CN101900733A - 一种肿瘤标志物胶体金免疫层析定量检测试纸条及制备方法 - Google Patents

一种肿瘤标志物胶体金免疫层析定量检测试纸条及制备方法 Download PDF

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方成
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Abstract

本发明公开了一种肿瘤标志物胶体金免疫层析定量检测试纸条及制备方法。包括样品垫、金标抗体结合物膜、硝酸纤维膜、吸水垫、反应支持物。所述的硝酸纤维膜以靠近样品垫一端为起始端，靠近吸水垫一端为末端，依次包被5条抗体条带，分别为包被鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅰ的T1、T2、T3、T4检测条带和包被羊抗鼠IgG的C质控条带，金标抗体结合物膜为喷涂有胶体金标记的鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅱ的膜。本发明实现了肿瘤标志物的快速、准确的定量检测，从而满足了应对癌症普查筛选和家庭癌症预后监测等快速检测的需要。

Description

一种肿瘤标志物胶体金免疫层析定量检测试纸条及制备方法
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及用于肿瘤检测的胶体金免疫层析定量检测试纸条及其制备的方法。
背景技术
肿瘤标志物(tumor marker，TM)是指在肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身所产生的或者是由机体对肿瘤细胞反应而产生的，反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素、酶(同工酶)及癌基因产物等。这些物质有的不存在于正常人体内只见于胚胎中，有的在肿瘤病人体内含量超过正常人体内含量。肿瘤标志物在肿瘤普查、诊断、判断预后和转归、评价治疗疗效和高危人群随访观察等方面都具有较大的实用价值。通过测定其存在或含量可辅助诊断肿瘤、分析病程、指导治疗、监测复发或转移、判断预后。目前临床上检测的肿瘤标志物绝大多数不仅存在于恶性肿瘤中，也存在于良性肿瘤、胚胎组织、甚至正常组织中。因此，肿瘤标志物动态检查和多项联合检查更有价值，所以需要一种快捷易行的肿瘤标志物定量检测手段。
临床上肿瘤标志物的检测一般采用酶联免疫吸附法分析(ELISA)，由于ELISA需要多次孵育，检测时间较长，不适宜快速检测。胶体金免疫层析技术具有简单、快速、灵敏、可现场操作等优点，已被广泛应用于鼠疫、禽流感、嗜肺军团等的检测，国内尚无成功研制出肿瘤标志物定量检测试纸条的报道。本发明利用双抗体夹心法，发明了肿瘤标志物的快速定量检测试纸条，从而满足了应对癌症普查筛选和家庭癌症预后监测等快速检测的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、准确的检测肿瘤标志物的胶体金免疫层析定量检测试纸条及其制备方法。
本发明的一种肿瘤标志物胶体金免疫层析定量检测试纸条，包括样品垫、金标抗体结合物膜、硝酸纤维膜、吸水垫、反应支持物，反应支持物位于底层，硝酸纤维膜位于反应支持物上的中部，金标抗体结合物膜位于硝酸纤维膜上部的一侧并与之部分重叠；吸水垫位于硝酸纤维膜上相对于金标抗体结合物膜而言的另一侧并与硝酸纤维膜部分重叠；样品垫位于硝酸纤维膜上与吸水垫相反的一侧并与金标抗体结合物膜部分重叠；所述的硝酸纤维膜以靠近样品垫一端为起始端，靠近吸水垫一端为末端，依次包被5条抗体条带，分别为包被鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅰ的T1、T2、T3、T4检测条带和包被羊抗鼠IgG单克隆抗体的C质控条带，金标抗体结合物膜为喷涂有胶体金标记的鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅱ的膜。
所述的每条抗体条带上鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅰ的合适包被量为0.3-1.5ug，羊抗鼠IgG纯化抗体的合适包被量为0.15-0.75ug。
所述的每条抗体条带之间有3mm的平行间隔，所述的硝酸纤维膜的宽度为0.3cm。
每8-15ug鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅱ采用1ml OD520nm值为1.5～2.0的胶体金溶液标记，胶体金颗粒直径为40nm。
所述的金标抗体结合物膜上胶体金标记的鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅱ的合适用量为5-10ul。
