripleto de bases para um novo ácido aminado.

Na Figura 12 apresenta-se a comparaÇao das re gioes de codificação dos ADNc's de ACV-alfa e ACV-beta· Surpreendentemente os ADNs mostram apenas um grau de homologia de 5^,2 %, deste modo um pouco menor que o das duas proteínas.

Na Figura 13 mostram-se os perfis de hidrofilicidade das duas proteínas. Neste caso alterou-se o algoritmo de Hopp e Wood (T.P. Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sei.

(I98I), pp. 3θ24-3828). Os quatro domínios de repetição es tao indicados por meio de barras, que encaixam os compostos i peptfdeos nas sequências dadas abaixo. Surpreendentemente o composto peptídeo entre a segunda e a terceira repetições é particularmente hidrofílico. Neste peptídeo encontra—se tanto na proteína ACV-alfa como também na proteína ACV-beta uma arginina em idêntica posição. Seria portanto possível que essa arginina constituisse um ponto de ataque preferido para uma protease com especificidade do tipo da tripsina. Deste modo a molácula deveria dividir-se em duas metades de dimensão aproximadamente igual. Seria previsível que já uma semi-molécu• la destas pudesse ostentar uma actividade biológica,por exem

pio uma acçao anticoagulante. Além da digestão dirigida das proteínas por exemplo com uma protease com uma especificidade do tipo da da tripsina, estas semi-molêculas podem ser obtidas tal qual ou com ligeiras modificações de muitos outros mo dos diferentes. Deste modo, é possível introduzir em vectores de expressão apropriados moléculas de ADN obteníveis de acordo com métodos conhecidos em si que codifiquem para estas semi-moléculas de modo a que esses ADNs sejam regulados pelas

A ** ** ** sequências de regulaÇao da expressão e obter a expressão dessas semi-molêculas cultivando um organismo hospedeiro trans formado com esses vectores, isolando-as e purificando-as em seguida.

Obtêm-se semi-molêculas com pequenas modifica M A» A* çoes por exemplo por introdução de locais de cisão que conferem à proteína total a especificidade necessária para determi nadas proteases. Deste modo ê possível por exemplo preparar uma proteína com um local de cisão com especificidade do tipo da do factor X por meio da introdução na secção que codifica para a sequência do adaptador entre a segunda e a terceira es trutura repetida de um tetrapeptídeo de reconhecimento da pro tease do factor X · Deste modo obtêm-se em primeiro lugar uma proteína integral que apresenta possivelmente propriedades mo dificadas, por exemplo uma estabilidade diferente ao ataque proteolítico e que contém, por outro lado, um local altamente específico para a protease de factor X , sendo possível deste a modo preparar as duas semi-molêculas pretendidas tornando-as disponíveis para a utilização terapêutica.

Por meio de mutaçao dirigida do ADN que codifica para proteínas com actividade ACV ê possível além disso preparar proteínas que resistem melhor a um ataque proteolíti co. Deste modo a permuta da arginina comum às proteínas ACV

-alfa e ACV-beta entre a segunda e a terceira estrutura repetida por histidina, por exemplo, dá origem possivelmente como consequência a uma melhoria da estabilidade das proteínas.Tam ·

A» ’ bém a substituição dirigida da referida arginina e da lisina por histidina, possível por substituição dos correspondentes

codoes, dá origem a proteínas que podem ser dificilmente hidrolisadas pela tripsina. Estas mutações dirigidas deixam essencialmente inalteradas as propriedades biológicas das pro— teinas/peptídeos, por exemplo as propriedades anti-coagulantesj mas levam, por outro lado, a alterações, por exemplo a melhorias da estabilidade das proteínas, isto ê, a uma altera çao do período de semi-vida das proteínas.

Em muitos casos ê vantajoso, por exemplo para a expressão das proteínas, juntar à proteína ou ao peptídeo maduro pretendido uma sequência de sinal ou ainda uma sequência proteica própria do organismo hospedeiro, resultando como produto da expressão uma proteína de fusão. A sequencia de si nal que codifica para um peptídeo de sinal pode ser de origem microbiana ou pode também resultar de células de mamífero; de preferência o peptídeo de sinal é homólogo ao organismo hospe deiro. A fim de poder transformar estes produtos na proteína madura desejada é necessário um local de cisão específico entre a fracçao de sinal/fracçao de fusão e a proteína madura. Para este fim pode-se por exemplo, como descrito acima, intro duzir neste local um oligonucleótido que codifique para o tetrapeptídeo de reconhecimento da protease de factor X · Deste modo toma-se possível cindir a protelúa de fusão com a protease de factor X^. Obtêm-se a proteína madura.

Quando se substituem especificamente os codoes A» responsáveis pela metionina, excepto o na posição do ácido ami nado 1, por codoes que codificam para leucina, isoleucina ou valina, torna-se possível transformar uma eventual proteína i imatura ou proteína de fusão na proteína madura por cisão por meio de BrCN.

No caso de se verificar que uma proteína modificada deste mo- | do apresenta propriedades biológicas iguais ou eventualmente |

A* i melhoradas, teremos uma via possível para a elevaçao do rendi j mento e eventualmente um processo para a preparaçao de proteí nas com propriedades melhoradas em relaçao as proteínas ACV naturais.

Uma outra mutaçao dirigida a mencionar é cons tituida pela permuta específica de uma ou eventualmente váA* rias cisteínas por serina ou valina, por permuta dos codoes correspondentes. Se esta permuta nao influencia a actividade biológica negativamente, esta via pode constituir um melhoramento do isolamento e/ou do rendimento das proteínas. Nao se deve excluir também neste caso uma melhoria das propriedades das proteínas. Outra mutaçao prevista é a combinação de diferentes sequências integrais ou parciais dos ADNs que codifií cam para as proteínas da presente invenção, obtendo-se proteí nas híbridas com propriedades anti-coagulantes vasculares. Os

A>» A* processos para a preparaçao de todas estas mutações ou de mutações semelhantes e dos ADNs que codificam para estas proteí

A» nas sao igualmente abrangidos pelo âmbito da presente invenção.

A partir da Figura 13, ê, para além do referido, fácil reconhecer que tanto a proteína ACV—alfa como a ACV -beta apresentam um domínio hidrófobo de maior dimensão que permite a secreção através duma membrana ou a integração das proteínas na própria membrana. Ê portanto de aceitar que as proteínas ACV-alfa e ACV-beta sao proteínas intracelulares.

I

I I

Wallner et al. (Nature 320 (1986), pp. 77—81) ;

I referem a estrutura da lipocortina I humana e Saris et al. ι (Cell 46 (1986), pp. 201-212) e Huang et al. (Cell 46 (1986), pp. 191-199) a estrutura da calpactina murina ou humana, também chamada lipocortina II. Estas proteínas pertencem igual- | A. >

mente a classe das proteínas de ligaçao de fosfolípidos depen ' dentes de Ca . A sua estrutura pode ser descrita de modo ana j logo à das proteínas ACV-alfa e ACV-beta (Figura 14). A homo- i logia entre as proteínas ACV-alfa e ACV-beta ê porém mais pro ; nunciada do que entre cada uma das proteínas ACV e as lipocor : tinas: I

ACV-alfa - ACV-beta : 55,0 %

ACV-alfa - lipocortina I í 41,9 %

ACV-alfa - lipocortina II í 43,8 %

ACV-beta - lipocortina I '· 41,7 % ACV-beta - lipocortina II · 44,6 %

Deverá portanto admitir-se que as lipocortinas possuem, em virtude da sua estrutura análoga, uma acçao anticoagulante, e, em consequência podem ser utilizadas como agen tes contra a coagulaçao e alem disso que esta acçao e uma pro priedade geral desta classe de proteínas de ligaçao de fosfoufa lípidos dependentes de Ca . Em virtude da analogia de estruturas ê possível também explicar que as proteínas da presente invenção apresentam além da actividade anticoagulante também as propriedades já conhecidas das proteínas de ligaçao de fos folípidos dependentes de Ca⁺⁺. Por exemplo podem referir-se a este propósito as propriedades antiinflamatórias das lipocortinas. A actividade inibidora da fosfolipase própria destas proteínas pode também ser demonstrada para as proteínas dapre sente invenção.

M objectivo da presente invenção abrange por conseguinte um processo para a preparaçao de composiçoes farmacêuticas antiinflamatótias contendo as proteínas obtidas pe lo processo da presente invenção bem como de composiçoes farmacêuticas óteis para o tratamento de afecçoes para as quais ê válida a indicaçao de lipocortinas, como seja por exemplo de doenças reumáticas. Também nestes processos se considera abrangido o uso dos produtos obtidos a partir das proteínas naturais de acordo com a presente invenção do modo anteriormente referido e com as respectivas propriedades eventualmente melhoradas.

Na comparaçao das proteínas ACV-alfa, ACV-beta, lipocortina I e lipocortina II verificou-se que as diferenças constatadas entre estas proteínas ocorriam nos peptidos N-terminais, especialmente entre as proteínas ACV por um lado e as lipocortinas por outro. Uma modificação de acordo com a presente invenção consiste por conseguinte na permuta destes peptídeos N-terminais. Estas proteínas modificadas po

dem ser preparadas por preparaçao das moléculas de ADN que co dificam para estes peptídeos N-terminais, por exemplo por meio de síntese de oligonucleótidos de acordo com métodos conhecidos em si, e por ligaÇao com o restante ADN que codifica para as repetições restantes e para a secção adaptadora· Pode ser w A# provocada a expressão de vectores de expressão contendo estes ADNs modo conhecido em organismos hospedeiros, isolando-se e purificando-se em seguida as proteínas expressas.

Muitos membros da classe das proteínas de ligaçao de fosfolípidos dependentes de Ca ^{+ +} ligam-se a vesículas de secreção purificadas ou a outros componentes do citoesqueleto (ver R.H. Kretsinger et al. , Nature 320 (1986), p. 573 para uma revisão de conjunto). Durante a secreção, as vesículas do aparelho de Golgi das células descapsulam-se, migram para as membranas celilares e fundem-se com estas. Deste modc liberta-se o conteúdo das vesículas no espaço exterior das cê

A# A* lulas. Por analogia com a excitaçao na contracçao muscular, foi sugerido (W.W. Douglas, Br. J. Pharmac. 34 (1968), 451) que o estímulo e a secreção também estão ligados à ocorrência de C⁺⁺. Neste processo as proteínas de ligaÇao dos fosfolípidos podem desempenhar um papel importante. Na região conserva da de 17 ácidos aminados de comprimento todas as repetições apresentam na proteína ACV-alfa 5 a 6 ácidos aminados contendo grupos hidroxilo (Asp, Glu, Thr e Ser), estando três destes ácidos aminados sempre em posição idêntica. Na proteína ACV-beta encontram-se em cada repetição quatro destes ácidos ami nados. Se bem que nenhuma das proteínas apresente a estrutura em EF observada em calmodulina, troponina C, S-100 e parvalbu mina (R· H. Kretsinger et al. , CRC Crit. Rev. Biochem. 8 (1980), p. 119)» que nestas moléculas é responsável pela ligaÇao do

4,4, IV

Ca , a conservaÇao deste subconjunto em todas as repetições leva à conclusão de que esta região é responsável pela ligaÇao do Ca⁺⁺.

Por meio de mutações dirigidas neste domínio foi possível experimentar alterar a actividade biológica das

proteínas. As mutações de acordo com a presente invenção podem ter como resultado a substituição integral ou parcial do domí nio que codifica para os 17 ácidos aminados da região conservada í

a. a partir das proteínas ACV por domínios que codificam para os correspondentes ácidos aminados das lipocortinas#

b. a partir da proteína ACV-alía por domínios que codificam para os correspondentes ácidos aminados da lipocortina II e vice-versa,

c. a partir da lipocortina I por domínios que codificam para os correspondentes ácidos aminados da lipocortina II e vice-versa,

d. a partir das lipocortinas por domínios que codificam para os correspondentes ácidos aminados das proteínas ACV ou

e. nos referidos polipeptídeos/proteínas por domínios que co dificam para os correspondentes ácidos aminados de cada um dos outros polipeptídeos/proteínas >

por permuta dos domínios correspondentes que codificam para estes ácidos aminados.

A estrutura análoga referida acima permite pre ver além disso que as proteínas que apresentam esta analogia possuem acçoes tanto anti-inflamatétias como anti-coagulantes e sao, em consequência, utilizáveis de modo correspondente pa ra fins terapêuticos e/ou profiláticos.

Está abrangido no âmbito da presente invenção, por conseguinte, um processo em que se incorporam os peptídeos obtidos pelo processo de acordo com a presente invenção para a j preparaçao de agentes anti-inflamatérios ou anti-reumáricos ou úteis para as indicações para que se usam as lipocortinas, ! os polipeptídeos/proteínas que apresentam domínios de repeti- !

«Μ *>» çao para a preparaçao de agentes inibidores da coagulaçao do sangue, de agentes inibidores da trombina, de agentes anti-in flamatérios ou de agentes anti-reumáticos, lipocortinas para a preparaçao de agentes inibidores da coagulaçao do sangue, agentes inibidores da trombina ou úteis para as indicações das

proteínas ACV, considerando-se expressamente excluida a utiii A* zaçao de proteínas com os referidos domínios de repetição na parte em que sao já conhecidas e descritas em pedidos de patentes anteriores.

A presente invenção abrange ainda um processo ; Λ* /V _A j para a preparaçao de composiçoes farmacêuticas que compreende incorporar uma quantidade activa de um destes polipeptídeos em conjunto com adjuvantes farmaceuticamente inertes.

A ** âmbito da presente invenção abrange ainda um processo para a preparaçao de moléculas de ADN que codificam para um polipeptídeo/proteína com domínios de repetição, de moléculas de ADN que codificam para um domínio de repetição, ou de molécula de ADN que contêm no devido ordenamento domínios que codificam para as repetições integrais bem como das proteínas codificadas por aquelas.

Os processos para a preparaçao de todas aspro teínas contendo estas mutações ou mutações semelhantes e dos ADNs que codificam para aquelas estão igualmente incluidos no âmbito da presente invenção, considerando-se expressamente ex cluidos os processos de preparaçao de proteínas e de ADNs que codificam para essas proteínas na parte em que sao já conheci dos e descritos em pedidos de patentes anteriores.

Também está abrangido no âmbito da presente in vençao um processo para a preparaçao de moléculas de ADN de origem nao humana e das proteínas codificadas por aqueles ADNs que possam ser preparadas de modo análogo ao descrito de acor do com a presente invenção.

Está abrangido pela presente invenção nao ape ** A nas o processo para a preparaçao de sequências de genes que codificam especificamente para as proteínas de acordo com a presente invenção mas igualmente das modificações que se podem obter facilmente por mutaçao, cisão, transposição ou adi21

çao. Todas as sequências que codificam para as proteínas da presente invenção (isto é, as que apresentam o espectro de ac

A* tividade biológica aqui descrito) e que sao degeneradas em com paraçao com as referidas estão também incluídas; os especialistas na matéria estão em posição de degenerar as sequências as as a/ de ADN da região de codificação. Do mesmo modo, estão abrangi das todas as sequências que codificam para um polipeptídeo com o espectro de actividade das proteínas da presente invenção e as que hibridam com as referidas sequências (ou com partes des tas) sob condiçoes críticas (por exemplo sob condiçoes de se lecçao para uma homologia superior a 85 %, de preferência superior a 90 %)·

AS AS

As hibridaÇoes sao levadas a efeito em solução de Denhardt 6x SSC/5x com 0,1 % de SDS a 65°C. As condiçoes críticas foram introduzidas em grau crescente. Deste modo, para uma selecçao de sequências de ADN com cerca de 85 %

A* AS ou mais de homologia sao apropriadas as condiçoes de 0,2xSSC/ /0,01 % de SDS/65°C e para uma selecçao de sequências de ADN com cerca de 90 % ou mais de homologia sao apropriadas as con dições de 0,lx SSC/0,01 % de SDS Ó5°C.

A*

A presente invenção refere-se ainda a vectores de expressão que contêm sequências de ADN que codificam para proteínas ACV que sao regulados de tal modo por uma sequência de regulaçao que se obtêm polipeptídeos com actividade ACV por expressão em células hospedeiras transformadas com

AS esses vectores de expressão.

A* AS

Os vectores de expressão sao preparados de ac<r do com a presente invenção por exemplo por integração de uma sequência de ADN que codifica para uma proteína ACV num ADN dum vector contendo uma sequência de regulaÇao de expressão que regula a sequência de ADN referida da sequência de regula çao de expressão.

A escolha dum vector apropriado tem em vista

a transformaçao das células hospedeiras que se pretende usar.

A#

Sao hospedeiros apropriados por exemplo microorganismos» como leveduras» por exemplo» Saccharomyces cerevisiae» e especialmente estirpes bacterianas que estejam disponíveis sem qualA* A» quer enzimas de restrição ou de modificação» principalmente estirpes de Eschericia coli» por exemplo E. coli X1776, E· co- li HB1O1, E. coli W3110* E. coli HBIOI/IMIO35, E. coli Ja221 (30) ou E. coli K12 estirpes 2p4» Bacillus subtilis» Bacillus stearothermophilus» Pseudomonas» Haemophilus» Streptococcus e outros» além de células de organismos superiores» especialmen i «V te linhas de células humanas e de animais estabelecidas. Sao células hospedeiras preferidas todas as estirpes de E. coli» especialmente E. coli HB101» E. coli JM1O1 e E. coli W3HO.

Basicamente sao apropriados todos os vectores que se replicam e-expressam nos hospedeiros seleccionados as sequências de ADN heterólogas que codificam para as proteínas ACV de acordo com a presente invenção.

Exemplos de vectores que sao apropriados para a expressão do gene das proteínas ACV numa estirpe de E. coli sao bacteriófagos, por exemplo derivados do bacteriófago X»ou plasmídeos» como especialmente o plasmídeo colEl e os seus de rivados» por exemplo os plasmídeos pMB9» pSF2124» pBR317 ou pBR322. Os vectores preferidos de acordo com a presente inven çao derivam do plasmídeo pBR322. Os vectores preferidos contem um replicao integral e um gene de marcaçao que possibiliW AZ ta a selecçao e a identificação dos microorganismos transforA» medos com os plasmídeos de expressão em virtude de uma observação fenotípica. As marcações apropriadas conferem aos micro organismos por exemplo resistência a metais pesados» a antibióticos ou agentes semelhantes. Os vectores preferidos de acordo com a presente invenção contem ainda» para alem das re

A» *** A gioes do replicao e do gene de marcaçao» sequências de recoA# nhecimento para endonucleases de restrição» de tal modo sepos sam introduzir nestes locais as sequências de ADN que codificam para a sequência de ácidos aminados das proteínas ACV e

.., , ' ·λ ~- —..

. >^; · ,.. .

eventualmente as sequências de regulação de expressão. Um vec j tor preferido, o plasmídeo pBR322, contém um replicao intacto, £enes de marcaçao que conferem resistência contra a tetraciclina e contra a ampicilina (tet e amp ) e uma série de sequência de reconhecimento que ocorrem apenas uma vez para en~ R ί donucleases de restrição, por exemplo PstI (corta no gene amp ,ι

R ficando intacto o gene tet ), BamHI, HindIII, Sall (cortam to ι R R' dos no gene tet , ficando intacto o gene amp ), NruI e EcoRI.

A***

A maioria das sequências de regulaçao de exA* A* A*I pressão podem ser utilizadas para a regulaçao da expressão das ; proteínas ACV. Sao usadas de modo especial sequências de regu ‘ laçao de expressão de genes de alto grau de expressão das células dos hospedeiros a transformar. No caso do plasmídeo pBR322 como vector híbrido e de E. coli como organismo hospedeia* A ** ro sao apropriadas por exemplo as sequências de regulaçao de expressão (que entre outros contém o promotor e o local de li ** *** A* í gaÇao ribossomal) do operao de lactose, do operao de triptofa |

A* ¹ no, do operao de arabinose e outros, do gene da ^rlactamase,as as sequências correspondentes do gene do fago >N ou do gene das proteínas das camadas fd fágicas e outros. Enquanto que o promotor do gene da Λ-lactamase (gene /9-lac) está já contido no plasmídeo pBR322, as sequências de regulaçao de expressão acima referidas devem ser introduzidas no plasmídeo. Ê prefeA ** A» rida como sequencia de regulaÇap de expressão na presente invenção a do operao do triptofano (trp po) bem como de Serratia marcescens como também de E. coli e do promotor da fosfatase alcalina ou dos respectivos híbridos.

Para além dos promotores especialmente utili- | záveis foram desenvolvidos e utilizados também outros promoto res microbianos. A sequência dos genes para as proteínas da

A» presente invenção pode, por exemplo, ser colocada sob regulaçao do promotor esquerdo do bacteriéfago lambda (Pj^)· Este pro motor é especialmente comandável de modo efectivo. 0 comando j é possível por intermédio do repressor lambda, de que sao conhecidos os locais de corte por restrição adjacentes. Um ale- 24 -

lo sensível à temperatura do gene deste repressor pode ser in tegrado num vector que contenha uma sequência dum gene da pro teína. Se a temperatura se eleva até 42°C o repressor ê inactivado e o promotor 6 activado. Por meio da utilização deste sistema é possível estabelecer um banco de clones no qual se coloca uma sequência dum gene da proteína funcional na vizinhança de um local de ligaçao ribossomal a varias distancias do promotor lambda-P^. Estes clones podem ser então verificados, seleccionando-se-o com mais alto rendimento.

M

A expressão e a traduçao de uma sequencia que codifica para as proteínas da presente invenção podem também ter lugar sob a regulação de outros sistemas de regulaÇao que sejam homólogos” em relaÇao ao organismo na sua forma nao transformada. Deste modo, por exemplo, o ADN de um E. coli de pendente de lactose contêm um operao de lactose ou operao lac que torna possível a decomposição de lactose por libertação da enzima beta-galactosidase.

Os elementos de regulaçao lac podem ser obti dos a partir do bacteriófago lambda-plac5, que ê infeccioso para E. coli. 0 operao lac do fago pode ser produzido por transduçao a partir da mesma espécie bacteriana.

Os sistemas de regulaçao que podem ser utilizados no processo da presente invenção podem também resultar de ADN plasmídico próprio do organismo. 0 sistema promotor—

-operador lac pode ser induzido por IPTG.

Podem do mesmo modo ser utilizados outros sis temas promotor-operador ou partes destes: por exemplo operador de colicina E., operador de galactose, operador A de xiio

A j se, promotor tac, etc.. j

Além de microorganismos procarióticos também se podem utilizar eucarióticos, como culturas de leveduras, ϋ mais utilizado dos microorganismos eucarióticos é a levedura

i

Saccharomyces cerevisiae se bem que se possam utilizar várias i i outras espécies· |

Os vectores apropriados para a replicaçao e a j expressão em leveduras contêm um início de replicaçao para le j veduras e um marcador genético selectivo para leveduras. Os vectores híbridos que contêm um início de replicaçao para leveduras, por exemplo o segmento cromossomal de replicaçao au- I ténoma (ars), sao conservados apés a transiormaÇao no interiordas células de levedura de forma extra-cromossoma 1 e replicam I -se durante a mitose de forma auténoma· Para expressão em Saccharomyces usa-se por exemplo o plasmideo YRp7 (Stinchomb et ' al. , Nature 282, 39 (1979)j Kingsman et al. , Gene 141(197$» Tschumper et al., Gene 10, 157 (19θθ)) e o plasmideo YEpl3 (bwach et al. * Gene .8, 121-133 (1979))· 0 plasmideo YRp7 con [

AZ AZ · têm o gene TRP1 que apresenta uma marcaçao de selecçao para í

um mutante de levedura que ê incapaz de crescer em meio isento de triptofanoj por exemplo ATCC N2 44076.

A existência da deficiência TRP1 como caracte rística do genoma da levedura hospedeira representa portanto

ZV AZ um poderoso meio auxiliar para verificação da transformação quando se cultiva na ausência de triptofano. De modo completa mente análogo ocorre com o plasmideo YEpl3 que contem o gene de levedura LEU 2 que pode ser usado para suplemento de um mu I AZ ( tante negativo em relaÇao a LEU 2. ΐ i

A·

Outros genes de marcaÇao apropriados para le- j veduras sao, no caso de mutantes de leveduras auxotrofos, em geral genes que complementam deficiências do hospedeiro.Os ge nes correspondentes compensam para prototrofia de um mutante ; auxotrofo de levedura, por exemplo os genes URA3 e HIS3» De I preferência os vectores híbridos de leveduras contêm ainda um j início de replicaçao e um gene de marcaçao para um hospedeiro a< I bacteriano, especialmente para E. coli, podendo então a cons~ i truçao e a clonagem dos vectores híbridos e as fases preliminares ter lugar num hospedeiro bacteriano. Outras sequências

¹

I de regulaçao de expressão apropriadas para expressão em leveA* duras sao por exemplo as do gene PH03 ou PHOg e ainda os pro- , motores envolvidos na decomposição glicolítica, por exemplo o promotor PGK e o promotor GAPDH.

í

Outras sequências de promotor adequadas para vectores de leveduras abrangem a região de flanco 5’ do gene í de ADH I (Ammerer G. , Methods of Enzymology 101, 192-201 (1983)), da 3-fosfoglicerato-quinase (Hitzman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (198O)) ou de outras enzimas glicollticas (Kawasaki ;

I e Fraenkel, BBRC 108, 1107-1112 (1982)) como enolase, gliceraldeído-3-fosfato-de-hidrogenase, hexoquinase, piruvato-descarboxilase, fosfofrutoquinase, glucose-6-fosfato-isomerase, fosfoglucose-isomerase e glucoquinase. Na construção de piasmídeos de expressão apropriados as sequências de terminação associadas com estes genes podem estar já introduzidas no vec tor de expressão na extremidade 3^f da sequência que se preten de expressar, a fim de possibilitar a poliadenilaÇao e a terA# minaçao do ARNm.

i

Outros promotores que possuem ainda a vantagem de transcrição regulada pelas condiçoes de crescimento sao ί ~ > i as regiões promotoras do gene para a alcool-de-hidrogenase-2, do isocitocromo C, da fosfatase ácida, de enzimas de decomposição ligadas ao metabolismo do azoto, da acima referida gliA» I ceraIdeído-3-fosfato-de-hidrogenase e enzimas que sao responsáveis pelo processamento da maltose e da galactose. Os promo tores que sao regulados pelo local do tipo de emparelhamento das leveduras, como por exemplo os promotores dos genes BARI, MFgÇL, STE2, STE3 e STE5 podem ser utilizados em sistemas de a» *** regulaçao de temperatura por meio do uso de mutações sir dependentes da temperatura. (Rhine Ph. D. Thesis, Universidade 1 de Oregon, Eugene, Oregon (1979), Herskowitz e Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, parte I, 181-209 (1981), Cold Spring Harbor Lafaoratory). Estas mutações influ. enciam a expressão do bloco integrado do tipo de emparelhamen to em repouso de leveduras e deste modo indirectamente os pro

motores dependentes do tipo de emparelhamento. Em geral sao, no entanto, adequados todos os vectores plasmídicos que contêm um promotor compatível com leveduras e sequências orogiM M nais de replicaçao e de terminaÇao.

Deste modo podem ser usados também vectores híbridos que contêm sequências homólogas do ADN do plasn/deo j de leveduras 271· Estes vectores híbridos sao incorporados ou ί replicados autonomamente por recombinaçao de plasmídeos 2ji já '

- a 1 existentes nas células. As sequências 2ji sao especialmente apropriadas para plasmídeos com maior frequência de transformação e permitem um grande número de cópias. :

Além de microorganismos, também sao organismos apropriados culturas de células de organismos multicelula res. Em princípio qualquer destas culturas de células é utili zável, tanto as culturas de células de animais vertebrados co mo de invertebrados. No entanto apresentam maior interesse as I células de animais vertebrados uma vez que o crescimento de células de vertebrados em cultura (cultura de tecidos) se tor nou nos últimos anos um método de rotina (Tissue Culture, Aca demic Press, Kruse e Patterson, Editores (1973))· Exemplos de linhas de células hospedeiras utilizáveis sao células VERO e ¹ HeLa, células CHO e linhas de células WI38, BHK, COS-7 e MDCK. Os vectores de expressão para estas células contêm habitualmente (quando necessário) um ponto de início de replicaçao e um promotor localizado antes do gene que se pretende expressar, juntamente com todos os locais de ligaÇao de ribossomas, locais de separaÇao de ARN, locais de poliadenilaçao e sequên

M M cias de terminação de transcrição.

Para a utilizaÇao de células de mamíferos, as MM MM funções de regulaçao dos vectores de expressão sao na maioria das vezes originárias de material virai. Por exemplo, os pro— | motores normalmente usados sao originários de vírus do polio- | ma, de adenovirus 2 e especialmente do vírus de símio 40 (SV j 4θ). Os promotores precode e tardio do SV 40 sao especialmen28 i » A.

‘•'λ

Nature te úteis uma vez que ambos podem ser facilmente obtidos sob a forma de fragmentos a partir do vírus que também contém ainda o local de replicaçao virai do SV 40. (Fiers et al., 273> 113 (1978))· Também podem ser usados fragmentos ou maiores do SV 40, no pressuposto de que contenham cia de cerca de 250 pb de comprimento que se estende local de corte HindIII até ao local de corte Bgll no início de replicaçao virai· Além disso ê igualmente possível e muitas vezes aconselhável utilizar sequências de promotor e de regulaçao que sao normalmente acopladas às sequências gêni cas pretendidas desde que essas sequências de regulaçao sejam compatíveis com o sistema das células hospedeiras.

menores a sequên desde o ponto de

Ê possível proporcionar um ponto de início de replicaçao por meio da respectiva construção do vector, a fim de integrar um ponto de início exógeno, por exemplo do SV 4o ou de outras origens virais (p. ex. de polioma, adenovírus, λ# a*

VSV, PBV, etc.) ou então por meio do mecanismo de replicaçao cromossomal das células hospedeiras. Quando o vector ê integrado no cromossoma das células hospedeiras é na maioria das vezes suficiente a última via mencionada.

A presente invenção diz especialmente respeito à replicaçao e à selecçao fenotípica de vectores de expres sao apropriados que contem uma sequençia de regulaçao de ex** A A pressão e uma sequençia de ADN que codifica para uma sequência de ácidos aminados duma proteína ACV, possuindo a referida sequência de ADN um sinal de início de transcrição e um si nal de terminação de transcrição bem como um sinal de início

Μ A>

de traduçao e um sinal de paragem de traduçao no referido pias mídeo de expressão sob regulaçao da referida sequençia de regulaÇao de expressão ordenados de tal forma que se expressa a proteína ACV numa célula hospedeira transformada com o referi do plasmídeo de expressão.

i l

A fim de conseguir uma expressão efectiva, a direcção do gene da proteína ACV deve estar ordenado (em fase) i

de acordo com a sequencia de regulaçao da expressão. E vantajoso que a sequência de regulaÇao de expressão esteja associa da no domínio entre o início do ARNm principal e o ATG da sequência de codificação do gene» a qual naturalmente está asso i ciada com a sequência de regulação de expressão (p. ex. a se- ; quência de codificação /9-lac na utilizaÇao do promotor/^-lan) , ; com o gene ACV, que de preferência inclui os seus próprios si | nais de início de traduçao (ATG) e sinal de paragem de tradu- I çao (p. ex. TAG). Deste modo ê garantida uma efectiva trans- j

Μ A* criçao e traduçao.

Por exemplo» corta-se um vector» especialmente pBR322» com uma endonuclease de restrição e, eventualmente após modificação do vector linearizado assim formado» integra A iv iv

-se uma sequencia de regulaçao de expressão contendo extremi** A*** dades de restrição correspondentes. A sequencia de regulaçao de expressão contêm na extremidade 3' (no sentido da traduçao)

A** a sequencia de reconhecimento de uma enzima de restrição» de

-A*** tal modo que o vector contendo ja a sequencia de regulaçao de expressão se digere com a enzima de restrição referida e se l pode integrar o gene ACV contendo as extremidades convenientes. Obtêm-se deste modo uma mistura de dois plasmídeos híbri «W IV I dos contendo o gene na orientação correcta ou na orientação errada. Ê vantajoso cindir o vector que contêm já a sequência i de regulaçao de expressão ainda com uma segunda endonuclease ] de restrição no interior do ADN do vector e integrar no fra- | gmento de vector resultante o gene ACV contendo as extremida- j des correctas. Todas as operações no vector sao de preferenΛΙ IV 1 cia levadas a efeito de tal modo que a função do replicao e pelo menos um gene de marcaçao nao sejam danificados.

Numa forma preferida de concretização da presente invenção digere-se um vector derivado do plasmídeo pBP322 que contêm uma sequência de regulaçao de expressão, especialmente a do operao de triptofano (trp po), que tem na extremidade 3' (entre o início do ARNm principal e o primeiro ATG) a sequência de reconhecimento para uma endonuclease de

α» restrição, de preferencia que forme extremidades coesivas, p.

A# ex. EcoRI, com a referida endonuclease de restrição e digere- ; -se uma parte do ADN do vector com uma segunda endonuclease

A* de restrição que forma extremidades alinhadas ou coesivas, p. , ex. BamHl, juntando-se em seguida o vector linearizado deste j modo com o ADN de ACV que apresenta extremidades corresponden tes (p. ex. com uma extremidade EcoRI antes do sinal de iníA* cio ATG e uma extremidade BamHl depois do codao de paragem de traduçao). A ligaçao é levada a efeito de modo conhecido por ; emparelhamento das extremidades complementares (coesivas) e ;

A/ ligaçao, por exemplo com ligase de ADN Ί/· |

De preferência as sequências de ADN da presen te invenção podem também ser expressas no plasmídeo de expres são pER103 (E. Rastl-Dworkin et al., Gene 21, 237-248 (1983) e EP-A-0 115 613 depositado na DSM sob o número DSM 2773 ^em 20 de Dezembro de 1983), no plasmídeo parpER33 (EP-A—0 115 613) ou no plasmídeo pRHlOO, uma vez que estes vectores contêm toA* dos os elementos de regulaçao que conduzem a uma alta taxa de expressão dos genes clonados.

