NO160114B

NO160114B - Blanding for bruk ved ekstern paavisning og lokalisering av blodpropp.

Info

Publication number: NO160114B
Application number: NO821111A
Authority: NO
Inventors: Stephanie A Olexa; Linda C Knight; Andrei Z Budzynski
Original assignee: Temple Univ Of T Commonwealth
Priority date: 1981-04-02
Filing date: 1982-04-01
Publication date: 1988-12-05
Also published as: EP0063002B1; EP0063002A2; IE53340B1; EP0063002A3; DE3262006D1; NO160114C; DK161015C; CA1198671A; US4427646A; DK152082A; JPH0161087B2; JPS5813524A; NO821111L; ATE11372T1; IE820776L; DK161015B

Abstract

Fremgangsmåte ved lokalisering av blodpropper in vivo bestående av at man administrerer et radioaktivt mar-kert peptid valgt fra gruppen fragment E^ -isolert fra kryssbundet fibrin, fragment Eisolert fra kryssbundet fibrin, og peptider med en aminosyresekvens som ligger mellom fragmenteneog Eavledet fra kryssbundet fibrin ved plasminnedbrytning til et menneske eller dyr hvori peptidet selektivt innføres i eller bindes til en forut dannet blodpropp og utenfra påviser strålingen som emitteres fra det radioaktivt markerte peptid. En blanding inneholdende peptider som brukes for lokalisering av blodpropper er også beskrevet.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en blanding for bruk ved ekstern påvisning og lokalisering av blodpropper hos mennesker og dyr og nærmere bestemt inneholdende et radioaktivt merket peptid som angitt i krav l's karakteriserende del samt et farmasøytisk anvendelig bæremiddel som er egnet for intravenøs injeksjon.

Forstyrrelser i blodkoagulerings-systemet forekommer hos

en betydelig del av den menneskelige befolkning. Den mest vanlige av disse forstyrrelser er dannelse av blodpropp, aggregater dannet i et blodkar eller hjertehulerom som forblir ved dannelsespunktet. Blodpropper i hjertekar kan f.eks. forhindre blodstrømmen og føre til myokardialt infarkt (død av hjertemuskel), en av de alvorligste former for hjerte-anfall.

Dertil kan deler av en blodpropp eller hele blodproppen løsne fra sitt festepunkt og bevege seg gjennom blodkarene inntil det når et punkt hvor passasjen er innsnevret. Den resulterende plutselige blokkering av blodstrømmen er kjent som thromboembolisme. En del av sirkulasjonssystemet som særlig er gjenstand foremboli-dannelse er lungene, det første punkt hvor arterier deler seg i mindre arterier og kapillarårer etter at hjertet har mottatt blod fra venesystemet. En undersøkelse fra 1968 av alle dødsfall i hospitaler viste at lungeemboli forelå hos 50% av pasienter som døde ved alderen 60, og hos 64% av dem som døde i en alder av 70 år. Hos pasi-entene med emboli var embolus hoveddødsårsaken i 4 3% av til-fellene. Totalt sett blir 700.000 tilfeller av lungeemboli påvist i U.S.A. hvert år og hos mer enn 90% av disse kan emboli oppspores til dyptliggende venethrpmbose.

Følgelig er metoder som muliggjør påvisning av blodpropper

av stor medisinsk betydning slik at preventive tiltak såsom antikoagulant terapi eller kirurgi kan foretas..

I senere år har humant fibrinogen merket med en radioaktiv isotop blitt brukt for påvisning av blodpropper i dyptliggende vener av benet og andre deler av kroppen. Fibrinogen kan merkes med jod-125 (U.S. patent 3,933,996 eller teknetium-99m(U.S. patent 4.057.617) og injiseres gjennom en egnet bærer i en sene hvor den går inn i trombe(blodpropp)dannelsen. Aktivering av fibrinogen med enzymet thrombin forårsa-ker frigjøring av fibrinopeptider (fibrinmonomerer) som polymeriserer under dannelse av en fibrinpolymer som danner en del av en blodpropp. Når radioaktivt merket fibrinogen går inn i trombedannelsen, blir radioaktiviteten lokalisert og blodproppen kan lokaliseres ved utvendig påvisning av strålingen.

