FI115035B - In vivo -kuvantaminen käyttäen peptidijohdannaisia - Google Patents

Description

115035

In vivo -kuvantaminen käyttäen peptidijohdannaisia Keksinnön ala 5 Keksintö koskee eräitä faaginäyttötekniikalla saatuja LLG-peptidijohdannaisia kuvanta-misaineina diagnostisiin tarkoituksiin sekä menetelmää kasvainten ja infektioi-den/tulehduksen kuvantamiseksi ja niihin kohdistamiseksi.

Keksinnön taustaa 10

Siitä huolimatta, että akuutin myelooisen leukemian (AML) hoidossa on saavutettu merkittäviä etuja, suurin osa potilaista kuolee sairauteensa. Noin puolet AMLrää sairastavista lapsista voidaan parantaa, mutta vähäisen edistymisen vuoksi AML:ää sairastavien iäkkäiden aikuispotilaiden pitkäaikaisessa eloonj äämisessä on tapahtunut paranemista vähitellen. 15 AML:n hoidot ovat raskaita käsittäen suuria annoksia solumyrkkyjä ja allogeenisten kan-tasolujen siirteitä, mutta siitä huolimatta suurimmalla osalla aikuisista sairaus uusiutuu. AML:n hoidon tehostamiseen on kehitetty muutamina viime vuosina uusia strategioita, kuten esimerkiksi modifioimattomaan vasta-aineeseen tai soluun perustuvat immuunihoi-dot. Kuitenkin sellaiset sairaudet kuin esimerkiksi AML, joissa tulos on huono, tulisi hoi-20 taa mahdollisuuksien mukaan kliinisissä kokeissa.

:Integriini CD 11 on yhdistetty AML:n huonoon ennusteeseen. Äskettäin faaginäyttöteknii-•.;. * kalla saatu bioaktiivinen peptidi on spesifinen ligandi valkosolujen ft-integriineille. Seu- ’... ’ lomalla (panning) puhdistetulla Oki/32-mtegrimillä (CD11/CD18) eristettiin uusi nonapepti- i * * : ·' 25 di CPCFLLGCC (LLG), joka on riippuvainen kahdesta disulfidisillasta, jotka rajoittavat ’ · * * * peptidin rakennetta (katso WO 02/072618, joka sisällytetään tähän viitteellä). Porrastetusti syklisoiduilla peptideillä tehdyt tutkimukset osoittivat, että tietyn disulfidikonfiguraation •;;; omaava peptidi on toista aktiivisempi. Keksinnön mukaiseen käyttöön edullinen peptidi on • · e *; * sellainen peptidi, jossa on yksi disulfidisidos Cl - ja C8-kysteimien välissä, ja toinen disul- •. *. * 30 fidisidos C3- ja C9-kysteiinien välissä. Peptidi estää ^-integriinivälitteistä valkosolun so- • · * • · ’ * ·' luadheesiota j a sitoutuu integriinin o:-alayksikön kationiherkkään I-domeeniin. Kahden LLG-konformeerin NMR-rakenteet on määritetty, ja aktiivisempi konformeeri toimii eh- • · *. ’ | dokkaana mahdollisten anti-inflammatoristen aineiden j a leukemiasoluun kohdistuvien yhdisteiden kehittämiseen.

2 115035

Monenlaisia peptidiin perustuvia radioaktiivisia ligandej a on tällä hetkellä kehitteillä hoidollisiin ja diagnostisiin in vivo -strategioihin, mukaan luettuna bombesiini, gastrii-ni/kolekystokiniini ja neurotensiini, jotka ovat yleisissä syövissä ilmentyviä reseptoreja, ja Arg-Gly-Asp-peptidit, joita voidaan kohdistaa moniin tavallisiin kasvaimiin, koska ne si-5 toutuvat reseptoreihin, joita ilmentyy uusissa muodostuvissa verisuonissa.

