PT85730B - Processo para a preparacao de factor de estimulacao de megacariocitos - Google Patents

Description

A presente invenção refere-se geralmente ao campo hemológico especificamente à área das proteínas das plaquetas.

As plaquetas do sangue são o produto da diferenciação terminal de megacariócitos. Os megacariócitos crê-se serem originados a partir das células de origem pluripotencial primordialmente da medula dos ossos. A forma que se consegue reconhecer mais cedo é o megacarioblasto que possui um núcleo imaturo embebido em citoplasma basofílico com um número mínimo de grânulos. 0 processo de maturação complexo envolve a formação dum núcleo poliplóide, multilobulado e de grânulos citoplasmáticos distintivos, muito especializados. As plaquetas são desprendidas de megacariócitos maduros por um processo que é mal conhecido.

Muito embora se tenha conseguido fazer algum progresso na identificação da síntese de proteínas específicas de plaquetas e da estrutura súbcelular no amadurecimento de megacariócitos, relativamente pouco se sabe sobre a regulação da megacariocitopoise.

Postulou-se que diversos factores humorais controlam a ptoidização e a maturação citoplásmica de megacariócitos. Estas substâncias foram obtidas sob a forma bruta e são designadas trombopoietina (2P0) ou factor com actividade de estimulação trombopoiética (TSP), dependendo da fonte de que deriva a actividade. Os ensaios usados para quantificar a actividade biológica destes factores dependem de medições da incorporação de rádio-isótopos, especialmente de (^SE)-seleniometionina e de (^^SO^, nas proteínas e glicosaminoglicanos de plaquetas recentemente formadas, que são todas sintetizadas pelos megacariócitos. Por consequência, estas medições provavelmente reflectem as taxas de maturação citoplásmica de megacariócitos incluindo o desenvolvimento das estruturas citoplás micas especializadas integrais com a função das plaquetas.

Dados recentes indicam que um factor de estimulação de colónias de megacariócitos (Még-CSF) provoca um tremendo aumento de replicações de DNA. A segunda fase, a maturação das células precursoras encarregues de originarem megacariócitos completamente diferenciados, pensa-se que é regulada poi um ou por vários factores humorais cuja concentração no sangue é ligeiramente alterada por modificações do nível de plaquetas em circulação.

Este factor (ou factores) aumenta a taxa de transcrição de proteínas para inclusão em múltiplos grânulos secretórios. 0 citoplasma do megacariócito maduro contém múltiplos grânulos secretórios de plaquetas, incluindo alfa-grânulos, grânulos densos e lisosomas de plaquetas. De maneira particular, sabe-se que os alfa-grânulos contêm factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGrF), beta-tromboglobulina, factor de plaquetas 4 (PF4) e o veículo de proteoglicano de sulfato de condroitina.

Alguns investigadores descreveram anteriormente maneiras de proceder para isolar uma ou mais substâncias trombo4

poieticamente activas parcialmente purificadas incluindo T. í. McBonald e col. em Exp. Hematol. 9, 288-296 (1981), J. levin e col. em Blood, 54, 166a (abst.) (1979) e T. P. McDonald em Biochem. Med. 21, 146-155 (1979)« Estas preparações parcialmente purificadas, aproximadamente 100 vezes purificadas, foram geralmente preparadas por precipitação com sulfato de amónio e cromatografia numa coluna de lectina. Muito embora se tenha verificado que têm um certo papel no estímulo da síntese de proteínas, não se isolou ainda nenhum factor sob a forma pura que permitisse fazer a sua caracterização e estudar a sua aplicação.

Constitui portanto um objectivo d.a presente invenção identificar e isolar um factor que regula a maturação de células progenitoras de megacariócitos com obtenção de megacariócitos completamente difenenciados, particularmente, um factor que aumenta a velocidade de síntese das proteínas.

É um outro objectivo da presente invenção proporcionar um método para isolar factor de estimulação de formação de megacariócitos muito puro.

É ainda um outro objectivo da presente invenção pro porcionar métodos para ensaiar especificamente o factor de estimulação de megacariócitos.

E um outro objectivo da presente invenção proporcionar sequências de nucleótidos que codificam proteínas do factor de estimulação de megacariócitos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se a um factor de estimulação de megacariócitos (MSF) que foi purificado até à homogeneidade e ensaiado relativamente à sua capacidade para aumentar a velocidade de síntese de proteínas semelhantes ao factor de plaquetas 4 numa linha de células de promegacarioblastos de ratazana (RPM) e numa fracção enriquecida em megacariócitos derivada da medula de ossos da ratazana (Heg-D).

Nos exemplos descritos, purifica-se o MSJ? até à hoc mogeneidade (7,5 x IO'² vezes) a partir de meio condicionado isento de soro obtido a partir de células de rim de embriões humanos (HEK) cultivadas ou até próximo da homogeneidade (1,44 x 10 ) a partir de plasma trombocitopénico. No primeiro exemplo, isola-se o MSF preparando um lisato de células de HEK isento de soro, centrifugando e concentrando o lisato, precipitando o MSF com sulfato de amónio a 80 % de saturação, dialisando com tampão de tris fisiológico para eliminar a matéria insolúvel diferente de MSF, aplicando a proteína solúvel a uma coluna de WGA-Sepharose e eluindo a proteína de MSF com quitina oligossacáridos, preferivelmente trímeros de N-acetil-glucosamina, aplicando o eluído concentrado contendo a actividaàe de MSF a uma coluna com Biogel P200, eluindo e concentran3.0 as fracções que contêm actividade de MS? usando um tampão icom elevada força iónica, cromatografando aquelas fracções numa coluna de exclusão de tamanhos TSK-G3000 para HPLC e eluindo o MSF com um tampão de pequena força iónica. No segundo exemplo, usa-se uma maneira de proceder de purificação semelhante com a omissão da coluna de Biogel P200 para isolar o MSF do plasma trombocitopénico.

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MSF marcado com -Ί, preparado a partir de meio condicionado por células de HEK, é homogéneo como apreciado por SDS-PAGE e por concentração dos valores do ponto isoeléc-

trico na presença de ureia 9,2 molar. 0 MSF é uma proteína acídica (p¹ = 5,1) com um valor de Mr - 15 000 que estimula a síntese de proteínas semelhantes a PF4 em células promegacarioblásticas de ratazana 7 vezes e possui uma actividade semimáxima a uma concentração de 0,8 picomolar. Usando megacariócitos normais (Meg-D), demonstrou-se uma estimulação aproximadamente tripla da síntese de proteína por acção de KSF. 0 MSF não possui actividade biológica que corresponda a outros factç res de crescimento hemopoiéticos e parece ser específico em relação à linhagem de megacariócitos.

As sequências de nucleótidos que codificam a proteína do factor que estimula a formação de megacariócitos são isolados por métodos conhecidos pelos peritos no assunto. No método preferido, isola-se RUA de células que produzem o factor estimulante de megacariócitos, sintetiza-se cDNA a partir do RNA, insere-e o cDNA num fago indutível que é depois empacotado e introduzido num hospedeiro apropriado tal como E. coli, o fago é induzido e as células são escolhidas relativamente à proteína de MSF e isola-se o DNA das células que produzem proteína de KSF e caracteriza-se. 0 gene e as sequências de cDNA que codificam total ou parcialmente o MSF são úteis na produção de MSF e de porções de MSF que podem ser usados como antigenes para a produção de anticorpos ou como alvos específicos de medicamentos. As sequências genéticas ou de nucleótidos podem também ser modificadas para produzir KSF com actividade incrementada ou alterada.

