FI113840B - Matriisi-metalloproteinaasi-inhibiittorien käyttö liposomien kohdentamisessa - Google Patents

Matriisi-metalloproteinaasi-inhibiittorien käyttö liposomien kohdentamisessa Download PDF

Info

Publication number
FI113840B
FI113840B FI20010620A FI20010620A FI113840B FI 113840 B FI113840 B FI 113840B FI 20010620 A FI20010620 A FI 20010620A FI 20010620 A FI20010620 A FI 20010620A FI 113840 B FI113840 B FI 113840B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
liposomes
peptides
ctt
cells
amino acid
Prior art date
Application number
FI20010620A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20010620A0 (fi
FI20010620A (fi
Inventor
Paavo Kinnunen
Erkki Koivunen
Medina Oula Penate
Original Assignee
Ctt Cancer Targeting Tech Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ctt Cancer Targeting Tech Oy filed Critical Ctt Cancer Targeting Tech Oy
Publication of FI20010620A0 publication Critical patent/FI20010620A0/fi
Priority to FI20010620A priority Critical patent/FI113840B/fi
Priority to US10/471,980 priority patent/US20040213833A1/en
Priority to ES02706813T priority patent/ES2266458T3/es
Priority to RU2003131332/15A priority patent/RU2003131332A/ru
Priority to PL02365248A priority patent/PL365248A1/xx
Priority to PCT/FI2002/000252 priority patent/WO2002076491A1/en
Priority to EP02706813A priority patent/EP1372694B1/en
Priority to NZ528043A priority patent/NZ528043A/en
Priority to IL15811402A priority patent/IL158114A0/xx
Priority to CZ20032805A priority patent/CZ20032805A3/cs
Priority to JP2002575004A priority patent/JP2004529127A/ja
Priority to KR10-2003-7012506A priority patent/KR20040000414A/ko
Priority to CNB028073118A priority patent/CN1250279C/zh
Priority to SK1298-2003A priority patent/SK12982003A3/sk
Priority to AT02706813T priority patent/ATE331526T1/de
Priority to CA002441227A priority patent/CA2441227A1/en
Priority to DK02706813T priority patent/DK1372694T3/da
Priority to BR0208681-6A priority patent/BR0208681A/pt
Priority to EEP200300467A priority patent/EE200300467A/xx
Priority to DE60212814T priority patent/DE60212814T2/de
Priority to HU0303649A priority patent/HUP0303649A3/hu
Priority to YU74703A priority patent/YU74703A/sh
Publication of FI20010620A publication Critical patent/FI20010620A/fi
Priority to NO20034280A priority patent/NO20034280L/no
Application granted granted Critical
Publication of FI113840B publication Critical patent/FI113840B/fi
Priority to US11/125,186 priority patent/US20050271588A1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/12—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules
    • A61K51/1217—Dispersions, suspensions, colloids, emulsions, e.g. perfluorinated emulsion, sols
    • A61K51/1234—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/12—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules
    • A61K51/1282—Devices used in vivo and carrying the radioactive therapeutic or diagnostic agent, therapeutic or in vivo diagnostic kits, stents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