Selv om bruken av radioaktivt merket fibrinogen har blitt et fremskritt i lokaliseringen av blodpropper, foreligger fremdeles noen problemer. Fibrinogen opptas bare gjennom relativt ferske blodpropper eller som fortsatt er under dannelse og kan følgelig ikke lokaliseres tilstrekkelig i gamle blodpropper(mer enn 1 dag gamle) og muliggjøre effek-tiv utvendig billeddannelse. Følgelig er det et sterkt behov for et billeddannende reagens som ville opptas både i blodpropper under dannelse og tidligere dannede blodpropper. Imidlertid var ingen slike reagenser kjent forut for foreliggende oppfinnelse.

Følgelig er det et formål å tilveiebringe en blanding som brukes for lokalisering av både nydannede og tidligere dannede blodpropper.

Det er et annet formål å tilveiebringe en mulighet for lokalisering av blodpropper ved hjelp av et radioaktivt merket billeddannende reagens som selektivt vil opptas både av nydannede og eldre dannede blodpropper hvilket derved kunne lokaliseres ved måling utenfra av emittert stråling.

Disse og andre formål ved oppfinnelsen som vil fremgå klar-ere av følgende, er oppnådd ved å tilveiebringe et reagens for lokalisering av tromber in vivo hvilket man tilfører et radioaktivt merket peptid valgt fra gruppen bestående av fragment E1 isolert fra kryssbundet fibrin, og fragment E_ isolert fra kryssbundet fibrin, og peptider med aminosyresekvens som er delsekvenser av fragmentene E, og E£ hvor peptidet selektivt opptas av blodpropper og uten-

for måler strålingen som emitteres av det radioaktivt merkede peptid.

Fragmentene og E2 er løselige nedbrytningsprodukter

som er frigjort fra kryssbundet fibrin ved innvirkning av enzymet plasmin. Disse fragmenter er tidligere påvist og publisert, men det var ikke kjent at de ville opptas hver-ken av ferske eller eldre dannede aggregater eller blodpropper .

Sammenhengen mellom fibrinogen og fragmentene E^ og E^

ser men best når man betrakter aggregatdannelses- og nedbrytningskjemien.

Menneskelig fibrinogen er et løselig plasma protein som spaltes av enzymet thrombin, og danner uløselig fibrin som er nettverket eller matrisen til et aggregat. Fibrinet kan være kovalent kryssbundet ved faktor XHIa under dannelse av et stabilisert aggregat. Menneskelig kryssbundet fibrin nedbrytes av enzymet plasmin under frigjøring av nedbrytningsproduktene: (DD)E kompleks, fragmentene DD og E og en a polymer bestanddel. (DD)E komplekset er det primære løse-lige plasmin nedbrytningsproduktet som frigjøres fra kryssbundet fibrin. Dette komplekset kan videre påvirkes av plasmin ifølge det efterfølgende skjema:

kryssbundet fibrin (DD) E-^ (DD) E^ DD + E3 .

Det opprinnelige kompleks inneholder fragmentene DD og E . Etter videre behandling spaltes fragmentet E til fragmentet E2 uten tap av evne til å bindes til fragment DD. Behandling av fragment E2 til E^ fører til dissosiasjon av komplekset. Derfor er plasmin slutt-nedbrytningsproduktene fra kryssbundet fibrin fragmentene DD og E^. Dette nedbrytnings-mønster er konstant uavhengig av plasmin til fibrinforholdet, men hastigheten av dannelsen til sluttproduktene avhenger betydelig av plasminkonsentrasjonen.

Fremstilling av forskjellige plasminnedbrytningsprodukter har tidligere vært publisert av to av de foreliggende opp-finnere, Olexa og Budzynski, i Biochemistry 18, 991 (1979), og i J. Biol. Chem. 254, 4925 (1979). Den grunnleggende fremgangsmåte som er beskrevet i disse publikasjoner for fremstillingen og isoleringen av fragmentene E og E begyn-ner med dannelsen av et fibrinaggregat fra fibrinogen anriket med faktor XIII. Aggregatet- hydrolyseres med plasmin og det resulterende produkt sentrifugeres for å fjerne store 'partikler., Supernantanten inneholder løselige ned-brytningprodukter innbefattende . ønskede fragmenter E-j^ og E^. Nedbrytingsproduktene separeres avhengig av molekylvekten, fortrinnsvis på en agarosegel kolonne og gir (DD)E komplekset. Fragmentene . ei og E^ erholdes fra det rensede (DD)E kompleks ved inkubering i en konsentrert saltløsning og gir dissosiering av DD og E eller E^ fragmenter etter-fulgt av seperasjon avhengig av molekylvekten, fortrinnsvis ved hjelp av en agarosegel kolonne. Detaljert beskrivelse av prosessen som brukes er angitt i de foran nevnte publikasjoner av Olexa og Budzynski.