Tulehdus on puolustusmekanismi, johon kuuluvat tulehduksen esiasteen välittäjien vapautuminen, selektiinivälitteinen valkosolujen tarttuminen ympäröivien verisuonien endotee-lisoluihin, spesifisten valkosoluintegriinien aktivaatio, tiukempi kiinnittyminen johtuen 10 integriinin ja soluväliaineen adheesiomolekyylien (ICAM:ien) vuorovaikutuksesta sekä valkosolujen purkautuminen suonen ulkopuolelle.

Integriinit osallistuvat monenlaisiin solujen väliseen viestintään liittyviin aktiivisuuksiin ja ne ryhmitellään alaperheisiin erilaisten jS-alayksiköiden mukaan. Valkosolut ilmentävät 15 vain fo-integriinejä ja β 2 -integriinejä. Neljä β 2 -integriiniperheen jäsentä ovat arfh eli CD1 la/CD18, α^β2 eli CD1 lb/CD18 eli Mac-1, αχβ2 eli CD1 lc/CD18 ja αοβ2 eli CD1 ld/CD18. ICAM:t ovat β 2 -integriiniperheen pääligandeja ja niillä on yhteinen tunnis-tussekvenssi LLG, jota Q^ft-integriini suosii, a^-integrum osallistuu immuunireaktioihin sitomalla iC3b-päällysteisiä punasoluja, välittämällä myeloidisolun kiinnittymistä ja 20 fagosytoosia voimistaen NK-solujen aktiivisuutta, a^ft-integriini osallistuu makrofagin ja .. : ’ mikro-organismin välisiin vuorovaikutuksiin ja samoin se välittää solun tartuntavuorovai- ’ · . * kutuksia myeloidisoluilla. 0^/¾ :11a on muita ligandeja, mukaan luettuna faktori X ja fibri- nogeeni.

; ’ 25 Äskettäin faaginäyttötekniikalla saatu bioaktiivinen peptidi on spesifinen ligandi val- ' kosolun /k-integriineille. Seulomalla puhdistetulla Q^/32-integriinillä (CD 11 /CD 18) eristet- , tiin uusi nonapeptidi CPCFLLGCC (LLG), joka on riippuvainen kahdesta disulfidisillastä, ..! jotka rajoittavat peptidin rakennetta. Porrastetusti syklisoiduilla peptideillä tehdyt tutki mukset osoittivat, että tietyn disulfidikonfiguraation omaava peptidi on toista aktiivisempi.

; ’ 30 Peptidi estää Q^j32-integriinivälitteistä valkosolun soluadheesiota ja sitoutuu integriinin a- » alayksikön kationiherkkään I-domeeniin. Kahden LLG-konformeerin NMR-rakenteet on ;.; ! määritetty, ja aktiivisempi konformeeri toimii ehdokkaana mahdollisten anti- . 1 i inflammatoristen aineiden ja leukemiasoluun kohdistuvien yhdisteiden kehittämiseen. Tut kimme tässä mahdollisuuksia käyttää LLG:tä tulehdukseen kohdistuvana aineena. 1 3 115035 LLG:hen voidaan myös liittää PEG-molekyyli sen hoidollisen vaikutuksen parantamiseksi. Meillä tulee myös olemaan projekti, jossa LLG kiteytetään kompleksilla I-domeenin kanssa ja jossa suunnitellaan peptidille orgaaninen analogi. Arvioimme myös analogin mahdollisuudet tässä kuvatuilla eläinmalleilla. LLG voi toimia myös terapeuttisena aineena li-5 posomin pinnalla. Liposomia käyttämällä voimme muokata peptidin farmakokinetiikkaa j a dynamiikkaa.

Tämä työ kuvaa tutkimuksen, joka koskee uutta toimintatapaa AML-soluihin kohdistamiseksi peptidiin perustuvalla menetelmällä, jota voidaan käyttää täsmähoitoon. Kuvataan 10 LLG:n tai LLG-PEG:n käyttö kuvantamisaineena diagnostisiin tarkoituksiin.

Keksinnön yhteenveto Tässä keksinnössä osoitamme LLG-peptidijohdannaisten ominaisuudet, joilla ne kohdistu-15 vat kasvaimeen ja infektioon. Samoin LLG:hen liitetään PEG-molekyyli sen biokineettis- ten ominaisuuksien parantamiseksi. Nukutettuja eläimiä, joissa on ksenografteja, on kuvanneita eri ajankohtina kasvaimeen siirtymisen tutkimiseksi. Biojakautumista on tutkitta eläimillä, joilla on kasvaimia ja tulehduksellisia vaurioita.

