JP2013507365A - 血餅結合脂質化合物に関する方法および組成物 - Google Patents

血餅結合脂質化合物に関する方法および組成物 Download PDF

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Abstract

血餅結合頭基に関係する組成物および方法が開示される。開示される標的化は、癌ならびに他の疾患および障害の処置のために有用である。一局面において、両親媒性分子を含む組成物が提供され、上記両親媒性分子の少なくとも１つは血餅結合頭基を含み、上記血餅結合頭基は凝固血漿タンパク質に選択的に結合し、上記組成物は凝固を引き起こさない。一局面において、上記血餅結合頭基は、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）またはその保存的な改変体を含むアミノ酸セグメント、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含むアミノ酸セグメント、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなるアミノ酸セグメント、またはアミノ酸配列ＲＥＫからなるアミノ酸セグメントより独立して選択されるアミノ酸セグメントを含む。

Description

連邦政府によって資金供与を受けた研究についての声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｒｔ， Ｌｕｎｇ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって付与された助成金第ＨＬ０７０８１８号、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓによって付与された助成金第１Ｓ１０ＲＲ０１７７５３号およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによって付与された助成金第ＤＭＲ０５−２０４１５号の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
心血管疾患は、米国では生涯の間に３人に１人に影響を及ぼし、毎年発生する死亡症例のほぼ１／３を占める（非特許文献１）。アテローム硬化症は、心血管疾患の主要な原因の１つであり、血管内腔を閉塞し、血管を通る血流を妨害し得る隆起したプラークを動脈壁内にもたらす。近年では、全てのプラークが同じものであるというわけではないことが明らかになった。破裂、亀裂を生じること（ｆｉｓｓｕｒｉｎｇ）および以降の血栓症を起こしやすいものは、最も高い頻度で急性の冠動脈症候群および死の原因となっている（非特許文献２）。
アテローム硬化性プラークの破裂は、コラーゲンおよび他のプラーク構成成分を血流に曝露させる。これは血管内の止血を誘発し、破裂部位でトロンビンの活性化および血栓の形成をもたらす。血管壁に結合した高レベルの活性化トロンビンは、脈管損傷の最長７２時間後まで観察されている（非特許文献３）。これらの高いトロンビンレベルは、血餅形成を誘導するだけでなく、平滑筋細胞を循環する低比重リポタンパク質に結合させることによるアテローム硬化症の進行との関係が示唆されている（非特許文献４）。プラークのかすかな凝固は、アテローム硬化性プラークの内部およびその表面でのフィブリン／フィブリノーゲンの沈着によっても示され、それは１９４０年代から詳細に記録されている（Ｄｕｇｕｉｄ ＪＢ（１９４８年）Ｊ Ｐａｔｈｏｌ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ６０巻、５７〜６１頁；Ｓｍｉｔｈ ＥＢ（１９９３年）Ｗｉｅｎ Ｋｌｉｎ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ１０５巻、４１７〜４２４頁；Ｄｕｇｕｉｄ ＪＢ（１９４６年）Ｊ Ｐａｔｈｏｌ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ５８巻、２０７〜２１２頁）。
フィブリンを含有する血餅は、血栓への造影剤および抗凝固剤の部位特異的送達のための標的として、広く用いられてきた（Ｂｏｄｅ Ｃ、ら（１９９４年）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９０巻、１９５６〜１９６３頁；Ｓｔｏｌｌ Ｐ．、ら（２００７年）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２７巻、１２０６〜１２１２頁；Ａｌｏｎｓｏ Ａ、ら（２００７年）Ｓｔｒｏｋｅ ３８巻、１５０８〜１５１４頁）。凝固が起きている血管に抗凝血物質を送達することは、血餅の形成および拡大を低減することで効果的であることが示され、さらに全身の副作用のリスクを減少させる（Ｂｏｄｅ Ｃ、ら（１９９４年）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ９０巻、１９５６〜１９６３頁；Ｓｔｏｌｌ Ｐ．、ら（２００７年）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２７巻、１２０６〜１２１２頁）。アテローム硬化性プラーク上に特異的に発現される分子マーカーに結合する抗体およびペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでのプラーク画像化のための見込みを示した（Ｈｏｕｓｔｏｎ Ｐ、ら（２００１年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４９２巻、７３〜７７頁；Ｌｉｕ Ｃ、ら（２００３年）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６３巻、１８５９〜１８７１頁；Ｋｅｌｌｙ ＫＡ、ら（２００６年）Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｂｉｏｌ ８巻、２０１〜２０７頁；Ｂｒｉｌｅｙ−Ｓａｅｂｏ ＫＣ、ら（２００８年）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１７巻、３２０６〜３２１５頁）が、プラーク上の凝固は、標的として用いられなかった。プラーク上に沈着するフィブリンは、プラークに診断および治療用の化合物を送達するための標的の役目を果たすことができた。
診断および治療用の化合物をプラークに送達するために、フィブリンホーミング化合物を含有するナノ粒子を用いることができた。血餅結合ペプチドＣＲＥＫＡが、ｉｎ ｖｉｖｏでのファージライブラリースクリーニングによって腫瘍ホーミングペプチドとして特定され、その後、腫瘍の血管および間質内で凝固血漿タンパク質に結合することが示された（Ｓｉｍｂｅｒｇ Ｄ、ら（２００７年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４巻、９３２〜９３６頁；Ｋａｒｍａｌｉ ＰＰら、（２００９年）Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、５巻、７３〜８２頁）。診断および治療用の化合物をプラークに送達するために、ＣＲＥＫＡ標的化ビヒクルを用いることができる。
Ｒｏｓａｍｏｎｄ Ｗら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（２００７年）１１５巻、ｅ６９〜１７１頁 Ｄａｖｉｅｓ ＭＪ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（１９９２年）８５巻、１１９〜２４頁 Ｇｈｉｇｌｉｏｔｔｉ Ｇ、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ（１９９８年）１８巻、２５０〜２５７頁 Ｉｖｅｙ ＭＥおよびＬｉｔｔｌｅ ＰＪ、Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ（２００８年）１２３巻、２８８〜２９７頁
両親媒性分子を含む組成物が開示され、両親媒性分子の少なくとも１つは血餅結合頭基（ｃｌｏｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｈｅａｄ ｇｒｏｕｐ）を含み、血餅結合頭基は凝固血漿タンパク質に選択的に結合し、組成物は凝固を引き起こさない。
両親媒性分子を含む組成物を被験体に投与するステップを含む方法も開示され、ここで、両親媒性分子の少なくとも１つは血餅結合頭基を含み、血餅結合頭基は凝固血漿タンパク質に選択的に結合し、組成物は凝固を引き起こさず、組成物は被験体の中の凝固血漿タンパク質に結合する。開示される組成物の１つまたは複数を被験体に投与するステップを含む方法も開示され、組成物は被験体の中の凝固血漿タンパク質に結合する。
両親媒性分子を混合するステップを含む、組成物を作製する方法も開示され、両親媒性分子の少なくとも１つは血餅結合頭基を含み、血餅結合頭基は凝固血漿タンパク質に選択的に結合し、組成物は凝固を引き起こさない。組成物を作製する方法も開示され、両親媒性分子を混合するステップを含み、両親媒性分子の少なくとも１つは開示される血餅結合頭基の１つまたは複数を含む。
両親媒性分子は、機能的頭基を含むことができる。両親媒性分子の少なくとも１つは、機能的頭基を含むことができる。機能的頭基は、検出頭基であってよい。機能的頭基は、処置頭基であってよい。両親媒性分子の少なくとも１つは検出頭基を含むことができ、両親媒性分子の少なくとも１つは処置頭基を含むことができる。
両親媒性分子は、親水性媒体にさらしてよい。両親媒性分子は、親水性媒体中で凝集体を形成することができる。凝集体は、ミセルを含むことができる。
血餅結合頭基は、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）もしくはその保存的な改変体を含むアミノ酸セグメント、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含むアミノ酸セグメント、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなるアミノ酸セグメント、アミノ酸配列ＲＥＫからなるアミノ酸セグメント、またはそれらの組合せより独立して選択されるアミノ酸セグメントを含むことができる。アミノ酸セグメントは、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）またはその保存的な改変体を各々独立して含むことができる。アミノ酸セグメントは、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を各々独立して含むことができる。アミノ酸セグメントの少なくとも１つは、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなることができる。アミノ酸セグメントの少なくとも１つは、アミノ酸配列ＲＥＫからなることができる。
両親媒性分子は検出可能であってよい。両親媒性分子は、蛍光、ＰＥＴまたはＭＲＩによって検出可能であってよい。検出頭基は、ＦＡＭまたはその誘導体を含むことができる。
処置頭基は、心血管疾患を処置するための化合物または組成物を含むことができる。処置頭基は、アテローム硬化症を処置するための化合物または組成物を含むことができる。処置頭基は、トロンビンの直接的な阻害剤を含むことができる。処置頭基は、ヒルログまたはその誘導体を含む。処置頭基は、プログラム細胞死またはアポトーシスを誘導するための化合物または組成物を含むことができる。処置頭基は、癌を処置するための化合物または組成物を含むことができる。ミセルは、両親媒性分子を含むことができる。組成物は、両親媒性分子を含むリポソームを含むことができる。
開示される組成物のいずれかと、被験体の中のプラークとのコンジュゲートも開示される。開示される組成物のいずれかと、被験体の中の腫瘍とのコンジュゲートも開示される。
被験体は、凝固血漿タンパク質に関連するおよび／またはそれを生じる疾患または状態の処置を必要とするものであってよい。被験体は、心血管疾患の処置を必要とするものであってよい。被験体は、凝固血漿タンパク質に関連するおよび／またはそれを生じる疾患または状態の検出、視覚化またはその両方を必要とするものであってよい。被験体は、心血管疾患の検出、視覚化またはその両方を必要とするものであってよい。被験体は、癌、腫瘍またはその両方の検出、視覚化またはその両方を必要とするものであってよい。被験体は、癌の処置を必要とするものでよい。
組成物を投与するステップは、凝固血漿タンパク質に関連するおよび／またはそれを生じる疾患または状態を処置することができる。組成物を投与するステップは、心血管疾患を処置することができる。心血管疾患は、アテローム硬化症であってよい。組成物を投与するステップは、癌を処置することができる。方法は、凝固血漿タンパク質に関連するおよび／またはそれを生じる疾患または状態を検出するステップ、視覚化するステップ、またはその両方をさらに含むことができる。方法は、心血管疾患を検出するステップ、視覚化するステップ、またはその両方をさらに含むことができる。方法は、癌、腫瘍またはその両方を検出するステップ、視覚化するステップ、またはその両方をさらに含むことができる。
方法は、投与するステップの前に、親水性媒体に両親媒性分子をさらすステップをさらに含むことができる。両親媒性分子は、親水性媒体中で凝集体を形成することができる。凝集体は、ミセルを含むことができる。方法は、投与するステップの後に、両親媒性分子を検出するステップをさらに含むことができる。両親媒性分子は、蛍光、ＰＥＴまたはＭＲＩによって検出することができる。両親媒性分子は、蛍光によって検出することができる。組成物は、被験体の中のプラークとコンジュゲートすることができる。組成物は、被験体の中の腫瘍とコンジュゲートすることができる。
血餅結合頭基は、アミノ酸配列ＲＥＫを含むアミノ酸セグメント、フィブリン結合ペプチド、血餅結合抗体および血餅結合小有機分子から各々独立して選択することができる。血餅結合頭基は、アミノ酸配列ＲＥＫを含むアミノ酸セグメントを各々独立して含むことができる。
血餅結合頭基は、フィブリン結合ペプチドを各々含むことができる。フィブリン結合ペプチドは、フィブリン結合タンパク質およびフィブリンに結合するその誘導体からなる群より独立して選択することができる。別の例では、血餅結合頭基は、血餅結合抗体を各々含むことができる。さらに、血餅結合頭基は、血餅結合小有機分子を各々含むことができる。
組成物は、脂質、ミセル、リポソーム、ナノ粒子、微小粒子またはフルオロカーボン微小泡をさらに含むことができる。一例において、組成物は検出可能であってよい。別の例では、組成物は処置頭基を含むことができる。処置頭基の例は、ヒルログである。
組成物は、１つまたは複数の頭基をさらに含むことができる。例えば、頭基は、抗血管新生剤、血管新生促進剤、癌化学療法剤、細胞傷害剤、抗炎症剤、抗関節炎剤、ポリペプチド、核酸分子、小分子、画像造影剤、フルオロフォア、フルオレセイン、ローダミン、放射性核種、インジウム１１１、テクネチウム９９、炭素１１および炭素１３からなる群より独立して選択することができる。頭基の少なくとも１つは、処置頭基であってよい。処置頭基の例は、パクリタキセルおよびタキソールである。頭基の少なくとも１つは、検出頭基であってよい。
組成物は、凝固血漿タンパク質に選択的に向かうことができる。組成物は、腫瘍血管系、創傷部位またはその両方に選択的に向かうことができる。一例において、組成物は治療効果を有することができる。この効果は、腫瘍部位または創傷部位への処置頭基の送達によって強化することができる。
治療効果は、心血管疾患の増大における遅延化または心血管疾患の低減であってよい。治療効果は、アテローム硬化症の増大における遅延化またはアテローム硬化症の低減であってよい。治療効果は、プラークの数および／またはサイズの増大における遅延化あるいはプラークの数および／またはサイズの低減であってよい。治療効果は、処置される疾患の原因または症状のレベルまたは量の低減であってよい。治療効果は、腫瘍負荷の増大における遅延化または腫瘍負荷の低減であってよい。
被験体は、標的化される１つまたは複数の部位を有してもよく、そこで、組成物は、標的化される部位の１つまたは複数に向かう。例えば、被験体は複数の腫瘍または損傷部位を有してよい。
開示される方法および組成物のさらなる利点は、以下の記載で一部示され、および記載から一部理解され、または開示される方法および組成物の実施によって学ぶことができる。開示される方法および組成物の利点は、添付の特許請求の範囲で詳細に指摘される構成要素および組合せによって実現され、達成される。上記一般記載および以下の詳細な記載の両方は、例示および説明するだけであり、請求される本発明を制限するものでないことを理解すべきである。
この明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、開示される方法および組成物のいくつかの実施形態を例示し、記載と一緒に、開示される方法および組成物の原理を説明する役目を果たす。
図１は、ＣＲＥＫＡペンタペプチドの腫瘍ホーミングを示す。フルオレセインコンジュゲート型ＣＲＥＫＡペプチド（１マウスにつき２００μｇ）を、同系Ｂ１６黒色腫を有するマウスに注射した。野生型マウスでの腫瘍中のフィブリン様構造へのフルオレセイン−ＣＲＥＫＡのホーミング（Ａ、矢印）、およびフィブリノーゲンヌルマウスでのホーミングの欠損（Ｂ）を例示するために、代表的な顕微鏡視野を示す。（Ｃ）ＣＲＥＫＡファージはチューブ内で凝固血漿タンパク質に結合するが、非組換え対照ファージはほとんど結合を示さない。（Ｄ）フルオレセイン−ＣＲＥＫＡとコンジュゲートしたデキストランコート酸化鉄ナノ粒子は凝固血漿タンパク質に結合し、結合は遊離のＣＲＥＫＡペプチドによって阻害される。（Ｄ）中の挿入図は、血餅結合ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの顕微鏡的外観を示す。倍率：Ａ〜Ｂ、×２００；Ｄ、×６００。 図２は、ＣＲＥＫＡコンジュゲート型酸化鉄粒子の腫瘍ホーミングを示す。直径１〜１．５ｃｍのＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳癌異種移植腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃヌードマウスに、ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ粒子を静脈内に注射した（４ｍｇ Ｆｅ／ｋｇ）。マウスは５〜６時間後に灌流によって屠殺し、組織をＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ蛍光（緑色）について検査した。核は、ＤＡＰＩ（青色）で染色した。（Ａ）２時間前にＰＢＳ（Ａ、上パネル）または２００μｌのＰＢＳに０．２μｍｏｌのＮｉを含有するＮｉ／ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬリポソーム（Ｎｉ−リポソーム）（Ａ、下パネル）の注射を受けたＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍マウスからの組織でのＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの分布。（Ｂ）異なる処置の後のＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの血漿中循環半減期。少なくとも４つの時点で収集した。Ｐｒｉｚｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて一指数関数的減衰にデータをあてはめ、半減期の値を対応のないｔ検定で比較した（＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎ＝１０）。（Ｃ）腫瘍血管でのＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子の蓄積。マウスを注射し、組織をパネルＡのように収集した。蛍光血管内ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ粒子は、透過光で見られる酸化鉄と重なる。倍率：×６００。（Ｄ）Ｎｉ−リポソーム／ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯを注射したマウスの対照器官。時折の蛍光スポットは、腎臓および肺で見られる。心臓で見られる蛍光は注射されていない対照と異ならず、それが自己蛍光であることを示した。少なくとも３つの独立した実験からの代表的な結果を示す。倍率ＡおよびＤ、×２００；Ｃ、×６００。 図３は、腫瘍血管でのＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子の蓄積を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植を有するマウスを、図２の凡例に記載のＮｉ−リポソームおよびＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子で注射した。ナノ粒子注射の６時間後にマウスを潅流し、組織を収集した。（Ａ）上パネル：血管中のＣＤ３１染色とのナノ粒子蛍光の共局在；中パネル：腫瘍血管中のナノ粒子蛍光および抗フィブリン（フィブリノーゲン）染色の共局在。挿入図−腫瘍血管中の原線維に沿って分布するＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯを示す画像；下パネル；血小板の抗ＣＤ４１染色とのナノ粒子蛍光の共局在の欠如。（Ｂ）血流のマーカーとしてＤｉＩ染色赤血球を用いる腫瘍の生体内共焦点鏡検。矢印は、静止赤血球が血流の閉塞を示す血管を指し示す。上記の血管中の血流は、妨げられていない。１分間動画（補助資料の動画２）からの６連続フレームを示す。（Ｃ）ＣＲＥＫＡコートリポソームは、腫瘍血管中でフィブリンと共局在する。結果は、３つの独立した実験を代表する。倍率：ＡおよびＣ、×６００、Ｂ、×２００。 図４は、腫瘍でのナノ粒子蓄積に対する血液凝固の影響を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳癌異種移植を有するマウスに、ＰＢＳまたは８００Ｕ／ｋｇのヘパリンのボーラスとその１２０分間後にＮｉ−リポソーム（またはＰＢＳ）およびＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ（または対照ナノ粒子）とを静脈内に注射した。実験全体で、マウスは、腹腔内注射によるさらなるヘパリン（合計１０００Ｕ／ｋｇ）またはＰＢＳを受けた。（Ａ）腫瘍をナノ粒子注射の６時間後に取り出し、異なる処置の後の腫瘍中の磁気シグナルをＳＱＵＩＤで測定した。アミノ化されたデキストランＳＰＩＯは、粒子対照（対照ＳＰＩＯ）の役目を果たした。組織中のＳＰＩＯナノ粒子の濃度は、ブランク組織の反磁性および常磁性のバックグラウンドを引き算した後の１Ｔ磁場での組織の飽和磁化値（電磁単位、ｅｍｕ）によって表される。磁化値は、組織の乾燥重量に正規化した。３つの実験からの結果を示す。（Ｂ）血管中の凝固に対するヘパリンの影響の定量化。マウスは前記のようにＰＢＳ（白棒）またはヘパリン（黒棒）で前処置し、続いてＮｉリポソーム／ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子で処置した。各処置を表す２つの腫瘍からの３つの切片を血管のために抗ＣＤ３１で染色し、蛍光および蛍光血餅に陽性の血管の百分率を決定した。ヘパリンは粒子を含有する血管の百分率を有意に変化させなかったが、蛍光で満たされた内腔の発生率を劇的に低下させたことに注意されたい。（Ｃ）ヘパリンで処置したマウスの腫瘍血管でのＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ粒子の外観の代表的な例。（Ｄ）ヘパリン前処理の有り無しでＮｉ−リポソームおよび続いてＣｙ７標識ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯを受けたマウスの近赤外画像化。Ｏｄｙｓｓｅｙ２ ＮＩＲスキャナ（Ｌｉ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）を用いて、ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ粒子の注射の８時間後に画像を取得した。示す画像は、赤（７００ｎｍチャンネル、体および食物の自己蛍光）および緑（８００ｎｍチャンネル、Ｃｙ７）の２色の合成物である。矢印は腫瘍を指し示し、矢じりは肝臓を示す。ヘパリンで前処置されたマウスでの、腫瘍からのシグナルの大きな低下に注意されたい。３つの中の代表的な実験を示す。 図５は、ＣＲＥＫＡペプチドの腫瘍ホーミングを示す。（Ａ）。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳癌異種移植腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃヌードマウスまたは乳房腫瘍を有するトランスジェニックＭＭＴＶ ＰｙＭＴマウスに、０．１ｍｇのフルオレセイン−ＣＲＥＫＡを静脈内に注射した。動物を注射の２４時間後に灌流によって屠殺し、組織切片を蛍光顕微鏡検査法によって検査した。右パネル、ＭＤＡ−ＭＢ ４３５腫瘍マウスの対照器官。倍率×２００。（Ｂ）。６時間前に３０μｇのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識ＣＲＥＫＡを注射したＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍マウスの動物全身画像化。画像を取得して処理するために、Ｍａｅｓｔｒｏ画像化システム（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を用いた。矢印は腫瘍を指し示し、矢じりは膀胱を指し示す。ペプチドが尿に排出され、肝臓に蓄積しないことに注意されたい。 図６は、フルオレセイン標識ＣＲＥＫＡペプチドに様々なレベルの置換で結合する酸化鉄ナノ粒子（ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ）の蛍光強度を示す。コンジュゲート粒子によって放出される蛍光は、置換のレベルと直線的に関連する。Ａ．Ｕ．＝任意単位。 図７は、ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子が腫瘍組織に蓄積するが、非ＲＥＳ正常組織には蓄積しないことを示す。凝固がＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ蛍光を濃縮した血管だけがその倍率で可視であるので、これらの画像を作製するために低い倍率（×４０）を用いた。腫瘍組織での血餅中にナノ粒子は取り込まれる（矢印）が、非ＲＥＳ正常組織では取り込まれないことに注意されたい。図２のように注射を実施し、分析のための組織を調製した。１０個の中の代表的な実験を示す。 図８は、肝臓でのフィブリン（フィブリノーゲン）染色およびＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの共局在の欠如を示す。フィブリン（フィブリノーゲン）陽性構造はナノ粒子（Ａ）と共局在せず、注射を受けていないマウスからの肝臓は類似したフィブリン（フィブリノーゲン）染色（Ｂ）を示したので、それは肝臓によるフィブリノーゲン生成からのバックグラウンドであるかもしれない。倍率×６００。 図９は、ナノ粒子ホーミングでの血小板の役割を示す。（Ａ）。マウスへの４ｍｇ／ｋｇのＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの注射の５分後に血液を引き抜き、５０μｌのアリコートを磁気カラムに通した。結合したＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ粒子をカラムから溶出させ、スライドの上で濃縮し、抗ＣＤ４１抗体で染色した。粒子の一部は、血小板と関連しているようである。（Ｂ）。血小板除去マウスからの腫瘍におけるＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯホーミングおよび血餅形成を示す低倍率像（×４０）。血小板除去は、記載（Ｖａｎ ｄｅｒ ＨｅｙｄｅおよびＧｒａｍａｇｌｉａ（２００５年））のように、マウスを０．１ｍｇの抗ＣＤ４１モノクローナル抗体で処置することによって達成された。マウスは、図２の凡例に記載のＮｉ−リポソーム／ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯをその後受けた。抗血小板処置は、蛍光血餅の発生率を低下させなかった（図７の腫瘍パネルと比較されたい）。 図１０は、モジュラー型の、多官能性ミセルの構築を示す。（Ａ）個々のリポペプチドモノマーは、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）テール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００）スペーサー、およびＣＲＥＫＡ、ＦＡＭ−ＣＲＥＫＡ、ＦＡＭ、Ｎ−アセチルシステイン、Ｃｙ７またはヒルログのいずれかを含有する可変極性の頭基で構成される。モノマーを組み合わせて様々な混合ミセルを形成した。（Ｂ）ＦＡＭ−ＣＲＥＫＡ／Ｃｙ７／ヒルログ混合ミセルの三次元構造。 図１１は、アテローム硬化症マウスの大動脈樹のｅｘ ｖｉｖｏの画像化を示す。ミセルを静脈内に注射し、３時間循環させた。灌流の後大動脈樹を切り取り、ｅｘ ｖｉｖｏで画像化した。（Ａ）ＦＡＭ−ＣＲＥＫＡ標的化ミセルによる注射の後にＡｐｏＥヌルマウスの大動脈樹で蛍光の増大が観察されたが、非標的化蛍光ミセルでは観察されなかった。過剰の非標識ＣＲＥＫＡミセルをＦＡＭーＣＲＥＫＡミセルの前に注射したとき、大動脈樹での蛍光は減少した。過剰の非標的化、非標識ミセルの事前注射は、蛍光の有意な減少を引き起こさなかった。（Ｂ）蛍光ピクセルの強度を測ることによって、大動脈樹での蛍光を定量化した（群につきｎ＝３）。 図１２は、アテローム硬化性プラークでのＣＲＥＫＡミセルの局在化を示す。（Ａ）連続薄片（厚さ５μｍ）を、ＣＤ３１（内皮細胞）に対する抗体、ＣＤ６８（マクロファージに対する抗体および他のリンパ球）およびフィブリノーゲンに対する抗体で染色した。アテローム硬化性プラークでのミセルナノ粒子の局在化を例示するために、代表的な顕微鏡視野を示す。ミセルはプラークの表面全体に結合し、血管の健康な部分への明らかな結合はない。ＣＲＥＫＡ標的化ミセルは、重い炎症（ＣＤ６８染色）があり、プラークが破裂しやすいプラークの肩（挿入図）の内皮層（ＣＤ３１染色）の下にも透過する。凝固血漿タンパク質はプラーク全体で、およびその表面で見られる（フィブリノーゲン染色）。左パネルの画像は１０倍率でとり（バー＝２００μｍ）、右パネルの画像は１５０倍率でとった（バー＝２０μｍ）。（Ｂ）蛍光は心臓でも肺でも観察されず、少量だけが腎臓、脾臓および肝臓で見られた。画像は、２０倍率でとった（バー＝１００μｍ）。 図１３は、アテローム硬化性プラークへのヒルログの特異的標的化を示す。（Ａ）ヒルログがミセル形のときに効力が低下しないことを確実にするために、等モル濃度のヒルログペプチドおよびヒルログミセルを抗トロンビン活性について試験した。ヒルログのペプチドおよびミセルは、発色性アッセイで類似した活性を示した。（Ｂ）ＣＲＥＫＡ標的化または非標的化のヒルログ混合ミセルをマウスに静脈内注射し、３時間循環させた。大動脈樹を切り取り、結合したヒルログについて分析した。ＡｐｏＥヌルマウスの大動脈樹で、ＣＲＥＫＡ標的化ヒルログミセルの注射の後に非標的化ミセルよりも有意に高いレベルの抗トロンビン活性が観察された（組織１ｍｇにつき１．８μｇおよび１．２μｇ、ｐ≦０．０５、１群につきｎ＝３）。ＡｐｏＥヌルマウスでＣＲＥＫＡ標的化ヒルログミセルによって生成された抗トロンビン活性は、野生型マウスでのそれよりも同様に有意に高かった（組織１ｍｇにつき０．８μｇ、ｐ≦０．０５、１群につきｎ＝３）。 図１４は、アテローム硬化性プラークに対する特異的標的化ミセルを示す。ＡｐｏＥヌルおよび野生型マウスに、ＦＡＭ−ＣＲＥＫＡミセルを静脈内注射し、それを３時間循環させた。（Ａ、Ｃ）灌流の後大動脈樹を切り取り、ｅｘ ｖｉｖｏで画像化した。（Ｂ、Ｄ）組織学的薄片を、血管壁へのミセルの結合についても分析した。ｅｘ ｖｉｖｏ画像化で、（Ａ）野生型マウスと比較して（Ｃ）ＡｐｏＥマウスでより高い蛍光強度が観察された。蛍光ＣＲＥＫＡミセルは（Ｂ）野生型マウスの組織学的切片において健康な血管に結合しなかったが、（Ｄ）ＡｐｏＥヌルマウスのアテローム硬化性病変の表面で観察された。組織学的画像は、１０倍率でとられた（バー＝２００μｍ）。 図１５は、ＣＲＥＫＡミセルの結合での凝固の役割を示す。（Ａ）マウスにＰＢＳまたは８００単位／ｋｇのヘパリンのボーラスを静脈内注射し、続いて１００μｌの１ｍＭ ＦＡＭ−ＣＲＥＫＡミセルを６０分後に注射した。実験全体で、マウスは、さらなるヘパリン（合計１０００単位／ｋｇ）またはＰＢＳを受けた。ＰＢＳまたはヘパリンの事前注射および続いてＦＡＭ−ＣＲＥＫＡミセルの注射を受けたＡｐｏＥヌルマウスの大動脈樹で、類似した蛍光が観察された。（Ｂ）ＣＲＥＫＡミセルは、２２ＲＶ１マウス前立腺腫瘍モデルで凝固を誘導しなかった。厚さ５μｍの切片は、フィブリノーゲンに対する抗体で染色した。ＦＡＭ−ＣＲＥＫＡミセルは腫瘍中の血管に結合するが、フィブリン凝塊を形成させないことを示すために、代表的な顕微鏡視野を示す。画像は、４０倍率（バー＝５０μｍ）でとられた。 図１６は、両親媒性分子を用いてリポソームを生成するための表面ベースの方法の例示である。
開示される方法および組成物は、特定の実施形態の詳細な説明およびそこに含まれる実施例および図およびそれらの前後の説明の参照によってより容易に理解することができる。
本化合物、組成物、物品、装置および／または方法が開示および記載される前に、特に明記されない限りそれらが特定の合成方法もしくは特定の組換え生物工学方法に限定されず、または特に明記されない限りそれらが特定の試薬に限定されず、このように当然ながらそれらは変更可能であることを理解すべきである。本明細書で用いられる用語は特定の実施形態を記載することだけが目的であり、限定するものではないことも理解されたい。