Fragmentene E er det plasmini ske spaltningsprodukt av menneskelig kryssbundet fibrin hvilket innholder NH2~terminale regioner av alle seks polypeptidkjeder av fibrinogen. Minst tre arter av fragment E er isolert og karakterisert, dvs. fragmentene E^ E^ og E3 med molekylvekt 60.000, 55.000 og 50.000. Artene er sekvensielle nedbrytningsprodukter og mik roheterogenitet hos hver art er registrert. Fragmentene E og E^ har evne til å bindes til fragment DD fra kryssbundet fibrin(men ikke til DD-E komplekset, fibrinogen, eller andre plasmiske nedbrytningsprodukter fra fibrinogen eller fra ikke-kryssbundet fibrin.

I nyere undersøkelser som førte til foreliggende oppfinnelse, vis te oppf innerene at fragment E^ ville inngå i e:t f ibrin-aggregat under dannelse i et in vitro system. Dette var den første indikasjon på at E^^ fragmentet ville bli tatt opp i et aggregat. Videre undersøkelser indikerte at fragment E^ også ble opptatt i forut dannede aggregater dannet fra normalt plasma og modnet i serum i 2 timer.

Da fragment E^ ble funnet å binde til både f i br in aggregater under dannelse og til forut dannede, modnede fibrinaggregater men ikke å binde til løselig fibrinogen eller plasmaproteiner, fant oppfinnerene at dette molekyl kan virke som en tracer for å lokalisere in vivo propper. Fragmentet E^ som var radioaktivt merket med 123J, 125J, 131J, 111IN og 99mTc eller andre egnede isotoper med gamma-stråling egnet for ekstern billeddannelse(kan injiseres intravenøst i en pasi-ent som er mistenkt for å ha entrombe. Periodisk ville områder av pasientens legeme beskues med et gamma-kamera eller måles med en rektilineær scintillasjonsteller. En alternativ metode for undersøkelse av de dype venene i bena anvender en håndholdt scintillasjons teller som brukes for å ta tellinger på flere punkter.

Under bestemmelsen av fragment E^s evne som in vivo billeddannende reagens må flere faktorer tas i betraktning. En virksom tracer for merkingen av in vivo blodpropper bør ha de følgende karakteristika: (1) den bør være lett å merke med en radioaktivitet opp til en høy spesifikk aktivitet; (2) ved systemisk injeksjon bør den både inngå spesi-fikt og raskt i dannelse av tromber og bindes til eldre tromber- (3) ikke bundet materiale bør raskt fjernes fra sirkuleringen; (4) materialet bør ikke bindes til fibrinogen eller til andre løselige plasmaproteiner; (5) mengden av bundet materiale bør avta ettersom trombenlyserer ; og (6) materialet bør være ikke-antigent. Fragment E^ oppfyller alle disse krav.

Fragment E-^ inneholder ca. 20 tyrosinrester og ca. 10 histi-dinrester og kan derfor lett merkes med radioaktivt jod, f.eks. med kloramin-T, jod monoklorid, jod(1,3,4,6-tetra-klor-3a,6a-difenylglykoluril) eller laktoperoksydasemetoder. Radioaktiv merking " med andre isotoper kan også lett oppnås f.eks. med 99mTc som beskrevet i Abramochi et al, U.S. Patent 4.057.617. Meget stabilt feste av radioaktive metall-ioner kan best oppnås ved å bruke et bifunksjonelt gelateringsmiddel, d.v.s. et molekyl som inneholder en metallkom-plekserende gruppe hvilken kan festes til peptidet gjennom kovalent binding. Et eksempel på et slikt bifunksjonelt gelateringsmiddel er beskrevet av Krejcarek og Tucker i Biochem. Biophys. Res Commun. 77: 581-585 (1977).Fragment

