KR0181520B1 - 항응고제를 함유하는 진단용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 감지할 수 있는 물질로 표지된 약제, 특히 아넥신 및 진단 목적용의 이들의 용도에 관한 것이다.
Description
제1도는 Ca2+농도의 증감에 따른 인지질에 대한 VAC의 교대 흡착 및 탈착의 변화를 나타낸 것이다. 20%DOPS/80%DOPC 인지질 이중층에 대한 VAC(1㎍/㎖)의 흡착이다. Ca2+(3, 4, 6 mM)의 첨가는 ↑ 또는 ▽로 나타내었다.
제2도는 인지질 표면상의 VAC의 흡착에 대한 인지질 조성 및 Ca2+농도의 영향에 대한 것이다.
○ 100%DOPS; ● 20%DOPS; △ 5%DOPS; □ 1%DOPS; ◇ 100% DOPC; 모든 혼합물은 DOPC로 보충하였다.
[VAC] = 1㎍/㎖
제3도는 VAC의 흡착에 대한 2가 이온의 효과에 관한 것이다. 규정된 이온(1 또는 3mM)의 존재하에서 20% DOPS 및 80% DOPC의 이중층에 대한 VAC 흡착이다. [VAC]=1㎍/㎖.
제4도는 인지질 표면 상의 VAC의 Ca2+-의존성 흡착에 대한 Zn2+의 상승효과에 관한 것이다. 50μM Zn2+의 존재하에서 1% DOPS 및 99% DOPC 상의 VAC 흡착에서의 Ca2+의 효과를 측정하였다. [VAC] = 1㎍/㎖
제5도는 조성을 변화시킨 인지질 이중층 상의 VAC의 흡착에 관한 것이다. 순수하거나 80% 디올레오일 포스파티딜 콜린(DOPC)과 혼합된 디올레오일 포스파티딜 세린(DOPS), 카디올리핀(CL) 및 디올레오일 포스파티딜 에탄올아민, (DOPE)에 대한 VAC 흡착, 80% DOPC와 혼합된 디올레오일 포스파티딜 글리세롤(DOPG), 포스파티딜 이노시톨(PI) 및 스테아릴아민에 대한 VAC 흡착 또는 순수한 DOPC에 대한 VAC 흡착에 관한 것이다. [VAC] 1㎍/㎖; [Ca2+]=3mM.
제6도는 1,3,4,6-테트라클로로-3α-6α-디페닐글리콜우릴(IODO-GEN)의 도식이다.
제7도는 분획 1 내지 12에서 방사능 분포이다.
제8도는 선형 분석기에서의 방사능 분포이다.
계산된 혼합물을 필름 발란스 상에 위치시켰다. 이중층의 양은 편광 반사법으로 측정하고14C-표지된 DOPS의 활성도를 베크만(Beckmann) 6S 3801 섬광계수기를 사용하여 측정하고 (s.d. 2%) 바탕방사(60DPM)로 보정하였다. 이중층 중의 DOPS 분획은 방정식 2를 사용하여 계산하였다:
DOPS의 비활성은 100,000 DPM·㎍이고, 인지질이 차지한 면적은 0.62cm2이었다.
특정화된 인지질 표면에 대한 최대 VAC-흡착(Γ최대)과 [Ca2+]1/2과 결합하는 절반 VAC 최대값을 주는 칼슘농도를 함께 표준편차를 가지는 적어도 3개의 다른 실험의 평균값으로 나타냈다. n.d.는 측정되지 않음.
[참고문헌]
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본 발명은 검출용 물질로 표지된 시약(agent), 특히 아넥신 및 진단 목적용의 이것의 용도에 관한 것이다.
혈액은 혈장 매질 내에 분산된 특정의 비결합성 세포로 구성된다. 세포의 내용물은 소위 원형질막에 의해 주변 혈장으로부터 분리되어 있다. 이들 막은 이중층 형태의 인지질 및 이 이중층을 부분적으로 관통하거나 이로부터 돌출된 결합 단백질로 이루어져 있다.
다양한 이지질들은 이중층의 외층 및 내층에 무질서하게 분포되어 있는 것이 아니라 비대칭 형태로 세포에 의해 유지되고 있다(7,8). 포스파티딜 콜린(PC) 및 스핑고마이엘린(SPH)이 외층의 월등한 종류인 반면에 포스파티딜 에탄올아민(PE) 및 포스파티딜 이노시톨(PI)은 시토졸을 향하여 내층에 우세하게 위치해 있다. 이와 같은 에너지를 소비하는 비대칭 상태는 생리학적으로 대단히 중요하다. PC 및 SPH는 인지질류 중에서는 가장 불활성인 종류이며 그외의 다른 종류와는 아주 대조적으로 혈장 성분의 존재하에서 이례적으로 중성의 특성을 나타낸다. 이와같은 혈장 단백질에 비해 외층의 비활성적 반응성은 혈액이 액체로 존재하기 위한 절대적 선행조건이다. 응고인자라고 하는 응고 단계(Cascade)에 속하는 특정의 혈장 단백질들은 사실상 이들이 활성화 될 때에 액체 혈액을 고체 상태로 전환시킬 수 있다(9). 이들 응고인자는 포스포티딜 세린과 같은 인지질에 의해 활성화될 수 있다.
