KR20060025137A - 펩티드 유도체를 이용한 생체 내 영상화 - Google Patents

펩티드 유도체를 이용한 생체 내 영상화 Download PDF

Info

Publication number
KR20060025137A
KR20060025137A KR1020057020866A KR20057020866A KR20060025137A KR 20060025137 A KR20060025137 A KR 20060025137A KR 1020057020866 A KR1020057020866 A KR 1020057020866A KR 20057020866 A KR20057020866 A KR 20057020866A KR 20060025137 A KR20060025137 A KR 20060025137A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peptide
llg
peptides
imaging
targeting
Prior art date
Application number
KR1020057020866A
Other languages
English (en)
Inventor
칼레비 카이레모
사미 카우키넨
헬리 발타넨
Original Assignee
씨티티 캔서 타겟팅 테크놀로지즈 오와이
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 씨티티 캔서 타겟팅 테크놀로지즈 오와이 filed Critical 씨티티 캔서 타겟팅 테크놀로지즈 오와이
Publication of KR20060025137A publication Critical patent/KR20060025137A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/088—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins conjugates with carriers being peptides, polyamino acids or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 발명은 진단용 종양 표적화제 및 영상화제로 사용되는 파아지 디스플레이 LLG 펩티드 유도체 및 종양 및 감염/염증의 표적화 및 영상화 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명에서는 상기 펩티드 유도체를 포함하는 진단용 조성물도 개시하였다.
표적화, 영상화, 진단용 조성물, LLG 펩티드.