20 Niinpä keksintö koskee sellaisen peptidin tai sen johdannaisen käyttöä, joka sisältää raken-teen CXCXLLGCC, jossa X on mikä tahansa aminohappotähde, kasvaimeen kohdistami- M.' sessa tai diagnostisiin tarkoituksiin.

t . I

' · * * ’ Vielä keksintö koskee vastaavia menetelmiä, so. menetelmää potilaan kasvainsolujen ku- • ’ 25 vantamiseksi sekä menetelmää solumyrkkyjen kohdistamiseksi kasvainsoluihin.

Vielä keksinnön edullisessa suoritustavassa keksintö koskee sellaisen peptidin tai sen j oh- * · · dannaisen käyttöä, joka sisältää rakenteen CPCPLLGCC, kasvaimeen kohdistamisessa tai ‘ · ’ diagnostisiin tarkoituksiin.

30 » · * » · • »* / 5 4 115035

Piirustusten lyhyt kuvaus

Kuvassa 1 osoitetaan kasvaimeen kohdistuminen ihmisen myelomonosyyttileukemiassa hiirimallissa. Käytetään metallikelatointia, esimerkki In-111.

Kuvassa 2 osoitetaan kasvaimeen kohdistuminen 24 tunnin kuluttua I-125-YADGA-LLG-peptidin laskimoruiskeesta.

Kuvassa 3 osoitetaan kasvaimeen kohdistuminen 24 tunnin kuluttua PEG-molekyyliin 10 liitetyn I-125-YADGA-LLG-peptidin laskimoruiskeesta.

Kuvat 2-3.

Kasvaimeen kohdistuminen osoitetaan halogenoiduilla LLG-j ohdoksilla, vasemmalla pal-jas peptidi, oikealla PEG-molekyyliin liitetty peptidi. I-125-leima, ihmisen myelomono-15 syyttileukemian hiirimalli. Planaarinen gammakuva. Näissä kuvissa eläimiin on ruiskutettu radioaktiivisesti leimattua peptidiä ja nukutetut eläimet on kuvattu gammakameralla (rei-käkollimaattori, pinhole collimator, Picker SX-300 gammakamera).

Kuvassa 4 esitetään tutkimus I-125-YADGALLG-peptidin biojakautumisesta. 125I:lla lei-20 matun peptidin in vivo -biojakautuminen määritettiin NMRI/immuunikyvyttömillä hiirillä , i ’ kolmena ajankohtana ruiskeiden jälkeen. 125I:lla leimatun peptidin biojakautuminen hiirillä ’ . ·’ 2 h, 6 h ja 24 h p.i., koijattu painon mukaan. Tulokset ilmoitetaan prosentteina ruiskutetus- ' .: ta annoksesta 0,1 grammaa kudosta kohti (% ID/0,1 gramma). Kaikki arvot ilmoittavat 5 ’ · ’ hiiren keskiarvon ± keskihajonnan.

\ 25 * · · · ‘ Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 5 115035 LLG-PEG CPCFLLGCC, johon on liitetty PEG-molekyyli MRI magneettiresonanssikuvaus NMR ydinmagneettinen resonanssi PEG polyetyleeniglykoli 5 PEG-NHS polyetyleeniglykoli-N-hydroksisukkinimidyyli

Ensin LLG-peptidin YADGA-johdannaista tutkittiin kasvaimeen kohdistumisen suhteen U937-solulinjassa. Peptidi leimattiin käyttämällä In-111-leimaa sekä suoraa jodausta ja cDTPA:ta. Koska kasvaimeen kohdistaminen onnistui, kehitettiin lisää johdannaisia lä-10 hempään kuvantamisen karakterisointiin. Niitä laajennettiin käsittämään Tc-99m ja muita kelatointiaineita, kuten esimerkiksi HYNICiä. Tämä peptidi kytkettiin myös PEG-NHSrään, jolloin kuvantaminen onnistui.