많은 경우에, 예를들어 혈관에 상처가 생긴 후에는 응고 인자가 활성화되어야 함은 물론 생존을 위해서도 중요한 것은 언급할 필요도 없다. 혈관에 상처가 난 상황에서는, 특수한 혈액세포인 혈소판은 포스파티딜 세린을 외층에 수송하는 활성화 기작에 의해 그의 막 비대칭성을 포기할 수 있으며, 여기에서 이것은 응고인자의 활성을 돕는다(10).
혈소판 원형질막의 외층의 인지질 조성에서의 이러한 체계적 변화는 예를 들어 스코트 증후군(Scott syndrome)에서 지적된 바와 같이, 지혈에서 주된 생리적 중요성을 갖는다(11).
그러나, 생리학은 또한 병리학도 포함한다: 따라서, 혈액의 항상성은 어떤 경우에는 동맥, 관상동맥 및 정맥 혈전증에서 나타나는 바와 같이 병리학적인 상태로 전개될 수 있다.
이들 지혈 질환은 통상 특발성이며 의사들이 이들의 발생을 예측하여 예방적 치료법을 개발하는 것은 불가능하다.
본 발명의 목적은 지혈 질환의 초기 인식을 돕는 시약을 제공하는 것이다.
증상의 전개와는 달리 질환의 전개는 통상 서서히 일어난다. 증상없는 상태가 진행되는 이러한 단계 동안에는 응고 시스템의 활성화가 계속되는 프로트롬빈 상태가 국부적으로 일어난다. 이런 국부적 활성과 관련하여, 말초부에서는 활성화 초기 단계에 있는 혈소판이 생성된다.
이들 혈소판들은 이들의 원형질막 외층의 인지질 조성물을 이미 변화시키기 시작한 것이다. 포스파티딜 세린은 외피층에 존재하게 된다. 따라서,이러한 소위 프로트롬빈 상태를 진단하는 시약은 매우 큰 임상학적 중요성을 가질 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 포스파딜 세린을 포스파티딜 콜린으로부터 특이적으로 분별할 수 있는 보조제(adjuvant)를 제공하는 것이다.
말초부에서의 약하게 활성화된 혈소판의 생성 이외에도, 혈관의 벽이 병리 상태에 있는 곳은 어디든지 완전히 활성화된 혈소판이 축적될 것이다. 이와같은 위치는 지혈시스템의 활성에 대한 트리거(trigger)로 간주될 수 있다. 병리학적인 부위(site)와 이 지점에서 형성되는 혈전의 위치를 찾아내는 것(locating)은 중요한 치료학상의 가치가 있을 것이다.
따라서, 본 발명의 추가의 목적은 지혈시스템의 활성화 및(또는) 혈전의 위치를 찾아낼 수 있는 시약을 제공하는 것이다.
혈액응고 기작은 효소반응의 단계들로 이루어지며 마지막 단계에서 최종적으로 피브리노겐을 피브린으로 전환시키는 트롬빈의 형성이 수반된다. 다양한 응혈 촉진성 반응, 예를들면 Xa 및 Va 인자에 의한 프로트롬빈의 활성화는 응고인자가 결합된 인지질 표면에 의해 촉매화된다.
인지질에 결합하여 인지질 표면에 따라 과정을 방해하는 단백질은 인지질에 대한 이들의 결합에 있어서 Ca2+-의존성인 군(family)으로 구성된다.
아넥신으로도 알려진 이 군은 리포코틴(lipocortin) I, 칼팍틴(calpactin) I, 프로테인(Protein) II, 리포코틴 III, p67-칼레렉트린(calelectrin) 이외에도, 혈관 항 응고 단백질(VAC) 및 IBC, PAP, PAPI, PP4, 엔도넥신(endonexin) II 및 리포코틴 V를 포함한다.
아넥신의 공통적인 구조적 형태는 이들의 유사한 Ca2+및 인지질-결합 특성에 기초하는 것으로 추정된다. 이 일반적 특성은 모든 아넥신에 적용되지만, Ca2+및 다양한 인지질에 대한 이들의 친화력에 대해서는 명백한 개체성이 있다.
아넥신의 병리학적인 기능은 막-결합성 과정에 관계된다. VAC의 항응고작용의 기본적인 기작은 VAC가 인지질 표면에 결합하여 인지질의 촉매적 능력을 억제시키고 이것에 따라 이들의 표면상에서 응고 촉진 복합체의 형성을 방해하는 것으로 인식되었다.