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられるように、内容が明らかに別途指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には複数形が含まれる。したがって、例えば、「薬学的なキャリア」への言及には、２つ以上のそのようなキャリアの混合物が含まれる、などである。
本明細書で、範囲は、「およその」１つの特定の値から、および／または「およその」別の特定の値までとして表すことができる。そのような範囲が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約」の使用によって値が近似値で表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されよう。範囲の各々のエンドポイントは、他のエンドポイントに対して、および他のエンドポイントと独立して有意であることがさらに理解されよう。本明細書で開示されるいくつかの値があり、各値も本明細書でその値自体に加えて「およその」その特定の値として開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」も開示される。当業者によって適切に理解されるように、ある値が開示される場合、その値「以下」、「その値以上」および値の間の可能な範囲も開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０以下」ならびに「１０以上」も開示される。本出願全体で、データは異なるいくつかのフォーマットで提供され、このデータはエンドポイントおよび出発点を表し、データポイントの任意の組合せのために変動することも理解される。例えば、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント１５が開示される場合、１０および１５を超える、それ以上、それ未満、それ以下、およびそれと同等、ならびに１０から１５の間も開示されるとみなされると理解される。２つの特定の単位間の各単位も開示されることも理解される。例えば、１０および１５が開示される場合、１１、１２、１３および１４も開示される。
この明細書および後に続く特許請求の範囲では、以下の意味を有すると定義されるいくつかの用語が参照される：
「任意選択の」または「任意選択で」は、その後に記載される事象または状況が起きても起きなくともよいこと、およびその記載が前記事象または状況が起きる例および起きない例を含むことを意味する。
本出願全体で、様々な刊行物が参照される。本出願が関係する技術水準をより完全に記載するために、これらの刊行物の開示は、ここにその全体が参照により本出願に組み込まれる。開示される参照は、参照が依存される文で議論されるそれらに含まれる材料のためにも、参照により本明細書に個々におよび具体的に組み込まれる。
開示される方法および組成物は、特に明記されない限り特定の合成方法、特定の分析手法、または特定の試薬に限定されず、このように変更することができることを理解すべきである。本明細書で用いられる用語は特定の実施形態を記載することだけが目的であり、限定するものではないことも理解されたい。
材料
本明細書で開示される方法で用いるための、開示される組成物を調製するために用いられる構成成分、ならびに組成物自体が開示される。これらおよび他の材料が本明細書で開示され、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群などが開示される場合、これらの化合物の各様々な個々のおよび集合的な組合せおよび順列の具体的な参照が明示的に開示されていないかもしれないが、各々は本明細書で具体的に企図および記載されることが理解される。例えば、特定のペプチドが開示、議論され、ペプチドを含むいくつかの分子に加えることができるいくつかの改変が議論される場合、それとは反対に具体的に示されていない限り可能であるペプチドおよび改変のあらゆる組合せおよび順列が具体的に企図される。したがって、分子Ａ、ＢおよびＣのクラスに加えて分子Ｄ、ＥおよびＦのクラスが開示され、組合せ分子の例、Ａ−Ｄが開示される場合には、各々が個々に挙げられない場合でも、各々は個々におよび集合的に企図され、組合せＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−ＥおよびＣ−Ｆが開示されるとみなされることを意味する。同様に、これらの任意のサブセットまたは組合せも開示される。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−ＦおよびＣ−Ｅのサブグループは、開示されるとみなされる。この概念は、それらに限定されないが、開示される組成物を作製、使用する方法でのステップを含む、本出願の全ての態様に適用される。したがって、実施することができる様々なさらなるステップがある場合、これらのさらなるステップの各々は開示される方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組合せで実施することができるものと理解される。
両親媒性分子を含む組成物が開示され、両親媒性分子の少なくとも１つは血餅結合頭基を含み、血餅結合頭基は凝固血漿タンパク質に選択的に結合し、ここで、この組成物は凝固を引き起こさない。
両親媒性分子を含む組成物を被験体に投与するステップを含む方法も開示され、両親媒性分子の少なくとも１つは血餅結合頭基を含み、血餅結合頭基は凝固血漿タンパク質に選択的に結合し、組成物は凝固を引き起こさず、ここで、この組成物は被験体の中の凝固血漿タンパク質に結合する。開示される組成物の１つまたは複数を被験体に投与するステップを含む方法も開示され、組成物は被験体の中の凝固血漿タンパク質に結合する。
両親媒性分子を混合するステップを含む組成物を作製する方法も開示され、両親媒性分子の少なくとも１つは血餅結合頭基を含み、血餅結合頭基は凝固血漿タンパク質に選択的に結合し、組成物は凝固を引き起こさない。両親媒性分子を混合するステップを含む組成物を作製する方法も開示され、両親媒性分子の少なくとも１つは開示される血餅結合頭基の１つまたは複数を含む。
両親媒性分子は、機能的頭基を含むことができる。両親媒性分子の少なくとも１つは、機能的頭基を含むことができる。機能的頭基は、検出頭基であってよい。機能的頭基は、処置頭基であってよい。両親媒性分子の少なくとも１つは検出頭基を含むことができ、両親媒性分子の少なくとも１つは処置頭基を含むことができる。
両親媒性分子は、親水性媒体にさらされてもよい。両親媒性分子は、親水性媒体中で凝集体を形成することができる。凝集体は、ミセルを含むことができる。
血餅結合頭基は、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）またはその保存的な改変体を含むアミノ酸セグメント、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含むアミノ酸セグメント、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなるアミノ酸セグメント、アミノ酸配列ＲＥＫからなるアミノ酸セグメント、またはそれらの組合せより独立して選択されるアミノ酸セグメントを含むことができる。アミノ酸セグメントは、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）またはその保存的な改変体を各々独立して含むことができる。アミノ酸セグメントは、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を各々独立して含むことができる。アミノ酸セグメントの少なくとも１つは、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなることができる。アミノ酸セグメントの少なくとも１つは、アミノ酸配列ＲＥＫからなることができる。
血餅結合頭基は、例えば、アミノ酸配列ＲＥＫを含むアミノ酸セグメント、フィブリン結合ペプチド、血餅に結合するがフィブリンに結合しないペプチド（例えばＣＧＬＩＩＱＫＮＥＣ（ＣＬＴ１、配列番号２）およびＣＮＡＧＥＳＳＫＮＣ（ＣＬＴ２、配列番号３））、血餅結合抗体および血餅結合小有機分子から各々独立して選択することができる。
両親媒性分子は検出可能であってよい。両親媒性分子は、蛍光、ＰＥＴまたはＭＲＩによって検出可能であってよい。両親媒性分子は、蛍光によって検出可能であってよい。検出頭基は、ＦＡＭまたはその誘導体を含むことができる。
処置頭基は、心血管疾患を処置するための化合物または組成物を含むことができる。処置頭基は、アテローム硬化症を処置するための化合物または組成物を含むことができる。処置頭基は、トロンビンの直接的な阻害剤を含むことができる。処置頭基は、ヒルログまたはその誘導体を含む。処置頭基は、癌を処置するための化合物または組成物を含むことができる。ミセルは、両親媒性分子を含むことができる。組成物は、両親媒性分子を含むリポソームを含むことができる。
開示される組成物のいずれかと、被験体の中のプラークとのコンジュゲートも開示される。開示される組成物のいずれかと、被験体の中の腫瘍とのコンジュゲートも開示される。
被験体は、凝固血漿タンパク質に関連するおよび／またはそれを生じる疾患または状態の処置を必要とするものであってよい。被験体は、心血管疾患の処置を必要とするものであってよい。被験体は、凝固血漿タンパク質に関連するおよび／またはそれを生じる疾患または状態の検出、視覚化またはその両方を必要とするものであってよい。被験体は、心血管疾患の検出、視覚化またはその両方を必要とするものであってよい。被験体は、癌、腫瘍またはその両方の検出、視覚化またはその両方を必要とするものであってよい。被験体は、癌の処置を必要とするものであってよい。「凝固血漿タンパク質と関連する疾患または状態」は、凝固血漿タンパク質の生成および／または形成を引き起こすか、血餅の生成および／または形成を引き起こすか、アテローム硬化性プラークの生成および／または形成を引き起こすか、症状として凝固血漿タンパク質を有するか、症状として血餅（ｂｌｏｔ ｃｌｏｔ）を有するか、症状としてアテローム硬化性プラークを有するか、凝固血漿タンパク質に起因するか、血餅に起因するか、アテローム硬化性プラークに起因するか、凝固血漿タンパク質を特徴とするか、血餅を特徴とするか、アテローム硬化性プラークを特徴とするか、その症状は凝固血漿タンパク質によって悪化するか、その症状は血餅によって悪化するか、その症状はアテローム硬化性プラークによって悪化するか、あるいはそれらを組合せたものである疾患または状態を意味する。
組成物を投与するステップは、凝固血漿タンパク質に関連するおよび／またはそれを生じる疾患または状態を処置することができる。組成物を投与するステップは、心血管疾患を処置することができる。心血管疾患は、アテローム硬化症であってよい。組成物を投与するステップは、癌を処置することができる。方法は、凝固血漿タンパク質に関連するおよび／またはそれを生じる疾患または状態を検出するステップ、視覚化するステップ、またはその両方をさらに含むことができる。方法は、心血管疾患を検出するステップ、視覚化するステップ、またはその両方をさらに含むことができる。方法は、癌、腫瘍またはその両方を検出するステップ、視覚化するステップ、またはその両方をさらに含むことができる。
方法は、投与するステップの前に、親水性媒体に両親媒性分子をさらすステップをさらに含むことができる。両親媒性分子は、親水性媒体中で凝集体を形成することができる。凝集体は、ミセルを含むことができる。方法は、投与するステップの後に、両親媒性分子を検出するステップをさらに含むことができる。両親媒性分子は、蛍光、ＣＴスキャン、ＰＥＴまたはＭＲＩによって検出可能である。両親媒性分子は、蛍光によって検出可能である。組成物は、被験体の中のプラークとコンジュゲートすることができる。組成物は、被験体の中の腫瘍とコンジュゲートすることができる。
両親媒性分子および血餅結合頭基を含む組成物が本明細書で開示される。血餅結合頭基は、凝固血漿タンパク質に選択的に結合することができる。一部の形では、組成物は凝固を引き起こさないし、強化もしない。
細胞の上でまたは凝固血液タンパク質中で、特異的または優先的に発現され、局在化され、吸着されまたは誘導可能であるいくつかの適当な血餅結合頭基が同定されている。これらは、さらに詳細に下で議論される。
Ａ．両親媒性分子
両親媒性物質または両性分子とも呼ばれる両親媒性分子は、水性環境にあるとき、単層、小胞、ミセル、二重層、リポソームなどを形成することができる任意の物質である。両親媒性分子は両親媒性であり、１つまたは複数の疎水性基および１つまたは複数の親水性基を含む。疎水性基は両親媒性分子のテールと呼ぶことができ、親水性基は両親媒性分子の頭部と呼ぶことができる。有用な両親媒性分子には、界面活性剤、脂肪酸、脂質、ステロール、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド（脂肪）、リン脂質、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、糖脂質、ポリケチド、ブロックコポリマー、およびそれらの組合せなどが含まれる。開示される両親媒性分子はイオン性、アニオン性、カチオン性、両性イオン性、および非イオン性であってよい。
用語両親媒性分子は、限定するものではない。詳細には、開示される両親媒性分子は、単一分子で構成される物質、化合物、組成物、粒子または他の材料に限定されない。むしろ、開示される両親媒性分子は、開示される組成物および方法と一緒におよびそこで用いることができる、両親媒性である任意の物質（複数可）、化合物（複数可）、組成物（複数可）、粒子（複数可）および／または他の材料（複数可）であってよい。
両性分子は、溶質、特に水へのそれらの親和性が異なる２つの異なる構成成分を有する。極性の溶質である水への親和性を有する分子の一部は、親水性と言われる。炭化水素などの非極性の溶質への親和性を有する分子の一部は、疎水性と言われる。両性分子を水に入れると、親水性の部分は水と相互作用しようとし、疎水性の部分は水を避けようとする。これを達成するために、親水性の部分は水中にとどまり、疎水性の部分は水面より上の空中に、または水上に浮かぶ無極性、非混和性の液体に保持される。水面のこの分子層の存在は、表面での凝集エネルギーを破壊し、表面張力を低下させる。この作用を有する両性分子は、両親媒性物質として知られる。限られた数の両親媒性物質だけが、上記のような水／空気または水／炭化水素界面に整列することができる。適する両親媒性物質の様々な例が、本明細書で記載、開示される。
１．脂質
脂質は、合成されたまたは天然に存在する分子であってよく、それには脂肪、ろう、ステロール、プレノール脂質、脂溶性ビタミン（ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫなど）、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、リン脂質、脂肪酸モノグリセリド、糖脂質およびその他が含まれる。脂質は、疎水性または両親媒性の小分子であってよい。一部の脂質の両親媒性の性質は、それらが適当な環境、すなわち水性環境で単層、小胞、ミセル、リポソーム、二重層または膜などの構造を形成することを可能にする。両親媒性脂質、中性脂質、カチオン性脂質およびアニオン性脂質を含むいくつかの脂質のいずれかを、両親媒性分子として用いることができる。そのような脂質は、単独でまたは併用で用いることができ、また、二重層安定化構成成分、例えばポリアミドオリゴマー（例えばＡｎｓｅｌｌによる米国特許第６，３２０，０１７号、「ポリアミドオリゴマー」を参照）、ペプチド、タンパク質、界面活性剤、脂質誘導体、例えばホスファチジルエタノールアミンに結合したＰＥＧおよびセラミドとコンジュゲートしたＰＥＧを含むこともできる（米国特許第５，８８５，６１３号を参照）。好ましい実施形態では、宿主免疫系によるリポソームの排除を低減する被覆剤（ｃｌｏａｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、例えばポリアミド−オリゴマーコンジュゲート、例えばＡＴＴＡ脂質（１９９８年２月２日に出願された米国特許出願第０８／９９６７８３号を参照）およびＰＥＧ−脂質コンジュゲート（米国特許第５，８２０，８７３号、５，５３４，４９９号および５，８８５，６１３号を参照）が含まれてもよい。
ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ケファリン、コレステロール、セレブロシドおよびジアシルグリセロールを含む、生理的ｐＨで無荷電または中性の両性イオン形で存在するいくつかの脂質種のいずれかを指す、いくつかの中性脂質のいずれかが含まれてもよい。
生理的ｐＨで正味の正電荷を運ぶカチオン脂質を、両親媒性分子として容易に用いることができる。それらに限定されないがそのような脂質には、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ−Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）；３ベータ−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アンモニウムトリフルオロアセテート（「ＤＯＳＰＡ」）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（「ＤＯＧＳ」）、１，２−ジレオイル（ｄｉｌｅｏｙｌ）−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（「ＤＯＤＡＰ」）およびＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）が含まれる。さらに、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能）およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（エタノール中ＤＯＧＳを含む、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から）などのカチオン脂質のいくつかの市販調製物を用いることができる。
アニオン性脂質を両親媒性分子として用いることができ、例には、それらに限定されないが、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロールおよび中性脂質に連結される他のアニオン性改変基が含まれる。
両親媒性脂質も、適する両親媒性分子の可能性がある。「両親媒性脂質」は、脂質材料の疎水性部分は疎水性の相を指向し、親水性部分は水相を指向する、任意の適する材料を指す。そのような化合物には、脂肪酸、リン脂質、アミノ脂質およびスフィンゴ脂質が含まれるが、これらに限定されない。代表的なリン脂質には、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンまたはジリノレオイルホスファチジルコリンが含まれる。他の無リン化合物、例えばスフィンゴ脂質、グリコスフィンゴリピドファミリー、ジアシルグリセロールおよびβ−アシルオキシ酸を用いることもできる。さらに、そのような両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールなどの他の脂質と容易に混合することができる。両性イオン性脂質は、両親媒性脂質の１つの形である。
スフィンゴ脂質は、脂肪族アミノアルコールスフィンゴシンとコンジュゲートした脂肪酸である。脂肪酸は、アミド結合を経てスフィンゴシンに共有結合させることができる。前記の任意のアミノ酸をスフィンゴシンに共有結合させて、スフィンゴ脂質を形成することができる。スフィンゴ脂質は、α−ヒドロキシル基を通した共有結合によってさらに改変することができる。改変は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、芳香族基、複素環式芳香族基、シクリル基、ヘテロシクリル基、ホスホン酸基を含むことができる。スフィンゴ脂質の非限定例は、Ｎ−アシルスフィンゴシン、Ｎ−アシルスフィンゴミエリン、フォルスマン抗原である。
糖脂質は、脂肪酸および糖の両方を含有する化合物である。脂肪酸は、糖骨格に共有結合する。糖骨格は、１つまたは複数の糖を含むことができる。脂肪酸は、アミドまたはエステル結合を通して糖に結合することができる。糖は、任意の糖の基部（ｓｕｇａｒ ｂａｓｅ）であってよい。脂肪酸は、本明細書のほかで記載される任意の脂肪酸であってよい。提供される組成物は、天然または合成の糖脂質を含むことができる。非限定糖脂質は、ＵＤＰ−３−Ｏ−（β−ヒドロキシミリストイル）−ＧｌｃＮＡｃ、脂質ＩＶ Ａ、Ｋｄｏ２−脂質Ａである。
ｉ．脂肪酸
脂肪酸は、動物または植物の脂肪、油またはろうに由来するか、それらにエステル型で含有される脂肪族モノカルボン酸である。脂肪酸は合成または天然であってよい。天然の脂肪酸は炭素数４から２８の鎖（通常非分枝状および偶数）を一般に有し、それは飽和または不飽和であってよい。「脂肪酸」は、全ての非環式脂肪族カルボン酸を含むために用いられる。
提供される組成物とコンジュゲートさせることができる脂肪酸には、リポソームへのプロタンパク質コンバターゼ阻害剤の効率的な組込みを可能にするものが含まれる。一般に、脂肪酸は極性の脂質である。脂肪酸は、遊離脂肪酸（パルミチン酸またはパルミトレイン酸が例である）であってよい。組成物は、天然または合成の脂肪酸を含むことができる。脂肪酸は分枝状または非分枝状、および飽和または不飽和であってよい。脂肪酸の非限定例は、酪酸、吉草酸、カプロン酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、マルガリン（ダチュリン）酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、カルボセリン酸、モンタン酸、メリシン酸、ラッセロイン酸（ｌａｃｃｅｒｏｉｃ ａｃｉｄ）、セロメリシン（サイリン）酸、ゲディン酸（ｇｅｄｄｉｃ ａｃｉｄ）、セロプラスチン酸（ｃｅｒｏｐｌａｓｔｉｃ ａｃｉｄ）、カプロレイン酸（ｃａｐｒｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ラウロレイン酸（ｌａｕｒｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、リンデリン酸（ｌｉｎｄｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、ミリストレイン酸、フィゼテリン酸（ｐｈｙｓｅｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、ツズ酸（ｔｓｕｚｕｉｃ ａｃｉｄ）、パルミトレイン酸、サピエン酸（ｓａｐｉｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、ペトロセリン酸（ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、オレイン酸、エライジン酸、バクセン（アスクレピン）酸、ガドレイン酸、ゴンドイン酸（ｇｏｎｄｏｉｃ ａｃｉｄ）、セトレイン酸（ｃｅｔｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、α−リノレン酸、ステアリクドン酸（ｓｔｅａｒｉｃｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＥＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡ、ニシン酸（ｎｉｓｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、ミード酸（ｍｅａｄ ａｃｉｄ）である。これらの脂肪酸のこれらのテールは、例えばアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、芳香族基、複素環式芳香族基、シクリル基、ヘテロシクリル基、ヒドロキシル基、ケト基、酸性基、アミン基、アミド基、リン基または硫黄基を含むように改変することもできる。
脂肪酸は、グリセロールとコンジュゲートさせることができる。１つ、２つまたは３つの脂肪酸を、グリコール分子とコンジュゲートさせることができる。
モノグリセリドまたはモノアシルグリセロールは、エステル結合を通してグリセロール分子に共有結合した１つの脂肪酸鎖からなる。グリセロール部分の上のエステル結合の位置に従い、モノアシルグリセロールは１−モノアシルグリセロールまたは２−モノアシルグリセロールであってよい。モノアシルグリセロールは、上記の脂肪酸のいずれかを１−モノアシルグリセロールまたは２−モノアシルグリセロールとして含有することができる。
ジグリセリドまたはジアシルグリセロールは、エステル結合を通してグリセロール分子に共有結合した２つの脂肪酸鎖からなるグリセリドである。ジアシルグリセロールは、Ｃ−１およびＣ−２位の両方に上記の脂肪酸の任意の組合せを有することができる。１つの例は１−パルミトイル−２−オレオイル−グリセロールであり、それはパルミチン酸およびオレイン酸に由来する側鎖を含有する。
トリグリセリドまたはトリアシルグリセロールは、グリセロールがエステル結合を通して３つの脂肪酸に共有結合しているグリセリドである。トリグリセリドは、上記の脂肪酸の任意の組合せを任意の順序で含有することができる。１つの例は、グリセロールがパルミチン酸、オレイン酸およびステアリン酸にその順序で結合している場合である。
脂肪酸は、別の部分、すなわちリン脂質またはスフィンゴ脂質とコンジュゲートすることができる。脂肪酸は、ホスホン酸、すなわちリン脂質とコンジュゲートすることができる。リン脂質は、スフィンゴ脂質またはホスホグリセリドであってよい。ホスホグリセリドは、グリセロールに基づくリン脂質である。例えば、ジグリセリドはグリセロールを通してホスホン酸とさらにコンジュゲートする、すなわちグリセロリン脂質である。したがって、脂肪酸は他の極性基とコンジュゲートし、脂質、すなわちリン脂質を形成することができる。リン脂質は、水に溶解性または混和性のリン脂質であってよい。非限定例は、グリセロリン酸塩、グリセロホスフホリルコリン、ホスホリルコリン、グリセロホスホリルエタノールアミン、ホスホリルエタノールアミン、エタノールアミン、グリセロホスホリルセリンおよびグリセロホスホスホリルグリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）である。提供される組成物は、天然または合成のリン脂質を含むことができる。リン脂質は、飽和または不飽和の一または二基置換の脂肪酸およびその組合せを含有するリン脂質から選択することができる。これらのリン脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルセリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジン酸、パルミテライドイルオレオイルホスファチジルコリン、パルミテライドイルオレオイルホスファチジルセリン、パルミテライドイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミテライドイルオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミテライドイルオレオイルホスファチジン酸、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルコリン、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルセリン、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルグリセロール、ミリストレオイルオレオイルホスファチジン酸、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルセリン、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノレオイルホスファチジン酸、パルミチクリノレオイルホスファチジルコリン、パルミチクリノレオイルホスファチジルセリン、パルミチクリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミチクリノレオイルホスファチジルグリセロール、パルミチクリノレオイルホスファチジン酸であってよい。これらのリン脂質は、ホスファチジルコリン（リゾホスファチジリジルコリン）、ホスファチジルセリン（リゾホスファチジルセリン）、ホスファチジルエタノールアミン（リゾホスファチジルエタノールアミン）、ホスファチジルグリセロール（リゾホスファチジルグリセロール）およびホスファチジン酸（リゾホスファチジン酸）のモノアシル化誘導体であってもよい。これらのリゾホスファチジル誘導体のモノアシル鎖は、パルミトイル、オレオイル、パルミトレオイル、リノレオイルミリストイルまたはミリストレオイルであってよい。リン脂質は、合成であってもよい。合成リン脂質は、ＡＶＡＮＴＩ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌｂａｓｔｅｒ、Ａｌａ．）、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）などの様々な供給源から商品として容易に入手できる。これらの合成化合物は変更されてもよく、天然に存在するリン脂質では見られない変異をそれらの脂肪酸側鎖に有することができる。脂肪酸はＣ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０の鎖長の不飽和脂肪酸側鎖を、ＰＳまたはＰＣの一方または両方に有することができる。合成リン脂質は、成分として、ジオレオイル（１８：１）−ＰＳ；パルミトイル（１６：０）−オレオイル（１８：１）−ＰＳ、ジミリストイル（１４：０）−ＰＳ；ジパルミトレオイル（１６：１）−ＰＣ、ジパルミトイル（１６：０）−ＰＣ、ジオレオイル（１８：１）−ＰＣ、パルミトイル（１６：０）−オレオイル（１８：１）−ＰＣおよびミリストイル（１４：０）−オレオイル（１８：１）−ＰＣを有することができる。したがって、一例として、提供される組成物は、パルミトイル１６：０を含むことができる。
ｉｉ．プレノール
プレノール脂質は、主にメバロン酸（ＭＶＡ）経路を通して生成される５炭素前駆体イソペンテニルジホスフェートおよびジメチルアリルジホスフェートから自然に合成される。プレノールは、合成的に作製することもできる。単純イソプレノイド（線形アルコール、ジホスフェートなど）は、Ｃ５単位の連続付加によって形成され、これらのテルペン単位の数によって分類される。４０個を超える炭素を含む構造は、ポリテルペンとして公知である。カロチノイドは、抗酸化剤としておよびビタミンＡ前駆体として機能する重要な単純イソプレノイドである。酸素に結合する末端のイソプレノイド単位が不飽和のままであるポリプレノール（バクトプレノールと呼ばれる）を原核生物は合成するが、動物ポリプレノール（ドリコール）では、末端のイソプレノイドは還元される。プレノールの非限定例は、ネロール、カタルポール、メントール、ネオメントール、ペリリルアルコール、カルバクロールである。
ｉｉｉ．ステロール
ステロールは、脂質である。ステロールは、改変することができる４環式のステラン構造を有する。ステロールは、ステラン構造に１つまたは複数のヒドロキシル基を含有する。１つのヒドロキシル基は、ステラン構造の３位にあってよい。ステロールは、１つまたは複数の水素原子を様々な官能基に置換することによってさらに改変されてもよい。官能基には、それらに限定されないが、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、芳香族基、複素環式芳香族基、シクリル基、ヘテロシクリル基、ヒドロキシル基、ケト基、酸性基、アミン基、アミド基、リン基または硫黄基が含まれる。ステロールは、天然または合成であってよい。ステロールの非限定例は、コレステロール、フィトステロール、エルゴステロール、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、スピノステロール、タラキサステロール、ブラシカステロール、デスモステロール、カリノステロール、ポリフェラステロールおよびクリオナステロールである。
ｉｖ．ポリケチド
ポリケチドは、大きな、構造的に多様なファミリーの化合物である。ポリケチドは、抗生物質的および薬理学的特性を含む広範囲の生物学的な活性を有する。例えば、ポリケチドは、テトラサイクリンおよびエリスロマイシンのような抗生物質、ダウノマイシンを含む抗癌剤、免疫抑制薬、例えばＦＫ５０６およびラパマイシン、ならびにモネンシンおよびアベルメクチンなどの獣医科製品によって代表される。ポリケチドは生物体のほとんどの群に存在し、様々なポリケチドを産生する菌糸状細菌群、放線菌類で特に豊富である。ポリケチドの非限定例は、トリコスタチン、タウトマイセチン、ラウレネニンＡ、タイロシン、スピラマイシンである。
２．ブロックコポリマー
ブロックコポリマーは、例えば、ホモポリマーブロック、コポリマーブロック（例えば、ランダムコポリマーブロック、統計コポリマーブロック（ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｂｌｏｃｋ）、勾配コポリマーブロック（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｂｌｏｃｋ）、周期コポリマーブロック（ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｂｌｏｃｋ））、ならびにホモポリマーおよびコポリマーブロックの組合せから選択される２つ以上の異なるポリマーを含有するコポリマーである。ポリマー「ブロック」は、単一型（ホモポリマーブロック）または多重型（コポリマーブロック）の構成単位の複数のコピーの群化を指す。「鎖」は、非分枝状ポリマーブロックである。ポリマーブロックは、単一の型または多重型の構成単位の少なくとも２つ（例えば、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０個）および／または多くとも１０００個（例えば、多くとも７５０、多くとも５００、多くとも２５０、多くとも１００、多くとも５０、多くとも２０、多くとも１０、多くとも５個）のコピーの群化であってよい。ポリマーブロックは、いくつかの異なる構造のいずれかをとることができる。