E^ bindes til både tromber under dannelse og eldre tromber. Den biologiske halveringstid for menneskelig frag-

ment E^ i kaniner er 1,4 timer sammenlignet med 49,3 timer for fibrinogen. Det er ganske sannsynlig at menneskelig fragment E^ også ville ha en relativt kort halveringstid i mennesker. Fragment E^ bindes ikke til fibrinogen eller andre fibrinogendegraderingsprodukter, men bindes til innrettede fibrinmonomermolekyler i en fibrinkjede (tabell 1 og 2). Fragment E bindes ikke til noen løselige plasmaproteiner. Da fragment E^ kan spaltes til fragment E-. av plasmin under tap av sin bindingsevne, kan fragment

E-^ som har inngått i en fibrinklump spaltes og frigjøres

i blodet. Tapet av radioaktivt fragment E1 fra blodproppen går parallelt med lyseringavblodproppen. Til slutt kan fragment E^ avledes fra humant fibrinogen og er sannsynelig-vis derfor ikke et sterkt antigen. Følgelig ville fragment E^ eller enhver del av fragment E^ som inneholder bindings-punkter være en virksom tracer for lokalisering av in vivo blodpropper.

Når produktet skal brukes i behandling av mennesker bør fragment E^ fortrinnsvis isoleres fra menneskelig kryssbundet fibrin for å minimalisere dets antigenegenskaper, men for andre formål er kryssbundet dyrefibrin egnet som en kilde til fragment: E-^.

Fragment E^ kan injiseres intravenøst i ethvert egnet farmasøytisk bæremiddel . Egnede

bærere er sådanne som oppløser fragment E^ eller holder det i suspensjon og som ikke er toksiske i en slik grad at de permanent skader vertsorganismen. Foretrukket er ikke-toksiske vandige løsninger av salter eller ikke-ioniske forbindelser såsom natriumklorid eller glukose, helst i en isotonisk konsentrasjon.

Fragment E^ kan injiseres i blodstrømmen på ethvert beleilig punkt, skjønt injeksjon oppstrøms fra eller nær stedet for den antatte blodpropp foretrekkes.

Egnede mengder for injeksjon er avhengig av den spesifikke radioaktiviteten til det radioaktivt merkede fragment E, og kan lett bestemmes ved enten beregning eller enkel eksperimentering. Radioaktivt merket fragment E^ bør gis i en tilstrekkelig mengde til å påvises ved gamma stråling billeddannelse eller annen utvendig bestrålingspåvisnings-anordning som kan lokalisere den emittere stråling som er tilstede i blodproppen såsom autoradiografi. Generelt bør lO^iCi til 50 mCi bestråling injiseres for å oppnå denne virkning hos mennesker. Den aktuelle mengde vil avhenge av egenskapene til radionukleidet som brukes (f .eks. fysi-kalsk halveringstid og energiene fra emitterte gammastråler). I allminnelighet foretrekkes mengder innenfor 50 til 100% av den maksimale tillatelige administrerte dose(begrenset av foreliggende sikkerhetsstandard) basert på måleorganet og hele legems-bestrålingseksponeringen hos forsøks-personene .

Analyse ved scintillisasjonstelling eller andre utvendige påvirkningsmetoder kan begynne innen en time etter injeksjonen eller kan også bli utsatt i inntil tre dager.

Det blir imidlertid vanligvis oppnådd best xesultater

6 til 18 timer etter injeksjonen. I mengden av radioaktivt fragment E1 som gis foreligger ingen nedre grense bortsett fra for den grad i hvilket fragment E-^ kan merkes med en radioaktiv isotop. Det synes ikke å være noen øvre grense, bortsett fra de som settes av løseligheten hvis fragment E^ isoleres fra den samme art hvori den injiseres. En øvre grense er satt for injeksjoner av fragment E^ fra en forskjellig art ved immunreaksjoner som er kjent, og hvilken er bestembar ved enkel eksperimentering. Hvis den spesifikke radioaktiviteten til fragment E er kjent og den ønskede radioaktiviteten er kjent som forut beskrevet, kan mengden av fragment E^ som injiseres lett bestemmes. Hvis f.eks.

den spesifikke aktiviteten er 2 ;jCi/mg vil en 5 mg prøve inneholde 10 .uCi radioaktivitet.