결합에 대한 연구에서는 VAC가 칼슘 의존성 방식으로 가역적으로 응혈 촉진 인지질과 결합하는 것으로 나타났다.
Cd2+, Zn2+, Mn2+및 Co2+시리즈로부터의 기타의 2가 양이온들도 또한 결합에 대해 양성적 효과를 가졌으나, Ca2+와 같은 정도는 아니었다.
또한, 본 발명자들은 놀랍게도 인지질상의 VAC 흡착은 Ca2+및 Zn2+이온의 존재하에서 이례적인 정도로 양성적인 영향을 받는다는 것을 밝혀내었다.
놀랍게도, 본 발명자들은 혈장-칼슘 농도에서, VAC가 포스파티딜 세린에 결합하나, 포스파티딜 콜린 및 스핑고마이엘린(sphingomyelin)과는 결합하지 않는다는 것을 발견하게 되었다. 따라서, VAC는 말초 혈소판을 인식하여, 외막층에서 말초 혈소판과 PS를 결합시킬 것이다. 또한, VAC는 PS를 혈액으로 내보내는 혈관계에서 이러한 위치들을 특이적으로 인식할 것이다.
인지질들 사이에서 이런 구별화에 의하여 기타 아넥신처럼 VAC는 상기 서술된 바와 같이 프로트롬빈 상태의 초기 인식을 하기 위한 이상적인 시약이 되는 것이다.
본 발명에 의하여, 놀랍게도 혈관계의 프로트롬빈 상태의 인식이 처음으로 가능하게 되었다. 이 진단은 즉, 정상 상태와는 다른 혈소판의 프로트롬빈 상태를 인식할 수 있는 시약 물질의 특이성에 의하여 가능하다. 프로트롬빈의 상태는 단지 프로트롬빈성 혈소판 외층만이 포스파티딜 세린을 나타내는 점에 있어서 혈소판의 정상 상태와는 다르므로, 이 원리는 포스파티딜 세린을 포스파티딜 콜린으로부터 특이적으로 구별할 수 있는 모든 시약에 대해 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 시약은 포스파티딜 세린에 대한 이들의 특이성에 의해 특징지어지며, 명세서 중에 서술된 결합 테스트에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에 따라, 이 시약의 특이성을 이용함으로써 지혈시스템의 활성화의 출발점 및(또는) 혈전의 위치를 찾아내는 것이 또한 가능하다. 결과적으로, 본 발명은 건강 위협 상황으로의 전개가 가능한 상태를 초기에 진단함으로 적합한 치료 수단을 취할 수 있게 하는 시약을 처음으로 제공한다.
본 발명에 따르는 바람직한 시약으로는 인지질 포스파티딜 세린에 대해 필요한 특이성을 갖는 항응고 폴리펩타이들이다.
아넥신류, 특히 VAC가 더욱 바람직하다.
본 발명에 따른 시약, 특히 VAC 및 그외의 다른 아넥신을 진단제로 사용하게 할 수 있기 위해서는, 이들은 그 자체로 공지된 방식으로 표지시킨다. 적합한 표지화는, 예를들면, 형광 그룹을 표지하거나 방사능 표지로 성취할 수 있다. 유리하게 사용될 수 있는 형광 표지로는 플루오레세인(fluorescein) 이소티오시아네이트가 있는 반면에, 유리하게 사용될 수 있는 방사능 표지로는 할로겐, 특히131I 또는125I와 같은 요오드 또는 납, 수은, 탈륨, 테크네튬 또는 인듐(203pb,198Hg,201Tl,99mTc,111In)의 방사능 동위원소가 있다.
플루오레세인 이소티오시아네이트(Serva)는 그 자체로 공지의 방식으로 VAC를 표지하여 사용될 수 있다(13). 표지화는 또한 MRI [자기공명 형상법(Magnetic resonance imaging)] 시스템으로 측정할 수 있는 상자기성 조영제의 수단에 의해서도 가능하다.
MRI 시스템에서 측정될 수 있는 진단 시약으로서 접합체(conjugate)가 제공되는 경우에는 가돌리늄, 코발트, 니켈, 망간 또는 철 착물을 사용하는 것이 가능하다. 생물체에서 원자의 핵스핀 벡터를 적정화하기 위해서는 강력한 자기장이 사용된다. 이어서, 자기장은 파괴되어 핵이 그들의 처음 상태로 되돌아간다. 이 과정을 관찰하고 기록한다.
이와같이 검출용 표지가 제공된 항응고 폴리펩타이드는 동맥 또는 정맥경로로 투여된다. 투여량은 충분한 잠복기간 후에 후속적인 측정에 충분해야 한다.