Description

펩티드 유도체를 이용한 생체 내 영상화{IN VIVO IMAGING USING PEPTIDE DERIVATIVES}
본 발명은 진단용 종양 표적화제 및 영상화제로 사용되는 파아지 디스플레이 LLG 펩티드 유도체 및 종양 및 감염/염증의 표적화 및 영상화 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명에서는 상기 펩티드 유도체를 포함하는 진단용 조성물도 개시하였다.
급성 골수성 백혈병 (AML)의 치료에 중대한 진전이 있음에도 불구하고, 대다수의 환자는 이러한 질병에 의하여 사망하게 된다. AML을 보유한 아동의 대략 절반 정도가 치료되나 AML을 보유한 고령 성인의 장기 생존의 면에서의 점진적인 발전이 거의 답보상태이다. AML의 치료는 세포독성제의 다량 복용과 동종 줄기 세포 이식을 포함하므로 매우 어렵다, 따라서 여전히 대다수의 성인 환자는 재발하게 된다. 최근 몇 년 동안, 면역치료에 기초한 비개질 항체 또는 세포 등과 같은 AML의 치료를 향상시키는 새로운 전략이 개발되었다. 그러나, 결과가 좋지 않은 AML 등의 질병은 가능한 경우마다 임상시험으로 치료되어야 한다.
상기 인테그린 CD 11은 AML의 좋지 않은 예후와 연관되어 있다. 최근 파아지 디스플레이에 의하여 얻은 생활성 펩티드는 백혈구β2 인테그린에 대한 특이적 리간 드이다. 정제된 αMβ2 인테그린(CD11/CD18)으로부터 펩티드 구조를 구속하는 두개의 디설파이드 브릿지에 의존하는 신규의 노나펩티드 CPCFLLGCC (LLG)가 단리되었다 (본 명세서에서 참조자료로 포함된 WO 02/072618 참조).
현재 방사성 리간드에 기초한 펩티드의 다양성은 일반 종양 및 Arg-Gly-Asp 펩티드 상에서 발현되는 수용체인 봄베신, 가스트린/콜레시스토키닌 및 뉴로텐신을 포함하는 체내 치료 및 진단 전략에 의하여 발전하고 있다. 이들은 새로 형성되는 혈관에서 발현되는 수용체에 결합하기 때문에 많은 일반 종양을 표적화 할 수 있다.
염증은 염증 유발 매개체를 방출, 셀렉틴 매개 백혈구의 주위 혈관의 내피 세포 부착, 특이적 백혈구 인테그린의 활성화, 인테그린 및 세포 내 부착 분자(ICAMs)의 상호작용에 의한 고정자(firmer) 부착 및 백혈구 유출로 구성되는 방어기작이다.
인테그린은 세포 내 신호전달에 관한 폭넓은 범위의 활성과 관계 있으며, 이들은 구별되는 β 소단위의 아과(subfamilies)로 대별된다. 백혈구는 β2 인테그린만을 발현한다. β2 인테그린 과(family)의 네 가지 구성원은 αLβ2 또는 CD11a/CD18, αMβ2 또는 CD1lb/CD18 또는 Mac-l, αXβ2 또는 CD1lc/CDl8 및 αDβ2 또는 CD11d/CD18이다. ICAM은 β2 인테그린 과의 주요 리간드이며, 이들은 αMβ2 인테그린에 의해 선호되는 일반 인식 서열 LLG를 지닌다. αMβ2 인테그린은 iC3b- 피복 적혈구의 결합, 부착 및 골수 세포의 포식작용의 매개, NK 세포 활성의 항진 등에 의한 면역반응에 관계되는 것이다. αMβ2 인테그린은 마크로파아지와 미생물의 상호작용에 관한 것이며, 이는 골수 세포상의 세포 부착 상호작용을 매개한다. αMβ2는 X 인자 및 피브리노겐을 포함하는 다른 리간드이다.
전술한 바와 같이, 최근 파아지 디스플레이에 의하여 얻은 생활성 펩티드는 백혈구 β2 인테그린에 대한 특이적 리간드이다. 정제된 αMβ2 인테그린(CD11/CD18)으로부터 펩티드 구조를 구속하는 두개의 디설파이드 브릿지에 의존하는 신규의 노나펩티드 CPCFLLGCC (LLG)가 단리되었다. 별개의 고리화 펩티드에 대한 연구에서는 특이적 디설파이드 배치가 다른 것보다 더 활성되었음을 보여주었다. 본 발명에의한 용도로서 선호되는 펩티드는 Cl 및 C8 시스테인 간의 하나의 디설파이드 결합 및 C3 및 C9 시스테인 간의 두번째 디설파이드 결합을 지닌 펩티드이다. 상기 펩티드는 상기 αMβ2 인테그린-매개 백혈구 세포 부착을 억제하고, 인테그린 아단위의 양이온-민감성 I-도메인에 결합한다. 두개의 LLG 이형태체의 NMR 구조가 결정되었으며, 더 활성인 이형태체가 잠재적인 항염증제 및 백혈병 세포-표적화 화합물의 개발을 위한 선도체가 된다. 본원에서, 본 발명자들은 LLG의 염증 및 종양 표적화 및 영상화제로서의 용도에 대한 가능성을 모색하였다. LLG는 치료 효과를 증대시키기 위하여 페길화될 수 있다. 본 발명자들은 또한 LLG를 I-도메인을 지닌 복합체로 결정화하고, 펩티드의 유기 유사체를 설계할 계획을 가지고 있으며. 본원에서 개시할 실험동물 모델로 상기 유사체의 잠재성을 평가할 것이다. 상 기 LLG는 리포좀 표면의 치료제로서의 기능이 있다. 리포좀을 사용함으로써, 본 발명자들은 펩티드의 약물동태학 및 역학적 성질을 변형할 것이다.
LLG 또는 LLG-PEG의 진단용 영상화제로서의 용도를 개시하였다. 본원은 또한 표적화 치료에 활용할 수 있는 펩티드에 기초한 방법에 의하여 AML 세포를 표적화하는 새로운 전략을 개시하였다.
본 발명의 요약