A proteína purificada tem um certo número de aplicações potenciais como, por exemplo, potenciar a função das plaquetas em pacientes com trombocitopenia ou arteriosclerose, na cura de feridas, em pacientes com anticorpos contra as plaquetas ou na preparação de medicamentos para reforçar, alterar ou diminuir a função das plaquetas.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA

INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um factor de estimulação de megacariócitos (MSF) purificado até homogeneidade aparente. No primeiro exemplo, o MSF é obtido a partir de células de rins de embriões humanos usando um esquema de purifi cação que envolve o fraccionamento com sulfato de amónio, cro matografia de afinidade em WGA-Sepharose, filtração através de gel de Biogel P200 e cromatografia em fase líquida sob alta pressão em TSK G3000. 0 MSF mareado com ¹²^I tem um valor de M_r - 15 000 determinado por SDS-PAGE mas migra como uma proteína de M = 9 000 no ensaio de cromatografia em fase líquida sob alta pressão de exclusão de tamanhos analíticos o que concorda com uma extensa glicosilação. S necessário mar125 car com Ί o L?SP purificado porque o factor não pode ser vi· sualizado por manchamento com prata. A falta de manchamento com prata também se observou para outras glicoproteínas. 0 MSF, quando é examinado por focagem do ponto isoeléctrico na presença de ureia 9,2 molar, apresenta uma apertada banda a pH 5,1 (largura da banda menor do que 0,1 unidade de pH). 0 MSF purificado tem uma forte tendência para se auto-associar em condições não desnaturantes. Muito embora o MSF seja recuperado consistentemente como uma proteína de M = 9 000 em condições apropriadas por cromatografia em fase líquida sob alta pressão por filtração com gel, 16 % do MSF marcado com 125 ^1 migra como um componente de elevado peso molecular quando recromatografado nas mesmas condições. In vitro, o KSF é activo em concentrações sub-picomolares estimulando a produção de proteínas semelhantes a PF-4 por uma linha de células promegacariocíticas de ratazana e a síntese de PF-4 autêntico ao fim de pouco tempo em culturas de megacariócitos de medula óssea de ratazana.

No segundo exemplo, utiliza-se um procedimento de

purificação idêntico, sem a operação de tratamento com Biogel P200, para isolar preparações quase homogéneas de KSF de piasma trombocitopénico. 0 ³I-MSF de plasma trombocitopénico no ensaio de SDS-PAGE e de cromatografia em fase líquida de alta pressão analítica em TSK G3000, comporta-se de maneira idêntica ao preparado a partir de células de H3K. No entanto, no produto derivado do plasma encontram-se presentes impurezas como é demonstrado por SDS-PAGE e pela actividade específica três vezes menor deste material quando se compara com o factor derivado de ΗΞΚ. Isso provavelmente deve-se à omissão de operação de filtração através de gel de Biogel P200 que serve para eliminar os contaminantes de baixo peso molecular de MS? derivado de HEK. A operação de fraccionamento com Biogel P200 não foi usada durante a purificação do factor de estimulação de plasma visto que o conhecimento aproximad o da actividade específica de KSF no plasma trombocitopénico, aproximadamente sessenta vezes menor do que nos sobrenadantes TI3K isentos de soro, sugeria que as extremamente pequenas quantidades de proteína activa seriam difíceis de remover. A concentração de MSF no plasma trombocitopénico calcula-se que seja aproximadamente igual a 0,08 pM.

KSF é específico para megacariócitos. As preparações que contêm KSF não possuem qualquer efeito de estimulação de colónias hemopoiéticas, nem actividade de CSF macrófago granulócito, nem actividade de promoção da ruptura, nem de Meg-CSF nem actividade de multi-CSF. 0 factor de estimulação não é activo no ensaio mitogénico das células 3T3 nem em ensaios que detectam a interleucina-1 e a interleucina-2. Os factores de estimulação bemopoiéticos que foram purificados até ao presente sabe-se que são funcionais a concentrações comparáveis com a gama indicada para este factor. Eles incluen Hemopoitina-1 (1,5 pK), GK-OSF (3 pM) e interleucina-3 (5-25 pM). As determinações das concentrações de KSF no soro normal demonstra que os níveis basais deste factor variam em cerca

de 1,5 a 2 vezes. As concentrações de KSJ? no plasma parecem responder a alterações nos níveis de plaquetas em circulação. Os resultados sugerem que o MSF aumenta aproximadamente três a seis vezes nos animais agudamente trombocitopénicos.

Utilizam-se as mesmas operações iniciais para a purificação de TPO de plasma trombocitopénico como descrito por JT. Levin e col. em Blood. 54, 166a (resumo), P. Cohen e col. em J. Clin. Invest. 44, 1036 (resumo) (1965) θ R. E. Stanley em Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 2764-2768 (1985) na purificação parcial de KSJ? de meio condicionado de células de ΗΞΚ isentas de soro. No entanto, o NSF obtido como produto final é aproximadamente 1000 vezes mais puro do que as misturas isoladas por Levin e col., Cohen e col. e Stanley, devido à selec ção das condições para a cromatografia em WGA-Sepharose (um gradiente linear de trímeros de N-acetilglucosamina) e às operações adicionais que usam uma coluna.de Biogel P200 (tampão de elevada força iónica) e uma coluna de exclusão de tamanhos (tampão de baixa força iónica).

Purificou-se e caracterizou-se MSF prazeniente de duas origens: meios condiconados isentos de soro obtidos a partir de células de rins de embriões humanos e plasma trombo-, citopénico obtido de coelhos da Nova Zelândia. Usaram-se os seguintes materiais e métodos.

Produtos químicos: Os produtos químicos para a eleetroforese foram adquiridos à firma Bio-Rad Laboratories. 0 Na foi adquirido à firma Amersham Radiochemicals Inc. A (^C)-leucina foi comprada à firma New England Nuclear. 0 hidrolisado de lactalbumina foi obtido na firma Gibco. Todos os outros produtos químicos eram do grau reagente ou mais puros.

Proteínas e hidratos de carbono: A aglutinina de gérmen de trigo (WGA), ovomucóide, quitina, N-acetil-glucosamina, albumina de soro bovino, ovalbumina, anidrase carbónica, aprotinina e outras enzimas foram adquiridas na firma Sigma Chemical Corp. A heparina de intestino de porco bruta (121,C U/mg) foi obtida na firma Biosynth. 0 sulfato de condroitina-4 e o 6-N-sulfato de condroitina foram obtidos na firma ICN Biochemicals, Cleveland, Ohio, Estados Unidos da América.

linhas de cãulas; As câulas RPM, como descritas por Cicoria e Hempling em J. Cell. Physiol., 105, 105-12? (1980) foram propagadas em Meio de Eagle modificado por Dulbecco complementado com 10 % de soro de feto de vitela. As células foram desenvolvidas a 37°C numa atmosfera humidificada contendo 5 % úe CC^. Em todos os meios de cultura estava presente penicilina (100 U/ml) e estreptomicina (100 microgramas/ml). As células de HEK foram obtidas de Μ. A. Biologicals e cultivadas em larga escala pelo Centro de Cultura de Células do Cambridge, MA, Estados Unidos da América. As

O células foram semeadas a uma densidade de 6 x 10 células/om em sessenta e três balões cilíndricos de 850 cm e desenvolvidas até à confluência (5 x 10? células/balão) num meio Mi99 contendo 10 % de soro de fetos bovino. Depois de se ter atingido a confluência, as células foram mantidas em meio M199 isento de soro mas contendo 0,5 % de hidrolisado de lactalbumina, descrito por T. P. McDonald em J. Lab. Olin. Med. 85, 59-66 (1975). Os sobrenadantes foram retirados semanalmente para processamento e o meio de soro substituído ao fim dum intervalo de seis semanas. A contagem das células realizou-se com um contador de Coulter (Coulter Electronics).