113840
Matriisi-metalloproteinaasi-inhibiittorien käyttö liposomien kohdentamisessa Keksinnön ala 5 Esillä oleva keksintö koskee kohdennettua syöpähoitoa ja koskee nimenomaisesti pienten matriisi-metalloproteinaasi-inhibiittoreiden käyttöä liposomien kohdentamisen parantamisessa syöpäsoluihin, ja niiden sisäänoton tehostamisessa tällaisiin soluihin. Keksintö saa näin ollen aikaan menetelmän syövän hoitamiseksi, sekä menetelmän liposomien kohdentamisen parantamiseksi tuumori soluihin, menetelmän liposomien 10 sisäänoton tehostamiseksi tuumorisoluihin, ja menetelmän kemoterapeuttisten aineiden valikoitua liposomaalista kuljetusta varten tuumori solujen sisään.
Keksinnön tausta 15 Matriisi-metalloproteinaasit (MMPt) muodostavat sellaisten entsyymien perheen, jotka kykenevät hajottamaan tyvikalvoa ja soluväliainetta (ECM), myötävaikuttaen näin kudosten uusiutumiseen ja solujen migraatioon (Koivunen et ai, 1999; Shapiro, 1997). MMPt voidaan jakaa alaryhmiin, joista toisen muodostavat tyypin IV kollagenaasit eli gelatinaasit, MMP-2 ja MMP-9. Gelatinaasien ilmentyminen normaaleissa soluissa, kuten 20 trofoblasteissa, osteoklasteissa, neutrofiileissä ja makrofageissa on tiukasti säädeltyä. Muiden MMPiden tavoin gelatinaasit erittyvät inaktiivisessa muodossa (pro-MMP) ja ' · *: niiden aktivaatioon tarvitaan proteolyyttistä hajotusta.
Gelatinaasien ja muiden MMPiden kohonnut tai säätelemätön ilmentyminen voi osaltaan . , 25 edistää monien tautien patogeneesiä, mukaan luettuna tuumorin angiogeneesi ja metastaasi, nivelreuma, multippeliskleroosi, ja periodontiitti. Gelatinaaseja inaktivoivat yhdisteet voivat näin ollen tarjota mahdollisen hoitokeinon syövälle ja tulehdustaudeille (Sorsa et ai., 1994; Lauhio et ai., 1991). Vaikka monia MMP:n inhibiittoreita on kuvattu, ei ·. ; gelatinaasien spesifisiä inhibiittoreita ole ollut saatavilla (Lauhio et ai, 1991). Äskettäin 30 seuloimme satunnaisia faagipeptidikirjastoja tavoitteena kehittää selektiivinen inhibiittori tätä MMP-alaryhmää vastaan. Aktiivisimman niistä johdetun peptidin, lyhennettynä CTT, !.. havaittiin selektiivisesti inhiboivan tutkituista MMP-perheen jäsenistä MMP-2:n ja MMP- 9:n aktiivisuutta (Koivunen et ai, 1999). CTT myös inhiboi endoteeli- ja tuumorisolujen 113840 2 migraatiota in vitro, sekä tuumorin kehittymistä in vivo hiirimalleissa, osoittaen gelatinaasien tärkeyden tuumori-invaasiossa.
Kokeet tuumoriksenotransplantaatteja kantavissa hiirissä osoittivat, että CTT:tä esitteleviä 5 faageja kerääntyi tuumori verisuonistoon, kun niitä oli injektoitu suonensisäisesti vastaanottajahiiriin. Faagin kohdentuminen tuumoreihin estyi antamalla samalla CTT-peptidiä (Koivunen et ai., 1999). Nämä tulokset viittaavat siihen, että CTT:tä, sen lisäksi että se itse on tehokas tuumorivastainen aine syöpäsolujen migraatiota ja angiogeneesiä estämällä, voidaan myös käyttää hyödyksi kemoterapeuttisten aineiden kohdentamiseksi 10 tuumoreihin.
Kemoterapiassa vain murto-osa lääkkeestä saavuttaa syöpäsolut, kun taas loput lääkkeestä saattaa vahingoittaa normaaleja kudoksia. Haitallisia vaikutuksia voidaan vähentää antamalla syöpälääkkeet liposomeihin kapseloituina (Lasic et ai., 1995). Parannettuja 15 liposomikoostumuksia on kuvattu, niiden pysyvyyden parantamiseksi ja myös niiden eliniän pidentämiseksi verenkierrossa (Tardi et ai, 1996). Sekä in vitro- että in vivo-tutkimuksia syöpäsoluihin kohdennettujen liposomien kehityksestä on raportoitu (Northfelt et ai, 1996; Adlakha-Hutcheon et ai, 1999). Tehostunut selektiivisyys voidaan saada aikaan derivatisoimalla liposomit spesifisillä vasta-aineilla, jotka tunnistavat kohdesolujen 20 plasmamembraanin antigeenejä, näin lisäten liposomien ottoa soluihin (Storm ja Crommelin, 1998). Koska sekä MMP-2:a (Toth et ai, 1997) ja MMP-9:a (Brooks et ai, • / 1996) sitovat spesifiset solun pinnan reseptorit, nämä entsyymit edustavat mahdollisia ;;; reseptoreita liposomikohdennusta varten invasiivisiin soluihin, kuten tuumorisoluihin ja angiogeenisiin endoteelisoluihin.
.· ·' 25
Lisäksi monometoksipolyetyleeniglykoliin (PEG) konjugoituja fosfolipidejä on käytetty laajalti aina vuodesta 1984, jolloin Sears kytki toisiinsa amidisidoksen välityksellä karboksi-PEGin ja soijan puhdistetun fosfatidyylietanoliamiinin (PE) (Sears, 1984). PEG:n . *. : lisääminen liposomin pintaan kerää vesikuoren ympäröimään liposomia. Tämä kuori estää 30 erilaisten plasmaproteiinien (opsoniinien) adsorboitumisen liposomin pintaan siten, että • * » .;. ‘ retikuloendoteliaalijärjestelmä ei tunnista liposomeja eikä ota niitä sisäänsä.
113840 3
Keksinnön yhteenveto
Esillä oleva keksintö perustuu sille havainnolle, että tietyt MMP-inhibitoriset peptidit parantavat liposomien kohdentumista syöpäsoluihin ja tehostavat liposomien ottoa 5 tällaisiin soluihin.
Sen mukaisesti keksintö kohdistuu peptidiyhdisteiden, joissa on syklinen motiivi C(X)yHWGFXXC (SEQ ID NO:l tai 3) tai peptidiyhdisteiden, joissa on lineaarinen motiivi S(X)yHWGFXXS (SEQ ID NO:4 tai 5), joissa X on mikä tahansa 10 aminohappotähde ja y on kokonaisluku 2 tai 3, käyttöön liposomien kohdentamisen parantamisessa tuumorisoluihin, tai liposomien oton tehostamisessa tuumorisoluihin.
Keksinnön muita tavoitteita ovat vastaavat menetelmät, s.o. menetelmä liposomien kohdentamisen parantamiseksi potilaan tuumorisoluihin, ja menetelmä tuumorisolujen 15 liposomioton tehostamiseksi, jossa vähintään yksi peptidiyhdiste, jossa on syklinen motiivi C(X)yHWGFXXC, tai peptidiyhdiste, jossa on lineaarinen motiivi S(X)yHWGFXXS, joissa X on mikä tahansa aminohappotähde ja y on kokonaisluku 2 tai 3, sekoitetaan liposomien kanssa ja saatu seos annetaan potilaalle.
20 Vielä toinen keksinnön tavoite on menetelmä kemoterapeuttisten aineiden valikoitua liposomaalista kuljetusta varten potilaan tuumorisoluihin, jossa vähintään yksi • ’' peptidiyhdiste, jossa on syklinen motiivi C(X)yHWGFXXC, tai peptidiyhdiste, jossa on ;;; lineaarinen motiivi S(X)yHWGFXXS, joissa X on mikä tahansa aminohappotähde ja y on kokonaisluku 2 tai 3, sekoitetaan vähintään yhtä kemoterapeuttista ainetta kantavien . . 25 liposomien kanssa ja saatu seos annetaan potilaalle.
Keksintö saa näin ollen aikaan menetelmän syövän hoitamiseksi potilaassa, saaden aikaan vähintään yhtä kemoterapeuttista ainetta kantavia liposomeja, sekoittamalla liposomeihin : vähintään yhtä peptidiyhdistettä valittuna ryhmästä, joka koostuu peptideistä, joissa on . “' 30 syklinen motiivi C(X)yHWGFXXC ja peptideistä, joissa on lineaarinen motiivi S(X)yH- • Y WGFXXS, joissa X on mikä tahansa aminohappotähde ja y on kokonaisluku 2 tai 3, ja ... antamalla saatu sekoitus potilaalle.
113840 4
Keksinnön edullisessa lisäsuoritusmuodossa edellä määritellyt menetelmät toteutetaan siten, että polyetyleeniglykolia (PEG) kiinnitetään liposomeihin, edullisesti liposomin pinnalle, ennen peptidiyhdisteen sekoittamista liposomeihin.
5 Vielä eräs keksinnön lisätavoite on diagnostinen menetelmä, jossa kuvattuja peptidiyhdisteitä käytetään kohdentamaan leima epäiltyyn tuumoriin. Radioaktiivinen tai magneettinen leima voidaan liittää C(X)yHWGFXXC-peptidiin, tai liposomin sisään, tai liposomin pinnalle, joka kohdennetaan tuumorin kohtaan C(X)yHWGFXXC-peptidillä. Tuumorin diagnoosi suoritetaan leimatun peptidin tai peptidiliposomien i.v. injektiolla, ja 10 mitataan gamma-kuvantamisella tai autoradiografialla.
Keksintöä kuvataan tässä jäljempänä yksityiskohtaisemmin oheisiin piirroksiin viitaten.
Piirrosten lyhyt kuvaus 15
Kuvio IA. MMP-2 -aktiivisuuden inhibitio peptideillä CTT, CLP, STT ja CWL, kukin 85 μΜ:η pitoisuudessa ja kaseiinitsymografialla määritettynä. Tulokset esitetään hajotetun alueen prosenttiosuutena, jossa inhiboimaton MMP-2 katsotaan 100 %:ksi. Virhepylväät edustavat standardipoikkeamaa kolmelle erilliselle kokeelle.
20 ;·\ Kuvio IB. MMP-9:n inhibitio vapaalla CTT:lla (o) ja liposomeihin sitoutuneella (·) mitattuna käyttäen fluorogeenistä substraattia kuten materiaalit ja menetelmät -osassa !!! kuvataan. Fosfolipidin kokonaispitoisuus oli 200 μΜ POPC/POPE (80/20 mol/mol).
<t’’: Tulospisteet edustavat keskiarvoja kolmesta kokeesta pylväiden kuvatessa ,· · 25 standardipoikkeamaa.
Kuvio 2. CTT:n (·), CLP:n (), ja STT:n (▲) tunkeutuminen eggPC -yksöiskerrokseen, joka käy ilmi pintapaineen nousuna (Δπ) ilmoitetun peptidin lisäämisen jälkeen ‘; vesialifaasiin. Tulokset esitetään alkupintapaineen funktiona (πο).
:·; . 30 v Kuvio 3A. Anisotropia (r) CTT:n Trp-tähteelle POPC/POPE:n (80/20 mol/mol) ’...· pitoisuuden funktiona. Tulospisteet edustavat keskiarvoa viidestä mittauksesta virhepylväiden ilmoittaessa standardipoikkeamat. Signaali-kohinasuhteen parantamiseksi 113840 5 signaalin keskiarvoa arvioitiin 15 s ajan. CTT:n pitoisuus oli 5 μΜ PBS:ssa ja lämpötila oli 37 °C.
Kuvio 3B. Trp-emission voimakkuus vapaalle CTT-peptidille (o) ja sen 5 liposomikompleksille (·) mitattiin käyttäen I':a vesiliukoisena törmäysvaimentimena. Tulospisteet edustavat kahta erillistä mittausta.
Kuvio 4. U937-, CHO-, ja HT1080-solujen, joita oli inkuboitu PC/PE-liposomien (molaarinen suhde 80/20), joissa oli, kuten merkitty, sisään kapseloitu fluoresoiva 10 markkeri ja kohdennuspeptidi CTT, kanssa, rodamiini B:n oton fluoresenssimikroskopiakuvat. Kentät A ja B esittävät U 937 -soluja, joita on inkuboitu CTT:tä sisältävien liposomien kanssa ja vastaavasti CTT:tä sisältämättömien liposomien kanssa. Kentät C ja D kuvaavat samaa koetta HT 1080 -soluille ja kentät E ja F CHO-soluille (altistusaika pidennetty kymmenkertaiseksi).
15
Kuvio 5A. Osoitettujen peptidien vaikutukset rodamiini B:tä sisältävien liposomien (PC/PE, molaarinen suhde 80/20) ottoon U937-soluilla. Kokonaislipidi-, rodamiini B-, ja peptidipitoisuudet olivat 200 μΜ, 2 μΜ ja vastaavasti 100μΜ. Tulokset on normalisoitu vertaamalla niiden solujen rodamiinifluoresenssia, joita oli inkuboitu liposomien kanssa, .... 20 joissa oli lisätty peptidi (I), soluihin, joita oli inkuboitu liposomien kanssa, joissa ei ollut , ·. · peptidiä (Io = kontrolli). Virhepylväät edustavat standardipoikkeamaa (n=3).
.··* Kuvio 5B. CTT lisättiin liposomeihin, joissa oli kapseloituna liukoinen ..... fluoresenssimarkkeri rodamiini B. Tämän fluoroforin otto HT1080-soluihin määritettiin 25 liposomien kanssa 37 °C:ssa tai 4 °C:ssa tapahtuneen 30 min inkubaation jälkeen. Tulospisteet ovat keskiarvoja ± SD kolmesta rinnakkaisesta kuopasta.
Kuvio 6. Osoitettujen vasta-aineiden vaikutukset rodamiini B:tä sisältävien liposomien (PC/PE, molaarinen suhde 80/20) ottoon HT 1080 -soluihin. Tulokset esitetään 30 prosentteina sellaisten solujen rodamiinifluoresenssista (joka katsottiin 100 %:ksi), joita I t ; oli inkuboitu CTT-peptidi-liposomien kanssa ilman vasta-aineita alustassa. Käytettävät :’' vasta-aineet ovat anti-MMP-2, anti-MMP-9 ja integriini β3:η antisytosolinen domeeni, jota .···. käytettiin kontrollivasta-aineena. Osoitetun peptidin, adriamysiinin, vasta-aineiden, ja liposomien (kokonaisfosfolipidinä ilmaistuna) lopulliset pitoisuudet olivat vastaavassa järjestyksessä 85 μΜ, 0,2 mM, 20 pg/ml, and 0,4 μΜ. Virhepylväät edustavat standardipoikkeamaa neljälle erilliselle kokeelle.
113840 6 5 Kuvio 7. Osoitettujen gelatinaasin inhibiittoreiden vaikutukset rodamiini B:tä sisältävien liposomien (PC/PE, molaarinen suhde 80/20) ottoon HT 1080 -soluihin. Tulokset esitetään prosentteina sellaisten solujen rodamiinifluoresenssista (joka katsottiin 100 %:ksi), joita oli inkuboitu CTT-peptidi-liposomien kanssa ilman vasta-aineita alustassa. Tässä käytetty inhibiittori on TIMP-2 (10 pg/ml). Marimastat (50 μΜ) on MMP-ryhmää inhiboiva 10 synteettinen lääkeaine, EDTA on Zn2+:n kelaattori (500 μΜ) ja aprotiniini (1 pg/ml) on seriiniproteaasin inhibiittori. Osoitetun peptidin, rodamiinin, ja liposomien (kokonaisfosfolipidinä ilmaistuna) lopulliset pitoisuudet olivat vastaavassa järjestyksessä 85 μΜ, 0,2 mM, ja 0,4 μΜ. Virhepylväät edustavat standardipoikkeamaa neljälle erilliselle kokeelle.
15
Kuvio 8. CTT:n, CLP:n, STT:n ja CWL:n vaikutusten vertailu adriamysiiniä sisältävien liposomien indusoimaan U937-solujen tappoon EthD-l:n fluoresenssilla määritettynä. Soluja inkuboitiin liposomeihin (200 μΜ kokonaisfosfolipidi, PC/PE = 80/20, molaarinen suhde) kapseloidun adriamysiinin (200 ng/ml) ja osoitettujen peptidien kanssa. Osoitetun 20 peptidin, adriamysiinin, ja liposomien (fosfolipidinä ilmaistuna) lopulliset pitoisuudet
I I I
,·. olivat vastaavassa järjestyksessä 85 μΜ, 0,2 mM, ja 0,4 μΜ. Tulokset ilmoitetaan . muodossa RFI/RFIo, jossa RFIo on niiden solujen arvo, joita inkuboitiin adriamysiiniä :' ’ “ sisältävien liposomien kanssa ilman peptidejä. Peptidien pitoisuus oli 85 μΜ. Virhepylväät 4 · · • · * * osoittavat standardipoikkeamia (n=3).
25
Kuvio 9. CTT-liposomien otto korreloi forboliesterin lisäämisen kanssa lyhyillä induktioajoilla, minkä tiedetään stimuloivan gelatinaasi-ilmentymistä, ja siten gelatinaaseja solun pinnalla. Kun induktioaika pitenee, on gelatinaaseja myös alustassa. Vapaan '. 1 gelatinaasin määrä alustassa kasvaa, minkä avulla liposomien otto estyy.
^ 30 : : Kuvio 10. Sytokromi c:n kohdentaminen HT1080-soluihin käyttäen CTT-PEG-liposomeja.
Solujen elinkyky testataan MTT-määrityksellä ja tulokset esitetään suhteellisena fluoresenssin voimakkuutena 590 nm:n aallonpituudella. 'Ei lisäystä' ilmaisee solujen 113840 7 elinkyvyn ilman toksista lääkeainetta. 'Lääkeaine ilman liposomeja' ilmaisee tilanteen, jossa sytokromi c lisätään soluille ilman liposomeja. 'Kohdentamattomat lääkeaineliposomit' ovat pegyloituja liposomeja ilman CTT:ta, ja 'CTT-lääkeaineliposomit' ovat pegyloituja liposomeja, joissa CTT-peptidi on liitetty PEG:n etäällä oleviin päihin.