Ｘ−（ＡＢ）ｎ構造は、ジブロックコポリマー（ｎ＝１の場合）またはトリブロックコポリマー（ｎ＝２の場合）としばしば呼ばれる。（この用語は開始剤の存在を無視し、例えばＡ−Ｘ−Ａを単一のＡブロックとして扱い、したがってトリブロックはＢＡＢと表される）。ｎが３以上の場合、これらの構造は星状ブロックコポリマーと一般に呼ばれる。
セグメントＡおよびＢは、非加水分解性（ｎｏｎ−ｈｙｄｒｏｌｙｚａｂｌｅ）の結合を通して連結される。非加水分解性結合とは、例えば約６から約８のｐＨで、通常の水性または溶媒性加水分解反応によってわずかに切断される共有結合である。非加水分解性である特異的な結合は、当業者に公知であり、アミド、エステル、およびエーテルなどが含まれる。
両親媒性セグメントコポリマーでのセグメントＡおよびＢ間の非加水分解性結合は、親水性モノマー単位のブロックが疎水性の高分子開始剤の官能基化の部位から成長するように、最適に官能基化された疎水性の高分子開始剤の存在下で適する親水性モノマーを重合させることによって形成することができる。適する高分子開始剤には、熱的または光化学的に活性化が可能なラジカル開始基が含まれる。開始基は、疎水性高分子開始剤の末端基と第一の親水性モノマーとの間の共有結合性非加水分解性結合を提供する方法で疎水性の高分子開始剤に連結され、両親媒性ブロックコポリマーを調製するための共重合の間に成長するセグメントを形成する。
例えば、第一の親水性セグメントＡを予め形成された疎水性セグメントＢの上で増殖させ、次に親水性セグメントＡ’を前に調製されたセグメントＡの末端に結合させるように、共重合の間にモノマーを変更することも可能である。同様に、２つ以上の親水性モノマーを同時に用いることにより、親水性セグメントＡＡ’を予め形成された疎水性セグメントＢの上で増殖させることができる。
したがって、一実施形態では、両親媒性ブロックコポリマーは、１つの親水性セグメントＡおよび１つの疎水性セグメントＢ（Ａ−Ｂ型、ジブロック）から、または１つの疎水性セグメントＢおよびその末端に結合する２つの親水性セグメントＡ（Ａ−Ｂ−Ａ型、トリブロック）からなることができる。別の実施形態では、両親媒性ブロックコポリマーは、２つ以上の親水性モノマーから作製される１つの親水性セグメントＡＡ’および１つの疎水性セグメントＢ（ＡＡ’−Ｂ型、ジブロック）から、または１つの疎水性セグメントＢおよびその末端に結合する２つの親水性セグメントＡＡ’（ＡＡ’−Ｂ−ＡＡ’、トリブロック）からなることができる。
さらに、両親媒性ブロックコポリマーは、実質的に非重合性である。本明細書で用いるように、実質的に非重合性とは、両親媒性ブロックコポリマーが他の重合性構成成分と重合される場合、両親媒性ブロックコポリマーはヒドロゲルへの有意な共有結合形成なしでヒドロゲル製剤に組み込まれることを意味する。有意な共有結合形成の不在とは、軽微な程度の共有結合形成が存在するかもしれないが、それはヒドロゲルマトリックス中での両親媒性ブロックコポリマーの保持に付随することを意味する。いかなる付随的な共有結合形成が存在することがあるとしても、それはヒドロゲルマトリックス中で両親媒性ブロックコポリマーを保持するのにそれ自体では十分でない。代わりに、両親媒性ブロックコポリマーをヒドロゲルと結合させておく非常に支配的な作用は、捕捉（ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ）である。この明細書によると、両親媒性ブロックコポリマーは、それがヒドロゲルマトリックス中に物理的に保持されるときに「捕捉される」。これは、ヒドロゲルポリマーマトリックスの中での両親媒性ブロックコポリマーのポリマー鎖の絡み合いを通して実行される。しかし、ファンデルワールス力、双極子相互作用、静電引力および水素結合も、より少ない程度でこの捕捉に寄与することができる。
出発疎水性セグメントＢの上に共重合される１つまたは複数のセグメントＡまたはＡＡ’の長さは、共重合のために加えられる親水性モノマーの量を制御することによって容易に制御することができる。この方法で、セグメントのサイズおよびそれらの比を容易に制御することができる。親水性モノマーの重合が完了後、生じる両親媒性ブロックコポリマーは、シリコーンヒドロゲル製剤への組込みの際に前記両親媒性コポリマーが硬化シリコーンヒドロゲルの湿潤性を向上させるのに十分な重量平均分子量を有する。
適するポリシロキサン含有ブロックは、１つまたは複数の反応基を有するシリコーン化合物から形成することができる。そのようなシリコーン化合物の例には、末端反応基を有する線形のポリジメチルシロキサンが含まれる。有用であろう反応基には、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、ヒドロシリル、ビニルシリル、イソシアネート、アゾ、酸ハロゲン化物、シラノールおよびアルコキシシリル基が含まれる。シリコーン基は、一次鎖（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｈａｉｎ）中にまたは一次鎖の付属物に位置してよい。これらのシリコーン化合物は、縮合、開環平衡化またはビニル重合を含む当業者に公知であるいくつかの方法のいずれかによって、オクタメチルシクロテトラシロキサン；１，３−ビス−アミノプロピルテトラメチルジシロキサン；１，３−ビス−ヒドロキシプロピルテトラメチルジシロキサン；ジクロロジメチルシラン、１，１，３，３−テトラメチルジシロキサン；４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）；ジイソシアン酸トルエン、イソホロンジイソシアネート；１，３−ビス−ビニルテトラメチルジシロキサン；３−メタクリルオキシプロピルトリス（トリメチルシロキシ）シラン；ペンタメチルジシロキサニルメチルメタクリレート；およびメチルジ（トリメチルシロキシ）メタクリルオキシメチルシラン；モノメタクリルオキシプロピル末端モノ−ｎ−ブチル末端ポリジメチルシロキサン；３−［トリス（トリメチルシロキシ）シリル］プロピルアリルカルバメート；３−［トリス（トリメチルシロキシ）ウイリル］プロピルビニルカルバメート；トリメチルシリルエチルビニルカーボネート；トリメチルシリルメチルビニルカーボネート；および２−プロペン酸、２−メチル−２−ヒドロキシ−３−［３−［１，３，３，３−テトラメチル−１−［トリメチルシリル）オキシ］ジシロキサニル］プロポキシ］プロピルエステルおよびその組合せなどの出発物質から、それ自体形成することができる。
ポリマーミセルの安定性を向上させる１つの手法は、ポリマーの疎水性を増加させることである。そうするためには、ポリマーの分子量または濃度を調節するべきである。しかし、分子量が増加するに従いその生分解性は低下し、その結果ポリマーは体から十分に排出されずに器官に蓄積し、そこで毒作用を引き起こす。米国特許第５，４２９，８２６号は、親水性ポリアルキレングリコールおよび疎水性ポリ乳酸を含む二ブロックまたは多ブロックコポリマーを開示する。具体的には、この特許は、二ブロックまたは多ブロックコポリマーをミセル化することによってポリマーミセルを安定させる方法であって、アクリル酸誘導体を二ブロックまたは多ブロックコポリマーの末端基に結合し、次に、ミセルを形成するために水溶液中でポリマーを架橋する方法を記載する。上記の方法はポリマーミセルの安定化を達成することができたが、架橋ポリマーは分解されず、したがってｉｎ ｖｉｖｏでの使用に適用することはできない。上記のポリマーミセルは、中性ｐＨの水溶液で十分に水溶性でない大量の薬物を可溶化することができるが、欠点はこの薬物が短期間で放出されることである。また、米国特許第６，４５８，３７３号では、十分に水溶性でない薬物がα−トコフェロールを有する乳濁液の形に可溶化される。この特許によると、乳濁液を安定させるために、ＰＥＧ化されたビタミンＥが両親媒性分子として用いられる。ＰＥＧ化ビタミンＥは親水性ブロックおよび疎水性ブロックからなる両親媒性ブロックコポリマーに類似した構造を有し、高度に疎水性のトコフェロールは十分に水溶性でない薬物とのコポリマーの親和性を増加させ、したがってそれは十分に水溶性でない薬物を可溶化することができる。しかし、親水性ポリマーとして用いられるポリエチレングリコールは限られた分子量を有し、その結果ＰＥＧ化ビタミンＥだけでは２．５ｍｇ／ｍｌまでしかパクリタキセルなどの疎水性の薬物を可溶化することができない。２．５ｍｇ／ｍｌ以上では、不安定ミセルが形成され、薬物の結晶は沈殿物を形成する可能性がある。
様々な構造、例えばＡ−Ｂ、Ａ−Ｂ−Ａおよび星状のブロックコポリマーを有するブロックコポリマーが、当技術分野で公知である。Ａ−Ｂ型ジブロックコポリマーの中で、モノメトキシポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＭＰＥＧ−ｂ−ＰＤＬＬＡ）（Ｙａｓｕｇｉ， Ｋ．、Ｎａｇａｓａｋｉ， Ｙ．、Ｋａｔｏ， Ｍ．、Ｋａｔａｏｋａ， Ｋ．１９９９年、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ．６２巻、８９〜１００頁）；モノメトキシポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（イプシロン−カプロラクトン）（ＭＰＥＧ−ｂ−ＰＣＬ）（Ｓｈｉｎ， Ｉ． Ｇ．、Ｋｉｍ， Ｓ． Ｙ．、Ｌｅｅ， Ｙ． Ｍ．、Ｃｈｏ， Ｃ． Ｓ．、Ｓｕｎｇ， Ｙ． Ｋ．１９９８年、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ．５１巻、１〜１１頁）およびモノメトキシポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（ベータ−ベンジルＬ−アスパルテート）（ＭＰＥＧ−ｂ−ＰＢＬＡ）（Ｙｏｋｏｙａｍａ， Ｍ．、Ｍｉｙａｕｃｈｉ， Ｍ．、Ｙａｍａｄａ， Ｎ．、Ｏｋａｎｏ， Ｔ．、Ｓａｋｕｒａｉ， Ｙ．、Ｋａｔａｏｋａ， Ｋ．、Ｌｎｏｕｅ， Ｓ．１９９０年、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ．１１巻、２６９〜２７８頁）がミセル薬物送達のために広く研究されてきた。ＭＰＥＧ−ｂ−ＰＤＬＬＡは、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中で２５℃においてカリウムモノメトキシポリ（エチレングリコ）レート（Ｊｅｏｎｇ， Ｂ．、Ｂａｅ， Ｙ． Ｈ．、Ｌｅｅ， Ｄ． Ｓ．、Ｋｉｍ， Ｓ． Ｗ．１９９７年、Ｎａｔｕｒｅ３８８巻、８６０〜８６２頁）によって、またはバルクで１１０から１５０℃においてＭＰＥＧ（Ｋｉｍ， Ｓ． Ｙ．、Ｓｈｉｎ， Ｉ． Ｇ．、Ｌｅｅ， Ｙ． Ｍ．１９９８年、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ．５６巻、１９７〜２０８頁）によって開始されたＤ，Ｌ−ラクチドの開環重合によって合成された。同様に、ＭＰＥＧ−ｂ−ＰＣＬも、２５℃においてＴＨＦ中でカリウムＭＰＥＧアルコレート（Ｄｅｎｇ， Ｘ． Ｍ．、Ｚｈｕ， Ｚ． Ｘ．、Ｘｉｏｎｇ， Ｃ． Ｄ．、Ｚｈａｎｇ， Ｌ． Ｌ．１９９７年、Ｊ． Ｐｏｌｙｍ． Ｓｃｉ． Ｐｏｌｙｍ． Ｃｈｅｍ．３５版、７０３〜７０８頁）によって、またはバルクで１４０から１８０℃においてＭＰＥＧ（Ｃｅｒｒａｉ， Ｐ．、Ｔｒｉｃｏｌｉ， Ｍ．、Ａｎｄｒｕｚｚｉ， Ｆ．、Ｐｏｃｉ， Ｍ．、Ｐａｓｉ， Ｍ．１９８９年、Ｐｏｌｙｍｅｒ３０巻、３３８〜３４３頁）によって開始されたイプシロン−カプロラクトンの開環重合によって合成された。ＭＰＥＧ−ｂ−ＰＢＬＡは、２５℃の溶媒中でＭＰＥＧアミンによって開始されたアスパラギン酸のＮ−カルボキシアンヒドリドの重合によって合成された（Ｙｏｋｏｙａｍａ， Ｍ．、Ｌｎｏｕｅ， Ｓ．、Ｋａｔａｏｋａ， Ｋ．、Ｙｕｉ， Ｎ．、Ｓａｋｕｒａｉ， Ｙ．１９８７年、Ｍａｋｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．８巻、４３１〜４３５頁）。
ジブロックコポリマーミセルに負荷された異なる薬物分子には、パクリタキセル（Ｚｈａｎｇ， Ｘ．、Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｊ． Ｋ．、Ｂｕｒｔ， Ｈ． Ｍ．１９９６年、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ．１３２巻、１９５〜２０６頁）；テストステロン（Ａｌｌｅｎ， Ｃ．、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ， Ａ．、Ｍｒｓｉｃ， Ｊ．、Ｍａｙｓｉｎｇｅｒ， Ｄ．２０００年、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．７巻、１３９〜１４５頁）；インドメタシン（Ｋｉｍ， Ｓ． Ｙ．、Ｓｈｉｎ， Ｉ． Ｇ．、Ｌｅｅ、Ｙ． Ｍ．、Ｃｈｏ， Ｃ． Ｓ．、Ｓｕｎｇ， Ｙ． Ｋ．１９９８年、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ．５１巻、１３〜２２頁）；ＦＫ５０６、Ｌ−６８５、８１８（Ａｌｌｅｎ， Ｃ．、Ｙｕ， Ｙ．、Ｍａｙｓｉｎｇｅｒ， Ｄ．、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ， Ａ．１９９８年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ．９巻、５６４〜５７２頁）；ジヒドロテストステロン（Ａｌｌｅｎ， Ｃ．、Ｈａｎ， Ｊ．、Ｙｕ， Ｙ．、Ｍａｙｓｉｎｇｅｒ， Ｄ．、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ， Ａ．２０００年、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ．６３巻、２７５〜２８６頁）；アムホテリシンＢ（Ｋｗｏｎ， Ｇ． Ｓ．、Ｎａｉｔｏ， Ｍ．、Ｙｏｋｏｙａｍａ， Ｍ．、Ｏｋａｎｏ， Ｔ．、Ｓａｋｕｒａｉ， Ｙ．、Ｋａｔａｏｋａ， Ｙ．１９９８年、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ．５１巻、１６９〜１７８頁）；ドキソルビシン（Ｙｕ， Ｂ． Ｇ．、Ｏｋａｎｏ， Ｔ．、Ｋａｔａｏｋａ， Ｋ．、Ｋｗｏｎ， Ｇ．１９９８年、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ．５３巻、１３１〜１３６頁）およびＫＲＮ（Ｙｏｋｏｙａｍａ， Ｍ．、Ｓａｔｏｈ， Ａ．、Ｓａｋｕｒａｉ， Ｙ．、Ｏｋａｎｏ， Ｔ．、Ｍａｔｓｕｍａｒａ， Ｙ．、Ｋａｋｉｚｏｅ， Ｔ．、Ｋａｔａｏｋａ， Ｋ．１９９８年、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ．５５巻、２１９〜２２９頁）が含まれる。場合によっては、ポリマーミセルへの薬物の組込みは、増加した効力または減少した副作用をもたらした。
Ａ−Ｂ−Ａ型トリブロックコポリマー組成物の中で、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（プロピレンオキシド）−ブロック−ポリ（エチレンオキシド）ベースの薬物が負荷されたミセルが、広く研究されてきた（Ｋａｂａｎｏｖ， Ａ． Ｖ．ら、１９８９年、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２５８巻、３４３〜３４５頁、Ｂａｔｒａｋｏｖａ， Ｅ． Ｖ．ら１９９６年、Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ７４巻、１５４５〜１５５２頁、Ｂａｔｒａｋｏｖａ， Ｅ． Ｖ．、Ｈａｎ， Ｈ． Ｙ．、Ａｌａｋｈｏｖ， Ｖ． Ｙ．、Ｍｉｌｌｅｒ， Ｄ． Ｗ．、Ｋａｂａｎｏｖ， Ａ． Ｖ．１９９８年、Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．１５巻、８５０〜８５５頁、Ｒａｐｏｐｏｒｔ， Ｎ．Ｙ．、Ｍａｒｉｎ， Ａ．、Ｌｕｏ， Ｙ．、Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ， Ｇ． Ｄ．、Ｍｕｎｉｒｕｚｚａｍａｎ， Ｍ． Ｊ．２００２年、Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．９１巻、１５７〜１７０頁、Ｒａｐｐｏｒｔ， Ｎ．Ｙ．、Ｈｅｒｒｏｎ， Ｊ． Ｎ．、Ｐｉｔｔ， Ｗ． Ｇ．、Ｐｉｔｉｎａ， Ｌ．１９９９年、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ．５８巻、１５３〜１６２頁、Ｃｈｅｎｇ， Ｈ． Ｙ．、Ｈｏｌｌ， Ｗ． Ｗ．１９９０年、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．７９巻、９０７〜９１２頁）。しかし、これらのポリマーは、生分解性実施形態を構成しない。そのような実施形態を開発する努力の中で、研究者は様々な生分解性、両親媒性Ａ−Ｂ−Ａトリブロックコポリマーを開発した。
米国特許第６，３２２，８０５号は、親水性ポリ（アルキレンオキシド）構成成分ならびにポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、ポリ（ε−カプロラクトン）およびその誘導体および混合物からなる群から選択される生分解性疎水性ポリマーを有する両親媒性ブロックコポリマーを含む、親水性環境で疎水性の薬物を可溶化することが可能な生分解性ポリマーミセルに関する。その特許は、それらの成分の１つとしてポリ（ε−カプロラクトン）を含有することができるＡ−Ｂ−Ａ型トリブロックコポリマーを広く教示するが、本発明に示すブロックコポリマーを含む特定の親水性ビニルポリマーも、そのようなポリマーをうまく合成することができる方法も開示していない。
米国特許第６，２０１，０６５号は、少なくとも２つの親水性基、１つの疎水性基および１つの架橋基を含む少なくとも４つのポリマーブロックを含むゲル形成マクロマーに向けられる。この参考文献は複数の重合技術の可能な利用を開示し、その中には反応物へのチオールの結合およびマクロマーへの以降の共有結合が含まれる。この参考文献は、架橋反応基を分離する生分解性連結の形成をさらに教示する。この参考文献は、本発明に示される特定の種類のブロックコポリマーも、そのようなポリマーをうまく合成することができる方法も教示、提案していない。
先に引用した報告書のほとんどは、ＰＥＧがブロックコポリマーミセルにコロイド安定性を付与する親水性セグメントの好ましい選択肢であることを示す。しかし、特定の状態では、ＰＥＧは凍結乾燥の後ナノ粒子の凝集を促進することがある（Ｄｅ Ｊａｇｈｅｒｅ， Ｆ．、Ａｌｌｅｍａｎ， Ｅ．、Ｌｅｒｏｕｘ， Ｊ． Ｃ．、Ｓｔｅｖｅｌｓ， Ｗ．、Ｆｅｉｊｅｎ， Ｊ．、Ｄｏｅｌｋｅｒ， Ｅ．、Ｇｕｒｎｙ， Ｒ．１９９９年、Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．１６巻、８５９〜８６６頁）。さらに、標的化のために様々な官能基をコンジュゲートするか、ミセルにｐＨおよび／または温度感受性を誘導するために用いることができた付属部位がＰＥＧ鎖には欠けている。様々なビニルモノマーの重合または共重合によって合成される親水性ポリマーは、ブロックコポリマーにそのような特性を提供することができる。そのようなブロックコポリマーの例には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）−ブロック−ポリ（Ｌ−乳酸）（Ｋｉｍ， Ｉ． Ｓ．、Ｊｅｏｎｇ， Ｙ． Ｉ．、Ｃｈｏ， Ｃ． Ｓ．、Ｋｉｍ， Ｓ． Ｈ．２０００年、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ．２１１巻、１〜８頁）；ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）−ブロック−ポリ（メタクリル酸ブチル）（Ｃｈｕｎｇ， Ｊ． Ｅ．、Ｙｏｏｙａｍａ， Ｍ．、Ｙａｍａｔｏ， Ｍ．、Ａｏｙａｇｉ， Ｔ．、Ｓａｋｕｒａｉ， Ｙ．、Ｏｋａｎｏ， Ｔ．１９９９年、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ．６２巻、１１５〜１２７頁）；ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−メタクリル酸−コ−オクタデシルアクリレート）（Ｔａｉｌｌｅｆｅｒ， Ｊ．、Ｊｏｎｅｓ， Ｍ． Ｃ．、Ｂｒａｓｓｅｕｒ， Ｎ．、Ｖａｎ Ｌｉｅｒ， Ｊ． Ｅ．、Ｌｅｒｏｕｘ， Ｊ． Ｃ．２０００年、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．８９巻、５２〜６２頁）が含まれる。さらに、多くの異なる生物的環境と相互作用することができるミセルを生成するための、外側の親水性シェルの構造変動が非常に望ましい。
近年、Ｂｅｎｈａｍｅｄら（２００１年）は、新規ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ブロック−ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＶＰーｂーＰＤＬＬＡ）ミセルを報告した（Ｂｅｎｈａｍｅｄ， Ａ．、Ｒａｎｇｅｒ， Ｍ．、Ｌｅｒｏｕｘ， Ｊ． Ｃ．２００１年、Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．１８巻、３２３〜３２８頁）。これらのミセルは、ＰＶＰシェルが凍結乾燥保護物質および凍結保護物質の両方である潜在的利点を有する（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ， Ｍ．、Ｄｅｌｕｃａ， Ｐ． Ｐ．１９８８年、Ｊ． Ｐａｒｅｎｔ． Ｓｃｉ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．３７巻、１９０〜１９９頁、Ｄｏｅｂｂｌｅｒ， Ｇ． Ｆ．１９６６年、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ３巻、２〜１１頁）。また、その両親媒性により、ＰＶＰは様々な化合物と相互作用することが可能である（Ｇａｒｒｅｔｔ， Ｑ．、Ｍｉｌｔｈｏｒｐｅ， Ｂ． Ｋ．１９９６年、Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．３７巻、２５９４〜２６０２頁、Ａｌｅｎｃａｒ ｄｅ Ｑｕｅｉｒｏ， Ａ． Ａ．、Ｇａｌｌｏｒｄｏ， Ａ．、Ｒｏｍｍａｎ， Ｊ． Ｓ．２０００年、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ２１巻、１６３１〜１６４３頁）。他方で、Ｊｅｏｎｇら（１９９９年）（２０００年）のグループは、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）−ブロック−ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＥｔＯｚ−ｂ−ＰＤＬＬＡ）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）−ブロック−ポリ（イプシロン−カプロラクトン）（ＰＥｔＯｚ−ｂ−ＰＣＬ）、およびポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）−ブロック−ポリ（１，３トリメチレンカーボネート）（ＰＥｔＯｚ−ｂ−ＰＴＭＣ）でのシェル形成ポリマーとしてのポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（ＰＥｔＯｚ）の使用を報告した。上記のミセル中の親水性シェルは、ｐＨ３．９より上で解離することができるポリ（アクリル酸）との水素結合複合体を形成する。（Ｌｅｅ， Ｓ． Ｃ．、Ｃｈａｎｇ， Ｙ．、Ｙｏｏｎ， Ｊ． Ｓ．、Ｋｉｍ， Ｃ．、Ｋｗｏｎ， Ｉ． Ｃ．、Ｋｉｍ， Ｙ． Ｈ．、Ｊｅｏｎｇ， Ｓ． Ｙ．１９９９年、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ３２巻、１８４７〜１８５２頁、Ｋｉｍ， Ｃ．、Ｌｅｅ， Ｓ． Ｃ．、Ｓｈｉｎ， Ｊ． Ｈ．、Ｋｗｏｎ， Ｉ． Ｃ．、Ｊｅｏｎｇ， Ｓ． Ｙ．２０００年、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ３３巻、７４４８〜７４５２頁）。
ポリ（Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ＰＨＰＭＡ）は、別の親水性の、非免疫原性および生体適合性のポリマーである。ＰＨＰＭＡとコンジュゲートさせた抗癌剤は、遊離の薬物より強力な抗腫瘍作用を示すことができることが実証されている。実際、ＰＫ１およびＰＫ２は、現在治験中であるドキソルビシンコンジュゲートＰＨＰＭＡプロドラッグである（Ｋｏｐｅｃｅｋ， Ｊ．、Ｋｏｐｅｃｏｖａ， Ｐ．、Ｍｉｎｋｏ， Ｔ．、Ｌｕ， Ｚ． Ｒ．２０００年、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｐｈａｒｍ．５０巻、６１〜８１頁）。遊離のＰＨＰＭＡは、ポロキサマーミセルベースの化学療法液体組成物の構成成分の１つとしても用いられている（Ｋａｂａｎｏｖ， Ａ． Ｖ．、Ａｌａｋｈｏｖ， Ｖ． Ｙ．２０００年、米国特許第６，０６０，５１８号）。さらに、ポリ（Ｌ−リジン）およびポリ（トリメチルアミノエチルメタクリレート）とのＰＨＰＭＡのブロックおよびグラフトコポリマーが、遺伝子送達への適用のために記載されている（Ｔｏｎｃｈｅｖａ， Ｖ．、Ｗｏｌｆｅｒｔ， Ｍ． Ａ．、Ｄａｓｈ， Ｐ． Ｒ．、Ｏｕｐｉｃｋｙ， Ｄ．、Ｕｌｂｒｉｃｈ， Ｋ．、Ｓｅｙｍｏｕｒ， Ｌ． Ｗ．、Ｓｃｈａｃｈｔ， Ｅ． Ｈ．１９９８年、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ．１３８０巻、３５４〜３６８頁；Ｋｏｎａｃｋ， Ｃ．、Ｍｒｋｖｉｃｋｏｖａ， Ｌ．、Ｎａｚａｒｏｖａ， Ｏ．、Ｕｌｂｒｉｃｈ， Ｋ．、Ｓｅｙｍｏｕｒ， Ｌ． Ｗ．１９９８年、Ｓｕｐｒａｍｏｌ． Ｓｃｉ．５巻、６７〜７４頁）。
疎水性の生分解性ポリマーおよび親水性のビニルポリマーで構成されるブロックコポリマーの合成は、Ｈｅｄｒｉｃｋらによって前に報告されている（Ｈｅｄｒｉｃｋ， Ｊ． Ｌ．、Ｔｒｏｌｌｓａｓ， Ｍ．、Ｈａｗｋｅｒ， Ｃ． Ｊ．、Ａｔｔｈｏｆｆ， Ｂ．、Ｃｌａｅｓｓｏｎ， Ｈ．、Ｈｅｉｓｅ， Ａ．、Ｍｉｌｌｅｒ， Ｒ． Ｄ．、Ｍｅｃｅｒｒｅｙｅｓ， Ｄ．、Ｊｅｒｏｍｅ， Ｒ．、Ｄｕｂｏｉｓ， Ｐｈ．１９９８年、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ３１巻、８６９１〜８７０５頁）。しかし、この研究では、著者らは、コポリマーを調製するために原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）を用いた。残念なことに、ＡＴＲＰは多くのビニルモノマー（例えばＨＰＭＡ、ＶＰ）の重合にとって最適でない。したがって、本発明者らは、高分子生分解性連鎖移動剤の存在下で親水性ビニルモノマーをラジカル的に重合させ、そのブロックコポリマーを得ることに決めた。先行技術では、Ｓａｔｏら（１９８７年）は、連鎖移動剤としてモノまたはジチオール末端ＰＥＧ、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（ビニルアルコール）およびポリ（スチレン）の存在下での、ビニルモノマー、例えば酢酸ビニル、メタクリル酸メチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドおよびアクリル酸のフリーラジカル重合によって、様々なＡ−ＢおよびＡ−Ｂ−Ａ型のブロックコポリマーを合成した（Ｓａｔｏ， Ｔ．、Ｙａｍａｕｃｈｉ， Ｊ．、Ｏｋａｙａ， Ｔ． １９８７年、米国特許第４，６９９，９５０号）。Ｉｎｏｕｅら（１９９８年）は、連鎖移動剤としてチオール末端オリゴ（メタクリル酸メチル）の存在下でのアクリル酸のラジカル重合によって、Ａ−Ｂ型ブロックコポリマーミセルを合成した（Ｉｎｏｕｅ， Ｔ．、Ｃｈｅｎ， Ｇ．、Ｎａｋａｍｅ， Ｋ．、Ｈｏｆｆｍａｎ， Ａ． Ｓ．１９９８年、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ．５１巻、２２１〜２２９頁）。しかし、先行する当業者は、高分子生分解性連鎖移動剤の使用を教示または提案していない。
３．ミセル
本明細書で用いるように、「ミセル」は、外側の脂質単層を含む構造を指す。臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を超える場合、水性媒体でミセルを形成することができる。臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）近くの希釈溶液中の小さなミセルは、球状であると一般に考えられている。しかし、他の条件の下では、それらは変形した球、ディスク、ロッド、ラメラなどの形状であるかもしれない。比較的低分子量の両親媒性分子から形成されるミセルは高いＣＭＣを有することができ、したがって形成されるミセルは希釈によりかなり速やかに解離する。これが望ましくない場合、大きな疎水領域を有する両親媒性分子を用いることができる。例えば、長い脂肪酸鎖もしくは２つの脂肪酸鎖を有する脂質、例えばリン脂質およびスフィンゴ脂質、またはポリマー、特にブロックコポリマーを用いることができる。
１０−６Ｍ（モル濃度）の低さのＣＭＣを示すポリマーミセルが調製された。したがって、それらは非常に安定であると同時に両親媒性ミセルと同じ有益な特性を示す傾向がある。当技術分野で現在公知であるか、そのように将来公知になることができる任意のミセル形成ポリマーを、開示される組成物および方法で用いることができる。ミセル形成ポリマーの例には、メトキシポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（ε−カプロラクトン）、ホスファチジルエタノールアミンとのポリ（エチレングリコール）のコンジュゲート、ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリエステル、ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（Ｌ−アミノ酸）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ｂｌ−ポリ（オルソエステル）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ｂ−ポリアンヒドリドおよびポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ｂ−ポリ（アクリル酸アルキル）が含まれるが、これらに限定されない。
ミセルは、当技術分野で慣例の方法で生産することができる。その例は、例えばＬｉｇｇｉｎｓ（Ｌｉｇｇｉｎｓ， Ｒ． Ｔ．およびＢｕｒｔ， Ｈ． Ｍ．、「Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ−ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ ｄｉｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｌｏａｄｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｍｉｃｅｌｌｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ． Ｒｅｖ．５４巻：１９１〜２０２頁（２００２年））；Ｚｈａｎｇら（Ｚｈａｎｇ， Ｘ．ら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ ｄｉｂｉｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｓ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ ｔａｘｏｌ」Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ．１３２巻：１９５〜２０６頁（１９９６年））；およびＣｈｕｒｃｈｉｌｌ（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ， Ｊ． Ｒ．およびＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ， Ｆ． Ｇ．、「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」米国特許第４，７４５，１６０号（１９８８年））に記載される。そのような一方法では、親水性（ポリエーテル）および疎水性（ポリエステル）セグメントを有する両親媒性ポリマーであるポリエーテル−ポリエステルブロックコポリマーが、ミセル形成キャリアとして用いられる。