De acordo com a presente invenção, utiliza-se > para vector de expressão para o gene sintético da proteina o j

I plasmídeo pRHlOO que contém o promotor de triptofano regulaA# vel de Serratia mercescens e um local de ligaçao ribossomal artificial. Para a preparaçao do plasmídeo de expressão pRHlOO: lineariza-se o plasmídeo pER103 (Eva Dworkin-Rastl et al., Ge ne 21 (1983) 237-248, EP-A-0 115 613) com a endonuclease de j restrição HindIII e integra-se a sequência oligonucleútida |

5’ AGCTTAAAGATGAGCTCATCTTTA 3' ' !

ATTTCTACTCGAGTAGAAATTCGA 5* I

ADN da proteína ACV obtido de acordo com a via do ARNm, a partir do ADN genómico ou por via sintética, í com as extremidades correspondentes (especialmente EcoRI e ! BamHl) pode ser clonado antes da incorporação num plasmídeo ί i expressão também num vector, por exemplo em pBR322, a fim

de se obter uma quantidade superior de ADN de ACV, por exem- ; pio para análise sequencial. 0 isolamento dos clones que con- Ϊ têm o piasmídeo híbrido ê levado a efeito por exemplo com uma sonda oligonucleótida marcada com um isótopo radioactivo espe cifica em relaçao ao ADN de ACV (ver acima). A caracterizaÇao do ADN de ACV é efectuada por exemplo de acordo com o proces- j í

so de Maxam e Gilbert (11). !

De acordo com uma outra forma de concretiza- i çao da presente invenção, sintetizam-se íracçoes do ADN de ACV. ι A invenção refere-se também ao processo para a preparaçao de ι células hospedeiras transformadas caracterizado por se transformar uma célula hospedeira com um vector de expressão que contém uma sequência de ADN que codifica para a sequência de ácidos aminados da proteína ACV regulada por uma sequência de /W «W regulaÇap de expressão.

As células hospedeiras apropriadas por exemplo os microorganismos acima mencionados, como estirpes de Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis e especialmente Escherichia coli. A transformaçao com os plasmídeos de expres sao de acordo com a presente invenção é levada a efeito por exemplo como descrito na literatura, tanto para S. cerevisiae | (12), como para B. subtilis (13) ou para E. coli (14). 0 iso- ! lamento das células hospedeiras transformadas é vantajosamente levado a efeito num meio de cultura selectivo a que se adi ciona o biocida contra o qual o gene de marcaçao contido no piasmídeo de expressão confere resistência. Quando, conforme se considera preferido, o piasmídeo de expressão contém o geR / ' ne amp , adiciona-se ampicilina ao meio de cultura· As celu- j ** A # *** i las que nao contem o piasmídeo de expressão morrem neste meio. > ι i I

A invenção refere-se igualmente a um processo ** # para a preparaçao de células transformadas obtidas conforme descrito. !

As células hospedeiras transformadas podem ser

usadas para a preparaçao de compostos com actividade ACV. 0 processo para a preparaçao destes composto 6 caracterizado por se cultivarem as células hospedeiras transformadas, se liberter o produto das células hospedeiras e se isolar.

A presente invenção refere-se por conseguinte principalmente a um processo para a preparaçao de compostos com actividade ACV e de sais destes compostos caracterizado por se cultivarem num meio de cultura líquido que contêm fontes assimiláveis de carbono e de azoto células hospedeiras transformadas com um plasmídeo de expressão que contém uma se quência de ADN que codifica para uma sequência de ácidos aminados duma proteína ACV regulada por uma sequência de regulaçao de expressão, se libertar o produto das células hospedeiras e se isolar e, caso necessário, se transformar o produto obtido de acordo com o processo descrito com um redutor apropriado e se tratar o polipeptídeo reduzido obtido eventualmen te com um oxidante para ligar de novo as pontes de dissulfure to e, caso se queira, se transformar um composto ACV obtido num outro composto ACV, se separar uma mistura de compostos com actividade ACV nos vários componentes e/ou, caso se queira, transformar um sal obtido no respectivo polipeptídeo e transformar um polipeptídeo obtido no respectico sal.

A#

A presente invenção refere—se especialmente a um processo para a preparaçao de compostos ACV.

A cultura das células hospedeiras transformadas de acordo com o processo da presente invenção ê levada a efeito de modo conhecido. Assim, podem ser usadas para a cultura dos microorganismos transformados da presente invenção diferentes fontes de carbono. Sao exemplos de fontes de carbo no preferidas hidratos de carbono, como glucose , maltose, ma nitol ou lactose# ou um acetato, que podem ser usados isolada mente ou em misturas apropriadas. Sao fontes de azoto apropri adas por exemplo ácidos aminados, como ácidos casamínico, peptídeos e proteínas e os respectivos produtos de decomposição,

como triptona, peptona ou extracto de carne, para além disso j podem ser usados extracto de levedura, extracto de malte e ain , da sais de amónio, p. ex. cloreto, sulfato ou nitrato de amónio, quer isoladamente quer em mistura. Igualmente podem ser usados sais inorgânicos, como p. ex. sulfatos, cloretos, fos- ! fatos e carbonatos de sódio, potássio, magnésio e cálcio. | i

meio contém ainda por exemplo substâncias | promotoras do crescimento, como elementos vestigiais, p. ex. ι ferro, zinco, manganês e outros, e de preferência substâncias !

Aí _t que exercem uma pressão selectiva e inibem o crescimento das I células que perderam o plasmídeo de expressão. Assim o meio é suplementado por exemplo com ampicilina quando o plasmídeo de expressão contém um gene amp^. Uma adiçao de substâncias com acçao antibiótica como esta tem também a função de matar os microorganismos contaminantes sensíveis ao antibiótico. |

As condiçoes da cultura, como a temperatura,

M «W AZ o valor do pH do meio e a duraçao da fermentação, sao selec- | cionadas de modo a que se obtenha o máximo título de proteína ACV. Deste modo, cultiva-se uma estirpe de E. coli ou de uma levedura, de preferência sob condiçoes aeróbicas em cultura ] submersa com agitaçao mecanica ou num agitador orbital a uma j temperatura de cerca de 20 a 40°C, de preferência a cerca de 30°C e a um valor de pH entre 4 e 9» de preferência a pH 7, durante cerca de 4 a 20 horas, de preferência entre 8 e 12 ho 1 ras. Nestas condiçoes o produto acumula-se intracelularmente.

i

Quando a densidade celular atinge um valor hu ** Z z i ficiente, a fermentação e interrompida e o produto e, caso ne cessário, libertado das células. Para este fim, as células sao submetidas a disrupçao, por exemplo por tratamento com um deAZ tergente, como o SDS ou o Triton, ou sao lisadas com lisozima ou com uma enzima de acçao semelhante. Em alternativa ou adi*** A j cionalmente pode exercer-se uma acçao mecanica ou uma acçao de corte (por exemplo por meio de prensa X, prensa francesa ou Dyno-Mill), por agitaçao com pérolas de vidro ou com óxido 1

- 34 4

I

I

-J&¹ de alumínio ou por congelamento, p guido de descongelamento, p.

⁰ e 40 C, bem como por tura resultante, que se—

30^o mis ex. em azoto líquido, ex. a uma temperatura entre ultrassons para rotura das células·A contém as proteínas, os ácidos nucleicos celulares, é concentrada nas proteínas de modo conhecido em si. Deste modo sepa e outros componentes após a centrifugação ra-se, por exemplo, a maior parte dos componentes nao protei cos por tratamento com polietilenimino e precipitam-se as pro teínas incluindo os compostos ACV, por exemplo por saturaÇao da solução com sulfato de amónio ou com outros sais. Outras fases de purificação incluem por exemplo processos cromatográ ficos, como cromatografia de permuta iónica, HPLC, HPLC de fa ; se inversa e outros semelhantes. Deste modo efectua-se a sepa ! raçao dos componentes da mistura por diãlise, de acordo com a carga por meio de electroforese em gel ou sem suporte,de acor do com a dimensão molecular por meio de uma coluna de cromato ί grafia adequada, por cromatografia de afinidade, por exemplo com anticorpos, especialmente com anticorpos monoclonais, ou com trombina imobilizada num suporte apropriado, ou por outros processos especialmente os conhecidos da literatura·

Por exemplo, o isolamento dos compostos ACV ex ;

- A* pressos e efectuado segundo as seguintes fases: Separaçao das células e do sobrenadante por centrifugaçãoj preparaÇao dum extracto bruto por disrupçao das células, por exemplo por tra i tamento com uma enzima lisogénica e/ou congelamento e descon- } gelaçao alternadamente; separaÇao por centrifugação dos compo

A» /V nentes insolúveis; separaçao do ADN após precipitaÇao por adi 1 çao de polietiienimina; precipitação das proteínas por adiçao de sulfato de amónioj cromatografia de afinidade do precipita j do dissolvido através de uma coluna de anticorpos anti-ACV; | eliminação dos sais da solução assim obtida por dialise ou por I cromatografia através de Sephadex G25 ou de Sephadex G10.

~ !

A purificaÇao também pode incluir outras fases como filtraÇao por gel através de Sephadex G50 (ou G75) e e HPLC de fase reversa. Eliminam-se os sais novamente através 1

I

de Sephadex G25

Para determinaÇao da actividade ACV 6 possível ! utilizar o ensaio com anticorpos anti-ACV (por exemplo obtidos j a partir de coeihos/ratos ou com anticorpos monoclonais obti- ; dos a partir de células de hibridomas) ou 6 possível utilizar o ensaio descrito na EP-A-0 181 465· i

Como referido anteriormente, o promotor de fosfatase alcalina é especialmente adequado para a expressão da proteína da presente invenção.

gene para a fosfatase alcalina (PhoA) de E. coli está sujeito a uma regulaÇao mais fina. Na presença de fosfato o gene 6 completamente inactivo e na ausência de fos_ A# fato no meio da-se a expressão do gene. H. Shuttleworth et al. , Nucleic Acids Res. 14 (1986), p. 8689 bem como C.N. Chang et al., Gene 44 (1986), pp. 121-125 descrevem a sequência de nucleétidos deste gene. Para a construção de um vector de expres «W A* sao apropriado preparou-se a região do promotor do gene PhoA 1 a partir de vários oligonucleÔtidos e integrou-se no plasmí- ¹ deo pAT153 (Amersham) cortado com EcoRI-Clal. Introduziu-se um local Xhol antes do local de ligaçao ribossomal. 0 local EcoRI original é destruído durante a ligaÇao dos fragmentos de ADN sintéticos. Depois do local de ligaçao ribossomal colo cou-se um codao de início de traduçao ATG, cujo G e o primeiro nucleótido de um local Saci (=Sstl). 0 vector de expressão 1

I pode ser linearizado por corte com Saci neste local e a extre J midade 3' saliente pode ser transformada numa extremidade ali nhada por tratamento com o fragmento de Klenow-polimerase de ’ í ADN I na presença de dGTP. Deste modo é possível introduzir ' qualquer gene neste local, devendo, para uma expressão correc ta, este gene começar com a primeira base da região de codifi caçao.

fragmento HindIII-SalI da secção pAT foi eli !

r<t I minado e substituído pelo terminador de transcrição da fosfa- 36 -

tase alcalina. 0 local Asll originai foi destruído. Para este fim este local foi reparado antes do terminador em conjunto com o local BamHI suprimido do plasmídeo pAT153·

A sequência do ADN sintético preparado está, representado na Figura 15· 0 vector resultante foi denominado ! pRH284T. |

I I i

Para a preparaçao de um vector apropriado pa- j

I ra expressão da proteína ACV-alfa introduziu-se uma molécula ΐ ( I de ADN que codifica para a proteína ACV-alfa no plasmídeo j pRH284T. Para esse fim cortou-se por exemplo o clone de ADNc | pPó/5 com BglII e PstI e isolou-se o fragmento de 980 pb de i z **** i comprimento que contem a maior parte da região de codificação ι

Λ,I e cerca de 200 pb da região nao traduzida 3’· Por meio de oli , **A* gonucleotidos reparou-se a região 5’ que falta na região de

A*«V codificação. Nesta operaçao introduz-se simultaneamente no ADNc da proteína ACV um local de corte Kpnl por meio de duas mutações (GGC -> GGT, Gly-7 e ACT -> ACC, Thr-8).

Os oligonucleótidos têm o seguinte aspecto.* |EBI-678 ||EBI-677

5' GCACAGGTTCTACGAGGTA CCGTGA CTGACTTCCCTGGATTTGATGAGCGGGCT CGTGTCCAAGAGTCTCCATGGCACTGACTGAAGGGACCTAAACTACTCGCCCGA

I

I ebi-68o||

GATGCAGAAACTCTTCGGAAGGCTATGAAAGGCTTGGGCACAGATGAGGAGAGC

CTACGTCTTTGAGAAGCCTTCCGATACTTTCCGAACCCGTGTCTACTCCTCTCG

EBI- í ||EBI—682

ATCCTGACTCTGTTGACATCCCGAAGTAATGCTCAGCGCCAGGAAATCTCTGCA 3’

TAGGACTGAGACAACTGTAGGGCTTCATTACGAGTCGCGGTCCTTTAGAG 5'

679|f EBI-6811 vector preparado deste modo foi denominado pRH291 (Figura 16).

Para a expressão da proteína ACV-beta utilizou-se de preferência como vector de expressão o plasmídeo _PER1O3 (E. Rastl-Dworkin et al. , Gene 21 (1983), 237-248). 0 vector foi linearizado com HindIII. As extremidades 5' salien tes foram preenchidas parcialmente com dAPT e com polimerase de ADN I/fragmento de ílenow e o resto de cadeia simples resultante foi digerido com nuclease Si. Cortou-se o vector com BamHI e isolou-se o fragmento maior (Figura 17)· No vector mo dificado como descrito ligou-se a molécula de ADN que codifica para a proteína ACV-beta» Para este fim isolou-se,por exem pio, o fragmento MaelII-BamHI de 440 pb de comprimento que con tém os codoes 13 a 157 a partir do clone pRH2O3· A extremidade 5* em falta foi completada com oligonucleótidos!

EBI-307

5' CCATGGCTTGGTGGAAAGCTTGGATCGAACAGGAAGGT 3’

3' GGTACCGAACCACCTTTCGAACCTAGCTTGTCCTTCCACAGTG 5' EBI-3O6

Neste caso foram utilizados os codoes optimos para E. coli (p. ex. R. Grantham et al. , Nucleic Acids Res. 8 (1980), I893-I912). Esta permuta de codoes tem como resultado í um novo local HindIII no codao 5 a 7· Após o corte posterior ί com BamHI ligou-se o fragmento ACV 5'-terminal no vector pER103 prêviamente preparado. 0 vector resultante foi denominado pRH211* A fim de completar a região de codificação para a pro teína ACV-beta, isolou-se a partir do clone pRH201 o fragmen- I

I to BamHI-Sphl de 1230 pb de comprimento. A secção de pBR322 de cerca de 200 pb de comprimento do local BamHI até ao Sphl do plasmídeo pRH211 foi eliminada e substituída pela correspondente secção do ADNc da proteína ACV. Resulta o vector pRH212. 0 fragmento EcoRI-BamHI, que contém o promotor Trp (S. marcescens), o local de ligaçao rifaossomal e o início do gene ; de ACV-beta preparado por síntese, foi verificado por meio de !

A* | sequenciao. A detecçao da proteína ACV-beta codificada pelo plasmídeo foi levada a efeito de acordo com o sistema Maxi-cé lula (A. Sanear et al. , J. Bacteriol. 137 (1979), PP» 692-693)·

Ê especialmente preferida para a expressão da

- 38 1

proteína ACV-beta a construção de um vector de expressão pro· veniente do plasmídeo pRH284T. Para este fim ligou-se no vec· *V ΛΙ tor de expressão de modo conhecido a inserção que codifica ra a proteína ACV-beta· Como material de partida para esta serçao pode servir por exemplo o vector pRH212:

pa in vector de expressão pRH284T foi linearizado com Saci e as extremidades 3’ salientes foram transformadas com polimerase de ADN I/fragmento de Klenow e dGTP em extremi dades alinhadas. 0 vector foi em seguida cortado com

IV isolado. A inserção HindIII-SalI par de oligonucleótidos fragmento maior foi pRH212 foi isolada.

5’

3'

GCTTGGTGGAA 3» CGAACCACCTTTCGA

EBI-684 5' EBI-685 ligado com a inserção de ACV—beta e com o vector

Sall e o do clone pRH2Ô4T foi prèviamente preparado. Transformou-se E. coli HB101 com a solução de liga se. 0 clone resultante foi denominado pRH292 (Fig 18).

Uma vez que nos vectores de expressão pRH291 (ACV-alfa) e pRH292 (ACV-beta) foi suprimido o gene de resistência à tetraciclina desde o promotor atê ao local Asll, esnao apresentam qualquer resistência a tetracicii vectores de expressão resistentes à tetraciclina por meio da construção de acordo com o esquema na ADNc de ACV-alfa e de ACV-beta apresenta em amΛΙ ÍW um local Sphl na região 3’ nao traduzida» No ne da beta-lactamase do vector encontra-se um local Pvul. bas as sequências de reconhecimento sao singulares. Deste do é possível retirar dos dois vectores de expressão por coriw te com Pvul e com Sphl uma fracçao do gene da

M IV o promotor phoA e o da fracçao de codificaÇao -alfa e de ACV-beta mais uma parte de ADNc Por outro lado é possível separar a partir por corte com Pvul e EcoRI o resto do gene

IV tes vectores na* Obtem-se por exemplo

Figura 3^· 0 bos os casos geAmmobeta-lactamase, integral de ACV nao traduzidaplasmídeo pAT153 beta-lactamase, a origem de replicaçao e o gene integral da resistência à te3' do da

traciclina incluindo o promotor. Tornando alinhadas as extremidades Aphl e EcoRl por tratamento enzimático, obtêm-se extremidades compatíveis. Por ligaÇao do fragmento vector com o ! fragmento que contêm o ADNc de ACV-alfa e de ACV—beta, resul- ί tam vectores de expressão que contêm o gene completo da tetra ciclinaí pGN25 (ACV—alfa) e pGN26 (ACV—beta)·

Transformaram-se organismos hospedeiros compe tentes, por exemplo E. coli, de preferência E. coli HB1O1, com os vectores de expressão preparados deste modo e cultivaram—se num meio apropriado.

Um meio bem apropriado para a expressão de ACV-alfa e de ACV-beta pode ser o em seguida descrito com os seus

componentes.
0,2	-	2,0	g/1	de	(nh4)2hpo4
0,1	-		g/1	de	k2po4.3H20
0,1 -		5	g/1	de	KC1
0,1	-	10	g/1	de	NaCl
0	-	5	g/1	de	nh4ci
0,1	-	5	g/1	de	MgSO4.7H20
0,001	-	0,1	g/1	de	CaCl2
1	-	50	mg/1	de	tiamina.HC1
0,5	-	100	mg/1	de	(NH4)2Fe(S04)2· 6H20
0,1 -	—	5	mg/1	de	aici3* 6h2o
0,1	-	10	mg/1	de	CoC12·6H2O
0,2	-	5	mg/1	de	KCr(SO4)2·12H20
0,1	-	5	mg/1	de	CuS04·5H2o
0,05	-	1	mg/1	de	h3bo3
0,1	-	5	mg/1	de	MnSO4*H2O
0,1	-	5	mg/1	de	níso4* 6h2o
0,1	-	5	mg/1	de	Na2Mo04·2H20
0,1	-	5	mg/1	de	ZnS04·7H2O
10	—	30	g/1	de	hidrolisado de caseina	(Merck. Art. ΝΩ. 2238)
0	—	100	g/1	de	hidrolisado de caseina	(Sigma C93&6)

sição seguinte:

0,10 -	1	mg/1	de	cisteína
0	10	g/1	de	extracto de levedura	(Difco)
0	2	g/1	de	ácido cítrico
0	50	g/1	de	glucose (início)
5	50	g/1	de	glucose (alimentaçao	durante a
			mentaçao

Ê especialmente adequado o meio com a compoMeios: 1) Prê-cultura

10	g/1	de	triptona
5	g/1	de	extracto de levedura
4	g/1	de	glucose
9	g/1	de	Na2HP04·2H20
1	g/1	de	NH^Cl
1	g/1	de	KC1
1	ml/1	de	MgSO^·7H20 1 M
100	mg/1	de	ampacilina

pH de início = 7>2

2) Cultura principal

0,68	g/1	de	(NH^)2HP04
0,62	g/1	de	k2hpo4·3H2o
2,33	g/1	de	KC1
0,5	g/1	de	NaCl
0,53	g/1	de	NH^Cl
1,23	g/1	de	MgSO^·7H2o
0,011 g/1	de	CaC1 2
10	mg/1	de	tiamina·HC1
3,92	mg/1	de	(NH4)2Fe(S04)2«6H20
0,72	mg/1	de	AlCly6H20
0,71	mg/1	de	CoC12’6H20
1,5	mg/1	de	KCr(S04)2· 12H20
0,75	mg/1	de	cuso4·5H2o

0,19	mg/1	de	H BO 3 3
0,51	mg/1	de	MnSO^·HgO
0,79	mg/1	de	NiSO^·6H20
0,73	mg/1	de	Na2Mo04·2H2	0
0,86	mg/1	de	ZnSO^· 7H20
21	g/1	de	hidrolisado	de caseína	(Merck. Art. NQ 2238)
25	g/1	de	hidrolisado	de caseína	(Sigma C9386)
100	mg/1	de	cisteína
2	g/1	de	extracto de	levedura
1	g/1	de	ácido cítri	co
11	g/1	de	glucose·	(início e alimentaçao)

meio

Para a fermentação inoculou-se, por exemplo, de pré—cultura com E. cóli transformado com o corresponΜ dente vector de expressão e incubou-se sob agitaçao e com for necimento de oxigénio. Uma parte desta pré-cultura foi então adicionada a um fermentador contendo a cultura principal e es ta foi cultivada com agitaçao e arejamento, de fermentação observaram-se a concentraÇao pressão parcial de oxigénio, optimizando-se parâmetros. Após cerca de 20 horas de fermentação arrefeceu-se a cultura, separou-se o meio nutriente da biomassa e con·

Durante o período de glucose e a os valores destes gelou-se

A detecçao da proteína expressa foi levada a efeito por exemplo por meio de análise de mancha de Western. Os resultados estão reproduzidos na Figura 19· ’' + Fosfato’' representa a amostra sem expressão, -Fosfato representa a expressão ACV-alfa (clone HB101/pRH291) e ACV-beta (clone sob regulaçao do promotor de fosfatase alcalina teína ACV-alfa como a ACV-beta podem ser logo reconhecidas no gel corado. A quantidade formada de proteínas ACV surpreenden temente é pelo menos 20 mg/l/ϋθ^θθ^ cultura bacteriana.

de comparaÇao das proteínas HB101/pRH292)

Tanto a proA análise de mancha de Western mostra distin·

a:

tamente a banda corada da proteína ACV-alfa· Adicionalmente podem ver-se algumas proteínas de baixo peso molecular no do mínio até 3θ KD que possivelmente resultam de hidrólise enzi mática na ACV-alfa.

peína reconhecida pelo anti-soro no domínio de dimensão inferior a 20 kD, a qual pode representar uma semi-mplécula resul tante de proteólise da proteína ACV-alfa. Surpreendentemente a proteína ACV-beta foi também reconhecida pelo anti-soro anti-ACV. Uma vez que esta banda ê signiíicativamente mais fracamente corada do que a banda da proteína ACV-alfa, e como outro lado no entanto, na coloraçao por azul de Coomassie gel a banda da proteína ACV-beta apresenta uma intensidade melhante à da proteína ACV-alfa, ê de concluir daqui que o conhecimento da proteína ACV-beta pelo anti-soro anti-ACV é essencialmente pior do que o mesmo reconhecimento da proteína ACV—aIfa.

da proteína ACV-alfa extremidade N-terminal ou C-terminal da proteína Ê além disso surpreendente a ocorrência de uma propor do se re

Para isolamento e purificação das proteínas expressas suspendeu-se a biomassa congelada num tampao de lise apropriado. As células foram em seguida sujeitas a disrupçao por meios mecânicos, por exemplo por meio de uma prensa de Manton-Gauiin. Apos adiçao de um agente de precipitação pa «v aa ra a fracçao nao proteica, como a polietilenimina, eliminaram -se os componentes sólidos, por exemplo por meio de centrifugação. Depois de precipitar as proteínas, de preferência por at fraccionamento com sulfato de amónio, dissolução do precipita at at a» do, eliminação do agente de precipitaÇao e clarificaçao da so luçao, submeteu-se o extracto assim obtido a diferentes fases de purificação por cromatografia. Êm vez da precipitação das proteínas, também é possível purificar o extracto bruto das at proteínas ACV por uma purificação prévia por cromatografia de modo a que em seguida se possa efectuar uma série de purifica çoes finais. Constatou-se que um material apropriado para a coluna de purificação prévia é por exemplo SiOg, podendo também ser utilizados outros materiais com propriedades semelhan at tes. De acordo com o processo da presente invenção pode utili

zar-se Catalisador de dade Grace.

Sílica» suporte de garu 953 W da SocieUm ciclo de purificação cromatográfica apropriado para a purificaÇao das proteínas da presente invenção é constituído, por exemplo, por uma cromatografia através de DEAE-Fast-Elow-Sepharose seguida de outra através de Sephacryl< S-200 de alta resolução e finalmente de uma cromatografia em j Q-Sepharose-Fast-Flow. A pureza das proteínas assim obtidas ! foi determinada por meio de análises de SDS-PAGE, mancha de Western, HPLC de permeaçao em gel, HPLC de fase reversa e focagem isoeléctrica.

Os parâmetros cuja observaÇao é requerida para as fases de cultura, isolamento e purificaÇao, como a tem- j peratura, as proporçoes das quantidades, a sequência das dife rentes fases, o valor do pH, os reagentes a usar, etc., sao bem conhecidos dos especialistas. Os exemplos abaixo apresentados podem, se se pretender, ser modificados apropriadamente de modo conhecido pelos especialistas. I

I , ** I

E de especial significado a questão de saber l se uma proteína ACV preparada por meio de métodos de manipula ' çao genéticai designada no que se segue abreviadamente por ACV-r, é idêntica à proteína ACV obtenível a partir de material natural (ver EP-A 0 181 465), seguidamente designada por j ACV; idêntica tanto na sua estrutura como também nas suas pro ι priedades biológicas. | j

Para responder a esta questão foram usados os ! seguintes métodos!

i

1. HPLC de permeaçao em gel[

2. HPLC de fase inversa

ΜI

3· Sequenciaçao N-terminal

4. MapeaÇao tríptica de peptídeoí

5· Electroforese em gel de SDSj

-i

b. Mancha de Western!

| 7· Focagem isoeléctrica i

i

A HPLC de permeaçao em gel apresenta para

ACV um peso molecular de 34 000 e para a r-ACV de 33 000» que se pode considerar» dentro da precisão do método» como lores iguais. Deve-se observar que a coluna utilizada retém i ** « I com uma força que nao esta relacionada com o peso molecular ; mas sim com a dimensão das moléculas.

Na HPLC de fase inversa as duas proteínas sao eluídas de acordo com um tempo de retenção de cerca de 29 minutos.

A sequenciaçao N-terminal da ACV—r até ao áci do aminado 39 revelou uma concordância de 100% com a sequência esperada. A metionina N-terminal» frequentemente encontra I da adicionalmente nas proteínas preparadas por manipulaçao ge

- A» _Λ| netica» nao pode» surpreendentemente, ser detectada. Como era | de esperar» a extremidade N—terminal da ACV—r nao está blo- ! queada.

A*«V

Na comparaçao da fragmentaÇao tríptica as duas amostras peptídicas revelaram-se pràticamente iguais.i

Também a comparaçao das duas proteínas por j meio de SDS-PAGE mostra um comportamento pràticamente idêntico. Ambos incluem formas dímeras que aparentemente estão liga das através de pontes de dissulfureto e que podem ser reduzidas com ditiotreitol.

j i

Do mesmo modo» a comparaçao imunológica por meio de análise de mancha de Western confirma a identidade das duas proteínas.

A diferença manifestada na determinação do pon i to isoeléctrico de +0»l unidades de pH na ACV-r pode ser explicada pelo facto de ter a extremidade N-terminal livre.

- 45 da

A fim de verificar a actividade biológica proteína ACV-r foram levados a efeito diferentes ensaios de coagulaçao e os resultados foram comparados com os da proteí^ na ACV obtida a partir de material de origem natural. Todos os ensaios realizados, o tempo de protrombina modificado bem como o ensaio de trombina e a geraçao de factor X em plasma a activado por factor de tecido atestam sem qualquer dúvida que a proteína ACV-r apresenta actividade biológica e que esta nao se distingue da actividade da proteína ACV proveniente de material natural.

A sequências de ácidos aminados derivados do ADNc para a proteína ACV-/5 apresenta uma homologia de 54% pa ra com a ACV-ÇL Com base nesta constataçao, efectuou-se uma comparaçao de algumas actividades biológicas da ACV-/5com as da

ACV—OÇ

1. Efeito das proteínas ACV-01 e ACV-/3 na actividade da protrom; binaseí A Figura 47 mostra que tanto a proteína ACV-jX como ; a ACV-/5 exercem o mesmo efeito inibidor sobre a activida— de de protrombinase, o que deixa conjecturar que existam

A/ A» mecanismos semelhantes de inibição de coagulaçao. | i

2. Actividade de inibição da fosfolipasesí conforme já meneio nado, ê possível classificar com base na sua estrutura pri mária a ACV-pÇ e a ACV-/J na família das amexinas (Gusow, M. J. (1987) FEBS Letters 203, 99-1θ3)· Alguns outros membros desta família, por exemplo as calpactinas I e II, têm —se revelado como inibidores da fosfolipases. A sua activi 1 dade baseia-se numa ligaçao dependente de cálcio aos fosfo ; lípidos através da qual aqueles produtos bloqueiam o estaque i das fosfolipases ao seu substrato (Davidson et al., (1987) J. Biol. Chem. 262, 1698-1705.

i

Uma vez que agora as proteínas ACV-Pl e ACV-ft ! se ligam aos fosfolípidos de modo dependente de cálcio foi le vada a efeito uma verificação para determinar se as duas proteínas apresentam também possivelmente actividades anti-fosfo !

lipase. Um processo de ensaio com E. coii marcado com ácido -H-oxálico foi usado para esta finalidade.

As Figuras 48 e 49 mostram que tanto a ACV-Λ como a ACV-/3 inibem a actividade da fosfolipase A^. Para além disso as duas proteínas sao igualmente activas nas condiçoes seleccionadas. Observou-se uma inibição de cerca de 50% a cer

ZM ZXZ ca de 65 mM de ACV-ou ACV-/^. A diminuição da concentração do da substrato tem como resultado uma reduçpao no Ιϋ^θ das ACV metade. Isto é um sinal de que as ACV agem sobre o nível de substrato. Por conseguinte as ACV encontram-se provavelmen te nas membranas dos fosfolípidos e inibem deste modo a acti vidade das fosfolipases.

i

A calpactina liga-se às membranas de fosfolípidos a um nível micromolar de Ca⁺⁺ (Orust, D.S. e Cremitz, C.E. (1988) Nature 331» 88-91)· Deste modo verifica-se se a proteína ACV tem a capacidade de inibir a actividade da fosfo lipase com concentrações reduzidas de cálcio. Uma vez que a

AZ í fosfolipase pancreática A^ era inactiva a concentrações de + + ~ Ca inferiores a 5θ mM, foi esta a concentração mais baixa utilizada. As Figuras 5θ e 51 mostram a dependência do cálcio j da inibição induzida pela proteína ACV da actividade de fosfo !

** *1” i lipase. A todas as concentrações de Ca verificou-se activi- j dade tanto da proteína ACV-^C como da ACV-/3 . Na verdade nota- | -se uma diferença funcional ente a ACV-Λ e a ACV-β. A baixas

Az + ψ A concentrações de Ca a ACV-p era significativamente mais activa do que a ACV-Λ· Isto pode implicar que a ACV-/9 necessita de menos Ca para a ligaçao as membranas.

De acordo com a presente invenção as proteínas ACV obtidas podem ser transformadas em outras proteínas ACV (peptídeos) de modo conhecido em si.

Por meio de investigações constatou-se que as 1

AZ pontes de dissulfureto nao tem qualquer significado para a ac

AZ AZ _ tividade de inibição da coagulaçao das proteínas ACV naturais.

Segundo a escolha da célula hospedeira nao é de excluir que possa ocorrer uma ligaÇao de resíduos de cisteína no produto a# w primário da traduçao com formaçao de pontes de dissulfureto de modo diferente do referido anteriormente. Ê possível que a estrutura terciária incorrecta” ocorrente do produto tenha como consequência uma diminuição ou mesmo uma perda mas eventualmente também um melhoramento das propriedades farmacológi A# cas úteis» especialmente da actividade de inibição da coagula Çao, o que pode ser estabelecido por meio das análises de pro í teínas ACV acima referidas. Em tal caso é eventualmente conve ; niente cindir as ligações de dissulfureto com um redutor conveniente e tratar o polipeptídeo reduzido com um oxidante apro j priado a fim de estabelecer novamente as ligações de dissulA* \ fureto. Em relaçao a actividade do produto formado, e possível comprovar se ascondiçoes escolhidas (redutores e/ou oxiI dantes) provocaram o aumento desejado da actividade biológica ou se as condiçoes têm de ser alteradas de modo conhecido.

AJ A»'

Para a cisão das pontes de dissulfureto sao redutores apropriados, por exemplo, compostos de tiol, como tiofenol, 4-nitrofenol, 1,4-butanoditiol e especialmente 1,4i -ditiotreitol.i !

A redução é levada a efeito vantajosamente num i

A#ί meio aquoso alcalino, por exemplo na solução aquosa diluida de um hidróxido de metal alcalino» por exemplo hidróxido de sódio, de um carbonato de metal alcalino, por exemplo carbona to de sódio, ou numa base orgânica, especialmente numa trialquilamina inferior, por exemplo trietilamina, à temperatura I ! ambiente. ί

A» Os oxidantes que sao apropriados para se es— ~ i tabelecerem de novo as ligações de dissulfureto no polipeptídeo reduzido sao por exemplo o oxigénio do ar, o qual pode ser | feito borbulhar através de uma solução aquosa do polipeptídeo < contendo eventualmente uma quantidade catalítica de um sal dun metal de transiçao, por exemplo sulfato de ferro-(IIl), clore !