Keksijät havaitsivat eläimen leukemiamallilla, että LLG:tä voidaan käyttää kohdistamisai-15 neena sellaisenaan ja että sitä voidaan muokata PEG-molekyylillä. Tämä on erittäin tärkeää, koska näitä aineita pidetään ihmiselle myrkyttöminä ja niitä on helppo testata ja valmistaa. Keksintö koskee myös LLG:n käyttöä solumyrkkyjen kohdistamisaineena liposomeis-sa. Edelleen LLG voi edistää solumyrkkyjen vaikutuksen säätelyä vähäisemmin sivuvaikutuksin. Tätä arvioitiin AML:ssä leukemian eläinmallilla. Tässä leukemiamuodossa hoitotu-20 los on tällä hetkellä epätyydyttävä j a uusia hoitotapoj a tarvitaan.

LLG on peptidi, joka sitoutuu valkosolun integriineihin (J. Biol. Chem. 2001; 153: 905- ‘ · ’ 15). YADGACPCFLLGCC-johdannainen kehitettiin lähempään kuvantamisen karakte- ‘ · ' risointiin. Kehitettiin radioaktiiviset leimausmenetelmät In-111- ja I-125-johdannaisille.

• · • ; * 25 LLG-peptidi kytkettiin myös PEG-NHS:ään. Kehitettiin lisää radionuklidimodifikaatioita ’ * “ ’ käsittäen myös fosfolipidillä liitetyn PEG:n ja liposomirakenteet.

• · ·

Radioaktiivisesti leimatuille peptidijohdannaisille suoritettiin kuvantaminen eri ajankohtina • käyttämällä gammakameraa, jotta saatiin tutkittua kasvaimeen siirtyminen in vivo ajan ; ‘ 30 funktiona. Viimeisen kuvantamisen jälkeen kasvainkudos leikattiin irti ja sen radioaktiivi suus mitattiin. Tutkittiin yksityiskohtainen hienojakautuminen käyttämällä kvantitatiivista : i autoradiografiaa. YADGA-LLG-peptidistä tutkittiin kasvaimeen kohdistuminen ihmisen , ·: myelomonosyyttileukemian U937-solulinjassa. Peptidi leimattiin käyttämällä In-111- leimaa ja suoraa jodausta, samoin kuin cDTPA.ta. ‘ 6 115035

Lisäksi voitiin kuvantaa peptidoliposomeja, joita käytettiin terapeuttisiin lähestymistapoihin. Liposomeihin voidaan kapseloida kaasumaisia partikkeleja sonografiaan, paramag-neettisia yhdisteitä MRLhin ja fluoreseiinileima fluoresenssikuvantamiseen sekä esimer-5 kiksi lusiferaasientsyymij äij estelmä kemiluminesenssikuvantamiseen.

Myöhemmin kehitetään liposomirakenne, joka sisältää terapeuttisena aineena antrasyk-liiniä, jota kutsutaan idarubisiiniksi, joka on tällä hetkellä tehokkain AML:n hoito mutta jolla on myrkyllisiä vaikutuksia, ja kohdistamisaineena LLG:tä. LLG voi toimia myös te-10 rapeuttisena aineena liposomin pinnalla. Tätä leimattua liposomia käyttämällä voimme tutkia idarubisiinin farmakokinetiikkaa ja dynamiikkaa.

t i

Kokeellinen osa ! 15 LLG-rakenteiden testaaminen eläimissä antaa taustatietoj a akuutin myelooisen leukemian (AML) hoidon kliiniseen kehittämiseen. LLG-rakenteiden solufarmakologian, sytokinetii-kan ja farmakokinetiikan tuntemus leukemiahiirissä tuo esiin huomattavan riippuvuuden jaksotuksesta ja annoksesta.