De høye blodpropp-til-blod forhold som oppnås med det radioaktivt merkede fragment E-^ i nye og eldede blodpropper medfører at radioaktivt merket fragment E^ kan ha stor klinisk betydning. I tillegg til å påvise blodpropper i venene i bena vil prinsippet for bruk av radioaktivt merket fibrin fragment E.^ merket med en egnet billedgivende isotop (f.eks. 123J, lllln, 99mTc) være anvendelig for påvisning av blodpropper eller embolier hvor som helst i kroppen, f.eks. i hjernen i slagtilfeller, i hjertet i tilfeller av myo-kardinalt infarkt og også for påvisning av lungeemboli som det ikke foreligger noen spesifikk prøve på på det nåværende tidspunkt.

Da dertil fragment E^ også gir binding med tromber eller blodpropper, kan fragment E^ brukes som beskrevet ovenfor for fragment E.^ som et blodpropp billedgivende reagens. Da både E-^ og E^ gir binding med kryssbundet fibrin, er det sannsynlig at et peptid med en aminosyre-sekvens som er en del ■ av de sekvenser som foreligger i fragmentene E^ og E^ også ville gi binding og vil være anvendelige som thrombose billedgivende reagenser. Slike peptider kan dannes ved begrenset proteolystisk spaltning av terminale aminosyrer fra de forskjellige kjeder av fragment E1, og kan merkes med en radioaktiv isotop på samme måte som fragmentene E-^ og E^-

Etter denne generelle beskrivelse av oppfinnelsen vil man

få en mer fullstendig forståelse gjennom visse spesifikke eksempler som her er angitt for illustrasjon alene og ikke er ment å på annen måte være begrensende med mindre dette er angitt.

EKSEMPLER

Rensing av fragment E^ - E2

Menneskelig kryssbundet fibrin ble nedbrutt med plasmin (6 enheter/g fibrin) i.24 timer ved 37°C. Ca. 500 mg av nedbrytningsproduktet ble gelfiltrert på en"Sepharose CL-6B" kolonne (2,5 x 190 cm), i en puffer inneholdende 0,05 M Tris-HCl, 0,028 M natriumsitrat, 0,1 M natriumklorid, 25 enheter/ml Trasylol (aprotinin) og 0,02% natriumazid, pH 7,8. Fraksjoner inneholdende (DD)E kompleks ble fortynnet med et likt volum 6 M urea/0,05 M natriumsitrat, pH 5,5, og inkubert ved 37°C i en time, deretter rekromatograf ert på en "Sepharose CL-6B" kolonne (2,5 x 190 cm), i ovennevnte puffer. Denne fremgangsmåte dissosierte (DD)E komplekset og muliggjorde rensing av fragment E artene. Fragementene E^ og E2 ble samlet sammen og adskilt ved kromatografi gjennom en 0,6 x 6 cm DEAE-cellulosekolonne. Elueringsmiddelet var en lineær gradient av 0 til 0,5 M NaCl i 0,01 M natriumkarbonatpuffer, pH 8,9. Fraksjoner som inneholdt peptidet ble identifisert ved absorpsjon ved 280 nm. Alternativt ble fragmentene E separert ved en isoelektrisk fokusering i en pH gradient på 4 til 6 med en sukrosegradientstabilisator. Sammenslåtte fraksjoner ble samlét og amfolytter ble fjernet med dialyse av fragmentene E mot to 500-ganger volumer av 1,0 M natriumklorid og to 500-ganger volumer av 0,15 M natriumklorid og fire 500-ganger volumer av destillert vann og fragmentene ble deretter frysetørket.