프로트롬빈 상태를 진단하기 위해서는, 본 발명에 따라 표지된 폴리펩타이드 또는 시약을 임의로 헤파린과 같은 혈장 칼슘농도를 감소시키지 않는 추가의 항응고제의 존재하에서, 시험하고자 하는 혈액에 체외적으로 투여시킨 다음, 특정 형태의 세포와 결합된 표지를 분석한다.
본 발명에 따라 표지된 폴리펩타이드는 혈액-등장성 수용액으로써 또는 보조제와 함께 본 발명의 목적에 사용될 수 있다. 보조제는 예를들어 트윈(TWEEN) 80, 아르기닌(arginine), 인산염 완충액 및 생리학적으로 혼화성인 보존제가 포함될 수 있다. 그외의 다른 물질은 당업자에게 잘 알려져 있으며 이들 또한 사용될 수 있다.
방사능 표지는 예를들어, 공지의 요오도겐 방법(12) 또는 통상의 클로르아민-T 방법을 사용하여 수행한다. 8일의 반감기를 고려할 때,131I가 생체내의 진단용으로 권유된다. 방사능 표지된 시약을 혈액-등장 수용액에서 용해시킨다. 멸균 여과후에 이것을 주입시킨다. 주입후 1,2,4 및 7일에131I용 감마 카메라로 몸 전체의 섬광조영(scintigraph)을 수행한다.
본 발명의 목적을 위하여 아넥신의 진성 형태 뿐만아니라 변형된 형태를 사용하는 것이 또한 가능하다.
EPA 0 293 567에 기술된 변형을 참고하기 바란다. 더욱이 인지질들, 포스파티딜 세린/포스파티딜 콜린에 특이성이고, 따라서 수반된 혈소판의 포로트롬빈 상태를 인식할 수 있는 아넥신의 단편 또는 화학적으로 변형된 유도체들을 또한 사용할 수 있다.
본 발명은 구체적으로 다음에 관한 것이다:
- 검출용 표지를 가진 아넥신군, 특히 VAC로부터의 항응고 폴리펩타이드.
- 검출용 표지로써 형광표지, 바람직하게는 플루오레세인 이소티오시아네이트, 할로겐, 테크네튬, 납, 수은, 탈륨 또는 인듐과 같은 방사능동위원소, 특히 바람직하게는131I 또는125I 또는 상자기성 조영제를 함유하는 항응고 폴리펩타이드.
- 포스파티딜 세린을 포스파티딜 콜린으로부터 구별하기 위한 상기한 바의 항응고 폴리펩타이드.
- 진단제 용도로 사용하기 위한 상기 항응고 폴리펩타이드.
다음 a) 및 b)를 포함하는 지혈시스템의 활성화 출발점의 위치를 찾아내는 방법:
a) 아넥신군, 바람직하게는 VAC 부터의 검출 표지가 제공된 항응고 폴리펩타이드 또는 시약을 시스템, 바람직하게는 동맥 또는 정맥 경로로 투여하고,
b) 잠복기간 후에, 상기 폴리펩타이드의 분포를 체외적으로 감마-섬광 카메라에 의하거나 또는 자기공명 측정 중 어느 하나에 의해 관찰하는 방법.
- 다음 a) 및 b)를 포함하는 프로트롬빈 상태를 진단하는 방법:
a) 시험하고자 하는 혈액을 검출용 표지를 가진 아넥신, 특히 VAC로부터의 항응고 폴리펩타이드 또는 시약과 체외에서 혼합시키고,
b) 특정의 세포 형태와 결합된 표지를 분석하는 방법.
- 검출 표지를 가진 아넥신, 특히 VAC 로부터 얻어진 항응고 폴리펩타이드 외에 추가로 보조제 예를들어 생리식염용액, TWEEN 80, 아르기닌 및(또는) 인산염 완충액, 임의로 사용되어 혈장 칼슘 농도를 감소시키지 않는 항응고제, 바람직하게는 헤파린을 함유하는 시약.
- 포스파티딜 세린을 포스파티딜 콜린으로부터 구별할 수 있는 본 발명의 시약 또는 항응고 폴리펩타이드를 함유하는 지혈시스템의 활성화 및(또는) 혈전의 개시점 또는 프로트롬빈 상태의 진단 검출용 키트.
- 포스파티딜 세린을 포스파티딜 콜린으로부터 구별하기 위한 본 발명의 항응고 폴리펩타이드 또는 시약의 용도.
- 지혈계 또는 혈전의 질환의 출발점 또는 프로트롬빈 상태를 진단하기 위한 본 발명의 항응고 폴리펩타이드 또는 시약의 용도.
[물질 및 방법]
VAC 는 EPA 0 181 465 또는 EPA 0 293 567 중의 어느 하나와 유사하게 제조된다. 다음 실험은 VACα로 수행하였으나, 이 결과는 기타 아넥신, 특히 VACβ에 또한 적용될 수 있다.