例えばＴｕｚａｒ（Ｔｕｚａｒ， Ｚ．およびＫｒａｔｏｃｈｖｉｌ， Ｐ．、「Ｂｌｏｃｋ ａｎｄ ｇｒａｆｔ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｍｉｃｅｌｌｅｓ ｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」Ａｄｖ． Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．６巻：２０１〜２３２頁（１９７６年））；およびＷｉｌｈｅｌｍら（Ｗｉｌｈｅｌｍ， Ｍ．ら、「Ｐｏｌｙ（ｓｔｙｒｅｎｅ−ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ） ｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｍｉｃｅｌｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｗａｔｅｒ： ａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｂｅ ｓｔｕｄｙ」Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２４巻：１０３３〜１０４０頁（１９９１年））に記載されるように、例えば親水性および疎水性のセグメントの両方を有するＡＢ型ブロックコポリマーを用いて、別の種類のミセルを形成することができる。これらのポリマーミセルは、満足のいく水性安定性を維持することができる。サイズが約＜２００ｎｍの範囲のこれらのミセルは、非選択的ＲＥＳスカベンジングの低減に効果的であり、強化された透過性および保持を示す。
さらに、Ｋａｔａｏｋａらへの米国特許第５，９２９，１７７号は、とりわけ薬物送達キャリアとして使えるポリマー分子を記載する。ミセルは、その両端に官能基を有し、親水性／疎水性セグメントを含むブロックコポリマーから形成される。ブロックコポリマー末端のポリマー官能基には、アルファ末端のアミノ、カルボキシルおよびメルカプト基ならびにオメガ末端のヒドロキシル、カルボキシル基、アルデヒド基およびビニル基が含まれる。親水性セグメントはポリエチレンオキシドを含むが、疎水性セグメントはラクチド、ラクトンまたは（メト）アクリル酸エステルに由来する。
さらに、例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）−ｂ−メトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ：ＰＤＬＬＡ）ジブロックコポリマーは、ＭｅＰＥＧ １９００および５０００を用いて作製することができる。触媒としてオクタン酸第一錫（０．２５％）を用いて、反応を１６０℃で３時間進行させることができる。しかし、反応を約６時間進行させる場合には１３０℃の低さの温度を用いることができ、または反応をわずか約２時間実施する場合には１９０℃の高さの温度を用いることができる。
別の例として、Ｋｏｈｏｒｉ， Ｆ．ら（１９９８年）の方法を用いて、ラジカル重合過程でヒドロキシル末端ポリ（ＩＰＡＡｍ−コ−ＤＭＡＡｍ）を作製するために、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（「ＩＰＡＡｍ」）（Ｋｏｈｊｉｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）およびジメチルアクリルアミド（「ＤＭＡＡｍ」）（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いることができる。（Ｋｏｈｏｒｉ， Ｆ．ら、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒｍａｌｌｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｍｉｃｅｌｌｅｓ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｐｏｌｙ（Ｎ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ−ｂ−Ｄ，Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ）」Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｒｅｌ．５５巻：８７〜９８頁（１９９８年））。得られたコポリマーを冷水に溶解し、１０，０００および２０，０００の分子量カットオフを有する２つの限外濾過膜を通して濾過することができる。ポリマー溶液は、２０，０００分子量カットオフの膜を通して先ず濾過される。次に、濾液は１０，０００分子量カットオフの膜を通して再び濾過された。３つの分子量画分、低分子量画分、中間分子量画分および高分子量画分をその結果得ることができる。ブロックコポリマーは、中間分子量画分のポリ（ＩＰＡＡｍ−コ−ＤＭＡＡｍ）の末端ヒドロキシル基から、Ｄ，Ｌ−ラクチドの開環重合によって次に合成することができる。生じたポリ（ＩＰＡＡｍ−コ−ＤＭＡＡｍ）−ｂ−ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）コポリマーは、Ｋｏｈｏｒｉ， Ｆ．ら（１９９９年）に記載されているように精製することができる。（Ｋｏｈｏｒｉ， Ｆ．ら、「Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅｒｍａｌｌｙ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｍｉｃｅｌｌｅｓ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ｐｏｌｙ（Ｎ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ−ｃｏ−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）−ｂ−ｐｏｌｙ（Ｄ，Ｌ−ｌａｃｉｄｅ）」Ｃｏｌｌｏｉｄｓ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ｂ： Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ１６巻：１９５〜２０５頁（１９９９年））。
支持体表面にコーティングするために用いることができるミセルを調製することができるブロックコポリマーの例は、Ｋａｔａｏｋａらへの米国特許第５，９２５，７２０号、Ｓａｋａｒａｉらへの米国特許第５，４１２，０７２号、Ｋａｔａｏｋａらへの米国特許第５，４１０，０１６号、Ｋａｔａｏｋａらへの米国特許第５，９２９，１７７号、Ｓａｋｕｒａｉらへの米国特許第５，６９３，７５１号、Ｙｏｋｏｙａｍａらへの米国特許第５，４４９，５１３号、国際公開第９６／３２４３４号、国際公開第９６／３３２３３号および国際公開第９７／０６２３号に見られ、その全ての内容は参照により組み込まれる。そこに適する官能基（エチレン不飽和重合性基を含む）を導入して調製されるその改変も、好ましくは本発明のミセルが調製されるブロックコポリマーの例である。好ましいブロックコポリマーは、前述の特許およびまたは国際特許公報で開示されるものである。国際公開第９６／３２４３４号のブロックコポリマーの場合のようにブロックコポリマーが親水性ポリマーセグメントの一端に糖残基を有する場合、対応するアルデヒド基が形成され得るように糖残基は好ましくはＭａｌａｐｒａｄｅ酸化を受けるべきである。
４．リポソーム
本明細書で用いられる用語「リポソーム」は、内部水性空間を囲む外側の脂質二重層または多重層膜を含む構造を指す。細胞への送達のために任意の生物学的活性剤を詰め込むためにリポソームを用いることができる。
リポソームを形成するための材料および手法は、当業者に周知である。適当な媒体中での分散の際に、さまざまな種類のリン脂質が膨潤、水和し、脂質二重層を分離する水性媒体層を有する多重膜同心状の二重層小胞を形成する。これらの系は多重膜リポソームまたは多重膜脂質小胞（「ＭＬＶ」）と呼ばれ、１０ｎｍ〜１００μｍの範囲の直径を有する。これらのＭＬＶは、Ｂａｎｇｈａｍら、Ｊ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．１３巻：２３８〜２５２頁（１９６５年）によって最初に記載された。一般に、脂質または親油性物質は、有機溶媒に溶解される。溶媒が、例えば減圧下で回転蒸発によって除去されたとき、脂質残留物は容器の壁にフィルムを形成する。電解質または親水性の生物学的活性材料を一般に含有する水溶液が、次にフィルムに加えられる。撹拌の際に大きなＭＬＶが生成される。より小さなＭＬＶが望まれる場合、より大きな小胞が超音波処理、孔径の漸減するフィルターによる逐次的な濾過を受けるか、他の形の機械的剪断によって縮小される。ＭＬＶを、例えば加圧押し出し（Ｂａｒｅｎｈｏｌｚら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．９９巻：２１０〜２１４頁（１９７９年））によってサイズおよびラメラの数の両方において縮小させることができる技術もある。
リポソームは、単層膜小胞の形をとることもでき、それはＭＬＶのより広範な超音波処理によって調製され、水溶液を囲む単一の球状脂質二重層からなる。単層膜小胞（「ＵＬＶ」）は、直径が２０〜２００ｎｍの範囲と小さくてもよいが、より大きなＵＬＶは２００ｎｍ〜２μｍの範囲の直径を有することができる。単層膜小胞を作製するためのいくつかの周知技術がある。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ１３５巻：６２４〜２３８頁（１９６８年）では、リン脂質の水性分散液の超音波処理は、水溶液を囲む脂質二重層を有する小さなＵＬＶを生成する。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、米国特許第４，０８９，８０１号は、生体分子脂質層系を形成するための、超音波処理、および続く両親媒性化合物を含有する水性媒体の添加および遠心分離によるリポソーム前駆体の形成を記載する。
小さなＵＬＶは、Ｂａｔｚｒｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ２９８巻：１０１５〜１０１９頁（１９７３年）によって記載されるエタノール注射技術、およびＤｅａｍｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ４４３巻：６２９〜６３４頁（１９７６年）のエーテル注射技術によって調製することもできる。これらの方法は、緩衝溶液への脂質の有機溶液の迅速な注入を含み、それは単層膜リポソームの急速な形成をもたらす。ＵＬＶを作製するための別の技術は、Ｗｅｄｅｒらによって「Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｇ． Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．、第Ｉ巻、第７章、７９〜１０７頁（１９８４年）で教示される。この界面活性剤除去方法は、所望の小胞を生成するために、撹拌または超音波処理によって界面活性剤で脂質および添加剤を可溶化することを含む。
Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，２３５，８７１号は、有機溶媒中の脂質および水性緩衝液中のカプセル化される薬物の油中水型乳濁液の形成を含む逆相蒸発技術による、大きなＵＬＶの調製を記載する。有機溶媒は圧力の下で除去されて混合物を与え、それは、水性媒体での撹拌または分散によって大きなＵＬＶに変換される。Ｓｕｚｕｋｉら、米国特許第４，０１６，１００号は、剤および脂質の水性リン脂質分散液を凍結／解凍することによる単層膜小胞内に剤をカプセル化する別の方法を記載する。
ＭＬＶおよびＵＬＶに加えて、リポソームは多胞性であってもよい。Ｋｉｍら、Ｂｉｏｃｈｉｍ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ７２８巻：３３９〜３４８頁（１９８３年）に記載されるように、これらの多胞性リポソームは球状であり、内部粒状構造を含有する。外膜は脂質二重層であり、内部領域は二重層隔壁によって分離される小さなコンパートメントを含有する。さらに別の種類のリポソームはオリゴラメラ小胞（「ＯＬＶ」）であり、それはいくつかの辺縁脂質層によって囲まれる大きな中心コンパートメントを有する。２〜１５μｍの直径を有するこれらの小胞は、Ｃａｌｌｏら、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ２２巻（３号）：２５１〜２６７頁（１９８５年）に記載される。
Ｍｅｚｅｉら、米国特許第４，４８５，０５４号および４，７６１，２８８号も、脂質小胞の調製方法を記載する。より最近、Ｈｓｕ、米国特許第５，６５３，９９６号は、エアゾール化を利用するリポソームの調製方法を記載し、Ｙｉｏｕｒｎａｓら、米国特許第５，０１３，４９７号は、高速剪断混合チャンバーを利用するリポソームの調製方法を記載する。ＵＬＶ（Ｗａｌｌａｃｈら、米国特許第４，８５３，２２８号）またはＯＬＶ（Ｗａｌｌａｃｈ、米国特許第５，４７４，８４８号および５，６２８，９３６号）を生成するために、特定の出発物質を用いる方法も記載される。
全ての前記の脂質小胞およびそれらの調製方法の包括的レビューは、「Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｇ． Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．、第Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ巻（１９８４年）に記載される。本発明で使用するために適する様々な脂質小胞を記載するこの参考文献および前出の参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
ｉ．リポソームの調製
例えば、その全ては参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｅｎｇ．、９巻：４６７頁（１９８０年）、米国特許第４，１８６，１８３号、４，２１７，３４４号、４，２３５，８７１号、４，２６１，９７５号、４，４８５，０５４号、４，５０１，７２８号、４，７７４，０８５号、４，８３７，０２８号、４，９４６，７８７号、ＰＣＴ公報国際公開第９１／１７４２４号、ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、４４３巻：６２９〜６３４頁（１９７６年）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７６巻：３３４８〜３３５２頁（１９７９年）；Ｈｏｐｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、８１２巻：５５〜６５頁（１９８５年）；Ｍａｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、８５８巻：１６１〜１６８頁（１９８６年）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、８５巻：２４２〜２４６頁（１９８８年）、テキストＬｉｐｏｓｏｍｅｓ、Ｍａｒｃ Ｊ． Ｏｓｔｒｏ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ 、１９８３年、第１章、およびＨｏｐｅら、Ｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ． Ｌｉｐ．、４０巻：８９頁（１９８６年）に記載されるように、リポソームを調製するために様々な方法が利用できる。適する方法には、それらに限定されないが、超音波処理、押し出し、高圧／均質化、微小流動化、界面活性剤透析、小さなリポソーム小胞のカルシウム誘導融合、およびエーテル注入法が含まれ、その全ては当技術分野で周知である。
リポソームは、例えば、有機溶媒に両親媒性分子を溶解し、表面に薄いフィルムを形成させ、フィルムを水和させ、生じた溶液を濾過してリポソームを得ることによって調製することができる。図１６にこの方法を例示する（両親媒性分子の例としてペプチド両親媒性物質を用いる）。
リポソームを調製する代替方法も、利用できる。例えば、Ｗｈｅｅｌｅｒらに公布された米国特許第５，９７６，５６７号で、脂質粒子の界面活性剤透析に基づく自己集合を含む方法が開示、請求され、それは時間のかかる、難しい一定比率の乾燥および再構成段階を避ける。連続流動水和を用いてリポソームを調製するさらなる方法が開発中で、最も有効な大規模製造工程を多くの場合提供することができる。
１つの方法は、不均一なサイズの多重膜小胞を生成する。この方法では、小胞形成脂質が適する有機溶媒または溶媒系に溶解され、真空下または不活性気体の下で乾燥されて薄い脂質フィルムを形成する。所望により、フィルムを第三ブタノールなどの適する溶媒に再融解し、次に凍結乾燥して、より容易に水和される粉末様の形であるより均一な脂質混合物を形成することができる。このフィルムは水性緩衝溶液で覆われ、一般に撹拌を伴う１５〜６０分間、水和させられる。より激しい撹拌条件の下で脂質を水和させるか、またはデオキシコレートなどの可溶化界面活性剤を加えることによって、生じる多重膜小胞のサイズ分布をより小さなサイズに移行させることができる。
単層膜小胞は、超音波処理または押し出しによって調製することができる。超音波処理は、氷浴でＢｒａｎｓｏｎチップソニファイアー（ｔｉｐ ｓｏｎｉｆｉｅｒ）などのチップソニファイアーで一般に実施される。一般的に、懸濁液は分断された超音波処理サイクルを受ける。押し出しは、Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅ Ｅｘｔｒｕｄｅｒなどの生体膜押し出し機によって実施することができる。押し出しフィルターの規定の孔径は、特定のサイズの単層膜リポソーム小胞を生成することができる。リポソームは、Ｎｏｒｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ Ｍａｓｓから市販されているＣｅｒａｆｌｏｗ Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｅｒなどの、不斉セラミックフィルタを通して押し出しによって形成することもできる。エタノールにリン脂質を溶解し、次に緩衝液に脂質を注入して、脂質に単層膜小胞を自発的に形成させることによって単層膜小胞を作製することもできる。また、界面活性剤、例えば、コレート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘまたはｎ−アルキルグルコシドにリン脂質を可溶化させてもよい。可溶化された脂質−界面活性剤ミセルへの薬物の添加の後、透析、ゲル濾過、親和性クロマトグラフィー、遠心分離および限外濾過を含む可能ないくつかの方法のいずれかで界面活性剤は除去される。
リポソーム調製後、リポソームサイズの所望のサイズ範囲および比較的狭い分布を達成するために、形成の間に大きさを調整されなかったリポソームは、大きさを調整されてもよい。約０．２〜０．４ミクロンのサイズ範囲は、従来のフィルターによるリポソーム懸濁液の濾過滅菌を可能にする。リポソームが約０．２〜０．４ミクロンまで小さくされた場合、フィルター滅菌法を高いスループットで実行することができる。
所望のサイズへのリポソームの大きさの調整に、いくつかの技術を利用できる。大きさを調整する１つの方法は、米国特許第４，７３７，３２３号に記載され、それは参照により本明細書に組み込まれる。浴槽超音波処理またはプローブ超音波処理によってリポソーム懸濁液を超音波処理することは、約０．０５ミクロン未満のサイズの小単層膜小胞への進行的なサイズ縮小を生じる。均質化は、大きなリポソームを小さなものに断片化する剪断エネルギーに依存する別の方法である。一般的な均質化手法では、一般的に約０．１から０．５ミクロンの選択されるリポソームサイズが観察されるまで、多重膜小胞を標準乳濁液ホモジナイザー中に再循環させる。リポソーム小胞のサイズは、参照により本明細書に組み込まれるＢｌｏｏｍｆｉｅｌｄ、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｅｎｇ．、１０巻：４２１〜４５０頁（１９８１年）に記載される準電気的光散乱（ＱＥＬＳ）によって決定することができる。平均リポソーム直径は、形成されるリポソームの超音波処理によって低減することができる。効率的なリポソーム合成を導くために、間欠性超音波処理サイクルをＱＥＬＳ調査と交互に行うことができる。
小孔ポリカーボネート膜または不斉セラミック膜を通してのリポソームの押し出しも、比較的良好に規定されたサイズ分布にリポソームサイズを低減するための有効な方法である。一般的に、所望のリポソームサイズ分布が達成されるまで、懸濁液は１回または複数回、膜を通して循環させられる。リポソームサイズの段階的な縮小を達成するために、連続的に孔がより小さくなる膜を通してリポソームを押し出すことができる。
これらの方法によって調製されるリポソームは、薬物負荷および患者への投与の前に相当な期間保存することができる。例えば、リポソームを脱水、保存し、その後再水和し、１つまたは複数のビンカアルカロイドを負荷し、投与することができる。脱水は、例えば標準の凍結乾燥装置を用いて達成することができ、すなわち、それらは低圧条件下で脱水される。また、脱水の前に、リポソームを、例えば液体窒素で凍結させることができる。脱水の前に、リポソームの環境に、例えばリポソームを含有する緩衝液に糖を加え、それによって脱水の間、リポソームの完全性を促進することができる。例えば、米国特許第５，０７７，０５６号または５，７３６，１５５号を参照。
Ｂ．頭基
本明細書で開示される組成物および／または両親媒性分子は、１つまたは複数の頭基をさらに含むことができる。頭基は、例えば、標的化頭基および機能的頭基であってよい。標的化頭基は、例えば、血餅結合頭基であってよい。機能的頭基は、例えば、検出頭基および処置頭基であってよい。頭基は、異なる種類の頭基の特性の２つ以上を組み合わせることもできる。例えば、処置頭基は検出可能であってもよく、したがって検出頭基とみなすこともできる。一部の形では、頭基は、血餅結合頭基、抗血管新生剤、血管新生促進剤、癌化学療法剤、細胞傷害剤、抗炎症剤、抗関節炎剤、ポリペプチド、核酸分子、小分子、フルオロフォア、フルオレセイン、ローダミン、放射性核種、インジウム１１１、テクネチウム９９、炭素１１および炭素１３からなる群より独立して選択することができる。頭基の少なくとも１つは、処置頭基であってよい。処置頭基の例は、パクリタキセルおよびタキソールである。頭基の少なくとも１つは、検出頭基であってよい。
本明細書で用いるように、用語「頭基」は、連結またはコンジュゲートされる分子に生物学的に有用な機能を一般に付与する、物理的、化学的または生物学的な材料を意味するものとして広義に用いられる。後に続く処置頭基および検出頭基の記載は、頭基、両親媒性分子または血餅結合頭基のいずれにも適用されるものとする。したがって、例えば、頭基は、開示される両親媒性分子、血餅結合頭基または両親媒性分子および血餅結合頭基のコンジュゲートにコンジュゲートされるか、結合されるか、またはその一部であってよい。
頭基は、それらに限定されないが、生物学的な材料、例えば細胞、ファージまたは他のウイルス；小分子などの有機化学物質；放射性核種；核酸分子またはオリゴヌクレオチド；ポリペプチド；またはペプチドを含む、任意の天然または非天然の材料であってよい。有用な頭基には、それらに限定されないが、血餅結合頭基および処置頭基、例えば癌化学療法剤、細胞傷害剤、アポトーシス促進剤および抗血管新生剤；検出可能な標識および画像化剤；およびタグまたは他の不溶性支持体が含まれる。有用な頭基には、それらに限定されないが、ファージおよび他のウイルス、細胞、リポソーム、ポリマーマトリックス、非ポリマーマトリックスまたは粒子、例えば金粒子、マイクロデバイスおよびナノデバイス、およびナノスケールの半導体材料がさらに含まれる。これらの頭基および当技術分野で公知である他の頭基は、組成物の構成成分であってもよい。
１．血餅結合頭基
血餅結合頭基は、血餅および／または凝固血漿タンパク質などの血餅の構成成分と相互作用する能力を有する任意の化合物であってよい。組成物が凝固部位、プラーク部位および損傷部位で組成物の蓄積を引き起こすように、組成物は、十分な数および組成の血餅結合頭基を含むことができる。一例において、血餅結合頭基の数および組成の十分性は、ヒト以外の動物で凝固部位、プラーク部位および／または損傷部位での組成物の蓄積を調査することによって決定することができる。
血餅結合頭基は、例えば、アミノ酸配列ＲＥＫを含むアミノ酸セグメント、フィブリン結合ペプチド、血餅に結合するがフィブリンに結合しないペプチド（例えばＣＧＬＩＩＱＫＮＥＣ（ＣＬＴ１、配列番号２）およびＣＮＡＧＥＳＳＫＮＣ（ＣＬＴ２、配列番号３））、血餅結合抗体および血餅結合小有機分子から各々独立して選択することができる。血餅結合頭基は、アミノ酸配列ＲＥＫを含むアミノ酸セグメントを各々独立して含むことができる。そのようなペプチドは、米国特許出願公開第２００８／０３０５１０１号でも記載され、それは、そのようなペプチドのその記載に関して、参照により本明細書に組み込まれる。アミノ酸配列ＣＡＲまたはＣＲＫを含むペプチドも、米国特許出願公開第２００９／００３６３４９号に記載され、それは、そのようなペプチドのその記載に関して、参照により本明細書に組み込まれる。
組成物は、任意数の血餅結合頭基を含むことができる。例示のために、組成物は、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、６２５、７５０，７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、７５，０００、または１００，０００個以上の血餅結合頭基を含むことができる。組成物は、上で記載される数の間の任意の個数を含むこともできる。
本明細書で用いるように、用語「ホーミング分子」は、正常組織に優先して特定の標的部位または組織にｉｎ ｖｉｖｏで選択的に向かう任意の分子を意味する。同様に、用語「ホーミングペプチド」または「ホーミングペプチド様物質」は、正常組織に優先して特定の標的部位または組織にｉｎ ｖｉｖｏで選択的に向かうペプチドを意味する。例えば腫瘍にｉｎ ｖｉｖｏで選択的に向かうホーミング分子は、全ての腫瘍に向かうことができるか、腫瘍型のうちの１つまたはサブセットへの優先的ホーミングを示すことができるものと理解される。
「選択的に向かう」は、ｉｎ ｖｉｖｏで、ホーミング分子が非標的と比較して標的に優先的に結合することを意味する。例えば、ホーミング分子は、非腫瘍組織または非創傷組織と比較して、１つまたは複数の腫瘍、創傷組織または血餅の凝固血漿に優先的に結合することができる。そのようなホーミング分子は、例えば腫瘍に選択的に向かうことができる。例えば腫瘍への選択的ホーミングは、非腫瘍組織のいくつかの組織型と比較して、腫瘍（または他の標的）内への少なくとも２倍の局在化を一般に特徴とする。ホーミング分子は、非腫瘍組織のいくつかもしくは多くの組織型と比較して、またはほとんどもしくは全ての非腫瘍組織と比較して、腫瘍（または他の標的）への５倍、１０倍、２０倍またはそれを上回る優先的局在化を特徴とすることができる。したがって、場合によっては、ホーミング分子は、標的組織に向かうことに加えて、一部、１つまたは複数の正常な器官に向かうものと理解される。選択的ホーミングは、標的化と呼ぶこともできる。
開示される血餅結合頭基には、血餅結合頭基の改変形が含まれてもよい。血餅結合頭基は、任意の有用な改変を有することができる。例えば、一部の改変は、血餅結合化合物を安定させることができる。例えば、開示される血餅結合頭基には、メチル化血餅結合頭基が含まれる。メチル化血餅結合頭基は、血餅結合頭基がタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸セグメントを含むときに特に有用である。例えば、血餅結合頭基は、例えば改変されたアミノ酸セグメントまたはアミノ酸配列を含む、改変された血餅結合頭基であってよい。例えば、改変された血餅結合頭基は、例えばメチル化アミノ酸セグメントまたはアミノ酸配列を含む、メチル化血餅結合頭基であってよい。単独あるいは併用で、他の改変を用いることができる。血餅結合頭基が、タンパク質、ペプチド、アミノ酸セグメントおよび／またはアミノ酸配列であるかそれを含む場合、改変は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸セグメント、アミノ酸配列、ならびに／またはタンパク質、ペプチド、アミノ酸セグメントおよび／もしくはアミノ酸配列の任意のアミノ酸に加えられてよい。アミノ酸およびペプチドの改変は当業者に公知であり、そのいくつかは本明細書の下およびほかに記載される。メチル化は、開示される血餅結合頭基のために特に有用な改変である。
血餅結合頭基の改変形を用いることは、凝固部位、プラーク部位、および損傷部位での組成物の蓄積および／または送達の有効性を高めることが発見された。組成物が凝固部位、プラーク部位および損傷部位で組成物の蓄積を引き起こすように、組成物は、十分な数および組成の血餅結合頭基を含むことができる。一例において、血餅結合頭基の数および組成の十分性は、ヒト以外の動物で凝固部位、プラーク部位および／または損傷部位での組成物の蓄積を調査することによって決定することができる。
複数の改変型および／または非改変型の血餅結合頭基は、例えば、アミノ酸配列ＲＥＫの改変形または非改変形を含むアミノ酸セグメント、アミノ酸配列ＣＡＲの改変形または非改変形を含むアミノ酸セグメント（例えばＣＡＲＳＫＮＫＤＣ（配列番号６））、アミノ酸配列ＣＲＫの改変形または非改変形を含むアミノ酸セグメント（例えばＣＲＫＤＫＣ（配列番号５））、フィブリン結合ペプチドの改変形または非改変形、血餅に結合してフィブリンに結合しないペプチドの改変形または非改変形（例えばＣＧＬＩＩＱＫＮＥＣ（ＣＬＴ１、配列番号２）およびＣＮＡＧＥＳＳＫＮＣ（ＣＬＴ２、配列番号３））、血餅結合抗体の改変形または非改変形、および血餅結合小有機分子の改変形または非改変形から各々独立して選択することができる。複数の血餅結合頭基は、アミノ酸配列ＲＥＫの改変形または非改変形を含むアミノ酸セグメントを各々独立して含むことができる。そのようなペプチドは、そのようなペプチドのその記載に関して、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００８／０３０５１０１号にも記載される。アミノ酸配列ＣＡＲまたはＣＲＫを含むペプチドは、そのようなペプチドのその記載に関して、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９／００３６３４９号にも記載される。
組成物は、任意の数の改変型および／または非改変型の血餅結合頭基を含むことができる。例として、組成物は、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、６２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００，９２５，９５０、９７５、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、７５，０００または１００，０００個またはそれ以上の改変型および／または非改変型の血餅結合頭基を含むことができる。組成物は、上で記載される数の間の任意の個数を含むこともできる。
本明細書で用いるように、タンパク質、ペプチド、アミノ酸セグメント、アミノ酸配列などの「メチル化誘導体」は、メチル化されているタンパク質、ペプチド、アミノ酸セグメント、アミノ酸配列などの形を指す。文脈によって別途に示されない限り、タンパク質、ペプチド、アミノ酸セグメント、アミノ酸配列などのメチル化誘導体への言及は、基礎となるタンパク質、ペプチド、アミノ酸セグメント、アミノ酸配列などに対するメチル化以外のいかなる改変も含まない。メチル化誘導体は他の改変を有することもできるが、そのような改変は一般に記される。例えば、アミノ酸配列の保存的な改変体は、基礎となるアミノ酸配列の保存的なアミノ酸置換を含むであろう。したがって、例えば特定のアミノ酸配列「およびその保存的な改変体」の「メチル化誘導体」への言及は、特定のアミノ酸配列のメチル化形および特定のアミノ酸配列の保存的改変体のメチル化形を含むであろうが、いかなる他の改変または誘導も含まない。他の例として、アミノ酸置換を含むアミノ酸セグメントのメチル化誘導体への言及は、アミノ酸セグメントのアミノ酸配列のメチル化形を含むであろうし、アミノ酸セグメントのアミノ酸配列のメチル化形はアミノ酸置換を含む。
血餅結合頭基および他のペプチドおよびタンパク質は、本明細書のほかで記載される、異なるかさらなる改変を有することができる。
ｉ．ペプチド
一例において、血餅結合頭基は、ペプチドまたはペプチド様物質であってよい。開示されるペプチドは、単離された形であってよい。開示されるペプチドに関して本明細書で用いられるように、用語「単離された」は、通常、細胞中でそのペプチドと関連しているか、ライブラリーまたは粗調製物中でそのペプチドと関連している混入ポリペプチド、脂質、核酸および他の細胞物質などの物質が比較的含まれない形のペプチドを意味する。
開示されるペプチドは、任意の適する長さを有することができる。開示されるペプチドは、例えば、６未満、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５または４０残基の比較的短い長さを有することができる。開示されるペプチドは、かなり長い配列としても有用であることがある。したがって、ペプチドは、例えば、最高５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００または２０００残基の長さを有することができる。特定の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または２００残基の長さを有することができる。さらなる実施形態では、ペプチドは、５から２００残基、５から１００残基、５から９０残基、５から８０残基、５から７０残基、５から６０残基、５から５０残基、５から４０残基、５から３０残基、５から２０残基、５から１５残基、５から１０残基、１０から２００残基、１０から１００残基、１０から９０残基、１０から８０残基、１０から７０残基、１０から６０残基、１０から５０残基、１０から４０残基、１０から３０残基、１０から２０残基、２０から２００残基、２０から１００残基、２０から９０残基、２０から８０残基、２０から７０残基、２０から６０残基、２０から５０残基、２０から４０残基または２０から３０残基の長さを有することができる。本明細書で使用される場合、用語「残基」は、アミノ酸またはアミノ酸類似体をいう。