所述的鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅰ包括游离态前列腺特异抗原fPSA、复合态前列腺特异抗原cPSA、前列腺酸性磷酸酶PAP、核基质蛋白22NMP-22、膀胱癌抗原UBC或膀胱肿瘤抗原BTA的单克隆抗体；所述的鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅱ包括与鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅰ所述的各种抗体表位不同的单克隆抗体中的一种。
所述的样品垫选自聚脂膜或玻璃纤维；所述的金标抗体结合物膜选自聚脂膜或玻璃纤维或滤纸纤维；吸水垫选用滤纸；反应支持物选用PVC板。
所述的肿瘤标志物胶体金免疫层析定量检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(1)以鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅰ工作浓度为0.5-1mg/ml；以羊抗鼠IgG工作浓度为0.5-2.5mg/ml；以1ul/cm的量依次定量喷涂T1、T2、T3、T4、C五条抗体条带于硝酸纤维膜上，每条抗体条带之间有3mm的平行间隔；真空干燥；室温晾干后于封闭液中浸泡烘干，封存备用；
(2)以1ml OD520nm值为1.5～2.0的胶体金溶液标记8-15ug鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅱ，胶体金颗粒直径为40nm；以0.1ml/cm的涂布量喷涂在膜上；并烘干或冷冻干燥后，制成金标抗体结合物膜；
(3)将反应支持物置于底层，将步骤(1)制得的硝酸纤维膜置于反应支持物上的中部，将步骤(2)制得的金标抗体结合物膜置于硝酸纤维膜上靠近T1检测条带的一侧并与之部分重叠；吸水垫置于硝酸纤维膜上相对于金标抗体结合物膜而言的另一侧并与硝酸纤维膜部分重叠；样品垫置于硝酸纤维膜上与吸水垫相反的一侧并与金标抗体结合物膜部分重叠；组装，切取，即可。
肿瘤标志物定量检测的方法是取出试纸，将待测标本与样品稀释液混匀，再将样品混合液加入试纸样品孔处，样品中的液体依靠虹吸作用上行，10-15分钟判读结果。可依据以下两种方法进行肿瘤标志物的定量：
1、直观检测：计数显色T线的条数和观察颜色深浅，比对标准液显色情况表，从表中读取肿瘤标志物浓度；
2、定量检测：将空白样品用试纸检测20次，然后用金标试纸分析仪扫描读取信号T/C比值。20个样品T/C比值的平均值(AVERAGE)与3倍标准差(STDEVA)之和为CUT-OFF值。将显色后的金标条放入金标试纸分析仪扫描，读取各条测试线的信号T/C比值，可得到肿瘤标志物浓度。
利用本发明方法制备的前列腺癌和膀胱癌检测试纸，利用目视或配备手持式金标试纸分析仪，可实现多种肿瘤标志物的定量检测。检测操作十分简便，普通人也可以熟练操作。同时其检测灵敏度高，特异性好，检测周期短，适合基层医疗单位，家庭用户使用。可用于前列腺癌和膀胱癌的筛查和监测。
附图说明
图1为肿瘤标志物定量检测试纸平面结构区域图；
图2为肿瘤标志物定量检测试纸纵切面结构图；
其中：1-样品垫，2-金标抗体结合物膜，3-硝酸纤维素膜，4-吸水垫，51-T1检测条带，52-T2检测条带，53-T3检测条带，54-T4检测条带，55-C质控条带，6-下聚酯膜，7-上聚酯膜，8-max线，9-色皮，10-反应支持物；
图3为本发明试纸条检测显色示意图；
图4为本发明试纸条检测显色照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，而不会限制本发明。
本发明的肿瘤标志物胶体金免疫层析定量检测试纸条，包括样品垫1、金标抗体结合物膜2、硝酸纤维膜3、吸水垫4、反应支持物10。反应支持物10位于底层，硝酸纤维膜3位于反应支持物10上的中部，金标抗体结合物膜2位于硝酸纤维膜3上部的一侧并与之部分重叠；吸水垫4位于硝酸纤维膜3上相对于金标抗体结合物膜2而言的另一侧并与硝酸纤维膜3部分重叠；样品垫1位于硝酸纤维膜3上与吸水垫4相反的一侧并与金标抗体结合物膜2部分重叠。所述的硝酸纤维膜3以靠近样品垫1一端为起始端，靠近吸水垫4一端为末端，依次包被5条抗体条带，分别为包被鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅰ的T1、T2、T3、T4检测条带和包被羊抗鼠IgG的C质控条带，金标抗体结合物膜2为喷涂有胶体金标记的鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅱ的膜。
实施例1
本实施例的试纸条及试纸盒的制备方法包括以下步骤：
1、抗体制备
选用商品化的配对好的鼠抗人游离态前列腺特异抗原(fPSA)单克隆抗体Ⅰ和Ⅱ(产品型号：A8014-1，A8014-2北京博迈世纪生物技术有限公司)，对20mM，pH7.4的PBS 4℃透析过夜备用。