I to de ferro-(III) ou sulfato de cobre-(II); iodo, por exemplo >

o qual ê adi a forma de uma solução alcoólica, ~ numa solução numa mistura de agua de água-metanol} Hexacianoferratosob a forma do aducto de iodeto de potássio LI^, cionado de preferência sob por exemplo metanólica, ou com um álcool» por exemplo

-(III) de potássio em solução aquosa, 1,2-diiodoetano ou azodicarboxilato de dimetilo ou de dietilo, fazendo-se a reacçao em água ou num álcool miscível com água, por exemplo metanol. A oxidaçao é especialmente realizada à temperatura ambiente.

A separaÇao dos reagentes, especialmente dos sais e do oxidante ou do redutor e dos seus produtos secundários do composto ACV pretendido é realizada por meio de técnicas conhecidas em si, por exemplo por filtraçao molecular,por exemplo através de Sephadex ou de Biogel.

Uma mistura de produtos com actividade ACV ob tida de acordo com o processo da presente invenção pode ser separada nos respectivos componentes por meio de técnicas conhecidas. Sao técnicas de separaçao apropriadas por exemplo métodos cromatográficos, por exemplo cromatografia de adsorçao, cromatografia de permuta iónica, HPLC ou HPLC de fase in vertida, e ainda métodos de distribuição multiplicativa ou electroforéticos, por exemplo electroforese em acetato de celulose ou electroforese em gel, especialmente electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE”).

Os compostos preparados de acordo com o proces

A» so da presente invenç» podem apresentar-se sob forma livre ou também sob forma dum sal, especialmente dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Uma vez que estes produtos contêm vá rios resíduos de ácidos aminados com grupos amina livres, os compostos da presente invenção podem apresentar-se por exemplo sob a forma de sais de adiçao de ácido. Os sais de adiçao de ácido considerados sao especialmente sais fisiológicamente aceitáveis com ácidos habituais terapeuticamente utilizáveis} como ácidos inorgânicos podem referir-se os halogenetos de hidrogénio mas também o ácido sulfúrico e o ácido fos- 49 -

fórico e pirofosfóricoj para ácidos orgânicos sao apropriados em primeiro lugar o ácido benzenossulfónico ou p-toluenossulfónico ou ácidos alcanossulfónicos inferiores» como o ácido metanossulfónico» bem como ácidos carboxílicos» como ácido acé tico» ácido láctico» ácidos palmítico e esteárico» ácido máli co» ácido tartárico» ácido ascórbico e ácido cítrico. Uma vez que os compostos ACV contêm também resíduos de ácidos aminados com grupos carboxílicos livres» podem também apresentar-se sob a forma de sais metálicos» especialmente sais de metais alcalinos ou alcalinoterrosos, por exemplo, sais de sódio, de cálcio ou de magnésio, ou também sais de amónio derivados de amoníaco ou de uma base fisiologicamente aceitável orgânica contendo azoto. Uma vez que estes compostos comtêm portanto simultaneamente grupos carboxílicos livres e grupos amina livres podem também apresentar-se sob a forma de sais internos.

De acordo com o procedimento adoptado assim se obtêm os compostos da presente invenção sob forma livre, sob a «w forma de sais de adiçao de ácido ou de sais com bases. A par** tir dos sais de adiçao de acido ou de sais com bases podem ser obtidos os composto livres segundo técnicas conhecidas, por exemplo por ajuste do valor do Ph ao ponto isoeléctrico.A par tir dos compostos livres podem, por seu turno, ser obtidos ** _ * sais de adiçao de acido terapeuticamente aceitáveis ou sais com bases por reacçao com ácidos ou com bases, respectivamente, por exemplo com os ácidos e as bases que formam os sais acima referidos, seguida de evaporaçao ou de liofilizaçao.

A propriedade dos anticorpos de ligar antigenes específicos encontra utilização prática ainda na determinação qualitativa e quantitativa (análise imu.no 16gica) e na purificação dos antigenes (cromatografia de imunoafinidade). 0 soro de animais imunizados contêm normalmente uma variedade de diferentes anticorpos que reagem com os mesmos antigenes em diierentes locais de ligaçao, encontrando-se no entanto en tre estes também anticorpos contra outros antigenes que refle

tem as experiências anteriores do indivíduo. A ucilizaçao bem sucedida de anticorpos para a determinação e para a purificação de antigenes exige no entanto alta especificidade e repro dutibilidade.

Os anticorpos homogénios que preenchem estas exigências podem ser obtidos por meio da técnica de hibridomas descrita por Kõhler e Milstein (17)· Dum modo geral esta têcnina consiste em fundir com células tumorais linfécitos B que segregam anticorpos, por exemplo do baço, de animais imunizados. As células de hibridomas formadas combinam a faculda de de multiplicação ilimitada por divisão com a faculdade de formar e de segregar anticorpos dum único tipo. Por cultura num mei selectivo em que as células tumorais nao fundidas mor rem mas as células de hibridoma se multiplicam e por meio de manipulações apropriadas podem ser obtidos clones, isto é, po pulaçoes de células que descendem de uma única célula de hibridoma, que podem ser cultivados, podendo ser isolados os an ticorpos monoclonais produzidos pelas células.

A#

A presente invenção refere-se a um processo para a preparaçao de anticorpos monoclonais contra ACV e de células de hibridomas qjie produzem estes anticorpos. Sao preferidas as linhas de células de hibridomas e os anticorpos mo noclonais segregados por estas que reagem especificamente com _ A» as proteínas ACV. 0 processo para a preparaçao de anticorpos monoclonais anti-ACV-p( e anti-ACV-^ 6 caracterizado por se imu nizarem ratos com proteínas ACV, fundirem—se linfúcitos B de animais deste modo imunizados com células de mieloma, clonarem-se as células de hibridoma formadas, em seguida cultivaA* rem-se in vitro ou por injecçao em ratos e isoiarem-se os anticorpos da cultura·

A presente invenção refere-se também a colunas de cromatografia de imunoafinidade e a conjuntos de análi se (test kits”) para análises imunolúgicas que contêm estes anticorpos.

De acordo com o processo da presente invenção imunizam-se ratos, por exemplo ratos Balb/c, de modo conheciAZ do. De acordo com uma forma de concretização preferida, injec ta-se ACV por exemplo semanalmente ou também a intervalos mai ores durante várias semanas, por exemplo 5 a 12 semanas, até se ter formado um número suficiente de linfócitos B produtores de anticorpos.

A fim de aumentar a imunogeneidade das ACV usadas ligam-se estas a um suporte fortemente imunogénico como por exemplo albumina heteróloga ou hemocianina de Megathura crenulata (keyhole limpet hemocyanin·’ = KLH). De preferên

A.

cia utilizam-se diferentes preparações de ACV/KLH, imunizando

AZ

-se de acordo com um esquema de imunizaÇao durante o tempo ne cessário para que se formem células produtoras de anticorpos em número suficiente, por exemplo durante cerca de 40 semanas. Retiram-se os órgãos que contêm os linfócitos B, por exemplo células de baço, dos ratos imunizados e fundem-se com células de mieloma tais que, com base numa mutaçao, nao cresçam num meio de cultura selectivo. Estas células de mieloma sao conhe cidas e podem por exemplo ser as designadas XÓ3-Ag8, XÓ3-Ag8.~ 6.5.3, MPC-11, NSl-Ag4/l, MOPC-21 NS/1 ou SP 2/0. De acordo com um modo preferido de concretização fundem-se células de baço de ratos imunizados com células de mieloma da linha de células X63—Ag8. 6. 5· 3·

A fusão ê levada a efeito de acordo com métodos conhecidos em si por mistura de linfócitos B e de células de mieloma com adiçao de um fusiogénio de células, como polie tilenoglicol, virus Sendai, cloreto de cálcio ou lisolecitina. De preferência a fusão ê levada a efeito na presença de polietilenoglicol, por exemplo com um peso molecular entre 1000 e 4000.

Após a fusão cultivam-se os híbridos obtidos de acordo com um método conhecido em si num meio de cultura selectivo complementado com hipoxantina, aminopterina e timi52 -

dina (meio HAT)

As células de mieloma nao fundidas nao podem crescer neste meio e morrem tal como os linfócitos normais.

Os sobrenadantes das culturas de hibridomas podem ser verificados no que respeita ao seu conteúdo em anti corpos específicos de acordo com um método conhecido em si, por exemplo por análise radio-imunológica· ELISA ou aglutinaA» çao. Deste modo verificou-se de modo surpreendente que com o processo descrito ê possível obter células de hibridoma que segregam anticorpos específicos contra proteínas ACV. As célu las de hibridoma que produzem anticorpos com a especificidade

A* pretendida sao seleccionados por clonagem a partir da mistura de diferentes células de hibridoma proveniente da fusão. Para este fim estabelecam-se culturas provenientes de uma única das células que crescem por meio de um método conhecido em si, no meadamente do método conhecido por diluição limitante” (”Limiting dilution”).

Para a produção em massa cultivam-se os clones de células de hibridomas que produzem anticorpos com a es pecificidade pretendida in vitro num meio apropriado ou injec tam-se em ratos para multiplicação. De acordo com uma forma preferida de concretização injectam—se células de hibridoma em ratos tratados com pristano,, colhe-se líquido ascítico e isolam-se os anticorpos a partir deste por meio de precipitação com solução de sulfato de amónio.

Os anticorpos específicos para as proteínas ACV obtidos por meio das células de hibridomas referidas podem ser usados para a preparaçao de colunas de cromatografia de imunoafinidade de acordo com técnicas conhecidas em si.Num AZ AZ modo de concretização preferido da presente invenção faz-se reagir um material de suporte adequado (suspenso numa solução tampao) com uma solução do anticorpo, Eliminam-se em seguida por lavagem as fracçoes nao ligadas e bloqueiam-se os locais

- de ligaÇao nao utilizados do material de suporte. Os anticorpos específicos para as proteínas ACV obtidos por meio das cê lulas de hibridomas podem ser utilizados para a preparaçao de conjuntos de análise (test kits”) de acordo com técnicas conhecidas em si. Estes conjuntos de análise podem basear-se em diferentes métodos analíticos, por exemplo em análises radio-imunológicas, de aglutinaçao de latex, análises de mancha, análises radio-imunológicas competitivas ou de sanwich”, aná lises imunológicas enzimáticas, de imuno-fluorescência ou ensaios enzimáticos imunoquímicos. Estes conjuntos podem conter, para além dos anticorpos usuais, conjugados de anticorpos com enzimas de diferente proveniência ou com suportes fluorescentes, proteínas ACV marcadas com isótopos radioactivos como

125

I ou conjugados com enzimas, por exemplo com peroxidase de rábano bastardo ou com fosíatase alcalina, podendo conter ain da substratos de enzimas , tampões apropriados, geis, latex, poliestireno ou outros materiais de enchimento ou de suporte.

As proteínas conhecidas obteníveis de acordo com o processo da presente invenção (peptídeos) apresenram propriedades farmacológicas notáveis e podem ser utilizadas para fins profiláticos ou principalmente para fins terapêuticos.

Os novos compostos ACV de acordo com a presen te invenção podem por conseguinte ser utilizados por analogia para com as proteínas ACV naturais para a terapia e para a pro filaxia de tromboses e tromboembolias, incluindo a profilaxia de tromboses pós-operativas, para a terapia de shock agugo (p. ex. no shock séptico ou traumático), para a terapia de coagulopatias de consumo, na hemodiálise, hemosseparaçoes, conservaçao de sangue e em circuito extracorporal.

AJ

A presente invenção refere-se igualmente a um «w ** A processo para a preparaçao de composiçoes farmacêuticas que contêm pelo menos um dos compostos da presente invenção ou dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, eventualmente em con- 54 -

junto com substâncias veiculares e/ou adjuvantes farmacêutica _ A» mente utilizáveis. Estas composiçoes podem ser usadas especialmente nas indicações acima referidas» podendo ser adminis tradas por exemplo por via parenteral, como intravenosa» intracutânea, subcutânea ou intramuscular, ou por via tópica.

A» A presente invenção refere-se igualmente a

IWAI utilizaÇao dos novos compostos da presente invenção e das-com ** AA posiçoes farmacêuticas que os contem para o tratamento profilático e terapêutico do corpo humano ou de animais, especialmente nos quadros patológicos acima referidos, em primeiro

IVM lugar para a inibição da coagulaÇao do sangue no interioreno exterior do corpo humano ou de animais.

A dosagem depende principalmente da forma de utilizaÇao específica e do objectivo da terapia ou da profila xia. A quantidade incorporada em cada dose unitária bem como

Aí o esquema de administreÇao podem ser determinados principalmente por meio de uma apreciaçao individual de cada caso patológico! os métodos utilizáveis com este fim para a determinação de factores sanguíneos relevantes sao conhecidos dos espe cialistas. Normalmente a dosagem dos compostos da presente in

IV AI vençao numa quantidade terapeuticamente eficaz numa injecçao situa-se na gama desde cerca de 0,005 até cerca de 0,1 mg/kg de peso corporal. Ê preferida a gama desde cerca de 0,01 até

A* cerca de 0,05 mg/kg de peso corporal. A administraçao e levaAI da a efeito por injecçao intravenosa, intramuscular ou subcutânea» Em conformidade, os preparados farmacêuticos para admi ** > A nistraÇao parenteral sob forma de dose unitaria contem por do se em dependência com o modo de aplicaçao cerca de 0,4 a cerAI ca de 7,5 mg do composto da presente invenção. Juntamente com

AI A A o produto activo estas composiçoes farmacêuticas contem habiAI IV tualmente ainda um tampao, por exemplo um tampao de fosfato, que deve manter o valor do pH entre cerca de 3,5 e 7, e ainda cloreto de sódio, manitol ou sorbitol para ajustamento da iso tonia. As composiçoes podem ser apresentadas sob forma liofilizada ou dissolvida, podendo a solução conter um conservante

I

com acçao anti-bacteriana, por exemplo 0,2 a 0,3 % de 4-hidro xibenzoato de metilo ou de etilo. Um preparado para utilizaçao tópica pode apresentar-se sob a forma de uma solução aguo A/ /* sa, de uma solução ou geleia, de uma solução ou suspensão ole osa ou de uma pomada gordurosa ou especialmente emulsionada. Um preparado sob a forma de uma solução aquosa pode ser obti— A. A da, por exemplo, por incorporação de uma substancia activa de acordo com a presente invenção ou de um seu sal terapeuticamente utilizável numa solução aquosa tamponizada de pH 4 a 6,5 e eventualmente com outras substâncias activas, por exemplo um antiinflamatório. e/ou um polímero endurecedor, por exemrw pio polivinilpirrolidona, e/ou um conservante. A concentraÇao da substância activa situa-se entre 0,1 e 1,5 mg» de preferên

A# cia entre 0,25 a 1,0 mg, em 10 ml de uma solução ou em 10 mg de um gel.

Uma forma de aplicaçao para a administraçao

A* tópica pode ser obtida por exemplo por suspensão de uma subs— A ** tancia activa da presente invenção ou de um seu sal terapeuti camente utilizável num óleo, eventualmente com adiçao de um espessante, como estearato de alumínio, e/ou de agentes tensioactivos cujo valor de HLB (hydrophilic-lipophilic balancé') seja inferior a 10, como monoésteres de poliálcoois de ácidos gordos, por exemplo monoestearato de glicerina, monolaurato de sorbitol, monoestearato de sorbitol ou monooleato de sorbi tol. Uma pomada gordurosa pode ser obtida por exemplo por sus A» _Λ A* pensão de uma substancia activa da presente invenção um de um seu sal numa base gorda moldável, eventualmente com adiçao de um agente tensioactivo de valor de HLB inferior a 10. Uma pomada emulsionada pode ser obtida por trituração de uma soluA* A

Çao aquosa de uma substancia activa de acordo com a presente invenção ou de um seu sal numa base gordurosa branca moldável com adoçao de um agente tensioactivo de valor de HLB inferior a 10. Todas estas formas de aplicaçao tópica podem conter tam ** A bem um conservante. A concentraÇao da substancia activa situa —se de preferencia de 0,1 a 1,5 mg, de preferencia de 0,25 a 1,0 mg, em cerca de 10 g de massa base.

* ¹ .y*'

-- jt ** Α

Alem das composiçoes farmacêuticas acima descritas e dos seus analogos destinados a uma utilização mediei nal directa no corpo humano ou de um mamífero, a presente invenção refere-se também ao uso de composiçoes e preparados far macêuticos fora do corpo humano ou do mamífero. Estas composi çoes e preparados sao usadas principalmente como aditivos ini bidores da coagulaçao no sangue, que pode, alem de circular no corpo, estar sujeito a uma circulação ou a um tratamento (por exemplo um circuito extracorporal ou diálise em condutas de plástico), conservaÇao ou modificação (por exemplo hemo-se

Ar .A» A# paraçao). A composição destes preparados, como solução para diluição ou também em solução de dose única pronta a usar, 6 semelhante aos preparados injectáveis acima descritos? de moA# do conveniente, no entanto, a quantidade ou a concentração de substância activa é referida ao volume de sangue a tratar. De acordo com o objectivo específica uma dose apropriada contém desde cerca de 0,01 a cerca de 1,0 mg de subatância activa/1 de sangue, sendo possível ainda ultrapassar o limite superior sem perigo.

De modo especial a presente invenção refere-se às moléculas de ADN que codificam para as proteínas ACV descritas nos exemplos justificativos, aos plasmídeos de expressão que contem essas moléculas de ADN, aos microorganismos transformados com esses plasmídeos de expressão, aos anticorpos monoclonais contra as proteínas ACV, às células de hibridoma que produzem esses anticorpos e a conjuntos de análise para análise imunolégica contendo esses anticorpos, aos processos descritos nos exemplos para a sua preparaçao e aos pro cessos descritos nos exemplos para preparaçao de proteínas/po lipeptídeos com actividade ACV por meio dos microorganismos transformados, bem como aos novos compostos ACV descritos nos exemplos.

As referencias feitas na presente meméria des critiva a proteínas anticoagulantes vasculares ou, abreviada. mente, a proteínas ACV devem ser entendidas como significando,

•j

sempre que nada em contrário se determina, os polipeptídeos/ proteínas que apresentam essencialmente as propriedades próprias das proteínas descritas pela primeira vez na EP-A 181465» Estas propriedades podem ser verificadas por meio dos ensaios e dos processos de caracterizaÇao apresentados nessa publicação (actividade ACV).

Para alêm disso estão abrangidos sob esta definição também os polipeptídeos/proteínas que apresentam agre gaçao como por exemplo dímeros, trímeros ou tetrâmeros, também quando estas formas nao apresentam qualquer actividade bio lógica per se ou apenas a apresentam de forma restrita, como pressuposto de que estas possam ser transformadas in vivo ou in vitro pelo menos num componente activo.

Quando, no quadro da presente invenção, se ob têm polipeptídeos/proteínas que per se nao apresentam qualquer actividade biológica ou só a apresentam de forma restrita,por exemplo proteínas de fusão ou as chamadas pro drugs”, masque podem ser transformados pelo especialista de um modo conhecido em si nos componentes activos, por exemplo por meio de pro cessamento in vitro ou in vivo ou polipeptídeos/proteínas que apenas ostentam actividade in vivo, deve considerar-se que es tes compostos correspondem à definição de proteínas anticoagu lantes vasculares, abreviadamente proteínas ACV, e portanto se encontram abrangidos no âmbito da presente invenção.

Por compostos com actividade ACV devem entender-se também os compostos expressos pelas células hospedeiras transformadas que apresentam uma actividade ACV e uma reacçao positiva com anticorpos anti-ACV e que apresentam a estrutura primária de ACV ou de uma estrutura daí derivada. Por compostos ACV com uma estrutura primária derivada de ACV entendem-se compostos ACV modificados nos quais a modificação leva a um encurtamento da estrutura primária de ACV, e um re«w /V ordenamento da estrutura de repetição ou a uma modificação que provoca uma alteraçao da estabilidade ou da actividade.

Por gene cu ADN de ACV entende-se na presente invenção uma molécula de ADN que codifica para as proteínas ACV acima definidas.

Os exemplos e as figuras que se seguem destinam-se a ilustrar a invenção e nao devem limitá-la de qualquer modo.

A fim de simplificar os exemplos que se seguem descrever-seao abreviadamente os métodos que se repitam muitas vezes.

Os plasmídeos sao designados por um símbolo iniciado com um p” minúsculo seguido de letras maiúsculas e de números. Os plasmídeos de partida podem ser adquiridos comercialmente ou obtidos sem restrições. Podem set também cons truidos por meio de métodos publicados a partir de plasmídeos livremente obteníveis.

Cortar ou digerir ADN refere—se a cisão catalítica do ADN por meio de endonucleases de restrição (enzimas de restrição) em locais específicos para estas enzimas, conhecidos como locais de restrição. As endonucleases de restriçao podem ser adquiridas comercialmente e sao utilizadas nas condiçoes aconselhadas pelos fornecedores (tampao, soro de albumina de bovino (SAB) como proteína de suporte, ditiotreitol (DTT) como protector de oxidaçao).

A# A*

As endonucleases de restrição sao designadas com uma inicial maiúscula na maioria das vezes seguida por le tras minúsculas e normalmente por um número romano. As letras referem-se ao microorganismo a partir do qual foi isolada a

A* A, .

endonuclease de restrição em questão (p. ex.: Sma I! Serratia marcescens). Habitualmente corta-se 1 pg de ADN vom uma ou com várias unidades da enzima em cerca de 20 p.1 de solução de tam A» A* A.

pao. Normalmente utiliza-se uma duraÇao de incubaçao de 1 hora a 37 C mas e possível variar estas condiçoes de acordo com as inst uso do fornecedor. Αρδε o corte elimina-se

muitas vezes o grupo 5’fosfato por incubação com fosfatase al calina de intestino de vitela (CIP). Esta operaçao destina-se a evitar a reacçao indesejada dos locais específicos numa reacçao de ligase que se efectue em seguida (p. ex. fecho em círculo de um plasmídeo linearizado sem inserção de um segundo fragmento de ADN). Quando nada em contrário for indicado, os fragmentos de ADN após o corte com endonucleases de restri çao nao sao normalmente fosforilados. As condiçoes de reacçao

A* A* para a incubaçao com fosfatase alcalina sao, por exemplo, as indicadas no manual de clonagem em M13 e sequenciaçao (Cloning and Sequencing Handbook, Companhia Amersham, PI/129/83/12). Ap6s a incubaçao elimina-se a proteína por extracçao com fe— nol e clorofórmio e precipita-se o ADN a partir da fase aquosa por adiçao de etanol.

Isolamento” de um determinado fragmento de ADN significa a separaçao do ADN cortado por exemplo sobre um gel de agarose a 1 %. Após a electroforese e a visualizaçao do ADN a luz ultra-violeta por coloraÇao com brometo de etí— dio (EtBr) o fragmento pretendido S localizado por meio de mar cadores de peso molecular depositados conjuntamente e ê ligado por meio de nova electroforese em papel de DE 81 (Schleicher und Schuell). 0 ADN ê lavado por enxaguamento com tampao de baixa concentraÇao salina (NaCl 200 mM, Tris 20 níM pH=7,5, EDTA 1 mM) e por fim ê eluido com um tampao de alta concentra ção salina (NaCl 1 M, Tris 20 mM pH=7,5, EDTA 1 mM). 0 ADN ê «w precipitado por adiçao de etanol.

Análise de Southern” ê um método pelo qual se detecta a presença de um determinado fragmento de ADN numa mistura de ADN por hibridaÇao com uma sonda oligonucleotídica marcada conhecida ou com um fragmento de ADN marcado. A análise de Southern significa nos exemplos que se seguem, quando nada em contrário for especificado, a separaçao da mistura de ADN num gel de agarose a 1 %, a desnaturaçao e a transferência sobre um filtro de nitrocelulose (Schleicher und Schuell, BA 85) por meio do método de E. Southern, J. Biol. 98 (1978),

ρρ. 5θ3--517» β a hibridaçao conforme descrito por R. Hauptmann et al., Nucleic Acids Res. 13 (1985), PP· 4739-4749· •tf **

Transformaçao significa a integração de ADN num organismo de tal modo que o ADN se possa multiplicar nesse organismo quer de modo extra-cromossomal quer como integrante cromoÉsoma1. A transformaçao de E. coli segue o método dado no manual de clonagem em M13 e sequenciaçao (Cloning and Sequencing Handbook, Companhia Amersham, Pl/129/83/12).

•tf Sequenciaçao” de um ADN significa a analise da sequência de nucleétidos num ADN. Para esse fim o ADN ê cor

A» *tf tado com diferentes enzimas de restrição e os fragmentos sao integrados no correspondente ADN de dupla cadeia cortado de M13 mp8, mp 9» mp 18 ou mp 19, ou o ADN ê integrado por meio *· de ultra-sons seguindo-se reparaçao das extremidades e selec•tf A* „ çao por dimensão em ADN de M13 mpo cortado por Sma I e des— fosforilado (método shotgun). Apés a transformaçao de E. co li JM 101, isola-se o ADN de cadeia simples a partir de fagos M13 recombinantes conforme o manual de clonagem em M13 e sequenciaçao (Cloning and Sequencing Handbook, Companhia Amersham, PI/I29/83/I2) e sequencia-se de acordo com o método de didesoxi de Sanger (F. Sanger et al. } Proc. Natl. Acad. Sei.

(1977)i PP· 5463-5467)· A determinação das sequências foi realizada por meio do programa de computador originalmente de senvolvido por R. Staden (R. Staden Nucleic Acids Res. 10 (1982)# pp. 4731—^751) ^e modificado por Ch. Pieler (C. Pieler 1987, Dissertação, Universidade de Viena).

«tf *·

Ligaçao refere-se ao processo de formaÇao de ligações de diéster de fosfato entre duas extremidades de fragmentos de ADN de dupla cadeia. Normalmente ligam-se entre 0,02 e 0,2 /ig de fragmentos de ADN em 10 pl com cerca de 5 uni dades de ligase de ADN T4 (ligase) numa solução tampao apro priada (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, 1982, p. 474).

•tf

Preparaçao de ADN a partir de transformantes

significa o isolamento do ADN plasmídeo a partir de bactérias por meio do método de SDS alcalino modificado de acordo com Birnboim e Doly (T. Maniatis et al. , Molecular Cloning, 1982, pp. 368-369) com eliminação da lisozima. Para este fim utilizam-se as bactérias de 1,5 a 5θ ml de cultura.

Oligonucleótidos” sao polidesoxinucleÓtidos sintetizados quimicamente. Para este fim utilizou-se o sintetizador Modelo 38IA da Applied Biosystems. Os oligonucleótidos sao processados de acordo com o User Manual do Modelo 38IA (Applied Biosystems) e foram purificados por electroforese em poliacrilamida (PAGE).

Fosforilar” significa a transferência enzima tica do resíduo de gama-fosfato de ATP para um grupo 5’OH livre de um Úcido nucleico, geralmente de um oligonucleótido. A fosforilaÇao é levada a efeito em 10 yul de solução sobre um máximo de 100 pmol do oligonucleótido com 10 unidades de poli -nucleotidoquinase T 4 na presença de 100 pmol de ATP numa so luçao tampao apropriada (tris 70 mM, pH=7,6, MgClg 1L mM, DTT 5 mM) durante 3θ minutos a 37 C. A reacçao e feita parar gera lmente por aquecimento durante 10 minutos a 100°C.

Esclarecem-se sumàriamente algumas abreviaturas usadas!

pares de bases

BSA:

albumina de soro de bovino

DTT: ditiotreitol

EDTA: etilenodinitrilotetraacetato dissódico

SDS: dodecilsulfato de sódio

Tris:

Denhardt:

LB;

SSC lx:

TE:

tris-(hidroximetil)-aminometano

0,02 % de ficol, 0,02 % de polivinilpirrolidona,

0,02 % de BSA g/1 de triptona, 5 g/1 de extracto de levedura, g/1 de NaCl

NaCl I50 mM, citrato trissódico 15 mM, pH=7 tris 10 mM pH=8,0, EDTA 1 níM

índice das Figuras:

0.1: Fragmentos trípticos de proteínas ACV de placenta

0.2: HPLC dos fragmentos trípticos de proteínas ACV de placenta

O.3; HPLC dos fragmentos trípticos de proteínas ACV de cordão umbilical

0.4: HPLC de permeaçao em gel de proteínas ACV de placenta e de cordão umbilical

0.5: HPLC de fase inversa de proteínas ACV de placenta

0,6: Electroforese em gel de SDS de proteínas ACV de placenta

1: Selecçao dos oligonucleótidos EBI-386, 3θ7 e 3θ8

2: Selecçao dos oligonucleótidos EBI-118 e 119

3: Análise de mancha de Northern com ADNc de ACV-alfa e de

ACV-beta

4: Sequência do ADNc de ACV-alfa

5: Ordenaçao da sequência de peptídeos na sequência de áci dos aminados derivada do ADNc de ACV-alfa

6: Sub-sequência repetida 4 vezes na proteína ACV-alfa

7: Sequência de ADNc de ACV-beta

8: Sub—sequência repetida 4 vezes na proteína ACV-beta

9: Composição em ácidos aminados de ACV-alfa e de ACV-beta

10: Análise genómica de mancha de Southern com ADNc de ACV-alfa e de ACV-beta

11: Comparaçao de ácidos aminados de ACV-alfa com ACV-beta

12: Comparaçao de nucleótidos de ADNc de ACV—alfa com ADNc de ACV-beta

13: Gráfico de hidrofilicidade de ACV-alfa e de ACV-beta

14: Comparaçao de ACV-alfa, ACV-beta, lipocortina I e lipocortina II

15:	Sequência pRH284	da	fracçao do promotor e do terminador em
16:	Construção	de	pRH291
17:	Construção	de	pRH212
18:	Construção	de	pRH292
19:	Electroforese	em gel de SDS das proteínas expressas

- 63 r

21:

22:

23í

24:

25:

26:

í

28:

29:

a) Gel com as proteinas corado com azul

b) Mancha de

Legenda! M= +fosfato=

-fosfato=

Western

Purificação de

SDS corado com

Bandas!

1:

2:

3:

4:

de Coomassie

Marcas de peso molecular

W A*

Inibição da expressão de

Expressão de ACV (promotor pho induzido) ACV—alfa· Gel de electroforese em gel de azul de Coomassie

ACV

Extracto bruto

Precipitado com sulfato de amónio (dissolvido e dia lisa do)

12:5 ug de fracções 1 a 11 de DEAE-FF-Sepha rose

ACV apos

ACV apôs cromatogracromatofraConjunto de fracções com fia em DEAE-FF-Sepharose «V

Conjunto de fracções com fia em Sephacryl-S 200 HR

ACV purificada após cromatografia

Q-Sepharose—FF

ACV natural purificada de placenta humana Marcadores de peso molecular (Pharmaciaj 94 kD, 64kD, 43 kD, 30 kD, 20 kD e 14 kD)

Cromatografia em Sephacryl S-200 de ACV-A—r pré-purifica da

Cromatografia em Q-Sepharose-FF de ACV-p(-r pré-purifica da

HPLC

HPLC

HPLC

HPLC

HPLC

HPLC

5·'

6:

7:

de de de de em permeaçao em permeaçao em fase inversa fase inversa gel de gel de de ACV

ACV natural

ACV-Á recombinante natural de ACV— recombinante dos fragmentos trípticos dos fragmentos trípticos de ACV natural de ACV-(X recombinante *** .J

Gel de SDS de uma comparaçao entre ACV-p< natural e recombinante na presença e na ausência de DTT

«

30:

31:

32:

33:

34:

35!

36:

37:

38:

39:

4θί :

42:

43:

44:

45:

46:

47:

Gel de SDS de ACV-p( recombinante na presença e na ausência de DTT

Análide de mancha de Western de ACV natural e de CAV-K recombinante

Focagem isoelóctrica de ACV natural e de ACV— ff- recombi nante

Ensaio de tempo de protrombina modificado com ACV natutural e recombinante

Ensaio de tempo de trombina com ACV natural e recombinante

Formaçao de factor X^ no plasma por meio de ACV natural e recombinante

Ligaçao de ACV à dupla camada de fosfolípidos

Construção de pGN25 e de pGN26

Purificação de ACV /3 recombinante} gel de electroforese em gel corado com azul de Coomassie

PurificaÇao de ACV fi recombinante} amostras durante o processo

HPLC de permeaçao em gel de ACV b recombinante

HPLC de fase inversa de ACV /3 recombinante

HPLC de fase inversa de ACV ή recombinante após incubaA* çao

Análise de ácidos aminados de ACV recombinante

Sequenciaçao N-terminal de ACV /3 recombinante

Gel de SDS de ACV /3 recombinante na presença e na ausên cia de DTT

Focagem isoelóctrica de ACV /5 recombinante

Efeito de ACV-Ç( e de ACV-$ sobre a actividade de protrombinase. A activaÇao da protrombina foi medida como descrito na presença de quantidades variáveis de ACV(o) ou de ACV— ( ).

- 65 -______________-Λ '

48: Efeito de ACV-Qk sobre a actividade de fosfolipase Ag.

A actividade de fosfolipase A foi determinada como des M crito. A inibição induzida por ACV-tfC foi medida com fos folípidos 13,2 pM o (círculos em branco) ou com fosfolí pidos 6,6 pM (círculos a cheio).

49: Efeito de ACV-/3 sobre a actividade de fosfolipase Ag.

A* . **

A determinação da % de inibição foi determinada como descrito. A inibição induzida foi medida com fosfolípidos (13,2 pM o (círculos em branco) ou com fosfolípidos 6,6 jiM (círculos a cheio).

50í Acçao de Ca⁺⁺ sobre a inibição induzida por ACV-Λ da actividade de fosfolipase.

A inibição foi determinada com fosfolípidos 6,6 pM e com Ca⁺⁺ 1 niM (círculos em branco), 0,5 mM (círculos a cheio), 0,1 mM (quadrados em branco) ou 0,05 mM (quadra dos a cheio).