5
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Lyhenteet: CLP CLPGHWGFPSC (SEQ ID NO:7) 10 CTT CTTHWGFTLC (SEQ ID NO:6) CWL CWLTFTHGTC (SEQ ID NO:9) DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO dimetyylisulfoksidi DPPE dipalmitoyylifosfatidyylietanoliamiini 15 DPPRho 1,2-diheksadekanoyyli-sn-glysero-3-fosfoetanoliaminotiokarbamoyyli-N- 6-tetrametyylirodamiini ECM ekstrasellulaarinen matriksi EGF epidermaalinen kasvutekijä eggPC munankeltuaisen fosfatidyylikoliini 20 LUV suuri unilamellaarinen vesikkeli MLV multilamellaarinen vesikkeli MMP matriisi-metalloproteinaasi NBD-PE l-asyyli-2-((7-nitro-2-l,3-bentsoksadiatsol-4-yyli)amino)dodekanoyyli- 1 «-glysero-3 -fosfoetanoliamiini 25 NHS N-hydroksisulfosukkinimidi PA fosfatidyylihappo PC fosfatidyylikoliini *. t * PE fosfatidyylietanoliamiini . ,· PEG polyetyleeniglykoli 30 POPC l-palmitoyyli-2-oleoyyli-sn-glysero-3-fosfokoliini •,., POPE l-pahmtoyyli-2-oleoyyli-s«-glysero-3-fosfoetanoliamiini .... RFI suhteellinen fluoresenssin voimakkuus , , SDS natriumdodekyylisulfaatti :. STT STTHWGFTLS (SEQ ID NO:8) 35 TIMP-2 metalloproteinaasi-2:n kudosinhibiittori
Gelatinaasia inhiboivat peptidit. Kolme peptidiä valittiin tätä tutkimusta varten (taulukko 1). CTT on äskettäin kuvattu syklinen kollagenaasin inhibiittori, jonka on osoitettu , 40 kohdentuvan tuumoreihin (Koivunen et ai., 1999). STT on CTT:n vastaava lineaarinen V sekvenssi, jossa terminaaliset kysteiinit korvattiin seriineillä. Kolmas peptidi oli CTT- homologi CLP, joka on löydetty sekvenssihomologiahaulla SWISS-PROT- ja EMBL- f tietokannoista Blast 1.4.11 -ohjelmalla. Koska päämielenkiintomme oli CTT:n 113840 8 konservoitumit osa, oli hakusekvenssimme CXXHWGFTXC (SEQ ID NO:2)(Koivunen et ah, 1999). Tietokonehaku paljasti yhdeksän homologia, niiden joukossa CLP:n sekvenssi, joka on osa EGF-7-domeenia ihmisen laminiinin β-1-ketjussa (LMB1). Kolme muista kahdeksasta homologista olivat laminiineja muista lajeista, yksi oli immunoglobuliinin 5 raskasketjusta, ja neljä oli tiatsidille herkkiä natriumin ja kloridin kotransporttereita ihmisestä ja muista lajeista. Koska tällä jälkimmäisellä ryhmällä oli vähemmän ilmeistä samanlaisuutta CTT:n kanssa, keskityimme niiden sijaan CLP:hen, CTT:tä muistuttavaan laminiinin EGF-7-domeenin sekvenssiin. Huomionarvoista oli, että kaikki kolme peptidiä (CTT, CLP ja STT) inhiboivat MMP-2:n aktiivisuutta kaseiinitsymografialla mitattuna 10 (kuvio 1). Inhibition määrä oli noin 70 % CTT-pitoisuudessa 85 μΜ. Myös CLP oli MMP-2:n tehokas inhibiittori, aiheuttaen 50 %:n inhibition 85 μΜ:η peptidipitoisuudessa. Lineaarinen CTT-analogi STT (85 μΜ) vähensi MMP-2:n aktiivisuutta noin 30 %:lla. Samanlaisia tuloksia saatiin myös MMP-9:llä.
15 Vapaa CTT ja liposomien kanssa kompleksoitu CTT inhiboivat MMP-9:aa myös gelatinaasimäärityksellä tutkittuna fluorogeenistä peptidiä substraattina käyttäen (kuvio IB), sopusoinnussa kaseiinitsymografialla saatujen tulosten kanssa. IC50-arvot CTT:lle ja CTT-liposomille olivat 8 μΜ molemmissa määrityksissä. Nämä tulokset lisäksi osoittavat MMP-9:n kanssa vuorovaikutuksessa olevan CTT:n epitoopin, joka säilyy saatavilla 20 olevana vuorovaikutukselle entsyymin kanssa ollessaan sitoutuneena lipidikalvoon. MMP-'...: 9:n (5 nM) täydellinen inhibitio tässä määrityksessä saatiin 100 μΜ EDTA:lla, joka kelatoi ’. ·: katalyysille vaadittavan Zn2+:n.
'···’ Vuorovaikutus fosfolipidiyksöiskerrosten kanssa. CTT:n aminohappokoostumus 25 osoittaa ilman muuta tämän peptidin olevan hydrofobinen. Sen mukaisesti oli kiinnostavaa '·*·' tutkia, sitoutuuko CTT lipideihin. Vertailuksi tutkimme myös CLP:ta ja STT:ta. Tätä tarkoitusta varten käytimme ilma/puskuri-rajapinnalla olevia fosfolipidiyksöiskerroksia, joka on lipidi-proteiini-vuoro vaikutusten ja proteiinien vaikutusten lipidiyksöiskerrosten . . lateraaliseen rakenteeseen tutkimiseen laajalti käytetty biomembraanimalli (Söderlund et 30 ai, 1999). Lipidiyksöiskerroksen alle injektoidun peptidin tunkeutuminen kohottaa ; pintapainetta π, ja peptidit, jotka eivät työnny lipidiyksöiskerroksiin, eivät aiheuta \.. muutoksia pintapaineessa. eggPC-yksöiskerrosten alkupintapaine (πο) oli 10 ja 40 mN/m:n '·'· välillä ja peptidien (lopullinen pitoisuus 200 μΜ) lisäämisestä alifaasiin johtuvat 113840 9 pintapaineen nousut (Δπ) mitattiin (kuvio 2). Kaikki kolme peptidiä tunkeutuivat nopeasti yksöiskerroskalvoihin ja kulmakertoimet Δπ vs. πο olivat kvalitatiivisesti samanlaisia. Yksöiskerrosten alkupakkauspaineissa, jotka ylittivät 38, 31, ja 33 mN/m CTTtle, STT:lle ja vastaavasti CLPrlle, näiden peptidien tunkeutuminen membraaniin loppui.
5
Vuorovaikutukset Iiposomien kanssa. Edeltävät kokeet eggPC-lipidiyksöiskerroksia käyttäen paljastivat, että CTT, CLP, ja STT sitoutuivat membraaneihin. Tämä varmistettiin mittaamalla Trp:n fluoresenssiemission anisotropia CTT: lie kasvavien liposomipitoisuuksien läsnä ollessa (kuvio 3A). Sen mukaisesti ilman liposomeja oli r:n 10 arvo 0,065, heijastaen peptidin nopeaa Brownin pyörimisliikettä liuoksessa. Liposomien kasvavat pitoisuudet kuitenkin aiheuttivat jatkuvasti nousevan r-arvon, aina arvoon 0,349 saakka mitattuna 230 μΜ:η fosfolipidipitoisuudessa. CTT/fosfolipidi-moolisuhteessa lähellä arvoa 5:90 ilmeni noin puolet maksimaalisesta vaikutuksesta.
15 Sisäinen tryptofaanifluoresenssi mahdollistaa tämän fluoroforin mikroympäristössä tapahtuvien mahdollisten muutosten arvioimisen peptidin yhdistyessä liposomeihin. l35o/l33o:n arvo CTT:n Trp-tähteelle PBS:ssa mitattuna on 1,4, kun taas LUVien läsnä ollessa (0,5 mM kokonaisfosfolipidi) tämä suhde laski arvoon 1,00. Näin ollen Trp on hydrofobisemmassa ympäristössä liposomien läsnä ollessa, mikä on sopusoinnussa CTT:n 20 lipidimembraaniin jakautumisen kanssa. Lisäksi Trp:n vaimentuminen I':lla oli alentunut liposomien läsnä ollessa, ja osoittaa Trp:n olevan CTT:ssä vain osittain alttiina ' · ': vesiliukoiselle kollisiovaimentimelle Γ. Stem-Volmer-vakiot olivat 0,0087 ja 0,0034 ilman ‘ : ' liposomeja ja vastaavasti niiden läsnä ollessa.
25 Jotkut lipidejä sitovat peptidit ja proteiinit voivat indusoida lipidivesikkelien fuusiota. Tämän mahdollisuuden tutkimiseksi leimattuja ja leimaamattomia LUVeja sekoitettiin ilman peptidejä tai niiden läsnä ollessa, ja lipidin sekoittumista mitattiin aiemmin kuvatulla tavalla. CTT, STT, tai CLP eivät kuitenkaan aiheuttaneet mitattavia muutoksia NBD-PE:n . . fluoresenssiemissiovoimakkuudessa 15 minuutin aikana, mikä osoittaa lipidisekoittumisen 30 ja siten myös vesikkelien hemifuusion ja fuusion puuttumisen (tuloksia ei esitetä).
;,, Vaikutukset liposomien sellulaariseen ottoon. Edellä olevat tulokset osoittavat, että CTT
*: ‘. sitoutuu fosfolipideihin ja että CTT ei aiheuta liposomien fuusiota. Siten oli kiinnostavaa 113840 10 tutkia se mahdollisuus, että CTT.tä voitaisiin käyttää liposomien kohdentamisessa. Lähestyimme tätä kysymystä ensin sisällyttämällä liposomeihin fluoresoivan markkerin DPPRho, kuten materiaalit ja menetelmät -osassa kuvataan. Sen jälkeen CTT lisättiin näihin liposomeihin, minkä jälkeen ne lisättiin U937-leukemiasoluihin, jotka toimivat tässä 5 gelatinaasia ilmentävien solujen mallina. 5 minuutin kuluttua solut pestiin ja soluissa oleva fluoresenssi mitattiin mikrolevynlukijalla. CTT edisti liposomien yhdistymistä U937-solujen kanssa ja noin 3,7-kertaisesti enemmän fluoresoivaa markkeria DPPRho sitoutui soluihin, kun CTT oli läsnä (tuloksia ei esitetä).
10 Jatkoimme sitten tutkimalla CTT:n kykyä tehostaa liposomeihin kapseloidun vesiliukoisen fluoresoivan markkerin rodamiini B:n ottoa U937-, CHO-, NRK52E-, ja HT 1080 -soluihin. Samoja liposomeja ilman CTT.ta käytettiin kontrollina. Viisi minuuttia sen jälkeen kun CTT-liposomit lisättiin soluihin, voitiin liukoinen rodamiinileima havaita soluissa fluoresenssimikroskopialla. CTT tehosti rodamiinin ottoa U 937- ja HT 15 1080 -soluilla muttei CHO-soluilla (kuvio 4). Kaikilla U 937- ja HT 1080 -soluilla on fluoresenssia, mutta se on jakautunut epätasaisella tavalla solujen kesken siten, että jotkut solut emittoivat enemmän fluoresenssia kuin toiset. MMP-2:n tai MMP-9:n ilmentyminen on olennaista liposomien otolle. Sen mukaisesti kiinanhamsterin munasarjasolut (CHO), . * jotka eivät tsymografisen määrityksemme mukaisesti ilmennä gelatinaaseja, eivät . \ 20 osoittaneet mitään CTT-liposomien ottoa olosuhteissa, joissa tehostunut liposomien otto oli , .* ilmeistä HT1080-ja U937-soluille.
• ...· Liposomeihin kapseloidun rodamiinin otto kvantitoitiin fluoresenssilevylukijalla.
’ Liposomeihin kapseloidun rodamiinin otto U937-solujen sisään tehostui 3,6-kertaisesti 25 CTT:n vaikutuksesta, verrattuna liposomeihin, joista peptidi puuttui (kuvio 5A). Vain vähäinen vaikutus havaittiin STT:lle ja CLP:lle, ja signaali oli liian heikko ollakseen tilastollisesti merkitsevä verrattuna liposomeihin, joista peptidit puuttuivat. Sekoitettu • (‘ · syklinen peptidi CWL oli myös tehoton liposomioton edistämisessä. Samanlainen CTT.n vaikutus liposomiottoon oli ilmeinen ihmisen HT1080-fibrosarkooma- ja NRK52E rotan 30 munuaisen epiteelisolujen kaltaisille soluille (tuloksia ei esitetä). CTT ei edistänyt vapaan T rodamiini B:n ottoa. Tehostunut liposomiotto CTT:n toimesta oli ilmeistä vain 37 °C:ssa ·'*, mutta ei 4 °C:ssa, osoittaen näin aktiivisen reseptorivälitteisen endosytoosin olevan osallisena (kuvio 5B). TPA.n vaikutus CTT-liposomien ottoon on bifaasinen, ja lyhyen altistusajan jälkeen (15 min) liposomiotto kasvaa, kun taas pitkitetyn inkubaation jälkeen 113840 n (75 min) liposomien otto estyy. Tämä voitaisiin selittää sillä, että gelatinaasit alhaisissa pitoisuuksissa pysyvät sitoutuneina pääasiassa solun pintaan, kun taas korkeissa pitoisuuksissa ylimääräinen gelatinaasi sijoittuu ekstrasellulaariseen tilaan (Toth et ai, 1997).
5
Gelatinaasit CTT-liposomikompIeksien kohteina. Tutkimme lisäksi, olivatko solun pintaan sitoutuneet gelatinaasit reseptoreita CTT:tä sisältäville liposomeille. Solut pestiin gelatinaasien liukoisten muotojen poistamiseksi, ja esi-inkuboitiin sitten 30 min MMP-inhibiittorien tai spesifisten vasta-aineiden kanssa ennen liposomien lisäämistä. Nämä 10 kokeet osoittivat, että CTT:tä sisältävien liposomien sisäänotto HT1080-soluihin voitiin erityisen tehokkaasti estää vasta-aineilla MMP-9:ta vastaan. Erityisesti kaksi tällaista MMP-9-vasta-ainetta yhdessä käytettyinä täydellisesti estivät liposomeihin kapseloidun fluoresoivan väriaineen sisäänoton (kuvio 6). Inhibitio MMP-2:a vastaan kohdistuvalla vasta-aineella oli vain osittainen. Vasta-aineella integriini β1:η sytosolista osaa vastaan ei 15 ollut mitään vaikutusta. Nämä tulokset osoittavat liposomioton spesifisen estymisen anti-MMP-9- ja anti-MMP-2-vasta-aineilla.
Tutkimukset sarjalla proteinaasi-inhibiittoreita paljastivat MMP-inhibiittorien muttei seriiniproteinaasi-inhibiittorien estävän liposomioton. MMP-inhibiittorit TIMP-2 ja 20 Marimastat ja kationikelaattori EDTA vaikuttivat kukin samalla tavalla, aiheuttaen noin 50 %:n inhibition liposomien siirtymisessä soluihin (kuvio 7). Seerumin trypsiini-;' inhibiittoreilla tai aprotiniinilla ei ollut merkitsevää estävää vaikutusta soluissa, jotka oli : ;'· viljelty 10%:isessa sikiövasikan seerumissa ja jotka intemalisoivat liposomit.
..... 25 Adriamysiiniä, laajalti käytettyä syöpälääkettä, on kapseloitu liposomeihin suurella : tehokkuudella (Gokhale et ai, 1996). CTT:n tehokkuus liposomioton edistämisessä ja tämän hoidollisen aineen kohdentamisessa tuumorisoluihin tutkittiin U937-viljelmässä.
CTT lisättiin liposomiliuokseen 200 μΜ:η pitoisuudeksi, vastaten molaarista CTT/fosfolipidisuhdetta —1:2. Tämä liuos lisättiin sitten U937-soluihin siten, että saatiin 30 lopulliset CTT- ja adriamysiinipitoisuudet 85 μΜ ja vastaavasti 0,4 μΜ. Tässä ' ; tutkimuksessa käytettyihin pitoisuuksiin saakka eivät synteettiset peptidit ja liposomit olleet soluille toksisia (tuloksia ei esitetä). Liposomeja ilman lisättyä CTT:tä käytettiin kontrollina ja solujen tappo mitattiin EthD-1-määrityksellä. 24 h kuluttua havaittiin 4,1- 113840 12 kertainen nousu solujen tapossa (p<0,001) verrattuna liposomeihin ilman CTT:ta (kuvio 8). Myös gelatinaasia inhiboivat peptidit STT ja CLP, muttei sekoitettu CWL-peptidi, tehostivat liposomeihin kapseloidun adriamysiinin solutappoa, joskin vähemmän kuin CTT. Sen mukaisesti STT ja CLP lisäsivät kuolleiden solujen lukumäärää 1,7- ja 5 vastaavasti 1,3-kertaisesti (p<0.01).
PEG-liposomit. Teimme myös PEG-liposomeja, joissa PEG-lipidijohdannainen on liitetty CTTHWGFTLC-peptidin karboksyylipäähän 1 -etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)kar- bodi-imidihydrokloridin välityksellä (Grabarek ja Gergely, 1990). DPPE, jolla on 10 karbamaattisidos PEG (2000):een, on amiiniryhmä toisessa päässään. PEG- lipidijohdannaisten käyttö pidentää liposomien kiertoaikaa in vivo. Se myös ankkuroi peptidin liposomin pintaan, estäen peptidin dissosiaation liposomista verenkierrossa. Sitä voidaan käyttää tuumorisolujen, tuumoriverisuonten, nivelreumavaurioiden ja muiden taudin vaivaamien kudosten, joissa gelatinaaseja ilmentyy runsaasti, kohdentamiseen.