[지질류]
디올레오일-포스파티딜 콜린(DOPC, 제 P-1013호),
디올레오일-포스파티딜 에탄올아민(DOPE, 제 P-0510호),
카디오리핀(CL, 제 C-5646호),
디올레오일-포스파티딜 글리세롤(DOPG, 제 P-9664호),
포스파티딜 이노시톨(PI, 제 P-0639호),
디올레오일-포스파티드 산(DOPA, 제 P-2767호),
스테아릴아민(SA, 제 S-6755호) 및 계란 노른자 스핑고마이엘린(제 S-0756호)를 시그마 화학(Sigma Chemical Co.)으로부터 구입하였다.
DOPC 및 DOPE의 순도는 얇은 층(thin layer) 크로마토그래피로 측정하였다. 디올레오일-포스파티딜 세린(DOPS)은 (1)에 따라서 DOPC를 전환시켜 제조하였다.14C-표지된 DOPS(비활성 100,000 dpm/㎍)는 아머샴(Amersham)에서 구입하였다.
[실리콘 판상에 인지질 이중층의 제조]
인지질 이중층은 코셀(Corsel) 등이 기술한 바와 같이 랑무어-필름 발란스(Langmuir-film balance) (라우다(Lauda) 형태 FW-1)을 사용하여 적용시켰다. 친수성 실리콘 판을 30% 발색 황산 및 물로 24시간 동안 처리하고 50% 에탄올/물에 저장하였다. 사용전에 이들을 세제와 물로 골고루 세척하였다. 필름 발란스를 탈이온수 및 50 μM CaCl2로 채웠다. 클로로포름 1ℓ 중의 인지질 약 2g을 함유하는 20㎕의 용액을 이 기질에 가하였다. 이중층 중의 DOPS 분획물을 DOPC와 혼합시킨14C-표지된 DOPS로 시험하였다. 채워진 이중층은 섬광세제(Dupont Formula 989)를 사용하여 실리콘 판으로부터 제거시키고 총 방사능을 섬광계수기 (scintillation counter)로 측정하였다.
[타원 편광 반사법(ellipsometry)에 의한 결합 측정법]
인지질 이중층상의 VAC의 흡착은 (2,3)에 기술된 바와 같이 자동 타원 편광 반사법을 이용하여 측정하였다.
결합 시험은 교반시킨 완충용액(0.05M 트리스(Tris)/HCl; 0.1M NaCl; pH=7.5; T=20℃) 5㎖을 함유하는 친수성 큐벳(cuvett)에서 수행하였다. 2가의 양이온을 염화물로써 단계적으로 첨가하였다.
VAC-농도 0.1㎍/㎖ 미만에서, 특이성이 있는 VAC 농축액을 함유한 완충 용액을 계속 가하여 VAC에 적합한 완충용량으로 만들었다.
흡착시킨 필름의 굴절률 및 두께 d는 합한 편극 및 분석 자료로부터 결정하였다. 흡착된 단백질층의 용량 Γ은 변형된 로렌츠-로렌즈(Lorentz-Lorenz) 방정식[1]을 사용하여 굴절률 및 두께로부터 결정하였다(3,5):
[1] Γ=3d(n2-nb2)/[(n2+2)(r(nb2+2)-v(nb2-1))]
여기에서, nb는 완충용액의 굴절률이다. r=0.254 및 v=0.71 값은 특정 몰의 굴절 및 부분적인 특정 용적에 사용된다.
[결과]
[VAC의 인지질 결합에 대한 2가 양이온의 효과]
VAC는 칼슘 농도에 따라서 20% DOPS/80% DOPC로 이루어진 인지질막에 결합한다. 이 이후의 EDTA의 첨가는 즉시적이며 총체적인 탈착을 초래하였다(제1도). 유리 Ca2+농도를 변화시킴으로써 흡착된 양 또는 흡착속도에서의 어떤 주목할만한 변화없이, 몇번의 흡착을 개시하는 것도 가능하였다. 따라서, 흡착 또는 탈착에 의해 생기는 VAC 분자 또는 인지질 이중층의 비가역적 변화들은 불가능하다. 결합은 또한 큐벳을 Ca2+가 없는 완충용액으로 헹굴때 전체적으로 가역적이었다.