51í Acçao de Ca sobre a inibição induzida por ACV-/^ da actividade de fosfolipase.

A inibição foi determinada com fosfolípidos 6,6 pM e com Ca⁺⁺ 1 niM (círculos em branco), 0,5 niM (círculos a cheio), 0,1 mM (quadrados em branco) ou 0,05 mM (quadra dos a cheio).

Exemplo 0 material isolado a partir dos vasos de cordoes umbilicais e/ou de placenta e purificado foi novamente purificado por meio de uma HPLC de fase inversa·

Fase estacionária!

Fase móvel A!

Fase móvel B: Gradiente !

Caudal·

Detecçao í

Bakerbond WP-RP 18, 4,6x250 mm, partículas de 5 /im, poros 300 A

Acido trifluoroacótico a 0,1 % em água, pH 2,2

Acido trifluoroacético a 0,1 % acetonitri-lo a 68 % de B em 24 minutos ml/min

UV, 214 nm

Em seguida a esta fase de purificação digeriram—se com tripsina os dois materiais; em cada caso a substân cia que apresentava um peso molecular de 32 000.

Condiçoes de reacçao pg de ACV de placenta em 135 pl de NH^HCO^ 0,15 M, pH 8,0 + 2% p/p de tripsina (Worthington) horas a 37°C + 2% p/p de tripsina (Worthington) dum dia para o outro 37° ^c pg de ACV de cordão umbilical em 100 pl de NH^HCO^ a 1%, pH 8,0 + 2% p/p de tripsina (Worthington) horas a 37°C + 2% p/p de tripsina (Worthington) dum dia para o outro 37°C

Os fragmentos obtidos foram separados mor meio de HPLC e foi realizada uma sequenciaÇao dom o sequenciador de

fase gasosa Tipo 470A de Applied Biosystems com o programa 02 RTPH.

Condigoes de separaçao por HPLC:

Fase	estacionária:	^iBondapack C18, 3,8x300 mm, 10 Λ	partículas de
Fase	móvel A:	Acido trifluoroacético a 0,1	% em água,
		pH 2,2
Fase	móvel B:	Acido trifluoroacético a 0,1	% em acetoni-
		trilo
Gradiente·	0 a 55 % de B em 55 minutos
Caudal·	1 ml/min
Detecçao:	UV, 214 nm (pista superior)
		280 nm (pista inferior)

Além da digestão por tripsina, o material purificado por HPLC de fase inversa foi submetido também ainda a cisão por BrCN. Também os peptídeos desta cisão foram sequenciados e comparados com os dados dos peptídeos da digestão tríptica·

A#

Cisão por BrCN:

Dissolveram-se 111 yug de ACV purificada por HPLC de fase inversa em 111 jil de ácido acético a 70 %· Este já continha um excesso molar de 250 vezes de BrCN (90 /ig)· A A/ incubagao e realizada ao abrigo da luz durante 17 horas a tem peratura ambiente· Para a separaçao por HPLC foram usados 100 Jil.

Coluna de HPLC:

Fase móvel A:

Fase móvel B:

Gradiente:

pBondapack C18

Acido trifluoroacético a 0,1 % em água lAcido trifluoroacético a 0,1 % em acetoni— trilo a 70 % de B em 70 minutos

Cauda 1 ·

A*

Detecçao:

ml/min

UV, 214 e 280 nm

Uma comparaçao dos resultados obtidos nas con dições descritas bem como as analises por meio de HPLC de per meaçao por gel e por electroforese em gel de SDS prova a iden tidade da proteína ACV da placenta e da proteína ACV do corA* dao umbilical.

HPLC de permeaçao em gel:

Fase estacionária: Waters 1-125, jxm Na₂S0₄ 0,5 M, etilenoglicol

0,5

UV,

Fase móvel:

Cauda15

Detecçao:

ml/min

214 nm

7,8x600 mm, partículas de

Na₂PO₄ 0,02 M, pH 7,0 a 25 %, Tween 20 a 0,04 %

Electroforese em gel de

SDS

Gel de SDS:

Espessura do gel:

Condiçoes de electroforese:

A*

Coloraçao:

Amostras %

0,7 mm

A* mA/placa, 2-3 horas de duraÇao

Azul de Coomasie jig de ACV de cordão umbilical ou

p.g de ACV de placenta

Exemplo 1

Preparaçao de um banco de ADNc placenta! humano

a) Isolamento do ARN total a partir de placenta

GT:

Tiocianato de guanidino 5 M, tris 50 níM pH=7>4 EDTA 25 raM. Antes de utilização adicionar (v/v) de beta—mercaptoetanol. 20 ml de GT refecidos em gelo 5 s 10 minutos antes de sao arusar, %

GH:

nao devendo nesta operaçao o GT precipitar·

Cloridrato de guanídio 6 M, EDTA 25 mM, beta-mer captoetanol 10 mM, ρΗ*7,θ· Arrefecimento em gelo.

Homogeneiza-se 1 g de placenta congelada e pui verizada mecanicamente em 20 ml de GT (0°C) durante 20 segundos com a máxima velocidade com um Polytron (Brinkmann). Determina-se o volume do produto homogénio, deita-se sobre 0,3 volumes de etanol (-20°C), mistura-se e centrifuga-se imediatamente a 12 000 rpm durante 5' a -10°C (centrífuga Beckman JA 21, rotor JS13»1)· Elimina-se uma eventual película de pro teína bem como o sobrenadante. Adicionam-se ao sólido 10 ml de GH gelado e homogeneiza-se com o Polytron. Centrifuga-se a ** o suspensão durante 5 minutos a -10 C e 12 000 rpm. Transfere-se o sobrenadante para o tubo de Corex estéril e despreza-se o sólido. Ao sobrenadante adicionam-se 0,025 volumes de ácido acético 1 M e 0,75 volumes de etanol frio (-20°C) e misturaΛ ** O

-se bem. Após cerca de 2 horas de incubação a -20 C centrifuga-se durante 10 minutos a 6 000 rpm a -20°C (rotor JA20). Eliminam-se cuidadosamente a película proteica e o sobrenadan te. Adicionam-se ao sólido 2 ml de GH (0°C), ressuspende-se o sólido e transfere-se a suspensão para um tubo de Corex de 15 ml. Enxagua-se o primitivo tubo de Corex com mais 8 ml de GH e reune-se a solução com os 2 ml. Ê importante que todo o sólido esteja em suspensão para o que eventualmente será necessário um tratamento rápido com ultra-sons. Adicionam-se 0,025 volumes de ácido acético 1 M e 0,5 volumes de etanol frio 4-70° C) e incuba-se durante cerca de 2 horas a -20°C. Repetem-se por duas vezes a centrifugação(6 000 rpm, 10 min, rotor JA20), a dissolução e a precipitação, resultando a quantidade total de GH reduzida a 5 η>1· Após a última centrifugação nao deve ser já visível qualquer película proteica sobre a solução, ca so contrário deverá ser repetida esta fase de purificação. Res suspende-se agitando no vortex durante 2 minutos o sólido com 5 ml de água tratada com pirocarbonato de dietilo (0°C), Decanta-se a solução límpida, adiciona-se novamente água a um

eventual resto de sólido e agita-se novamente no vortex até se obter uma solução límpida. Após adiçao de 0,1 volumes de acetato de sódio 3 M (pH=5,8) e 2,5 volumes de etanol e incu** o *** baçao durante 1 hora a -70 C, separa-se por centrifugação o ARN a 6 000 rpm durante 10 minutos a 4°C. Repete-se uma vez mais a dissolução e a precipitação. Por fim conserva-se o ARN em etanol a -20°C.

b) Isolamento de poli-A*-ARN

Suspende-se 0,5 mg de oligo-dT-celulose (Colla

A» borative Research, tipo 3, capacidade de ligaçao: 5 mg de poli-A⁺-ARN/g) em tampao de ligaçao (NaCl 200 mM, SDS a 0,2 %, tris 10 mM, pH=«7,4, EDTA 1 mM). Carrega-se 1 ml desta suspensão numa coluna e lava-se sucessivamente com 10 ml de água, 10 ml de NaOH 0,1 N, 10 ml de água e por fim com 10 ml de tam

A* A# A, pao de ligaçao. Separa-se o ARN integral a partir da solução alcalina por centrifugação (10 min, 6 000 rpm, rotor JA20). Dissolvem-se cerca de 10 mg de ARN em 4,5 ml de água· Após adiçao de 50 /11 de SDS a 2 % aquece-se a solução durante 3 min a 70 C e arrefece-se imediatamente em gelo. Após a adiçao de 50 ^1 de tris 1 M (pH=7,4), 10 pi de EDTA 0,5 M e 200 /11 de

A»

NaCl 5 M, carrega-se a solução imediatamente na coluna. A soluçao que goteja da coluna e novamente carregada nesta. Este procedimento é repetido três vezes. Por fim lava-se a coluna

A# A# com 30 ml de tampao de ligaçao. 0 ARN ligado é eluido com 5 ml de SDS a 0,2 %. Lava-se a coluna com 10 ml de água, 10 ml de NaOH 0,1 N e 10 ml de Hg e equilibra-se com 10 ml de tamA* A» ** pao de ligaçao. Aquece-se a solução de ARN novamente durante minutos a 70°C, arrefece-se ràpidanmnte com gelo, adicionam — se 50 /11 de tris 1 M, 10 /11 de EDTA 0,5 M e 200 jil de NaCl 5 M e carregasse na coluna. A solução efluente ê feita passar integralmente três vezes através da coluna de oligo-dT. Após lavagem elui-se o ARN com 3θ »1 de SDS a 0,2 %.

A*

Precipita-se o ARN por adiçao de 0,1 volumes de acetato de sódio 3 M a pH 5,6 e 2,5 volumes de etanol se—

guida de incubaçao a —20°C (16 horas). 0 ARN ê separado por centrifugação (10 000 rpm, 15 min, rotor JA-20) e é dissolvido em água com uma concentração de 1 yj.g/^il.

c) Construção do banco de ADNc de lambda-gtlO

A síntese do ADNc, a metilaçao dos locais EcoRE internos, a colocaçao de adaptadores EcoRI, o corte com EcoRI, M A* a separaçao do fragmento menor de ADN, a ligaçao com os braços de lambda-gtlO e o acondicionamento in vitro do ADN ligado foram levados a efeito com o sistema de síntese de ADNc de Amersham (RPN 1256) e com o sistema de clonagem de ADNc lambda-gtlO (Amersham, RPN 1257)· Os procedimentos de trabalho ihdicados pelo fornecedor foram integralmente respeitados·Par tindo de cerca de 3 jig foi obtido no fim ARNm em cerca de O,5xlO⁶ fagos lambda-gtlO recombinantes.

Exemplo 2

Isolamento de ADNc

a) Busca no banco de lambda-gtlO com oligonucleótidos

A fim de proceder a uma busca no banco de ADNc de ADNc que codificasse para proteínas ACV, sintetizaram-se dois oligonucleótidos correspondentes às sequências dos peptí deos trípticos P16/II e um oligonucleótido correspondente à sequência do peptideo Staph A P20/I/6 (Fig. 1). Estes oligonu cleótidos apresentam todos uma mistura de todas as variantes correspondentes à diferentes possibilidades de codificação dos correspondentes ARNm. 0 oligonucleótido EBI-386 apresenta, pa ra um comprimento de cadeia de 20 nucleótidos, 512 variações e corresponde ao peptideo Staph-A P20/I/6. A fim de reduzir a variaÇao nos oligonucleótidos para o peptideo tríptico P16/II, sintetizaram-se dois oligonucleótidos (de 20 bases): EBI-387: 128 variações, EBI-388: 64 variações.

Além disso sintetizaram-se dois oligonucleótidos correspondentes ao peptideo tríptico de ACV P30/I usanA» . v do como base desoxiinosina nas posiçoes «Wobble” (Fig. 2)! EBI-118 e EBI-119· Esta substituição foi descrita por E. Oh— tsuka et ai· , J· Biol· Chem. 260/5 (19^5)) PP· 2605-2608 e por Y. Takahashi et al. , Proc. Nat. Acad. Sei. (1985) pp. 1931-1935· A inosina emparalha-se bem com a citosina mas prejudica ligeiramente a formaçao da dupla hélice quando se oferecem como parceiros de emparelhamento outros nucleétidos.

Fosforilaram-se alíquotas de 60 pmol de cada 32 oligonucleótido com 60 pmol de gama- P-ATP (Amersham, PB 218, 5000 Ci/mmol) em 3θ de solução usando 20 unidzdes de polinucleotidoquinase T^· A solução continha tris 70 niM a pH 7,5, MgCl 10 mM e DTT 5 niM, a incubação durou 3θ minutos· Por adi ~ o ^— çao de EDTA 3θ «M e aquecimento durante 5 minutos a 70 C fez-se parar a reacçao. 0 oligonucleôtido marcado foi separado por cromatografia em coluna sobre Biogel PÓDG (Biorad) dos com ponentes sem radioactividade integrada· Por oligonucleÓtido integraram-se entre 70 e 110x10^ de fósforo-32.

Alíquotas de 15 pmol de EBI—118 e de EBI—119 ~ 32 foram fosforiladas em 90 ul com adiçao de 45 mmol de gama- P-ATP (Amersham, PB 218, ^5000 Ci/mmol) com 10 unidades de polinucleotidoquinase T^ e em seguida purificou-se através de Biogel P6DG. No total integraram-se 70χ10θ cpm de fésforo-32.

_{f x} Cerca de 1,2x10 pfu (plaque forming units) de fagos recombinantes de um banco de ADNc placental humano em fagos lambda-gtlO foram usados para infectar E. coli C600. Cerca de 50 000 foram depositados por placa de 13,5 cm (LB, MgSO^ 10 mM, 15 g/1 de agar Bacto). Depois de as placas serem quase confluentes, preparam-se duas tomas de cada placa em fil tros de nitrocelulose (Schleicher und Schuell, BA 85) (T. Maniatis et al·, Molecular Cloning, 1982, pp 320-321). Os filtros foram tratados durante 3x20 minutos em TE a 100° C e em seguida foram lavados dum dia para o outro a 65°C!

Solução de lavagem: Tris 5θ wM pH=8

NaCl 1 M

EDTA 1 niM SDS 0,1 %

Em seguida os filtros foram pró-hibridados durante 4 horas a 49°C!

Solução de pró-hibridaçao:

SSC 6 X

Denhardt 5 X SDS a 0,1 % Pirofosfato de Sódio 1 mM NaHgPO^ 50 mM pH»6,5 ATP 100 pM ^ig/ml de ADN de esperma de arenque desnatura do «V

A hibridaçao foi levada a efeito na mesma solução com adiçao da mesma quantidade de oligonucleótidos marcados. As tomas duplas das placas 1 a 6 foram hibridadas com EBI-386 e as das placas 7 a 12 com EBI-387 e EBI-388 durante 16 horas a 49°C. As tomas das placas 13 a 24 foram hibridadas durante 16 horas com EBI-118 e EBI-119 a 37°C. Após hibridaçao, os filtros foram enxaguados duas vezes com SSC 6xSDS 0^01 % durante 2 x 30 minutos à temperatura ambiente com SSC 6x/ SDS 0,01 % e durante 3 x 20 minutos na mesma solução a 49 C e a 37°C respectivamente. Após secagem ao ar, os filtros foram expostos a película Kodak X-Omat S a -70 C com utilização de uma película de ampliaçao.

Os fagos lambda que apresentaram hibridaçao com o oligonucleótido em ambos os filtros foram purificados até homogeneidade mediante o uso do mesmo procedimento de hibridaçao.

Da hibridaçao com EBI-386, 387 e 388 resultaram os fagos lambda-Pll/3, lambda-P6/5 e lambda—P6/6. A hibri daçao com EBI-118 e 119 deu como resultado os fagos lambda- 74 -

-Nrl5» lambda-Nr!9 e Iambda-Nr22.

b) Isolamento da inserção de ADNc , 6 Infectou-se E. coli C 600 com 2,5 * 10 pfu.

(•'plaque forming units”) de fagos e cultivou-se em cápsulas de agar de 13:5 cm (LB, SO^Mg 10 mM, agarose a 1,5 %, glucose a 0,2%) com 6 ml de agarose de camada superior (agarose a 0,7 %, MgSO^ 10 níM, LB). Após 5:5 horas de incubaÇao a 37°C as pia cas estavam confluentes. As cápsulas foram arrefecidas durante 3θ minutos a 4°C e a agarose foi coberta com uma camada de 10 ml de diluente lambda (tris 10 mM, pH=8, MgSO^ 10 niM, EDTA 0,1 mM). Os fagos foram eluidos de um dia para o outro a 4° C com agitaçao ligeira. A suspensão de fagos sobrenadante (cerca de 8 ml) foi transferida para um tubo Corex e foi centrifugada durante 10 minutos a 15 000 rpm (4°C, centrífuga JA 21). 0 sobrenadante foi decantado em tubos de policarbonato e centri

M» fugado a 50 000 rpm (20°C, centrífuga Beckman L70, 20°C, rotor Ti) até omega t « 3x10 (cerca de 23 minutos). Os fagos sedimentados foram ressuspensos em 0,5 ml de diluente lambda após eliminação do sobrenadante e foram transferidos para tubos de Eppendorf. A suspensão foi liberta de partículas nao suspensas por uma centrifugação rápida e o sobrenadante foi passado para um novo tubo. Após adiçao de 10 jug/ml de RNaseA e de 1 jug/ml de DNase I incubou-se durante 30 minutos a 37°C. Após adiçao de EDTA 25 mM, tris 25 mM a pH=8 e SDS a 0,2% incubou-se durante 30 minutos a 70°C. Em seguida adicionou-se 1 volume de fenol/clorofórmio (1:1) e extraiu-se a proteína invertendo os tubos. Depois de 2 minutos de centrifugação na cen trífuga de Eppendorf extraiu-se a fase aquosa com 1 volume de clorofórmio (apenas por inversão dos tubos, sem usar o vortexK Após a separaçao das fases por centrifugação adicionaram-se ao sobrenadante 1/20 volumes de acetato de sodio 3 M e 1 ml de etanol. Deste modo o ADN fágico precipitou sob forma de filamentos. Após 5 minutos de incubação a 0°C separou-se o ADN por centrifugação (10 minutos). 0 sólido foi lavado uma vez com etanol a 70 %, seco e dissolvido dum dia para o outro em 50

yul de TE (4°C)

Os ADNs foram cortados com EcoRI e os fragmen tos resultantes foram separados num gel de agarose a 1 %. As inserções de ADNc dos clones lambda-Pll/3, lambda—P6/5 e lambda-Pó/6 tinham dimensões de cerca de 1300 a 1400 pb. A análi se de sequência mostrou que todos os três clones eram originá rios de um mesmo ARNm. No entanto a extremidade 5’ do ARNm fal

A# ta nos ADNc’s· As inserções dos fagos lambda-NrlJ* lambda-Nrl9 e Iambda-Nr22 tinham comprimentos de cerca de 1600, 1100 e 1000 pb. A análise de sequência deixa supor um ADNc completo aproximado. Os ADNc* s dos dois grupos de fagos lambda-Pll/ 3, lambda-Pó/5 e lambda-P6/6 bem como de Iambda-Nrl5, lambda-Nrl9 e Iambda-Nr22 sao derivados de dois ARNm’s diferentes, conforme revelado por análise de sequência.

A#

As inserções de EcoRI dos tres clones lambda-Pll/3, lambda-Pó/5 e lambda-P6/6 foram isoladas e ligadas no vector Blueescribe M13⁺ cortado com EcoRI (Vector Cloning Sys tems, 3770 Tansy Street, San Diego, CA 92121, USA). Os clones resultantes foram denominados pP6/5, pP6/6 e pPll/3.

As inserções de EcoRI dos três clones lambda-Nrl5» Iambda-Nrl9 e Iambda-Nr22 foram isoladas e ligadas no vector Blueescibe M13⁺ cortado com EcoRI. Os clones resultantes foram denominados pRH201, pRH202 e pRH203·

c) Outros clones de ADNc de ACV

A fim de obter outros clones de ADNc, fez—se uma nova busca no banco de lambda-gtlO placental humano, desta vez com a inserção EcoRI de pll/3 como sonda. Este fragmen to de ADN foi marcado por um isótopo radioactivo por transia— çao de enxaixe (T. Maniatis, Molecular Cloning, 1982, pp. 109-112, sem usar DNase)^ No total fez-se a busca em 4x10^ fagos em 8 placas. 0 tratamento dos filtros de nitrocelulose foi re alizado como descrito em T. Maniatis, Molecular Cloning, 1982,

ρρ. 320-321. A solução de hibridaçao continha SSC 6x, solução 6 de Denhardt 5^X> SDS a 0,1 % e 20x10 cpm da inserção pll/3· A hibridaçao durou 16 horas a 65^oC. Os filtros foram em seguida lavados durante 3^χ1θ minutos ã temperatura ambiente com SSC 6x/SDS a 0,01 % e durante 3^X^5 minutos a 65°C com SSC 0,2. No total foram obtidos 69 clones positivos que davam reacçao (lambda-VAC1 a lambda-VAC69).

destes clones foram preparados em pequena escala conforme acima descrito, a inserção de ADNc foi libertada com EcoRI e separada num gel de agarose a 1 %· Deste modo verificou-se que a inserção do clone lambda-VÂClO continha o quadro de leitura integral que codifica para a proteína ACV. Exemplo 3

Caracterizaçao dos ADNc's que codificam para as proteínas ACV-alfa. e ACV—beta

a) Experiência de mancha de Northern

4.

A 2 jug de poli-A -ARN adicionaram-se 5 /11 de água, 16 jil de formamida, 6 p.1 de formaldeído e 3 /11 de NaOH 0,1 M, incubou-se a solução durante 10 minutos a 68 C e em se

A# ** guida arrefeceu-se em gelo. Após adiçao de 5 pl de solução de corante (0,4 % de azul de bromofenol, 0,4 % de xilenocianol em 50 % de glicerina, EDTA 1 mM) separou-se o ARN num gel de agarose de formamida (agarose a 1,5 fosfato de Na 10 mM pH= 7,6, EDTA 1 mM, acetato de Na 5 mM, formaldeído a 6 %, elecAT A# A# _A troforese 100 V, 3 horas, tampao de eluiçao de composição iden tica ao tampao do gel, sem formaldeído). Como referencia depo sitou-se ARN integral. Esta pista foi separada após a electro A* forese e corada com EtBr, a fim de determinar a localizaçao dos ARNr’s de 28 e de 18 S. 0 resto do gel foi lavado duas ve zes durante 10 minutos em SSC lOx e o ARN foi transferido para um filtro de nitrocelulose com SSC 20x. 0 filtro foi lavado com SSC 2x, foi seco e foi aquecido durante 2 horas sob vá

cuo a 80°C. Marcaram-se por isótopos radioactivos alíquotas de 1 ps de pPll/3 e de pRH203 com o sistema de marcaÇao de ADN Multiprime (Amersham, RPN 1601). 0 filtro de nitrocelulose foi pró-hibridado durante 2 horas a 65°C em SSC 6x/soluçao de Den hardt 5xSDS a 0,1 %. Cada uma das pistas foi hibridada com 180x10^ cpm de pPll/3 ou de pRH2O3 respectivamente (16 h a 65^a C). Os filtros foram lavados duas vezes durante 30 minutos à temperatura ambiente com SSC 6x/SDS a 0,01 % e duas vezes durante 30 minutos com SSC 0,2x/SDS a 0,01 %, foram secos e foram expostos sobre uma película Kodak X-0mat com uma folha de ampliaçao. Os resultados sao representados na Figura 3· 0 ADNc do clone pPll/3 hibridou com um ARNm com uma dimensão de cerca de 1700 bases (”ACV-alfa”) e o ADNc do clone pRH2O3 com um ARNm da dimensão de cerca de 2200 bases (”ACV-beta”).

Uma vez que tanto a quantidade de radioactivi dade como a quantidade de ARNm separada por pista eram aproxi madamente iguais e em segundo lugar a hibridaÇao de uma mancha genómica na mesma solução deu a mesma intensidade em ambos os ADNc’s (ver abaixo), deve-se concluir que o ARNm mais curto (”ACV-alfa”) ocorre em maior quantidade do que o ARNc mais longo (”ACV-beta”) na placenta·

b) Análise de sequsnciaçao do ADNc da proteína ACV-alfa

Os ADNc’s dos clones pP6/5, pP6/6 e pPll/3 fo ram totalmente sequenciados e os dos clones lambda-VACl a lam bda-VAC12 foram sequenciados parcialmente. 0 resultado está representado na Figura 4. No total foram sequenciadas 1465 ha ses· 0 ADNc apresenta um quadro de leitura livre longo que po de codificar para 320 ácidos aminados· Quando a sequência do ADN 6 traduzida numa sequência de ácidos aminados* todos os peptídeos sequenciados podem ser acomodados nesta sequência (Figura 5)· Por consequência o ARNm correspondente a este ADNc codifica para uma proteína ACV. Uma vez que as sequências dos dois ADNc’s isolados (ver abaixo) codificam para uma proteína semelhante mas diferente da proteína ACV, introduziu-se aqui o nome de ACV-alfa

primeiro codao ATG (bases 35-57) precede no mesmo quadro de leitura um codao de paragem. As bases 30 a 3θ obedecem razoavelmente bem à regra de Kozak, (M. Kozak, Nature 308 (1984), pp. 241-246) que indica para a sequência de con senso na proximidade do codao de início de traduçao CC(A/G)CCAUGG, sendo aqui a sequência correspondente TCGCTATGG. A reA» A# .

giao 3’ nao traduzida tem um comprimento de 471 bases. 15 des sas bases antes do início da secção poli-A encontra-se a sequência de poliadenilaçao AATAAA (N.J. Proudfoot et am., Natu re 263 (1976), pp· 211-214). Como se calcula, um comprimento de cadeia de 150 a 200 bases para a secção poli—A do ARNm, o comprimento total do ARNm deve ser de 1600 a I65O bases, devi do à sequência de ADNc. Uma vez que na experiência de mancha de Northem foi determinado um valor superior, a região 5* nao traduzida nao 6 contida em qualquer ADNc.

ADNc do clone pP6/5 apresenta, ao contrário de todos os outros clones de ADNc na posição 100, uma C em vez de uma A. Deste modo o tripleto 98-100 (220 codao) ê GAA em

A4 vez de GAC e codifica para Asp em vez Giu. Esta modificação pode ter várias causas·

a) a transcriptase inversa integrou um nucleótido errado,

b) trata-se de uma transcrição de dois alelos de dois genes diferentes neste local ou

A# A»

c) existem dois genes nao alelos que sao diferentes nesta posiçao.

quadro de leitura livre longo codifica para uma proteína com 320 ácidos aminados da qual verosimilmente a Met-1 foi eliminada e a alanina seguinte foi bloqueada no gru po amina possivelmente por acilaçao. 0 peso molecular calcula do é de 35 896 D e é mais elevado do que o valor de acordo com SDS -PAGE. Note-se que a fracçao de ácidos aminados carregados (Asp, Glu, Lys, Arg e His) com 30,6 % (98/320) é em média elevada em comparaçao com o valor médio de 25,1 %· Este facto

deverá explicar o comportamento de migraçao diferente das pro teínas na SDS-PAGE. No grupo dos ácidos aminados com forte car ga sobressaem os ácidos aminados de carácter ácido (Asp e GLU) com 54 frente aos de carácter básico (Lys e Arg) com 41· Este facto explica o ponto isoelêctrico ácido da proteína ACV-alfa (pl=4,4 a 4,8). 0 gene da proteína ACV-alfa contém apenas um tripleto que codifica para cisteína Aácido aminado na posição 315} nao existe qualquer local típico de N-glicosilaÇao (Asn-XXX-Ser/Thr). Uma análise estrutural da sequência de ácidos aminados (modificada de acordo com Pustell, J. et al., Nucleic Acids Res. 10 (1982), pp. 4705-4782) dá uma repetição quádrupla de uma sequência de 67 ácidos aminados de comprimento (Fig. 6), seguidamente denominada por repetição. No interior desta sequência mantêm-se 7 ácidos aminados (10,4 %) em todas as quatro repetições, 15 ácidos aminados (22,4 %) ocorrem em três das quatro repetições e em 28 posiçoes (41,8 %) existem em ca da duas repetições o mesmo ácido aminado.

Uma comparaçao com dados da literatura publicada (M.J. Geisow, FEBS Letters 203 (1986), pp. 99-103, M.J. Geison et al., TIBS 11 (1986), pp. 420-423) indica surpreendentemente que a proteína ACV-alfa pertence a um grupo maior de proteínas de ligaÇao de fosfolípidos dependentes de Ca⁺⁺. Foi descrita uma sequência de consenso (Lys-Gly—fob-Gly-Thr-Asp-Glu-var-var-Leu-Ile-fil-Ile-Leu-Ala-fob-Arg j fob=hidrófo bo, filsshidrofílico, var=variável) que pode participar na ligaçao de Ca⁺⁺ (M.J. Geisow et al., Nature 320 (1986), pp. 636-638). Esta sequência encontra-se em todas as quatro sub-snquências de 67 ácidos aminados de comprimento repetidos das proteínas da presente invenção (Fig. 6). Ê também surpreenden ta o facto de a secção de 6 ácidos aminados de comprimento na extremidade de cada repetição ser quase exclusivamente consti tuida por ácidos aminados hidrôfobos (000000 na Fig. 6).

c) Análise sequencial do ADNc da proteína ACV-beta

A sequência de ADNc da ACV-beta dos clones

Nrl5, Nrl9 e Nr22 contém 1940 pb e passa por uma secção poli-A (Fig. 7)· 16 bases antes da secção poli-A encontra-se o si nal de poliadenilaçao AATAAA. Esta sequencia de consenso ocor re evidentemente já nas posiçoes dos nucleétidos 1704 a 1709·

A» A ** Λ

Nao se sabe por que motivo esta sequencia nao e usada como si nal de poliadenilaçao· A sequência necessária adicionalmente na extremidade 3’ da sequência AATAAA, YGTGTTYY (Gill A. et al., Nature 312 (1984), pp. 473-474) sé ocorre relativamente afastada (TGTGTTAT, posição 1735-1742); ê possível que este facto represente a explicação para a nao aceitaçao desta seA ** quencia de poliadenilaçao.

ADNc contém um quadro de leitura livre longo que se estende desde o início do ADNc até a posição 1087·

A» Este quadro de leitura abrange um potencial de codificação pa ra 362 ácidos aminados. Por razoes de analogia com a proteína ACV-alfa e com base no facto de que também precipita uma proteína de 34 000 D na purificação da proteína ACV (ver EP-A 181 465) tomou-se como início da traduçao o primeiro codao pa M ra a metionina (ATG, posiçoes 107-109)· A regra de Kozak nao é neste caso tao bem obedecida como com a ACV-alfa (AAGAGATGG na posição 102—110).

A proteína resultante (ACV-beta) tinha 327 áci dos aminados de comprimento. Possui 4 resíduos de cisteína (ácidos aminados nas posiçoes 161, 206, 2?0 e 293) e um local potencial de N-glicosilaçao (Asn-Lys—Ser, ácidos aminados nas posiçoes 225-227)· 0 peso molecular calculado foi de 36 837 (Fig. 9)· Também na ACV-beta ocorrem em média muitos resíduos carregados: 97/327 (29,6 %), predominando os ácidos aminados de carácter ácido (Asp+Glu: 49) sobre os de carácter básico (Lys+Arg 42); o que pode ser uma explicação para o peso molecular mais baixo determinado por SDS-PAGE.

Também a proteína ACV-beta apresenta uma repe tição interna de uma sequencia de 67 ácidos aminados de comprimento (Fig. 8). No interior desta sequência estão 7 ácidos

aminados (10,4 %) que se mantém em todas as quatro repetições^ 17 ácidos aminados (25,4 %) aparecem em três das quatro repetições e 25 posiçoes (37,7 %) contêm duas repetições cada do mesmo ácido aminado· Também a proteína ACV-beta apresenta uma boa concordância com a sequência de consenso de 17 ácidos ami nados de comprimento. As observações feitas a propósito da pro teína ACV-alfa sao também válidas para a ACV-beta.

d) Análise de mancha de Southern genómica

A análise de ADN cromossomal de placenta huma na de acordo com Southern apresenta um quadro complexo. 0 ADN foi cortado com EcoRI, HindIII, BamHI e PstI. 0 ADN transferi do para um filtro de nitrocelulose foi hibridado tanto com um ADN de ACV—alfa (pPll/3) como também com um ADN de ACV-beta (pRH203)· A lavagem do filtro foi realizada sob condiçoes crí ticas (ver ponto a)), isto ê, com SSC 0,2x e a Ó5°C. Mesmo as

A* sim encontraram-se sempre em todas as digestões relativamente muitas bandas (Fig. 10). A comparaçao das duas manchas mostra *v que é de excluir uma reacçao cruzada entre o ADN de ACV-alfa e de ACV-beta nestas condiçoes. Esta grande quantidade de ban das pode ser explicada pela existência de genes semelhantes ao da ACV-alfa e ao da ACV-beta ou então trata-se dum único gene interrompido por muitos introes ou por introes muito com pridos.

Exemplo 4

Na Figura 11 apresenta-se a comparaçao da sequência de ácidos aminados de ACV-alfa e de ACV-beta. As estruturas repetidas podem ser ordenadas de modo semelhante nas duas proteínas. Os peptídeos de ligaçao sao igualmente do mes mo comprimento com excepçao dos situados entre a 2* e a 3^a re petição. Neste peptídeo de ligaçao deve ser introduzida uma lacufea na proteína ACV-alfa, a fim de possibilitar uma corres pondência óptima das duas sequências. Os peptídeos N-terminais das duas proteínas têm comprimentos diferentes, 19 ácidos ami

nados na proteína ACV-alfa e 25 ácidos aminados na proteína ACV-beta· Estes peptídeos apresentam também o grau de homologia mais reduzido de todos· As duas proteínas sao idênticas em 176 dos 320 ácidos aminados, o que corresponde a um grau de homologia de 55,0 %.