15 Tavallisimmin käytettyjen PEGien molekyylipainot ovat 2 000 ja 5 000, mutta käytetään myös PEGejä, jotka vaihtelevat välillä 600- 12 000. Konjugaatin lipidiosa voi vaihdella tyydyttyneistä tai tyydyttymättömistä PEistä kolesteroliin ja keramideihin lyhytketjuisin (C8), keskipituisin ketjuin (Cl4) ja pitkäketjuisin (C20) rasvahapoin. Lipidipuolella .··· voidaan käyttää ääretöntä lipidiankkurien valikoimaa PEistä PAhan, kardiolipiiniin, » » · .·. 20 kolesteroliin tai keramideihin. Tässä käytetään funktionaalisena ryhmänä amiinia, mutta • · , , voidaan myös käyttää kaikkia muita reaktiivisia ryhmiä, jotka voivat sitoa peptidejä tai modifioituja peptidejä EG-johdannaisiin, kuten biotiinia, maleimidiä tai karboksi-NHS- ... esteriä.
> » 25 Solut ottavat CTT-peptidi/liposomin tavalla, joka reagoi forboliesteriä lisäämällä, minkä tiedetään stimuloivan gelatinaasin ilmentymistä (kuvio 9). Tämä osoittaa, että gelatinaasin ilmentymistasot korreloivat CTT-liposomioton kanssa. Tutkimuksissamme olemme * käyttäneet kiinanhamsterin munasarjasoluja, jotka eivät ilmennä gelatinaaseja merkitsevässä määrin gelatiinitsymografiamääritystemme mukaisesti. Tuloksissamme 30 liposomikohdennusta ei tapahtunut CHO-solujen tapauksessa. Tämän peusteella ’; ’ ehdotamme, että CTT-liposomien otto on riippuvaista solutyypistä ja korreloi solutyypin ; , gelatinaasi-ilmentämistason kanssa.
Liposomikohdennuskokeet käyttäen liposomeja, joissa oli CTT-peptidi liposomin pinnalla 113840 13 ja rodamiini liposomin sisällä osoittivat, että liposomikohdennus on tuloksekasta 37 °C:ssa muttei 4 °C:ssa. Tämä merkitsee, että aktiivista reseptorivälitteistä endosytoosia on tapahduttava liposomeja intemalisoitaessa.
5 CTT-liposomien otto korreloi forboliesterin lisäyksen kanssa lyhyillä induktioajoilla, minkä tiedetään stimuloivan gelatinaasin ilmentymistä, ja siten gelatinaaseja solun pinnalla. Induktioajan pidentyessä gelatinaaseja on myös alustassa. Vapaan gelatinaasin määrä alustassa kohoaa, jolloin liposomien otto estyy (kuvio 10).
» · • · 113840 14 KOKEELLINEN OSA Materiaalit ja menetelmät 5 Materiaalit. Munankeltuaisen fosfatidyylikoliini (eggPC), l-palmitoyyli-2-oleoyyli-.sn- glysero-3-fosfoetanoliamiini, (POPE), adriamysiini (doksorubisiini), rodamiini B, ja 0,01 M fosfaattipuskuroitu suolaliuos 2,7 mM KCl:n ja 0,137 M NaCl:n kanssa, pH 7.4 25 °C:ssa, (PBS) hankittiin Sigmalta ja l-asyyli-2-((7-nitro-2-l,3-bentsoksadiatsol-4- yyli)amino)dodekanoyyli-l-sn-glysero-3-fosfoetanoliamiini (NBD-PE) ja l-palmitoyyli-2- 10 oleoyyli-vn-glysero-3-fosfokoliini (POPC) Avantilta (Birmingham, AL). Toinen fluoresoiva lipidi 1,2-diheksadekanoyyli-sn-glysero-3-fosfoetanoliaminotiokarbamoyyli- N-6-tetrametyylirodamiini (DPPRho), ja fluoresoiva koetin fenantridinium, 5,5'-[1,2- etaanidiyylibis(imino-3, 1 -propaanidiyyli)]bis(3,8-diamino-6-fenyyli)-, dikloridi, dihydrokloridi (EthD-1) olivat Molecular Probes’lta (Leiden, Alankomaat). MMP-2 15 hankittiin Boehringer Mannheim GmbH’lta (Saksa). Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ja RPMI 1640 -soluviljelyalusta Glutamax-1:11a olivat Gibco Life
Technologies’lta (Paisley, Skotlanti). Fosfolipidien kantaliuokset valmistettiin kloroformiin. Lipidien puhtaus tarkistettiin ohutkerroskromatografialla piihapolla päällystetyillä levyillä (Merck, Darmstadt, Saksa) käyttäen kloroformi/metanoli/vettä 20 (65:25:4, til/til) liuottimena. Levyjen tarkastelu jodi värjäyksen jälkeen tai tarvittaessa fluoresenssivalaisulla ei paljastanut mitään epäpuhtauksia. Ei-fluoresoivien fosfolipidien .·. pitoisuudet määritettiin gravimetrisesti käyttäen erittäin tarkkaa sähkövaakaa (Cahn ; Instruments, Inc., Cerritos, CA, USA) ja fluoresoivien fosfolipidianalogien pitoisuudet • · · : ‘ *' · spektrofotometrisesti käyttäen molaarisia ekstinktiovakioita ε= 93 000 aallonpituudella 540 • t » 25 nm DPPRho:lle ja ε= 21 000 aallonpituudella 463 nm NBD-PE:lle, metanoli liuottimena.
:. . Anti-ihmis-MMP-9:n ja -MMP-2:n toimitti ystävällisesti Dr. Timo Sorsa (Lääketieteellisen kemian ja periodontologian laitos, Helsingin yliopisto, Suomi). Marimastat saatiin British Biotech’lta. TIMP-2 ja fluorogeeninen substraatti MMP-2:lle, MCA-Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg olivat Calbiochem’lta (La Jolla, CA, USA).
30 ; . Sekvenssihomologiahaku. CTT:n (CTTHWGFTLC)(SEQ ID NO:6) homologeja etsittiin BLASTP 1.4.11 MP:lla käyttämällä National Center of Bioinformation’in suosittelemaa ,,. strategiaa pienille peptideille (identtisyysmatriisi, sanakoko yksi, ja odotusarvo 1 000).
) » » · 113840 15
Muut parametrit pidettiin oletusarvoissaan. Hakusekvenssimme oli CXXHWGFTXC (SEQ ID NO:2). Yhdeksän analogia löytyi, niiden joukossa oli osa EGF-7-domeenista ihmisen laminiinin β-1-ketjun prekursorista CLPGHWGFPSC (merkitty tässä CLP, SEQ ID NO:7).
CLP:n homologeja etsittiin myös ja niitä verrattiin SWISS-PROT SIM -ohjelmalla.
5
Synteettiset peptidit. Peptidit syntetisoitiin Applied Biosystems 433 A (Foster City, CA, USA) automaattisella syntetisoijalla käyttäen Fmoc-kemiaa. Disulfidisillat muodostettiin 5 %:isessa etikkahapossa (pH 6,0), joka sisälsi 20 % dimetyylisulfoksidia (DMSO), inkuboimalla yli yön huoneen lämpötilassa jatkuvalla sekoituksella (Domingo et ah, 1995).
10 1:2 laimennuksen jälkeen 0,1 % trifluorietikkahapolla peptidit ladattiin preparatiiviseen käänteisfaasi-HPLC-pylvääseen ja eluoitiin asetonitriiligradientilla. Peptidien identiteetti varmistettiin massaspektrometrialla. Tässä tutkimuksessa käytetyt peptidit aminohapposekvensseineen ja vastaavine lyhenteineen on koottu taulukkoon 1.
15 Taulukko 1. CTT:n, CLP:n, STT:n ja CWL:n aminohapposekvenssit konservoidut tähteet korostettuina. Molekyylipainot ovat sulkeissa.
CTT: Cys-Thr-Thr-His-Trp-Gly-Phe-Thr-Leu-Cys (1168) (SEQ ID NO:6) CLP: Cys-Leu-Pro-Gly-His-Trp-GIy-Phe-Pro-Ser-Cys (1203) (SEQIDNO:7) 20 STT: Ser-Thr-Thr-His-Trp-Gly-Phe-Thr-Leu-Ser (1136) (SEQ ID NO:8) CWL: Cys-Trp-Leu-Thr-Phe-Thr-His-Gly-Thr-Cys (1168) (SEQ ID NO:9) • · · ; Gelatinaasimääritys. MMP-9:n ja MMP-2:n inhibitio erilaisilla synteettisillä peptideillä mitattiin käyttäen kaseiinitsymografiaa (Halinen et ai., 1996). MMP-9 puhdistettiin • · * ···· 25 kuvatulla tavalla (Sorsa et ai, 1997). Sen jälkeen MMP-2 (2,5 pg) tai MMP-9 (2,5 pg) : _ t ajettiin 10 % SDS-PAGE:ssa, joka sisälsi kaksi mg/ml kaseiinia. Geeli pestiin ensin Triton X-100:aa sisältävässä puskurissa SDS:n poistamiseksi, ja se leikattiin viideksi liuskaksi, jotka upotettiin peptidiä (CTT, CLP, CWL tai STT) sisältäviin liuoksiin (85 pM). Kun oli inkuboitu 48 h 37 °C:ssa, geelit värjättiin Coomassie bluella, skannattiin, ja hajotetut alueet ‘ 30 kvantitoitiin kuvantamisanalyysiä käyttäen (Global Lab Image 3.2, Data Translation Inc. ja ’ ; Acuity Imaging Inc., Marlboro, MA, USA).
113840 16 MMP-9:n aktiivisuus mitattiin myös käyttäen fluorogeenistä peptidisubstraattia MCA-Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg (Calbiochem, San Diego, CA, USA). Tarkemmin sanoen, 50 ng MMP-9 esi-inkuboitiin PBS:ssa 30 min huoneenlämmössä ilman CTT:ta tai sen liposomikompleksia tai CTT:n tai sen liposomikompleksin läsnä ollessa. Sen jälkeen 5 fluorogeeninen substraatti lisättiin 0,1 mM loppupitoisuudeksi ja inkubointia jatkettiin 37 °C:ssa 15 min, minkä jälkeen fluoresenssin voimakkuudet mitattiin 340 nm:n eksitaatiolla ja 390 nm:n emissiolla mikrotiitterilevynlukijassa.
Peptidien vuorovaikutus lipidiyksöiskerrosten kanssa. Peptidien tunkeutuminen 10 monomolekulaarisiin lipidikalvoihin mitattiin käyttämällä magneettisesti sekoitettavia pyöreitä kaivoja (alifaasin tilavuus 400 μΐ). Pintapainetta (π) seurattiin mikrovaakaan (μ Troughs, Kibron Inc., Helsinki, Suomi) ja Pentium PC:hen liitetyllä Wilhelmy-langalla. Lipidit levitettiin ilman ja puskurin (PBS, pH 7) rajapintaan kloroformissa (noin yksi mg/ml) erilaisiin alkupintapaineisiin (πο) ja annettiin tasapainottua 15 min ennen 15 osoitettujen peptidien lisäämistä (4 μΐ, 10 mg/ml H20:ssa ja CWL DMSO:ssa) alifaasiin. Nousu π:η arvossa alkupintapaineista (πο) peptidin lisäämisen jälkeen oli täydellinen noin 20 minuutissa ja ero πο:η ja peptidin kalvoon sitoutumisen jälkeen havaittu arvo katsottiin AK:ksi. Kaikki mittaukset suoritettiin vallitsevassa lämpötilassa (—H24 °C). Tulokset esitetään muodossa Δπ vs. πο (Brockman, 1999).
20 *... Liposomien valmistus. Lipidien kantaliuokset sekoitettiin kloroformiin haluttujen * · ‘ · ' koostumusten saamiseksi. Liuotin poistettiin heikon typpivirtauksen alla ja lipidijäännöstä • · *·;· pidettiin alipaineessa ainakin 2 h ajan. Multilamellaarisia liposomeja muodostettiin lisäämällä kuiviin lipideihin vettä huoneen lämpötilassa yhdellä ml:lla PBS, joka sisälsi . . 25 rodamiini B:tä (10 μΜ) tai adriamysiiniä (1,8 μΜ) näiden yhdisteiden kapseloimiseksi liposomeihin siten, että saatiin yhden mM:n lipidipitoisuus. Multilamellaariset liposomit jäädytettiin ja sulatettiin viisi kertaa kapseloitumisen tehostamiseksi (Clifford et ai., 1990). Suuria unilamellaarisia vesikkeleitä (LUVit) saatiin ekstrudoimalla MLV-dispersiot 19 . , kertaa polykarbonaattikalvon läpi, jonka huokoskoko oli 100 nm (Nucleapore, Pleasanton, ,·“ 30 CA, USA), kaasupaineella toimivalla pienitilavuuksisella LiposoFast Pneumatic -homogenisaattorilla (Avestin, Ottawa, Kanada). Vesikkelien ekstrudoimiseen suodattimien läpi käytettiin 25 psi:n painetta (~170 kPa). Niin mainittaessa peptidit (2 Ί13840 17 mg/ml PBS:ssa, paitsi CWL DMSO:ssa) sekoitettiin LUVien kanssa siten, että saatiin vastaavasti lipidin ja peptidin loppupitoisuudet 1 mM ja 0,5 mg/ml.
PEG-Iiposomien valmistus. DPPE:llä, jolla on karbamaattisidos PEG (2000):een, on 5 amiiniryhmä toisessa päässään. PEG-lipidijohdannainen on liitetty peptidin CTTHWGFTLC karboksyylipäähän 1 -etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidihydrokloridin välityksellä (Grabarek ja Gergely, 1990). CTT-PEG-PE puhdistetaan geelisuodatuksella. 4 % CTT-PEG-PE:ta lisätään 16 %:iin POPE:a ja 80 %:iin POPC:ta (mol/mol) ja valmistetaan kuten edellä olevat liposomit.
10
Fluoresenssispektroskopia. CTT:n, STT:n, CLP:n, ja CWL:n tryptofaanitähteiden ympäristöt liposomeissa tutkittiin fluoresenssispektroskopian avulla. Vedessä Trp- fluoresenssihuipun keskus on ~350 nm:n kohdalla, kun taas hydrofobisessa ympäristössä emissio keskittyy 330 nm:n läheisyyteen. Sen mukaisesti muutoksia Trp:n 15 mikroympäristössä voidaan seurata niittämällä I350/I330, 350 nm:n kohdalla havaitun emission suhde emissioon 330 nm:n kohdalla (Lakowicz, 1999). Tryptofaanin fluoresenssi mitattiin Perkin Elmer LS 50 B -spektrofluorometrillä, joka oli varustettu magneettisesti sekoitettavalla ja termostoidulla kyvettikammiolla. Kaikki mittaukset tehtiin 37 °C:ssa 5 mM Hepes-, 0,1 mM EDTA-, pH 7,4 puskurissa. Eksitaation ja emission kaistaleveydet 20 olivat 10 nm ja 10 nm, vastaavassa järjestyksessä. Eksitaatioaallonpituus oli 295 nm, ja .·*· emissiospektrit mitattiin alueella 300-400 nm. CTT:n, STT:n, CLP:n, ja CWL:n Trp- • · * emissiospektrit mitattiin sekä ilman POPC/POPE (80/20, mol/mol) LUVeja että niiden ; läsnä ollessa, tuottaen lopulliset lipidipitoisuudet 10 μΜ ja 100 μΜ, osoitetulla tavalla.
Iti * ·* 25 CTT:n Trp-tähteen fluoresenssin polarisaatio liposomien kasvavan pitoisuuden funktiona : _ mitattiin käyttämällä kääntyviä polarisoijia eksitaatio- ja emissiosäteissä, 10 nm:n kaistaleveydellä. Tulokset ilmaistaan emissioanisotropiana (Lakowicz, 1999) laskettuna seuraavasti: r = (In -I±)/( Iii+2 li).
30 Tässä yhtälössä li ja In edustavat emission voimakkuutta vastaavasti kohtisuoraan ja yhdensuuntaisesti eksitaatiopolarisoijan suhteen.
113840 18
Trp:n vesifaasille alttiina olon määrä tutkittiin käyttämällä I':a kollisiovaimentimena (Lakowicz, 1999). Vaimennuksen määrä laskettiin käyttämällä yhtälöä: F0/F= l+k[Q]= 1+kqTotQ] jossa Fo ja F ovat Trp:n fluoresenssi voimakkuudet 345 nm:n aallonpituudella ilman 5 vaimenninta tai sen läsnä ollessa, Q, το on Trp-fluoresenssin elinaika ilman vaimenninta, k on Stem-Volmer -vakio (saatu tulosten lineaarisovituksen kulmakertoimesta). CTT:ssä (5 μΜ) olevan Trp:n fluoresenssi ja sen vaimentuminen mitattiin ilman POPC/POPE (80/20, mol/mol) LUVeja (lopullinen lipidipitoisuus 0,5 mM) ja niiden läsnä ollessa. Tulokset korjattiin PBS:n ja liposomien aiheuttaman taustan suhteen.
10
Lipidien sekoittumisen määritys. CTT-, CLP-, STT-, ja CWL-peptidien kyky indusoida liposomifuusiota määritettiin mittaamalla lipidien sekoittuminen, kuten aiemmin on kuvattu (Struck et ai., 1981). Lyhyesti, NBD-PE (X=0,01) ja DPPRho (X=0,01) sisällytettiin liposomeihin (POPC/POPE, 78/20, mol/mol). Johtuen NBD-PE:n (donori) 15 emission ja DPPRho (akseptori) absorptioresonanssin spektrien päällekkäisyydestä on energian siirtyminen näiden väriaineiden välillä erittäin tehokasta. Kun liposomeja, jotka sisältävät NBD-PE:tä ja DPPRho:a sekoitetaan leimaamattomien liposomien kanssa, fuusio havaitaan NBD-PE:n emissiovoimakkuuden kasvuna koettimien laimentumisesta johtuen. NBD-PE:lle käytettiin eksitaatio- ja emissioaallonpituuksia 430 nm ja 530 nm. Kaikki 20 fluoresenssimittaukset tehtiin 37 °C:ssa i · « <
IM
Solujen liposomioton mittaus. Erilaisten peptidien vaikutusten tutkimiseksi liposomien !sellulaariseen ottoon liposomeihin sisällytettiin rodamiinileimattu fosfolipidianalogi (DPPRho) merkkiaineeksi, koostumuksen POPC/POPE/DPPRho (80:19:1, mol/mol) 25 tuottamiseksi. Osoitetut peptidit sekoitettiin LUVien kanssa ja sen jälkeen lisättiin
» I