인지질에 결합하는 VAC의 Ca2+의존성은 제2도에 나타내었다. Ca2+- 적용량 활성 곡선은 최대 VAC 흡착량의 절반이 수득되는 Ca2+농도 즉 [Ca2+]1/2를 아주 명확히 나타낸다. [Ca2+]1/2 값은 인지질 표면의 조성물에 의존된다. DOPS 100%, 20%, 5% 및 1%를 함유하는 인지질 표면을 사용하여 [Ca2+]1/2 값이 각각 36μM, 220μM, 1.5mM 및 8.6mM 으로 측정되었다(표 1). 이들 결과는 동일 몰의 혼합물 PS/PC에 결합한 엔도넥신(endonexin) II (=VAC)에 대해 측정하였던 [Ca2+]1/2 값인 53μM와 특히 잘 일치한다(6). 흡착된 (Γ최대) 단백질의 최대양은 막중의 DOPS 분획물과는 무관하였으며, 0.217㎍/cm2의 양에 이르렀다. 순수한 DOPC이중층 내지 3mM미만의 Ca2+농도에서는 흡착이 탐지되지 않았다.
다른 농도에서의 인지질 이중층에 대한 VAC의 흡착은 제5도에 나타내었다. 사실상 순수한 DOPC 이중층을 사용해서는 VAC의 흡착이 이루어지지 않음을 여기에서 아주 명백히 나타낸다. 스테아릴아미드(SA)에 대한 VAC의 흡착도 마찬가지로 미약하다.
Ca2+이외의 양이온을 사용한 실험에 있어서, 인지질에 대한 VAC의 결합은 강한 Ca2+특이성인 것으로 밝혀졌다(제3도). Cd2+, ZR2+, Mn2+및 CO2+는 결합을 미미하게만 촉진하는 것으로 나타났으며; Ba2+및 Mg2+는 아무런 영향을 미치지 못했다. 양이온의 이러한 특성은 어느 정도로 그의 이온 반경에 관련될 수 있다.
[아연의 상승작용(synergism)]
고농도의 이온(1mM)은 단지 적은 정도로 VAC-흡착을 촉진한다(제3도); 50μM은 흡착에 대하여 아무런 영향을 주지 않았다. 놀랍게도, 이 농도는 Ca2+의 존재하에서는 결합에 영향을 미친다: 즉, 약간의 상승작용이 있다. [Ca2+]1/2 값은 단지 DOPS 1% ([Zn2+]=50μM)을 갖는 이중층에 대하여 8.6 에서부터 2.7mM 까지 감소되었다(제4도). 50μM[Zn2+]은 혈장 아연 농도의 정상 범위내에 있다.
[진단방법]
[1. 시험관내 진단]
a) VAC를 플루오레세인 그룹, 즉 플루오레세인 이소티오시아네이트로 그 자체로 공지된 방법으로 표지시켰다; 이 방식으로 VAC-FITC를 수득하였다.
b) 환자의 혈액을 혈장-칼슘 농도를 감소시키지 않는 항응고제(즉, 헤파린) 및 VAC-FITC을 함유하는 플라스틱 시험관에 넣었다.
c) 혼합후, 혈액세포는 FACS(형광 활성화시킨 세포분류기)를 사용하여 분석하였다. 이 분석에 의해 특정 형태의 세포와 결합된 형광의 세기를 결정하였다.
d) 분석 내역들은 결합 VAC-FITC을 가진 혈소판, 즉 노출된 PS을 가진 혈소판의 양 및 이에 따른 프로트롬빈 상태의 존재를 나타낸다. 이 건강-위협 상태는 이 방법으로 초기에 인식될 수 있으며 따라서 초기단계에서 치료될 수 있다.
[2. 생체내 진단]
a) VAC는131I과 같은 단명 동위원소를 가지고 그 자체로 공지된 방법을 사용하여 표지시켰다;131I-VAC를 수득하였다.
b)131I-VAC를 환자의 정맥에 주사하였다.
c) 일정한 잠복기간후에 환자를 전체 또는 부분적으로 몸을 섬광계수기에 노출시켰다. 방사능의 분포는 큰 자기장의 투시 감마 카메라를 사용하여 관찰 할 수 있다.
d)131I-VAC 축적된 혈관내 부위는 혈전증이 진행하고 있는 지점을 나타낸다. 적합한 혈전증 예방 또는 혈전증 완화조치를 초기에 취할 수 있다.
[1. 방사능 표지화]
[1.1 제조]
[1.1.1. 500 mmol/ℓ 인산나트륨 완충액의 제조]
이수소인산나트륨 일수화물 24.5g을 이차 증류수 1ℓ에 용해시키고 이것을 pH 7.5가 얻어질 때까지 이차 증류수 1ℓ 중의 수소인산이나트륨 35.5g 용액에 가하였다.
[1.1.2. 20 mmol/ℓ 인산나트륨 완충액+150 mmol NaCl(용출 완충액)의 제조]
이수소인산 나트륨 일수화물 2.76g을 이차 증류수 1ℓ에 용해시키고 pH 7.2가 얻어질때까지 이차 증류수 1ℓ 중의 수소인산이나트륨 2.84g의 용액에 가하였다. 용출 완충용액은 완충용액 1ℓ 에 NaCl 8.77g(150 mmol)을 가하여 제조하였다.