본 발명에서, 발명자들은 LLG 펩티드 유도체의 종양 및 감염 표적화 특성을 입증하였다. LLG는 생물역동학적 특성을 향상시키기 위하여 페길화 될 수 있다.서로 다른 시간에 종양 흡수를 조사하기 위하여 이종이식을 한 마취된 동물을 영상화하였다. 종양 및 염증 병변이 있는 동물 내에서의 생체분포성향을 연구하였다.
결과적으로, 본 발명은 X가 어떠한 아미노산 잔기라도 가능한 CXCXLLGCC 구조를 포함하는 펩티드 또는 이들의 유도체의 종양 및 염증 표적화에 대한 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 환자의 종양 세포 또는 감염/염증의 영상화 방법 및 종양 세포에 대한 세포독성 또는 세포증식억제제의 표적화 방법이다.
본 발명의 또 다른 목적은 X가 어떠한 아미노산 잔기라도 가능한 CXCXLLGCC 구조를 포함하는 적어도 하나의 펩티드 또는 그 유도체를 포함하는 진단 조성물이다.
선호되는 구체예에서, 본 발명에 사용되는 상기 펩티드는 CPCPLLGCC 구조를 포함하는 펩티드 또는 이들의 유도체이다.
급성 골수성 백혈병 (AML)의 치료 방법에 있어서, a) 치료제, 좋기로는 안트라시클린; b) X가 어떤 아미노산 잔기라도 가능한 CXCXLLGCC 구조를 포함하는 펩티드 또는 이들의 유도체; 및 필요에 따라 c) 종래에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 보조제를 포함하는 약학적 조성물의 유효량이 치료가 필요한 환자에 투여한다.
발명의 상세한 설명
약 어:
AML 급성 골수 백혈병
cDTPA 고리형디에틸렌 트리아민 펜타아세트산
EDC-NHS 에틸디메틸아미노프로필카보디이미드-N-히드록시석신이미딜
HPLC 고압 액체 크로마토그래피
HYNIC 6-하이드라조피리딘-3-카복실산
LLG CPCFLLGCC
LLG-PEG 페길화 CPCFLLGCC
MRI 자기 공명 영상화
NMR 핵 자기 공명
PEG 폴리에틸렌 글리콜
PEG-NHS 폴리에틸렌 글리콜-N-히드록시석신이미딜
우선, LLG 펩티드의 YADGA 유도체가 U937 세포주 내의 종양 표적화를 위하여 연구되었다. 상기 펩티드는 In-111 표지 및 직접 요오드화 및 cDTPA를 사용하여 표지되었다. 종양 표적화가 성공적이었기 때문에, 추가의 영상화 특성을 위하여 추가의 유도체를 발전시켰다. 이들을 Tc-99m 및 HYNIC 등의 추가의 킬레이드제를 포함하도록 확장시켰다. 이 펩티드를 성공적인 영상화를 지닌 PEG-NHS에 커플링시켰다.
본 발명자들은 동물 백혈병 모델을 이용하여 LLG가 그 자체로 표적화제로 사용 기능하고, PEG-분자에 의해 변형이 가능하다는 사실을 밝혀내었다. 이러한 시약이 인간에 무독성이며, 손쉽게 실험할 수 있고 생산이 용이하다는 점에서 매우 중요하다. 본 발명은 또한 리포좀 내에서의 LLG의 세포독성 또는 세포증식억제제의 표적화제로서의 용도에 관한 것이다. 추가적으로 LLG는 적은 부작용으로 세포 독소효과를 제어할 수 있다. 이는 AML을 겪는 백혈병 동물 모델에 의해 평가되었다. 이러한 형태의 백혈병에서, 상기 치료 결과는 현 시점에서 수용하기 어려운 상태이며 새로운 치료 모델화가 필요하다.
LLG는 백혈구 인테그린에 결합하는 펩티드이다 (J Biol Chem 2001 ; 153: 905-15). YADGACPCFLLGCC 유도체는 추가의 영상화 특성을 위하여 개발되었다. In-111 및 I-125 유도체의 방사성표지 방법이 개발되었다. 상기 LLG 펩티드를 PEG-NHS에도 커플링시켰다. 추가의 방사선 핵종 변형이 인지질 연결 PEG 및 리포좀 구조를 포함하도록 개발되었다.
시간에 대한 함수로써 체내 종양 흡수를 연구하기 위하여 감마 카메라를 사용하여 방사성표지된 펩티드 유도체를 서로 다른 시점에서 영상화시켰다. 마지막 영상화 후에, 종양 조직을 적출하여 방사성활성을 계수하였다. 정량적 자가방사선술을 사용하여 자세한 미소분배가 연구되었다. 인간 골수 단구 백혈병 U937 세포주 내의 종양 표적화를 위하여 YADGA LLG 펩티드가 연구되었다. 상기 펩티드는 In-111 표지 및 직접 요오드화뿐만 아니라 cDTPA를 사용하여 표지되었다.
치료용으로 사용되는 펩티도리포좀도 추가로 영상화할 수 있었다. 리포좀은 초음파검사를 위해 기체 입자로, MRI를 위하여 상자성 화합물로, 및 형광 영상화를 위하여 형광표지로 캡슐화될 수 있으며, 예컨대, 화학적 발광 영상화를 위한 루시퍼라아제 효소계가 있다.
다음에, 현재 AML의 가장 효과적인 치료방법으로서, 치료제로서 독성효과가 여전히 존재하는 안트라시클린인 이다루비신 및 표적화제로서 LLG를 함유한 리포좀구조가 개발될 것이다. 상기 LLG는 리포좀 표면의 치료제로서 작용한다. 표지된 리포좀을 사용하여, 발명자들은 이다루비신의 약물동태학 및 약력학을 연구할 수 있었다.
동물의 LLG 구조를 시험하여 급성 골수성 백혈병 (AML) 치료의 의학적 발전의 기초를 제공하였다. 백혈병 마우스의 LLG 구조에 대한 세포약학, 세포동력학 및 약물동태학적 이해를 함으로써 실질적인 계획 및 의존하는 복용량을 알 수 있다.
페길화 LLG -펩티드 및 LLG -펩티드를 함유한 리포좀