2、硝酸纤维膜的包被
包被缓冲液的配制：0.02M pH 7.4的磷酸缓冲液(PBS)为包被缓冲液，0.22um微孔滤膜过滤除菌后置4℃保存备用，有效期两周。
封闭液的配制：含0.5％BSA的0.02M，pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，0.22um微孔滤膜过滤除菌后置于4℃保存备用，有效期一周。
用包被缓冲液将鼠抗人游离态前列腺特异抗原单克隆抗体1稀释为1mg/ml，羊抗鼠IgG单克隆抗体稀释为1mg/ml，使用定量喷膜装置BioDot以1ul/cm的量将二者以3mm的间隔均匀喷印于2.5cm宽度硝酸纤维素膜上。室温晾干30分钟后，于封闭液中浸泡30分钟后，于37℃烘干8小时，加入干燥剂封存备用。
3、胶体金标记鼠抗游离态前列腺特异抗原单克隆抗体Ⅱ的制备
分别取直径为40nm的胶体金20ml及鼠抗人游离态前列腺特异抗原单克隆抗体Ⅱ200ug，在pH9.0的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加牛血清白蛋白(BSA)作为稳定剂，且使得BSA最终浓度为1％，采用高速离心法(10000r/min，30min，4℃)除去未结合的单克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀即为胶体金-抗体复合物。
4、金标抗体结合物膜制备
用20ml 0.2％聚乙二醇缓冲液洗涤胶体金-抗体复合物，离心除去上清液，得到深红色沉淀，纯化后的沉淀用2ml浓度为20mmol/L，PH 8的硼酸缓冲液溶解，用BioDot喷膜仪以0.1ml/cm的量均匀喷涂于0.8cm宽度玻璃纤维膜上，37℃真空干燥3小时，即得到金标抗体结合物膜。
5、样品垫的处理
将2.5cm宽度样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡处理1小时后取出37℃烘干3小时。样品垫处理液是含有1％Casein和1.0％的PVA以及0.2％Tween-20的0.02M，pH7.4的PBS溶液。
6、试纸条的组装及切割
下述所有操作都必须在湿度小于20％，温度20-25℃的房间内进行。试纸的组装：使用BioDot LMS000型组装仪按照图2要求将2.5cm宽的包被鼠抗人游离态前列腺特异抗原单克隆抗体Ⅰ和羊抗鼠IgG单克隆抗体的硝酸纤维膜，2.5cm宽的吸水垫，0.8cm宽的金标抗体结合物膜，2.5cm宽的样品垫组装于8cm宽度透明塑料底板上，覆盖上max线和色皮，组装成试纸条。使用BioDot CM4000型切条机将组装好的试纸板切成0.3cm宽的成品试纸条。下聚酯膜6，上聚酯膜7能将金标抗体结合物膜与反应支持物和max线8隔离开，防止金标抗体结合物膜直接与反应支持物和max线8上的不干胶接触，从而避免金标抗体结合物释放不完全。max线8能指示测试试纸可插入样品的深度，并且增强金标抗体结合物膜与硝酸纤维素膜的结合紧密性。色皮9能指示试纸的手持端，并且增强吸水垫与硝酸纤维素膜的结合紧密性。
用上述1-6步骤的方法同样制备出了复合态前列腺特异抗原(cPSA)，前列腺酸性磷酸酶(PAP)，核基质蛋白-22(NMP-22)，膀胱癌抗原(UBC)，膀胱肿瘤抗原BTA等肿瘤标志物的胶体金免疫层析快速定量检测试纸。以上所需抗体均来源于北京博迈世纪生物技术有限公司。
实施例2
本发明的肿瘤标志物快速定量检测试纸的使用方法：
将待测标本与样品稀释液混匀，再将试纸插入样品混合液中，样品中的液体依靠虹吸作用上行，10-15分钟判读结果。可依据以下两种方法进行肿瘤标志物的定量：
1、直观检测：计数显色T线的条数和观察颜色深浅，比对标准液显色情况表，从表中读取游离态前列腺特异抗原浓度。
按确定的最佳条件制备游离态前列腺特异抗原胶体金免疫层析试纸条，检测不同浓度的游离态前列腺特异抗原。将游离态前列腺特异抗原用样品处理液配制成1ng/ml、3ng/ml、5ng/ml、7ng/ml。三次重复测定，如图3，4所示，＜1ng/ml时无检测线显色，1ng/ml时只一条检测线显色、3ng/ml时有两条检测线显色；5ng/ml时有三条检测线显色、7ng/ml时有四条检测线显色性反应；即肉眼可观察到的最低浓度＜1ng/ml；C线不显色说明试纸已失效。
2、定量检测：
将空白样品用试纸检测20次，然后用金标试纸分析仪扫描读取信号T/C比值。20个样品T/C比值的平均值(AVERAGE)与3倍标准差(STDEVA)之和为CUT-OFF值。将显色后的金标条放入金标试纸分析仪扫描，读取各条测试线的信号T/C比值，可得到游离态前列腺特异抗原浓度。
实施例3
稳定性试验将新制备的胶体金免疫层析试纸条于37℃存放8天，分别用1ng/ml、3ng/ml、5ng/ml、7ng/ml肿瘤标志物游离态前列腺特异抗原进行检测，结果显示和新制备的检测试纸条相比，灵敏度没有明显下降，且特异性良好。