', , mikrotiitterikuoppalevyillä viljeltyihin soluihin. 5 minuutin inkuboinnin jälkeen 38 °C:ssa liposomit, jotka eivät olleet sitoutuneet soluihin, poistettiin huuhtomalla solut kolme kertaa kylmällä PBS:lla. Soluihin liittyvän DPPRhom suhteellinen määrä määritettiin käyttäen Tecan Spectrafluor Plus mikrolevynlukijaa (Tecan, Hombrechtigon, Sveitsi) eksitaatiolla i t ; 30 535 nm:ssa ja emissiolla at 595 nnr.ssa.
' Toisessa koesarjassa vesiliukoinen fluoresoiva markkeri rodamiini B kapseloitiin ' liposomien sisään ja sen otto solujen toimesta mitattiin. Näytteet rodamiini B:n ottoa t 113840 19 varten valmistettiin sekoittamalla 60 μΐ POPC/POPE (80/20, mol/mol, yksi mM) -liposomeja, jotka sisälsivät 10 μΜ rodamiini B:tä, 300 pkaan DMEM-alustaa, joka oli täydennetty 10 % sikiövasikan seerumilla, Glutamax I:lla, penisilliinillä 100 U/ml ja streptomysiinillä 0,1 mg/ml. Peptidejä lisättiin sitten siten, että saatiin loppupitoisuudeksi 5 8,5 μΜ. Kymmenen μΐ (105 solua) alustaa, joka sisälsi osoitetut solut, yhdistettiin LUVien kanssa. 15 minuutin inkubaation jälkeen 37 °C:ssa tai +4 °C:ssa soluihin sitoutumattomat liposomit poistettiin 96-kuoppaisista levyistä huuhtelemalla kolme kertaa kylmällä PBS:lla. +4 °C:n lämpötila toimi kontrollina solujen ei-endosytoottiselle liposomiotolle (Oess ja Hildt, 2000). Soluihin liittyvän rodamiini B:n suhteellinen määrä määritettiin 10 mikrolevynlukijaa käyttäen eksitaatiolla 535 nm:ssa ja emissiolla at 595 nmrssa.
Esi-inkuboimme soluja myös forboliesterin (TPA) kanssa (50 nM). Esi-inkubaatioajat vaihtelivat välillä 15-75 min. Solujen käsittely forboliesterillä (TPA) lisää sekä MMP-9:n ilmentymistä että eritystä (Toth et ai, 1997). Tulokset esitetään muodossa RFI=I/I0, jossa 15 RFI on suhteellinen fluoresenssivoimakkuus, Io on emissiovoimakkuus kontrollille, 2 μΜ rodamiini B LUVeissa ilman peptidejä, ja I on rodamiiniemissio solujen ottamille peptidi-liposomikomplekseille. Osoitettujen vasta-aineiden (aMMP-9 ja aMMP-2) ja gelatinaasia inhiboivien yhdisteiden (TIMP-2, Marimastat ja EDTA) vaikutukset rodamiini B:tä sisältävien liposomien (PC/PE, molaarinen suhde 80/20) ottoon HT 1080 -soluihin 20 suoritettiin kuten edellä. M-17 inhiboi MMP-9:n sitoutumista substraattiin ja tämän . ·1'. inhibition odotetaan olevan pitoisuudesta riippuvaista. Ei tiedetä, estääkö kanin polyklonaalinen vasta-aine ihmisen MMP-2:a (Murphy et ai., 1994). Osoitetun peptidin, : :': adriamysiinin, vasta-aineiden ja liposomien lopulliset pitoisuudet olivat 85 μΜ, 0,2 mM, : : 20 pg/ml ja vastaavasti 0,4 μΜ.
25
Soluviljelmät ja fluoresenssimikroskopia. U937- (ECACC 85011440), HT 1080-(ECACC 85111505), ja CHO- (ECACC 85050302) -soluja viljeltiin RPMI- tai DMEM-alustassa, joka oli täydennetty 10 % sikiövasikan seerumilla, Glutamax I:lla, penisilliinillä (100 U/ml), ja streptomysiinillä (0,1 mg/ml). Rodamiini B:tä sisältävien liposomien otto 30 viljeltyihin soluihin varmistettiin fluoresenssimikroskopialla. Erityisen pitkällä ’ ·, · ’ työskentelyetäisyydellä toimivilla Nikon-objektiiveilla (20x) ja (40x) varustettua käänteistä fluoresenssimikroskooppia (Zeiss IM 35) käytettiin. Näytteet valmistettiin kuten •... · rodamiinin oton määritykselle kuvattiin, pienin muunnoksin. Siten pesun asemesta U937-, 113840 20 HT 1080-, ja CHO-solut rodamiinia sisältävien liposomien kanssa ja soluviljelyalustassa siirrettiin Nunclon 48 -levyn kuoppiin. Eksitaatio- ja emissioaallonpituudet valittiin sopivin kaistaleveyssuotimin (Melles-Griot), joiden läpäisy oli alueella 535 nm ja >600 nm, vastaavassa järjestyksessä. Fluoresenssikuvia tarkasteltiin Peltier-j äähdy tteisellä 5 digitaalisella kameralla (C4742-95, Hamamatsu, Japan), joka oli liitetty tietokoneeseen ja jota operoitiin laitteen valmistajan toimittamalla ohjelmistolla (Hipic 5.0).
Elinkykymääritykset. Peptidi-liposomikomplekseja, joihin oli kapseloitu adriamysiiniä, valmistettiin edellä kuvatulla tavalla siten, että saatiin peptidin, lipidin ja adriamysiinin 10 vastaavat lopulliset pitoisuudet 85 μΜ, 0,2 mM ja 0,4 μΜ, ja nämä lisättiin sen jälkeen U937-solujen kymmenen μ1:η (105 solua) näytteeseen. Kuolleiden solujen havaitsemiseen käytettiin EthD-l:a. Tämä fluorofori on membraania läpäisemätön ja emittoi fluoresenssia vain ollessaan sitoutunut DNA:han (Papadopoulos et ah, 1994). Sen mukaisesti EthD-1 menee kuolleisiin soluihin helposti ja sitoutuu niiden DNA:han, sen fluoresenssin 15 korreloidessa kuolleiden solujen määrään. EthD-1-emissio mitattiin käyttäen mikrolevyn lukijaa 495 nm:n eksitaatiolla ja 635 nm:n emissiolla. Studentin t-testiä käytettiin tilastollisen merkitsevyyden määrittämiseen.
5 113840 21
Viitteet
Adlakha-Hutcheon, G., Bally, M.B., Shew, C.R., ja Madden, T.D. Controlled destabilization of a liposomal drug delivery system enhances mitoxantrone antitumor activity. Nature Biotechnol. 17: 775-779, 1999.
Brockman, H. Lipid monolayers: why use half a membrane to characterize protein-membrane interactions? Curr. Opin. Struct. Biol. 9:425-427, 1999.
Brooks, P.C., Stromblad, S. Sanders, L.C., von Schalscha, T.L. Aimes, R.T. Stetler-10 Stevenson, W.G. Quigley, J.P., ja Cheresh, D.A. Localization of matrix metalloproteinase MMP-2 to the surface of invasive cells by interaction with integrin avp3. Cell 85: 683-693, 1996.
Clifford, C.J., Warren, E.L. Richard, T.W., ja Pfeiffer, D.R. Factors affecting solute 15 entrapment in phospholipid vesicles prepared by the freeze-thaw extrusion method: a possible general method for improving the efficiency of entrapment. Chem. Phys. Lipids 55: 73-83,1990.
Domingo, G.J., Leatherbarrow, R.J., Freeman, N., Patel, S., ja Weir, M. Synthesis of a 20 mixture of cyclic peptides based on the Bowman-Birk reactive site loop to screen for serine protease inhibitors. Int. J. Peptide Protein Res. 46: 79-87, 1995.
Gokhale, P.C., Radhakrishnan, B., Husain, S.R., Abemethy, D.R., Sacher, R., Dritschilo, A., ja Rahman, A. An improved method of encapsulation of doxorubicin in liposomes: 25 pharmacological, toxicological and therapeutic evaluation. Br. J. Cancer 74: 43-48, 1996.
Grabarek, Z. ja Gergerly, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Anal. Biochem. 185, 131-135, 1990.
30 Halinen, S., Sorsa, T., Ding, Y., Ingman, T., Salo, T., Konttinen, Y.T., ja Saari, H. Characterization of matrix metalloproteinase (MMP-8 and -9) activities in the saliva and in : gingival crevicular fluid of children with Down's syndrome. J. Periodontology 67: 748- *· ;· 754,1996.
• · .'··. 35 Koivunen, E., Arap, W,. Valtanen, H., Raininsalo, A., Penate Medina, O., Heikkilä, P.,
Kantor, C, Gahmberg, C. G., Salo, T., Konttinen, Y.T., Sorsa, T., Ruoslahti, E., ja · Pasqualini, R. Cancer therapy with a novel tumor-targeting gelatinase inhibitor selected by ’: phage peptide display. Nature Biotechnol. 17: 768-774, 1999.
40 Lakowicz, J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Plenum Press, New York and London, Ch 5, s. 111-153, 1999.
Lasic, D.D., Ceh, B., Stuart, M.C., Guo, L., Frederik, P.M., ja Barenholz, Y. Transmembrane gradient driven phase transitions within vesicles: lessons for drug 45 delivery. Biochim. Biophys. Acta 7259:145-156, 1995.
: Lauhio, A., Leirisalo-Repo, M., Lähdevirta, J., Saikku, P., ja Repo, H. Doubleblind, placebo-controlled study of the three month treatment with lymecyclinein reactive arthritis, with special reference to Chlamydia arthritis. Arthritis Rheum. 24: 6-14, 1991.
50 113840 22
Murphy, G., Nguyen, Q., Cockett, M., Atkinson, S., Allan, J., Knight, C., Willenbrock, F., ja Docherty, A. Assessment of the role of the fibronectin-like domain of gelatinase A by analysis of a deletion mutant. J. Biol. Chem. 269:6632-6636, 1994.
5 Northfelt, D.W., Martin, F.J., Working, P., Volberding, P.A., Russell, J., Newman, M., Amantea, M.A., ja Kaplan, L.D. Doxorubicin encapsulated in liposomes containing surface-bound polyethylene glycol: pharmacokinetics, tumor localization, and safety in patients with AIDS-related Kaposi's sarcoma. J. Clin. Pharmacol. 36: 55-63, 1996.
10 Oess, S., ja Hildt, E. Novel cell permeable motif derived from the PreS2-domain of hepatitis-B virus surface antigens. Gene Therapy. 7:750-758,2000.
Papadopoulos, N. G., Dedoussis, G.V., Spanakos, G., Gritzapis, A.D., Baxevanis, C.N., ja Papamichail, M. An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-15 mediated cytotoxity using flow cytomethry. J. Immunol. Meth. 177: 101, 1994.
Sears, B.D. (1984). Synthetic Phospholipid Compounds. US Patent 4,426,330.
Shapiro, S.D. Mighty mice: transgenic technology "knocks out" questions of matrix 20 metalloproteinase function. Matrix Biol. 15: 527-533,1997.
Sorsa, T., Ding, Y., Salo, T., Lauhio, A., Teronen, O., Ingman, T., Ohtani, H., Andoh, N., Takeha, S., ja Konttinen, Y. T. Effects of tetracyclines on neutrophil, gingival, and salivary collagenases. A functional and westem-blot assessment with special reference to their 25 cellular sources in periodontal diseases. Ann. N. Y. Acad. Sci. 732: 112-131, 1994.
Sorsa, T., Salo, T., Koivunen, E., Tyynelä, J., Konttinen, Y.T., Bergmann, U., Tuuttila, A., Niemi, E., Teronen, O., Heikkilä, P., Tschesche, H., Leinonen, J., Osman, S., ja Stenman. Activation of type IV procollagenases by human tumor-associated trypsin-2. J.Biol. Chem.
30 2 72: 21067-21074, 1997.
-··' Storm, G., ja Crommelin, D. J. A. Liposomes: quo vadis? Pharm. Sci. & Tech. Today 1: :/.: 19-31,1998.
’ 35 Struck, D.K., Hoekstra, D., ja Pagano, R.E. Use of resonance energy transfer to monitor :,,,: membrane fusion. Biochemistry 20: 4093-4099,1981.
, . Söderlund, T., Lehtonen, J.Y.A., ja Kinnunen, P.K.J. Interactions of cyclosporin A with phospholipid membranes: effect of cholesterol. Mol. Pharm. 55: 32-38, 1999.
40
Tardi, P.G., Boman, N.L., ja Cullis, P.R. Liposomal doxorubicin. J. Drug Target. 4:129-140, 1996.
, . Toth, M., Gervasi, D.C., ja Fridman, R. Phorbol ester-induced cell surface association of ’ · 45 matrix metalloproteinase-9 in human MCF10A breast epithelial cells. Cancer Res. 57; 3159-3167,1997.
113840
SEQUENCE LISTING
<110> Licentia Oy <120> Matriisi-metalloproteinaasi-inhibiittorien käyttö liposomien kohdentamisessa <130> 31617 <160> 9 <170> Patentin Ver. 2.1
<210> 1 <211> 10 <212> PRT
<213> Unknown Organism <220> <221> SITE <222> (2) <223> Vaihtuva aminohappo, Xaa kohdassa 2 voi olla mikä tahansa aminohappo <220> <221> SITE <222> (3) <223> Vaihtuva aminohappo, Xaa kohdassa 3 voi olla mikä tahansa aminohappo <220> <221> SITE <222> (8) <223> Vaihtuva aminohappo, Xaa kohdassa 8 voi olla mikä tahansa aminohappo <220> <221> SITE <222> (9) <223> Vaihtuva aminohappo, Xaa kohdassa 9 voi olla mikä tahansa aminohappo <400> 1 !’* Cys Xaa Xaa His Trp Gly Phe Xaa Xaa Cys :/· 15 10 • · • · • * · .*·* <210> 2 <211> 10
·”· <212> PRT
. , <213> Unknown Organism <220> <221> SITE <222> (2) <223> Vaihtuva aminohappo, Xaa kohdassa 2 voi olla mikä tahansa aminohappo <220> <221> SITE <222> (3) <223> Vaihtuva aminohappo, Xaa kohdassa 3 voi olla mikä tahansa aminohappo
* I
V <220>
, ·· <221> SITE
<222> (9) - } i · I » » 113840 2 <223> Vaihtuva aminohappo, Xaa kohdassa 9 voi olla mikä tahansa aminohappo <400> 2
Cys Xaa Xaa His Trp Gly Phe Thr Xaa Cys 15 10
<210> 3 <211> 11 <212> PRT
<213> Unknown Organism <220> <221> SITE <222> (2) <223> Vaihtuva aminohappo, Xaa kohdassa 2 voi olla mikä tahansa aminohappo <220> <221> SITE <222> (3) <223> Vaihtuva aminohappo, Xaa kohdassa 3 voi olla mikä tahansa aminohappo <220> <221> SITE <222> (4) <223> Vaihtuva aminohappo, Xaa kohdassa 4 voi olla mikä tahansa aminohappo <220> <221> SITE <222> (9) <223> Vaihtuva aminohappo, Xaa kohdassa 9 voi olla mikä tahansa aminohappo <220> <221> SITE <222> (10) <223> Vaihtuva aminohappo, Xaa kohdassa 10 voi olla mikä tahansa aminohappo ... <400> 3 •tl> Cys Xaa Xaa Xaa His Trp Gly Phe Xaa Xaa Cys 15 10 i » « t
I I
<210> 4 <2ΐι> ίο
<212> PRT
‘ “ <213> Unknown Organism I » ’, , <220> <221> SITE <222> (2) <223> Vaihtuva aminohappo, Xaa kohdassa 2 voi olla mikä tahansa aminohappo <220> <221> SITE <222> (3) » ' <223> Vaihtuva aminohappo, Xaa kohdassa 3 voi olla mikä tahansa aminohappo •;.' <220>
V <221> SITE
<222> (8) ' ·· <223> Vaihtuva aminohappo, Xaa kohdassa 8 voi olla mikä tahansa aminohappo i > » * t 113840 3 <220> <221> SITE <222> (9) <223> Vaihtuva aminohappo, Xaa kohdassa 9 voi olla mikä tahansa aminohappo <400> 4
Ser Xaa Xaa His Trp Gly Phe Xaa Xaa Ser 15 10
<210> 5 <211> 11 <212> PRT
<213> Unknown Organism <220> <221> SITE <222> (2) <223> Vaihtuva aminohappo, Xaa kohdassa 2 voi olla mikä tahansa aminohappo <220> <221> SITE <222> (3) <223> Vaihtuva aminohappo, Xaa kohdassa 3 voi olla mikä tahansa aminohappo <220> <221> SITE <222> (4) <223> Vaihtuva aminohappo, Xaa kohdassa 4 voi olla mikä tahansa aminohappo <220> <221> SITE <222> (9) <223> Vaihtuva aminohappo, Xaa kohdassa 9 voi olla mikä tahansa aminohappo :_ : <220> <221> SITE <222> (10) . .·, <223> Vaihtuva aminohappo, Xaa kohdassa 10 voi olla mikä tahansa aminohappo f; <400> 5
Ser Xaa Xaa Xaa His Trp Gly Phe Xaa Xaa Ser ····: 15 ίο
<210> 6 <211> 10 <212> PRT
<213> Unknown Organism . . <220> · <223> Tuntemattoman organismin kuvaus: Tuntematon ’ . <400> 6
Cys Thr Thr His Trp Gly Phe Thr Leu Cys •1 5 10 <210> 7 <211> 11
11384C
4
<212> PRT
<213> Unknown Organism <400> 7
Cys Leu Pro Gly His Trp Gly Phe Pro Ser Cys 15 10
<210> 8 <211> 10 <212> PRT
<213> Unknown Organism <400> 8
Ser Thr Thr His Trp Gly Phe Thr Leu Cys 15 10
<210> 9 <211> 10 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220> <223> Keinotekoisen sekvenssin kuvaus: Keinotekoinen <400> 9
Cys Trp Leu Thr Phe Thr His Gly Thr Cys 15 10