펩티드의 페길화는 일반적으로 혈청 내에서 이들을 더 안정적으로 만들고 따라서, 더 효과적이다. 이러한 간단하고 신속한 펩티드의 변형에 의해서 상기 펩티드를 혈청 내에서 안전하게 하여 치료제 및 영상화제로 사용할 수 있게 한다. 표지화를 위하여 LLG-펩티드의 N-말단에 YADGA 서열을 첨가하여, 펩티드와 PEG-분자를 연결 시킨다. 이 펩티드를 EDC-NHS 반응에 의하여 다양한 분자량을 가진 PEG-NHS와 커플링시킨다. 최상의 분자를 찾기 위하여, 이 구조체를 세포 배양 시험하였고, 생체분포성향을 이종이식을 한 마우스를 이용하여 평가하였다.
티오글리콜산 배양
초기에, 티오글리콜산의 배양은 상기 물질을 복강 내에 주사한 뒤 실험동물 내에서 시험하였다. 10 분 후 생체분포성향을 위하여 실험동물들을 연구하였다. 복강 내 유체를 채집하였고 인테그린 발현을 위하여 세포를 염색하였다. 추가 연구에 의하여 최고로 흡수되는 것을 사용하였다. 염증 부위에 중성구를 투입하는 특성에 의하여 세포적 시료를 수집하였다.
티오글리콜산 배양 후의 LLG -펩티드 표적화
관련 염증을 발달시키기 위한 선택된 하나의 티오글리콜산 배양 시점에서, 표지된 LLG-펩티드 구조의 상세한 생체분포성향 연구를 수행하였다. 펩티드 흡수를 주사 후 5 분, 30 분, 3 시간, 18 시간 등의 서로 다른 시점에서 연구하였다. 복강 내 유체 채집시 특별한 주의를 요한다. 세포적 시료를 염증 부위에 중성구 투입을 평가하기 위하여 채집하였다.
LPS 배양
초기에, LPS 배양을 실험동물 내에서 시험하였다. 72 시간, 24 시간 및 3 시간의 배양시간이 시험 되었다. 실험동물을 3 시간의 생체분포성향에 대하여 연구하였다. 추가 연구를 위하여 24시간에서 최고로 흡수되는 것을 사용하였다.
LPS 배양 후의 LLG -펩티드 표적화
관련 염증을 발달시키기 위한 LPS의 선택된 하나의 배양 시점에서, 표지된 LLG-펩티드 구조의 상세한 생체분포성향 연구가 수행되었다. 염증부위에 중성구의 투입을 평가하기 위하여 병리학적 시료가 채집되었다. 요오드표식 펩티드를 사용한 정상 생체분포성향 데이터를 도 4에 나타내었다.
결 과
U937 세포주 내의 종양 표적화를 위하여 YADGA LLG 펩티드를 연구하였다. 상기 펩티드는 In-111 표지, 직접 요오드화 및 cDTPA를 사용하여 표지되었다. 도 1은 In-111-YADGA LLG 정맥 주사 후 3시간 경과시의 종양 표적화를 명백히 도시한다. 이러한 모델에서, 혈액에 대한 종양의 절대 비율은 24 시간에서 4.7이었다.
본 발명자들은 LLG의 방사성할로겐화 및 페길화 LLG를 입증하였다. 할로겐화를 방사선 핵종 I-123을 사용하여 유사하게 수행하였고, 이 동위원소는 감마 영상 및 양전자 방출 단층촬영에 활용될 수 있는 I-124, (영상), 및 I-125 (오제(Auger)-치료, 감마탐침, 수술 기술), 및 I-131 (감마 영상, 방사선 핵종 치료, 베타 방사)를 위하여 사용할 수 있다.추가로 사용가능한 방사선 핵종은 Br-76, Br-77, At-211이다. 브로민은 양전자 방출기에 사용되고, 아스타틴은 알파-방출기 (방사선 핵종 치료)에 사용된다. In-111은 전이금속이다. 동일한 방법을 수많은 방사성금속의 방사성표지화에 사용할 수 있다.
전술한 cDTPA 킬레이션을 이용한 금속성 방사선 핵종은 In-111이며, 다른 예로써 In-110 (PET), In-114m (오제, 감마) 등이 있다. 그 밖의 다른 유사한 것으로서는 Y-90 및 다른 핵종, Co, Fe, Ni, Cu, Zn, 기본적으로 모든 전이 금속 및 이들의 방사선 핵종이 있다. Gd는 상자성 조영제로 사용되는 금속이고, 이는 DTPA 킬레이션에 의해 커플링된다. 대부분의 란탄계 금속은 상자성 영상화에 유용한 특징을 지니며, cDTPA 킬레이션을 활용할 수 있다.
발명자들은 영상화를 위해 펩티도리포좀도 사용하였다. 리포좀은 초음파검사를 위해 기체 입자로, MRI를 위하여 상자성 화합물로, 그리고 형광 영상화를 위하여 형광표지로 캡슐화될 수 있으며, 예컨대, 화학적 발광 영상화를 위한 루시퍼라아제 효소계가 있다.
아래의 실험에서, 방사성표지화를 위하여, 표지화 방법에 따라 상기 펩티드(YADGACPCFLLGCC)의 긴 구조, 짧은 구조(CPCFLLGCC) 또는 융합 단백질 GST-LLG가 사용되었다.
농양에 대한 LLG 표적화
이 실험에서, 좌측 경직 근육 내에 주사된 농양이 대략 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 또는 에셰리시아 콜리 (Escherichia coli)의 1 x109 군집형성 단위인 것을 포함하여 위스타(Wistar) 레트 및 뉴질랜드 흰 토끼 내의 염증부위의 상기 LLG 표적화를 조사하였다. 이 절차 중에, 상기 실험동물을 마취시켰다. 24 시간 경과 후, 근육이 현저하게 부어올랐을 때, 상기 In-1ll 방사성표지 펩티드 CPCFLLGCC를 정맥내 점적(點滴)주사한다. 그리고 펩티드의 축적이 감마 카메라 영상화에 의해 검출된다. 상기 펩티드는 상기 두 종의 동물에서 3마리의 실험동물을 사용하여 시험 되었다.