20 PEG-molekyylin kanssa yhdistetty LLG-peptidi ja LLG-peptidiä kantavat liposomit ;, , · PEG-molekyylin liittäminen peptideihin tekee niistä tavallisesti pysyvämpiä seerumissa j a *. .' siitä syystä tehokkaampia. Tämä peptidin yksinkertainen ja nopea muokkaus voi tehdä ‘ · · ·' peptidistä seerumissa niin pysyvän, että sitä voidaan käyttää terapeuttisena aineena j a ku- : ; ‘ 25 vantamisaineena. LLG-peptidin N-päähän lisätään YADGA-sekvenssi leimaamistoimenpi- ’ * ’ teeseen sekä sidoksen saamiseksi peptidin ja PEG-molekyylin välille. Tämä peptidi kytke tään PEG-NHS :ään erilaisia molekyylipainoja käyttäen EDC-NHS-reaktiolla. PEG.hen '; ! liitettävän parhaan molekyylin selville saamiseksi tätä rakennetta testataan soluviljelmällä ja biojakautuminen arvioidaan hiirillä, joissa on ksenografteja.

v;: 30

Tioglykolaatti-inkubointi > 1 * * :.' i Alussa tioglykolaatin inkubaatiota on testattu eläimissä sen jälkeen, kun niihin on ruisku- / tettu ainetta intraperitoneaalisesti. Eläimistä tutkitaan biojakautuminen 10 minuutin kulut- 7 115035 tua. Intraperitoneaalineste otetaan talteen ja solut värjätään integriinin ilmentymisen suhteen. Suurinta siirtymismäärää käytetään lisätutkimuksiin. Sytologiset näytteet otetaan talteen neutrofiilien ilmaantumisen karakterisoimiseksi tulehduskohdissa.

5 LLG-peptidin kohdistuminen tioglykolaatti-inkubaation jälkeen

Yhdestä sellaisesta valitusta tioglykolaatti-inkubaation ajankohdasta, jossa kehittyi tarkoituksenmukainen tulehdus, suoritettiin leimatun LLG-peptidirakenteen yksityiskohtainen biojakautumistutkimus. Peptidin siirtymistä kudoksiin on tutkittu eri ajankohtina: 5 mi-10 nuuttia, 30 minuuttia, 3 tuntia, 18 tuntia ruiskeen jälkeen. Erityistä huomiota kiinnitettiin intraperitoneaalinestenäytteisiin. Sytologiset näytteet on otettu talteen neutrofiilien ilmaantumisen arvioimiseksi tulehduskohdissa.

Tulehdukseen kohdistumisen tutkimukset LLG-peptidiä käyttäen 15 LPS-inkubointi

Alussa LPS:n inkubaatiota testataan eläimissä. Tutkitaan inkubaatioajat 72 tuntia, 24 tuntia ja 3 tuntia. Eläimistä tutkittiin biojakautuminen 3 tunnin kuluttua. Suurinta siirtymismäärää 20 24 tunnin kohdalla käytettiin lisätutkimuksiin.

» * .: LLG-peptidin kohdistuminen LPS-inkubaation jälkeen ' * Yhdestä sellaisesta valitusta LPS-inkubaation ajankohdasta, jossa kehittyi tarkoituksenmu- : 25 kainen tulehdus, suoritettiin leimatun LLG-peptidirakenteen yksityiskohtainen biojakau tumistutkimus. Histologiset näytteet otetaan talteen neutrofiilien ilmaantumisen arvioimiseksi tulehduskohdissa. Kuvassa 4 esitetään jodattua peptidiä käyttämällä saatu normaali bioj akautumisaineisto.

30 Tulokset - · YADGA-LLG-peptidiä tutkittiin kasvaimeen kohdistumisen selvittämiseksi U937- > » •. : solulinj assa. Peptidi leimattiin käyttämällä In-111 -leimaa j a suoraa j odausta sekä cDTPA:ta. Kuva 1 osoittaa selvästi kasvaimeen kohdistumisen 3 tunnin kuluttua In- lii- 8 115035 YADGA-LLG:n laskimoruiskeesta. Tässä mallissa absoluuttinen kasvaimen ja veren suhde (tumor-to-blood ratio) oli 24 tunnin kohdalla 4,7.