Claims (12)

  1. 23 113840
  2. 1. Peptidiyhdisteiden, jotka sisältävät rakenteen valittuna peptideistä, joissa on syklinen rakenne C(X)yHWGFXXC ja peptideistä, joissa on lineaarinen rakenne S(X)yHWGFXXS, 5 joissa X on mikä tahansa aminohappotähde ja y on kokonaisluku 2 tai 3, käyttö parantamaan liposomien kohdentamista tuumorisoluihin.
  3. 2. Peptidiyhdisteiden, jotka sisältävät rakenteen valittuna peptideistä, joissa on syklinen rakenne C(X)yHWGFXXC ja peptideistä, joissa on lineaarinen rakenne S(X)yHWGFXXS, 10 joissa X on mikä tahansa aminohappotähde ja y on kokonaisluku 2 tai 3, käyttö tehostamaan liposomien ottoa tuumorisoluihin.
  4. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen käyttö, jossa peptidiyhdiste valitaan peptideistä CTTHWGFTLC, CLPGHWGFPSC ja STTHWGFTLS. 15
  5. 4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen käyttö, jossa tuumorisolut ovat matriisi-metalloproteinaaseja ilmentäviä tuumorisoluja.
  6. 5. Peptidiyhdisteiden, jotka sisältävät rakenteen valittuna peptideistä, joissa on syklinen 20 rakenne C(X)yHWGFXXC ja peptideistä, joissa on lineaarinen rakenne S(X)yHWGFXXS, ' · · ’ joissa X on mikä tahansa aminohappotähde ja y on kokonaisluku 2 tai 3, käyttö liposomien '· valmistamiseksi parantamaan liposomien kohdentamista tuumorisoluihin.
  7. 6. Peptidiyhdisteiden, jotka sisältävät rakenteen valittuna peptideistä, joissa on syklinen 25 rakenne C(X)yHWGFXXC ja peptideistä, joissa on lineaarinen rakenne S(X)yHWGFXXS, joissa X on mikä tahansa aminohappotähde ja y on kokonaisluku 2 tai 3, käyttö liposomien valmistamiseksi tehostamaan liposomien ottoa tuumorisoluihin.
  8. 7. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen käyttö, jossa mainitut liposomit sisältävät ainakin 30 yhden kemoterapeuttisen aineen. ·' 8. Jonkin patenttivaatimuksista 5-7 mukainen käyttö, jossa peptidiyhdiste valitaan ' peptideistä CTTFIWGFTLC, CLPGHWGFPSC ja STTHWGFTLS. 24 113840
  9. 9. Jonkin patenttivaatimuksista 5-8 mukainen käyttö, jossa tuumorisolut ovat matriisi-metalloproteinaaseja ilmentäviä tuumorisoluja.
  10. 10. Diagnostinen tai kuvantamiskoostumus, joka sisältää 5. liposomeja, - vähintään yhden peptidiyhdisteen valittuna peptideistä, joissa on syklinen rakenne C(X)yHWGFXXC ja peptideistä, joissa on lineaarinen rakenne S(X)yHWGFXXS, joissa X on mikä tahansa aminohappotähde ja y on kokonaisluku 2 tai 3, ja - havaittavissa olevan leiman. 10
  11. 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen diagnostinen tai kuvantamiskoostumus, jossa peptidiyhdiste valitaan peptideistä CTTHWGFTLC, CLPGHWGFPSC ja STTHWGFTLS.
  12. 12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen diagnostinen tai kuvantamiskoostumus, jossa 15 havaittavissa oleva leima on radioaktiivinen leima, magneettinen partikkeli tai fluoresoiva leima. • * * j 113840 25
FI20010620A 2001-03-26 2001-03-26 Matriisi-metalloproteinaasi-inhibiittorien käyttö liposomien kohdentamisessa FI113840B (fi)