상기 방법이 최적화된 것은 아니라 하더라도, 토끼에 있어서 E. coli 농양의 상기 LLG 영상화 (감마 카메라)는 경직 근육에 대하여 특이적으로 표적화된 것으로 입증되었고, 이는 1시간 내로명백히 가시화되었다(Fig. 5 A-E 참조). 상기 실험동물은 4 시간 동안 검출되었다. 후반부의 영상에서, 배뇨로 인해 영상화가 방해되었으나 배경에 대한 신호의 비율은 여전히 높다. 농양 이외의 다른 표적은 검출되지 않았다. 영상화 과정 전에 상기 실험 토끼에 삽관(또는 방광을 비우면)한다면 영상화가 훨씬 더 성공적이 될 것이다. 이러한 펩티드는 매우 친수성이지만 표지되기 쉬우며, 이들은 신장을 통하여 급속히 제거되었다.
레트 분석에 있어서, 실험동물을 펩티드 주사 후 2 시간 동안 검출하였다. S. 아우레우스 (S. aureus) 농양을 감마 카메라를 사용하여 LLG 영상화하여 특이적 표적화 (도 6 A-C)를 나타내었다. 그러나 후반부의 영상에서, 배뇨로 인해 영상화가 방해되었다. 이와 유사하게, 레트에서 영상화 전에 방광을 비우면 표적화가 더 효과적으로 나타났다. 그러나, 상기 실험토끼와 마찬가지로 배경에 대한 신호의 비율은 여전히 높았다. 농양 이외의 다른 표적은 검출되지 않았다
영상화한 후, 실험동물들을 도살하여, 다양한 조직을 채집하였으며, 상기 축적된 방사성 활성을 감마-계수기에 의하여 측정하였다. 도 7A에서, 축적된 펩티드의 양 (주사된 양/측정된 조직의 중량의 백분율로 표현; %ID/g)을 토끼의 특정 조직 (3마리 실험동물의 평균)마다 나타내었다. 농양에서만큼 고도로 축적된 장기(신장 제외, 데이터 없음)가 없었다.여기서 축적은 근육에 비하여 21.7 배였으며, 혈액에 비해 2.3 배였다. 도 7B에서는 레트에 의한 동일한 축적을 나타내었다. 이 실험동물에서 근육 및 혈액에 상응하는 비율은 각각 4.5 및 2.0이었다. 이러한 실험은 방사성활성 표지된 LLG가 감염 부위의 영상화에 효과적인 수단이라는 사실을 명백히 나타내고 있다. 그러나 급속한 제거 때문에, 요로 감염은 이러한 구조체에 의하여 검출될 수 없다.
염증부위에 대한 LLG 표적화 (귀)
이 실험에서, 여섯마리의 Balb/c 마우스의 좌측 귀에 10 ㎍의 E. 콜리 LPS를 주사하였다. 24시간 동안 염증을 발달시키고, 그 다음, 20 ㎍ (75 kBq)의 방사성 표지 GST-LLG를 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 상기 펩티드 주사 후 3시간 후, 마우스를 도살처리하고 좌측 귀 (감염) 및 우측 귀 (대조구)를 채집하여 축적된 방사성 활성을 측정하였다. 결과는 1.0 g 조직당 주사된 양의 백분율(%ID/g)로 나타내었다 (Fig.8). 모든 측정값은 마우스 3 마리의 평균±SD 값을 나타낸다.
LLG 유도성 억제
발명자들에 의한 이전의 연구에서(전술), 본 발명자들은 LLG-GST 융합 단백질을 마우스의 정맥에 투여하면 염증이 있는 복강내 티오글리콜산으로 중성구가 이동하는 것을 억제한다는 사실을 밝혀내었다. 이동하는 중성구의 수는 대조구의 40%로 감소하였다. 이러한 효과는 시간에 의존하며 l 시간 및 2 시간의 시점에서 가시적이고, 시간에 따라 사라지며,4 시간 이후에는 보이지 않게 된다.
이 연구는 아래와 같이 반복되었다:
염증을 유도하기 위하여, 그룹당 3마리의 Balb/c 마우스 암컷의 복강 내로 1 ml의 3 % 티오글리콜산 액체 배지 (TG)를 주사하였다. 대조구의 마우스에는 단순 운반체 PBS-10 % DMSO를 정맥 점적주사하였으며, 펩티드군의 마우스에는 1 mg/kg YADGACPCFLLGCC의 PBS-10 % DMSO 용액을 정맥 점적주사하였다. 60 또는 120 분 후에 상기 마우스를 도살처리하고 복강 내의 세포를 채집하여 5 ml의 PBS-5 mM EDTA로 세척하고 혈구계로 측정하였다.
TG의 국소 주사에 의하여 다형핵백혈구가 복강 내로 유출된다는 것을 알게 되었다. 이 실험에서 다양한 세포 집단을 구별하지 않았다. 그러나, 다시 한번 언급하자면, YADGACPCFLLGCC는 체내 실험적인 염증 내에서 세포 축적을 60 분 후 78%로, 120 분 후 52%로 감소시켰다 (도 9).
LLG 의 안정성
LLG 펩티드 (CPCFLLGCC)의 가장 안정한 형태를 찾기 위하여, 상기 펩티드를 I-125로 표지시켰다. 상기 정제된 펩티드를 PEG(10000) 또는 DSPE-PEG(3400)에 커플링시켰다. 수용액 상에서 DSPE-PEG(3400)-LLG는 교질입자를 형성하여 미검출 리포좀 내로 혼입된다. I-125-LLG (LLG), 페길화 LLG (Peg-LLG), 교질 LLG (M-LLG) 및 리포좀 LLG (L- LLG)가 Balb/c 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 펩티드 주사 후 3시간 경과시, 상기 마우스를 도살처리하여, 혈액시료를 수집하고 방사성활성을 측정하였다. 결과는 1.0 g 조직당 주사된 양의 백분율(%ID/g)로 나타내었다. 모든 측정값은 마우스 5 마리의 평균±SD 값을 나타낸다.