Fremstilling av radioaktivt merket fragment E-^ - E2

Renset fragment E1 eller E2 ble merket med radioaktivt jod ved jodmonokloridmetoden beskrevet av McFarlane i Biochem. J., 62, 135-143 (1956). Det merkede preparat inneholdt 0,9 jod-atomer/fragmenter E-^ molekyl og hadde en spesifikk radioaktivitet på 0,5 jaCi/mg. Fragmenter E2 og E^ ble merket med samme metode. Når høyere spesifikk aktivitet var ønsket, såsom for dyreeksperimenter, ble jodogenmetoden (1,3,4,6-tetraklor-3.a , 6a-dif enylglykoluril) anvendt for å feste 131J eller 123J til fragmentene E1 og E2- Bruk av jodogen for jodering av proteiner er beskrevet av Fraker og Speck i Biochem. Biophvs. Res. Commun. 80: 849-857 (1978). Det mer-kede preparat i dette tilfellet ble tracermerket uten bæremiddel og hadde en spesifikk radioaktivitet på opptil 2 mCi/fag.

Karakterisering av fragment E, - E^

Aminosyresekvensen av fragmenter E-^, E^, E^ er fastlagt. Hvert fragment E inneholder seks polypeptidkjeder, to

stykker fra hver av Aa, BP ogY kjeder av fibrinogen. Parametrene av fragment E molekylene er oppført i tabell 1 basert på den kjente aminosyresekvens av fibrinogen.

Bindingseksperimenter

Evnen av fragmentene E^ og E2 til å assosiere eller bindes til fibrinogen og fragmenter av fibrinogen eller fibrin ble prøvet i et løselig system. Fragment E og typene som skulle prøves ble blandet i et 1:1 molarforhold, deretter analysert på Tris-glycinpolyakrylamid (9%) geler. Fragmenter E^ og E2 binder seg bare til fragment DD men ikke til fibrinogen, fragmentene X, Y, D eller E (tabell 2). Dette indikerer at fragment E bare binder til de innrettede D regioner av fragment DD, men ikke til det monovalente fragment D området av fibrinogen eller fibrinogenderivater.

For å undersøke denne bindingen på en overflate fremstilles sepharose-insolubilisert fibrinogen, fibrinmonomer og en kort oligomer av kryssbundet fibrin. Fragmenter E-^ og E2 binder ikke til sepharose--f ibr inogen eller sepharose-f ibrinmonomer, men bindes til den kryssbundene fibrinoligomer (tabell 3). Dette indikerer igjen at fragmentene E^ og E2 ikke bindes til fibrinogen eller fibrinmonomer, men bare til innrettet fibrinmonomerer i et fibrinkjede.

Innføring av fragment E^ i fibrinaggregater

Fragment ble undersøkt med hensyn til innbygningsevne

i et fibrinaggregat under dannelse i et in vitro system. Fragmenter E^ og E^ radioaktivt merket med 125-jod ble

tilsatt normalt humanplasma. Aggregering ble initiert ved tilsetning av trombin, og derefter ble aggregatet vunnet ut på en glass-stav. Radioaktiviteten i aggregatet og i serumet ble målt. Hver konsentrasjon av fragment E ble under-søkt tre ganger. Middelverdiene er vist i tabell 4. En betydelig andel av fragment E^ ble inntatt i fibrinagg-regatet mens fragmentet E^ forble i serumet. Følgelig kan fragment E^ bindes under dannelse av et fibrinaggregat.

Binding av fragment E^ til forut dannede plasmaaggregater Plasmaaggregater ble dannet fra 0,5 ml normalt humanplasma oppslemmet på en spiraltråd og eldet i serum i 2 timer. 125-jod merkede fragmenter E^ eller E^ ble tilsatt serumet og inkubasjon fortsatt i 1 time. Aggregatene ble vasket 5 ganger i 0,5 ml 0,15 M natriumklorid. Radioaktiviteten i serumet, vaskevannet og i aggregatet ble målt. Fragmentet E^ bandt seg til aggregatet, men fragmentet

E3 bandt seg ikke (tabell 5). Mengden av fragment E^

som bandt seg til et forut dannet eller eldet aggregat var lavere enn den mengde som inngikk i et aggregat under dannelse og var proporsjonal med overflateområdet av aggregatet .