この明細書が様々なタンパク質およびタンパク質配列について論ずる場合、それらのタンパク質配列をコードすることができる核酸も開示されるものと理解される。これには、特定のタンパク質配列に関係する全ての縮重配列、すなわち１つの特定のタンパク質配列をコードする配列を有する全ての核酸、ならびにタンパク質配列の開示される改変体および誘導体をコードする、縮重核酸を含む全ての核酸が含まれる。したがって、各々および全ての特定の核酸配列は本明細書で書き出されていないかもしれないが、どの配列も、開示されるタンパク質配列を通して本明細書で実際に開示および記載されるものと理解される。
ペプチドは環状（環式）であってもよいし、ループを含有してもよい。２つ以上のペプチドを一緒に環化するか結合するために、システイン残基を用いることができる。これは、特定のコンフォメーションにペプチドを制約するために有益なことがある。（ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１巻：３８７頁（１９９２年）、参照により本明細書に組み込まれる）。多くのペプチド、ホーミングモチーフおよび配列、ならびに標的化モチーフおよび配列が一端または両端のシステイン残基と一緒に示されるが、そのようなシステイン残基はホーミング機能のために一般に必要とされないものと理解される。一般に、そのようなシステインは、ホーミングおよび標的化配列を同定した方法に起因して存在する。したがって、１つまたは２つの末端システインを有する公知のまたは開示されるペプチド、ホーミングモチーフおよび配列、ならびに標的化モチーフおよび配列のいずれかが、そのようなシステインなしで用いることができる。公知のまたは開示されるペプチド、ホーミングモチーフおよび配列、ならびに標的化モチーフおよび配列のそのような形が、本明細書で特に企図される。そのような末端システインは、例えば、本明細書で開示されるものなどのペプチドを環化するために用いることができる。これらの理由から、開示されるペプチドのいずれかの末端にシステイン残基を加えることができると理解されてもいる。
ペプチドは、様々な改変を有することができる。ペプチドの特性を変更するか向上させるために、改変を用いることができる。例えば、開示されるペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸でＮ−メチル化、Ｏ−メチル化、Ｓ−メチル化、Ｃ−メチル化されているか、またはそれらの組合せがなされている可能性がある。
開示されるペプチドのアミノおよび／またはカルボキシ末端は、改変されてよい。アミノ末端改変には、メチル化（例えば、−ＮＨＣＨ３または−Ｎ（ＣＨ３）２）、アセチル化（例えば、酢酸またはそのハロゲン化誘導体、例えばα−クロロ酢酸、α−ブロモ酢酸またはα−ヨード酢酸による）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）基を加えること、ＲＣＯＯ−によって定義されるカルボキシレート官能基またはＲ−ＳＯ２−によって定義されるスルホニル官能基を含有する任意のブロック基でアミノ末端をブロックすることが含まれ、上式でＲはアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリールなど、および類似の基からなる群から選択される。プロテアーゼへの感受性を低下させるか、ペプチド化合物のコンフォメーションを制限するために、Ｎ末端に（Ｎ末端アミノ基がないように）デスアミノ酸を組み込むこともできる。好ましい実施形態では、Ｎ末端は酢酸または無水酢酸でアセチル化される。
カルボキシ末端の改変には、カルボキサミド基で遊離酸を置換するか、またはカルボキシ末端に環状ラクタムを形成して構造制約を導入することが含まれる。開示されるペプチドを環化するか、またはペプチドの末端にデスアミノまたはデスカルボキシ残基を組み込み得、その結果、末端のアミノ基またはカルボキシル基が存在せず、プロテアーゼへの感受性を低下させるか、ペプチドのコンフォメーションを制限することもできる。開示されるペプチドのＣ末端の官能基には、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシおよびカルボキシ、およびその低級エステル誘導体、およびその薬学的に許容される塩が含まれる。
遺伝的にコードされるアミノ酸（または立体異性体のＤアミノ酸）の天然に存在する側鎖を他の側鎖で、例えばアルキル、低級（Ｃ１〜６）アルキル、環式４−、５−、６−から７員環のアルキル、アミド、アミド低級アルキルアミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびその低級エステル誘導体などの基で、ならびに４−、５−、６−から７員環の複素環式基（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ）で置換することができる。詳細には、プロリン残基の環サイズが５員から４、６または７員に変更されたプロリン類似体を使用することができる。環状基は飽和または不飽和であってよく、不飽和の場合には芳香族または非芳香族であってよい。複素環基は、１つまたは複数の窒素、酸素および／または硫黄のヘテロ原子を好ましくは含有する。そのような基の例には、フラザニル、フリル、イミダゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、モルホリニル（例えばモルホリノ）、オキサゾリル、ピペラジニル（例えば、１−ピペラジニル）、ピペリジル（例えば、１−ピペリジル、ピペリジノ）、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル（例えば、１−ピロリジニル）、ピロリニル、ピロリル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、チオモルホリニル（例えば、チオモルホリノ）およびトリアゾリルが含まれる。これらの複素環基は、置換型もしくは非置換型であってよい。基が置換される場合、置換基はアルキル、アルコキシ、ハロゲン、酸素または置換型もしくは非置換型のフェニルであってよい。
リン酸化および他の方法［例えば、Ｈｒｕｂｙら（１９９０年）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２６８巻：２４９〜２６２頁に記載されているもの］によって、ペプチドを容易に改変することもできる。
開示されるペプチドは、類似した生物学的な活性を有する非ペプチド化合物の構造モデルの役目も果たす。リード物質であるペプチド化合物と同じか類似する所望の生物学的な活性を有するが、溶解性、安定性ならびに加水分解およびタンパク質分解への感受性に関してリード物質よりも好ましい活性を有する化合物を構築するために、様々な技術が利用できることを当業者は認識する［ＭｏｒｇａｎおよびＧａｉｎｏｒ（１９８９年）Ａｎｎ． Ｒｅｐ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．２４巻：２４３〜２５２頁を参照］。これらの技術には、ホスホネート、アミデート、カルバメート、スルホンアミド、二級アミンおよびＮ−メチルアミノ酸で構成される骨格でペプチド骨格を置換することが含まれるが、これに限定されない。
ペプチドに似ているが、天然のペプチド結合を通して接続されていない分子を生成することができる。例えば、アミノ酸またはアミノ酸類似体のための結合には、ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−および−ＣＨＨ２ＳＯ−が含まれてよい（これらおよび他のものは、Ｓｐａｔｏｌａ， Ａ． Ｆ．、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ． Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６７頁（１９８３年）；Ｓｐａｔｏｌａ， Ａ． Ｆ．、Ｖｅｇａ Ｄａｔａ（１９８３年３月）、１巻、３号、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（一般レビュー）；Ｍｏｒｌｅｙ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ（１９８０年）４６３〜４６８頁；Ｈｕｄｓｏｎ， Ｄ．ら、Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔ Ｒｅｓ１４巻：１７７〜１８５頁（１９７９年）（−ＣＨ２ＮＨ−、ＣＨ２ＣＨ２）；ＳｐａｔｏｌａらＬｉｆｅ Ｓｃｉ３８巻：１２４３〜１２４９頁（１９８６年）（−ＣＨ Ｈ２−Ｓ）；Ｈａｎｎ Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ巻３０７〜３１４頁（１９８２年）（−ＣＨ−ＣＨ−、シスおよびトランス）；ＡｌｍｑｕｉｓｔらＪ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．２３巻：１３９２〜１３９８頁（１９８０年）（−ＣＯＣＨ２−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−ＷｈｉｔｅらＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ２３巻：２５３３頁（１９８２年）（−ＣＯＣＨ２−）；Ｓｚｅｌｋｅら欧州出願、ＥＰ４５６６５ＣＡ（１９８２年）：９７巻：３９４０５頁（１９８２年）（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）；ＨｏｌｌａｄａｙらＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ． Ｌｅｔｔ２４巻：４４０１〜４４０４頁（１９８３年）（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−）；およびＨｒｕｂｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ３１巻：１８９〜１９９頁（１９８２年）（−ＣＨ２−Ｓ−）で見られ、その各々は参照により本明細書に組み込まれる）。特に好ましい非ペプチド結合は、−ＣＨ２ＮＨ−である。ペプチド類似体は、β−アラニン、γ−アミノ酪酸などのように、結合原子の間に１つより多い原子を有することができるものと理解される。
別の機能を有する第二のペプチドに融合する血餅結合ペプチドを含有する、二官能性ペプチドも開示される。そのような二官能性ペプチドは、完全長分子の異なる部分によって付与される少なくとも２つの機能を有し、例えば、凝固を強化する能力に加えて、抗血管新生活性またはアポトーシス促進活性を示すことができる。
各々独立してペプチド（例えば、アミノ酸配列番号１、またはその保存的な改変体もしくはペプチド様物質）を含有する少なくとも２つの部分配列を含む、単離された多価ペプチドも開示される。多価ペプチドは、例えば、各々独立してペプチドを含有するそのような部分配列を少なくとも３、少なくとも５または少なくとも１０個有することができる。特定の実施形態では、多価ペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０個の同一であるか同一でない部分配列を有することができる。これは、組成物を含むことができる複数の血餅結合頭基に加えてのものである。さらなる実施形態では、多価ペプチドは、配列番号１の反復配列などの同一の部分配列を含有することができる。さらなる実施形態では、多価ペプチドは連続した同一であるか同一でない部分配列を含有し、それらはいかなる介在アミノ酸によっても分けられていない。
本明細書で用いるように、用語「ペプチド」は、ペプチド、タンパク質、タンパク質の断片などを意味するように広義に用いられる。本明細書で用いる用語「ペプチド様物質」は、それが構造的にベースにしているペプチドの活性を有するペプチド様分子を意味する。そのようなペプチド様物質には化学的に改変されたペプチド、天然に存在しないアミノ酸を含有するペプチド様分子、およびペプトイドが含まれ、ペプチド様物質が由来するペプチドの標的との選択的相互作用などの活性を有する（例えば、ＧｏｏｄｍａｎおよびＲｏ、Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、掲載書「Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」１巻（Ｍ． Ｅ． Ｗｏｌｆｆ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９５年）、８０３〜８６１頁を参照）。
例えば制約されたアミノ酸を含有するペプチド様分子、ペプチド二次構造を模倣する非ペプチド構成成分またはアミド結合アイソスターを含む、様々なペプチド様物質が当技術分野で公知である。制約された、天然に存在しないアミノ酸を含有するペプチド様物質には、例えば、α−メチル化アミノ酸；α，α−ジアルキルグリシンまたはα−アミノシクロアルカンカルボン酸；Ｎα−Ｃα環化アミノ酸；Ｎαメチル化アミノ酸；β−またはγ−アミノシクロアルカンカルボン酸；α，β−不飽和アミノ酸；β，β−ジメチルまたはβ−メチルアミノ酸；β−置換−２，３−メタノアミノ酸；Ｎ−ＣεまたはＣα−ＣΔ環化アミノ酸；置換プロリンまたは別のアミノ酸模倣体が含まれてもよい。ペプチド二次構造を模倣するペプチド様物質は、例えば、非ペプチドβ−ターン模倣剤；γーターン模倣剤；β−シート構造の模倣剤；またはヘリックス構造の模倣剤を含有することができ、その各々は当技術分野で周知である。ペプチド様物質は、例えば、アミド結合アイソスター、例えばレトロ−インベルソ改変；還元アミド結合；メチレンチオエーテルまたはメチレンスルホキシド結合；メチレンエーテル結合；エチレン結合；チオアミド結合；トランスオレフィンまたはフルオロオレフィン結合；１，５−二基置換テトラゾール環；ケトメチレンもしくはフルオロケトメチレン結合、または別のアミドアイソスターを含有するペプチド様分子であってもよい。これらおよび他のペプチド様物質は、本明細書で用いる用語「ペプチド様物質」の意味に包含されると、当業者は理解する。
ペプチド様物質を同定するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、可能なペプチド様物質のライブラリーを含有するデータベースのスクリーニングが含まれる。一例として、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ構造データベースは、既知の結晶構造を有する３００，０００を超える化合物の収集物を含有する（Ａｌｌｅｎら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｑｒ．セクションＢ、３５巻：２３３１頁（１９７９年））。新しい結晶構造が決定されるに従いこの構造保管庫は絶えず更新され、かつ、適する形状、例えば開示されるペプチドと同じ形状、ならびに標的分子への潜在的な幾何的および化学的相補性を有する化合物についてスクリーニングすることができる。ペプチドまたはペプチドに結合する標的分子の結晶構造が利用できない場合、構造は、例えばプログラムＣＯＮＣＯＲＤ（Ｒｕｓｉｎｋｏら、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｆ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｓｃｉ．２９巻：２５１頁（１９８９年））を用いて生成することができる。別のデータベース、Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ Ｃａｌｉｆ．）は、市販されており、例えば癌性の細胞と選択的に相互作用する活性を有するペプチドの可能なペプチド様物質を同定するために検索することができる、約１００，０００個の化合物を含有する。
ａ．ホーミングペプチド
凝固血漿タンパク質に向かうペプチドのいくつかの例が当技術分野にある。例には、ＲＥＫ、ＲＥＫを含むペプチド、ＣＲＥＫＡ（配列番号１）、およびＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含むペプチドが含まれる。アミノ酸セグメントは、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）またはその保存的な改変体を含むアミノ酸セグメント、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含むアミノ酸セグメント、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなるアミノ酸セグメント、およびアミノ酸配列ＲＥＫからなるアミノ酸セグメントより独立して選択することもできる。アミノ酸セグメントは、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）またはその保存的な改変体を各々独立して含むことができる。
アミノ酸セグメントは、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を各々独立して含むこともできる。アミノ酸セグメントは、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなることもできる。アミノ酸セグメントは、アミノ酸配列ＲＥＫからなることができる。
ｂ．フィブリン結合ペプチド
血餅結合頭基は、フィブリン結合ペプチド（ＦＢＰ）を含むこともできる。フィブリン結合ペプチドの例は、当技術分野で公知である（Ｖａｎ Ｒｏｏｉｊｅｎ Ｎ、Ｓａｎｄｅｒｓ Ａ（１９９４年）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ１７４巻：８３〜９３頁；Ｍｏｇｈｉｍｉ ＳＭ、Ｈｕｎｔｅｒ ＡＣ、Ｍｕｒｒａｙ ＪＣ（２００１年）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ５３巻：２８３〜３１８頁；米国特許第５，７９２，７４２号、全てはフィブリン結合ペプチドに関するそれらの教示について参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
ｃ．他の血餅結合ペプチド
血餅結合ペプチドは、フィブリン以外のタンパク質に結合することもできる。例には、血餅に組み込まれたフィブロネクチンに結合するペプチドが含まれる（Ｐｉｌｃｈら、（２００６年）ＰＮＡＳ、１０３巻：２８００〜２８０４頁、血餅結合ペプチドに関するその教示についてその全体が本明細書に組み込まれる）。血餅結合ペプチドの例には、ＣＧＬＩＩＱＫＮＥＣ（ＣＬＴ１、配列番号２）およびＣＮＡＧＥＳＳＫＮＣ（ＣＬＴ２、配列番号３）が含まれるが、これらに限定されない。アミノ酸セグメントは、アミノ酸配列ＣＬＴ１もしくはＣＬＴ２（配列番号２もしくは３）またはその保存的な改変体を含むアミノ酸セグメント、アミノ酸配列ＣＬＴ１もしくはＣＬＴ２（配列番号２もしくは３）を含むアミノ酸セグメント、またはアミノ酸配列ＣＬＴ１もしくはＣＬＴ２（配列番号２もしくは３）からなるアミノ酸セグメントより独立して選択することもできる。アミノ酸セグメントは、アミノ酸配列ＣＬＴ１またはＣＬＴ２（配列番号２または３）またはその保存的な改変体を各々独立して含むことができる。
アミノ酸セグメントは、アミノ酸配列ＣＬＴ１またはＣＬＴ２（配列番号２または３）を各々独立して含むこともできる。アミノ酸セグメントは、アミノ酸配列ＣＬＴ１またはＣＬＴ２（配列番号２または３）からなることもできる。
ｉｉ．血餅結合抗体
血餅結合頭基は、血餅結合抗体を含むことができる。血餅結合抗体の例は、当技術分野で公知である（ＨｏｌｖｏｅｔらＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８７巻、１００７〜１０１６頁、１９９３年；ＢｏｄｅらＪ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６４巻、２号、９４４〜９４８頁、１９８９年１月；ＨｕａｎｇらＳｃｉｅｎｃｅ１９９７年：２７５巻、５２９９号、５４７〜５５０頁、その全ては血餅結合抗体に関するそれらの教示について参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
用語「抗体」は本明細書で広義に用いられ、ポリクローナルおよびモノクローナルの両抗体を含む。完全な免疫グロブリン分子に加えて、用語「抗体」には、血餅に結合するかさもなければ相互作用する能力に関してそれらが選択される限り、それらの免疫グロブリン分子の断片またはポリマー、および免疫グロブリン分子またはその断片のヒトのまたはヒト化バージョンも含まれる。抗体は、本明細書に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いて、または類似した方法によってそれらの所望の活性について試験することができ、その後それらのｉｎ ｖｉｖｏでの治療的および／または予防的活性が公知の臨床試験方法によって試験される。
本明細書で用いる用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団中の個々の抗体は、抗体分子の小さなサブセットに存在するかもしれない可能な天然に存在する突然変異を除いて同一である。本明細書で、モノクローナル抗体には、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一であるか相同的であり、鎖（複数可）の残りは、別の種に由来するか別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一であるか相同的である「キメラ」抗体、ならびに、それらが所望の拮抗活性を示す限りそのような抗体の断片が具体的に含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８１巻：６８５１〜６８５５頁（１９８４年）を参照）。
開示されるモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を生成する任意の手法を用いて作製することができる。例えば、開示されるモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁（１９７５年）に記載されるものなどのハイブリドーマ法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法では、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するか生成することが可能なリンパ球を導き出すために、マウスまたは他の適当な宿主動物が免疫化剤で一般的に免疫化される。あるいは、リンパ球は、例えば本明細書に記載されるＨＩＶＥｎｖ−ＣＤ４コレセプター複合体を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化することができる。
モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙら）に記載されるものなどの組換えＤＮＡ法によって作製することもできる。開示されるモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）、容易に単離し、配列決定をすることができる。抗体または活性な抗体断片のライブラリーは、例えばＢｕｒｔｏｎらへの米国特許第５，８０４，４４０号およびＢａｒｂａｓらへの米国特許第６，０９６，４４１号に記載のようなファージディスプレイ技術を用いて生成し、スクリーニングすることもできる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法も、一価抗体を調製するために適する。その断片、特にＦａｂ断片を生成するための抗体の消化は、当技術分野で公知である慣用的な技術を用いて達成することができる。例えば、パパインを用いて消化を実施することができる。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日に公開された国際公開第９４／２９３４８号および米国特許第４，３４２，５６６号に記載される。抗体のパパイン消化は、Ｆａｂ断片と呼ばれている２つの同一の抗原結合断片を一般に生成し、それぞれ単一の抗原結合部位および残りのＦｃ断片を有する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、抗原を架橋することがなお可能である断片を与える。
断片は、抗体または抗体断片の活性が非改変抗体または抗体断片と比較して有意に変更されないか損なわれないならば、他の配列に結合しているかどうかにかかわらず、特定の領域または特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換または他の選択される改変を含むこともできる。これらの改変は、ジスルフィド結合が可能なアミノ酸を除去／追加するために、その生体寿命を増加させるために、その分泌性特性を変更するためなどのために、多少のさらなる特性を提供することができる。いずれの場合も、抗体または抗体断片は、その同族抗原への特異的結合などの生体活性特性を有しなければならない。抗体または抗体断片の機能的領域または活性領域は、タンパク質の特定の領域の変異誘発と、続く発現および発現したポリペプチドの試験によって同定することができる。そのような方法は当技術分野の技術者に容易に明らかであり、抗体または抗体断片をコードする核酸の部位特異的変異誘発を含むことができる（Ｚｏｌｌｅｒ， Ｍ．Ｊ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３巻：３４８〜３５４頁（１９９２年））。
本明細書で用いるように、用語「抗体」または「複数の抗体」は、ヒト抗体および／またはヒト化抗体を指すこともできる。多くのヒト以外の抗体（例えば、マウス、ラットまたはウサギに由来するもの）は、ヒトに本来抗原性であり、したがってヒトに投与されると望ましくない免疫応答を引き起こすことができる。したがって、この方法でのヒト抗体またはヒト化抗体の使用は、ヒトに投与される抗体が望ましくない免疫応答を惹起する可能性を少なくする役目を果たす。
ヒト抗体は、任意の技術を用いて調製することができる。ヒトモノクローナル抗体生成技術の例には、Ｃｏｌｅら（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ、７７頁、１９８５年）およびＢｏｅｒｎｅｒら（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻（１号）：８６〜９５頁、１９９１年）によって記載されるものが含まれる。ヒト抗体（およびその断片）は、ファージディスプレイライブラリーを用いて生成することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２７巻：３８１頁、１９９１年；Ｍａｒｋｓら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１頁、１９９１年）。
ヒト抗体は、トランスジェニック動物から得ることもできる。例えば、免疫化に応じてヒト抗体の完全なレパートリーを生成することが可能であるトランスジェニックの変異体マウスが記載されている（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻：２５５１〜２５５頁（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻：２５５〜２５８頁（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７巻：３３頁（１９９３年）を参照）。具体的には、これらのキメラおよび生殖細胞系変異体マウスでの抗体重鎖連結領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合の欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらし、そのような生殖細胞系変異体マウスへのヒト生殖細胞系抗体遺伝子アレイの成功裏の導入は、抗原投与後のヒト抗体の生成をもたらす。本明細書に記載されるＥｎｖ−ＣＤ４コレセプター複合体を用いて、所望の活性を有する抗体が選択される。
抗体ヒト化技術は、抗体分子の１つまたは複数のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作するために、組換えＤＮＡ技術の使用を一般に含む。したがって、ヒト以外の抗体（またはその断片）のヒト化形は、ヒト（レシピエント）抗体のフレームワークに組み込まれたヒト以外の（ドナー）抗体からの抗原結合部位の一部を含有するキメラ抗体または抗体鎖（またはその断片、例えば抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’または他の抗原結合性部分）である。
ヒト化抗体を生成するために、レシピエント（ヒト）抗体分子の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の抗原結合特性（例えば、標的抗原に対する特定のレベルの特異性および親和性）を有することが知られているドナー（ヒト以外の）抗体分子の１つまたは複数のＣＤＲからの残基によって置換される。場合によっては、ヒト抗体のＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基は、対応するヒト以外の残基によって置換される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含有することもできる。一般に、ヒト化抗体は、ヒト以外の供与源からそれに導入される１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。実際には、一般的に、ヒト化抗体は、一部のＣＤＲ残基およびおそらく一部のＦＲ残基が齧歯動物の抗体の類似部位からの残基によって置換されるヒト抗体である。ヒト化抗体は、抗体定常領域（Ｆｃ）、一般にヒト抗体のそれの少なくとも一部を一般に含有する（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２７頁（１９８８年）、およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．、２巻：５９３〜５９６頁（１９９２年））。
ヒト以外の抗体をヒト化する方法は、当技術分野で周知である。例えば、ヒト化抗体は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２７頁（１９８８年）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁（１９８８年））に従って、齧歯動物のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応配列に置換することによって生成することができる。ヒト化抗体を生成するために用いることができる方法は、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙら）、米国特許第５，５６５，３３２号（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら）、米国特許第５，７２１，３６７号（Ｋａｙら）、米国特許第５，８３７，２４３号（Ｄｅｏら）、米国特許第５，９３９，５９８号（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら）、米国特許第６，１３０，３６４号（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら）および米国特許第６，１８０，３７７号（Ｍｏｒｇａｎら）にも記載される。
ｉｉｉ．小有機分子
血餅結合頭基は、小有機分子であってもよい。血餅と相互作用するか結合することが可能である小有機分子が、当技術分野で公知である。これらの分子は、コンビナトリアルケミストリーなどの、当技術分野で公知の方法によって同定することもできる。小有機分子の一部の形は、１０００ダルトン未満の分子量を有する有機分子であってよい。
コンビナトリアルケミストリーには、それらに限定されないが、例えば血餅、フィブリンもしくはフィブロネクチンなどの血餅と関連する分子、または凝固血漿タンパク質と相互作用することが可能な小分子を単離するための全ての方法が含まれる。分子の大きなプールを合成し、その複合混合物をなんらかの選択および濃縮過程、例えば血餅との相互作用の検出にさらす。
当業者に周知の方法を様々なコンビナトリアルライブラリーと一緒に用いて、所望の標的に結合するかそれと相互作用する小分子を単離して、特徴付けることができる。当業者に周知である競合的結合試験を用いることによって、これらの化合物の相対的な結合親和性を比較し、最適な化合物を同定することができる。例えば、ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を用いる競合的結合試験を用いることができる。
所望の標的に結合する分子を単離するためにコンビナトリアルライブラリーを作製し、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする技術は、当業者に周知である。代表的な技術および方法は、それらに限定されないが、米国特許第５，０８４，８２４号、５，２８８，５１４号、５，４４９，７５４号、５，５０６，３３７号、５，５３９，０８３号、５，５４５，５６８号、５，５５６，７６２号、５，５６５，３２４号、５，５６５，３３２号、５，５７３，９０５号、５，６１８，８２５号、５，６１９，６８０号、５，６２７，２１０号、５，６４６，２８５号、５，６６３，０４６号、５，６７０，３２６号、５，６７７，１９５号、５，６８３，８９９号、５，６８８，６９６号、５，６８８，９９７号、５，６９８，６８５号、５，７１２，１４６号、５，７２１，０９９号、５，７２３，５９８号、５，７４１，７１３号、５，７９２，４３１号、５，８０７，６８３号、５，８０７，７５４号、５，８２１，１３０号、５，８３１，０１４号、５，８３４，１９５号、５，８３４，３１８号、５，８３４，５８８号、５，８４０，５００号、５，８４７，１５０号、５，８５６，１０７号、５，８５６，４９６号、５，８５９，１９０号、５，８６４，０１０号、５，８７４，４４３号、５，８７７，２１４号、５，８８０，９７２号、５，８８６，１２６号、５，８８６，１２７号、５，８９１，７３７号、５，９１６，８９９号、５，９１９，９５５号、５，９２５，５２７号、５，９３９，２６８号、５，９４２，３８７号、５，９４５，０７０号、５，９４８，６９６号、５，９５８，７０２号、５，９５８，７９２号、５，９６２，３３７号、５，９６５，７１９号、５，９７２，７１９号、５，９７６，８９４号、５，９８０，７０４号、５，９８５，３５６号、５，９９９，０８６号、６，００１，５７９号、６，００４，６１７号、６，００８，３２１号、６，０１７，７６８号、６，０２５，３７１号、６，０３０，９１７号、６，０４０，１９３号、６，０４５，６７１号、６，０４５，７５５号、６，０６０，５９６号および６，０６１，６３６号に見出すことができる。