도 10에서 나타낸 바와 같이, 펩티드를 고 분자량 분자 또는 미검출 리포좀에 커플링시키면, 순환 중의 펩티드 안정성이 7 배까지 증가된다.
LLG 의 생체분포성향
LLG (YADGACPCFLLGCC)는 I-125로 표지하고, 상기 정제된 펩티드(40ug; ~500kBq)를 100 ㎕의 부피로 마우스 꼬리 정맥에 주사하였다. 펩티드 주사 후 30 분 및 180 분 경과시, 상기 마우스를 도살처리하고 혈액 및 조직을 채집하여 방사성활성을 측정하였다. 결과는 1.0 g 조직당 주사된 양의 백분율(%ID/g)로 나타내었다 (도 11). 모든 측정값은 마우스 3 마리의 평균±SD 값을 나타낸다.
도 11에 나타난 바와 같이, 상기 펩티드는 어떠한 조직에도 축적되지 않고, 신장을 통하여 급속히 제거되었다.
LLG 의 친화도
발명자들은 BIACORE를 사용하여 LLG의 인테그린에 대한 친화도를 조사하였다. 이 방법에서, 정제된 인테그린 I-도메인을 금 피복 카복시메틸화 덱스트란 칩 상에 고정시켰다. 고정화를 지속시키며 다양한 채널에서 2000 내지 4000 사이의 RU를 얻었다. 농도를 달리하여 (3.3nM 내지 33μM)의 LLG-GST 또는 GST가 I-도메인에 결합하는 능력을 시험하였다. 반응 완충용액은 1mM MgCl2를 함유하거나 또는 함유하지 않는 10 mM HEPES (pH 7.4)-150 mM NaCl이다. 불행히도, LLG를 위한 특이적 결합이 검출되지 않았다. GST 단백질이 고도의 배경 결합을 이루기 때문이다. 0.05%의 P20 세제를 첨가하여도 상기 배경을 감소시키지 못하였다.
또 다른 실험절차에서, 친화도 시험을 위하여 단순 LLG 펩티드가 사용되었다. 시험된 펩티드의 농도는 134 nM에서 134 μM로 다양하였다. 상기 실험절차에서, 상기 펩티드의 크기가 작기 때문에 특이적 결합이 검출되지 않았다. 상기 BIACORE 방법은 현재 발전 중이며, 발명자들은 고 분자량의 불화성 담체 분자와 커플링된 펩티드를 이용하여 상기 친화도를 다시 연구할 계획이다.
도 12는 LLG-GFP가 THP-1 세포주에 결합하는 것을 막는 YLLG의 성능을 보여준다. 50μM의 YLLG 농도에서 95%의 LLG- GFP간의 결합이 차단된다는 사실이 관찰되었다. 농도가 20 μM로 낮아지는 경우에도 여전히 70 %가 억제되었다. 도 12에 기초하여, IC 50은 나노몰 스케일임은 명백하다. 그러나, 용기의 플라스틱 벽과 펩티드 간의 비특이적 결합과 나노몰 스케일 신호에 필요한 LLG-GFP가 상대적으로 고농도이기 때문에, 현재 아직 비최적화된 이러한 실험절차로는 실험을 수행할 수 없다. 비록 이러한 실험이 결합 상수를 직접적으로 산출할 수 없다 하더라도, 이들은 사실상, 체내 시스템과 더 관련된 생물계 내에서 결합하는 펩티드의 성능을 말해주고 있다.
도 1은 마우스 모델의 인간 골수 단구 백혈병 종양 표적화를 나타낸다. 금속 킬레이션을 사용한 실시예 In-111이다.
도 2는 I-125-YADGA LLG 펩티드 정맥주사 후 24 시간 경과시의 종양 표적화를 나타낸다.
도 3은 페길화 I-125- YADGA LLG 펩티드 정맥주사 후 24시간 경과시의 종양 표적화를 나타낸다.
도 2-3.
좌측에 비보호 펩티드, 우측에 페길화 펩티드에 대한 할로겐화 LLG-유도체에 의한 종양 표적화를 나타낸다. I-125로 표지된 인간 골수 단구 백혈병의 마우스 모델이다.
평면 감마 영상. 이 그림에서 실험동물들은 방사성표지된 펩티드가 주사되었고, 마취된 실험동물들은 감마 카메라로 영상화되었다 (핀홀 콜리메터, 픽커(Picker) SX-300 감마 카메라).
도 4는 I-125-YADGA LLG-펩티드의 생체분포성향 연구를 나타낸다. 상기 125I-표지 펩티드의 체내 생체분포성향을 주사 후 3번의 시점에서 NMRI/누드 마우스에 의하여 평가하였다. 2, 6 및 24 시간의 간격의 마우스 내의 125I-표지 펩티드의 생체분포성향이 무게에 의하여 보정되었다. 실험결과는 0.1 g 조직 (%In/0.1 g)당 주사된 양을 백분율로 표현하였다. 모든 측정값은 마우스 5마리의 평균±SD 값을 나타낸다.
도 5A-5E은 뉴질랜드 흰 토끼의 좌측 경직 근육에서의 In-111 방사성표지 펩티드 CPCFLLGCC의 E. 콜리 농양에 대한 축적을 나타낸다.
도 6A-6C는 위스타 레트의 좌측 경직 근육에서의 In-111 방사성표지 펩티드 CPCFLLGCC의 S. 아우레우스 농양에 대한 축적을 나타낸다.
도 7A는 토끼의 특정 조직에 대한 In-111-cDTPA-CPCFLLGCC의 생체분포성향을 나타낸다. 단위무게 당으로 보정되었다.
도 7B는 레트의 특정 조직에 대한 In-111-cTPA-CPCFLLGCC의 생체분포성향을 나타낸다. 단위무게 당으로 보정되었다.
도 8은 감염된 마우스 귀에서의 I-125-GST-LLG 축적을 나타낸다.
도 9는 LLG-펩티드를 사용한 염증 내의 백혈구 유입 억제를 나타낸다.
도 10은 3시간 간격의 I-125-LLG 접합체 혈액의 안정성을 나타낸다.
도 11은 마우스 내의 LLG 펩티드의 생체분포성향을 나타낸다.
도 12는 LLG-GFP가 THP-1 세포주에 결합하는 것을 차단하는 YLLG의 성능을 나타낸다.