Determinação de proteína; As concentrações de proteína foram determinadas usando o Estojo de Ensaio de Proteínas Bio-Rad (ligação de corante Azul de Coomassie) com a exeepção do material purificado em que as determinações da concentração se fizeram pelo método de Lowry e col., J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951). Como padrão, utilizou-se albumina de soro bovino em ambos os casos.

I i

I

molar

Chem,

Electroforese em gel de poliacrilamida: Realizou-se o ensaio com SDS-PAG3 pelo processo de U. K. Laemmli, Nature (Londres) 227, 660 - 685. A electroforese com gel de focagem do ponto isoeléctrico na presença de ureia 9,2 realizou-se pelo método de P. H. 0^TFarrell, J. Biol. 250, 4007-4021 (1975).

Quantificação rádio-isotépica: A contagem das cintilações do líquido realizou-se com um Contador de Cintilações Beckmann LS 6800. Para a auto-radiografia, expôs-se película Kodak XAR-5 a -70°C e revelou-se de acordo com as instruções do fabricante. A densimotria realizou-se usando um Densitómetro de laser 1KB. A densidade óptica total da escala foi regulada para 1,0.

Matrizes cromatográficas: Sephadex G-25, Sephadex G-75, BEAE Sephadex A-25 e Sepharose foram adquiridas à firma Pharmacia Chemicals. Biogel P-200 foi adquirido à firma Bio-Rad. As colunas TSK-G3000 SW foram compradas a Toya Soda.

Preparou-se aglutinina de gérmen de trigo (WGA)-Sepharose pelo método de Mintz e Glaser, Anal. Biochem., 97, 423-427 (1979). A capacidade de ligação da coluna era igual a 1,1 mg de ovumucóide/ml de gel. Preparou-se heparina-Sepharose a partir de heparina precipitada com cloreto de cetil-pirldínio e Sepharose-4B activada com brometo de cianogénio como foi descrito por R. D. Rosenberg e col. em J. Biol. Chem. 248, 6490-6505 (1973).

Radiomarcação da proteína: A radiomarcação da proteína com Na^^I realizou-se a 25°C com cloramina-T de acordo com o método de Greenwood e Hunter, Nature (London) 194, 495 (1962). A cromatografia realizou-se usando um caudal igual a 0,25 ml/minuto e colectaram-se fracções de 0,75 ml.

Indução de trombocitopenia imune e preparação plasma trombocitopénico: Obteve-se plasma trombocitopénico a partir

de coelhos brancos da Nova Zelândia (3 kg) que foram tornados agudamente trombocitopénicos (contagem de plaquetas inferiores a 5 % do normal) por injecção de 3 ml de antissoro de plaquetas anticoelho de cabra comprado à firma East Acres Biologicals (Southbridge, Mass., Estados Unidos da América) numa veia da orelha. A injecção de antissoro não provocou nenhum efeito significativo sobre as contagens de hesatócritos nem de glóbulos brancos. As contagens dos glóbulos brancos e das plaquetas realizaram-se pelo processo de Brecher e de Cronkite em J. Appl. Physiol. 3, 365-377 (1950). Colheu-se o sangue 4 horas depois da injecção por punctura cardíaca (aproximadamente 70 ml/coelho). Neste momento, as contagens das plaquetas

3 tinham descido de 500 000/mm^J para 20 000/mm . As amostras foram obtidas com seringas que continham citrato de sódio a 3,8 % (9 partes de sangue j 1 parte de solução de citrato) e centrifugados a 3 000 x g durante 20 minutos a 4°C.

Medição da actividade de MSF

A actividade de MSF foi ensaiada como se descreve em seguida usando ou uma linha de células RPM ou medula óssea isentada da maior parte dos megacarióeitos maduros por elutria ção centrífuga em contracorrente e centrifugação com gradiente de densidade de Percool e selectivamente enriquecidas nos megacarióeitos citoplasmicamente imaturos. A incorporação de (^C)-leucina na proteína dos alfa-grânulos específica das plaquetas, factor de plaquetas 4, assim como a incorporação de S-sulfato nos proteoglicanos das plaquetas sintetizados pelos megacarióeitos em amadurecimento são controladas para servir como marcadores da maturação citoplasmática. A incorporação de ambos os radiomarcadores nos componentes das plaquetas sintetizadas por megacarióeitos específicos é aumentada de três vezes de uma maneira que depende da dose pelo factor de estimulação de megacarióeitos purificado (MSF) sem se

verificar um aumento cocomitante da síntese geral de proteína, 0 factor de plaquetas 4 de ratazana é especificamençe isolado e caracterizado peJa sua elevada afinidade em relação a heparina-Sepharose e pela sua identidade da sequência de amino terminal com o facto?de plaquetas 4 humano e do coelho. Cs proteoglicanos marcados com ^S-sulfato são primariamente compostos por glicosaminoglicanos de 4-sulfato de condroitina e são identificados como componentes dos grânulos de plaquetas pela sua secreção pelos megacariócitos em resposta a trombina ou a A23187. A incorporação do marcador demonstra que o MSF purificado regula a síntese de componentes de grânulos de plaquetas por megacariócitos e sugere que este factor pode ser necessário para controlar a velocidade e/ou a extensão do desenvolvimento citoplasmático durante a maturação dos megacariócitos.

As células de promegacarióeitos de ratazana (RPM) usadas no ensaio foram isoladas e clonadas a partir de medula óssea duma ratazana Long-Evans por Cicoria e líempling na Universidade de South Caroline. Estudos prévios caracterizaram a célula RPM como um progenitor da linham de megacariócitos visto que contém diversos marcadores específicos das plaquetas tais como antigene relacionado com o factor VIII, fibrinogénio e acetilcalineesterase. Estes estudos demonstraram também que a célula RPM possui outras características do megacarióO eitos tais como a capacidade de adsorver (“'O-setrotonina por um mecanismo que pode ser induzido por trombina e a sua capacidade para segregar substâncias mitogénicas potentes.

Os efeitos do MSP purificado sobre a síntese de componentes de alfa-grânulos de plaquetas in vitro foram também ensaiadas em megacariócitos de ratazanas isolados. A elu triação e a centrifugação com gradiente de densidades de PercolL foram usadas para se obter uma população de megacariócitos,

Meg-P, que eram citoplasmaticamente não desenvolvidos como

foi evidenciado por microscopia luminosa e electrónica. A população de Meg-D possui inúmeras características de megacariócitos imaturos incluindo uma distribuição de relação volume do núcleo:volume do citoplasma relativamente,grande relativamente poucos grânulos de plaquetas e um sistema canalicular ligado superficialmente fracamente desenvolvido. No entanto, a análise da sua extensão de ploidização por citometria sob caudal demonstra que Meg-B tem a meema distribuição ploídica que líeg-Lt, a população mais madura de megacariócitos isolada por elutriação e centrifugação de densidade de Percoll. Observou-se que a população de Meg-D amadureceu durante a cultura in vitro a curto prazo com a aparência de grânulos e o extenso sistema de membrana canalicular aberta ligada superficialmente assim como por uma diminuição substancial da distribuição de volume do núcleo:volume do citoplasma, indicando que a população tinha completado o processo de poliploidização mas ainda não gerou a maior parte do seu complemento final de componentes citoplasmáticos específicos das plaquetas.