いくつかの異なる合成技法を用いて、広範な分子からコンビナトリアルライブラリーを作製することができる。例えば、縮合２，４−ピリミジンジオン（米国特許第６，０２５，３７１号）ジヒドロベンゾピラン（米国特許第６，０１７，７６８号および５，８２１，１３０号）、アミドアルコール（米国特許第５，９７６，８９４号）、ヒドロキシアミノ酸アミド（米国特許第５，９７２，７１９号）炭水化物（米国特許第５，９６５，７１９号）、１，４−ベンゾジアゼピン−２，５−ジオン（米国特許第５，９６２，３３７号）、環式化合物（ｃｙｃｌｉｃ）（米国特許第５，９５８，７９２号）、ビアリールアミノ酸アミド（米国特許第５，９４８，６９６号）、チオフェン（米国特許第５，９４２，３８７号）、三環系テトラヒドロキノリン（米国特許第５，９２５，５２７号）、ベンゾフラン（米国特許第５，９１９，９５５号）、イソキノリン（米国特許第５，９１６，８９９号）、ヒダントインおよびチオヒダントイン（米国特許第５，８５９，１９０号）、インドール（米国特許第５，８５６，４９６号）、イミダゾール−ピリド−インドールおよびイミダゾール−ピリド−ベンゾチオフェン（米国特許第５，８５６，１０７号）置換２−メチレン−２，３−ジヒドロチアゾール（米国特許第５，８４７，１５０号）、キノリン（米国特許第５，８４０，５００号）、ＰＮＡ（米国特許第５，８３１，０１４号）、含有タグ（米国特許第５，７２１，０９９号）、ポリケチド（米国特許第５，７１２，１４６号）、モルホリノ−サブユニット（米国特許第５，６９８，６８５号および５，５０６，３３７号）、スルファミド（米国特許第５，６１８，８２５号）およびベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）を含有するライブラリー。
本明細書で用いるように、コンビナトリアル法およびライブラリーには、伝統的なスクリーニングの方法およびライブラリー、ならびに反復過程で用いられた方法およびライブラリーが含まれた。
小有機分子のライブラリーは、少なくとも２つの有機化合物、多くの場合少なくとも約２５、１００、５００個の異なる有機化合物、より普通には少なくとも約１０００個の異なる有機化合物、好ましくは少なくとも約２５００個の異なる有機化合物、より好ましくは少なくとも約５０００個の異なる有機化合物、最も好ましくは少なくとも約１０，０００個またはそれ以上の異なる有機化合物を一般に含む。ライブラリーの各個々の分子がライブラリーの他の分子から空間的に分離されるように（例えば、ライブラリーの各メンバーは別々のマイクロタイターウェルに存在する）、またはデコンボリューションのための方法が容易に利用できるならばライブラリーの２メンバー以上が組み合わされるように、ライブラリーを選択または構築することができる。有機化合物のライブラリーが調製される方法は、重要でない。
２．処置頭基
頭基は、処置頭基であってよい。本明細書で用いるように、用語「処置頭基」は、正常または病的な組織で１つまたは複数の生物学的な活性を有する分子を意味する。様々な処置頭基を、頭基として用いることができる。
一部の実施形態では、処置頭基は、癌化学療法剤であってよい。本明細書で用いるように、「癌化学療法剤」は、癌細胞の増殖、成長、寿命または転移活性を阻害する化学薬剤である。そのような癌化学療法剤は、限定されずに、ドセタキセルなどのタキサン；ドキソルビシンなどのアントラサイクリン；アルキル化剤；ビンカアルカロイド；代謝拮抗物質；シスプラチンまたはカルボプラチンなどの白金剤；メトトレキセートなどのステロイド；アドリアマイシンなどの抗生物質；イソファミド（ｉｓｏｆａｍｉｄｅ）；または選択的なエストロゲン受容体モジュレーター；トラスツズマブなどの抗体であってよい。
タキサンは、本明細書で開示される組成物で有用な化学療法剤である。有用なタキサンには、限定されずにドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ；Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．；Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．））およびパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ；Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）が含まれる。例えば、Ｃｈａｎら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．１７巻：２３４１〜２３５４頁（１９９９年）およびＰａｒｉｄａｅｎｓら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．１８巻：７２４頁（２０００年）を参照。
本明細書で開示される組成物で有用な癌化学療法剤は、ドキソルビシン、イダルビシンまたはダウノルビシンなどのアントラサイクリンであってもよい。ドキソルビシンは一般に用いられる癌化学療法剤であり、例えば乳癌の処置に役立つことができる（ＳｔｅｗａｒｔおよびＲａｔａｉｎ、掲載書「Ｃａｎｃｅｒ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ」第５版、１９章（Ｄｅ Ｖｉｔａ， Ｊｒ．ら編、Ｊ． Ｐ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ１９９７年）；Ｈａｒｒｉｓら、掲載書「Ｃａｎｃｅｒ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ」、上記、１９９７年）。さらに、ドキソルビシンは抗血管新生活性を有し（Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１５巻：５１０頁（１９９７年）；Ｓｔｅｉｎｅｒ、掲載書「Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ： Ｋｅｙ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ−Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、４４９〜４５４頁（Ｓｔｅｉｎｅｒら編、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、１９９２年））、それは癌の処置でのその効果に寄与することができる。
メルファランまたはクロラムブシルなどのアルキル化剤も、有用な癌化学療法剤であり得る。同様に、ビンデシン、ビンブラスチンもしくはビノレルビンなどのビンカアルカロイド；または５−フルオロウラシル、５−フルオロウリジンなどの代謝拮抗物質もしくはその誘導体は、有用な癌化学療法剤であり得る。
白金剤も、有用な癌化学療法剤であり得る。例えば、そのような白金剤は、例えばＣｒｏｗｎ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２８巻：２８〜３７頁（２００１年）に記載されるように、シスプラチンまたはカルボプラチンであってよい。他の有用な癌化学療法剤には、メトトレキセート、マイトマイシンＣ、アドリアマイシン、イホスファミドおよびアンサマイシンが含まれるが、これらに限定されない。
乳癌および他のホルモン依存性の癌の処置に有用な癌化学療法剤は、エストロゲンの作用に拮抗する剤、例えば選択的なエストロゲン受容体モジュレーターまたは抗エストロゲン剤であってもよい。選択的なエストロゲン受容体モジュレーターであるタモキシフェンは、乳癌の処置のための組成物で用いることができる癌化学療法剤である（Ｆｉｓｈｅｒら、Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ ｌｎｓｔｉｔ．９０巻：１３７１〜１３８８頁（１９９８年））。
処置頭基は、ヒト化モノクローナル抗体などの抗体であってよい。一例として、抗表皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）抗体であるトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．）は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現する乳癌を処置するために有用な処置頭基になることができる（Ｗｈｉｔｅら、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｍｅｄ．５２巻：１２５〜１４１頁（２００１年））。
有用な処置頭基は細胞傷害剤であってもよく、それは、本明細書で用いるように、細胞死を直接または間接的に促進する任意の分子であってよい。有用な細胞傷害剤には、小分子、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド様物質、核酸分子、細胞およびウイルスが含まれるが、これらに限定されない。非限定例として、有用な細胞傷害剤には、ドキソルビシン、ドセタキセルまたはトラスツズマブなどの細胞傷害性小分子；下でさらに記載されるものなどの抗菌性ペプチド；カスパーゼおよび毒素などのアポトーシス促進ポリペプチド、例えばカスパーゼ８；ジフテリア毒素Ａ鎖、シュードモナス外毒素Ａ、コレラトキシン、リガンド融合毒素、例えばＤＡＢ３８９ＥＧＦ、ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ毒素（リシン）；ならびに細胞傷害性Ｔ細胞などの細胞傷害性細胞が含まれる。例えば、Ｍａｒｔｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０巻：３２１８〜３２２４頁（２０００年）、ＫｒｅｉｔｍａｎおよびＰａｓｔａｎ、Ｂｌｏｏｄ９０巻：２５２〜２５９頁（１９９７年）、Ａｌｌａｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７巻：２６１５〜２６１８頁（１９９７年）およびＯｓｂｏｒｎｅおよびＣｏｒｏｎａｄｏ−Ｈｅｉｎｓｏｈｎ、Ｃａｎｃｅｒ Ｊ． Ｓｃｉ． Ａｍ．２巻：１７５頁（１９９６年）を参照。本明細書に記載されるか、当技術分野で公知であるこれらのおよびさらなる細胞傷害剤は、開示される組成物および方法において有用であり得ることを当業者は理解する。
一実施形態では、処置頭基は、治療的ポリペプチドであってよい。本明細書で用いるように、治療的ポリペプチドは、生物学的に有用な機能を有する任意のポリペプチドであってよい。有用な治療的ポリペプチドは、限定されずに、サイトカイン、抗体、細胞傷害性ポリペプチド；アポトーシス促進ポリペプチド；および抗血管新生ポリペプチドを包含する。非限定例として、有用な治療的ポリペプチドは、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）；インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、リンホタクチン（ＬＴＮ）または樹状細胞ケモカイン１（ＤＣ−ＣＫ１）などのサイトカイン；抗ＨＥＲ２抗体またはその断片；毒素またはカスパーゼを含む細胞傷害性ポリペプチド、例えばジフテリア毒素Ａ鎖、シュードモナス外毒素Ａ、コレラトキシン、リガンド融合毒素、例えばＤＡＢ３８９ＥＧＦもしくはリシン；またはアンギオスタチン、エンドスタチン、トロンボスポンジン、血小板第４因子などの抗血管新生ポリペプチド；アナステリン；または本明細書でさらに記載されるか、当技術分野で公知であるもの（下記参照）の１つであってよい。生物学的な活性を有するこれらのおよび他のポリペプチドは、「治療的ポリペプチド」であってよいものと理解される。
処置頭基は、抗血管新生剤であってもよい。本明細書で用いるように、用語「抗血管新生剤」は、血管の成長および発達である血管新生を低減または阻止する分子を意味する。慣用される方法によって、様々な抗血管新生剤を調製することができる。そのような抗血管新生剤には、限定されずに、小分子；血管新生因子、転写因子および抗体のドミナントネガティブ形などのタンパク質；ペプチド；ならびに、例えば、血管新生因子および受容体、転写因子および抗体およびその抗原結合性断片のドミナントネガティブ形をコードするリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび核酸分子を含む核酸分子が含まれる。例えば、ＨａｇｅｄｏｒｎおよびＢｉｋｆａｌｖｉ、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｏｎｃｏｌ． Ｈｅｍａｔｏｌ．３４巻：８９〜１１０頁（２０００年）およびＫｉｒｓｃｈら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．５０巻：１４９〜１６３頁（２０００年）を参照。
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、ｉｎ ｖｉｖｏでの乳癌血管新生を含む、多くの種類の癌での血管新生にとって重要であることが示された（Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９巻：４２１３〜４２１４頁（１９９９年））。ＶＥＧＦの生物学的作用には、内皮細胞の増殖、生存、移動および管形成の刺激ならびに血管透過性の調節が含まれる。抗血管新生剤は、例えば、ＶＥＧＦまたは別の血管新生因子の発現またはシグナル伝達を低減する阻害剤または中和抗体、例えば抗ＶＥＧＦ中和モノクローナル抗体であってよい（Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍら、上記、１９９９年）。抗血管新生剤は、別の血管新生因子、例えばＦＧＦ−１（酸性）、ＦＧＦ−２（塩基性）、ＦＧＦ−４またはＦＧＦ−５などの線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバー（Ｓｌａｖｉｎら、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． Ｉｎｔ．１９巻：４３１〜４４４頁（１９９５年）、ＦｏｌｋｍａｎおよびＳｈｉｎｇ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２６７巻：１０９３１〜１０９３４頁（１９９２年））または内皮細胞特異的Ｔｉｅ２受容体チロシンキナーゼを通してシグナル伝達する因子であるアンギオポエチン１などの血管新生因子（Ｄａｖｉｓら、Ｃｅｌｌ８７巻：１１６１〜１１６９頁（１９９６年）およびＳｕｒｉら、Ｃｅｌｌ８７巻：１１７１〜１１８０頁（１９９６年））、またはこれらの血管新生因子の１つの受容体を阻害することができる。それらに限定されないが、受容体結合の直接的な阻害、細胞外間隙への血管新生因子の分泌を低減することによる間接的な阻害、または血管新生因子の発現、機能もしくはシグナル伝達の阻害を含む、血管新生因子の活性を阻害するために、様々な機構が作用することができるものと理解される。
それらに限定されないが、アンギオスタチン；アンギオスタチンのクリングルペプチド；エンドスタチン；アナステリン、フィブロネクチンのヘパリン結合断片；抗トロンビンの改変形；コラゲナーゼ阻害剤；基底膜ターンオーバー阻害剤；血管新生抑制ステロイド（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｒｏｉｄ）；血小板第４因子ならびにその断片およびペプチド；トロンボスポンジンならびにその断片およびそのペプチド；ならびにドキソルビシンを含む様々な他の分子も、抗血管新生剤として機能することができる（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅｌｌ７９巻：３１５〜３２８頁（１９９４年））；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅｌｌ８８巻：２７７〜２８５頁（１９９７年）；Ｈｏｍａｎｄｂｅｒｇら、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈ．１２０巻：３２７〜３３２頁（１９８５年）；Ｈｏｍａｎｄｂｅｒｇら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ８７４巻：６１〜７１頁（１９８６年）；およびＯ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５巻：１９２６〜１９２８頁（１９９９年））。市販の抗血管新生剤には、例えば、アンギオスタチン、エンドスタチン、メタスタチンおよび２ＭＥ２（ＥｎｔｒｅＭｅｄ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）；Ａｖａｓｔｉｎ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．）などの抗ＶＥＧＦ抗体；ならびにＶＥＧＦＲ−２阻害剤、例えばＳＵ５４１６、ＶＥＧＦＲ−２の小分子阻害剤（ＳＵＧＥＮ；Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．）およびＳＵ６６６８（ＳＵＧＥＮ）、ＶＥＧＦＲ−２の小分子阻害剤、血小板由来成長因子および線維芽細胞成長因子Ｉ受容体が含まれる。これらのおよび他の抗血管新生剤は慣用される方法によって調製することができ、本明細書で用いられる用語「抗血管新生剤」に包含されるものと理解される。
本明細書で開示される組成物は、炎症部位または損傷部位で用いることもできる。この目的のために有用な頭基には、炎症を予防する抗炎症剤、組織増殖を予防する再狭窄予防薬、血栓の形成を阻害または制御する抗血栓形成薬または血栓溶解剤、および組織増殖を調節し、組織の治癒を強化する生体活性剤を含むいくつかの塩基性基（ｂａｓｉｃ ｇｒｏｕｐ）に属する処置頭基が含まれてもよい。有用な処置頭基の例には、それらに限定されないが、ステロイド、フィブロネクチン、抗凝固薬、抗血小板機能薬、血管内壁上の平滑筋細胞の増殖を予防する薬剤、ヘパリン、ヘパリン断片、アスピリン、クマジン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、ヒルジン、ストレプトキナーゼ、増殖抑制薬（ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）（メトトレキセート、シスプラチン、フルオロウラシル、アドリアマイシン）、抗酸化剤（アスコルビン酸、ベータカロチン、ビタミンＥ）、代謝拮抗物質、トロンボキサン阻害剤、非ステロイド系およびステロイド系抗炎症薬、ベータおよびカルシウムチャネル遮断薬、ＤＮＡおよびＲＮＡ断片を含む遺伝物質、完全発現遺伝子、抗体、リンホカイン、増殖因子、プロスタグランジン、ロイコトリエン、ラミニン、エラスチン、コラーゲンおよびインテグリンが含まれる。
有用な処置頭基は、抗菌性ペプチドであってもよい。これは、創傷または他の感染部位を標的化するために特に有用となることができる。したがって、例えば、抗菌性ペプチドを含む頭基も開示され、そこで、組成物は選択的に内在化されて標的領域への高い毒性を示す。有用な抗菌性ペプチドは、組成物に組み込まれないときには低い哺乳動物細胞毒性を有することができる。本明細書で用いるように、用語「抗菌性ペプチド」は、１つまたは複数の微生物を死滅させるかその増殖を遅延させる能力である抗菌活性を有する、天然に存在するかまたは合成のペプチドを意味する。抗菌性ペプチドは、例えば、グラム陽性菌またはグラム陰性菌を含む細菌、または真菌類または原生動物の１つまたは複数の株を死滅させるかその増殖を遅延させることができる。したがって、例えば、抗菌性ペプチドは、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの１つまたは複数の株に対して、静菌活性または殺菌活性を有することができる。以下によって拘束されることを望まないが、自己集合の結果として膜二重層を通してイオンチャネルを形成する能力のために、抗菌性ペプチドは生物学的な活性を有することができる。
抗菌性ペプチドは一般的に非常に塩基性であり、線形または環式の構造を有することができる。さらに下で議論されるように、抗菌性ペプチドは、両親媒性αヘリックス構造を有することができる（米国特許第５，７８９，５４２号、Ｊａｖａｄｐｏｕｒら、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．３９巻：３１０７〜３１１３頁（１９９６年）およびＢｌｏｎｄｅｌｌｅおよびＨｏｕｇｈｔｅｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１巻：１２６８８〜１２６９４頁（１９９２年）を参照）。抗菌性ペプチドは、例えば、Ｍａｎｃｈｅｎｏら、Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．５１巻：１４２〜１４８頁（１９９８年）に記載のようにβストランド／シート形成ペプチドであってもよい。
抗菌性ペプチドは、天然に存在するかまたは合成のペプチドであってよい。天然に存在する抗菌性ペプチドは、細菌、昆虫、両生類および哺乳動物などの生物学的な供給源から単離され、宿主生物体を細菌感染から保護することができる誘導可能な防御タンパク質を表すと考えられる。天然に存在する抗菌性ペプチドには、グラミシジン、マガイニン、メリチン、デフェンシンおよびセクロピンが含まれる（例えば、ＭａｌｏｙおよびＫａｒｉ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ３７巻：１０５〜１２２頁（１９９５年）、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｂｒａｖｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．３０２巻：５３５〜５３８頁（１９９４年）、Ｂｅｓｓａｌｌｅら、ＦＥＢＳ２７４巻：１５１〜１５５頁（１９９０年）、およびＢｌｏｎｄｅｌｌｅおよびＨｏｕｇｈｔｅｎ、掲載書Ｂｒｉｓｔｏｌ編、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１５９〜１６８頁Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏを参照）。抗菌性ペプチドは、天然のペプチド、特に両親媒性を保持または強化するものの類似体であってもよい（下記参照）。
本明細書で開示される組成物に組み込まれる抗菌性ペプチドは、組成物に連結されると低い哺乳動物細胞毒性を有することができる。哺乳動物細胞毒性は、慣用されるアッセイを用いて容易に評価することができる。一例として、哺乳動物細胞毒性は、Ｊａｖａｄｐｏｕｒら、上記、１９９６年に記載されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト赤血球の溶解によってアッセイすることができる。低い哺乳動物細胞毒性を有する抗菌性ペプチドは、ヒト赤血球に溶解性でないか、溶解活性のために１００μＭを超える濃度、好ましくは２００、３００、５００または１０００μＭ を超える濃度を必要とする。
一実施形態では、真核生物の細胞によって内在化されるとき、抗菌性ペプチド部分がミトコンドリア膜の破壊を促進する組成物が開示される。詳細には、そのような抗菌性ペプチドは、真核生物の膜と比較してミトコンドリアの膜を優先的に破壊する。ミトコンドリア膜は、細菌の膜のように、しかし真核生物の原形質膜と対照的に、高含量の負に荷電したリン脂質を有する。例えばミトコンドリアの膨潤のためのアッセイまたは当技術分野で周知である別のアッセイを用いて、ミトコンドリア膜を破壊する活性について抗菌性ペプチドをアッセイすることができる。
例えば５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、１０μＭまたはそれ以下でミトコンドリアの膨潤を有意に誘導する抗菌性ペプチドは、ミトコンドリア膜の破壊を促進するペプチドとみなされる。
抗菌性ペプチドは希釈水溶液でランダムコイルコンフォメーションを一般に有するが、それでも、ヘリックス促進溶媒および両親媒性媒体、例えばミセル、合成二重層または細胞膜によって、なお高いレベルのヘリシティ（ｈｅｌｉｃｉｔｙ）を誘導することができる。αヘリックス構造は当技術分野で周知であり、理想的なαヘリックスは１ターンにつき３．６残基および１残基につき１．５Åの並進（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）を有することを特徴とする（１ターンにつき５．４Å、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｗ． Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４年）を参照）。両親媒性αヘリックス構造では、ペプチドをヘリックス軸に沿って見たとき、極性アミノ酸残基および無極性アミノ酸残基は両親媒性ヘリックスに整列し、それは、疎水性アミノ酸残基が主に１つの面にあり、親水性残基が主に反対側の面にあるα−ヘリックスである。
共通の特徴として両親媒性αヘリックス構造を共有する、大きく異なる配列の抗菌性ペプチドが単離されている（Ｓａｂｅｒｗａｌら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ１１９７巻：１０９〜１３１頁（１９９４年））。両親媒性およびヘリシティを強化することが予測されるアミノ酸置換を有する天然ペプチドの類似体は、抗菌活性を一般的に増加させた。一般に、増加した抗菌活性を有する類似体は、哺乳動物細胞に対して増加した細胞傷害性も有する（Ｍａｌｏｙら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ３７巻：１０５〜１２２頁（１９９５年））。
抗菌性ペプチドに関して本明細書で用いるように、用語「両親媒性αヘリックス構造」は、生理的ｐＨでいくつかの極性残基を含有する親水面および無極性残基を含有する疎水面を有するα−ヘリックスを意味する。極性残基は、例えばリジンまたはアルギニン残基であってよく、無極性残基は、例えばロイシンまたはアラニン残基であってよい。両親媒性アルファヘリックス構造を有する抗菌性ペプチドは、中性ｐＨでペプチドに全体的な正電荷を与えるために、両親媒性ドメイン中に同等数の極性の残基および無極性の残基ならびに十分な数の塩基性残基を一般に有する（Ｓａｂｅｒｗａｌら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ１１９７巻：１０９〜１３１頁（１９９４年））。当業者は、ロイシンおよびアラニンなどのヘリックス促進アミノ酸が抗菌性ペプチドに有利に含まれてよいことを理解する（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、上記、１９８４年を参照）。両親媒性αヘリックス構造を有する合成の抗菌性ペプチドは、例えばＭｃＬａｕｇｈｌｉｎおよびＢｅｃｋｅｒへの米国特許第５，７８９，５４２号に記載のように当技術分野で公知である。
これらのおよび他の剤が有用な処置頭基であり、それらは開示される組成物および方法で別々に、または一緒に用いることができることは、医療腫瘍学の当業者に理解されている。したがって、本明細書で開示される組成物は、そのような処置頭基の１つまたは複数を含有することができ、所望により、さらなる構成成分が組成物の一部として含まれてもよいものと理解される。非限定例として、場合により、血餅結合頭基と処置頭基との間のオリゴペプチドスペーサーを利用することが望ましいかもしれない（ＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋおよびＧａｒｎｅｔｔ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１０巻：１〜９頁（１９９５年））。
他の有用な剤には、血栓溶解剤、アスピリン、抗凝血物質、鎮痛剤および精神安定剤、ベータ遮断薬、ＡＣＥ阻害剤、硝酸塩、リズム安定薬（ｒｈｙｔｈｍ−ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｄｒｕｇ）および利尿剤が含まれる。心臓発作の数時間以内に与えられるならば、心臓への損傷を制限する剤は最も良好に作用する。血餅を破砕し、酸素の豊富な血液が遮断された動脈の中を流れるのを可能にする血栓溶解剤は、心臓発作の後できるだけ早く与えられるならば、患者の生存の可能性を増加させる。心臓発作の後数時間以内に与えられる血栓溶解剤が、最も有効である。静脈内に注射される場合、これらにはアニソイル化（ａｎｉｓｏｙｌａｔｅｄ）プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化因子複合体（ＡＰＳＡＣ）またはアニストレプラーゼ、組換え組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｒ−ｔＰＡ）、およびストレプトキナーゼが含まれる。開示される化合物は、これらのまたは類似した剤のいずれも用いることができる。
３．検出頭基
開示される組成物中の頭基は、検出頭基であってもよい。様々な検出頭基が、開示される方法で有用である。本明細書で用いるように、用語「検出頭基」は、検出することができる任意の分子を指す。有用な検出頭基には、ｉｎ ｖｉｖｏで投与することができ、その後検出することができる化合物および分子が含まれる。開示される組成物および方法で有用な検出頭基には、限定されずに、放射性標識および蛍光分子が含まれる。検出頭基は、例えば、直接的または間接的に、好ましくは非侵襲的および／またはｉｎ ｖｉｖｏでの視覚化技術によって検出を促進する任意の分子であってよい。例えば、検出頭基は、例えば、放射線技術、磁気共鳴技術または超音波技術を含む、任意の公知の画像化技術によって検出可能であってよい。検出頭基には、例えば造影剤が含まれてもよく、例えば、その造影剤はイオン性または非イオン性である。一部の実施形態では、例えば、検出頭基は、タンタル化合物および／またはバリウム化合物、例えば硫酸バリウムを含む。一部の実施形態では、検出頭基は放射性ヨウ素などのヨウ素を含む。一部の実施形態では、例えば、検出頭基は、有機ヨード酸（ｏｒｇａｎｉｃ ｉｏｄｏ ａｃｉｄ）、例えばヨードカルボン酸、トリヨードフェノール、ヨードホルムおよび／またはテトラヨードエチレンを含む。一部の実施形態では、検出頭基は、非放射性検出頭基、例えば非放射性同位体を含む。例えば、特定の実施形態ではＧｄを非放射性検出頭基として用いることができる。
検出頭基の他の例には、検出可能な放射線を放出するか放出させることができる分子（例えば、蛍光励起、放射性崩壊、スピン共鳴励起など）、局所電磁場に影響を及ぼす分子（例えば、磁性、強磁性、常磁性および／または超常磁性種）、放射エネルギーを吸収するか散乱させる分子（例えば、発色団および／またはフルオロフォア）、量子ドット、重元素および／またはその化合物が含まれる。例えば、米国特許出願公開第２００４／０００９１２２号に記載される検出可能な剤を参照。検出頭基の他の例には、陽子放出分子、ラジオパク分子、および／または放射性分子、例えばＴｃ−９９ｍおよび／またはＸｅ−１３のような放射性核種が含まれる。そのような分子は、放射性医薬品として用いることができる。さらに他の実施形態では、開示される組成物は、本明細書で開示される検出頭基の任意の組合せを含む、１つまたは複数の異なる種類の検出頭基を含むことができる。