Olemme suorittaneet LLG.n ja PEG:n kanssa yhdistetyn LLG:n radioaktiivisen halogenaa-5 tion. Halogenaatio voidaan suorittaa samalla tavalla käyttämällä radionuklideja 1-123, jota isotooppia voidaan käyttää myös gammakuviin, ja 1-124, jota voitaisiin käyttää positro-niemissiotomografiaan, (kuviin), ja 1-125 (Auger-terapia, gammailmaisin, operointiteknii-kat), ja 1-131 (gamma-kuvat, radionuklidihoito, beetasäteily). Muita mahdollisesti käyttökelpoisia radionuklideja ovat Br-76, Br-77 ja At-211. Bromi on positronisäteilijä ja astatii-10 ni alfasäteilijä (radionuklidihoito). In-111 on siirtymämetalli. Samaa menetelmää voitaisiin käyttää monien radiometallien radioaktiiviseen leimaamiseen.

Kuvatut cDTPA-kelatoidut metalliradionuklidit ovat In-111, muita esimerkkejä ovat In-110 (PET), In-114m (Auger, gamma) jne. Muita samanlaisia ovat Y-90 j a muut nuklidit, 15 Co, Fe, Ni, Cu, Zn, periaatteessa kaikki siirtymämetallit ja niiden radionuklidit. Gd on pa- ramagneettisiin tehosteaineisiin käytetty metalli ja se voidaan yhdistää cDTPA-kelaation kanssa. Useimmilla lantanideilla on paramagneettiseen kuvantamiseen käyttökelpoisia ominaisuuksia, ja niiden yhteydessä voidaan käyttää cDTPA-kelaatiota.

20 Olemme käyttäneet kuvantamiseen peptidoliposomej a. Liposomeihin voidaan kapseloida ; * kaasumaisia partikkeleja ultrasonografiaan, paramagneettisia yhdisteitä MRI:hin ja fluo- reseiinileima fluoresenssikuvantamiseen sekä esimerkiksi lusiferaasientsyymijärjestelmä . · kemiluminesenssikuvantamiseen.

» ·

Claims (10)

115035

1. Sellaisen peptidin käyttö, joka sisältää rakenteen

5 CXCXLLGCC, jossa X on mikä tahansa aminohappotähde, kasvaimeen kohdistamisessa.

2. Sellaisen peptidin käyttö, joka sisältää rakenteen 10 CXCXLLGCC, jossa X on mikä tahansa aminohappotähde, diagnostisiin tarkoituksiin.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen käyttö, jossa patenttivaatimuksen 2 mukainen peptidi liitetään radioaktiiviseen leimaan, magneettiseen partikkeliin tai fluoresoivaan leimaan, käytettäväksi kuvantamisaineena.

4. Sellaisen peptidin käyttö, joka sisältää rakenteen 20 CPCFLLGCC, » » kasvaimeen kohdistamisessa. . · ., 5. Sellaisen peptidin käyttö, joka sisältää rakenteen !· 25 CPCFLLGCC, ,;. diagnostisiin tarkoituksiin. • > · i · » · # » · .'. 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen käyttö, jossa patenttivaatimuksessa 5 määritelty peptidi _.. φ 30 liitetään radioaktiiviseen leimaan, magneettiseen partikkeliin tai fluoresoivaan leimaan, • · » I » käytettäväksi kuvantamisaineena. • » * · * ‘ * ' ' 7. Patenttivaatimuksen 1 tai 4 mukainen käyttö, jossa peptidiä käytetään solumyrkkyjä kohdistavana aineena liposomeissa. 115035

8. Jonkin edellä mainituista patenttivaatimuksista mukainen käyttö, jossa peptidiä on muokattu PEG-molekyylillä.

9. Pakkaus kasvainsolujen kuvantamiseksi potilaassa, joka pakkaus sisältää koostumusta, joka sisältää vähintään yhtä sellaista peptidiyhdistettä, joka on valittu niiden peptidien ryhmästä, joissa on rakenne CXCXLLGCC, jossa X on mikä tahansa aminohappotähde, kytkettynä todettavissa olevaan leimaan.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen pakkaus, jossa todettavissa oleva leima on radioaktiivinen leima, magneettinen partikkeli tai fluoresoiva leima. 15