Ensaio de RPM relativamente à actividade de M5F

Centrifugaram-se células de RPM, ressuspenderam em Meio Mínimo de Eagle isento de leucina contendo 10 % de soro de feto bovino e semearam-se em placas com 24 depressões com uma densidade de 3 x IO³ por mililitro (1 ml/depressão). Realizaram-se duas a nove determinações incluindo o controlo, depressões adicionaram-se quantidades variáveis das fracções de proteína a ser ensaiada, sendo o volume total adicionado inferior a 100 microlitros. Utiliza-se plasma normal identicamente fraccionado como controlo para o material precipitado com sulfato de amónio derivado do plasma trombocitopénico. guando se ensaiam amostras mais purificadas, as fracções são iiluídas com um veículo de proteína (0,6 mg de albumina de ovo/

/ml) antes de se misturar com as células a fim de se minimizar a adsorção não específica. Adiciona-se um volume igual de solução veicular às culturas de controlo, Subsequentemente, a cada depressão adicionam-se 20 microcuries de (^A^-leucina (340 mCi/mmole) e incuba-se as placas durante 24 horas. Transferem-se as células para tubos de polipropileno e centrifuga-se a 400 x g durante 5 minutos a 25²0. Re:, ovem-se os sobrenadantes isentos de células e rejeitam-se. As células assim obta das são de novo suspensas em 1 mililitro de P^/salina. A fim de se determinar os números de células dentro de cada tubo, diluem-se 200 microlitros de células ressuspensas com 10 mililitros de P^/salino e contam-se num Contador de Coulter. Aos SOC microlitros de células suspensas que ficam em cada tubo adicionam-se 200 microlitros de NaGl 1,0 molar e 50 microlitros de veículo semelhante a PF4 não marcado (0,2 mg/ml em NaCl 1,0 molar) (/NaCl/ final = 0,4 molar). As suspensões de células são em seguida arrefecidas a 4⁹C, submetidadas à acção de ultrassons durante 30 segundos com a potência de 30 watts e centrifugada a 10 000 x g durante 5 minutos a 4^S para separar os fragmentos das células. Os lisados resultantes são aplicados a colunas com 1,0 militro de Sepharose-heparina equi libradas com tris-HCl 0,01 molar, NaCl 0,5 molar, de pH 8,6. Lavam-se as colunas com tampão de equilíbrio com um caudal de 6,0 ml/hora até as contagens radioactivas que são eluídas de cada coluna individual serem menores que 150 cpm/50 microlitros. As contagens radioactivas que ficam ligadas às colunas são eluídas com um único gradiente linear desde NaCl 0,5 molar até NaCl 2,0 molar em tris-HCl 0,01 molar, pH 8,6 (15 ml/ /reservatório/coluna) e colectam-se fracções de 1,25 mililitros.

Os perfis de eluição radioactiva do material que sai de cada coluna de Sepharose-heparina durante o gradiente de NaCl 0,5 molar até 2,0 molar demonstra a presença dum único pico radioactivo por cada coluna que é eluído a uma condui

tividade que corresponde a /NaG17- 1,0 molar. A proporção de estimulação é avaliada de duas maneiras: 1) pelo quociente entre as contagens radioactivas no pico de MaCl 1,0 molar das amostras de células que são incubadas com fracções de proteína derivadas de plasma trombocitopénica pelas contagens no pico 1,0 molar da amostra de controlo acima mencionada; e 2) pelo quociente das densidades ópticas de autorradiogramas das proteínas semelhantes a PF-4 depois de SDS-PAGE de amostras de células estimuladas e de controlo.

Sm geral, o aumento observado por meio da densitometria é ligeiramente maior do que o observado por intermédio das contagens radioactivos possivelmente devido à ligação de proteínas radiomarcadas não semelhantes a PF4 nas colunas de Sepharose-heparina. 0 estímulo é aproximadamente igual a 3,1 vezes quando determinado pelo primeiro método e aproximadamente igual a 5,2 vezes quando determinado pela segunda técnica. A adição desta actividade estimulante às culturas de células RPM não tem absolutamente nenhum efeito sobre a velocidade de crescimento das células (tempo de duplicação = 24 horas). Bla também não altera a incorporação de radioactividade na proteína determinada pela medição das contagens precipitáveis com ácido tricloroacético.

factor estimulante de megacariócitos (MSF purificada apresenta uma capacidade, dependende da concentração, para aumentar a síntese de protéinas semelhantes a (PF4) quando apreciado pelo ensaio das células de promegacarioblastos de ratazana (RPM). 0 estímulo máximo varia entre 4 e 7 vezes dependendo do método de quantificação. Os resultados mostram que metade do estímulo máximo ocorre a uma concentração de 0,0125 ng/ml (0,8 pM); o estímulo máximo médio é igual a cerca de 3,9 vezes e a proporção máxima de estímulo mantém-se relativamente constante a concentração de MSF de até 0,625 ng/ /ml (41,7 pM). Além disso, esta substância retém a actividade biológica completa durante um ano se fôr armazenada a -80°C.

Determinam-se as curvas de resposta à dose para os produtos obtidos em cada uma das fases dos processos de purificação. Uma diminuição acentuada na resposta estimulatória ocorre para as fracções menos purificadas quando as suas concentrações no ensaio são suficientemente altas, como é evidenciado pela curva de resposta à dose determinada para urna fracção de sulfato de amónio a 60 - 80 % preparada a partir de plasma trombocitopénico. Os valores para a parte ascendente das curvas de resposta adaptam-se bem a uma linha recta determinada com base na análise dos quadrados mínimos dos valores. Uma unidade de actividade biológica é portanto definida como quantidade de factor que origina um estímulo igual a metade do máximo da porção ascendente duma dada curva de resposta à dose.

Ensaio de megacariócitos isolados da ratazana relativamente à actividade de MSF

A capacidade de MSF para estimular a biossíntese de PF4 e'examinada usando megacariócitos preparados a partir de ratazana derivadas de Sprague-Dawley (CD) (Charles River Breeding Laboratories, Inc., 'Wilmington, MA, Estados Unidos da América) com a idade de 2 1/2 a 5 meses. Medula do osso obtida a partir de 12 animais anestesiados com éter é suavemente retirada de cada tíbia e fémur para dentro duma cápsula de Ptri esterilizada contendo tampão de HATCH (uma modificação do meio de CATCH (J. Cell. Biol., 69; 159 - 172 (1976)), solução salina equilibrada de Hahk: isenta de cálcio e magnésio contendo adenosina 1 mM, tiofilina 20 mM e citrato de sódio a 0,38 % e mais HEPES 10 mM, dextrose a 0,1 albumina de soro de boi a 0,5 % e 0,15 % de unidades de apirase/ml. A medula é extraída com uma agulha do tamanho 18 por diversas vezes, fil trada através de redes de malhas de nylon com 155 micron (Spectramesch, Spectrum Medicai In., los Angeles, \ik_t Estados Unidos da América) e diluída com tampão de EAIOH de maneira a obterem 2 a 5 x 1C³ células/ml para introduzir na câmara de separação de Sanderson dum sistema de elutriação de Beckman (Eeckmen Instruments, Inc., Paio Alto, CA, Estados Unidos da América). Antes de ser utilizado, o sistema é esterilizado com uma solução de etanol a 70 /, lavado com água destilada esterilizada e preparado com tampão de HATCH. Depois de 2 a 5 x

O células de medula terem sido carregadas para o sistema usando um caudal de tampão igual a 12 a 15 ml/minuto à temperatura de 18°C e, a uma velocidade de rótor de 1400 rotações por minuto, lava-se com 80 a 100 mililitros com um caudal de 20 a 25 mililitros/minuto. As células arrastadas para fora da câmara de elutriação com caudais de 12 a 15 ml/minuto e 20 a 25 ml/minuto são designadas como fracções 1 e 2, respectivamente. Neste momento, inverte-se o caudal de passagem do tampão para remover a população de células enriquecidas em megacariócitos da câmara de separação através da tubagem de entrada. As operações de carregamento e de contralavagem são repetidas até todas as células de medula terem sido elutriadas. As suspensões de células enriquecidas em megacariócitos são reunidas e colectadas em tubos de centrifugação de plástico esterilizados conservados em gelo.