有用な蛍光頭基には、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、ダンシルクロリド、ローダミン、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）、エオシン、エリトロシン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、ピレン、リサミン、キサンテン、アクリジン、オキサジン、フィコエリトリン、ランタニドイオンの大環状キレート、例えばｑｕａｎｔｕｍ ｄｙｅ（商標）、蛍光エネルギー転移色素、例えばチアゾールオレンジエチジウムヘテロダイマー、およびシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７が含まれる。他の具体的な蛍光標識の例には、３−ヒドロキシピレン５，８，１０−トリスルホン酸、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、酸性フクシン、アリザリンコンプレキソン、アリザリンレッド、アロフィコシアニン、アミノクマリン、Ａｎｔｈｒｏｙｌステアレート、アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ、アストラゾンオレンジＲ、アストラゾンレッド６Ｂ、アストラゾンイエロー７ＧＬＬ、アタブリン、オーラミン、Ａｕｒｏｐｈｏｓｐｈｉｎｅ、ＡｕｒｏｐｈｏｓｐｈｉｎｅＧ、ＢＡＯ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）、ＢＣＥＣＦ、硫酸ベルベリン、ビスベンズアミド、Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ ＦＦＧ溶液、Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ ＳＶ、Ｂｏｄｉｐｙ Ｆ１、ブリリアントスルホフラビンＦＦ、Ｃａｌｃｉｅｎブルー、カルシウムグリーン、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ ＲＷ溶液、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒホワイト、ＣａｌｃｏｐｈｏｒホワイトＡＢＴ溶液、Ｃａｌｃｏｐｈｏｒホワイト標準溶液、Ｃａｒｂｏｓｔｙｒｙｌ、カスケードイエロー、カテコールアミン、Ｃｈｉｎａｃｒｉｎｅ、Ｃｏｒｉｐｈｏｓｐｈｉｎｅ Ｏ、クマリン−ファロイジン、ＣＹ３．１ ８、ＣＹ５．１ ８、ＣＹ７、Ｄａｎｓ（１−ジメチルアミノナファリン５スルホン酸）、Ｄａｎｓａ（ジアミノナフチルスルホン酸）、ダンシルＮＨ−ＣＨ３、ジアミノフェニルオキシジアゾール（ＤＡＯ）、ジメチルアミノ−５−スルホン酸、ジピロメテンボロンジフルオリド、ジフェニルブリリアントフラビン７ＧＦＦ、ドーパミン、エリトロシンＩＴＣ、Ｅｕｃｈｒｙｓｉｎ、ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘導蛍光）、フラゾオレンジ、Ｆｌｕｏ３、フルオレサミン、Ｆｕｒａ−２、ＧｅｎａｃｒｙｌブリリアントレッドＢ、Ｇｅｎａｃｒｙｌブリリアントイエロー１０ＧＦ、Ｇｅｎａｃｒｙｌピンク３Ｇ、Ｇｅｎａｃｒｙｌイエロー５ＧＦ、Ｇｌｏｘａｌｉｃ ａｃｉｄ、Ｇｒａｎｕｌａｒ Ｂｌｕｅ、ヘマトポルフィリン、Ｉｎｄｏ−１、Ｉｎｔｒａｗｈｉｔｅ Ｃｆ液体、Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ ＰＡＦ、Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ ＳＦ、Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ ＷＳ、リサミンローダミンＢ２００（ＲＤ２００）、ルシファーイエローＣＨ、ルシファーイエローＶＳ、マグダラレッド、マリナブルー、マキシロンブリリアントフラビン１０ＧＦＦ、マキシロンブリリアントフラビン８ＧＦＦ、ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）、ミトラマイシン、ＮＢＤアミン、ニトロベンゾキサジドール、ノルアドレナリン、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｙｅｌｌｏｗ、ニロサンブリリアントフラビンＥ８Ｇ、オキサジアゾール、パシフィックブルー、パラローザニリン（Ｆｅｕｌｇｅｎ）、Ｐｈｏｒｗｉｔｅ ＡＲ溶液、Ｐｈｏｒｗｉｔｅ ＢＫＬ、Ｐｈｏｒｗｉｔｅ Ｒｅｖ、Ｐｈｏｒｗｉｔｅ ＲＰＡ、ホスフィン３Ｒ、フタロシアニン、フィコエリトリンＲ、Ｐｏｌｙａｚａｉｎｄａｃｅｎｅ Ｐｏｎｔｏｃｈｒｏｍｅブルーブラック、ポルフィリン、プリムリン、プロシオンイエロー、ピロニン、ピロニンＢ、ピロザールブリリアントフラビン７ＧＦ、キナクリンマスタード、ローダミン１２３、ローダミン５ＧＬＤ、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミンＢ２００、ローダミンＢエキストラ、ローダミンＢＢ、ローダミンＢＧ、ローダミンＷＴ、セロトニン、Ｓｅｖｒｏｎブリリアントレッド２Ｂ、Ｓｅｖｒｏｎブリリアントレッド４Ｇ、ＳｅｖｒｏｎブリリアントレッドＢ、Ｓｅｖｒｏｎオレンジ、ＳｅｖｒｏｎイエローＬ、ＳＩＴＳ（プリムリン）、ＳＩＴＳ（スチルベンイソチオスルホン酸）、スチルベン、Ｓｎａｒｆ１、スルホローダミンＢ Ｃａｎ Ｃ、スルホローダミンＧエキストラ、テトラサイクリン、チアジンレッドＲ、チオフラビンＳ、チオフラビンＴＣＮ、チオフラビン５、チオライト（Ｔｈｉｏｌｙｔｅ）、チオゾールオレンジ、チノポールＣＢＳ（Ｔｉｎｏｐｌ ＣＢＳ）、トゥルーブルー（Ｔｒｕｅ Ｂｌｕｅ）、ウルトラライト（ｕｌｔｒａｌｉｔｅ）、ウラニンＢ（Ｕｒａｎｉｎｅ Ｂ）、ＵｖｉｔｅｘＳＦＣ、キシレンオレンジおよびＸＲＩＴＣが含まれる。
特に有用な蛍光標識には、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）およびシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７が含まれる。これらの蛍光体の吸収および放出の最大値は、それぞれ以下の通りであり：ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ：６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）およびＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）、したがってそれらの同時検出を可能にする。フルオレセイン色素の他の例には、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，４’，１，４−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ）、２’−クロロ−５’−フルオロ−７’，８’−縮合フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ）および２’−クロロ−７’−フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）が含まれる。蛍光標識は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ；およびＲｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏを含む様々な民間供給源から得ることができる。蛍光プローブおよびその使用は、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ． ＨａｕｇｌａｎｄによるＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓにも記載されている。
放射性検出頭基のさらなる例には、ガンマ放射体（ｇａｍｍａ ｅｍｉｔｔｅｒ）、例えば、ガンマ放射体Ｉｎ−１１１、Ｉ−１２５およびＩ−１３１、レニウム−１８６および１８８、およびＢｒ−７７（例えば、Ｔｈａｋｕｒ， Ｍ． Ｌ．ら、Ｔｈｒｏｍ Ｒｅｓ．９巻３４５頁（１９７６年）、Ｐｏｗｅｒｓら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ３２巻９３８頁（１９８２年）、および米国特許第５，０１１，６８６号を参照）；陽電子放射体（ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｔｔｅｒ）、例えばＣｕ−６４、Ｃ−１１およびＯ−１５、ならびにＣｏ−５７、Ｃｕ−６７、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１３ｍ、Ｈｇ−１９７、Ａｕ−１９８およびＰｂ−２０３が含まれる。他の放射性検出頭基には、例えばトリチウム、Ｃ−１４および／またはタリウム、ならびにＲｈ−１０５、Ｉ−１２３、Ｎｄ−１４７、Ｐｍ−１５１、Ｓｍ−１５３、Ｇｄ−１５９、Ｔｂ−１６１、Ｅｒ−１７１および／またはＴｌ−２０１が含まれてもよい。
テクネチウム−９９ｍ（Ｔｃ−９９ｍ）の使用が好ましく、他の出願で記載されており、例えば米国特許第４，４１８，０５２号および米国特許第５，０２４，８２９号を参照されたい。Ｔｃ−９９ｍは１４０ｋｅＶの単光子エネルギーおよび約６時間の半減期を有するガンマ放射体であり、Ｍｏ−９９／Ｔｃ−９９発生器から容易に得ることができる。
一部の実施形態では、放射性検出頭基を含む組成物は、標的化頭基を検出のために適する放射性同位体に結合することによって調製することができる。結合は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）および／またはメタロチオネインなどのキレート剤を通して生じさせることができ、そのいずれも標的化頭基に共有結合することができる。一部の実施形態では、テクネチウム−９９ｍ、還元剤および水溶性リガンドの水性混合液を調製し、その後開示される標的化頭基と反応させることができる。そのような方法は当技術分野で公知であり、例えば国際公開第ＷＯ９９／６４４４６号を参照。一部の実施形態では、放射性ヨウ素を含む組成物を、交換反応を用いて調製することができる。例えば、ホットのヨウ素をコールドのヨウ素へ交換することは、当技術分野で周知である。あるいは、放射性ヨウ素標識化合物は、トリブチルスタンニル中間体を通して対応するブロモ化合物から調製することができる。
磁性検出頭基には、例えば磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）と一緒に用いられる常磁性の造影剤、例えばガドリニウムジエチレントリアミンペンタ酢酸が含まれる（例えばＤｅ Ｒｏｏｓ， Ａ．ら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｒｄ． Ｉｍａｇｉｎｇ７巻１３３頁（１９９１年）を参照）。一部の好ましい実施形態は、原子番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、４２、４４、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９または７０の元素の二価または三価イオンである常磁性の原子を検出頭基として用いる。適するイオンには、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、プラセオジム（ＩＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）およびイッテルビウム（ＩＩＩ）、ならびにガドリニウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ｄｙｓｏｐｒｏｓｉｕｍ）（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）およびエルビウム（ＩＩＩ）が含まれるが、これらに限定されない。一部の好ましい実施形態は、強力な磁気モーメントを有する原子、例えばガドリニウム（ＩＩＩ）を用いる。
一部の実施形態では、磁性検出頭基を含む組成物は、標的化頭基を常磁性原子に結合することによって調製することができる。例えば、適する常磁性原子の金属酸化物または金属塩、例えば硝酸塩、塩化物または硫酸塩を、水／アルコール媒体、例えばメチル、エチルおよび／またはイソプロピルアルコールに溶解または懸濁することができる。類似した水／アルコール媒体中の等モル量の標的化頭基の溶液に混合物を加え、撹拌することができる。反応が完了するかほとんど完了するまで、混合物を適度に加熱することができる。形成される不溶性組成物は濾過によって得ることができ、可溶性組成物は溶媒を蒸発させることによって得ることができる。キレート頭基の上の酸性基が開示される組成物に残っている場合、例えば組成物の単離または精製を促進するために、酸性基を中和するために無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウムおよび／またはリチウムの水酸化物、炭酸塩および／または重炭酸塩）、有機塩基および／または塩基性アミノ酸を用いることができる。
好ましい実施形態では、凝固部位と相互作用する血餅結合頭基の能力に干渉しないような方法で、検出頭基を組成物に結合することができる。一部の実施形態では、検出頭基は、血餅結合頭基に化学的に結合することができる。一部の実施形態では、検出頭基は、それ自体血餅結合頭基に化学的に結合して、間接的に画像化および標的化頭基を連結する頭基に化学的に結合することができる。
Ｃ．薬学的組成物およびキャリア
開示される組成物は、単独で、または薬学的に許容されるキャリア中でｉｎ ｖｉｖｏで投与することができる。「薬学的に許容される」は、生物学的にも他の形でも望ましくなくはない物質を意味し、すなわち、その物質は、いかなる望ましくない生物学的な影響も引き起こさずに、またはそれが含有される薬学的組成物の他の構成成分のいずれとも有害な方法で相互作用することなく、本明細書で開示される組成物と一緒に被験体に投与することができる。当然ながら、キャリアは、有効成分のいかなる分解も最小にし、被験体でのいかなる有害な副作用も最小にするように選択され、そのことは当業者に周知である。その物質は、溶液、懸濁液中にあってよい（例えば、微小粒子、リポソームまたは細胞に組み込まれる）。
１．薬学的に許容されるキャリア
本明細書で開示される組成物は、薬学的に許容されるキャリアと組み合わせて治療的に用いることができる。
適するキャリアおよびそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版）Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ１９９５年に記載される。一般的に、製剤を等張性にするために、適当な量の薬学的に許容される塩が製剤で用いられる。薬学的に許容されるキャリアの例には、生理食塩水、リンガー液およびブドウ糖溶液が含まれるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは約５から約８、より好ましくは約７から約７．５である。さらなるキャリアには、徐放性調製物、例えば抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、そのマトリックスは造形品（ｓｈａｐｅｄ ａｒｔｉｃｌｅ）、例えばフィルム、リポソームまたは微小粒子の形である。例えば、投与経路および投与される組成物の濃度に依存して、特定のキャリアがより好ましいことがあることは、当業者に明らかとなる。
薬学的キャリアは、当業者に公知である。これらは、最も一般的には、無菌水、生理食塩水および生理的ｐＨの緩衝溶液などの溶液を含む、ヒトへの薬物投与のための標準的なキャリアとなる。組成物は、筋内に、または皮下に投与することができる。他の化合物は、当業者によって用いられる標準手順によって投与される。
薬学的組成物は、選択される分子に加えて、キャリア、増粘剤、希釈剤、緩衝液、保存料、界面活性剤などを含むことができる。薬学的組成物は、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬などの１つまたは複数の有効成分を含むこともできる。
薬学的組成物は、局所または全身の処置が所望であるかどうかによって、および処置される領域によっていくつかの方法で投与することができる。投与は、局所的（眼科的、経膣的、直腸、鼻腔内を含む）、経口的、吸入によるか、あるいは非経口的、例えば静脈内点滴、皮下注射、腹腔内注射、または筋肉内注射によってもよい。開示される抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内または経皮的に投与することができる。
非経口投与のための調製物には、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液および乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性キャリアには、食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水性の溶液、乳濁液または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、または不揮発性油がある。静脈内ビヒクルには、流体および栄養素補液、電解質補液（例えばリンガーブドウ糖をベースにするもの）などが含まれる。保存剤や他の添加物、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなども存在してもよい。
局所投与用の製剤には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液体および粉末が含まれてよい。従来の薬学的キャリア、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要であるか望ましいであろう。
経口投与用組成物には、粉末または顆粒、水中または非水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、薬包（ｓａｃｈｅｔ）または錠剤が含まれる。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましいことがある。
組成物のいくつかは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸およびリン酸などの無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸およびフマル酸などの有機酸との反応、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、ならびにモノ−、ジ−、トリアルキルおよびアリールアミンおよび置換されたエタノールアミンなどの有機塩基との反応によって形成される、薬学的に許容される酸付加塩または塩基付加塩として投与することができる。
Ｄ．コンピューター支援ドラッグデザイン
開示される組成物は、開示される組成物の構造を同定するために、または開示される組成物と所望の方法で相互作用する、小分子などの可能なまたは実際の分子を同定するために、任意の分子モデリング技法の標的として用いることができる。
モデリング技法で開示される組成物を用いる場合、標的分子の機能の阻害または刺激などの特定の所望の特性を有する高分子量分子などの分子が同定されるものと理解される。開示される組成物、ペプチドなどを用いた場合に同定、単離される分子も開示される。したがって、開示される組成物を含む分子モデリング手法を用いて生成される生成物も本明細書で開示されているとみなされる。
したがって、選択される分子に結合する分子を単離する一方法は、合理的な設計を介するものである。これは、構造情報およびコンピューターモデリングを通して達成することができる。コンピューターモデリング技術は、選択される分子の３次元原子構造の視覚化、およびその分子と相互作用する新規化合物の合理的な設計を可能にする。３次元構築物は、選択される分子のＸ線結晶解析またはＮＭＲ画像化からのデータに一般的に依存する。分子動力学は、力場（ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ）データを必要とする。コンピューターグラフィクスシステムは、新規化合物がどのように標的分子に連結するかという予測を可能にし、その化合物および標的分子の構造の実験的操作を可能にすし、結合特異性を完全にする。一方または両方に小さな変化を加えた場合に分子−化合物間相互作用がどうなるかという予測は、分子設計プログラムと使用者との間のユーザーフレンドリーなメニュー方式のインターフェースと通常一緒になった、分子力学ソフトウェアおよびコンピューター処理に集約されたコンピューターを必要とする。
分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラム、Ｐｏｌｙｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡである。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子動力学の機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリングおよび分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子相互間の挙動の対話式の構築、改変、視覚化および分析を可能にする。
特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピューターモデリングを、いくつかの論文が概説している、例えばＲｏｔｉｖｉｎｅｎら、１９８８年、Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｆｅｎｎｉｃａ９７巻、１５９〜１６６頁、Ｒｉｐｋａ、Ｎｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ５４〜５７頁（１９８８年６月１６日）、ＭｃＫｉｎａｌｙおよびＲｏｓｓｍａｎｎ、１９８９年、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｉｏｌ．２９巻、１１１〜１２２頁、ＰｅｒｒｙおよびＤａｖｉｅｓ、ＱＳＡＲ： Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ１８９〜１９３頁（Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．１９８９年）、ＬｅｗｉｓおよびＤｅａｎ、１９８９年Ｐｒｏｃ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄ．２３６巻、１２５〜１４０頁および１４１〜１６２頁、および、核酸構成成分のためのモデル酵素に関しては、Ａｓｋｅｗら、１９８９年Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．１１１巻、１０８２〜１０９０頁。化学物質のスクリーニングおよび図示を行う他のコンピュータープログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ．、Ａｌｌｅｌｉｘ，Ｉｎｃ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ、およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ，Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｏｎｔａｒｉｏなどの会社から入手可能である。これらは主に特定のタンパク質に特異的な薬物への適用のために設計されるが、ＤＮＡまたはＲＮＡの特定の領域と特異的に相互作用する分子の設計に、一旦その領域が特定されたら、それらを適合させることができる。
結合を変更し得る化合物の設計および生成に関して上に記載したが、天然の生成物または合成化学物質を含む既知の化合物、およびタンパク質を含む生物学的に活性な物質のライブラリーを、基質結合または酵素活性を変更する化合物についてスクリーニングすることもできる。
Ｅ．類似した機能を有する組成物
本明細書で開示される組成物は、血餅への結合または血餅形成の強化などの特定の機能を有するものと理解される。開示される機能を実行するための特定の構造要件が本明細書で開示され、開示される構造に関連する同じ機能を実行することができる様々な構造があり、最終的にこれらの構造が同じ結果、例えば刺激または阻害を達成するものと理解される。
Ｆ．キット
本明細書で開示される方法の実施で用いることができる試薬を組み込む（ｄｒａｗｎ）キットが本明細書で開示される。キットは、本明細書で議論されるか、開示される方法の実施で必要であるか有益であると理解されるであろう任意の試薬または試薬の組合せを含むことができる。例えば、キットは、本明細書で開示される組成物を含むことができる。
Ｇ．混合物
その方法が組成物または構成成分または試薬を混合するか、接触させることを含むときはいつでも、その方法を実施することはいくつかの異なる混合物を生成する。例えば、その方法が３つの混合ステップを含む場合、ステップが別々に実施されるならば、これらのステップの各々の後に特異な混合物が形成される。さらに、ステップがどのように実施されたかに関係なく、全てのステップの完了時に混合物が形成される。本開示は、開示される方法の実施によって得られるこれらの混合物、ならびに、例えば本明細書で開示される任意の開示される試薬、組成物または構成成分を含有する混合物を企図する。
Ｈ．系
開示される方法の実施に、または実施を補助するのに有用な系が開示される。系は、製造品、例えば構造体、機械、装置など、および組成物、化合物、材料などの組合せを一般に含む。開示されるか、または開示から明らかであるそのような組合せが企図される。
Ｉ．コンピューター可読媒体
開示される核酸およびタンパク質は、アミノ酸のヌクレオチドからなる配列として表すことができるものと理解される。これらの配列を示すために様々な方法があり、例えばヌクレオチドグアノシンはＧまたはｇによって表すことができる。同様に、アミノ酸バリンは、ＶａｌまたはＶによって表すことができる。任意の核酸またはタンパク質配列を存在する各種方法のいずれかでどのように示し、表すべきかについて当業者は理解し、それぞれは本明細書で開示されているとみなされる。市販のフロッピー（登録商標）ディスク、テープ、チップ、ハードドライブ、コンパクトディスクおよびビデオディスクなどのコンピューター可読媒体、または他のコンピューター可読媒体でのこれらの配列の提示が、本明細書で具体的に企図される。開示される配列のバイナリーコード表示も、開示される。当業者は、どのコンピューター可読媒体だろうと理解する。したがって、核酸またはタンパク質配列が記録、記憶または保存されるコンピューター可読媒体。
Ｊ．ペプチド合成
特記されない限り、本明細書で開示される組成物および開示される方法を実施するのに必要な組成物は、その特定の試薬または化合物に関して当業者に公知である任意の方法を用いて作製することができる。
配列番号１などの開示されるタンパク質を生成する１つの方法は、タンパク質化学技術によって２つ以上のペプチドまたはポリペプチドを連結することである。例えば、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）化学またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）化学のいずれかを用いる今日利用できる実験装置を用いて、ペプチドまたはポリペプチドを化学的に合成することができる。（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。例えば、開示されるタンパク質に対応するペプチドまたはポリペプチドは、標準の化学反応によって合成することができると、当業者は容易に認識することができる。例えば、ペプチドまたはポリペプチドを合成することができるが、その合成樹脂から切断され得ない一方で、ペプチドまたはタンパク質の他の断片を合成し、その後、樹脂から切断し得、それによって他の断片上で機能的にブロックされている末端基を曝露させる。ペプチド縮合反応によって、これらの２つの断片をそれぞれそれらのカルボキシルおよびアミノ末端でペプチド結合によって共有結合することができ、抗体またはその断片を形成する。（Ｇｒａｎｔ ＧＡ（１９９２年）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ．、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．（１９９２年）、Ｂｏｄａｎｓｋｙ ＭおよびＴｒｏｓｔ Ｂ．編（１９９３年）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｉｎｃ．、ＮＹ（それは、少なくともペプチド合成に関連する材料について参照により本明細書に組み込まれる）。あるいは、本明細書に記載されるように、ペプチドまたはポリペプチドはｉｎ ｖｉｖｏで独立して合成される。単離されると、類似したペプチド縮合反応を通して、これらの独立したペプチドまたはポリペプチドを連結して、ペプチドまたはその断片を形成することができる。
例えば、クローニングされたまたは合成のペプチドセグメントの酵素ライゲーションは、比較的短いペプチド断片を連結させてより大きなペプチド断片、ポリペプチドまたは全タンパクドメインを生成することを可能にする（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ Ｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻：４１５１頁（１９９１年））。あるいは、より短いペプチド断片から大きなペプチドまたはポリペプチドを合成的に構築するために、合成ペプチドの天然の化学的ライゲーションを利用することができる。この方法は、２ステップ化学反応からなる（ＤａｗｓｏｎらＳｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６巻：７７６〜７７９頁（１９９４年））。第一のステップは、最初の共有結合生成物としてチオエステル連結中間体を与えるための、保護されていない合成ペプチド−チオエステルの、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含有する別の保護されていないペプチドセグメントとの化学選択反応（ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。反応条件の変更なしで、この中間体は、自然発生の迅速な分子内反応を経て、ライゲーション部位で天然のペプチド結合を形成する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ Ｍら（１９９２年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０７巻：９７〜１０１頁、Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６９巻：１６０７５頁（１９９４年）、Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻：３１２８頁（１９９１年）、Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ Ｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３巻：６６２３〜３０頁（１９９４年））。
あるいは、保護されていないペプチドセグメントが化学的に連結され、そこでは化学的ライゲーションの結果としてペプチドセグメントの間に形成される結合は非天然（非ペプチド）結合である（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ， ＭらＳｃｉｅｎｃｅ、２５６巻：２２１頁（１９９２年））。タンパク質ドメインの類似体、ならびに完全な生物学的な活性を有する大量の比較的純粋なタンパク質を合成するために、この技術が用いられた（ｄｅＬｉｓｌｅ Ｍｉｌｔｏｎ ＲＣら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＩＶ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２５７〜２６７頁（１９９２年））。
方法
本明細書で開示される組成物を被験体に投与するステップを含む方法が、本明細書で開示される。組成物は、凝固血漿タンパク質に選択的に向かうことができる。両親媒性分子を含む組成物を被験体に投与するステップを含む方法も開示され、ここで、両親媒性分子の少なくとも１つは血餅結合頭基を含み、血餅結合頭基は凝固血漿タンパク質に選択的に結合し、組成物は凝固を引き起こさず、組成物は被験体の中の凝固血漿タンパク質に結合する。開示される組成物の１つまたは複数を被験体に投与するステップを含む方法も開示され、組成物は被験体の中の凝固血漿タンパク質に結合する。
両親媒性分子を混合するステップを含む組成物を作製する方法も開示され、両親媒性分子の少なくとも１つは血餅結合頭基を含み、血餅結合頭基は凝固血漿タンパク質に選択的に結合し、組成物は凝固を引き起こさない。両親媒性分子を混合するステップを含む組成物を作製する方法も開示され、両親媒性分子の少なくとも１つは開示される血餅結合頭基の１つまたは複数を含む。
両親媒性分子は、機能的頭基を含むことができる。両親媒性分子の少なくとも１つは、機能的頭基を含むことができる。機能的頭基は、検出頭基であってよい。機能的頭基は、処置頭基であってよい。両親媒性分子の少なくとも１つは検出頭基を含むことができ、両親媒性分子の少なくとも１つは処置頭基を含むことができる。
被験体は、凝固血漿タンパク質に関連するおよび／またはそれを生じる疾患または状態の処置を必要とするものであってよい。被験体は、心血管疾患の処置を必要とするものであってよい。被験体は、凝固血漿タンパク質に関連するおよび／またはそれを生じる疾患または状態の検出、視覚化またはその両方を必要とするものであってよい。被験体は、心血管疾患の検出、視覚化またはその両方を必要とするものであってよい。被験体は、癌、腫瘍またはその両方の検出、視覚化またはその両方を必要とするものであってよい。被験体は、癌の処置を必要とするものであってよい。
組成物を投与するステップは、凝固血漿タンパク質に関連するおよび／またはそれを生じる疾患または状態を処置することができる。組成物を投与するステップは、心血管疾患を処置することができる。心血管疾患は、アテローム硬化症であってよい。組成物を投与するステップは、癌を処置することができる。方法は、凝固血漿タンパク質に関連するおよび／またはそれを生じる疾患または状態を検出するステップ、視覚化するステップ、またはその両方をさらに含むことができる。方法は、心血管疾患を検出するステップ、視覚化するステップ、またはその両方をさらに含むことができる。方法は、癌、腫瘍またはその両方を検出するステップ、視覚化するステップ、またはその両方をさらに含むことができる。
方法は、投与するステップの前に、親水性媒体に両親媒性分子をさらすステップをさらに含むことができる。両親媒性分子は、親水性媒体中で凝集体を形成することができる。凝集体は、ミセルを含むことができる。方法は、投与するステップの後に、両親媒性分子を検出するステップをさらに含むことができる。両親媒性分子は、蛍光、ＰＥＴまたはＭＲＩによって検出することができる。両親媒性分子は、蛍光によって検出することができる。組成物は、被験体の中のプラークとコンジュゲートすることができる。組成物は、被験体の中の腫瘍とコンジュゲートすることができる。
血餅結合頭基は、アミノ酸配列ＲＥＫを含むアミノ酸セグメント、フィブリン結合ペプチド、血餅結合抗体および血餅結合小有機分子から各々独立して選択することができる。血餅結合頭基は、アミノ酸配列ＲＥＫを含むアミノ酸セグメントを各々独立して含むことができる。
血餅結合頭基は、フィブリン結合ペプチドを各々含むことができる。フィブリン結合ペプチドは、フィブリン結合タンパク質およびフィブリンに結合するその誘導体からなる群より独立して選択することができる。別の例では、血餅結合頭基は、血餅結合抗体を各々含むことができる。さらに、血餅結合頭基は、血餅結合小有機分子を各々含むことができる。