Considere-se agora também a comparaçao das se quências nucleolfticas dos ADNc’s de ACV-alfa e de ACV-beta. Quando se comparam dois genes e os respectivos produtos entre si verifica-se ao nível do ADN (=ARN) uma maior homologia do que ao nível dos ácidos aminados, o que pode ser explicado pe lo facto de nos ácidos nucleicos ser suficiente uma finica alteraçao de uma base num tripleto para codificar para um ácido aminado diferente.

Na Figura 12 apresenta-se a comparaçao das re gioes de codificaÇao do ADNc de ACV-alfa e de ACV—beta. Surpreendentemente os ADBs mostram apenas um grau de homologia de 54,2 %, portanto um pouco mais baixo do que as duas proteí nas.

Na Figura 13 representam-se os perfis de hidrofilicidade das duas proteínas. Para esse fim utilizou-se o algoritmo de Hopp e Wood (T.P. Hopp et al. 5 Proc. Natl. Acad. Sei. 7θ (1981) ρρ· 3θ24-3828). Os quatro domínios de repetição sao realçados por meio de traços que enquadram os peptideos de ligaçao nas respectivas sequências. Nota—se que o peptídeo de ligaÇao entre a segunda e a terceira repetição é es pecialmente hidrofílico. Neste peptídeo encontra-se tanto na proteína ACV-alfa como na ACV-beta uma arginina em idêntica posição. Seria portanto possível que esta arginina constituis se um ponto de ataque preferido para uma protease com especificidade tríptica· Deste modo obter-seía um fraccionamento da molécula em duas metades quase iguais. Seria de prever que uma tal •'semi-molécula” pudesse desenvolver - uma acçao biológica, por exemplo uma acçao anticoagulante. Por outro lado seria tal a* vez possível que a substituição desta arginina por uma histi- 83 -

dina, por exemplo, na proteína ACV concedesse uma maior estabilidade.

A partir da Figura 13 6 ainda fácil de reconhecer que tanto a proteína ACV-alfa como a proteína ACV-heta apresentam um domínio hidrófobo longo que deverá permitir a secreção das proteínas através de uma membrana ou a sua inser çao na mesma membrana· E portanto de considerar que se trata, tanto para a proteína ACV-alfa como para a ACV-beta, de proteínas intracelulares.

Wallner et al· (Nature 320 (1986), pp. 77-81) descrevem a estrutura da lipocortina I humana e Saris et al. (Cell 46 (1986), pp. 201-212) e Huang et al. (Cell 46 (1986), pp. 191-199) a estrutura de calcipactina I murina e humana, respectivamente, que também é designada por lipocortina II* Estas proteínas pertençam igualmente à classe das proteínas de ligaçao de fosfolípidos dependentes de Ca · As suas estru turas podem ser apresentadas de tal modo que se realce a sua analogia para com as proteínas ACV-alfa e ACV-beta (Fig. 14). As homologias entre ACV-alfa e ACV-beta sao no entanto mais pronunciadas do que entre qualquer das ACV e as lipocortinasí

ACV-alfa - ACV-beta

55,0 %

ACV-alfa - lipocortina I

41,9 %

ACV-alfa - lipocortina II

43,8 %

ACV-beta - lipocortina I

41,7 %

ACV-beta - lipocortina II

44,6 %

Ê de considerar por conseguinte que também as lipocortina», com base na sua estrutura análoga, possuam acti vidade anticoagulante e por consequência possam ser utilizadas como agentes anticoagulantes e, para além disso, que isto constitua uma propriedade geral desta classe de proteínas de ** . «f* 4* ligaçao de fosfolípidos dependentes de Ca ·

Muitos membros das proteínas de ligaçao de fos folípidos dependentes de Ca⁺⁺ ligam-se a vesículas secretórias t

Ί|.

purificadas ou a outros componentes do citoesqueleto (ver R. H. Kretsinger et al. , Nature 320 (1986), p. 573 para um resumo). Na secreção as vesículas formam-se por capsulaçao do apa relho de Golgi das células, migram para a membrana celular e fundem-se com esta* Nesse momento o conteúdo das vesículas li berta-se da célula· Por analogia com a ligaçao de excitação com a contracçao muscular foi proposto (W.W. Douglas, Br. J. Pharmac. 34 (1986), 451) que também o estímulo e a secreção estão ligados a Ca · Neste mecanismo as proteínas de ligaçao de fosfolípidos dependentes de Ca podem desempenhar um papel importante. Na região que se mantém de 17 ácidos aminados de comprimento de cada repetição a proteína ACV-alfa apresenta 5 a 6 ácidos aminados contendo grupos hidroxilo (Asp, Glu, Thr, Ser), três dos quais sempre em idêntica posição. Se bem que nenhuma destas proteínas apresente a estrutura EF-Handque se observa na calmodulina, tropopina» C, S-100 e parvalbumina (R.H. Kretsinger et al., CRC Crit. Rev. Biochem. 8 (1980), p. 119)» que é responsável nesta molécula pela ligaçao de Ca⁺⁺, a manutenção desta sub-secçao em todas as repetições conduz a conclusão de que esta região é responsável pela ligaçao de r ⁺⁺

Por meio de mutações dirigidas é possível investigar alterações na actividade proteínas ACV.

Exemplo 5

Expressão de ACV-alfa em E. coli

a) pRH284T: yector.de expressão como promotor da fosfatase alcalina

0.X neste domínio biológica das e o terminador gene para a fosfatase alcalina (PhoA) de E. coli está sujeito à uma forte regulação. Na presença de fosfa to o gene ê completamente posto fora de funcionamento e na au

A ** sencia de fosfato no meio verifica-se a expressão do gene. H.

Shuttleworth et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986), p. 8689 e C.N. Chang et al. , Gene 44 (1986), pp. 121-125 descrevem a se quência de nucleótidos deste gene.

A região do promotor do gene PhoA foi reunida a partir de vários oligonucleótidos e foi integrada em pAT153 a* cortado com EcoRI e Ciai. Antes do local de ligaçao ribossomal foi introduzido um local Xhol. 0 local original AcoRI foi destruido pela ligaçao do fragmento de ADN sintético. A seguir ao local de ligaçao ribossomal foi previsto um ATG de início de traduçao, de que o G έ o promeiro nucleótido de um local Saci (aSstl). 0 vector de expressão pode ser linearizado por corte com Saci neste local e as extremidades 3' desalinhadas podem ser transformadas em extremidades alinhadas por tratamento com fragmento de Klenow - polímerase de ADN I na presen ça de dGTP. Deste modo é possível integrar neste local qualquer gene que se pretendaj para a expressão correcta, este ge

A# A# ne deve começar com a primeira base da região de codificação.

fragmento HindIII-SalI da fracçao de pAT foi eliminado e substituído pelo terminador de transcrição de fosfatase alcalina. 0 local original Sall foi destruido. Deste modo este local foi novamente introduzido antes do termina dor juntamente com o local BamHI igualmente suprimido de pAT153· A sequência do ADN preparado sinteticamente ê representa da na Figura 15·

b) Clone de expressão pRH291 clone de ADNc pP6/5 foi cortado com BglII e PstI e isolou-se o fragmento de 980 pb de comprimento que con têm a parte principal da região de codificação e cerca de 200

A* A# pb da região 3’ nao traduzida· A extremidade 5’ ^em falta da

Μ A* região de codificação foi substituída por meio de oligonucleo tidos. Também foi introduzido um local de corte Kpnl simultaA/ neamente por meio de duas mutações (GGC GGT, Gly—7 e ACT —> ACC, Thr-8).

-t

Os oligonucleôtidos tinham o seguinte aspecto:

lEBI-678 IIEBI-677

5’ GCACAGGTTCTCAGAGGTACCGTGACTGACTTCCCTGGATTTGATGAGCGGGCT 3’

CGTGTCCAAGAGTCTCCATGGCACTGACTGAAGGGACCTAAACTACTCGCCCGA

I EBI-68O I I

GATGCAGAAACTCTTCGGAAGGCTATGAAAGGCTTGGGCACAGATGAGGAGAGC CTACGTCTTTGAGAAGCCTTCCGATACTTTCCGAACCCGTGTCTACTCCTCTCG

EBIllEBI-682 |

ATCCTGACTCTGTTGACATCCCGAAGTAATGCTCAGCGCCAGGAAATCTCTGCA 3' TAGGACTGAGACAACTGTAGGGCTTCATTACGAGTCGCGGTCCTTTAGAG 5'

679|| EBI-6811

Os oligonucleótidos EBI-680, 677, 678 e 682 foram fosforilados na extremidade 5*· Aqueceram-se aos pares EBI-678 e 680, EBI-677 e 679 bem como EBI-682 e 681 a 100°C e arrefeceram-se lentamente (100 pmol de cada em 20 /11). Os oli gonucleótidos de dupla cadeia foram reunidos e ligados. Oplas mídeo pRH284T foi libearizado com Saci, as extremidades 3’ des alinhadas foram reduzidas a extremidades alinhadas por tratamento com polimerase de ADN I / fragmento de Klenow na presen ça de dGTP e foi em seguida cortado com BamHI. Ligaram-se em 15 /11 de solução cerca de 30 ng do vector, 200 ng de ADNc e 25O nmol do oligonucleótido. Transformaram-se células competentes de E. coli HB101 com a solução de ligase. 0 clone resultante foi denominado pRH291 (Fig· 16).

Exemplo 6

Expressão de ACV-beta em E. coli \ **

a) Clone de expressão pRH212

Para vector de expressão usou-se o plasmídeo

pER103 (E. Rastl-Dworkin et al. , Gene 21 (1983)» 237-248). 0 vector foi linearizado com HindIII. A extremidade 5’ desalinhada foi parcialmente preenchida com dATP e polimerase de ADN I / fragmento de Klenow e o resíduo de cadeia simples restante foi digerido com nuclease Sl. 0 vector foi em seguida cortado com BamHI e o fragmento maior foi isolado (Fig. 17)· A partir do clone pRH2O3 foi isolado o fragmento MaelII-BamHI de 440 pb de comprimento que contém os codoes 13 a 157· A extremidade 5’ em falta foi completada com o oligonucleótidoί EBI-307

5’ CCATGGCTTGGTGGAAAGCTTGGATCGAACAGGAAGGT 3»

3' GGTACCGAACCACCTTTCGAACCTAGCTTGTCCTTCCACAGTG 5» EBI-3O6

Nestas operaçoes foram usados os codoes óptimos para E. coli (por exemplo R. Grantham et al., Nucleic Acife Res. 8 (1980), 1893-1912). Esta permuta de codoes resulta num novo local HindIII no codao 5 a 7· 0 oligonucleótido EBI-306 foi fosforilado, hibridado com EBI—307 e ligado com o fragmen to de ACV-beta. Após o corte com BamHI ligou-se o fragmento ACV 5’ terminal no vector pER103 prèviamente preparado. 0 cio ne resultante foi denominado pRH211. A fim de completar a reA# A» giao de codificação para ACV-beta, isolou-se o fragmento BamHI—Sphl de 123θ pb de comprimento a partir do clone pRH201. A secção de pBR322 de cerca de 200 pb de comprimento desde o lo cal BamHI até ao local Sphl foi eliminada do plasmideo pRH211 A# e substituída pela fracçao correspondente do ADNc de ACV. Resultou o clone pRH212. 0 fragmento EcoRI-BamHI, que contém o promotor Trp (S. marcescens), o local de ligaçao ribossomal e o início do gene de ACV-beta preparado por via sintética foram verificados por meio de sequenciaçao.

b) Expressão de ACV-beta (pRH212)

A detecçao da proteína ACV-beta codificada por um plasmideo foi levada a efeito no sistema de células Maxi

(A. Sanear et al*, J. Bacteriol. 137 (1979), PP· 692-393)· Transformou-se com pRH212 E. coli CSR6O3 (F-, thr-1, leuBó, proA2, phr-1, recAl, argE3, thi-1, uvrAó, ara-14, lacYl, galK2, xyl-5, mtl-1, gyrA98 (nalA98), rpsL31, tsx-33, Maebda-, supE44) e cultivou-se até uma a 37°C. Irradiaram-se 20 ml de cultura numa cápsula de Petri aberta com uma lâmpada germicida de UV (15 W) a 50 cm de distância durante 5 segundos e em seguida incubou—se mais 1 hora* Adicionaram—se 100 de D-cicloserina à cultura* Após 16 horas separaram-se as bactérias por centrifugação, lavaram-se duas vezes com solução salina de Hershey (5,4 g/1 de NaCl, 3,0 g/1 de KC1, 1,1 g/1 de NH^Cl, 15 mg/1 de CaCl₂x2H₂0, 0,2 g/1 de MgClgXÓ^O, 0,2 mg/1 de FeCl^xóHgO, 87 mg/1 de KH^PO^, 12,1 g/1 de tris a pH»7,4), ressuspendeu-se em 5 “1 de meio de Hershey (por 100 ml de solução salina de Hershey: 2,0 ml de glucose a 20 %, Q5 ml de treonina a 2 %, 1,0 ml de leucina a 1 %, 1,0 ml de prolina a 2 %, 1,0 ml de arginina a 2 %, 0,1 ml de tiamina-HCl a 0,1 %) e incubou-se durante 2 horas com 20 pg/ml de ácido indolacrílico. Após adiçao de 5 ^iCi/ml de ^S-metionina e nova incubação a 37°C (1 hora) as proteínas codificadas pelo plasmídeo ficaram marcadas com o isótopo radioactivo. As bactérias foram separadas por centrifugação e foram retomadas em 200 pl de tampao de amostra de SDS (sistema de gel de Lammli, p. ex.

L.G. Davies et al., Methods in Molecular Biology (1986), pp. 3O6-3IO). Os produtos marcados foram separados num gel de acri lamida a 15 %· Secou-se o gel e expos-se sobre película Kodak X-Omat S. Para referência fez-se correr no mesmo gel proteína ACV-alfa purificada e visualizou-se por coloraçao. A ACV-alfa migra um pouco mais rapidamente do que a ACV-beta codificada pelo vector pRH212, como era de esperar tendo em conta o peso molecular. A expressão de ACV-beta é, além disso, estimulável pela adiçao do indutor ácido indolacrílico (Fig. 18).

c) Clons de expressão pRH292 vector de expressão pRH284T foi linearizado com Saci e as extremidades 3’desalinhadas foram transformadas

com polimerase de ADN I / fragmento de Klenow e dGTP em extre midades alinhadas· 0 vector foi em seguida cortado com Sall e fu o fragmento maior foi isolado· A inserção HindIII-SalI do cio ne pRH212 foi isolada· Ligaram-se 0,2 pmol do par de oligonucleótidos

5’ GCTTGGTGGAA 3’ EBI-684

3· CGAACCACCTTTCGA 5’ EBI-685 com 0,2 pmol da inserção ACV-beta e com 0,015 pmol de pRH284'T prèviamente preparado. Transformou-se E. coli HB101 com a soA# luçao de ligase* 0 clone resultante foi denominado pRH292 (Fig. 18).

Exemplo 7

Detecçao da expressão de ACV-alfa e de ACV-beta em E. coli

a) Cultura dos clones HB101/pRH291 e HB101/pRH292

Meiosí 1) Pré-cultura

10	g/1	de	triptona
5	g/1	de	extracto de levedura
4	g/1	de	glucose
9	g/1	de	Na2HP04*2H20
1	g/1	de	NH^Cl
1	g/1	de	KC1
1	ml/1	de	MgSO^·7H20 1 M
100	mg/1	de	ampicilina

pH de início » 7,2

2) Cultura principal

0,68 g/1 de (NH₄)₂HPO^

0,62 g/1 de K HPO, · 3H 0

2^2

2,33	g/1	de KC1
0,5	g/1	de NaCl
0,53	g/1	de NH^Cl
1,23	g/1	de MgS04-7H20
0,011	g/1	de CaClg
10	mg	de tiamina.HCl
3 »92	mg/1	de (NH4)2Fe(S04)2.6H2
0,72	mg/1	de AlCLy6 0
0,71	mg/1	de CoCl · 6ΗΓ0
1,5	mg/1	de KCr(S0^)2· 12H2
0,75	mg/1	de CuSO^·5H20
0,19	mg/1	de H3BO3
0,51	mg/1	de MnS04«H20
0,79	mg/1	de NiSO^^óHgO
0,73	mg/1	de Na2Mo04«2H20
0,86	mg/1	de ZnS0^«7H20
21	g/1	de hidrolisado de caseína (Merck Art. n2223Ô)
25	g/1	de hidrolisado de caseína (Sigma C93&6)
100	g/1	de cisteína
2	g/1	de extracto de levedura
1	g/1	de ácido cítrico
11	g/1	de glucose·HgO (início e adições)
	Inocularam-se 700 ml do meio de pré-cultura
o clone	de expressão e incubou-se a 37 C com agitaçao (1000

rpm (=rotaçoes por minuto), agitador magnético) e com forneci mento de oxigénio (5 vvm (=vol/vol.min), arejamento através de placa porosa) durante 12 a 15 horas. Transferiram-se 600ml desta pré-cultura para um fermentador com 12 1 do meio de cul tura principal. A cultura principal foi fermentada nas seguin tes condiçoe»!

Sistema de agitaÇaoí Impulsor a 1000 rpm

Arejamento: 1,0 vvm

Temperatura! 28° C pH! 6,5 (25 % de NH^ para correcçao

Durante a fermentação mediu-se a concentração • de glucose. Quando esta concentração baixou de 5 g/1 adicio91 -

nou-se mais 10 g/1. Todas as outras adições de glucose de 10 g/1 cada uma foram realizadas sempre que a concentração de glu cose no fermentador baixou de 10 g/1. Quando a pressão parcial

A* do oxigénio baixou de cerca de 0,05 atm, elevou-se a pressão no fermentadcr de 0,3 bar. Apés 20 horas arrefeceu-se a 15°C, separou-se a biomassa do meio numa centrífuga CEPA e congelou -se a -70°C.

b) Detecçao da proteína ACV-alfa e ACV-beta recombinante

Soluçoes.*

A/ Tampao de amostra!

Tris 125 niM a pH=6,8 % de SDS % de mercaptoetanol % de glicerina

0,02 % de azul de bromofenol

Gel de acrilamida!

Gel de reuniãoí % de acrilamida

0,1 % de bisacrilamida

Tris 125 mM a pH=6,8

0,1 % de SDS

W A#

Tampao de eluiçao!

14,4 g/1 de glicina

3,025 g/1 de tris ml; de SDS a 20 %

Gel de proteína - Solução de

0,1 % de azul de Coomassie % de metanol % de ácido acético

Gel de separaÇao!

13,5 % de acrilamida

0,45 % de bisacrilamida

Tris 375 mM a pH=6,8

0,1 % de SDS coloraçao! Solução de descoloração % de metanol % de ácido acético η

Solução de glicerina:

% de ácido acético

2% de glicerina ** A

Tampao de transferencia:

Tampao de transferência 10 x·

24,2 g/1 de tris

112,6 g/1 de glicina

Λ* A

Tampao de transferencia 1 x:

A*

100 ml/1 de tampao de transferência 10 x

200 ml/1 de metanol ml/1 de empigênio

Solução	de bloqueio:	PBS:
1 % de	Tween 20	8 g/1 de NaCl
1 % de	BSA (albumina de soro de bovino)	0,2 g/1 de KC1
10 % de	soro fetal de vitela (GIBCO)	1,15 g/1 de NagPO
em PBS		0,2 g/1 de ΚΗ^ΡΟ
		0,1 g/1 de MgCL2
		0,7 g/1 de CaClg

Tampao de fosfatase alcalina:

tris 100 niM a pH=9,5

NaCl 100 mM MgClg 5 mM

No fim da fermentação determinou-se a densida de óptica do caldo e colheu-se uma amostra. As bactérias foram separadas numa centrífuga de Eppendorf, foram ressuspensas com uma concentração de ^gOOnm^^ (densidade óptica a 600 nm) em tampao de amostra e foram desnaturadas durante cinco minutos a 100°Ç. As fracçoes insolúveis foram eliminadas por centrifugação na centrífuga de Eppendorf. Depositaram-se alíquotas de 5 ul no gel de acrilamida. Para referência utilizaram-se clones de expressão que tinham sido cultivados em cultura contínua com alta concentração de fosfato alcalina nao foi

activado

As proteínas foram separadas por pesos molecu lates a 6,5 v/cm (gel de reunião) ou a 13 v/cm (gel de separa Çao), até o corante de azul de bromofenol ter atingido o fim do gel. Corou-se metade do gel com azul de Coomassie. Para es se efeito agitou-se o gel durante 30 minutos na solução de co rante e em seguida tratou-se durante uma hora na solução de

A» M descoloração· A fim de melhorar a eliminaÇao do corante em ex _ ** cesso mergulhou-se um tubo de dialise cheio com carvao activa do na solução de descoloração. 0 gel foi por fim tratado duA* rante 30 minutos na solução de glicerina e seco por meio de um secador de gel.

As proteínas da segunda metade foram transferidas para um filtro de nitrocelulose. Para esse fim expos-se uma sandwich de papel Whatman 3MM - gel - nitrocelulose (Schleicher-Schell, BA85) - papel Whatman 3 MM num aparelho de transferência Biorad em tampao de transferência 1 x durante duas horas a uma tensão de 150 V (corrente de 1000 mA) com ar refecimento# 0 filtro de nitrocelulose foi tratado de um dia > ** para o outro a temperatura ambiente em 50 ml de solução de blo queio. 0 filtro foi incubado durante três horas em 5 ml de so luçao de bloqueio / anti-soro de coelho anti-ACV diluído 1; 1000 e em seguida lavado durante 30 Minutos em água corrente e três vezes durante 15 minutos em PBS/Tween 20 a 1 % (Merck-Schuchardt n0 822184). 0 filtro foi incubado em 20 ml de solução

A# de bloqueio com uma diluição de 1:2000 do conjugado de IgG (Fc) anti-coelho fosfatase alcalina (Promega-ProtoBlor Immuno screening System) durante três horas à temperatura ambiente. 0 filtro foi lavado como anteriormente em água corrente e em PBS/Tween 20 a 1 %· A detecçao do conjugado anticorpo-fosfata se alcalina ligado foi levada a efeito por uma reacçao corada (Promega-ProtoBlot Immunoscreening System). Dissolveram-se 66 jttl de NTB (50 mg/ml de azul de nitro-tetrazólio em 70 % de di metilformamida) e 33 pl de BCIP (50 mg/ml de fosfato de 5—bro mo-4-cloro-3~indolilo) em 10 ml de tampao de fosfatase alcali

na- 0 filtro de nitrocelulose foi incubado nesta solução até desenvolvimento da cor e em seguida foi lavado durante 30 minutos em água corrente. 0 filtro foi seco e envolvido em pelí cuia de plástico.

Na Figura 19 apresenta-se o resultado. +Fosfato” é a amostra de comparaçao sem expressão, -Fosfato mostra a expressão das proteínas ACV-alfa (clone HB101/pRH291) e ACV-beta (clone HB101/pRH292) sob regulaÇao do promotor de fosfatase alcalina. Tanto a proteína ACV-alfa como a proteína ACV-beta se podem já reconhecer no gel corado. As quantidades formadas das proteínas ACV elevam-se surpreendentemente a pelo menos 20 mg/l/D0600nm de cultura bacteriana.

A análise de mancha de Western mostra nitidamente a banda de ACV—alfa corada. Adicionalmente podem reconhecer-se algumas proteínas de baixos pesos moleculares no

Μ A* domínio atê 30 kD que possivelmente sao resultantes da cisão proteolítica na extremidade N e/ou C-terminal da proteína ACV-alfa. Ê ainda surpreendente a ocorrência de uma proteína reconhecida pelo anti-soro no domínio de pesos moleculares meno res do que 20 kD que eventualmente pode representar uma semi-molécula resultante de uma proteálise da proteína ACV-alfa. Surpreendentemente a proteína ACV-beta também foi reconhecida pelo anti-soro anti-ACV. Uma vez que esta banda é corada demo do consideravelmente mais fraco do que a banda da proteína ACV-alfa mas que por outro lado a banda da proteína ACV-beta no gel corado com azul de Coomassie corresponde em intensidade à da proteína ACV-alfa, conclui-se em consequência que o reconhecimento da proteína ACV-beta pelo anti-soro anti-ACV é consideravelmente pior que o da proteína ACV-alfa»

Exemplo 8

PurificaÇao da proteína ACV-alfa recombinante

Material de partidaí E. coli HBlOl/pRH 291

As células tinham sido centrifugadas e congeladas a -70°C.

a) Homogeneização e extracçao das células

Suspenderam-se 103,5 g de massa celular conge lada em 500 ml de tampao de lise gelado (tris«HCl 100 mM, EDTA 50 mM e NaCl 200 niM a pH 7»5) ® tratou-se com um Ultra-Turrax (5 impulsos rápidos) para desfazer os aglomerados. A suspenI são foi em seguida feita passar 3 vezes através de uma prensa de Manton-Gaulin a 6000 psi. Por fim enxaguou-se a prensa com A» A»

300 ml de tampao de lise. A fim' de homogeneizar a suspensão adicionou-se uma solução a 5 % de PEI (polietilenoimina, peso molecular de 3° 000 a 40 000) que tinha sido ajustada a pH 8 com HC1 5 N, até uma concentração final de 0,5 % de PEI. Após 30 minutos de agitaÇao num banho de gelo tornou-se a solução límpida por passagem numa centrífuga Beckmann J2-21 a 9000 g durante 60 minutos a 4°C (extracto bruto).

b) Fraccionamento com sulfato de amónio

Adicionou-se sulfato de amónio sólido lentaf mente ao extracto bruto até 30 % da saturaÇao (176 g/1). Após uma noite no recipiente de cultura eliminou-se o precipitado. 0 sobrenadante límpido foi tratado com sulfato de amónio sóli do lentamente até 65 % da saturaçao (235 g/1 do sobrenadante) e agitou-se durante duas horas. 0 precipitado foi em seguida separado por centrifugação a 10 000 g durante 30 minutos a 4^o C. Dissolveu-se em 500 ml de tris-HCl 20 niM + NaCl 50 niM a pH

7,4 e dialisou-se contra o mesmo tampao dufante o tempo neces sério para eliminar todo o sulfato de amónio (determinado pela ausência de formaçao de BaSO^ apos adiçao de BaCl^ ao dialisado ).

c) Cromatografia em DEAE-SEPHAROSE FAST FLOW • 0 dialisado foi tornado límpido por centrifu- 96 * 1

gaçao e foi carregado numa coluna de 160 ml de DEAE-FF-Sepharose (Pharmacia) que tinha sido equilibrada com tris*HCl 20 niM + NaCl 5θ mM a pH 7,4. Assim que a ^^2Ô0nm ^{do elu}^^do a^tin giu o nível do tampao, fez-se passar na coluna um gradiente de NaCl de 5θ a 5θθ mM em tris»HCl 20 mM a pH 7,4 (em conjunto 10 volumes de coluna com gradiente linear).

eluido foi controlado a ^D^280nm ^{e foi anaJLi} sado por SDS-PAGE e por análise de mancha de Western mediante o uso de um anti-soro de coelho contra ACV de placenta preparado como se descreve em EP-A 0 181 465 para a ACV de bovino e de uma IgG de suíno anti-coelho acoplada a fosfatase alcali na. As fracçoes contendo ACV foram reunidas, tendo sido desprezadas algumas fracçoes no fim do pico principal. 0 conjunto das fracçoes que continham ACV foi concentrado por meio de um múdulo de ultrafiltraçao AMICON e de um ultrafiltro tipo PM 10.

d) Cromatografia em Sephacryl S-200 High Resolution¹¹

Carregou-se uma coluna Pharmacia K 26/100 (5θ0 ml) com Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) e equilibrou-se com bis-tris*HCl 20 mM + NaCl 100 mM a pH 6,3 com um caudal de 15 a 20 ml/hora· Colheram-se alíquotas de 6 a 15 ml do conjunto de fracçoes concentradas em DEAE-FF-Sepharose (total 87,4 ml) e em seguida do tampao de bis-tris»HCl (ver acima) da coluna. 0 eluido foi observado a D0__Q„ . 0 pico representando a pro ύου nm — teína ACV era o último pico de amplitude considerável do perfil de UV, como foi possível demonstrar por SDS-PAGE e por aná lise de mancha de Western. Reuniram-se as fracçoes, misturaram-se as fracçoes de todas as experiências contendo o produto (no total 7) e dislisaram-se contra bis-tris»HCl 20 niM a pH 6,3-

e) Cromatografia em Q-SEPHAROSE-FAST-FLOW

Ligou-se uma coluna de 40 ml (K 16/20) de Q97

.jíp^

-Sepharose-Fast-Flow (Pharmacia) num sistema FPLC (Pharmacia) e equilibrou-se com bis-tris»HCl 20 niM a pH 6,3· θ conjunto de fracçoes contendo a proteína ACV dialisado foi carregado na coluna e lavado com bis-tris 20 niM até a ^°280nm ^{do elu}^^do ter atingido novamente o nível do tampao. Para eluiçao utilizou-se um gradiente de NaCl em bis-tri’HCl 20 niM a pH 6,3:

NaCl 0-105 mM em 1 volume de coluna (40 ml)

NaCl 105-245 mM em 20 volumes de coluna (800 ml)

NaCl 245-350 mM em 2 volumes de coluna (80 ml)

A proteína ACV pode ser identificada no último pico importante do perfil de UV, o qual foi eluido a cerca de NaCl 0,14 Μ. A pureza foi determinada por meio de SDS-PAGE, análise de mancha de Western, HPLC inversa e focagem isoelêctrica· 0 conjunto das fracçoes contendo © produto foi conservado a -20°C.

Exemplo 9

Comparaçao entre ACVfl recombinante e natural

Métodos utilizados!

. ***

a) HPLC de permeaçao de gel

b) HPLC de fase inversa

c) Sequenciaçao N-terminal

d) Mapa de peptídeos trlpticos

e) Electroforese em gel de SDS

f) Análise de mancha de Western

g) Focagem isoeléctrica

Para a comparaçao utilizou-se de uma vez ACV natural e de outra vez ACV-alfa recombinante. Seguidamente des crevem-se as condiçoes de trabalho para cada método de análise.

a) HPLC de permeaçao em gel

- 98 Colunat

Protein Pak Waters I 125, 2 x (7>8 ^χ 300 mm), diâmetro das partículas 10 yym

Eluente: Na^SO^ θ’5 Μ, ΝβΗ^ΡΟ^ 0,02 Μ, pH 7,0,

Tween 20 a 0,04 %, propilenoglicol a 25 %

Caudal: 0,5 ml/min

Detecçao: Absorção de UV, 214nm

Os cromatogramas das proteínas ACV-alfa recom binante e natural mostram o pico principal no monómero deACV a um peso molecular de 34 000 ou de 33 000. Além destepico existe em ambos os casos uma fracçao reduzida de dímeros de ACV que sao eluídos em primeiro lugar. A aferiçao da escala de pesos moleculares estende-se por 4 proteínas padrao. A coluna separa em rigor conforme a dimensão das moléculas e nao conforme o peso molecular.

b) HPLC de fase inversa

4,6 x 250,

Coluna:

Bakerbond WP C^g,

Diâmetro das partículas 5 /um, diâmetro dos poros 3θ nm

Eluente A:

Ácido trifluoroacético a

0,1 % em água

Eluente B:

Acido trifluoroacético a

0,1 % em acetonitrilo

Gradiente:

a 68

Caudal:

% de B durante 2 min, % de B durante 10 min, 68 a 20 % de B em 24min % de B em 1 min

1,0 ml/min

Absorção de UV, 214 nm e 280 nm

Os cromatogramas das proteínas ACV recombinan te e natural mostram para as proteínas ACV um tempo de retenção de cerca de 29 min. Os picos muito pequenos que também

A* aparecem sao apenas em parte impurezas de amostra de ACV. Todos os picos marcados BW dizem respeito ao valor de base (bran co) da coluna.

c) SequenciaÇao N-terminal

Submeteu-se a SequenciaÇao um pico de proteína ACV-alfa recombinante a que tinham sido eliminados os sais por HPLC de fase inversa· A SequenciaÇao foi realizada comum sequenciador de fase gasosa da sociedade Applied Biosystems (Modelo 47OA) com o programa 40APTH. A amostra foi dissolvida em 5θ /11 d® HCOOH a 70 %· Carregaram-se no sequenciador 2 x 25 /11. Com uma quantidade de partida de 2,3 nmol foi possível sequenciar até 39 ácidos aminados. Verificou-se 100 % de concordância em relaçao à sequência esperada (a partir da proteí na natural e do ADNC)* Nao foi possível detectar a Met adicio nal N-terminal (- 1 %). A extremidade N-terminal na ACV-alfa recombinante está livre e nao bloqueada como na ACV natural.

d) Mapa de peptídeos trípticos

Comparou-se a ACV natural com a ACV-alfa recombinante. Tanto numa amostra como na outra eliminaram-se os sais por HPLC de fase inversa, secou-se e dissolveu-se em

0,1 %. Para a cisão adicionaram-se 4 % em peso de (Worthington, tratada por TPCK, dissolvida até 1 mg/

NH^HCO^ a tripsina ml em água) e apés 6 horas de incubaçao a 37°C adicionaram-se mais 4 % em peso de tripsina· Depois de nova incubaçao dum dia para o outro separou-se o peptfdeo resultante por HPLC de fase inversa. Por meio dos cromatogramas anexos (214 nm e 280 nm) verifica-se que os peptídeos das amostras eram pràticamente idênticos·

Coluna t	jiBondapak Waters 0χθ, 3,8 x 300 mm, Diâmetro das partículas 10 jmm, Diâmetro dos poros 10 nm
Eluente A:	Acido trifluoroacêtico a 0,1 % em água
Eluente B:	Acido trifluoroacêtico a 0,1 % em acetonitrilo
Gradiente:	0 a 55 % de B em 55 min, 55 % de B em 15 min, 55 a 0 % de B em 1 min

100

Caudal: 1,0 ml/min

Detecçao: Absorção de UV, 214 nm e 280 nm

e) Electroforese em gel de SDS

A electroforese em gel de SDS foi realizada de acordo com a descrição original de U.K. Laemmli (Nature 227, 680-685 (1979))· A coloração por prata foi levada a efei to de acordo com o método de Oakley (Anal· Biochem. 105, 361-363 (I98O)). 0 primeiro gel apresenta uma comparaçao entre a

ACV-alfa recombinante e a natural. 0 conteúdo em dfmero de ACV foi quantificado por meio de varredura com um densitómetro de laser e era de 2 % na ACV natural e de 4 % na ACV recombinante. 0 segundo gel mostra apenas ACV-alfa recombinante, deposi tada com e sem DTT (ditiotreitol), agente redutor)^ A partir dos resultados é visivel que o dfmero estável perante SDS está ligado por pontes de dissulfureto que podem reagir com o DTT).