As suspensões de células enriquecidas em megacariócitos reunidas são centrifugadas a 400 x g durante 10 minutos a 4°C e ressuspensas numa solução de Percoll (Fharmacia Fine Chemicals, Piscataway, MJ, Estados Unidos da América), diluídas com meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DEEM) até uma massa volúmica final igual a 1,050 g/cm . Prepara-se um gradiente descontínuo com três fases aquosas: 10 mililitros de tampão de HATCH, 15 mililitros de suspensão de células em Fercoll com 1,050 g/cm e 15 mililitros de Percoll com 1,085 g/cm em tampão de HATCH. Os gradientes são centrífuga-

- dos a 18^0 durante 20 minutos a 400 x g e as células são colectadas em três fracções. A população de células enriquecidas em megacariócitos mais leve (Keg-It) é colectada da interface entre a fase de Percoll com 1,050 g/cnr e a fase de tam5 pão que a recobre (massa volámica menor que 1,050 g/cnr). A população de megacariócitos mais densa (Heg-D) consiste na camada de células que se forma na interface entre as duas fases de Percoll, assim como as células existentes na camada de Per·· O coll com 1,050 g/cm sobrejacente. A fracção da pelete consiste em células existentes na camada de Percoll com 1,085 g/cm^ e inferior. Cada população de células é diluída quatro vezes e lavada uma vez por centrifugação (400 x g, 8 minutos, 4°C) com tampão de HATCH e uma vez com DMEM para remover a solução de Percoll. As células são contadas numa câmara dum hemocitómetro ou usando um contador Coulter (Coulter Electronics).

Os diâmetros das células são determinados com um micrómetro óptico calibrado e calcula-se a massa citoplásmica dos megacariócitos como uma proporção da massa total de células da cultura. Podem-se reconhecer morfologicamente com certeza como megacariócitos as células com o diâmetro igual ou maior que 12,5 micron e a sua identidade ser confirmada relativamente à sua actividade por manchamento com acetilco linesterase durante 6 horas de acordo com o método de Karnovsky e Roots, J. Histochem, Cytochem., 12, 219 - 221 (1964) modificado por Jackson, Blood 42, 413 - 421 (1973). A quantificação da actividade de acetilcolinesterase de megacariócitos realíza-se de acordo com o método de Ellman e col. Biochem. Pharmac. 7, 88 - 95 (1961), modificado por Burstein e col. J. Oell Physiol. 122, 159 - 165 (1985). Analisam-se suspensões enriquecidas com megacariócitos cultivados ou recentemente isolados relativamente ao grau de ploidia por citometria bidimen* sional de passagem como descrito por Jackson, Blood, 63, 768 778 (1984).

Os megacariócitos isolados são suspensos em Meio de Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM) contendo 10 % (volume/volume) de soro de cavalo (Grand Island Biological Co., Grand Island, NI, Estados Unidos da América ou em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco suplementado com HEPES 10 mM. As suspensões de megacariócitos são cultivadas em placas com 24 depressões (Costar, Cambridge, MA, Estados Unidos da América) em 1,5 ml de meio de cultura com 5 % de CO^ a 37°C durante períodos de até 3 dias.

Para marcar radioactivamente as proteínas de megacariócitos, incubam-se as células durante as últimas 24 horas de cultura na presença de 40 microC/ml de (^Cj-leucina (New England Nuclear, Boston, MA, Estados Unidos da América contendo 10 % de soro de cavalo, MSF e mais 10 % de meio condicionado por cultura de megacariócitos antes do período de marcação radioactiva. A fim de marcar radioactivamente proteoglicanos de megacariócitos, adiciona-se à cultura SO^ isento de veículo em DMEM ou IMDM isentos de sulfato contendo soro de cavalo, MSF e meio condicionado.

Depois da cultura, adiciona-se EDTA dez milimolar, 100 unidades de aprotinina por ml e 10 microgramas de inibidor de tripsina de soja por ml, centrifugam-se as células de megacariócitcs isoladas a 400 x g durante 10 minutos e ressuspendem-se em 100 microlitros de tampão de HATCH. Adiciona-se proteína veicular (50 microgramas) preparada a partir de PF4 de plaquetas de ratazanas não marcadas radioactivamente, submetendo as células a lise em NaCl 1,5 molar (por adição de um volume igual de NaCl 3 molar), submete-se à acção de ultrassons e centrifuga-se a 10 000 x g durante 3 minutos para remover os fragmentos celulares. Precipitam-se alíquotas com ácido tricloroacético, neutraliza-se com NaOH 1 normal e contam-se as cintilações num Contador de .intimações 3eckman LS 6800 usando fluído de cintilações Ultrafluor (Nattonal Diagnos tics, Somerville, NJ, stados Unidos da América). As restantes suspensões de células lisadas com um elevado teor de sal são diluídas até Nall C,15 molar e purificadas por cromatogra·· fia de afinidade com Sepharose-heparina. A quantificação de PF4 marcado radioactivamente na coluna de Spharose-heparina é então utilizada para determinar a taxa de síntese de P?4 em função de KSF em culturas de megacariócitos a curto prazo.

Os estudos estruturais mostram que ο PP4 de ratazana é bastante homólogo do PP4 humano e de coelho, respectivamente. A maior espécie molecular de PP4 de megacariócitos marcado radioactivamente isolada por cromatografia com Sepharç se-heparina possui características de tamanho e carga idênticas a PP4 de ratazana como se pode apreciar por electroforese bidimensional e possui epítopos inumoquímicos semelhantes a PF4 de ratazana como julgado por análise de mancha de imunidade e precipitação com anticorpos dirigidos contra a última proteína de grânulos alfa. A molécula de PF4 de plaquetas de ratazana predominante tem um M aproximadamente igual a 9-570 por análise de aminoácidos e com SDS-PAGE. No entanto, encontra-se frequentemente presente uma forma de peso molecular igual a 19 000 dalton em quantidades variáveis e provavelmente representa um dímero não dissociável da espécie de menor peso molecular.

Prepara-se antissoro para PF4 para uso em análise imunoquímica a partir de coelhos inicialmente inoculados com uma mistura 1:1 de 50 a 100 microgramas de PF4 de ratazana ou em adjuvante de Fremd completo (Grand Island Biological Compa-ny, Grand Island, ΠΥ, Nstados Unidos da América) e subsequentemente em adjuvante de Freund incompleta em intervalos semanais. Retira-se sangue dos coelhos na veia da orelha periodicamente para se controlar o nível de anticorpos produzidos. Quando se usa antissoro não fraccionado na análise por imunomancha de lisados de plaquetas integrais, sõ aparecem duas

bandas com os mesmos pesos moleculares que o PF4 da ratazana purificado. Ambas as espécies do Pf4 de ratazana purificado são reconhecidas por anticorpos preparados contra qualquer das espécies de pesos moleculares e fraccionados por afinidade em Sepharose 2B com conjugado de Pf4.

A comparação dos autorradiogramas e dos cromatogra mas manchados por imunidade do material segregado por activação da trombina com os do material que fica na pélete de células revela a presença de proteínas de maior peso molecular na pelete que podem ser formas precursoras ainda não empacotadas para a secreção no grânulo alfa do megacariócito. Estão taimbém presentes proteínas não-imunorreactivas em pequenas quantidades e são indubitavelmente devidas a contaminantes em quantidade menores. Os níveis de PF4 de ratazana produzidos por megacariócitos são determinados isolando componentes marcados com destas células poliplóides por cromatografia em heparina-Sepharose e quantificando as quantidades de componentes radiomarcados presentes dentro das regiões apropriadas dos autorradiogramas SDS-PAG-E por varrimentos densitométricos.