Claims (15)

  1. CXCXLLGCC (여기서, X는 어떠한 아미노산 잔기라도 가능하다.)구조를 포함하는 펩티드 또는 이들의 유도체의 종양 및/또는 감염 표적화를 위한 용도.
  2. CXCXLLGCC (여기서, X는 어떠한 아미노산 잔기라도 가능하다.) 구조를 포함하는 펩티드또는 이들의 유도체의 진단 목적을 위한 용도.
  3. CPCFLLGCC 구조 또는 이들의 유도체를 포함하는 펩티드의 종양 및 감염 표적화를 위한 용도.
  4. CPCFLLGCC 구조 또는 이들의 유도체를 포함하는 펩티드의 진단 목적을 위한 용도.
  5. 제2항 또는 제4항에 있어서 상기 펩티드는 방사성 표지, 친화성 표지, 자성 입자, 형광 또는 발광 표지와 커플링시켜 영상화제로 사용하는 용도
  6. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 펩티드 또는 이들의 유도체를 세포독성 또는 세포증식억제제의 표적화제로서 사용하는 용도.
  7. 전술한 청구항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 펩티드 또는 이들의 유도체는 PEG-분자로 변형된 것인 용도.
  8. 전술한 청구항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 펩티드는 리포좀에 커플링된 것인 용도.
  9. (a) CXCXLLGCC (여기서, X는 어떠한 아미노산 잔기라도 가능하다)구조를 가진 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 펩티드 화합물을 검출가능한 표지와 커플링시키는 공정,
    (b) 이렇게 얻은 혼합물을 환자에 투여하는 공정, 및
    (c) 상기 표지를 검출하는 공정
    을 포함하여 이루어지는 환자의 종양세포 또는 감염/염증을 영상화하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 검출가능한 표지는 방사성 표지, 친화성 표지, 자성입자, 형광 표지 및 발광 표지로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. CXCXLLGCC (여기서, X는 어떠한 아미노산 잔기일 수 있다.)구조를 지닌 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물, 검출가능한 표지 및 필요에 따라 화학치료제 또는 항염증제를 포함하는 조성물을 종양 또는 감염이 의심되는 환자에 투여하는 공정; 및
    필요하다면, 상기 표지를 검출하는 공정
    을 포함하는 환자의 종양세포 또는 감염/염증을 표적화 및 영상화하는 방법.
  12. - CXCXLLGCC (여기서, X는 어떠한 아미노산 잔기일 수 있다.) 구조를 지니는 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 펩티드 화합물 및
    - 검출가능한 표지
    를 포함하는 환자의 종양세포를 영상화하는 키트.
  13. 제12항에 있어서, 상기 검출가능한 표지는 방사성 표지, 친화성 표지, 자성입자, 형광 표지 및 발광 표지로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 키트.
  14. CXCXLLGCC (여기서, X는 어떠한 아미노산 잔기일 수 있다.)구조를 포함하는 적어도 하나의 펩티드, 검출가능한 표지 및 필요에 따라 화학치료제 또는 항염증제를 포함하는 진단용 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 펩티드는 CPCFLLGCC 구조 또는 이들의 유도체를 포함하는 것인 진단용 조성물.
KR1020057020866A 2003-05-02 2004-05-03 펩티드 유도체를 이용한 생체 내 영상화 KR20060025137A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20030664A FI115035B (fi) 2003-05-02 2003-05-02 In vivo -kuvantaminen käyttäen peptidijohdannaisia
FI20030664 2003-05-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20060025137A true KR20060025137A (ko) 2006-03-20