[1.1.3. 정제 칼럼의 평형화]
PD-10 칼럼(세파덱스 (Sephadex) G25, Messrs Pharmacia)을 용출 완충액 약 30㎖로 평형화시켰다.
[1.1.4. 반응 용기의 제조]
IODO-GEN(분자량 : 432.09g/mo1) 2mg을 고순도의 디클로로메탄 50㎖중에 용해시켰다. 이 용액 200㎕을 1.5㎖ 에펜도르프 용기에 피펫팅한 다음 용매를 37℃(항온조)에서 증발제거시켰다. 이 방식으로 IODO-GEN 8㎍(1.85×10-2mmol)을 반응 용기의 벽에 미세하게 분포시켰다.
[1.1.5. 표지화에 사용되는 VAC-α]
사용된 출발물질은 이차 증류수 1㎖로 희석된 인산나트륨 완충액 20 mmol/ℓ + 150 mmo1/ℓ NaCl pH 7.24 ㎖ 중의 VAC-α 50mg의 용액이었다. VAC-α 분자량은 1몰당 34000g 이다.
[1.1.6. 표지화에 사용되는 I-125]
Na125I는 듀퐁(Dupont)사에서 제조된 넨(NEN) 제품으로, 보정일에 총 방사능 67.3MBq (=1.82mci)를 가진다. 이 비활성은 요오드 mg당 15.9Ci 즉 요오드 0.115㎍(1/2I2의 9.2×10-7mmol)에 대응하는 뜻 1/2 I2mmol 당 1.98 kCi 이다. 활성 NaI를 1ℓ당 NaOH 0.1몰 농도의 5.5㎕ 중에 용해시켰다.
[1.2. 요오드화법]
모든 작업은 납화시킨 유리 스크린 뒤에서 동위원소의 제거로 수행하였다. 1.1.5에서 서술한 VAC-α 용액 20㎕(=200㎍)을 IODO-GEN으로 전 처리시킨 반응용기에 옳겼다. 이 용기를 밀폐하고 주변온도에서 20분 동안 진탕시켰다. 이어서 반응 용액을 제조된 PD-10칼럼(1.1.3. 참조)에 피펫으로 가하였다. 반응 용기를 용출 완충액(1.1.2 참조) 500㎕로 다시 헹구고 이 용액을 또한 PD-10칼럼에 가하였다. 흘러 넘친 용출물은 버렸다.
[1.3. 정제]
용출 완충액(1.1.2 참조)을 0.5㎖씩 나누어 2분 간격으로 적용시켜서, VAC-α[125I]를 유리125I/Na125I 로부터 분리시켰다. 12개의 분획후에, 이 정제 단계를 완결하였다. 분획의 상대 활성 함유량은 실험실 모니터(GMZ)를 사용하여 측정하였다(제7도).
분획 6과 7을 합하고, 이들을 용출 완충액으로 정확히 2.0㎖가 되도록 채워서, 100㎕ 부분으로 각각 나누어 -20℃에서 냉동시켰다. 물질을 분석 및 앞으로 전개될 연구를 위하여 이들 분량으로 이용할 수 있게 유지시켰다.
[2. 분석 부분]
[2.1 함량의 측정]
발색물질 기질 분석에서는 용액 2.0㎖당 71.8㎍의 VAC-α 함량이 측정되었다.
[2.2 방사능 측정]
[2.2.1. 전체 방사능]
하나의 100㎕부분을 녹인 후에, 이 [125I] VAC-α 용액 50㎕을 불활성 VAC-α 용액의 950㎕에 피펫으로 가하고 (1.1.5. 참조), 골고루 혼합시키고 혼합 용액의 50㎕는 측정을 위하여 LSC-측정기(베크만)상에 위치시켰다. 총 용액은 2.0㎖ 당 24.5MBq(=0.663mCi)로 측정되었다.
[2.2.2. 비활성]
함량 및 총 방사능에 대한 측정결과 341.5MBq/mg-11.61 TBq/mmol(9.23mCi/mg=313.8Ci(mmol)의 비활성을 나타냈다.
[2.2.3. TCA 침전에 의한 방사능 결합 단백질의 측정]
VAC-α 용액 100㎕을 3% BSA 용액 50㎕ 및 40% 수용성 트리클로로아세트산 150㎕과 합하여, 완전히 진탕시키고 냉장고에 60분 동안 방치시켰다. 형성된 침전물을 원심분리기로 제거시켰다.
상청액 분취량을 LSC-계수기로 측정하였다.
결과: 방사능 99.3%를 침전시킬 수 있었다.
[2.2.4. 방사능 산출]
투입된 67.3MBq 중에서 24.5MBq가 VAC-α에서 발견되었다. 활성수율은 이에따라 36.4% 이다.