Claims (10)

1.一种肿瘤标志物胶体金免疫层析定量检测试纸条，包括样品垫、金标抗体结合物膜、硝酸纤维膜、吸水垫、反应支持物，反应支持物位于底层，硝酸纤维膜位于反应支持物上的中部，金标抗体结合物膜位于硝酸纤维膜上部的一侧并与之部分重叠；吸水垫位于硝酸纤维膜上相对于金标抗体结合物膜而言的另一侧并与硝酸纤维膜部分重叠；样品垫位于硝酸纤维膜上与吸水垫相反的一侧并与金标抗体结合物膜部分重叠；其特征在于，所述的硝酸纤维膜以靠近样品垫一端为起始端，靠近吸水垫一端为末端，依次包被5条抗体条带，分别为包被鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅰ的T1、T2、T3、T4检测条带和包被羊抗鼠IgG单克隆抗体的C质控条带，金标抗体结合物膜为喷涂有胶体金标记的鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅱ的膜。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述的每条抗体条带上鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅰ的包被量为0.3-1.5ug，羊抗鼠IgG纯化抗体的包被量为0.15-0.75ug。
3.根据权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于，所述的每条抗体条带之间有3mm的平行间隔，所述的硝酸纤维膜的宽度为0.3cm。
4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，每8-15ug鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅱ采用1ml OD520nm值为1.5～2.0的胶体金溶液标记，胶体金颗粒直径为40nm。
5.根据权利要求2或4所述的试纸条，其特征在于，所述的金标抗体结合物膜上胶体金标记的鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅱ的用量为5-10ul。
6.根据权利要求1或2或4所述的试纸条，其特征在于，所述的鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅰ包括游离态前列腺特异抗原fPSA、复合态前列腺特异抗原cPSA、前列腺酸性磷酸酶PAP、核基质蛋白22NMP-22、膀胱癌抗原UBC或膀胱肿瘤抗原BTA的单克隆抗体；所述的鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅱ包括与鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅰ所述的各种抗体表位不同的单克隆抗体中的一种。
7.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述的样品垫选自聚脂膜或玻璃纤维；所述的金标抗体结合物膜选自聚脂膜或玻璃纤维或滤纸纤维；吸水垫选用滤纸；反应支持物选用PVC板。
8.权利要求1所述的肿瘤标志物胶体金免疫层析定量检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅰ工作浓度为0.5-1mg/ml；以羊抗鼠IgG工作浓度为0.5-2.5mg/ml；以1ul/cm的量依次定量喷涂T1、T2、T3、T4、C五条抗体条带于硝酸纤维膜上，每条抗体条带之间有3mm的平行间隔；真空干燥；室温晾干后于封闭液中浸泡烘干，封存备用；
(2)以1ml OD520nm值为1.5～2.0的胶体金溶液标记8-15ug鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅱ，胶体金颗粒直径为40nm；以0.1ml/cm的涂布量喷涂在膜上；并烘干或冷冻干燥后，制成金标抗体结合物膜；
(3)将反应支持物置于底层，将步骤(1)制得的硝酸纤维膜置于反应支持物上的中部，将步骤(2)制得的金标抗体结合物膜置于硝酸纤维膜上靠近T1检测条带的一侧并与之部分重叠；吸水垫置于硝酸纤维膜上相对于金标抗体结合物膜而言的另一侧并与硝酸纤维膜部分重叠；样品垫置于硝酸纤维膜上与吸水垫相反的一侧并与金标抗体结合物膜部分重叠；组装，切取，即可。
9.根据权利要求8所述的试纸条的制备方法，其特征在于，所述的样品垫选自聚脂膜或玻璃纤维；金标抗体结合物膜选自聚脂膜或玻璃纤维或滤纸纤维；吸水垫选用滤纸；反应支持物选用PVC板。
10.根据权利要求8所述的试纸条的制备方法，其特征在于，所述的鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅰ包括游离态前列腺特异抗原fPSA、复合态前列腺特异抗原cPSA、前列腺酸性磷酸酶PAP、核基质蛋白22NMP-22、膀胱癌抗原UBC或膀胱肿瘤抗原BTA的单克隆抗体；所述的鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅱ与鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅰ所述的各种抗体表位不同的单克隆抗体中的一种。
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