Family

ID=8566059

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057020866A KR20060025137A (ko) 2003-05-02 2004-05-03 펩티드 유도체를 이용한 생체 내 영상화

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20070072251A1 (ko)
EP (1) EP1620135A1 (ko)
JP (1) JP2006525289A (ko)
KR (1) KR20060025137A (ko)
FI (1) FI115035B (ko)
WO (1) WO2004096291A1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3431503A1 (en) * 2005-01-12 2019-01-23 Proteonova, Inc. Method for making targeted therapeutic agents
WO2007088952A1 (ja) * 2006-01-31 2007-08-09 Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. 抗腫瘍活性物質のリポソーム製剤
US20120055055A1 (en) 2010-09-02 2012-03-08 Illumin8 Outdoor Media, LLC Systems and Method for Outdoor Media Signage
CN102147410A (zh) * 2010-12-24 2011-08-10 吉林大学 整合素αVβ3检测试剂盒及其制备方法
KR101467676B1 (ko) * 2013-04-12 2014-12-04 울산대학교 산학협력단 암 표적용 펩타이드 및 이의 의학적 용도
EP3548097A4 (en) 2016-12-02 2020-07-01 Avelas Biosciences, Inc. NERVE MARKING COMPOSITIONS AND USES THEREOF

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI114710B (fi) * 2001-03-12 2004-12-15 Ctt Cancer Targeting Tech Oy Leukosyytti-integriinien uusia peptidiligandeja
FI113840B (fi) * 2001-03-26 2004-06-30 Ctt Cancer Targeting Tech Oy Matriisi-metalloproteinaasi-inhibiittorien käyttö liposomien kohdentamisessa

Also Published As

Publication number Publication date
FI20030664A0 (fi) 2003-05-02
FI20030664A (fi) 2004-11-03
WO2004096291A1 (en) 2004-11-11
US20070072251A1 (en) 2007-03-29
EP1620135A1 (en) 2006-02-01
FI115035B (fi) 2005-02-28
JP2006525289A (ja) 2006-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Akhtar et al. Antimicrobial peptides as infection imaging agents: better than radiolabeled antibiotics
Zinn et al. Noninvasive monitoring of gene transfer using a reporter receptor imaged with a high-affinity peptide radiolabeled with 99mTc or 188Re
Signore et al. The molecular imaging approach to image infections and inflammation by nuclear medicine techniques
EP0662843B1 (en) Labelled monocyte chemoattractant protein material and medical uses thereof
US5403574A (en) Evaluation and treatment of the multidrug resistance phenotype
Gemmel et al. Future diagnostic agents
EP0670736B1 (en) Labelled interleukin-8 and medical uses thereof
JP4682313B2 (ja) 感染及び炎症をターゲティング及び撮像するための化合物
Gandomkar et al. Clinical evaluation of antimicrobial peptide [99mTc/Tricine/HYNIC0] ubiquicidin 29–41 as a human-specific infection imaging agent
Shen et al. Radiation dosimetry of 131 I-chlorotoxin for targeted radiotherapy in glioma-bearing mice
KR20190009330A (ko) Pet-영상화 면역조정제
US20060257389A1 (en) Diagnosis of blood clots using fibrin-binding proteins bound with contrast agents
van der Laken et al. Imaging of infection in rabbits with radioiodinated interleukin-1 (α and β), its receptor antagonist and a chemotactic peptide: a comparative study
JP7128528B2 (ja) 標的投与のための放射性標識物質
US20220211884A1 (en) Rk polypeptide radiopharmaceutical targeting her2 and preparation method thereof
Blankenberg et al. Imaging macrophages and the apoptosis of granulocytes in a rodent model of subacute and chronic abscesses with radiolabeled monocyte chemotactic peptide-1 and annexin V
Vaidyanathan et al. Improved xenograft targeting of tumor-specific anti-epidermal growth factor receptor variant III antibody labeled using N-succinimidyl 4-guanidinomethyl-3-iodobenzoate
KR20060025137A (ko) 펩티드 유도체를 이용한 생체 내 영상화
JP4279781B2 (ja) 白血球結合性化合物およびその標識化合物を有効成分とする医薬組成物
Sano et al. Radioimmunodetection of membrane type-1 matrix metalloproteinase relevant to tumor malignancy with a pre-targeting method
US20190160188A1 (en) Radiolabeled Alpha-Melanocyte Stimulating Hormone Hybrid Peptide for Melanoma Targeting
US20150050213A1 (en) Compositions and methods for imaging inflammation of traumatic brain injury
CN115651063A (zh) 放射性核素标记的ptp多肽及其应用
Verbeke et al. Influence of the bifunctional chelate on the biological behavior of 99mTc-labeled chemotactic peptide conjugates
Su et al. Preparation and bioevaluation of [99m Tc] Tc-labeled A7R and D A7R for SPECT imaging of triple-negative breast cancer

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid