CN102147410A - 整合素αVβ3检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种整合素αVβ3检测试剂盒及其制备方法，将纯化的整合素αVβ3抗体用胶体金标记，喷点于玻璃纤维膜上制备成金标垫，将纯化的整合素αVβ3抗体和正常抗小鼠IgG抗体分别包被在硝酸纤维素膜上的检测线处和质控线处，当被检样品中含有整合素αVβ3抗原时，则于金标垫与胶体金标记的整合素αVβ3抗体结合，并在吸收垫的作用下，向前渗透泳动，与检测线上的整合素αVβ3抗体再次结合，出现肉眼可见的色带。本发明应用免疫胶体金技术制备整合素αVβ3检测试剂盒,并拟应用于临床,以推动整合素αVβ3在临床的广泛应用,提高对子宫内膜容受性判断的准确性,可以快速，灵敏检测特定蛋白，避免了复杂的操作，无需特殊检测仪器，结果易于观察判断，可以适应多种检测环境，以及多种检测需要。
Description
技术领域
本发明涉及一种子宫内膜容受性指标的检测方法，尤其是提供了一种应用免疫胶体金技术研制的整合素αVβ3检测试剂盒，同时还公开了其制备方法，属于疾病检测技术领域。
背景技术
体外受精-胚胎移植（IVF-ET）治疗不孕症以来，人类辅助生殖技术（ART）得到飞速发展，但胚胎着床成功率提高并不明显。子宫内膜容受性是胚胎着床的一个重要因素，在不孕症患者的治疗过程中,了解子宫内膜的容受状态,对IVF-ET治疗方案的制定有重要的指导意义。判断子宫内膜容受性的金标准是子宫内膜活检，但由于这是一项侵入性检查而限制了其在IVF-ET 周期中的应用。超声参数与激素水平对子宫内膜容受性的评价还不十分准确。因此目前需要一个合理的评价标准预测子宫内膜容受性，为IVF-ET提供治疗指导。整合素αVβ3(integrinαVβ3)是评价子宫内膜容受性的一个可靠的分子指标，整合素αVβ3检测试剂盒的研制及临床实验的开展，将推动整合素αVβ3在IVF-ET中广泛应用，从而提高IVF-ET的成功率，具有广阔的市场前景。
目前检测整合素αVβ3的方法包括免疫组化、ELISA、Western blot等，可用于科学研究，但用于临床则存在很多弊端，如操作程序复杂，时间较长等。
发明内容
本发明公开一种整合素αVβ3检测试剂盒，用于评价子宫内膜容受性。
本发明还提供了整合素αVβ3检测试剂盒的制备方法，适用于工业化生产。
本发明提供的整合素αVβ3检测试剂盒，在硝酸纤维素膜的两端分别设有金标垫和吸收垫，金标垫上端为样品垫，金标垫包被有纯化的整合素αVβ3抗体胶体金偶联标记物，检测线包被有纯化的整合素αVβ3抗体，质控线包被有正常抗小鼠IgG抗体，质控线侧贴有吸收垫。
本发明整合素αVβ3检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
本发明根据抗原抗体能特异结合的免疫学基本原理，将纯化的整合素αVβ3抗体用胶体金标记，喷点于玻璃纤维膜上制备成金标垫，将纯化的整合素αVβ3抗体和正常抗小鼠IgG抗体分别包被在硝酸纤维素膜（NC膜）上的检测线处和质控线处，当被检样品中含有整合素αVβ3抗原时，则于金标垫与胶体金标记的整合素αVβ3抗体结合，并在吸收垫的作用下，向前渗透泳动，与检测线上的整合素αVβ3抗体再次结合，出现肉眼可见的色带。
本发明试剂盒的使用方法如下：取宫腔冲洗液标本约1ml超声粉碎处理后加入小试管中，然后插入试纸条，待1-2分钟反应带清晰后观察结果（见图2）。出现1条红色(对照)沉淀线，诊断为阴性；出现2条红色(样品和对照)沉淀线，诊断为阳性，未出现沉淀线则为无效。
本发明的积极效果在于：首次应用免疫胶体金技术制备整合素αVβ3检测试剂盒,并拟应用于临床,以推动整合素αVβ3在临床的广泛应用,提高对子宫内膜容受性判断的准确性,可以快速，灵敏检测特定蛋白，避免了复杂的操作，无需特殊检测仪器，结果易于观察判断，可以适应多种检测环境，以及多种检测需要。并且检测结果可以长期保存，便于对照分析。可用于肉眼水平的免疫检测，样本用量极小，对操作者无毒性，对环境无污染等。因此应用胶体金技术研制整合素αVβ3检测试剂盒具有重大的社会意义和广阔的市场前景。