MSF estimula a síntese de PF4 de ratazana por megacariócitos poliplóides cultivados de uma maneira que depende da dose sem alternar a extensão da síntese geral de proteína nem a viabilidade das células dentro das culturas. 0 efeito estimulante máximo sobre a síntese de PF4 é igual a cerca do triplo em resposta a 0,625 ng/ml de MSF.

PF4 humano é empacotado em grânulos alfa de plaquetas com um veículo de proteoglicano sulfato de condroitina num complexo estequiométrico que consiste em 8 moles de PF4 e 2 moles de proteoglicano. Os megacariócitos de ratazana absor vem -'-'S-sulfato rapidamente tanto em condiçoes in vivo como in vitro e incorporam-se nos componentes da membrana e de grânu los alfa. 0 sulfato de condroitina foi identificado como sendo o glicosaminoglicano sulfatado mais importante presente nas

Cl·*·*»* plaquetas de ratazana, Ο Γ3Ρ estimula a protecção do veículo de sulfato de condroitina assim como de PP4 de ratazana. Cul-

os meios de cultura foram extensivamente proteolisados e uiilizou-se a cromatografia com DEAE-Sephadex para se isolar os glicosaminoglicanos. 0 produto final é predominantes ente 4· -sulfato de condroitina. Uma proporção tão elevada como 7l ído 4-sulfato de condroitina radioactivamente marcado é especificamente libertado dos megacariócitos cultivados pelos agonistas das plaquetas, o que indica que os glicosaminoglicanos se encontram presentes dentro dos grânulos. Sstes ensaios, re· petidos na presença de várias concentrações de MSF revelam que a síntese de 4-sulfato de condroitina é estimulada pelo facto: ’ acima referido de uma maneira que depende da dose sendo uma quantidade tão pequena como 0,625 ng/ml de MSP suficiente para aumentar a produção do glicosaminoglicano para cerca do trip lo.

Com base nestes resultados, o ESF é capaz ou de intensificar a síntese de maiores números de cadeias de 4-sulfato de condroitina por núcleo de protoglicano ou, mais provavelmente, aumentar a produção de maior números de proteoglicanos de 4-sulfato de condroitina dentro dos grânulos alfa de megacariócitos de ratazana em amadurecimento.

MSF purificado foi também ensaiado num sistema de coágulo de plasma concebido para medir as actividades do factor de estimulação de colónias (CSF). Actividade de blastos-unidade de formação-USP, de granulócito-macrófago-CSF ou megacariócito-QFnã) são detectadas quando se adiciona 0,025 ng/ /ml do factor de estimulação ao sistema de ensaio. Além disso, o MSF não é activo no ensaio mitogénico 3T3 e o gama-interferão puro não é potente no ensaio de KSF.

Purificação de proteína MSF a partir de sobrena-

ÍaN>~ dantes de células de rins de embriões humanos (HBK)

Todas as operações do modo operatório de purificação se realizam a 4°C, a não ser que se especifique outra temperatura. Concentram-se os sobrenadantes (15 litros/semana, 0,5 mg/ml) 300 vezes usando um sistema de ultrafiltração com cassete PeDicon (líillipore), precipita-se crm sulfato de amónio a 80 / da saturação, centrifuga-se a 15 000 x g durante 20 minutos e armazena-se a -70°C. Depois duma acumulação durante seis semanas, as pletes são ressuspensas em 120 mililitros dum tampão contendo tris-HCl 0,05 molar, NaCl 0,15 molar, pH 7,4 (tampão A) e fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 milimolar e dialisa-se contra 3 mudanças de 4 litros de tampão A. Depois da diálise, separa-se a matéria insolúvel que corresponde a 90 / da proteína inicial por centrifugação a 5000 x g durante 10 minutos a 4°C.

Divide-se em alíquotas o material obtido a partir da operação de tratamento com sulfato de amónio (5 696 mg, 400 mililitros). Aplica-se cada alíquota a colunas contendo 25 ml de WGA-Sepharose equilibradas com tampão A. As colunas, operadas a um caudal igual a 10 mililitros/minuto, são lavadas com o tampão de equilíbrio até que Α₂θθ seja menor que 0,02 e depois eluídas com quitina-oligossacáridos preferivelmente trímeros de N-acetilglucosamina, a uma concentração igual a 12 milimolar (concentração da extremidade redutora, número médio de unidades de sacárido/extremidade redutora = = 2,5) em tampão A. A proteína activa eluída na operação de eluição com WGA-Sepharose (25,3 mg, 0,3 mg/ml) é concentrada sob pressão reduzida usando uma membrana de ultrafiltração YM5 (Amicon).

volume final, aproximadamente 8 ml, é dividido em alíquotas de 2,0 mililitros, cada uma das quais é aplicada a uma coluna contendo Biogel F200 (120 cm x 1,4 cm de diâme-

iro, 185 mililitros) equilabrada com tampão A, um tampão com / uma força iónica relativamente grande. A cromatografia realiza-se a um caudal igual a o mililitros/hora e colectam-se frac ções de 4 mililitros. Reunem-se as fracções apropriadas e concentram-se em sacos de diálise que são postos em contacto com Sephadex G-75 seco. C concentrado da operação com P20C (5,0 ml, 0,7 mg/ml) é dialisado contra tampão A e cromatografado numa coluna de exclusão (7,5 mm x 60 mm) TSK-G3000 por cromatografia em fase líquida sob alta pressão (HP10). Realizam-se injecções múltiplas de 300 ml. As colunas são equilabradas com tris-HCl 5 milimolar, pH 7,2, um tampão com pequena força iónica, com um caudal de 1,0 ml/minuto.

Na Tabela 1, encontram-se indicados os valores obti dos num ensaio de purificação de MS? usando precipitação com sulfato de amónio, cromatografia de afinidade com WGA-Sepharose, filtração através de gel Biogel P200 e cromatografia com filtração através de gel HLPC em TSK G3000. Os resultados apre sentados representam a média de três fraceionamentos diferentes

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TABELA 1 Purificação de MSP de células de

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Resumindo, a precipitação com sulfato de amónio e a subsequente diálise proporciona uma purificação de 3,2 vezes. A operação com WGA-Sepharose proporciona uma purificação de 70 vezes com a recuperação de oO y da actividade aplicada. 90 / da actividade estimulante é eluída da coluna contendo Biogel P200 no rebordo de saída do volume vazio. Esta operação proporciona uma purificação de 4 vezes e uma recuperação de £8 / da actividade aplicada, lais significativamente, a filtração com Biogel 1200 elimina os contaminantes de pequeno peso molecular que seriam difíceis de separar do produto final durante a subsequente cromatografia em 2SZ G30C0. A maior parte da actividade recuperável (maior que 90 f) é eluída comc um pico nítido de proteína com um peso molecular Tr = 9 COO e uma actividade específica = 1,4 x 1C unidades/mg numa coluna TSK G3C0 SW. Com base na actividade específica do produto final, o factor de purificação total conseguido usando esta maneira de proceder é igual a 7,5 x 10 .