AZ f*

Soluçoes padrao dos reagentes

Solução de amónia a 15 % - persulfato (APS)

Dissolveram-se 150 mg de persulfato de amónio em 1 ml de água destilada.

Acrilamida a 30 % + bis-acrilamida a 0,8 %

Acrilamida	Bis-acrilamida	Agua a
15 g	0,4 g	50 ml
30 g	0,8 g	100 ml
45 g	1,2 g	I50 ml

A acrilamida é dissolvida no volume de água correspondente e é filtrada antes da utilização.

AZ AZ

Tampao do gel de separaÇao

101

TRIS»HC1 1,5 M, SDS (sulfato de sodio e dodecilo) a 0,4 %, pH 8,8. Ajustar uma mistura de 18,16 g de TRIS + 0,4 g de SDS a pH 8,8 com HC1 concentrado e preencher a 100 ml com água destilada.

AZ Tampao de gel de Stackino

TRIS’HC1 0,5 M, SDS a 0,4 % pH 6,8 Ajustar uma mistura de 6,04 g de TRIS + 0,4 g de SDS a pH 6,8 com HC1 concentrado e preencher a 100 ml com água destilada.

a*

Tampao de desenvolvimento

T»IS 25 mM, glicina 192 mM, SDS a 0,1 %, azida de Na a 0,005 %, pH 8,5

Dissolvem-se 12 g de TRIS + 57,6 g de glicina + 4 g de SDS + 0,2 g de azida de sódio em cerca de 3,5 1 de água destilada, ajusta-se a pH 8,5 e preenche-se a 4,0 1. Ê aconselhável coma» parar a conductibilidade do tampao de desenvolvimento novo com a das cargas anteriores.

Solução de coloraçao de Azul de Coomassie a 0,05 %

Dissolveram-se 0,55 g de Azul Brilhante de Coo massie R 850 em 50θ ml de metanil, agita-se durante 3θ min e filtra-se. A esta mistura adicionam-se 100 ml de ácido acético glacial e 500 ml de água destilada.

A» AZ

Soluçao de descoloração

a) Descoloração manual

A solução de descoloraÇao 6 semelhante à solu fV AZ çao de coloraçao mas sem corante! 500 ml de metanol + 500 ml de água destilada + 100 ml de ácido acético glacial

b) Descoloração electroforética em ácido acético a 7,5 %

- 102 -

de 1 mês)

Tampao de aplicaçao de SDS 4 x (conserva-se cerca

Concentrado de corante:

Azul de bromofenol

Glicerina

Agua (dest.) atê

0,5 mg ml ml

A solução conserva-se inalterada durante cerca de mes.

Tampao de aplicaçaoí

Concentrado de corante SDS Glicerina

Agua (dest. )

0,4

0,8 ml atê

S ml

Tampao de aplicaçao de SDS 1 x

Λ* . A* A*

Diluição 1:4 do tampao de aplicaçao de SDS la da.

x com água desti

Coloraçao a prata segundo Oakley

Reagentes

Descolorante:

Etanol

Acido acético

Agua dest. até (conc. )

200

62,5

1000 ml ml ml

Solução de glutaraldeído a 10 %»

Solução de glutaraldeído a 25 % Agua destilada atê ml ml ou ou ml

100 ml

A solução deve ser conservada em frigorífico

Solução de prata amoniacal 0,1 N

Preparar imediatamente antes da utilização.

Nitrato de prata 0,1 N (16,9 g/1)	23	ml	46 ml
Amónia a 25 %	0,95	ml	4 9 ml
Hidróxido de sódio a 0,36 % (1,8 g/0,5 1)	10,5	ml	21 ml
Água dest. até	50	ml	100 ml

103 -

Solução de revelaçao:

Preparar imediatamente antes da utilização:

Acido cítrico a 0,5 % (1,25 g/125 ml)5 ml

Agua dest. 11

Formaldeído a 37 %1 ml

Solução de descoloração (Fixador fotográfico):

Fixador Kodak (de laboratório fotográfico) di luido 1:4 com água destilada· A diluição pode ser usada várias vezes mas a duraçao da descoloração ê mais demorada após frequentes utilizações.

Solução de glicerina a 2 % g de glicerina a 87 % em 1 1 de água destilada.

Procedimento para coloraÇao a prata segundo Oakley

Após terminar a electroforese marca-se o gel numa extremidade e submete-se em seguida às seguintes fases de coloraçao num agitador:

30	min	no	banho de	descoloração
30	min	na	A* solução	de glutaraldeido	a	20 % (50 ml)
30	min	em	água corrente ou dum dia	para 0 outro em
de	2 1	de	água
10	min	em	w solução	de prata amoniacal	(50 ml)
3	min	em	água corrente

Μ A» cerca de 5 min em solução de revelação

A operaçao de revelaçao nao se dá por termina da depois de uma duraçao exacta mas sim quando as bandas estão suficientemente coradas ou no máximo quando o fundo começa a apresentar coloraçao. A revelaçao e feita parar:

- 104 — mergulhando ο gel durante 30 min em água água corrente).

(numa tina ou sob

A revelaçao continua mesmo quando o gel já es tá na água. (Período de difusão).

A descoloração do gel é pois necessária se o fundo ganha uma coloraçao demasiado forte.

cerca de 5 a 10 min em fixador Kodak até se obter um conA# traste áptimo entre as bandas e o fundo. AtençãoI A descoloração também nao pêra imediatamente quando o gel ê colocado em água corrente (período de fifusao).

- 30 min em solução de glicerina a 2 %

Em seguida o gel é seco sobre papel de filtro a 80°C durante 1 hora.

f) Análise de mancha de Western

A detecçao imunolégica é realizada para a pro teína ACV com soro de coelho anti-ACV (diluido 1:1000) e com IgG de suino anti-coelho (diluido 1:500) conjugada com fosfatase alcalina. Para a detecçao da actividade enzimática da fos fatase alcalina utilizpu-se o substrato BCIP (fosfato de 5“ —bromo—4—cloro—3—indolilo) e NTP (azul de nitro—tetrazólio). A coloraçao das proteínas em comparaçao sobre a nitrocelulose é levada a efeito com negro de amida.

Análise de mancha de Western no processo semi-seco

1. Materiais!

Semy—dry Electroblotter (Sociedade Sartorius) SM 175 565 Papel de filtro na mesma dimensão do gel a analôsarj Membrana de nitrocelulose (dimensão de poro 0,45 /im) na mesma dimensão do gel}

2. Reagentes

- 10 5 -

** A Tampao de anodo 1! pH 10,4
TRIS 0,3 M	3»63 g/80	ml
Metanol a 20 %	20	ml

Tampao de anodo 2! pH 10,4
TRIS 25 mM Metanol a 20 %	0,3	g/80 20	ml ml
Tampao de cátodo: pH 9,4
TRIS 25 mM Acido E-aminocaproico Metanol	0,3 0,52	g/80 g/80 20	ml ml (PM 131,3) ml

Meio de coloraçao de proteínas por negro de amida

Negro de amida a 0,5 % (v/v) 0,5 g em 40 ml

Metanol a 5θ %50 ml

Acido acético a 10 %10 ml

Descoloração

Metanol - água - ácido acético

- 5 -1

PBS (solução salina de fosfato tamponizada) concentrada 10 x a pH 7,2

Cloreto de sódio	136	niM	80	g
Cloreto de potássio	26	mM	2	g
Hidrogenofosfato dissódico	80	mM	H>3	g
(Hidrogenofosfato dissódico.12H20	80	mM	28,7	g)
Di—hidrogenofosfato potássico	14	mM	2	g
Preencher com água destilada até			1	1

Diluir 1/10 antes da utilização.

Tampao de bloqueio!

BSA a 1 %

- 106 -

A-''

Tween 20 a 0,1 % em PBS 1 x

Tampao de crescimentoi

PBS 1 x

PBS 1 x + Tween 20 a 0,1 %

PBS 1 x

Tampao de coloraÇao para coloraÇao com fosfatase alcalina: pH 9,9

TRIS	100 mM	1,22 g
Cloreto de sódio	100 mM	0,58 g
Cloreto de magnésio* 6HgO	5 niM	0,10 g
Preencher com água destilada		até 100 ml

Solução de NBT (azul de nitro-tetrazólio) mg de NBT (Sociedade Sigma N-6876)/ml de dimetilformamida a 70 %

Solução de BCIP (fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo) mg de BCIP (Soc. Sigma B-85O3)/ml em dimetilformamidaa 100%

Meio de coloraÇao para fosfatase alcalina

Af A»

Tampao de coloraÇao

BCIP

NBT

0,033

0,065 ml ml ml

Reagente de anticorpo:

Conjugado de soro de coelho anti-ACV com fosfatase alcalina.

3· Realizaçao da análise de mancha desenvolvimento das manchas foi levado a efei to a 0,8 mA/cm de superfície do gel durante 60 min

107 -

Detecgao das proteínas sobre a membrana de nitrocelulose

4.1 Coloragao das proteínas com negro de amida

A parte da membrana de nitroceTulose prevista para a coloragao de proteínas foi cortada e mergulhada duran«V Aí te 5 minutos em solução de coloragao de negro de amida. Em se

W A» guida despejou-se a solugao de coloragao utilizada varias vezes e eliminou-se por lavagem com água o excesso de solugao

A* de coloragao da membrana de nitrocelulose.

4.2 Detecgao imunológica

4.2.1 Bloqueamento da membrana de nitrocelulose

Antes da detecgao imunológica bloqueou-se a membrana de nitrocelulose pelo menos durante 60 min (ou também dum dia para o outro) com BSA a 1 % em PBSxl com Tween 20 a 0,1 %.

4.2.2 Detecgao com anticorpos marcados por enzimas

Após o bloqueamento incubou-se a membrana de Aí nitrocelulose com soro de coelho anti-ACV (numa diluigao adequada em tampao de bloqueamento) durante 60 minutos.

Em seguida lavou-se 3 ^χ· PBS 1 ^x* PBS com 0,1% A# de Tween 20 e PBS 1 x. Em seguida realizou-se a incerbagao da membrana com IgG de suino anti-coelho conjugada com fosfatase alcalina (igualmente numa diluigao adequada em meio de bloquea mento durante 60 min). Por fim lavou-se novamente 3 ^x com PBS como acima.

4.2.3 Coloragao enzimática das manchas

Mergulhou—se a membrana de nitrocelulose em ' meio de coloragao (para um minigel sao suficientes 10 ml) e agitou-se lentamente num agitador orbital até se notar uma co

108 -

loraçao suficiente das bandas. A coloraçao foi feita terminar por eliminação do meio de coloraçao por lavagem com agua e em seguida a membrana de nitrocelulose foi seca ao ar.

5· Avaliaçao das manchas de Western

As bandas detectadas pela técnica imunológica/ enzimatica foram comparadas com as bandas da coloraçao das pro teínas e também com as correspondentes amostras de bandas da electroforese com SDS e correlacionadas entre si.

g) Focagem isoeléctrica ponto isoeléctrico (pi) para a ACV-alfa recombinante situa-se a 4,9 ou seja 0,1 unidades de pH acima do da ACV natural (4,8).

Focagem isoeléctrica em gel de poliacrilamida (PAGIF ou IEF)

Materiais e reagentes

Placas de gel de poliacrilamida para focagem isoeléctrica polimerizadas sobre películas (LKB - PAGplate”, SERVA - Servalyt Precotes”).

Soluçoes de eléctrodos para cada domínio de pH pH 3,5-9,5 (LKB-PAGplate)

Solução	do	ânodo:	ácido	fosfórico	1 M
Solução	do	cátodo:	soda cáustica	1 M
pH 5,5-8	,5	(LKB-PAGplate)
Solução	do	ânodo:	HEPES	0,4 (com	azida de Na)
Solução	do	cátodo·	NaOH	0,1 M
pH 4,0-6	,5	(LKB-PAGplate)
·*» Solução	do	ânodo:	ácido	fosfórico	0,5 M +

109

ácido glutâmico 0,1 M

Solução do cátodoi Beta-alanina 0,1 M (com azida de Na) pH 3,5-9»5 (SERVALIT-Precotes)

Solução do ânodo! acido aspartico 25 mM + ácido glutâmico 25 niM

Solução do cátodo! etilenodiamina 2 M + arginina base 25mM + li sina base 37»5nM

Transmissor de calor para arrefecimento; Kerosin (Soc. SERVA)

A#

Solução de fixaçao!

Âci do tricloroacético (TCA) a 10 % com ácido sulfossalicílico ' a 5 % í ** **

Solução de coloraÇao de azul de Coomassie a 0,05 %

Solução de descoloração! 500 ml de metanol + 500 ml de água ;

100 ml de ácido acético glacial

Amostras:

As amostras devem ter baixo conteúdo salino ou ainda melhor serem isentas de sais. Em caso de alta concentraÇao de sais as amostras devem ser dialisadas contra tampao aproximadamente 5 a 10 mM ou contta água antes da FIE. No entanto as amostras podem conter NaCl até 100 wM sem perturbar a frente de eluiçao.

í

A, '

Fixaçao do gel de FIE antes da coloraÇao das proteínas j

I (

gel foi mergulhado durante cerca de 20 min | na solução de fixador mas sem agitaçao durante este período. !

** i (Verifica-se uma fácil dissolução a partir da película supor- | i te). Em seguida lavou-se com água durante 5 min. i

ColoraÇao das proteínas do gel de FIE com azul de Coomassie

Os géis fixados foram mergulhados durante cer ca de 2 horas na solução de coloraÇao, mantendo-se durante es ta operaÇao apenas uma agitaçao muito lenta.

- 110 -

Descoloração dos géis de FIE

Depois da coloraçao eliminou-se o excesso de

A» A» _ solução de coloraçao por lavagem com agua e descolorou-se o gel por mudanças frequentes da solução de descoloração. Após descoloração suficiente o gel foi novamente lavado com água

A* AT A» até eliminação da solução de descoloração.

Secagem dos géis de FIE

Os géis secos sobre uma película transparente ou sobre uma membrana de diêlise permeável húmida com a face impermeável para cima durante 1 hora a 80°C.

Exemplo 10

Actividade biológica da ACV recombinante

A· Ensaio do tempo de protrombina modificado (ver EP-A 0181465

Agitou-se durante dois minutos a 37° C plasma isento de plaquetas (PIP) citrado na presença ou na ausência de ACV recombinante (ACV-r) ou de ACV natural· Após a incubaçao adicionou-se uma solução de factor de tecido cerebral e «φ> A*

Ca . A formaçao de fibrina foi observada e o tempo de coagulaçao foi registado. Os resultados sao apresentados na Fig.33 e atestam que a ACV-r e a ACV inibem a formaçao de fibrina de modo dependente da dose. As actividades específicas da ACV-r e da ACV situam-se na mesma ordem de grandeza.

B. Ensaio do tempo de trombina (ver EP-A 01 181 465)

Agitou-se durante dois minutos a 37°C PIP citrado na presença ou na ausência de ACV-r ou de ACV. Após a

A» Φ 4* ** incubação adicionou-se trombina e Ca .A formaçao de fibrina foi observada opticamente. Tanto a ACV-r como a ACV nao iniA, bem a formaçao de fibrina induzida pela trombina, como se cons

111

tata a partir da Figura 34· Por conseguinte tanto a ACV-r como a ACV inibem a formaÇao de trombina mas nao a acçao da trom bina.

C. FormaÇao de factor Xa em plasma activado por factoi' de tecido (ver EP—A 0 181 465)

Agitou-se durante dois minutos a 37° C PIP ci trado na presença ou na ausência de ACV-r ou de ACV. Em seguida adicionou-se ao PIP uma solução de factor de tecido ce rebral e Ca a fim de desencadear a coagulaÇao. A tempos de terminados foram colhidas amostras que foram diluidas 1000 ve zes num tampao. Adicionaram-se 10 j*l desta solução a 4θ /Λ1 de uma mistura que continha os seguintes componentes do complexo de protrombinase:

Factor Va 0,6 nM Fosfolípidos 50 jíM (80 % de dioleoil-fosfatidilcolina/20 % de dioleoil-fosfatidilserina) ·

Protrombina 1,0

Após um período de reacçao de dois minutos apreciou-se a fracçao de protrombina activada por meio da actividade amidolítica mediante o uso do substracto cromogénico S 2238. A quantidade de actividade amidolítica medida deste modo 6 directamente proporcional à quantidade de factor Xa ac tivo no PIP.

Após uma diluição de 1000 vezes na presença de ACV no PIP nao foi possível observar qualquer acçao da activaçao da protrombina.

Na Figura 35 apresenta-se uma curva típica de formaÇao do factor Xa e a acçao de ACV-r e de ACV. Através destes resultados pode ser estabelecido que a ACV-r inibe a activaÇao do factor X induzida pelo factor de tecido no plasma dum modo dependente da dose como a ACV.

112

Os resultados mostram ainda indirectamente que tanto a ACV—r como também a ACV nao inactivam o factor X dia rectamente de um modo dependente do tempo. Esta conclusão po de ser apresentada sob a forma de uma curva. Apôs ter atingido um máximo inicia-se uma redução da quantidade de factor X a activo no PIP segundo uma cinética de pseudo-ia ordem. Esta w A* redução resulta presumivelmente da inactivaçao do factor X a por meio da antitrombina III. A constante de velocidade de pseudo-l® ordem calculada a partir destes dados é de cerca de

0,25 min e nao varia na presença de ACV-r ou de ACV.

Estes dados indicam claramente que a ACV—r apresenta actividade de ACV. Se bem que a actividade específica da ACV-r neste ensaio de coagulaçao seja idêntica a da

A* ACV e se bem que a ACV—r nao inactive directamente o factor

A*

X e a trombina, levaram-se a efeito ainda investigações adiÔ cionais sobre a ligaçao de ACV-r aos fosfolípidos, a fim de demonstrar indubitavelmente que a actividade da ACV-r é uma actividade de ACV.

A*

A ligaçao da ACV-r e da ACV a uma dupla camada de fosfolípidos, formada por dioleoilfosfatidilcolina e dioleoilfosfatidilserina (80 % / 20 %) foi determinada por meão de um elipsémetro automático. Este processo foi descrito por Cuypers et al. em J. Biol. Chem. 258 (1983), 2426—2431·*

Um resultado típico deste estudo é reproduzido na Figura 36. Tanto a ACV-r como a ACV apresentam uma ciné tica de ligaçao idêntica na dupla camada quando a ACV foi adi cionada numa concentraÇao de 1 jug de ACV/ml desta dupla camada. A ligaçao tem lugar na presença de Ca e é reversível,co mo foi possível mostrar por meio de adiçao de EDTA.

Resumindo, pode estabelecer-se que a ACV-r é biologicamente activa e nao se diferencia da ACV natural.

Exemplo 11

113 -

Construção de vectores de expressão de ACV-alfa e de ACV-beta com resistência à tetraciclina (pGN25 e pGN2ó)

Cortou-se 1 jig de pAT153 em 5θ de solução com EcoRI. A actividade enzimática foi destruída por aquecimento a 70° C e as extremidades desalinhadas foram rectificadas por uma reacçao de preenchimento por meio de adiçao de po limerase I de ADN/fragmento de Klenow (PolIK) (5 unidades) e dos trifosfatos dos quatro desoxiribonucleósidos (cada um numa concentração final de 20 ^jM). Apos aquecimento a 70 C para destruição da actividade de PolIK, precipitou-se o ADN com etanol. 0 ADN linearisado foi em seguida cortado em 50 jil PvuL

Linearizaram-se em primeiro lugar os plasmídeos pRH291 e pRH292 com Sphl e eliminou-se a extremidade 3’ saliente por meio da actividade exonucleolítica em 3’ da PolIK na presença de dGTP. Após precipitação do ADN cortou-se este com Pvul. Os fragmentos das três digestões foram separados num gel de agarose e os fragmentos correspondentes foram eluídos (_PAT153: 3032 pb, pRH29i: 1987 pb, pRH292: 2607 pb). Fizeram-se reagir 50 ng do fragmento pAT153 com 50 ng do fragmento pRH291 ou pRH292 e ligou-se em 10 jil. Trataram-se 100 ^ul de

A> células competentes de E. coli HB101 com 5 /11 da solução de ligase e transformaram-se as células. Realizou-se a selecçao em agar de LB contendo 100 jig/ml de ampicilina. Dos clones re sultantes alguns foram cultivados em agar de LB com 12,5 pg/ ml de tetraciclina. Os clones que cresceram neste meio foram utilizados para a preparaçao de ADN plasmídeo. 0 ADN plasmídeo obtido numa minipreparaçao foi cortado com diferentes enA* A# zimas de restrição e deste modo foi comprovada a correcçao da construção. Em cada um dos casos escolheu-se um clone a que se deu a designaÇao de pGN25 (ACV-alfa) ou de pGN2Ó (ACV-beta).

Cultivou-se uma fermentação E. coli HBlOl/pGN25 ou HB101/pGN26, tal como descrito no Exemplo 7, utilizando -se desta vez, no entanto, 5 mg/1 de tetraciclina na pré-cultura em vez de ampicilina. Durante a fermentação principal co

114 -

lheram-se alíquotas que foram depositadas num gel de acrilami da a 15 %/SDS a 0,1 % de acordo com Lammli. Nao se manifestou qualquer diferença para as fermentações de E. coli HBlOl/pRH291 ou HB101/pRH292, respectivamente. A partir da biomassa da fermentação purificou-se a ACV-alfa ou a ACV-beta. A análise de proteínas nao revelou igualmente qualquer diferença para as proteínas recombinantes correspondentes a partir dos clones HB101/pRH291 e HB101/-RH292.

Exemplo 12

Purificação de ACV— recombinante

Material de partida: E. coli HB101/pRH292

As células tinham sido centrifugadas e congeladas a -70°C.

a) Homogeneização e extracçao das células

Suspenderam-se 100 g do bolo celular congelado em 500 ml de tampao de lise gelado (TRIS*HC1 100 mM, EDTA 50 niM e NaCl 200 mM a pH 7,5) e tratou-se com um Ultra-Turrax

A* (5 impulsos curtos) para destruição dos aglomerados. Em seguida fez-se passar a suspensão 3 vezes através de uma prensa de Manton-Gaulin a 6000 psi. Por fim enxaguou-se a prensa com 3OO ml de tampao de lise. Adicionou-se lentamente à suspensão homogeneizada uma solução a 5 % de PEI (polietilenoimina, peso molecular 3θ 000 a 40 000),cujo pH tinha sido ajustado a 8 com HC1 5 N, até uma concentração final de 0,5 % de PEI. Apés 30 minutos de agitaÇao num banho gelado tornou-se a solução límpida por centrifugação numa centrífuga Beckmann J2-21 a 9 000 g durante 60 min a 4°C (extracto bruto).

b) Cromatografia em sílica

Lavou-se sílica Catalyst Carrier, Grade 953^w (Grace GmbH, Worms, RFA) em água destilada e encheu-se com es

115 -

te material uma coluna de cromatografia de 5 cm de diâmetro e 20 cm de altura. Depois de equilibrar com tampao de lise, car regou-se o extracto bruto na coluna e lavou-se com 3 1 de tam pao de lise. Eluiu-se a ACV-/3 com um gradiente linear de cio reto de tetraetilamúnio em tampao de lise (0 a 1 M em 200 ml de tampao). Analizaram-se as fracçoes do eluído por meio de SDS-PAGE para verificar a presença de ACV-/? utilizando material de referência. As fracçoes contendo ACV-/? foram reunidas.

c) Cromatografia em DEAE-SEPHAROSE FAST FLOW

As fracçoes reunidas da coluna de sílica foram dialisadas contra TRIS* HC1 20 niM a pH 8,4 e em seguida car regadas numa coluna de 175 ml de DEAE-FF-Sepharose (26 x 330 mm, Pharmacia), que tinha sido equilibrada com TRIS*HC1 a pH 8,4. A coluna foi lavada com 500 ml de solução tampao e a pro teína ACV-/? foi eluida com um giadiente de NaCl de 0 a 500 mM em Ô75 ml de solução tampao (? volumes de coluna). 0 eluído foi controlado a 280 nm e analisado por SDS-PAGE com um material de referência. As fracçoes contendo ACV-/? foram reunidas e foram concentradas numa célula de ultrafiltraÇao AMICON e num ultrafiltro tipo PM 10.

d) Cromatografia em Sephacryl S-200 ”High Resolution”

Carregou-se uma coluna Pharmacia K 26/100 (500 ml) com Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) e equilibrou-se com bis-TRIS*HCl 20 mM + NaCl 100 mM a pH 8,4 com um caudal de 120 ml/hora· Carregaram—se alíquotas de 4 ml do conjunto das frac çoes concentradas da coluna de DEAE-FF-Sepharose na coluna an terior e o caudal foi reduzido para 60 a 80 ml/hora. 0 eluído foi vigiado a 280 nm. 0 pico representando a proteína ACV-/? era o único pico do perfil de UV. Reuniram-se as fracçoes des te pico, desprezando-se as impurezas de alto peso molecular que também eram detectáveis no perfil de UV. A proteína ACV-/? purificada foi analisada por meio de SDS-PAGE e conservada a

116 -

Quadro: Purificação	da proteína ACV-/?	recombinante massa bactérica conge-
Material	de	partida:	100 g de la da Volumes (ml)
mg de pro-r teína/mlX	mg total
EXTRACTO BRUTO CAUDAL NA C. SÍLICA		810 2270	16,1 0,35	13 040 795
CONJ. ACV-beta DA	C.	SÍLICA	380	5,0	1 900
CONJ. ACV-beta DA	C.	DEAE-FF	120	2,6	312
CONCENTRADO CONJ.	C.	DEAE-FF	4	58	232
CONJ. ACV-beta DA	C.	SEPHACRYL 33,5	2,2	74

^χ) Proteína determinada por análise de proteína BIO-RAD (Padraoí albumina de soro de bovino)

Exemplo 13

Análise e caracterizaçao da proteína ACV—beta

Para o controlo durante o processo entre cada fase de purificação utilizou-se a electroforese em gel de SDS. Esta análise é efectuada de modo idêntico ao descrito no controlo final. No Exemplo 12 apresenta-se uma série dos géis de SDS obtidos durante uma purificação (purificação de ACV-beta).

Para controlo final e para caracterizaçao da proteína purificada foram utilizados os seguintes métodos:

a) HPLC de permeaçao de gel

b) HPLC de fase inversa

c) Análise de ácidos aminados

d) Sequenciaçao N-terminal

e) Electroforese em gel de SDS

f) Focagem isoeléctrica

- 117 -

a) HPLC de permeaçao em gel

Coluna *	Protein Pak Waters I 125, 2 x (7)8 x 300 mm), diâmetro das partículas 10 ^tun, Temperatura ambiente
Eluente:	Na2SO4 0,5 M, NaH2P04 0,02 M, pH 7,0, Tween 20 a 0,04 %, propilenoglicol a 25 %
Caudal!	0,5 ml/min
Detecçao:	AbSorçao de UV, 214 nm, base 0,5

cromatograma (Fig. 40) da proteína ACV-beta recombinante apresenta o pico principal do monómero de ACV—be ta a u.m peso molecular de 29 000 e além deste pico detecta-se uma quantidade reduzida de dímero de ACV-beta (PM cerca de

000). Esta valor para o peso molecular encontra-se relativamente afastado do peso esperado (PM 37 000), o que provável

- A» mente e de atribuir ao facto de que a coluna de permeaçao em gel usada separa conforme a dimensão das moléculas e nao conforme o peso molecular.

b) HPLC de fase inversa

Coluna! Bakerbond WP C^g, 4,6 x 250 mm,

Diâmetro das partículas 5 Jim, diâmetro dos poros nm, temperatura ambiente

Eluente A:

Eluente B:

Gradiente !

Acido trifluoroacético a 0,1 % em água

Acido trifluoroacêtico a 0,1 % em acetonitrilo % de B durante 2 min, 20 a 68 % de B em 24min, % de B durante 10 min, 68 a 20% de B em 1 min

Caudal!

1,0 ml/min

Detecçao:

Absorção de UV, 214 nm, base 0,5 cromatograma (Fig. tamente a partir do eluído da última

41) foi efectuado direcfase de purificação e mos

118 -

tra príncipelmente o pico da ACV-beta oxidada (2 pontes de dis sulfureto, t_R=26,6 min). Juntamente com esta detectam-se cerca de 9 % de ACV-$ reduzida (T^= 27,4 min) bem como alguns picos mais pequenos de impurezas residuais.

cromatograma (Fig. 42) mostra a mesma amostra de ACV-beta

- ** após 2 horas de incubação em ureia 3 M e ditiotreitol 0,05 M. A proteína apresenta-se principalmente sob forma reduzida (r^a 27,4 min).

c) Análise de ácidos aminados

Eliminaram-se os sais por HPLC de fase inversa (segundo um método análogo ao de b) anterior) de uma amostra de ACV-beta purificada. 0 pico principal da ACV-beta foi reunido num tubo de hidrólise e foi seco.

A hidrólise foi levada a efeito com ácido cio rídrico 6 N (com fenol a 1 %) na fase gasosa (110°C, 22 segun dos).

** #

A determinação dos ácidos aminados foi realizada com um analisador de ácidos aminados (Tipo 63OO da Socie dade Beckman) através de uma derivatizaçao com ninidrina depois de passagem em coluna.

A análise de ácidos aminados (Fig. 43) de uma amostra de ACV-beta apresenta um desvio global em relaçao à composição teórica de 6,56 %.

. **

d) Sequenciaçao N-terminal

Eliminaram-se os sais de uma amostra de ACV-beta por HPLC de fase inversa (segundo um método análogo ao de b) anterior). 0 pico principal da proteína ACV-beta foi re unido e seco.

resíduo foi dissolvido em 75 71I de ácido tri fluoroacético e foi usado directamente para a sequenciaçao.

119 -

A sequenciaçao foi realizada com um sequencia dor de fase gasosa da sociedade Applied Biosystems (Modelo 470 A9) com o programa 39apth.

Com uma quantidade de partida de cerca de 1 nmol foi possível sequenciar até 39 ácidos aminados. Verificou-se 100 % de concordância em relaÇao a sequencia esperada. A metionina N-terminal foi aparentemente eliminada a 100 % (Fig. 44).

e) Electroforese em gel de SDS

A electroforese em gel de SDS foi realizada de acordo com a descrição original de U.K. Lammli. Para o contro lo durante o processo trataram-se com ditiotreitol e aqueceram-se as amostras de ACV-beta antes de as submeter ao proces so de separaçao. 0 controlo final foi realizado tanto sob con dições redutoras como sob condiçoes nao redutoras.

A#

A coloraçao dos geis foi levada a efeito com azul de Coomassie

A Figura 45 apresenta um gel de SDS de amostras de ACV-beta· Pistas 1 e 10! Marcadores de peso molecular

Pistas 2 e 3^: Amostra durante o processo de ACV-beta com e sem DTT (ditiotreitol)

Pistas	4	e	6:	10	/ig	de	ACV-beta	nao	reduzida
Pistas	5	e	7!	10	MS	de	ACV-beta	reduzida com DTT
Pistas	8	e	9:	1	Jig	de	ACV-beta	nao	reduzida

A ACV-beta sem redutor ê visível como uma ban da dupla. A banda inferior mais intensa a um PM de cerca de 36 000 é a forma oxidada e a banda superior a um PM de cerca de 38 000 ê a forma reduzida da proteína ACV-beta. A distribuição quantitativa das duas formas é mais visível nas pistas 8 e 9.

Após adiçao de DTT como redutor já só se obser va a banda superior (ver pistas 3, 5 e 7)· Uma vez que as pistas 4 e 7 estão mais carregadas tornam-se visíveis além das

120

bandas da proteína ACV-beta também algumas bandas de impurezas residuais.

f) Focagem isoeléctrica

A#

A coloraçao foi realizada com azul de Coomassie.

A focagem isoeléctrica (Fig. 56; 3·3·1988/51) de ACV-/3 consideravelmente purificada mostra que a ACV-/5 directa da última fase de purificação (pistas 2 e 3) dá duas bandas principais a pH 5,35 e 5,45· 0 ponto isoelêctrico (pi) da ACV-/3 é portanto nitidamente mais básico do que o da AC¥-./ (pl=4,9), o que corresponde à circunstância esperada de que a ACV-/$ contém menos ácidos aminados de carácter ácido.

Apús a redução com ditiotreitol (pistas 4 e 5) a banda princi pal a pH 5,^5 é fortemente enriquecida. Esta banda representa aparentemente a forma reduzida da ACV-/5»

Exemplo 14

Actividades biológicas de ACV—A, e ACV-/3

1. Efeito de ACV-%. e ACV-/3 sobre a actividade de protrombinase

Reconstituiu-se o complexo de protrombinase a partir de factores de coagulaçao de bovino purificados e de fosfolípidos. Ê constituído por factor Xa 0,3 M, factor Va 0,6 nM, protrombina 1 juM, vesículas de fosfolípidos 2 pM (25% de dioleoil-fosfatidilserina e 75 Me dioleoil-fosfatidilcolina) e CaCl^ 3 mM.

A activaçao da protrombina foi medida do seguinte modo: incubaram-se durante dois minutos a 37°C factor Xa, factor Va, fosfolípidos, Ca⁺⁺ e quantidades variáveis de A# _ A*

ACV. A activaçao da protrombina teve início com esta adiçao.

* A períodos diferentes colheram-se amostras da mistura no se. guinte tampao:

121 -

TRIS*HC1 50 ηϊΜ, NaCl 175 mM, 0,5 mg/ml de BSA, EDTA 20 níM e S2238 0,23 niM. A actividade amidolítica foi observada continuamente a 405 nm. A quantidade de protrombina activada foi por fim determinada a partir de uma curva padrao que tinha si do estabelecida com quantidades conhecidas de trombina. A Figura 47 reproduz os resultados.