Priority Applications (24)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20010620A FI113840B (fi) 2001-03-26 2001-03-26 Matriisi-metalloproteinaasi-inhibiittorien käyttö liposomien kohdentamisessa
CNB028073118A CN1250279C (zh) 2001-03-26 2002-03-26 基质金属蛋白酶抑制剂的脂质体靶向
AT02706813T ATE331526T1 (de) 2001-03-26 2002-03-26 Liposomen-targeting von matrix-metalloproteinase- hemmern
RU2003131332/15A RU2003131332A (ru) 2001-03-26 2002-03-26 Липосомное нацеливание ингибиторов матриксной металлопротеиназы
PL02365248A PL365248A1 (en) 2001-03-26 2002-03-26 Liposome targeting of matrix metalloproteinase inhibitors
PCT/FI2002/000252 WO2002076491A1 (en) 2001-03-26 2002-03-26 Liposome targeting of matrix metalloproteinase inhibitors
EP02706813A EP1372694B1 (en) 2001-03-26 2002-03-26 Liposome targeting of matrix metalloproteinase inhibitors
NZ528043A NZ528043A (en) 2001-03-26 2002-03-26 Use of peptides CTTHWGFTLC, CLPGHWGFPSC and STTHWGFTLS in enhancing targeting and uptake of liposome containing chemotherapeutic agents to tumor cells to treat cancer and its use in diagnostics
IL15811402A IL158114A0 (en) 2001-03-26 2002-03-26 Liposome targeting of matrix metalloproteinase inhibitors
CZ20032805A CZ20032805A3 (cs) 2001-03-26 2002-03-26 Použití peptidových sloučenin, způsob zlepšení směrování a absorpce lipozómů, způsob léčby a diagnostiky pacientů, diagnostická nebo zobrazovací testovací sada a přípravek
JP2002575004A JP2004529127A (ja) 2001-03-26 2002-03-26 マトリックス金属プロティナーゼ阻害物質を用いたリポソームターゲッティング
KR10-2003-7012506A KR20040000414A (ko) 2001-03-26 2002-03-26 매트릭스 메탈로프로테이나제 저해제의 리포좀 표적화
US10/471,980 US20040213833A1 (en) 2001-03-26 2002-03-26 Liposomes targeting of matrix metalloproteinase inhibitors
SK1298-2003A SK12982003A3 (sk) 2001-03-26 2002-03-26 Použitie peptidových zlúčenín, spôsob zlepšenia smerovania a absorpcie lipozómov, spôsob liečby a diagnostiky pacientov, diagnostická alebo zobrazovacia súprava a prostriedok
ES02706813T ES2266458T3 (es) 2001-03-26 2002-03-26 Transporte dirigido de liposomas de inhibidores de metaloproteinasas de matriz.
CA002441227A CA2441227A1 (en) 2001-03-26 2002-03-26 Liposome targeting of matrix metalloproteinase inhibitors
DK02706813T DK1372694T3 (da) 2001-03-26 2002-03-26 Liposom-målretning af matrix-metalloproteinase-hæmmere
BR0208681-6A BR0208681A (pt) 2001-03-26 2002-03-26 Compostos de peptìdeos e uso dos mesmos
EEP200300467A EE200300467A (et) 2001-03-26 2002-03-26 Liposoomide suunamine maatriksi metalloproteinaaside inhibiitorite abil
DE60212814T DE60212814T2 (de) 2001-03-26 2002-03-26 Liposomen-targeting von matrix-metalloproteinase-hemmern
HU0303649A HUP0303649A3 (en) 2001-03-26 2002-03-26 Liposome targeting of matrix metalloproteinase inhibitors
YU74703A YU74703A (sh) 2001-03-26 2002-03-26 Lipozomsko ciljanje inhibitora mreže metaloproteinaze
NO20034280A NO20034280L (no) 2001-03-26 2003-09-25 Liposommålretting av matrise metallproteinasehemmere
US11/125,186 US20050271588A1 (en) 2001-03-26 2005-05-10 Liposome targeting of matrix metalloproteinase inhibitors