Purificação de Plasma Trombocitopénico

Brepara-se plasma trombocitopénico (3C0 ml) a partir de coelhos que tinham sido previamente tornados agudamente trombocitopénicos mediante injecção de antissoro anti-pla•quetas, como se descreveu acima. A actividade específica deste material de partida é igual a 0,33 unidade/mg. A combinação de fraccionamento com sulfato de amónio, cromatografia em UGA-Sepharose e cromatografia com filtração em gel TSK permite 7 que 0 MSF seja purificado cerca de 1,44 x 10 vezes a partir ie plasma trcmbocitopénico com uma recuperação global da actividade aplicada igual a cerca de 45 /. Betecta-se mais que 90 % da actividade biológica na região do perfil Α₂γθ da coluna 2SK-3OOO correspondendo a proteína com l'_r = 9 000. Recupera-se aproximadamente 0,4 micrograma de proteína com uma actividade aspecífica igual a 4,8 x 10^ unidade/mg. Esta actividade espe-

cífica é 3 vezes menor do que a obtida em sobrenadantes de células de IÍEK.

Na presente invenção preparações fisicamente homogéneas de factor de estimulação de megacariócitos (NSF) isoladas a partir do meio de produção de células de rins embriónicos humanos ou a partir de soro trombopoiético mostram que concentrações picomolares de NSF são capazes de estimular a síntese de factor de plaquetas 4 e do veículo de sulfato de condroitina que se encontram nos grânulos alfa de plaquetas e de megacariócitos. Com base nesse facto, hipotetizou-se que o NSF é envolvido de maneira crítica na regulação da capacidade funcional de plaquetas em circulação pelo seu efeito sobre a síntese de componentes de grânulos específicos de plaquetas na medula dos ossos. Segue-se que o factor purificado tem múltiplas aplicações na prática incluindo o tratamento de pacientes trombocitopénicos, pacientes com saramento diminuído de feridas e no desenvolvimento de drogas e anticorpos para uso na regulação da actividade IÚSF in vivo.

As sequências de nueleótidos quer de DNA quer de cDNA que codificam o KSF podem ser isolados por métodos conhecidos pelos técnicos no assunto. 0 gene é mais difícil de isolar do que muitos outros porque é isento de metionina e a região N-terminal é bloqueada.

método preferido usado para isolar o gene ou outras sequências de nueleótidos que codificam 1’SF é o seguinte. Prepara-se RNA total a partir de 5 x 10 células de HEK que estão a produzir KSF como se determina pelos ensaios previamente descritos por extracção com guanidina-líCl. Extrai-se então RNA poliadenilado por dois ciclos de cromatografia em oligo(dT)-celulose. Sintetizam-se cDNAs de primeira fibra com transcriptase inversa usando oligo(dí) como primário e gera-se cDNA de segunda fibra com polimerase e ribonuclease H de DNA de E. coli de acordo com o método de Okayama e Berg, I.'ol. Se 11

Biol. 2, 161 - 170 (1982), modificado por Gubler e noffman, Gene 25, 263-269 (1983) com a diferença de se empregar Actinomicina D na mistura reaccional final a uma concentração de 50 mg/ml. Para produzir extremidades cegas utiliza-se polimerase de DNA de Os cCDNAs reparados são acoplados a ligantes

EcoRI sintéticos depois da protecção dos sítios internos com EcoRI-metilase. Os CDNas ligados aos ligantes são digeridos com EcoRI e separados de ligantes livres usando cromatografia com Sepharose CL 43. Este material é então ligado ao vector de expressão 1 GT11 do fago tratado com fosfatase alcalina digerido com EcoRI, empacotado ín vitro e placado na estirpe hospedeira E. coli Y1088 (Gene 25, 263 - 269, (1983); DNA Cloning techniques; A praticai aproach, eds. D. Glover (IRL Presí Oxford, 1984); Science 222, 778 - 782 (1983)).

Para detectar clones de bactérias que possuem pro teína de fusão de KSF pode-se utilizar heteroanticorpo IgG MSF anti-ratazana de coelho. Para esta finalidade, podem-se separar clones recombinantes como placas de fago na estirpe hospedeira Ξ. coli Y1090 de acordo com a técnica de Young e Davis, Science, 222, 778 - 782 (1983). As placas candidatas podem então ser submetidas a várias séries de operações de separação imunoquímicas e de purificação da placa. As proteínas de fusão podem ainda ser caracterizadas preparando lisogenes de 1GT-MSF e 1GT11 não recombnante na estirpe hospedeira de

E. coli Y1089, como descrito por Young e Davies, Proc. Natl, Acad. Sei. USA 80, 1194 - 1198 (1983). 0 fago é induzido alterando a temperatura para 45⁵C para inactivar o repressor e a produção de b-galactosidase ou de proteína de fusão iniciada com IPTG a uma concentração final igual a 5 ml'. Os Usados de células são precipitadas a 4²C com 33 % (em volume/volume) de sulfato de amónio saturado e depois examinados por SP S-PA GE assim como com análise de mancha de Western, utilizando heteroanticorpo IgG MSF anti-ratazana fraccionado por afinidade seguida por IgG anti- coelho marcada com ouro como descrito nas instruções do fabricante.

DNA isolado do fago recombnante pode ser submetido a digestão com EcoRI para se obter fragmentos de inserto, subclonados em M13mp8 e sequenciado pelo método de terminação da cadeia de didesoxi de Biggin e col., Proc. Natl, Acad. Sei. USA, 80, 2963 - 3965 (1983). Caso isso seja necessário, os insertos.podem ser usados para resseparar a livraria de cDNA pela técnica de Benton e Davis, Proc. Natl, Acad. Sei. USA, 80, 1194 - 1198 (1983) a fim de se obter clones com comprimento completo.

A confirmação da estrutura de IESF é conseguida clivando a proteína com enzimas proteolíticas como por exemplo tripsina, separando os polipéptidos resultantes por líPlC em fase inversa e determinando a sequência de aminoácidos dos con ponentes por sequenciamento em fase gasosa. No caso improvável de as amostras de heteroanticorpos não serem capazes de identificar clones com insertos de MSF, os dados da sequência de amino ácidos obtidos com MSF são empregados para planear oligonucleótidos apropriados de tal maneira que estas amostras podem ser utilizadas para obter os recombinantes iniciais com insertos de MSF. A tentativa para isolar clones de comprimento completo é depois idêntica ao método acima esboçado.

Estas sequências de nucleôtidos podem ser usados para produzir MSF em organismos geneticamente planeados. 0 gene pode também ser modificado para produzir MSF com actividade alterada.

Muito embora a presente invenção tenha sido descrita com referência às suas formas de realização preferidas, outras variações e modificações são óbvias para os peritos no assunto. Pretende-se incluir todas essas variações e modificações dentro do âmbito das reivindicações anexas.

Claims (33)

1. REIVINDICAÇÕES ia, - Processo para a preparação dum factor de estimulação de megacariócitos purificadp, mediante isolamento, caracterizado pelo facto de compreender as seguintes operações:

   a) a preparação duma solução isenta de células compreendendo proteinas de promegacarióeitos e de megacariócitos incluindo um facto de estimulação de megacariócitos;

   b) a precipitação do referido factor a partir da mencionada solução com sulfato de amónio a uma concentração superior a 50 % da saturação;

   c) a aplicação da proteína solúvel resultante da citada precipitação com sulfato de amónio a uma coluna de lectina-Sfepharose;

   d) a eluição do referido factor da mencionada coluna de lecti·na-Sepharose com uma solução compreendendo quitina-oligossacáridos;

   e) a aplicação das fracções eluídas da coluna de lectina-Sepharose contendo o citado factor a uma coluna cromatográfica de exclusão do tamanho; e

   f) a recolha das fracções eluídas contendo o referido factor.
2. 2^â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a mencionada solução ser plasma trombocitopénico.
3. 3^â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender ainda a cromatografia das fracções contendo o citado factor proveniente da coluna de exclusão de tamanho numa coluna de exclusão do tamanho de cromatografia em fase líquida sob alta pressão (HPIO).
4. 4^a. - Processo de acordo com a reivindicação 3, ca racterizado pelo facto de a referida solução ser constituída por meio de cultura de células de rins de embriões humanos.
5. 5^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo facto de se adicionar sulfato de amónio à mencionada solução até 80 da saturação.
6. 6^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o enchimento de lectina-Sepharose da citada coluna ser aglutinina de gérmen de trigo-Sepharose.
7. 7^a. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de se eluir o referido factor com uma solução que compreende trímeros de N-acetil-glucosamina.
8. 8^a. - Processo de acorde com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a mencionada coluna de exclusão de tamanho possuir capacidade de exclusão de 200 COO dalton.
9. 9^a. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se eluir o citado factor a uma elevada força iónica.
10. 10^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida coluna de exclusão de tamanho de cromatografia em fase líquida de alta pressão ser uma coluna TSK-G3000.
11. 11^a. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de se eluir o citado factor a uma pequena força iónica.
12. 12^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se obter um factor de estimulação de megacariócitos purificado tendo um peso molecular igual a 15 000 dalton de acordo com SDS-PÁGE e um ponto isoéLéctrico igual a 5,1 que estimula a síntese de proteínas em células da linhagem de megacariócitos.
13. 13^a. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de o referido factor apresentar a actividade semimáxima a uma concentração da ordem de grandeza de 0,8 pM.
14. 14^a. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de o mencionado factor compreender hidrato de carbono.
15. 15®. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de se purificar o citado factor a partir de meio condicionado isento de soro de células de rins de embriões humanos cultivadas.
16. 16^a. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de se isolar o referido factor a partir de plasma trombocitopénico.
17. 17^a* - Processo para a obtenção de factor de estimulação de megacariócitos purificado, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de compreender as operações que consistem em

    a) obter-se uma solução compreendendo proteínas de promegarió eitos e megacariócitos, incluindo o factor de estimulação de megacariócitosj

    b) precipitar-se o referido factor na mencionada solução de proteínas com sulfato de amónio a uma concentração maior do que 50 % da saturação;

    c) aplicar-se a proteína solúvel depois da citada precipitação com sulfato de amónio a uma coluna de cromatografia contendo lectina-Sepharose;

    d) eluir-se o referido factor com uma solução contendo quitina-oligossacáridos;

    e) aplicar-se o eluente concentrado proveniente da mencionada coluna de cromatografia contendo lectina-Sepharose e que contém o referido factor a uma coluna de cromatografia de exclusão dos tamanhos;

    f) cromatografar-se o mencionado eluente aplicado e

    g) colectar-se as fracções que contêm o citado factor.
18. 18^a. - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de, ao isolar-se o referido factor, se separar ainda por cromatografia as mencionadas fracções que contêm o citado factor provenientes da coluna de exclusão do tamiio numa coluna de exclusão de tamanho de HPIC (cro matografia em fase líquida sob alta pressão).
19. 19^a. - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de se eluir o referido factor de uma coluna de aglutinina de gérmen de trigo-Sepharose com uma solução que compreende trímeros de N-acetil-glucosamina.
20. 20^a. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de a columa de exclusão do tamanho possuir uma propriedade de exclusão de peso molecular na gama de 200 000 dalton.
21. 21^a. - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de se eluir o mencionado factor com um tampão de grande força iónica.
22. 22^â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a coluna de exclusão de tamanho de cromatografia em fase líquida sob alta pressão (HPLC) ser uma coluna de exclusão de tamanho de PSX G 3000.
23. 24-. - Processo para a obtenção duma sequência de nucleótidos que codifica um factor de estimulação de megacariócitos, caracterizado pelo facto de originar uma proteína com um peso molecular de 15 000 dalton no ensaio de 3DS-PAGE, um ponto isoeléctrico de 5,1 e estimular a síntese de proteínas em células promegacrioblásticas.
24. 25^â. - Processo de acordo cora a reivindicação 24, caracterizado pelo facto de se obter a referida sequência derivada dum gene que tem a extremidade N bloqueada e é isenta de metionina.
25. 26%, - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo facto dé se isolar RNA de células que produzem factcr de estimulação de megacariócitos;

    se sintetizar cDNA a partir do mencionado PNA;

    se ligar o citado cDNA a um vector de expressão do fago;

    se embalar e introduzir o referido vector numa célula hospedeira apropriada;

    se ensaiar e escolher as mencionadas células hospedeiras relativamente à produção de proteínas do factor de estimulação de megacariócitos; e se isolar e sequenciar DNA a partir das citadas células que produzem proteína do factor que estimula megacariócitos.
26. 27^&. - Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo facto de a referida sequência ser identificada por amostras de oligonucleótidos que codificam partes da sequência de aminoácidos do factor de estimulação de megacariócitos.
27. 28^. - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo facto de se ensaiar e escolher as mencionadas células hospedeiras contendo DNA que codifica factor de estimulação de megacariócitos relativamente a anticorpos de factor que estimula antimegacariócitos.
28. 29^s. - Método para o ensaio da actividade de factor de estimulação de megacariócitos, caracterizado pelo facto de compreender cultivar-se células de megacariócitos;

    adicionar-se a solução a ser ensaiada;

    adicionar-se aminoácidos marcado com radio-isótopos a cada amostra de células;

    incubar-se durante aproximadamente 24 horas;

    lavar-se as células incubadas;

    efectuar-se a lise da suspensão das células a 4 0;

    aplicar-se o lisado a uma coluna de heparina-Sepharose equilibrada com tampão de tris-ITaOl a aproximadamente ph 8,6;

    lavar-se a coluna para remover o material radioactivo não ligado ;

    eluir-se o material radioactivo ligado com um gradiente linear de cloreto de sódio de aproximadamente C-,5 M de NaOl a 2,0 M de NaCl em tampão de tris a ph aproximadamente igual a 8,6;

    medir-se a radioactividade eluída; e determinar-se a quantidade de aminoácido marcado radioactiva37 mente incorporado.

    3Qâ, - rétodo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo facto de as células de megacariócitos serem preparadas por centrifugação das células de megacariócitos;

    ressuspensão das células em meio isento do aminoáido marcado com radio-isótopos contendo 10 ·' de soro de fetos bovinos; e sementeira das células em cavidade de placas de ensaio a uma densidade de aproximadamente 3 x 10 células por mililitro antes de se adicionar a solução a ser ensaiada.
29. 31?·. - 1'étodo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo facto de compreender comparar-se a incorporação de aminoácido marcado com radio-isótopos no caso da solução a ser ensaiada com a incorporação do aminoácido marcado com radioisótopos no caso duma solução de controlo.
30. 32^. - Nétodo para o ensaio de factor de estimulação de megacariócitos, caracterizado pelo facto de compreender isolar-se e lavar-se células de medula dos ossos; elutriai>-se as células da medula dos ossos isoladas e lavadas; separar-se as células por densit.ade usando a centrifugação em gradiente de densidade de Percoll;

    cultivar-se as células na presença da proteína a ser ensaiada e de aminoácido marcado com radio-isótopos durante aproximadamente 24 horas;

    adicionar proteínas semelhantes ao factor 4 de plaquetas não marcado com radio-isótopos;

    proceder à lise das células e à remoção dos resíduos celulares; e precipitar as proteínas no lisado com ácido tricloroacético; € proceder à contagem da radioactividade precipitada.
31. 33^δ. - Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo facto de as citadas células terem um peso O volúmico maior do que aproximadamente 1,050 g/cnr.
32. 34 * “ Mo todo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo facto de compreender ainda a adição de ^so 2- à cultura de células que contêm ar.inoácido marcado com radio-isótopos para marcar proteoglicanos de megacariócitos.
33. 35-. - Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo facto de compreender ainda a purificação das proteínas no lisado por cromatografia de afinidade com heparina-Sepharose.