BIOLOGISKE FORSØK:

Inntak av radioaktivt jodert Fragment E^ i blodpropper

in vivo

For å prøve styrken av systemisk inj isert radioaktivt merket fragment E^ for blodpropplokalisering hos mennesker

med trombose, ble en in vivo modell av trombose i dyr benyttet. Fordi en blodpropp er strukturelt heterogen (forskjellige aggregater), og fordi blodsirkulasjonen og naturlig kataboliske mekanismer kan påvirke opptaket av "tracere" in vivo, var disse eksperimenter viktige for å forutse resultatet av radioaktivt merket fragment E, som et radioaktivt farma-søytisk middel for klinisk blodpropplokalisering.

Griser ble valgt som eksperimentell dyremodell da de er

kjent for å være temmelig like mennesker med hensyn til kardiovaskulære forstyrrelser som beskrevet i Pond et al, "The Pig as a Model in Biomedical Research" The Biology of the Pig, Comstock Pub. Assoc.) s. 31-35, 1978. Blodpropper ble indusert i halspulsåren hos unggriser som veide 11-22 kg med en lokalt tilført elektrisk strøm. Fremgangs-måten er kjent for å gi blodpropper som er morfologisk like de naturlige forekommende blodpropper. Etter induksjon fikk blodproppene eldes i opptil 5 dager før injeksjon av radioaktivt jodmerket Fragment e^ i grisen. Dette muliggjorde studium av "traceropptak" i blodpropper av forskjellig alder fra meget ferske blodpropper hvori fibrinavsetningen er aktiv til eldede blodpropper hvori fibrinavsetningen sann-125-synligvis er meget lav. I de fleste tilfeller ble jod-131 123 merket fibrinogen injisert samtidig med -jod- eller jod- merket Fragment E-^ for direkte å sammenligne trombus-opptaket av de to tracere. Radioaktivt jodmerket fibrinogen er en "tracer"som hyppig brukes for klinisk påvisning av dyp venetrombose under dannelse, og dens blodproppopptakadferd er grundig undersøkt. 24 timer etter injeksjonen av de radioaktive "tracere"ble blodproppene kirurgisk fjernet og blod-prøver tatt. Prøvene ble veid og talt.

Resultatene fra disse eksperimenter er oppført i tabell 6 for alle aldere av undersøkte blodpropper. Et høyt mål-til-bakgrunnsforhold er ønskelig for å gjøre det mulig å ta utvendig bilde av en blodpropp med et gamma-scintillasjons-kamera. P.g.a. at hovedkilden for bakgrunnsstråling i blod-proppsbildet sannsynligvis skyldes "blodpolradioaktivitet", er lokaliseringsutstrekningen i den eksperimentelle blodpropp uttrykt som et blodpropp-til-blodforhold som er defi-nert som:

Et blodpropp /blodforhold på 4 ansees for å danne bilde av

en blodpropp i leggvenene, og et forhold på 6 til 8 kan være nødvendig for å danne bilde av blodpropper i brystet. Resultatene i tabell 6 viser at radioaktivt jodert fibrinogen bare er betydelig lokalisert i meget ferske blodpropper (mindre enn 20 timer gamle). Radioaktivt jodert fragment E^ er imidlertid lokalisert i en sterk utstrekning i blodpropper av alle undersøkte aldere (0 til 5 dager). Fordi fragment E^ antas å binde seg til overflaten av en blodpropp, kan varia-sjonen i opptaket man her ser skyldes forskjellen i tilgjenge-lig blodproppoverflate fra dyr til dyr.

Etter nå å ha beskrevet oppfinnelsen vil det være klart for en fagmann at mange forandringer og modifikasjoner kan foretas med denne uten at man fjerner seg fra den her beskrevne oppfinnelsestanke.

Claims

Blanding for bruk ved ekstern påvisning og lokalisering av blodpropp, karakterisert ved at den inneholder et radioaktivt merket peptid valgt fra gruppen bestående av fragment isolert fra kryssbundet fibrin, fragment E^ isolert fra kryssbundet fibrin hvor fragment E^ har en aminosyresekvens som er identisk til den til humane fibrinogen-aminosyrer a, 17-78; a, 17-78; p, 15-122; p, 15-122; y, 1-62; og y, 1-62 og hvor fragment E^ har en aminosyresekvens som er lik den til humane fibrinogen-aminosyrer a, 17-78; a, 17-78; p, 15-121; p, 54-121; y, 1-62; og y, 1-62, samt et farmasøytisk anvendelig bæremiddel som er egnet til intravenøs injeksjon.