附图说明
图1. 整合素αVβ3检测装置示意图；（A：纵切图； B：平面图）
1.样品垫；2.金标垫；3.硝酸纤维素膜；4.吸收垫；5.检测线；6.质控线；
图2. 整合素αVβ3试剂盒检测结果判定。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1
根据图1所示，整合素αVβ3检测试剂盒由经过处理的样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3、检测线5、质控线6和吸收垫4组成，其中，金标垫2包被有纯化的整合素αVβ3抗体胶体金偶联标记物，检测线5包被有纯化的整合素αVβ3抗体，质控线6包被有正常抗小鼠IgG抗体，质控线6侧贴有吸收垫4。
实施例2
1、胶体金颗粒的制备：取1%氯金酸溶液1 ml加99 ml超纯水成终浓度0.01%的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1%柠檬酸三钠1.6 ml一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5 min，室温冷却，补充失水至原体积。在透射电镜下观察，可见金颗粒大小基本一致，分布均匀。测量100个胶体金颗粒直径，计算平均直径约20nm。
2、免疫胶体金复合物的制备：目测法确定胶体金与整合素αVβ3抗体用量比例。用0.1 mol/L的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH至8.2，取11支洁净试管，每管分装胶体金溶液(1 ml/管)。将整合素αVβ3抗体逐级稀释后(由0.5μg～5g另设对照管)，顺序加入一系列装有1 ml胶体金的试管中混匀；5min后,在2～11管内分别加入10%氯化钠溶液0.1ml，混匀，室温静置2 h以上观察结果；1号管既不加抗体也不加氯化钠溶液，为对照管；未加抗体的11号管也为对照（见表1）；未加抗体及加入量不足以稳定胶体金的试管，即呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入量达到或超过最低稳定量的试管则保持胶体金的红色不变。以此使胶体金红色不变而抗体含量最低试管的蛋白量，即为稳定1 ml胶体金的必需蛋白量，也即最低稳定量。在胶体金标记整合素αVβ3抗体最低稳定量的基础上再加上10﹪即为稳定胶体金所需整合素αVβ3抗体的实际所需用量，根据用以标记的胶体金的总量计算出所需要的整合素αVβ3抗体的总量。在电磁搅拌下，将标准整合素αVβ3抗体溶液加入胶体金溶液中，加入整合素αVβ3抗体时应逐滴加入，lmg的整合素αVβ3抗体大约5min加完；在磁性搅拌下加入终浓度为1﹪的牛血清白蛋白(BSA)。
表1 确定胶体金与整合素αVβ3抗体用量比例
| 1号管 | 2-10号管 | 11号管 | |
| 胶体金溶液1 ml | + | + | + |
| 整合素αVβ3抗体 | + | + | - |
| 5min | |||
| 10%氯化钠溶液0.1ml | - | + | + |
| 2h |
3、免疫胶体金的纯化：采用低温超速离心法纯化金标整合素αVβ3抗体，以除去溶液中未标记的整合素αVβ3抗体和未充分标记的胶体金以及在标记过程中可能形成的各种聚合物。先将金标整合素αVβ3抗体在4℃下，3000r/min低速离心40min，小心吸取上清液，弃去沉淀；上清再以10000r/min 4℃离心40min，弃去上清。用0.01mol/L、pH7.4的PBS(内含1﹪BSA，0.02﹪叠氮钠)溶解沉淀至原体积，充分稳定后过夜。再以4℃10000r/min离心40min，弃上清液。用0.01mol/L、pH7.4的PBS(内含1﹪BSA,0.02﹪叠氮钠)溶解沉淀至原体积的1/10，4℃贮存备用。
4、金标垫（结合释放垫）的制备：将胶体金标记整合素αVβ3抗体作1：5，1：10，1：50，1：100，1：500，1：1000稀释后，均匀等量浸于同样大小的玻璃纤维素膜制成金标垫。达到试纸条敏感度要求的最适胶体金复合物的稀释度，为工作浓度。保存液稀释胶体金标记整合素αVβ3抗体原液至工作浓度，均匀浸于玻璃纤维素膜，冷冻真空干燥后密封保存。
5、固相硝酸纤维素膜的制备：硝酸纤维素膜的实验反应区，定义为检测带，将整合素αVβ3抗体以直线形包被于检测带，距离检测带5 mm远的质控带(C)以直线形包被正常抗小鼠IgG抗体。37℃干燥2 h，4℃密封保存。
6、样品垫的处理：1%的BSA作为封闭蛋白质均匀浸于玻璃纤维素膜，室温干燥备用。
7、吸收垫用硬质吸水滤纸制备。
8、材料组装：在塑料底板上分别将吸液用玻璃纤维、冻干金标记抗整合素αVβ3玻璃纤维、已固定有抗整合素αVβ3抗体和抗小鼠IgG抗体的硝酸纤维素膜及硬质吸水滤纸按图1装配，配件与塑料底板的结合可用双面胶或其它粘性材料粘接。装配好的纸板按纵向剪切，裁成宽度为4mm的条状即可。
实施例3
试纸使用方法：
（1）样品制备：
宫腔冲洗液超声粉碎处理。
（2）操作：取超声粉碎处理后的宫腔冲洗液标本约1ml加入小试管中，然后将样品垫1端插入试纸条，注意不要超过样品垫1，待1分钟左右取出平放，5分钟读取结果。
（3）检测结果：参见图2，
出现1条红色(对照)沉淀线（质控线6），诊断为阴性；
出现2条红色(样品和对照)沉淀线（检测线5，质控线6），诊断为阳性，未出现沉淀线则为无效。
Claims (2)
1.一种整合素αVβ3检测试剂盒，在硝酸纤维素膜的两端分别设有金标垫和吸收垫，金标垫上端为样品垫，其特征在于：金标垫包被有纯化的整合素αVβ3抗体胶体金偶联标记物，检测线包被有纯化的整合素αVβ3抗体，质控线包被有正常抗小鼠IgG抗体，质控线侧贴有吸收垫。
2.权利要求1所述整合素αVβ3检测试剂盒制备方法，包括下述步骤：将纯化的整合素αVβ3抗体用胶体金标记，喷点于玻璃纤维膜上制备成金标垫，将纯化的整合素αVβ3抗体和正常抗小鼠IgG抗体分别包被在硝酸纤维素膜上的检测线处和质控线处，当被检样品中含有整合素αVβ3抗原时，则于金标垫与胶体金标记的整合素αVβ3抗体结合，并在吸收垫的作用下，向前渗透泳动，与检测线上的整合素αVβ3抗体再次结合，出现肉眼可见的色带。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014023819A1 (en) * | 2012-08-10 | 2014-02-13 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for predicting the survival time of a patient suffering from a glioblastoma |
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| US20070072251A1 (en) * | 2003-05-02 | 2007-03-29 | Ctt Cancer Targeting Technologies Oy | In vivo imaging using peptide derivatives |
| CN101419235A (zh) * | 2008-09-24 | 2009-04-29 | 吉林大学 | 一种kim-1检测试剂盒及其制备方法 |
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