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20010620 2001-03-26
FI20010620A FI113840B (fi) 2001-03-26 2001-03-26 Matriisi-metalloproteinaasi-inhibiittorien käyttö liposomien kohdentamisessa

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI20010620A0 FI20010620A0 (fi) 2001-03-26
FI20010620A FI20010620A (fi) 2002-09-27
FI113840B true FI113840B (fi) 2004-06-30

Family

ID=8560842

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20010620A FI113840B (fi) 2001-03-26 2001-03-26 Matriisi-metalloproteinaasi-inhibiittorien käyttö liposomien kohdentamisessa

Country Status (23)

Country Link
US (2) US20040213833A1 (fi)
EP (1) EP1372694B1 (fi)
JP (1) JP2004529127A (fi)
KR (1) KR20040000414A (fi)
CN (1) CN1250279C (fi)
AT (1) ATE331526T1 (fi)
BR (1) BR0208681A (fi)
CA (1) CA2441227A1 (fi)
CZ (1) CZ20032805A3 (fi)
DE (1) DE60212814T2 (fi)
DK (1) DK1372694T3 (fi)
EE (1) EE200300467A (fi)
ES (1) ES2266458T3 (fi)
FI (1) FI113840B (fi)
HU (1) HUP0303649A3 (fi)
IL (1) IL158114A0 (fi)
NO (1) NO20034280L (fi)
NZ (1) NZ528043A (fi)
PL (1) PL365248A1 (fi)
RU (1) RU2003131332A (fi)
SK (1) SK12982003A3 (fi)
WO (1) WO2002076491A1 (fi)
YU (1) YU74703A (fi)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7279150B2 (en) 2002-01-24 2007-10-09 Barnes-Jewish Hospital Chelating agents with lipophilic carriers
IL152609A0 (en) * 2002-11-03 2003-06-24 Hapto Biotech Inc Liposomal compositions comprising haptotactic peptides and uses thereof
CN1314704C (zh) * 2002-11-20 2007-05-09 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 基质金属蛋白酶2的小肽抑制剂
CA2514201A1 (en) * 2003-01-24 2004-08-12 Barnes-Jewish Hospital Chelating agents with lipophilic carriers
FI115035B (fi) * 2003-05-02 2005-02-28 Ctt Cancer Targeting Tech Oy In vivo -kuvantaminen käyttäen peptidijohdannaisia
FI20031528A0 (fi) * 2003-10-17 2003-10-17 Ctt Cancer Targeting Tech Oy Terapeuttinen liposomikoostumus ja menetelmä sen valmistamiseksi
FI20040572A0 (fi) * 2004-04-23 2004-04-23 Ctt Cancer Targeting Tech Oy Matriisi-metalloproteinaasin aktiviteetin inhibiittorit
FI20040682A0 (fi) * 2004-05-14 2004-05-14 Ctt Cancer Targeting Tech Oy Tuumorien ja mestastaasien kuvantaminen käyttäen gelatinaasiin targetoituvaa peptidiä
FR2870741B1 (fr) * 2004-05-25 2008-03-14 Coletica Sa Phase lamellaires hydratees ou liposomes, contenant une monoamine grasse ou un polymere cationique favorisant la penetration intercellulaire, et composition cosmetique ou pharmaceutique la contenant.
JP2006248978A (ja) 2005-03-10 2006-09-21 Mebiopharm Co Ltd 新規なリポソーム製剤
CN101616692B (zh) * 2006-07-06 2013-05-08 纽约市哥伦比亚大学信托人 用于血管造影术的多色的不同大小的颗粒
CN102114000B (zh) * 2009-12-31 2013-08-21 复旦大学 一种载药的共输送脂质纳米递药系统
US8871189B2 (en) * 2011-11-30 2014-10-28 Mallinckrodt Llc MMP-targeted therapeutic and/or diagnostic nanocarriers
US11339209B2 (en) 2016-11-14 2022-05-24 Novartis Ag Compositions, methods, and therapeutic uses related to fusogenic protein minion

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5158760A (en) * 1990-05-30 1992-10-27 Board Of Regents, The University Of Texas System 99m TC labeled liposomes
AU725376B2 (en) * 1996-10-15 2000-10-12 Transave, Inc. Peptide-lipid conjugates, liposomes and liposomal drug delivery
FI980604A0 (fi) * 1998-03-18 1998-03-18 Univ Helsinki Licensing Nya matrismetalloproteinasinhibitorer och -regulatorer

Also Published As

Publication number Publication date
EP1372694B1 (en) 2006-06-28
BR0208681A (pt) 2004-03-30
CA2441227A1 (en) 2002-10-03
JP2004529127A (ja) 2004-09-24
CZ20032805A3 (cs) 2004-06-16
US20040213833A1 (en) 2004-10-28
FI20010620A0 (fi) 2001-03-26
HUP0303649A3 (en) 2005-12-28
YU74703A (sh) 2006-05-25
NZ528043A (en) 2005-08-26
DE60212814T2 (de) 2007-02-08
ES2266458T3 (es) 2007-03-01
KR20040000414A (ko) 2004-01-03
IL158114A0 (en) 2004-03-28
CN1531439A (zh) 2004-09-22
SK12982003A3 (sk) 2004-08-03
DK1372694T3 (da) 2006-10-30
ATE331526T1 (de) 2006-07-15
NO20034280L (no) 2003-11-25
PL365248A1 (en) 2004-12-27
RU2003131332A (ru) 2005-04-10
DE60212814D1 (de) 2006-08-10
EE200300467A (et) 2003-12-15
WO2002076491A1 (en) 2002-10-03
EP1372694A1 (en) 2004-01-02
HUP0303649A2 (hu) 2004-01-28
NO20034280D0 (no) 2003-09-25
CN1250279C (zh) 2006-04-12
US20050271588A1 (en) 2005-12-08
FI20010620A (fi) 2002-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20050271588A1 (en) Liposome targeting of matrix metalloproteinase inhibitors
US11059718B2 (en) Methods and compositions using peptides and proteins with C-terminal elements
Lv et al. Nanoplatform assembled from a CD44-targeted prodrug and smart liposomes for dual targeting of tumor microenvironment and cancer cells
Medina et al. Targeted liposomal drug delivery in cancer
Serpooshan et al. [Pyr1]-Apelin-13 delivery via nano-liposomal encapsulation attenuates pressure overload-induced cardiac dysfunction
JP2004529127A5 (fi)
Shi et al. Intelligent “Peptide-Gathering Mechanical Arm” tames wild “Trojan-Horse” peptides for the controlled delivery of cancer nanotherapeutics
US20070140972A1 (en) Targeting compositions and preparation therof
US20060216342A1 (en) Micelle delivery system loaded with a pharmaceutical agent
JP2013507365A (ja) 血餅結合脂質化合物に関する方法および組成物
US20050058697A1 (en) Cell penetrating therapeutic agents
AU2002240989A1 (en) Liposome targeting of matrix metalloproteinase inhibitors
US20130058993A1 (en) Methods and compositions for enhancing wound healing using car peptides
WO2005039495A2 (en) Molecules that selectively home to vasculature of pre-malignant dysplastic lesions or malignancies
US9457041B2 (en) Controlled release nanoparticles and methods of use
Roveri Liposome-mediated delivery of vincristine to rhabdomyosarcoma
Medina et al. Research Article Liposomal Tumor Targeting in Drug Delivery Utilizing MMP-2-and MMP-9-Binding Ligands
Fields Protease-activated delivery and imaging systems
Scherer Mix-and-match nanodendrons for detection and treatment of breast cancer metastases
TW201018487A (en) Peptide ligand directed drug delivery