2. Actividades de inibição de fosfolipase da ACV

Marcou-se E. coli por via metabólica com ácido ^H-oxálico e tratou-se como descrito (Davidson, F. F. et al. (1987) J. Biol. Chem. 262, 1690-1705)· 0 preparado de membrana de E. coli continha fosfolípidos I98 /uM com uma actividade específica de 1,2 x 10 cpm/nmol de fosfolípidos. Este preparado de membrana serviu como substrato de fosfolipase na análise que foi levada a efeito como se segue! Incubaram-se atem peratura ambiente 103 /11 de TRIS^HCl 0,1 M a pH 8,0, diferentes quantidades de ACV contendo Ca⁺⁺ e 10 /11 de membranas de

E. coli. No tempo 0 adicionaram-se 10 de TRIS«HC1 0,1 M de pH 8,0 e 2 ng de pâncreas de bovino contendo fosfolipase A^. Após 2 minutos fez—se parar a reacçao por adiçao de 5θ /11 de HC1 2 N e 50 /11 de TRIS-HC1 0,1 M de pH 8,0 contendo 100 ng/ ml de BSA. Centrifugou—se a mistura a 14 000 rpm durante cinβ co minutos. Determinou-se a quantidade de ácido ^H-oxálico por contagem de cintilações do sobrenadante. Calculou-se a percen tagem de actividade de fosfolipase Ag pela seguinte fórmula!

100%-/~(cpm , -cpm, )/(cpm . -cpm, ) 7* 100%

- ^r pla+acv branco pia branco Nesta fórmula cpm , , cpm , e cpm, pla+acv pia branco significam as cpm que foram medidas nos sobrenadantes das mis turas contendo quer fosfolipase Ag e ACV, quer fosfolipase Ag, quer ainda ACV, respectivamente. Os resultados sao apresentados nas Figuras 48, 49, 5θ e 51.

Exemplo 15 • Preparaçao de anticorpos monoclonais contra ACV—Λ

122

1. Acoplamento de ÁCV-fi a hemocianina de Megathura crenulata (keyhole limpet hemocuanin, KLH)

A ACV-Λ. foi acoplada por uma ligaÇao covalente a hemocianina de Megathura crenulata (KLHj SIGMA Chemical Company, St Louis, EUA, N2 de catálogo H-2133)·

1.1 Preparado ACV-/K/KLH:

Dissolveram-se 0,51 mg de ACV-^( em 1,5 ml de solução de cloreto de sódio tamponizado por fosfato a pH 7,2 (seguidamente designada abreviadamente por ‘'PGS) e misturaram-se com 0,12 ml de uma solução de KLH (8 mg/ml em PGS)>

M

Adicionaram-se 0,017 ml de uma solução de glutaraldeido a 25 % e incubou-se a mistura durante 45 minutos à temperatura ambiente. Em seguida dialisou-se de um dia para o ou tro contra 1 1 de PGS. Conservaram-se porçoes desta solução a -20°C.

1.2 Preparado ACV—IK/KLH:

Dissolveram-se 2,54 mg de ACV-/ em 2 ml de tampao de fosfato de potássio 0,1 M de pH 7,0 e misturou-se com 0,3 ml de solução de KLH (ver 1.1). Adicionaram-se 0,023 ml de uma solução de glutaraldeido a 25 % e incubou-se a mistura durante 45 minutos à temperatura ambiente. Em seguida dialisou-se de um dia para o outro contra 1 1 de PGS (ver . ****** o

1.1). Conservaram-se porçoes desta solução a -20 C.

2. Imunização

Imunizou-se um rato Balb/c de 10 semanas de idade do sexo feminino do modo que se segue:

Imunizaçao	Dia	Preparado de ACV-oí/KLH	Adjuvante
1	1	1 (0,15 ml)	completo
2	24	1 (0,15 ml)	incompleto
3	49	1 (0,15 ml)	incompleto

- 123 -

A. Imunização	Dia	Preparado de ACV- /KLH	Adjuvante
4	188	2 (0,1 ml)	incompleto
5	225	2 (0,1 ml)	incompleto
6	258	2 (0,1 ml)	incompleto
7	265	2 (0,1 ml)	incompleto
8	271	2 (0,1 ml)	incompleto
9	272	2 (0,1 ml)	incompleto
10	273	2 (0,1 ml)	nenhum

Todas as imunizações, excluindo a última, foA# ram efectuadas por meio de injecçao intraperitoneal de uma A* A, emulsão de igual volume de solução de antigene e de adjuvante de Freund.

3· Fusão de células e selecçao de hibridomas

Colheram-se células peritoneais a partir de ra Λ» Λ tos Balb/c por arrastamento com uma solução estéril de sacaro se (110 g/1 em água desionizada), separaram-se por centrifuga çao e suspenderam-se em meio do Roswell Park Memorial Institu te 1640 com penicilina G sédica (100 unidades/ml) e estreptomicina (50 unidades/ml) (seguidamente designado por ”meio de cultura’’) com 10 % de soro fetal de vitela numa densidade ce4 lular com cerca de 3>5 x 10 células/ml. Pipetaram-se aliquotas de 0,1 ml para os alvéolos de placas de cultura de tecidos (96 alvéolos por placa)} as placas foram incubadas de um dia para o outro.

Um dia antes da última imunização anestesiou-se o rato com éter e sacrificou-se. Retirou-se o baço assepticamente e obtiveram-se as células de baço por raspagem cui dadosa com uma grade de aço. As células foram suspensas em 10 ml de meio de cultura e separadas por centrifugação.

Cultivaram-se células de mieloma P3x63Ag8,653 de rato (Kerney et al·, J. Immunol. 123, 1548. 1979) em cuitu

124 -

ra suspensa estacionária num meio de cultura com 10 % de soro fetal de vitela· Recolheram-se por meio de centrifugação cerca de 10° células· As células de mieloma foram adicionadas as células de baçoj a população mista de células foi novamente recolhida por centrifugação e suspensa em 3 ml de uma solução estéril de polietilenoglicol 4000 a 40 % (Merck, Darmstadt, RFA, Número de catálogo 9727) ^em meio de cultura. A suspensão foi agitada cuidadosamente durante 1,5 minutos à temperatura ambiente e em seguida foi deixada em repouso durante 1 minuto. Adicionaram-se gota a gota 3 ml de meio de cultura no decurso

M 99 de 1,5 minutos mantendo a agitaÇao e a suspensão foi em segui da deixada em repouso durante um minuto. Em seguida adicionaram-se gota a gota 6 ml de meio de cultura no decurso de 1,5 minutos mantendo a agitaçao e a suspensão foi em seguida deiA» A» xada em repouso durante 1 minuto. A suspensão foi então dilui da com 12 ml de meio de cultura com 10 % de soro fetal de vitela adicionados gota a gota durante dois minutos com agitaçao e em seguida foi deixada em repouso durante 15 minutos à temperatura ambiente. Recolheram-se as células por centrífuga çao e suspenderam-se estas em 150 ml de meio de cultura com 20 % de soro fetal de vitela, timidina (1,6 x 10 M), hipo—4 —7 xantina (10 M) e aminopterina (4 x 10 ') (seguidamente desi gnado por meio HAT”). Pipetaram-se alíquotas de 0,1 ml desta suspensão nos alvéolos de uma placa de cultura de células nos quais se tinham no dia anterior depositado células peritoneais (ver acima): as placas foram incubadas durante três dias. Adi cionaram-se 0,075 ml de meio HAT e em seguida incubaram-se as culturas durante mais 8 dias. Todas as incubações de culturas celulares foram levadas a efeito a 37°C numa atmosfera de ar saturado com vapor de água e com 5 % de CO^·

A#

3· Selecçao de hibridomas que produzem os anticorpos contra ACV

A selecçao foi levada a efeito por meio de um ensaio imunolôgico com enzimas. Revestiram-se com ACV-Λ os al

- ** veolos de uma placa de microtitulaçao adequada para ensaios

125 -

imunológicos com enzimas (0,005 mg/ml em tampao de carbonato de sódio 0,1 M de pH 9,6; de um dia para o outro de 2 a 8°C ou uma hora a 37°C). Eliminou-se a solução e lavaram-se as pia cas uma vez com água desionizada. Bloquearam-se os locais livres de ligaçao de proteínas com uma solução de albumina de soro de bovino (5 yu/ml em solução salina isotónica tamponizada com fosfato de pH 7,2 /PGS7) durante uma hora à temperatura ambiente e em seguida lavou-se uma vez com água· Adicionou -se a cada alvéolo 0,1 ml de sobrenadante de hibridomas e incubou-se durante 2 a 3 horas à temperatura ambiente. Em segui da eliminou-se o sobrenadante e lavaram-se tres vezes os alvéolos com água.

Adicionaram-se 0,05 ml de uma solução de anticorpos de coelho contra imunoglobulina de rato conjugados com peroxidase de rábano bastardo (Dakopatts, Copenhaga, Dina marca, número de catálogo P161; 1:2000) em PGS com 5 mg/ml de albumina de soro de bovino, incubou-se durante três horas à temperatura ambiente e em seguida lavou-se três vezes com água Adicionaram-se 0,1 ml de uma mistura de iguais volumes de soluções de orto-fenilenodiamina (8,65 mg/ml em citrato de potássio 0,1 M a pH 5)#perborato de sódio (3,75 mg/ml em citrato de potássio a pH 5) e água. ApÓs 30 minutos de incubação à temperatura ambiente adicionaram-se 0,1 ml de HgSO^ 4 N. A densidade Óptica da solução foi determinada num fotómetro de vários canais para placas de microtitulaçao a 492 nm. Utilizou—se para amostra de comparaçao negativa meio de cultura ce lular com soro fetal de vitela a 20 % e para amostra de compa raçao positiva soro de rato imunizado (diluido em PGS com 5 mg/ml de albumina de soro de bovino). Todos os sobrenadantes das culturas de hibridomas foram ensaiados em dois testes independentes 11 e 13 dias depois da fusão das células. As culturas que deram um sinal positivo em ambos os ensaios foram verificadas em ensaios de selecçao adicionais nos quais se utilizaram placas de ensaio nao revestidas e revestidas com ACV-φΙ. Duas das culturas deram novamente resultados positivos

AZ A* com placas revestidas mas nao com placas nao revestidas. Os

126 -

resultados sao apresentados no Quadro seguinte:

Amostra		Densidade óptica	a 492 nm
	Experiência	1	Experiência 2
	revestido		revestido
	a» nao	revestido		AZ nao revestido
Soro de rato 1:100	0,291	0,152	1,735	0,475
Hibridoma VAA-8	1,061	0,102	1,169	0,108
Hibridoma VAA—9	0,552	0,187	0,387	0,109
AZ Comparaçao negativa	0,032	0,031	0,071	0,055

Exemplo 16

Preparaçao dos vectores de expressão pRH281/n e pPH281/nT (n=5, 6, 7, 8 e 9) vector de expressão pRHlOO descrito na EP-A

NQ 186 098 tem vários inconvenientes:

a) distancias constantes e diferentes da distancia óptima entre o local de ligaÇao ribossomal (LLR) e o início de tradução ATG

b) entre o LLR e o codao ATG existem alguns C’» e G’s

c) a região -35 do promotor trp da Serratia marcescens nao é óptimo em comparaçao com a sequência de E. coli (TTGACT em vez de TTGACA)

d) o local EcoRI antes do promotor ê supérfluo.

Sintetizou-se uma fracçao oligonucleotídica com a seguinte sequência:

- 127 -

:Trp-l-> ::Trp-3->

AATTGACGCTGATGGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACATTGCC

CTGCGACTACCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGTAACGG <-Trp-2:ί :—>Transkriptionsstart :: Trp-5-3*·

TTCGCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCTCGAGACGGTAAGG

AAGCGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGAGCTCTGCCATTCC <-Trp-4:: ---RBS

SstI Ciai

------EcoRI ---AGGTTTAATATGAGCTCGAATTCAT TCCAAATTATACTCGAGCTTAAGTAGC ---- --- <-Trp-6: RBS Translationsstart-ATG : n»5 ^!

Fosforilaram-se alíquotas de 100 pmol dos oli gonucleútidos Trp-2, Trp-3> Trp-4 e Trp-5 em 10 μΐ. Depois da reacçao reuniram-se quantidades equimolares (de 100 pmol cada) de Trp-1 e Trp—2, Trp-3 e Trp-4 bem como de Trp—5 e Trp-6, aqueceram-se a 100°C e hibridaram-se por arrefecimento lento. Os pares de oligonucleútidos foram reunidos e ligados em 55 μ!· Cortou-se duplamente o plasmídeo pAT153 com EcoRI e Ciai e iso lou-se o fragmento de vector maior. Ligaram-se 50 ng do fragmento do vector pAT153 com 20 pmol do ADN do promotor sintético em 20 jil. Transformaram-se células competentes de E. coli HB101 com o plasmídeo resultante. Cultivaram-se algumas das colónias resultantes, isolou-se o ADN plasmídeo e verificou-se o domínio do ADN introduzido por meio de sequenciaÇao. Se leccionou-se um plasmídeo que se designou por pRH2Ôl/5, simbo lizando o número 5 os nucleôtidos entre o LLR e o codao de iní cio de traduçao ATG.

A partir deste vector de expressão substituiu—

128 -

-se a inserção Xhol-Sstl por meio dos seguintes pares de oligonucleótidos conforme descrito acima!

a) TCGAGACGGTAAGGAGGTTTAAATATGAGCT Trp-9

CTGCCATTCCTCCAAATTTATAC Trp-10

b) TCGAGACGGTAAGGAGGTTTAAATAATGAGCT Trp-11

CTGCCATTCCTCCAAATTTATTAC Trp-12

c) TCGAGACGGTAAGGAGGTTTAAAATAATGAGCT Trp-13

CTGCCATTCCTCCAAATTTTATTAC Trp-14

d) TCGAGACGGTAAGGAGGTTTAAAAATAATGAGCT Trp-15

CTGCCATTCCTCCAAATTTTTATTAC Trp-16

Os vectores de expressão resultantes foram de signados por pRH281/6, pRH281/7, pRH281/8 e pRH281/9.

Estes novos vectores de expressão apresentam as seguintes propriedades:

a) o local EcoRI original do vector pAT153 foi destruído.

b) a região -35 do promotor de Serratia marcescens está ajustada à do promotor trp de E. coli.

. A»

c) antes do local de ligaçao robossomal artificial encontra-se um local Xhol singular, o qual possibilita a introdução de ou tro LLR.

A* · ** -

d) 0 G do codao de inicio de traduçao ATG e a primeira base de um local SstI (=Sacl). Por corte com SstI seguido de decom posição da Saliência 3’ resulta uma extremidade alinhada na qual pode ligado um ADN qualquer ou um gene» Se este ADN come ça com a primeira base do domínio a traduzir, dá-se uma trans criçao e uma traduçao correctas em E. coli.

e) na direcçao 3’ deste local SstI encontram-se locais EcoRI, Ciai e HindiII singulares que podem ser usados para uma clona gem dirigida de um ADN a expressar· Além disso, 6 possível utilizar também os locais de corte singulares no gene de resistência à tetraciclina para esse objectivo.

f) As variações /5 a /9 possibilitam a determinação da distan

129 -

cia óptima entre o LLR e o codao ATG para o respectivo gene.

Na maioria dos casos torna-se necessário para uma expressão óptima e para a estabilidade do plasmídeo colocar antes do gene a expressar um terminador de transcrição (R. Gentz et al· , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78 (1981), 4936— -494o). 0 fragmento HindIII-SalI do plasmídeo pRH281/5 foi retirado por dupla digestão. A fraeçao em falta foi substitui da por um terminador de transcrição phoA (H.Shuttleworth et al. , Nucl. Acids Res. 14 (1936), 8689); C.N. Chang et al. , Ge ne 44 (1986), 121-125) contendo o par oligonucleotídico:

:eBX-456-> AGCTTGGATCCGTCGACCGCGCCCGGCAGTGAATTTTCGCTGCCGGGTGG ACCTAGGCAGCTGGCGCGGGCCGTCACTTAAAAGCGACGGCCCACC

-----BamHI -----HindIII Sall »

_TTTTTTTGCTGC

AAAAAAACGACGAGCT <-EBI-459:

Ligaram—se 10 pmol do par oligonucleótfdico hibridado com 100 ng da fraeçao do vector pRH281/5 cortado duplamente com HindIII-AslI em 20 jj.1. Após transformaÇao de E. coli HB101, isolamento do ADN plasmídico de algumas colónias e verificação da sequencia destas, seleccionou-se um plasmídeo que se designou por pRH281/5T.

De modo análogo ao acima descrito prepararam-se a partir deste plasmídeo a série pRH281/6T, pRH281/7T, pRH281/8T e pRH281/9T utilizando os oligonucleótidos Trp-9 a Trp-16.

Exemplo 171

Mutantes da ACV-alfa

I30 -

As mutações seguintes foram efectuadas no ADN da ACV-alfa (a numeraçao dos ácidos aminados e a numeraÇao das bases referem-se à Figura 4):

a) Encurtamento da molécula de ACV: a ACV-alfa apresenta uma sequência de 67/68 ácidos aminados de comprimento repetida quatro vezes com uma extensão N-terminal singular (Figura 6). Fonm preparadas três formas encurtadas:

AZ _ AZ

i) Supressão dos ácidos aminados 2 a 18: eliminaÇao da exten sao N-terminal singular, a Met-1 situa-se antes da Ala-19·

A* A» AZ ii) Supressão da terceira e da quarta repetições: o codao Arg-161 foi mutado para um codao de paragem.

iii) Supressão da extensão N-terminal singular, bem como da primeira e da segunda repetições, a Met situa-se antes da Ala-165.

b) Um possível ponto de ataque na decomposição proteolítica da ACV-alfa é eventualmente constituído pela Arg-161. Este áci do aminado foi por conseguinte mutado:

i) Arg-161 para Glu-161.

ii) Arg-161 para Gln-161.

. AZ

c) Por integração de um local dé corte do factor Xa entre a segunda e terceira repetição ê possível eventualmente ligar na ACV um factor Xa proveniente da cascata de coagulaçao da inibição e/ou até mesmo decompor este em duas metades funcionais, elevando deste modo a actividade da ACV-alfa. Deste modo provocou-se a seguinte mutaÇao! Asp-168 para Glu-168, Glu-169 pa ra Gly-179 e Ala-170 para Arg-170· Deste, o factor Xa fica com uma sequência de reconhecimento Ile-Glu-Gly-Arg.

d) A fim de comprovar a importância da cisteína-316 para a actividade biológica e simultaneamente verificar a sua parti-

AZ AZ cipaçao na formaçao de dímeros, mutou-se

i) Cys-316 para Ser-316 e ii) Cys-316 para Val-316·

e) A fim de estudar a influencia da extensão N-terminal, sub ^stituiu-se esta extensão (Ala-2 a Ala-19) pelas extremidades

131

N-terminais respectivas de lipocortina I, de calpactina I e de ACV—beta·

Como primeira fase preparou-se o vector de ex pressão pRH291 do vector de expressão pGNIO. Este vector de expressão apresenta o LLR cll do fago lambda em vez do LLR STII usado no vector pRH291· 0 vector pRH291 foi cortado duplamente com Xhol e com Kpnl. Hibridaram-se 40 pmol do par oli gonucleotidico EBI-725/EBI-727 com a seguinte sequência:

EBI-725 TCGAGTTATCTAAGGAAATACTTACATATGGCACAGGTTCTCAGAGGTAC EBI-727 CAATAGATTCCTTTATGAATGTATACCGTGTCCAAGAGTCTC

Xhol RBS ATG Kpnl em 6 μΐ e em seguida ligou-se com cerca de 200 ng do fragmento maior do vector pRH291 em 20 }1L de solução· Transformaram-se células competentes de E. coli HB101. A partir das colónias obtidas resistentes à ampicilina isolaram-se os plasmídeos de alguns clones e verificou-se a sequência da nova frac çao de ADN. Seleccionou-se um clone que foi denominado pGNIO.

Como anteriormente para a reacçao de mutagéne se, isolou-se o fragmento Pvul do vector pGNIO. A enzima Pvul «W A* cortou na fracçao do promotor phoA e a enzima Sphl na região nao traduzida do ADNc da ACV-alfa* 0 fragmento que continha o ADNc da ACV-alfa foi purificado e clonado na forma de dupla cadeia do vector M13mpl8 cortado duplamente por Smal/Sphl.Das placas obtidas apôs transformaçao de E. coli JM101 seleccionou—se uma e preparou-se em maior escala o ADN de cadeia simples de M13/ACV-alfa.

As reacçoes de mutaçao foram levadas a efeito por meio do sistema Oligonucletide-directed in vitro mutagenesis system” (Amersham, código RPN.2322) seguindo exactamente o protocolo anexo.

Após a verificação da sequência dos mutantes obtidos isolou-se a forma de dupla cadeia correspondente do ADN

132 -

fágico recombinante M13mp8/ACV-aIfa sob a forma de uma minipreparaçao plasmídica· Com excepçao da mutaçao com EBI-977 (local Ciai dos Nt. 105-110), cortaram-se estes ADNs duplamen te com Xhol e Sphl e isolou-se o fragmento que contêm o ADNc da ACV. Ligaram-se cerca de 50 ⁿS deste fragmento com 50 ⁿS da fracçao de vector pRH281/5 cortada duplamente com Xhol-Sphl e transformaram-se com o plasmídeo resultante células de E.coli HB101 competentes. Os plasmídeos de algumas das colónias resultantes foram isoladas e a exactidao da sua construção foi «V Af comprovada por digestão com enzimas de restrição. As colónias seleccionadas foram cultivadas num fermentador de laboratório e as proteínas da bactéria foram submetidas a uma anêlise por mancha de Western mediante o uso de anti-soro de coelho anti-ACV.

A*

Quadro seguinte apresenta uma visão de con-

junto dos mutantes preparados:
Oligo de	A# Vector de expressão	Propriedades dos novos
mutaçao	resultante	clones
EBI-1051	pGN42	Supressão desde Ala-2 até Arg-18
EBI-964	pGN29	Paragem de traduçao em 161(supressão desde Arg-161 até Asp-320)
EBI-IIO5	PGN43	A» Supressão desde Ala-2 até Asp-164
EBI-II03	pGN44	Arg—161 para Gin-161
EBI-11O4	pGN45	Arg—161 para Glu—161
EBI-96O	pGN30	Local de corte do factor Xa desde 167 até 170
EBI-96I	pGN41	Cys-316 para Ser-316
EBI-959	pGN46	Cys-316 para Val-316
EBI-977	pGN31	Local Ciai nos Nt. 105 a 110

133 -

As sequências dos oligos de mutaçao sao (5'—X)’):

EBI-1051: CCGAAGAGTTTCTGCATCAGCCATATGTAAGTATTTCCTTAG

EBI-964 : AATTCCAGCATCAGGGTCTTAGTTAGCCTGAAGGAGAAC

EBI-1105: AGCTTCATCAATTCCAGCCATATGTAAGTATTTCC

EBI-IIO3: AATTCCAGCATCAGGGTCCTGGTTAGCCTGAAGGAGAAC

EBI-1104: AATTCCAGCATCAGGGTCTTCGTTAGCCTGAAGGAGAAC

EBI-960 : GCCTGAGCATCTTGTTCAACTTGACGACCTTCAATTCCAGCA

TCAGGGTCTCTG

EBI-961: CGTTAGTCATCTTCTCCTGAGAGCAGCAGAAGAGC

EBI- 959·· CGTTAGTCATCTTCTCCCA CG AGC AGC AGA AGAGC

EBI-977: CAACAGAGTCAGGATCGATTCCTCATCTGTGCCC

As sequências dadas sao complementares da sequência de ADN da Figura 4, o que 6 devido à clonagem do ADNc da ACV-alfa em M13mpl8.

ADN mutado com o local Ciai nos Nt. 105 a

110 foi libertado da forma de dupla cadeia do M13mpl8 recombi nante por meio de dupla digestão com EcoRI-HinlII, isolado e clonado em Bluescribe M13+ (Stratagene, La Jolla, Califórnia, EUA) cortado duplamente com EcoRI—HindIII. 0 plasmídeo resultante foi denominado pGN31. 0 plasmídeo pGN31 foi cortado duplamente com Clal e Xhol e o fragmento maior foi isolado. Por meio de introdução de diferentes pares de oligonucleótidos fo ram incorporadas as extremidades N-terminais especificas para a lipocortina I (K.-S. Huang et al., Cell 46 (1986), 191-199), para a calpactina I (^lipocortina II, K.-S. Huang et al.,Cell 46 (1986), 191-199) e para a ACV-beta.

a) Extremidade N-terminal especifica para a lipocortina I:

:EBI-972-> :Inicio lipocortina

TCGAGAGGTTGAGGTGATTTTATGGCAATGGTATCAGAATTCCTCAAGCA

CTCCAACTCCACTAAAATACCGTTACCATAGTCTTAAGGAGTTCGT

- 134 -

GGCCTGGTTTATTGAAAATGAAGAGCAGGAATATGTTCAAACTGTGAAGT

CCGGACCAAATAACTTTTACTTCTCGTCCTTATACAAGTTTGACACTTCA :;EBI-977->

CATCCAAAGGTGGTCCCGGATCAGCGGTGAGCCCCTATCCTACCTTCAAT GTAGGTTTCCACCAGGGCCTAGTCGCCACrCGGGGATAGGATGGAAGTTA <—EBi-988::

:ContinuaÇao ACV-alfa CCATCCTCGGATGCAGAAACTCTTCGGAAGGCTATGAAAGGCTTGGGCAC GGTAGGAGCCTACGTCTTTGAGAAGCCTTCCGATACTTTCCGAACCCGTG

AGATGAGGAAT

TCTACTCCTTAGC <-EBI-982!

Fosforilaram-se alíquotas de 1 pmol de EBI-978 e de EBI-988 num volume total de 6 jul. A reacçao foi feita pa rar por aquecimento a 100°C, adicionou-se a cada amostra 1 pmol de EBI-972 e EBI-982, aqueceu-se a solução novamente a 100°C e arrefeceu-se lentamente. Os dois pares de oligonucleó tidos foram ligados entre si por adiçao de ligase. Em seguida adicionou-se 1 pg do fragmento maior Clal-Xhol de pGN31, ajus tou-se o volume a 40 pl e ligou-se. Após a transformaçao de células competentes de E. coli JM101, cultivaram-se algumas colónias, transferiram-se os respectivos plasmídeos de acordo com o protocolo Bluescribe da Stratageper meio de fagos auxiliares em ADN de cadeia simples e sequenciaram-se. Seleccionou-se um dos plasmídeos correctos e denominou-se pGN32. A in serçao foi cortada a partir do vector com Xhol e HindIII (situada depois do local Sphl no local de multiclonagem do Bluescribe M13+) e foi purificada. 0 plasmídeo pRH281/5 foi igual mente digerido duplamente com Xhol e com HindIII e o fragmento de vector foi isolado. Ligaram-se 200 ng da inserção de PGN32 e cerca de 5θ ng da fracçao do vector pRH281/5 em 20 pl. Transformou-se E. coli com o ADN e verificou-se, no que se re fere à correcçao da construção, o ADN plasmídeo de alguns cio • nes resistentes à ampicilina por meio de análise com enzimas

135 -

de restrição. Em seguida cultivaram-se num fermentador em escala de laboratório as colónias ultimamente seleccionadas e submeteram-se as proteínas da bactéria a uma análise pela técnica da mancha de Western utilizando o anti-soro anti-ACV de coelho. 0 plasmídeo de expressão resultante para o híbrido li pocortina I/ACV-alfa foi denominado pGN35·

b) Extremidade N-terminal específica para a calpactina I:

íEBI-99O-> Início calpactina

TCGAGAGGTTGAGGTGATTTTATGTCTACTGTTCACGAAATCCTGTGCAA

CTCCAACTCCACTAAAATACAGATGACAAGTGCTTTAGGACACGTT

GCTCAGCTTGGAGGGTGATCACTCTACACCCCCAAGTGCATATGGGTCTG CGAGTCGAACCTCCCACTAGTGAGATGTGGGGGTTCACGTATACCCAGAC <::EBI-1001-> íContinuaçao ACV-alfa

TCAAAGCCTATACTAACTTTGATGCTGAGCGGGATGCAGAAACTCTTCGG AGTTTCGGATATGATTGAAACfACGACTCGCCCTACGTCTTTGAGAAGCC EBI-985::

AAGGCTATGAAAGGCTTGGGCACAGATGAGGAAT TTCCGATACTTTCCGAACCCGTGTCTACTCCTTAGC í-EBI-994;

A preparaçao do plasmídeo recombinante Bluescribe M13+ pGn33> a respectiva verificação por SequenciaÇao e a transclonagem no vector de expressão pRH281/5 foram reali zadas de modo análogo ao procedimento descrito para o híbrido de lipocortina I. 0 plasmídeo de expressão resultante (híbrido calpactina I/ACV-alfa) foi denominado pGN3ó.

c) Extremidade N-terminal específica para a ACV-beta:

- 136 -

:EBI-9Ô7“> :Início ACV-beta

TCGAGAGGTTGAGGTGATTTTATGGCCTGGTGGÂAATCCTGGATTGAACA CTCCAACTCCACTAAAATACCGGACCACCTTTAGGACCTAACTTGT íACVGGAGGGTGTCACAGTGAAGAGCAGCTCCCACTTCAACCCAGACCCTGATG CCTCCCACAGTGTCACTTCTCGTCGAGGGTGAAGTTGGGTCTGGGACTAC

A* -alfa continuaÇao CAGAAACTCTTCGGAAGGCTATGAAAGGCTTGGGCACAGATGAGGAAT GTCTTTGAGAAGCCTTCCGATACTTTCCGAACCCGTGTCTACTCCTTAGC

4-EBI-989:

Para a preparaçao do plasmídeo recombinante BluescribeM13+ pGN34 hibridou-se neste caso apenas o par de oligonucleótidos (1 pmol de cada em 6 pl) por aquecimento e arrefecimento lento e em seguida ligou-se como acima no vector pGN31 cortado duplamente por Xhol-Clal. A preparaçao do vector de expressão pGN37 (híbrido ACV-beta/ACV-alfa em pRH281/5) foi levada a efeito como descrito acima·

Claims (1)

1. Processo para a preparaçao de uma molécula de ADN que codifica para polipeptídeos ou proteínas essencialmen te com as propriedades de uma proteína anticoagulante vascular (proteína ACV) caracterizado por se isolar o gene que codifica para o polipeptídeo referido a partir de um banco de

   137

   ADN genómico ou por se preparar um ADN complementar que codifica para este polipeptídeo a partir do ARNm corresponsente a este gene mediante o uso da enzima cranscriprase inversa ou por se preparar o ADN que codifica para este polipeptídeo mediante o uso de processos químicos ou enzimáticos.

   - 2ê Processo de acordo com a reivindicação 1, caX f racterizado por o ADN preparado corresponder a formula

   ATG GCA CAG GTT CTC AGA GGC ACT GTG ACT GAC TTC CCT GGA TTT GAT GAG CGG GCT GAT GCA XXX ACT CTT CGG AAG GCT ATG AAA GGC TTG GGC ACA GAT GAG GAG AGC ATC CTG ACT CTG TTG ACA TCC CGA AGT AAT GCT CAG CGC CAG GAA ATC TCT GCA GCT TTT AAG ACT CTG TTT GGC AGG GAT CTT CTG GAT GAC CTG AAA TCA GAA CTA ACT GGA AAA TTT GAA AAA TTA ATT GTG GCT CTG ATG AAA CCC TCT CGG CTT TAT GAT GCT TAT GAA CTG AAA CAT GCC TTG AAG GGA GCT GGA ACA AAT GAA AAA GTA CTG ACA GAA ATT ATT GCT TCA AGG ACA CCT GAA GAA CTG AGA GCC ATC AAA CAA GTT TAT GAA GAA GAA TAT GGC TCA AGC CTG GAA GAT GAC GTG GTG GGG GAC ACT TCA GGG TAC TAC CAG CGG ATG TTG GTG GTT CTC CTT CAG GCT AAC AGA GAC CCT GAT GCT GGA ATT GAT GAA GCT CAA GTT GAA CAA GAT GCT CAG GCT TTA TTT CAG GCT GGA GAA CTT AAA TGG GGG ACA GAT GAA GAA AAG TTT ATC ACC ATC TTT GGA ACA CGA AGT GTG TCT CAT TTG AGA AAG GTG TTT GAC AAG TAC ATG ACT ATA TCA GGA TTT CAA ATT GAG GAA ACC ATT GAC CGC GAG ACT TCT GGC AAT TTA GAG CAA CTA CTC CTT GCT GTT GTG AAA TCT ATT CGA AGT ATA CCT GCC TAC CTT GCA GAG ACC CTC TAT TAT GCT ATG AAG GGA GCT GGG ACA GAT GAT CAT ACC CTC ATC AGA GTC ATG GTT TCC AGG AGT GAG ATT GAT CTG TTT AAC ATC AGG AAG GAG TTT AGG AAG AAT ΓΓΓ GCC ACC TCT CTT TAT TCC ATG ATT AAG GGA GAT ACA TCT GGG GAC TAT AAG AAA GCT CTT CTG CTG CTC TGT GGA GAA GAT GA C TA A

   na qual XXX representa GAA ou GAC

   - 138 -

   - 3» Processo de acordo com a reivindicação 1, ca-

   racterizado por o ADN preparado corresponder à : fórmula ATG GCC TGG TGG AAA GCC TGG ATT GAA CAG GAG GGT GTC ACA GTG AAG AGC AGC TCC CAC TTC AAC CCA GAC CCT GAT GCA GAG ACC CTC TAC AAA GCC ATG AAG GGG ATC GGG ACC AAC GAG CAG GCT ATC ATC GAT GTG CTC ACC AAG AGA AGC AAC ACG CAG CGG CAG CAG ATC GCC AAG TCC TTC AAG GCT CAG TTC GGC AAG GAC CTC ACT GAG ACC TTG AAG TCT GAG CTC AGT GGC AAG TTT GAG AGG CTC ATT GTG GCC CTT ATG TAT CCG CCA TAC AGA TAC GAA GCC AAG GAG CTG CAT GAC GCC ATG AAG GGC TTA GGA ACC AAG GAG GGT GTC ATC ATT GAG ATC CTG GCC TCT CGG ACC AAG AAC CAG CTG CGG GAG ATA ATG AAG GCG TAT GAC GAA GAC TAT GGG TCC AGC CTG GAG GAG GAC ATC CAA GCA GAC ACA AGT GGC TAC CTG GAG AGG ATC CTG GTG TGC CTC CTG CAG GGC AGC AGG GAT GAT GTG AGC AGC TTT GTG GAC CCG GCA CTG GCC CTC CAA GAC GCA CAG GAT CTG TAT GCG GCA GGC GAG AAG ATT CGT GGG ACT GAT GAG ATG AAA TTC ATC ACC ATC CTG TGC ACG CGC AGT GCC ACT CAC CTG CTG AGA GTG TTT GAA GAG TAT GAG AAA ATT GCC AAC AAG AGC ATT GAG GAC AGC ATC AAG AGT GAG ACC CAT GGC TCA CTG GAG GAG GCC ATG CTC ACT GTG GTG AAA TGC ACC CAA AAC CTC CAC agc TAC TTT GCA GAG AGA CTC TAC TAT GCC ATG AAG GGA GCA GGG ACG CGT GAT GGG ACC CTG ATA AGA AAC ATC GTT TCA AGG AGC GAG ATT GAC TTA AAT CTT ATC AAA TGT CAC TTC AAG AAG ATG TAC GGC AAG ACC CTC AGC AGC ATG ATC ATG GAA GAC ACC AGC GGC GAC TAC AAG AAC GCC CTG CTG AGC CTG GTG GGC AGC GAC CCC TGA

   - 4a 2

   ΛΖ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o ADN preparado corresponder à fórmula

   ATG GCA CAG GTT CTC AGA GGC ACT GTG ACT GAC TTC CCT GGA TTT

   GAT GAG CGG GCT GAT GCA XXX ACT CTT CGG AAG GCT ATG AAA GGC

   139 -

   TTG GGC A CA GAT GAG GAG AGC ATC CTG ACT CTG TTG ACA TCC CGA AGT AAT GCT CAG CGC CAG GAA ATC TCT GCA GCT TTT AAG ACT CTG TTT GGC AGG GAT CTT CTG GAT GAC CTG AAA TCA GAA CTA ACT GGA AAA TTT GAA AAA TTA ATT GTG GCT CTG ATG AAA CCC TCT CGG CTT TAT GAT GCT TAT GAA CTG AAA CAT GCC TTG AAG GGA GCT GGA ACA AAT GAA AAA GTA CTG ACA GAA ATT ATT GCT TCA AGG ACA CCT GAA GAA CTG AGA GCC ATC AAA CAA GTT TAT GAA GAA GAA TAT GGC TCA AGC CTG GAA GAT GAC GTG GTG GGG GAC ACT TCA GGG TAC TAC CAG CGG ATG TTG GTG GTT CTC CTT CAG GCT AAC AGA

   na qual XXX representa GAA ou GAC e/ou que após o último AGA contém um codao de paragem.