[2.3 변형의 정도]
비활성 및 사용된 불활성 VAC-α의 양으로부터 통계적으로 매 6번째의 VAC-α 분자가125I-원자로 표지된 것으로 계산되었다.
[3.4 확인 및 순도]
SDS-PAGE (7 내지 17%의 구배 겔, 비환원 조건) 및 은염색법에 의한 겔의 결과적인 평가법(Oakley 법), 선형 분석기의 방사능 자동 사진 (autoradiography) 및 검출법(Berthold LB 282 제품, LB2820로 측정)(제8도)를 이용하여 이 물질을 사용된 VAC-α와 비교하여 연구하였다. 물질들은 동일하였으며, 이량체 생성물의 비율은 불활성 충진들에 대하여 용인되는 제한값 8%에 확실히 못미쳤다.
Claims (25)
- (a) 검출용 표지를 가진 아넥신 군으로부터의 항응고 폴리펩타이드를 시스템에 도입하고, (b) 잠복기간 후에 상기 폴리펩타이드의 분포를 관찰함을 특징으로 하는, 인간을 제외한 동물에 있어서 지혈시스템의 활성화의 출발 지점을 검출하는 방법.
- 제1항에 있어서, 폴리펩타이드가 VAC임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,125I,123I,131I,111In,99mTc,203Pb,198Hg 및201TI로 이루어지는 군 중에서 선택되는 방사능 동위원소 중의 하나 또는 상자기 조영 원소를 검출용 표지로 사용함을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 3항 중의 어느 하나에 있어서, 폴리펩타이드를 동맥내 또는 정맥내 경로로 투여함을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 분포를 감마 섬광 카메라 또는 자기공명 측정법을 사용하여 체외적으로 관찰함을 특징으로 하는 방법.
- a) 시험될 혈액을 검출용 표지를 가진 아넥신군으로부터의 항응고 폴리펩타이드와 체외적으로 혼합하고, b) 특정 형태의 세포와 결합된 표지를 분석함을 특징으로 하는, 프로트롬빈 상태를 검출하는 방법.
- 제6항에 있어서, 폴리펩타이드가 VAC임을 특징으로 하는 방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 플루오레세인 그룹 또는125I,123I,131I,111In,99mTc,203Pb,198Hg 및201Tl로 이루어진 군 중에서 선택되는 방사상 동위원소 중의 하나를 검출용 표지로 사용함을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, 부가적으로 보조제를 첨가함을 특징으로 하는 방법.
- 제9항에 있어서, 사용된 보조제가 생리식염 용액, 트윈 80, 아르기닌 또는 인산염 완충용액임을 특징으로 하는 방법.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 혈장-칼슘 농도를 감소시키지 않는 항 응고제를 부가적으로 사용함을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, 포스파티딜 콜린과 포스파티딜 세린을 구별하기 위한 방법.
- 제1항 내지 5항 중의 어느 하나에 따른 지혈 시스템의 활성화의 출발 지점을 진단 검출하기 위한 키트.
- 아넥신군의 항응고 폴리펩타이드를 함유함을 특징으로 하는, 프로트롬빈 상태, 지혈 시스템의 활성화 또는 붕괴의 출발 지점 또는 혈전의 진단용 조성물.
- 제14항에 있어서, 폴리펩타이드가 VAC임을 특징으로 하는 방법.
- 제14항에 있어서, 폴리펩티드에 검출용 표지가 제공됨을 특징으로 하는 조성물.
- 제16항에 있어서, 플루오레세인 이소시아네이트가 형광 표지로 사용되거나 할로겐, 테크네튬, 납, 수은, 탈륨 또는 인듐의 방사성 동위원소가 방사성 표지로 사용되거나, 상자기 조영제가 사용됨을 특징으로 하는 조성물.
- 제14항 내지 17항 중의 어느 하나에 있어서, 부가적으로 보조제를 함유함을 특징으로 하는 조성물.
- 제18항에 있어서, 생리식염 용액, 트윈80, 아르기닌 또는 인산염 완충 용액이 보조제로 사용됨을 특징으로 하는 조성물.
- 제14항에 있어서, 혈장-칼슘 농도를 감소시키지 않는 항응고제를 부가적으로 사용함을 특징으로 하는 조성물.
- 제14항에 있어서, 포스파티딜 콜린과 포스파티딜 세린을 구별하는 시약인 조성물.
- 제11항에 있어서, 항응고제가 헤파린임을 특징으로 하는 방법.
- 제17항에 있어서, 방사성 표지로서131I 또는125I를 사용함을 특징으로 하는 조성물.
- 제20항에 있어서, 항응고제가 헤파린임을 특징으로 하는 조성물.
- 제6항 내지 12항 중의 어느 하나에 따른 프로트롬빈 상태를 진단 검출하기 위한 키트.
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