   - 5a Processo de acordo com a reivindicação 1₅ caracterizado por o ADN preparado corresponder à fórmula

   GAC CCT GAT GCT

   GGA ATT GAT GAA GCT CAA GTT GAA CAA GAT GCT CAG GCT TTA TTT CAG GCT GGA GAA CTT AAA TGG GGG ACA GAT GAA GAA AAG TTT ATC ACC ATC TTT GGA ACA CGA AGT GTG TCT CAT TTG AGA AAG GTG TTT GAC AAG TAC ATG ACT ATA TCA GGA TTT CAA ATT GAG GAA ACC ATT GAC CGC GAG ACT TCT GGC AAT TTA GAG CAA CTA CTC CTT GCT GTT GTG AAA TCT ATT CGA AGT ATA CCT GCC TAC CTT GCA GAG ACC CTC TAT TAT GCT ATG AAG GGA GCT GGG ACA GAT GAT CAT ACC CTC ATC AGA GTC ATG GTT TCC AGG AGT GAG ATT GAT CTG TTT AAC ATC AGG AAG GAG TTT AGG AAG AAT TTT GCC ACC TCT CTT TAT TCC ATG ATT AAG GGA GAT ACA TCT GGG GAC TAT AAG AAA GCT CTT CTG CTG CTC TGT GGA GAA GAT GAC TAA

   na qual eventualmente antes do primeito GAC se situa um codao de iniciaçao.

   - 6a 140 -

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o ADN preparado corresponder à fÚrmula

   ATG GCC TGG TGG AAA GCC TGG ATT GAA CAG GAG GGT GTC ACA GTG AAG AGC AGC TCC CAC TTC AAC CCA GAC CCT GAT GCA GAG ACC CTC TAC AAA GCC ATG AAG GGG ATC GGG ACC AAC GAG CAG GCT ATC ATC GAT GTG CTC ACC AAG AGA AGC AAC A CG CAG CGG CAG CAG ATC GCC AAG TCC TTC AAG GCT CAG TTC GGC AAG GAC CTC ACT GAG ACC TTG AAG TCT GAG CTC AGT GGC AAG TTT GAG AGG CTC ATT GTG GCC CTT ATG TAT CCG CCA TAC AGA TAC GAA GCC AAG GAG CTG CAT GAC GCC ATG AAG GGC TTA GGA ACC AAG GAG GGT GTC ATC ATT GAG ATC CTG GCC TCT CGG ACC AAG AAC CAG CTG CGG GAG ATA ATG AAG GCG TAT GAG GAA GAC TAT GGG TCC AGC CTG GAG GAG GAC ATC CAA GCA GCA ACA AGT GGC TAC CTG GAG AGG ATC CTG GTG TGC CTC CTG CAG GGC

   AGC AGG na qual eventualmente apús o último AGG se situa um codao de paragem.

   - 7^a Processo de acordo com a reivindicação 1* cara cterizado por o ADN preparado corresponder à fúrmula

   GAT GAT GTG AGC AGC TTT GTG GAC CCG GCA CTG GCC CTC CAA GAC GCA CAG GAT CTG TAT GCG GCA GGC GAG AAG ATT CGT GGG ACT GAT GAG ATG AAA TTC ATC ACC ATC CTG TGC ACG CGC AGT GCC ACT CAC CTG CTG AGA GTG TTT GAA CAG TAT GAG AAA ATT GCC AAC AAG AGC ATT GAG GAC AGC ATC AAG AGT GAG ACC CAT GGC TCA CTG GAG GAG GCC ATG CTC ACT GTG GTG AAA TGC ACC CAA AAC CTC CAC AGC TAC TTT GCA GAG AGA CTC TAC TAT GCC ATG AAG GGA GCA GGG A CG CGT GAT GGG ACC CTG ATA AGA AAC ATC GTT TCA AGG AGC GAG ATT GAC TTA AAT CTT ATC AAA TGT CAC TTC AAG AAG ATG TAC GGC AAG ACC CTC AGC AGC ATG ATC ATG GAA GAC ACC AGC GGC GAC TAC AAG AAC GCC CTG CTG AGC CTG GTG GGC AGC GAC CCC TGA na qual eventualmente antes do primeiro GAT se situa i um codj

   141 -

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3> caraeterizado por se integrar um oligonucleótido que codifica para uma sequência de reconhecimento de uma protease específica no sector que codifica para a sequência do adaptador de ligaçao entre a segunda e a terceira estrutura de repetição.

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 2 ou 3» caraeterizado por se substituir o tripleto que codifica para a arginina +161 (ACV-íx) ou +167 (ACV-/3) por um codao que codifica para um ácido aminado que n§o é reconhecido por tripsina como local de cisão preferido, por exemplo pa ra histidina·

   - 10a Processo de acordo com qualquer das reivindi** Λ caçoes 1 a o, caraeterizado por se substituírem os tripletos que codificam para lisina e/ou para arginina por tripletos que codificam para histidina.

   - na Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 3 e 5 a 10, caraeterizado por se substituir o tri142 - pleto ou eventualmente os tripletos que codificam para cisteí na por tripletos que codificam para serina ou para valina.

   - 12a —

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o ADN preparado codificar para um polipeptídeo ou uma proteína com domínios de repetições.

   - 130 Processo de acordo com a reivindicação 12, ca racterizado por o ADN preparado codificar para um dos domínios de repetições.

   - 14a _

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 13, caracterizado por os domínios que codificam pa ra as repetições integrais estarem reordenados.

   - 15Ô -

   Processo de acordo com a reivindicação 1,a 14 caracterizado por os domínios que codificam para os 17 ácidos aminados da região conservada estarem modificados.

   - 16a - 143 -

   Processo de acordo com a reivindicaÇao la 15, caracterizado por os domínios que codificam para os 17 ácidos

   A* aminados da região conservada serem substituídos integralmente ou em parte

   a. nas proteínas anticoagulantes vasculares (ACV), por domínios que codificam para os ácidos aminados nas lipocortina s,

   b. nas proteínas ACV-alfa, por domínios que codificam para os ácidos aminados das proteínas ACV-beta e inversamente,

   c. na lipocortina I, por domínios que codificam para os ácidos aminados da lipocortina II e inversamente,

   d. nas lipocortinas, por domínios que codificam para os ácidos aminados das proteínas ACV ou

   e. nos polipeptídeos e proteínas referidos, por domínios que csdificam para os ácidos aminados correspondentes de cada um dos outros polipeptídeos ou de cada uma das outras proteínas·

   - 17^a Processo de acordo com qualquer das reivindicações la 16, caracterizado por o domínio que codifica para o peptídeo N—terminal ser permutado por um oligonucleótido que codifica para o peptídeo N-terminal de uma das outras proteínas que apresenta uma estrutura de repetições.

   - 18â Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 17, caracterizado por a extremidade 5* N-terminal ser colocada à frente de uma sequência de sinal homóloga para o respectivo hospedeiro.

   144 -

   19® Processo de acordo com a reivindicação 18, ca racterizado por a sequência de sinal na extremidade 3’ de um local de cisão de reconhecimento específico codificar para uma protease.

   - 20® Processo de acordo com qualquer das reivindicaçoes 1 a 11, caracterizado por a extremidade 5’ N-terminal ser colocada à frente de uma sequência que codifica para uma fracçao de uma proteína de fusão.

   - 21® Processo de acordo com a reivindicação 20, ca

   A* racterizado por o ADN que codifica para a fracçao de uma proteína de fusão na extremidade 3’ de um local de cisão de reconhecimento específico codificar para uma protease.

   - 22® Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o ADN obtido conter um alelo para um dos ADN*s obtidos de acordo com o processo de uma das reivindicações 1 a 21.

   - 23® - 145

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caacterizado por o ADN obtido representar uma forma degenerada de um dos ADN' s obtidos de acordo com o processo de uma das •w ·** reivindicações 1 a 22 ou ser formado por combinações de diferentes sequências integrais ou parciais de um dos ADN's obtidos de acordo com o processo de uma das reivindicações 1 a 22 que codificam para proteínas essencialmente dotadas de propri edades anticoagulantes vasculares.

   - 24a Processo para a preparaçao de uma molécula de ADN que codifica para polipeptídeos ou proteínas essencialmen te com as propriedades de uma proteína anticoagulante vascular e que possui a capacidade de reconhecimento de uma molecu la de ADN obtida de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 23 apresentando um grau de homologia superior a 85%, de pre ferencia superior a 9θ%> sob condiçoes de hibridaÇao, caracte rizado por se modificar uma molécula de ADN obtido de acordo w ·* com qualquer das reivindicações 1 a 23 por uma mutaçao, por substituições de nucleótidos, supressões de nucleótidos, inser çoes de nucleótidos ou inversões de nucleótidos.

   - 25^ Processo para a preparaçao de um ADN caracterizado por se integrar num ADN dum vector cortado por meio de endonucleases de restrição um ADN contendo extremidades adequadas que codifica para um polipeptídeo essencialmente dotado de propriedades de uma proteína anticoagulante vascular· «

   - 26a 146 -

   Processo para a preparaçao de um ADN caracterizado por se integrar num ADN dum vector cortado por meio de endonucleases de restrição, que contêm sequências de regulaçao de expressão, um ADN contendo extremidades adequadas que codifica para um polipeptídeo essencialmente dotado de propri dades de uma proteína anticoagulante vascular de tal modo que as sequências de regulaçao de expressão regulam o ADN integra do.

   - 27a Processo de acordo com qualquer das reivindicaçoes 25 ou 2o, caracterizado por o ADN obtido ser acoplado ** A em ligaçao funcional com uma sequençia de regulaçao de expres sao replicável em microorganismos e em células de mamíferos.

   - 28a Processo de acordo com qualquer das reivindicações 25 a 27 caracterizado por o vector ser um plasmídeo re plicável em procariontes.

   - 29a Processo de acordo com qualquer das reivindicações 25 a 27, caracterizado por o vector ser um plasmídeo replicável em eucariontes.

   - 14/ -

   Processo de acordo com qualquer das reivindi— caçoes 25 a 27, caracterizado por o ADN ser replicavel em células de mamífero.

   - 3ia Processo para a preparaçao de organismos hospedeiros transformados, caracterizado por se transformar um organismo hospedeiro com um dos vectores obtidos de acordo com qualquer das reivindicações 27 a 3θ·

   - 32^Ê Processo de acordo com racterizado por o organismo hospedeiro preferência E. coli.

   a reivindicação 31» ser um procarionte, ca de

   - 333 Processo de acordo com a reivindicação 31, ca racterizado por o organismo hospedeiro ser um eucarionte.

   - 34a Processo de racterizado por o organismo las de mamífero.

   acordo com a reivindicação 31» ca hospedeiro ser uma linha de célu- 35^a 148 -

   Processo para a preparaçao de um polipeptídeo essencialmente dotado de propriedades de uma proteína anticoa gulante vascular caraeterizado por

   a. transformar-se um organismo hospedeiro apropriado com informaçao genetica que codiíica para uma proteína ACV,

   b. provocar a expressão da informação para a produção da proteína ACV no organismo hospedeiro,

   c. isolar a proteína ACV.

   36a Processo de acordo com a reivindicação 35» ca racterizado por o organismo hospedeiro ser obtido de acordo com qualquer das reivindicações 31 a 34.

   - 37^ô Processo de acordo com qualquer das reivindicaçoes 35 ou 3θ> caraeterizado por a informaÇao genetica estar contida nas moléculas de ADN obtidas de acordo com qualA* quer das reivindicações 1 a 3θ·

   - 38ô Processo de acordo com qualquer das reivindicaçoes 35 a 37» caraeterizado por o polipeptídeo obtido ser codificado por um ADN obtido de acordo com qualquer das reiA# vindicaçoes 1 a 23·

   - 149 -

   39^a Processo de acordo com qualquer das reivindi-

   caçoes 35 a 37, caracteriza do por 0 polipeptldeo obtido ter fórmula 1 5 10 15 Met Ala Gin Vai Leu Arg Gly Thr Va 1 Thr Asp Phe Pro Gly Phe 20 25 30 Asp Glu Arg Ala Asp Ala XX Thr Leu Arg Lys Ala Met Lys Gly 35 40 45 Leu Gly Thr Asp Glu Glu Ser Ile Leu Thr Leu Leu Thr Ser Arg 50 55 60 Ser Asn Ala Gin Arg Gin Glu Ile Ser Ala Ala Phe Lys Thr Leu 65 70 75 Phe Gly Arg Asp Leu Leu Asp Asp Leu Lys Ser Glu Leu Thr Gly 80 85 90 Lys Phe Glu Lys Leu lie Vai Ala Leu Met Lys Pro Ser Arg Leu 95 100 105 Tyr Asp Ala Tyr Glu Leu Lys His Ala Leu Lys Gly Ala Gly Thr 110 115 120 Asn Glu Lys Vai Leu Thr Glu lie Ile Ala Ser Arg Thr Pro Glu 125 130 135 Glu Leu Arg Ala Ile Lys Gin Vai Tyr Glu Glu Glu Tyr Gly Ser 140 145 150 Ser Leu Glu Asp Asp Vai Vai Gly Asp Thr Ser Gly Tyr Tyr Gin 155 16o 165 Arg Met Leu 7a 1 Vai Leu Leu Gin Ala Asn Arg Asp Pro Asp Ala 170 175 lâo Gly Ile Asp Glu Ala Gin Vai Glu Gin Asp Ala Gin Ala Leu Phe 185 190 195 Gin Ala Gly Glu Leu Lys Trp Gly Thr Asp Glu Glu Lys Phe Ile 200 205 210 Thr Ile Phe Gly Thr Arg Ser Val Ser His Leu Arg Lys Vai Phe 215 220 225 Asp Lys Tyr Met Thr Ile Ser Gly Phe Gin Ile Glu Glu Thr Ile 23O 235 240 Asp Arg Glu Thr Ser Gly Asn Leu Glu Gin Leu Leu Leu Ala Vai

   150 -

   245 25O 255 Vai Lys Ser Ile Arg Ser Ile Pro Ala Tyr Leu Ala. Glu Thr Leu 260 265 270 Tyr Tyr Ala Met Lys Gly Ala Gly Thr Asp Asp His Thr Leu Ile 275 280 285 Arg Vai Met Vai Ser Arg Ser Glu lie Asp Leu Phe Asn Ile Arg 29O 295 300 Lys Glu Phe Arg Lys Asn Phe Ala Thr Ser Leu Tyr Ser Met Ile 305 310 315 Lys Gly Asp Thr Ser Gly Asp Tyr Lys Lys Ala Leu Leu Leu Leu

   320

   Cys Gly Glu Asp Asp x na qual XX representa Glu ou Asp e eventualmente a metionina na posição 1 e cindida e a alanina na posição 2 esta eventual mente bloqueada e/ou na qual existem eventualmente agregações por meio de, por exemplo, pontes intermoleculares de dissulfu reto entre as cisternas na posição 31o.

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 35 a 37 5 caracterizado por o polipeptídeo obtido ter a. fórmula

   1 5 10 15 Met Ala Trp Trp Lys Ala Trp Ile Glu Gin Glu Gly Vai Thr Vai 20 25 30 Lys Ser Ser Ser Hf s Phe Asn Pro Asp Pro Asp Ala Glu Thr Leu 35 4o 45 Tyr Lys Ala Met Lys Gly Ile Gly Thr Asn Glu Gin Ala Ile Ile 50 55 60 Asp Vai Leu Thr Lys Arg Ser Asn Thr Gin Arg Gin Gin lie Ala 65 70 75 Lys Ser Phe Lys Ala Gin Phe Gly Lys Asp Leu Thr Glu Thr Leu

   151 -

   80 85 90

   Lys Ser Glu Leu Ser Gly Lys Phe Glu Arg Leu Ile Vai Ala Leu 95 100 105 Met Tyr Pro Pro Tyr Arg Tyr Glu Ala Lys Glu Leu His Asp Ala 110 115 120 Met Lys Gly Leu Gly Thr Lys Glu Gly Vai Ile Ile Glu Ile Leu 125 I30 135 Ala Ser Arg Thr Lys Asn Gin Leu Arg Glu Ile Met Lys Ala Tyr 14o 145 150 Glu Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Leu Glu Glu Asp Ile Gin Ala Asp 155 16o 1Ó5 Thr Ser Gly Tyr Leu Glu Arg lie Leu Vai Cys Leu Leu Gin Gly 170 175 iÔO Ser Arg Asp Asp Vai Ser Ser Phe Vai Asp Pro Ala Leu Ala Leu 185 18o 195 Gin Asp Ala Gin Asp Leu Tyr Ala Ala Gly Glu Lys Ile Arg Gly 200 205 210 Thr Asp Glu Met Lys Phe Ile Thr Ile Leu Cys Thr Arg Ser Ala 215 220 225 Thr His Leu Leu Arg Vai Phe Glu Glu Tyr Glu Lys Ile Ala. Asn 23O 235 240 Lys Ser Ile Glu Asp Ser Ile Lys Ser Glu Thr Hi s Gly Ser Leu 245 250 255 Glu Glu Ala Mt e Leu Thr Vai Vai Lys Cys Thr Gin Asn Leu His 260 265 270 Ser Tyr Phe Ala Glu Arg Leu Tyr Tyr Ala Met Lys Gly Ala Gly 275 280 285 Thr Arg Asp Gly Thr Leu Ile Arg Asn Ile Vai Ser Arg Ser Glu 290 295 300 Ile Asp Leu Asn Leu Ile Lys Cys His Phe Lys Lys Met Tyr Gly 305 310 315 Lys Thr Leu Ser Ser Met Ile Met Glu Asp Thr Ser Gly Asp Tyr 320 325 Lys Asn Ala Leu Leu Ser Leu Vai Gly Ser Asp Pro & na q uai ever tua 1 ment e a meti onin a na Ρθ s rw >içao 1 é cin di da e a a lan ina na p osiç ao 2 est á ev entu alme nt e bloq uead a e/ou n a qual exi ε tem even tual ment e P° ntes int ramo 1 ecu lare s de di s sult ureto

   152 - entre as cisteínas nas posiçoes 161 e/ou 206 e/ou 250 e/ou 293 e/ou agregações por meio de pontes intermoleculares de dissul fureto entre as cisteínas nas posiçoes referidas.

   - 41& Processo de acordo com qualquer das reivindicações 35 a 37» caracterizado por o polipeptídeo obtido ter a fórmula

   1 5 10 15 Met Ala Gin Vai Leu Arg Gly Thr Vai Thr Asp Phe Pro Gly Phe 20 25 30 Asp Glu Arg Ala Asp Ala XX Thr Leu Arg Lys Ala Met Lys Gly 35 4o 45 Leu Gly Thr Asp Glu Glu Ser Ile Leu Thr Leu Leu Thr Ser Arg 50 55 60 Ser Asn Ala Gin Arg Gin Glu Ile Ser Ala Ala Phe Lys Thr Leu 65 70 75 Phe Gly Arg Asp Leu Leu Asp Asp Leu Lys Ser Glu Leu Thr Gly 80 85 90 Lys Phe Glu Lys Leu Ile Vai Ala Leu Met Lys Pro Ser Arg Leu 95 100 105 Tyr Asp Ala Tyr Glu Leu Lys His Ala Leu Lys Gly Ala Gly Thr 110 115 120 Asn Glu Lys Vai Leu Thr Glu Ile Ile Ala Ser Arg Thr Pro Glu 125 130 135 Glu Leu Arg Ala lie Lys Gin Vai Tyr Glu Glu Glu Tyr Gly Ser 140 145 150 Ser Leu Glu Asp Asp Vai Vai Gly Asp Tnr Ser Gly Tyr Tyr Gin 155 160 Arg Met Leu Vai Vai Leu Leu Gin Ala Asn Arg

   na qual XX representa Glu ou Asp e eventualmente a metionina na posição 1 e cindida e a alanina na posição 2 esta eventual

   A* mente bloqueada e/ou na qual existem eventualmente agregações.

   153 -

   - 42® Processo de acordo com qualquer das reivindicações 35 a 37, caracterizado por o polipeptídeo obtido ter a fórmula

   10 15 X Asp Pro A sp Ala 20 Gly Ile Asp Glu Ala Gin Vai Glu Gin Asp Ala Gin Ala Leu Phe 25 30 35 Gin Ala Gly Glu Leu Lys Trp Gly Thr Asp Glu Glu Lys Phe Ile 4o 45 50 Thr Ile Phe Gly Thr Arg Ser Vai Ser His Leu Arg Lys Vai Phe 55 60 65 Asp Lys Tyr Met Thr Ile Ser Gly Phe Gin Ile Glu Glu Tnr Ile 7o 75 80 Asp Arg Glu Thr Ser Gly Asn Leu Glu Gin Leu Leu Leu Ala Vai 85 90 95 Vai Lys Ser Ile Arg Ser Ile .Pro Ala Tyr Leu Ala Glu Thr Leu 100 105 110 Tyr Tyr Ala Met Lys Gly Ala Gly Thr Asp Asp His Thr Leu Ile 115 120 125 Arg Vai Met Vai Ser Arg Ser Glu Ile Asp Leu Phe Asn Ile Arg 130 135 14o Lys Glu Phe Arg Lys Asn Phe Ala Thr Ser Leu Tyr Ser Met Ile 145 150 155 Lys Gly Asp Thr Ser Gly Asp Tyr Lys Lys A la Leu Leu Leu Leu

   160

   Cys Gly Glu Asp Asp x na qual X representa metionina ou hidrogénio e/ou na qual exis tem eventualmente agregações por meio de, por exemplo, pontes intermoleculares de dissulfureto entre as cisternas na posição 156.

   - 43ê 154 -

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 35 a 375 caracterizado por o polipeptxdeo obtido ter a fórmula

   1 5 10 15 Met Ala Trp Trp Lys Ala Trp Ile Glu Gin Glu Gly Vai Thr Vai 20 25 30 Lys Ser Ser Ser His Phe Asn Pro Asp Pro Asp Ala Glu Thr Leu 35 40 45 Tyr Lys Ala Met Lys Gly Ile Gly Thr Asn Glu Gin Ala Ile Ile 50 55 60 Asp Vai Leu Thr Lys Arg Ser Asn Thr Gin Arg Gin Gin Ile Ala 65 70 75 Lys Ser Phe Lys Ala Gin Phe Gly Lys Asp Leu Thr Glu Thr Leu 80 85 9Q Lys Ser Glu Leu Ser Gly Lys Phe Glu Arg Leu Ile Vai Ala Leu 95 100 105 Met Tyr Pro Pro Tyr Arg Tyr Glu Ala Lys Glu Leu His Asp Ala 110 115 120 Met Lys Gly Leu Gly Thr Lys Glu Gly Vai Ile Ile Glu Ile Leu 125 130 135 Ala Ser Arg Thr Lys Asn Gin Leu Arg Glu Ile Met Lys Ala Tyr 140 145 150 Glu Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Leu Glu Glu Asp Ile Gin Ala Asp 155 16o 165 Thr Ser Gly Tyr Leu Glu Arg Ile Leu Vai Cys Leu Leu Gin Gly

   na qual eventualmente a metionina na posição 1 e cindida e a alanina na posição 2 esta eventualmente bloqueada e/ouna qual existem eventualmente agregações por meio de, por exemplo, pon tes intermoleculares de dissulfureto entre as cictexnas na po siçao 161.

   - 44a Processo de acordo com qualquer das reivindicações 35 a 37, caracterizado por o polipeptxdeo obtido ter a

   155 - fórmula

   X Asp Asp Vai 5 Ser 10 Ser Phe Vai Asp Pro Ala Leu Ala Leu 15 20 25 Gin Asp Ala Gin Asp Leu Tyr Ala Ala Gly Glu Lys Ile Arg Gly 30 35 40 Thr Asp Glu Met Lys Phe Ile Thr lie Leu Cys Thr Arg Ser Ala 45 50 55 Thr His Leu Leu Arg Vai Phe Glu Glu Tyr Glu Lys Ile Ala Asn 60 65 70 Lys Ser lie Glu Asp Ser Ile Lys Ser Glu Thr His Gly Ser Leu 75 80 85 Glu Glu Ala Met Leu Thr Vai Vai Lys Cys Thr Gin Asn Leu His 90 95 100 Ser Tyr Phe Ala Glu Arg Leu Tyr Tyr Ala Met Lys Gly Ala Gly 105 110 115 Thr Arg Asp Gly Thr Leu Ile Arg Asn Ile Vai Ser Arg Ser Glu 120 125 I3O Ile Asp Leu Asn Leu Ile Lys Cys His Phe Lys Lys Met Tyr Gly 135 14o 145 Lys Thr Leu Ser Ser Met Ile Met Glu Asp Thr Ser Gly Asp Tyr 150 155 160 Lys Asn Ala Leu Leu Ser Leu Vai Gly Ser A sp Pro

   na qual X representa metionina ou hidrogénio e/ou na qual existem eventualmente pontes de dissulfureto intramoleculares entre as cisteínas nas posiçoes 40 e/ou 84 e/ou 127 e/ou agre gaçoes por meio de, por exemplo, pontes intermoleculares de dissulfureto entre as cisreínas nas posiçoes referidas.

   - 45& Processo de acordo com qualquer das reivindicações 35 a 44, caracterizado por o polipeptldeo obtido estar completamente isento de polipeptídeos homólogos.

   - 156 -

   Processo de acordo com qualquer das reivindi· caçoes 35 a 45, caracterizado por o polipeptídeo obtido con· ter um peptídeo guia.

   Processo de acordo com a reivindicação 46, ca racterizado por o polipeptídeo obtido

   a. conter uma íracçeo de uma protexna de fusão e/ou

   b. ser formado por um domínio parcial de um dos polipeptídeos obtidos de acordo com uma das reivindicações 35 a 46 (proteína híbrida) e/ou

   c. apresentar-se sob a forma de um dímero, trímero, tetrâmero ou multímero.

   Processo para a preparaçao de sais de polipe— ptídeos essencialmente com as propriedades de uma proteína an ticoagulante vascular, caracterizado por se transformar um po lipeptldeo obtido de acordo com qualquer das reivindicações 38 a 47 num seu sal farmaceuticamente aceitável.

   - 49^a Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica átii para o tratamento terapêutico ou profilático do corpo humano ou de animais, caracterizado por se incor157 - porar como ingrediente activo uma quantidade activa de um popipeptídeo quando preparado por uma das reivindicações 35 a 47 em conjunto com adjuvantes farmacêuticos inertes.

   - 50^a Processo de acordo com a reivindicação 49, ca racterizado por o polipeptídeo incorporado ser dotado de propriedades inibidoras da coagulaçao do sangue.

   - 51^fi Processo de acordo com a reivindicação 49, ca racterizado por o polipeptídeo incorporado ser dotado de propriedades anti-inflamatorias.

   - 52a

   Processo de acordo com a reivindicação 49, ca racterizado por o polipeptídeo incorporado ser dotado de propriedades anti-reumáticas.

   - 53^a Processo de acordo com a reivindicação 49, ca racterizado por o polipeptídeo incorporado ser dotado de propriedades tais que o tornam apropriado para utilizaÇao de acor do com as indicações da lipocortina.

   - 158 -

   Processo de acordo com a reivindicação 49» ca racterizado por o polipeptídeo/proteína incorporado apresentar domínios de repetição e ser dotado de propriedades inibidoras da coagulaçao do sangue.

   - ₅₅â -

   Processo de acordo com a reivindicação 49» ca racterizado por o polipeptídeo/proteína incorporado apresentar dpmmios de repetição e ser dotado de propriedades inibi— doras da trombina.

   - 56ô - racterizado por tar domínios de -inflamatórias.

   racterizado por tar domínios de -reumáticas.

   Processo de acordo com a reivindicação 49» ca o polipeptídeo/proteína incorporado apresen99 repetição e ser dotado de propriedades anti- 57^a Processo de acordo com a reivindicação 49» ca o polipeptídeo/proteína incorporado apresen— repetição e ser dotado de propriedades anti- 580 -159

   Processo de acordo com a reivindicação 49, ca racterizado por o polipeptídeo/proteína incorporado ser uma lipocortina e ser dotado de propriedades inibidoras da coagulaçao do sangue.

   - 59& Processo de acordo com a reivindicação 49, ca racterizado por o polipeptídeo/proteína incorporado ser uma lipocortina e ser dotado de propriedades inibidoras da trombina·

   - ÓOa Processo de acordo com a reivindicação 49, ca racterizado por o polipeptídeo incorporado ser dotado de propriedades inibidoras da trombina.

   - 6ia -

   Processo para a produção de uma linha de célu las híbrida que segrega anticorpos monoclonais contra os polipeptideos obtidos de acordo com uma das reivindicações 35 a 47, caracterizado por se colherem de um animal imunizado com proteínas ACV linfócitos B que segregam anticorpos e se fundi rem com células tumorais

   - 62a -

   Processo para a produção de anticorpos mono

   160 clonais que neutralizam parcial ou totalmente de modo especifico um dos polipeptídeos obtidos de acordo com uma das reivindicações 35 a 47 ou se ligam de modo específico ao polipeptídeo referido, caracterizado por se imunizar um animal hospedeiro com o polipeptídeo referido, fundir linfócitos B do referido animal hospedeiro com células de mieloma, subclocai’ as linhas de células híbridas que segregam os anticorpos mono clonais e cultivar estas linhas de células in vitro ou in vivo

   - 63^ «V

   Processo para a determinação qualitativa ou quantitativa de polipeptídeos, caracterizado por se preparar uma coluna de cromatografia de imunoafinidade com um anticorA* _ po monoclonal preparado de acordo com a reivindicação o2& e se utilizar a coluna assim preparada para a análise qualitativa ou quantitativa dos polipeptídeos obtidos de acordo com uma das reivindicações 35 a 47·

   - 64 0 —

   A* Processo para a purificação de polipeptídeos, caracterizado por se fazer passar através de uma coluna de cro matografia de imunoafinidade preparada com um anticorpo monoclonal preparado de acordo com a reivindicação 62 os polipe— ptideos obtidos de acordo com uma das reivindicações 35 a 47·

   - 65a AZ

   Processo para a preparaçao de um conjunto de análise (test kit”) para a análise de polipeptídeos obtidos de acordo com uma das reivindicações 35 a 47, caracterizado por se incorporar como reagente de análise um anticorpo monoclonai preparado de acordo com a reivindicaçac 62.

   - 66S Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica para o tratamento terapêutico ou profilático do corpo humano ou animal, caraeterizado por se incorporar como ingrediente activo um aducto farmaceuticamente tolerável ou um composto covalente entre um polipeptídeo obtido de acordo com uma das reivindicações 35 a 47 e uma substancia veicular inerte.

   - 6?â Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica para o tratamento terapêutico ou profilático do corpo humano ou animal, caraeterizado por se incorporar como ingrediente activo um aducto farmaceuticamente tolerável ou um composto covalente enrre um polipeptídeo obtido de acordo com uma das reivindicaçoes 35 a 47 e, por exemplo polietilenoglicol.

   A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na Republica Federal Alema, em 28 de Março de 1987, sob os n^s P 37 10 3©9· 1 > P 37 10 430.6, P 37 10 364.4 e em 3 de Novembro de 198?, sob o

   P 37 37 367.6.