組成物は、脂質、ミセル、リポソーム、ナノ粒子、微小粒子またはフルオロカーボン微小泡をさらに含むことができる。一例において、組成物は検出可能であってよい。別の例では、組成物は処置頭基を含むことができる。処置頭基の例は、ヒルログである。
組成物は、１つまたは複数の頭基をさらに含むことができる。例えば、頭基は、抗血管新生剤、血管新生促進剤、癌化学療法剤、細胞傷害剤、抗炎症剤、抗関節炎剤、ポリペプチド、核酸分子、小分子、フルオロフォア、フルオレセイン、ローダミン、放射性核種、インジウム１１１、テクネチウム９９、炭素１１および炭素１３からなる群より独立して選択することができる。頭基の少なくとも１つは、処置頭基であってよい。処置頭基の例は、パクリタキセルおよびタキソールである。頭基の少なくとも１つは、検出頭基であってよい。
組成物は、凝固血漿タンパク質に選択的に向かうことができる。組成物は、腫瘍血管系、創傷部位またはその両方に選択的に向かうことができる。一例において、組成物は治療効果を有することができる。この効果は、腫瘍部位または創傷部位への処置頭基の送達によって強化することができる。
治療効果は、心血管疾患の増大における遅延化または心血管疾患の低減であってよい。治療効果は、アテローム硬化症の増大における遅延化またはアテローム硬化症の低減であってよい。治療効果は、プラークの数および／またはサイズの増大における遅延化あるいはプラークの数および／またはサイズの低減であってよい。治療効果は、処置される疾患の原因または症状のレベルまたは量の低減であってよい。治療効果は、腫瘍負荷の増大における遅延化または腫瘍負荷の低減であってよい。
被験体は標的化される１つまたは複数の部位を有してもよく、そこで、組成物は標的化される部位の１つまたは複数に向かう。例えば、被験体は複数の腫瘍または損傷部位を有してよい。
一部の形では、組成物は治療効果を有することができる。一部の形では、凝固血漿タンパク質の部位に治療的化合物または組成物を送達することによってこれを達成することができる。この効果は、腫瘍部位または創傷部位への処置頭基の送達によって強化することができる。
治療効果は、心血管疾患の増大における遅延化または心血管疾患の低減であってよい。プラークの数および／またはサイズのこの遅延化および／または減少は、処置されていない被験体、処置されていない心血管疾患、異なる方法によって処置された被験体、または異なる方法によって処置された心血管疾患と比較して１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％またはそれ以上の心血管疾患の遅延化および／または減少の向上であってよい。
治療効果は、アテローム硬化症の増大における遅延化またはアテローム硬化症の低減であってよい。プラークの数および／またはサイズのこの遅延化および／または減少は、処置されていない被験体、処置されていないアテローム硬化症、異なる方法によって処置された被験体、または異なる方法によって処置されたアテローム硬化症と比較して、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％またはそれ以上のアテローム硬化症の遅延化および／または減少の向上であってよい。
治療効果は、プラークの数および／またはサイズの増大における遅延化あるいはプラークの数および／またはサイズの低減であってよい。プラークの数および／またはサイズのこの遅延化および／または減少は、処置されていない被験体、処置されていないプラーク、異なる方法によって処置された被験体、または異なる方法によって処置されたプラークと比較して、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％またはそれ以上の、プラークの数および／またはサイズの遅延化および／または減少の向上であってよい。
治療効果は、処置される疾患の原因または症状のレベルまたは量の低減であってよい。処置される疾患の原因または症状のレベルまたは量のこの減少は、処置されていない被験体、処置されていない疾患、異なる方法によって処置された被験体、または異なる方法によって処置された疾患と比較して、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％またはそれ以上の、処置される疾患の原因または症状のレベルまたは量の低減の向上であってよい。
治療効果は、腫瘍負荷の増大における遅延化または腫瘍負荷の低減であってよい。腫瘍負荷の増加のこの遅延化またはその減少は、処置されていない腫瘍または異なる方法によって処置された腫瘍と比較して、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％またはそれ以上の、腫瘍負荷の増加または減少の改善であってよい。
被験体は標的化される１つまたは複数の部位を有してもよく、そこで、組成物は標的化される部位の１つまたは複数に向かう。例えば、被験体は複数の腫瘍または損傷部位を有してよい。
開示される組成物は、無制御の細胞増殖が起こる癌などの任意の疾患を処置するために用いることができる。異なる種類の癌の非限定リストは、以下の通りであってよい：リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、白血病、癌腫、固体組織の癌腫、扁平上皮癌、腺癌、肉腫、神経膠腫、高悪性度神経膠腫（ｈｉｇｈ ｇｒａｄｅ ｇｌｉｏｍａ）、芽細胞腫、神経芽細胞腫、プラズマ細胞腫、組織球腫、黒色腫、アデノーマ、低酸素腫瘍（ｈｙｐｏｘｉｃ ｔｕｍｏｒ）、骨髄腫、ＡＩＤＳ関連のリンパ腫または肉腫、転移癌または癌全般。
開示される組成物を処置のために用いることができる癌の代表的であるが非限定的なリストは、以下の通りである：リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳癌、神経系癌、頭頚部癌、頭頸部の扁平上皮癌、腎臓癌、肺癌、例えば小細胞肺癌および非小細胞肺癌、神経芽細胞腫／グリア芽細胞腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、肝癌、黒色腫、口、咽喉、喉頭および肺の扁平上皮癌、結腸癌、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸癌腫（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳癌、および上皮癌、腎臓癌、尿生殖器癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌腫、大腸癌、造血癌；精巣癌；結腸および直腸癌、前立腺癌または膵臓癌。
網内系（ＲＥＳ）組織による組成物の取り込みを低減するために、おとり粒子前処置の後に開示組成物を投与することもできる。そのようなおとり粒子前処置は、粒子の血中半減期を延長することができ、腫瘍標的化を増加させる。
以下の実施例は、本明細書で請求される化合物、組成物、物品、装置および／または方法がどのように作製され、評価されるかについての完全な開示および記載を当業者に提供するために示され、それらは単に例示的であるものとされ、本開示を限定するものではない。数（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するように努めたが、多少の誤差および逸脱があることが考慮されるべきである。特に明記しない限り、部は重量部であり、温度は℃であるか周囲温度であり、圧力は大気圧またはその近くである。
Ａ．（実施例１）：腫瘍に向かうナノ粒子の生物模倣増幅
標的化診断薬および治療薬が有用である。凝固血漿タンパク質を認識し、そのような凝固血漿タンパク質の部位に選択的に向かうペプチドが、本明細書に記載される。この実施例は腫瘍へのホーミングおよび凝固の増幅を記載するが、開示されるペプチドは、心血管疾患の部位などの凝固血漿タンパク質の他の位置を診断薬の標的にするために用いることができる。実施例２は、そのような使用の例を記載する。本実施例は、特定のペプチドの標的化能力を例示する。この実施例では、この凝固血漿タンパク質−ホーミングペプチドでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子およびリポソームが腫瘍血管に蓄積し、そこでそれらはさらなる局所凝固を誘導し、それによってより多くの粒子のための新しい結合部位を生成する。系は血小板を模倣し、それは自由に循環もするが、患部に蓄積してその部位でのそれら自体の蓄積を増幅する。凝固に基づく増幅は腫瘍の画像化を大いに強化し、粒子への薬物キャリア機能の追加を利用することもできる。
１．結果
ＣＲＥＫＡペプチド。標的化ナノ粒子を構築するために腫瘍ホーミングペプチドを用いた。このペプチドは、腫瘍を有するＭＭＴＶ−ＰｙＭＴトランスジェニック乳癌マウス（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ２０００年）における、腫瘍ホーミングのためのファージディスプレイペプチドライブラリーのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング（Ｈｏｆｆｍａｎ ２００３年、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ １９９６年）によって同定された。選択されたファージ調製物で最も頻繁に表れたペプチド配列はＣＲＥＫＡ（ｃｙｓ−ａｒｇ−ｇｌｕ−ｌｙｓ−ａｌａ；配列番号１）であった。ＣＲＥＫＡペプチドは、Ｎ末端に結合された蛍光色素とともに合成され、ペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ分布は腫瘍を有するマウスで研究された。静脈内注射されたＣＲＥＫＡペプチドは、ＰｙＭＴ腫瘍およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳癌異種移植片で、注射の数分後から数時間後に容易に検出可能であった。ペプチドは腫瘍間質に明瞭な網目構造を形成し（図５）、それは腫瘍中の血管を鮮明にもした。ＣＲＥＫＡペプチドは、正常組織では事実上検出不能であった。鏡検結果と一致して、蛍光色素Ａｌｅｘａ６４７で標識したＣＲＥＫＡペプチドを用いる全身画像化は、乳癌異種移植片、および膀胱でのペプチド蓄積を明らかにし、尿中への過剰なペプチドの排出を反映した（図５Ｂ）。
腫瘍は腫瘍間質および血管壁に凝固血漿タンパク質の網目構造を含有するが、そのような網目構造は正常組織では検出可能でない（Ｄｖｏｒａｋ １９８５年、Ａｂｅ １９９９年、Ｐｉｌｃｈ ２００６年）。腫瘍でＣＲＥＫＡペプチドによって生成される網状パターンは、凝固血漿タンパク質がこのペプチドの標的になることができるかどうかの研究を促した。ペプチドは、それらの腫瘍にフィブリン網目構造がないフィブリノーゲンノックアウトマウスで試験された。以前に同定された血餅結合ペプチド（Ｐｉｌｃｈ ２００６年）のように、静脈内注射されたＣＲＥＫＡペプチドは、フィブリノーゲンヌルマウスで増殖させたＢ１６Ｆ１黒色腫で蓄積することができなかったが、ヌルマウスの正常な同腹子で増殖させたＢ１６Ｆ１腫瘍では明るい蛍光網目構造を形成した（図１ＡおよびＢ）。この結果と一致して、ＣＲＥＫＡファージは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで凝固血漿タンパク質に結合したが、対照の挿入断片のないファージは結合しなかった（図１Ｃ）。これらの結果は、ＣＲＥＫＡを血餅結合ペプチドとして確立する。環式の１０アミノ酸ペプチド（Ｐｉｌｃｈ ２００６年）である他の血餅結合ペプチドと異なって、ＣＲＥＫＡは線形で５アミノ酸だけを含有するので、その構造は、それをナノ粒子標的化で用いるのに魅力的なペプチドにする。さらに、結合活性を提供するために単一のシステイン残基のスルフヒドリル基は必要とされず、それは他の部分にペプチドを結合させるために用いることができる。
ペプチドをコーティングしたナノ粒子。フルオレセイン標識ＣＲＥＫＡまたはフルオレセインを、５０ｎｍ超常磁性の、アミノデキストランをコーティングした酸化鉄（ＳＰＩＯ）ナノ粒子の表面に結合した。そのような粒子はそれらの化学、薬物動態学および毒物学に関して広く特徴付けされており、ＭＲＩ造影剤として用いられる（Ｊｕｎｇ １９９５年、Ｊｕｎｇ １９９５年、Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ １９８９年）。ＳＰＩＯへのフルオレセイン標識ペプチドの結合は、強い蛍光の粒子を生成した。加水分解による粒子からのペプチドの放出は、蛍光を約３倍さらに増加させた。粒子表面のフルオレセイン分子の近接性が蛍光の多少のクエンチングを引き起こすことを、これらの結果は示す。これにもかかわらず、結合したフルオレセインペプチドからの蛍光は、粒子上のペプチド分子の数に線形に関係し（図６）、粒子蛍光を測定することによる粒子上のペプチド部分の数の追跡、および試料中の粒子濃度の尺度としての蛍光強度の使用を可能にする。ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯは、ｉｎ ｖｉｖｏ実験では１粒子につき少なくとも８，０００個のペプチド分子で用いられた。ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子はｉｎ ｖｉｔｒｏでマウスおよびヒトの血漿凝塊に結合し、結合は遊離のペプチドによって阻害された（図１Ｄ）。ナノ粒子は、血餅中の原線維網目構造に沿って分布した（図１Ｄの挿入図）。粒子に結合したペプチドは凝固血漿タンパク質に対するその結合活性を保持することを、これらの結果は示す。
ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの腫瘍ホーミング対肝臓クリアランス。静脈内注射されたＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌異種移植片において効果的に蓄積しないことを初期実験は示した。対照的に、高濃度の粒子が、網内系（ＲＥＳ）組織で見られた（図２Ａ、上パネル）。遊離のＣＲＥＫＡペプチドはこれらの腫瘍に効果的に向かうので（図５）、ＲＥＳでの取り込みがナノ粒子のホーミングへの重大な障害であると仮定された。リポソームのクロドロナートを使用した肝臓のＲＥＳマクロファージを枯渇させることによって、ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯのクリアランスにおけるＲＥＳの役割が確認された（Ｖａｎ Ｒｏｏｉｊｅｎ １９９４年）。この処置は、粒子半減期の約５倍の延長を引き起こした（図２Ｂ）。特定の血漿タンパク質が粒子に結合してＲＥＳによるそれらの取り込みを媒介するので、粒子状物質は循環から除去された（オプソニン化；Ｍｏｇｈｉｍｉ ２００１年、Ｍｏｏｒｅ １９９７年）。血漿オプソニンを除去するおとり粒子を注射することは、ＲＥＳ取り込みをブロックする別の一般に用いられる方法である（Ｓｏｕｈａｍｉ １９８１年、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｕｒｒｕｓｕｎｏ １９９６年）。酸化鉄およびＮｉ２＋は類似した血漿オプソニンを引きつけ、したがってＮｉ−リポソームは全身の循環からそれらを除去することができると推測されたので、キレート化Ｎｉ２＋でコーティングしたリポソームを可能なおとり粒子として試験した。実際、Ｎｉ−リポソームで前処理されたマウスの血液では、有意により少ない血漿タンパク質がＳＰＩＯに結合することを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は示した。
静脈内注射されたＮｉ−リポソームは、血中のＳＰＩＯおよびＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの半減期を約５倍に延長した（図２Ｂ）。ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの注射の５分前または４８時間前にされたかどうかにかかわらず、Ｎｉ−リポソーム前処置はナノ粒子の腫瘍ホーミングを大いに増加させ、それは主に腫瘍血管に局在していた（図２Ａ下腫瘍パネルおよび図２Ｄ）。粒子の局所濃度は、酸化鉄の褐色がかった色が光学顕微鏡で観察できるほど高く（図２Ｃ、右パネル）、腫瘍血管で観察された蛍光シグナルがそのままのＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯに由来することを示した。Ｎｉ−リポソーム前処置の後に肝臓でより少ない粒子が見られたが、脾臓での蓄積は不変か、強化されさえした（図２Ａ）。Ｎｉ−リポソームが用いられたかどうかにかかわらず、他の器官は軽微な量のＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ粒子を含有していたか粒子をまったく含有しなかった（図１Ｄ）。プレーンなリポソームを、おとり粒子として試験した。これらのリポソームは、その後注射されたＣＫＥＫＡ−ＳＰＩＯの血中半減期および腫瘍ホーミングを延長し（図２Ｂ）、リポソームおよびＳＰＩＯの共通のクリアランス機構の存在を示す。
腫瘍血管でのナノ粒子によって誘導される血液凝固。リポソーム前処置の後に投与されたＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ粒子は、主に腫瘍血管と共局在し、一部の粒子は周囲の組織に溢出したようである（図３Ａ、上パネル）。注目に値することは、腫瘍血管内腔の最高２０％は、蛍光塊で満たされた。これらの構造をフィブリンについて染色し（図３Ａ、中パネル）、それらがナノ粒子で充満した血餅であることを示す。血管のいくつかでは、ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子は網目構造に沿って分布し（挿入図）、おそらくこれらはフィブリンおよび関連タンパク質で形成され、図１Ｄの挿入図に示すパターンに類似していた。
非ＲＥＳ組織の中では、腎臓および肺が軽微な量の特異的ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ蛍光を含有した（図２Ｄ）。しかし、それらの中に血餅を有する血管だけを明らかにする低倍率画像は、腎臓での非常に稀な血餅を除いてはこれらの組織で凝固を示さなかった（図７）。肝臓でのナノ粒子の大量の蓄積にもかかわらず、肝臓血管でのフィブリン（フィブリノーゲン）染色とＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ蛍光との共局在は見られなかった（図８）。さらに、注射を受けていないマウスからの肝臓組織もフィブリン（フィブリノーゲン）について染色され（図８Ｂ）、おそらく肝細胞によるフィブリノーゲン産生を反映する。したがって、ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子によって誘導される凝固は、腫瘍血管に事実上限られる。
ナノ粒子は血小板活性化を引き起こすこと、および血栓形成を増強することができる（Ｒａｄｏｍｓｋｉ ２００５年、Ｋｈａｎｄｏｇａ ２００４年）。血液から回収された一部のＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子（＜１％）は血小板と関連していた（図９Ａ）が、血小板マーカーについての染色は、腫瘍血管での血小板とＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子との共局在を示さなかった（図３Ａ、下パネル）。抗ＣＤ４１モノクローナル抗体をマウスに注射することによって血小板減少も誘導されたが（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｅｙｄｅ ２００５年）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍に向かうＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯに及ぼす目立つ影響は見出されなかった（図９Ｂ）。血小板がＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯのホーミングパターンに関与しないことを、これらの結果は示す。
ナノ粒子による血餅の深い浸潤は、これらの血餅が、注射の前ではなく粒子が血液中を循環しているときに形成したにちがいないことを示した。これは、流動マーカーとしてＤｉＩ標識赤血球を用いて生体内共焦点鏡検で試験された。腫瘍血管中での時間依存性の血餅形成および血流の障害が、形成中の血餅におけるＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの捕捉と並行してあった（図３Ｂ）。
凝固誘導効果がＳＰＩＯ粒子に特異的であったか、またはＣＲＥＫＡでコーティングされた異なる粒子で誘導することができたかどうか、次に試験した。テールに脂質が付いたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合している、フルオレセイン−ＣＲＥＫＡペプチドが組み込まれたリポソームを用いた。ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯのように、ＣＲＥＫＡ−リポソームは腫瘍に選択的に向かい、腫瘍血管内でフィブリンと共局在した（図３Ｃ）。このことはＣＲＥＫＡリポソームも腫瘍血管で凝固を引き起こすことが可能であることを示した。対照のＳＰＩＯまたは対照のリポソームが腫瘍マウスに注射されたときには、凝固は見られなかった。
凝固増幅腫瘍標的化。腫瘍血管でのＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの蓄積への凝固の寄与も試験した。超伝導量子干渉素子（ＳＱＵＩＤ）による腫瘍磁化の定量分析（図４Ａ）および蛍光シグナルの測定は、ＰＢＳ前処置マウスと比較してＮｉ−リポソーム前処置マウスで、ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの約６倍より多い蓄積を明らかにした。アミノ化されたＳＰＩＯ対照粒子は、腫瘍に有意に蓄積しなかった（図４Ａ）。
強力な凝固阻害剤であるヘパリンをＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの注射の前に注射することは、ナノ粒子の腫瘍蓄積を５０％を超えて低減することが、ＳＱＵＩＤ測定で分かった（図４Ａ）。ヘパリンは腫瘍血管内でフィブリン陽性／ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ陽性の構造を低減したが、粒子が血管壁に沿って、おそらく既存のフィブリン沈着物になお結合していたことを顕微鏡観察は示した（代表的な画像を図４Ｂに示す）。ホーミングパターンの別々の定量化は、ヘパリンが、血管壁に結合したナノ粒子を有する血管の数を有意に低減しなかったが、血管内凝固を事実上除去したことを示した（図４Ｃ）。したがって、腫瘍血管へのＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの結合は、これらの粒子と関連する凝固活性を必要としないが、凝固は腫瘍ホーミングの効率を向上させる。
ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯによって誘導された凝固は、全身スキャンで腫瘍シグナルの特に強力な強化を引き起こした。近赤外形蛍光化合物Ｃｙ７で標識されたＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子は、腫瘍に効果的に蓄積し（図４Ｄ、左の画像、矢印）、肝臓（矢じり）からもかなりのシグナルが出ていた。おそらく血餅からの濃いシグナルが蛍光の光学的な検出を強化したので、ヘパリンで得られた腫瘍シグナルの減少（図４Ｄ、右の画像）は、蛍光測定ではＳＱＵＩＤで測定された５０％値より大きいようであった。ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯによって誘導された凝固は、腫瘍画像化で特定の利点を提供することをこれらの結果は示す。
２．考察
この実施例は、腫瘍での粒子の有効な蓄積を提供するナノ粒子系の例を記載する。この系は、４つの要素に基づく：第一に、凝固血漿タンパク質に結合する腫瘍ホーミングペプチドでナノ粒子をコーティングすることは、腫瘍血管（および腫瘍間質）への特異的な親和性を粒子に与える。第二に、おとり粒子前処置は、粒子の血中半減期を延長させ、腫瘍標的化を増加させる。第三に、腫瘍標的ナノ粒子は、腫瘍血管で血管内凝固を引き起こす。第四に、血管内凝塊は腫瘍により多くのナノ粒子を引き寄せ、標的化を増幅する。
ナノ粒子のための標的化要素として、凝固血漿タンパク質への特異的な親和性を有するペプチドが選択された。腫瘍の間質空間は、フィブリン、および血液凝固中でフィブリンに架橋されるようになるフィブロネクチンなどのタンパク質を含有する（Ｄｖｏｒａｋ １９８５年、Ｐｉｌｃｈ ２００６年）。正常な組織ではなく腫瘍でのこれらの生成物の存在は、血漿タンパク質が血液から腫瘍組織へ入ることを可能にする腫瘍血管の漏出性の結果である可能性があり、そこで、漏出したフィブリノーゲンは組織凝血促進因子（ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ ｆａｃｔｏｒ）によってフィブリンに変換される（Ｄｖｏｒａｋ １９８５年、Ａｂｅ １９９９年）。凝固は、合成ペプチドで同定し、アクセスすることができる新しい結合部位を形成する（Ｐｉｌｃｈ ２００６年）。本結果は、ＣＲＥＫＡ改変ナノ粒子が血餅および血漿凝塊に結合するだけでなく、局在化された腫瘍凝固を誘導することもできることを示す。ＣＲＥＫＡでコーティングした酸化鉄およびミクロンサイズのＣＲＥＫＡでコーティングしたリポソームの両方が、腫瘍血管で凝固を引き起こすことが判明したので、粒子の性質はこの活性に限定されない。ＣＲＥＫＡ改変粒子による１つまたは複数の凝固生成物の結合は、凝固および血餅溶解の均衡を血餅形成の方に移行させることができ、粒子表面のこの活性の存在は接触依存性凝集を促進することができる。
一部のナノ材料は全身の血栓症を誘発することが可能である（Ｇｏｒｂｅｔ ２００４年）が、ここではＣＲＥＫＡ粒子によって誘導される血栓症は腫瘍血管に限られた。腫瘍血管中の高濃度の標的化粒子は、腫瘍血管への血栓症の選択的な局在化を説明することができる。しかし、同様にナノ粒子が高濃度で蓄積する肝臓で検出可能な凝固が見られなかったことから、他の因子が重要であるに違いない。腫瘍で一般的な凝血促進環境が、凝固の腫瘍特異性に寄与する主要な因子であるかもしれない（Ｂｏｃｃａｃｃｉｏ ２００５年）。
ナノ粒子の主要な利点は、複数の機能を単一の実体に組み込むことができるということである。腫瘍血管における、ナノ粒子によって誘導された凝固および血餅へのさらなるナノ粒子の結合によって可能になる自己増幅腫瘍ホーミングという、ナノ粒子のｉｎ ｖｉｖｏ機能がここに記載されている。このナノ粒子系は、いくつかの他の機能、すなわち、特異的腫瘍ホーミング、ＲＥＳの回避および効果的な腫瘍画像化を１つの粒子に組み合わせる。光学的画像化がこの研究で用いられたが、ＩＯプラットホームもＭＲＩ画像化を可能にする。腫瘍血管でＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子によって引き起こされる凝固は、顕微鏡的および全身画像化技術による腫瘍検出を向上させるような方法で粒子を病巣に濃縮させる役目を果たす。
標的化粒子の別の機能は、それらが局所塞栓によって腫瘍血管の物理的遮断を引き起こすということである。塞栓または凝固による血管閉塞は、腫瘍増殖を低減することができる（Ｈｕａｎｇ １９９７年、Ｅｌ−Ｓｈｅｉｋｈ ２００５年）。現在まで、腫瘍血管の２０％閉塞率が達成されている。ナノ粒子設計のモジュールの性質のために、本明細書に記載の機能は、さらなる活性を有する粒子に組み込むことができる。腫瘍血管中に蓄積し、血管を閉塞するのと同時に薬物ペイロードを徐々に放出する薬物運搬ナノ粒子を、本明細書で開示される方法および組成物で用いることができる。
３．材料および方法
ファージスクリーニング、腫瘍およびペプチド。６５〜７５日齢トランスジェニックＭＭＴＶ ＰｙＭＴマウス（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ２０００年）を用いて、式中ＣはシステインでありＸは任意のアミノ酸であるＣＸ７Ｃ（配列番号４）の一般構造を有するペプチドライブラリーのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングを記載の通りに実行した（Ｏｈ ２００４年）。これらのマウスはマウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）の転写調節の下でポリオーマウイルスミドルＴ抗原（ＭＴ）を発現し、保持体の１００％で多病巣性の乳房の腫瘍の誘導をもたらす。ヌードマウスのＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍およびペプチド合成が記載されている（Ｌａａｋｋｏｎｅｎ ２００２年、Ｌａａｋｋｏｎｅｎ ２００４年）。Ｂ１６Ｆ１マウス黒色腫腫瘍をフィブリノーゲンヌルマウス（Ｓｕｈ １９９５年）およびそれらの正常な同腹子で増殖させ、それらが０．５〜１ｃｍのサイズに到達したときに用いた（Ｐｉｌｃｈ ２００６年）。
ナノ粒子およびリポソーム。アミノ基官能基化デキストランでコーティングした超常磁性酸化鉄ナノ粒子（５０ｎｍのｎａｎｏｍａｇ−Ｄ−ＳＰＩＯ；Ｍｉｃｒｏｍｏｄ Ｐａｒｔｉｋｅｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ＧｍｂＨ、Ｒｏｓｔｏｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、架橋剤を用いてＣＲＥＫＡペプチドと結合させた。最終結合比は、１ｍｇ酸化鉄につき３０ｎｍｏｌのフルオレセイン標識ペプチド分子、または１粒子につき８，０００ペプチドであった。Ｃｙ７による近赤外標識化のために、アミンの約２０％をＣｙ７−ＮＨＳエステル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で誘導体化し、残りのアミンはペプチドをコンジュゲートするために用いられた。ＳＰＩＯおよびリポソームの調製に関する詳細は、下に記載される。クロドロナートはＳｉｇｍａから購入し、記載の通りにリポソームに組み込んだ（Ｖａｎ ＲｏｏｉｊｅｎおよびＳａｎｄｅｒｓ（１９９４年））。
ナノ粒子注射。静脈内注射のために、腹腔内アベルチンで動物に麻酔をかけ、リポソーム（２μｍｏｌ ＤＳＰＣ）および／またはナノ粒子（１〜４ｍｇ Ｆｅ／ｋｇ体重）を尾静脈に注射した。麻酔下ＰＢＳによる心臓灌流によって注射の５〜２４時間後に動物を屠殺し、器官を切開して粒子ホーミングについて分析した。肝臓マクロファージを抑制するために、マウスをリポソームのクロドロナート懸濁液（１マウスにつき１００μｌ）で静脈内注射し、２４時間後にマウスを実験のために用いた。
血餅に結合するファージおよびナノ粒子。凝固血漿タンパク質に結合するファージを、記載の通り（Ｐｉｌｃｈ２００６年）に決定した。遊離のＣＲＥＫＡペプチドの存在下または非存在下で、ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯおよび対照ＳＰＩＯを新たに形成された血漿凝塊に加えた。１０分間のインキュベーションの後、血餅をＰＢＳで４回洗浄し、新しいチューブに移し、１００μｌ濃硝酸で消化した。消化された材料を２ｍｌの蒸留水に希釈し、誘導結合プラズマ光学発光分光法（ＩＣＰ−ＯＥＳ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）を用いて鉄の濃度を測定した。
ナノ粒子調製。高いペプチド結合密度を達成することが必要な場合、さらなるアミノ基を以下の通りに市販品のＳＰＩＯに加えた：最初に、アミノ化ステップの前に粒子を架橋するために、３ｍｌのコロイド（二重蒸留水に約１０ｍｇのＦｅ／ｍｌ）を、５ｍｌの５ＭのＮａＯＨおよび２ｍｌのエピクロロヒドリン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に加えた。有機相（エピクロロヒドリン）と水相（デキストランでコーティングされた粒子コロイド）との間で相互作用を促進するために、混合物を室温で２４時間攪拌した。過剰なエピクロロヒドリンを除去するために、透析カセット（１０，０００Ｄａカットオフ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ）を用いて、二重蒸留水に対して反応混合物を２４時間透析した。アミノ基を、以下の通りに粒子の表面に加えた：０．０２ｍｌの濃水酸化アンモニウム（３０％）を、１ｍｌのコロイド（約１０ｍｇ Ｆｅ／ｍｌ）に加えた。混合物を室温で２４時間攪拌した。反応混合物を、二重蒸留水に対して２４時間透析した。粒子をさらに洗浄するために、コロイドをＭＡＣＳ（登録商標）ミディ磁気分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ ＣＡ）に捕捉し、ＰＢＳで３回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳでカラムから溶出させた。
ＣＲＥＫＡペプチドをＳＰＩＯとコンジュゲートさせるために、粒子を１ｍｇ Ｆｅ／ｍｌの濃度で再懸濁し、ヘテロ二官能性リンカーＮ−［ａ−マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ；Ｐｉｅｒｃｅ）を撹拌下で加えた（２ｍｇのＦｅにつき２．５ｍｇのリンカー）。室温で４０分間のインキュベーションの後、ＭＡＣＳカラムの上で粒子を１０ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した。遊離の末端システインを有するペプチドを次に加えた（２ｍｇのＦｅにつき１００μｇのペプチド）。４℃で一晩のインキュベーションの後、粒子を再び洗浄し、Ｆｅの０．３５ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに再懸濁した。粒子とコンジュゲートしたペプチド分子の数を定量化するために、既知量のストックまたはＡＭＡＳ活性化粒子を、様々の量のペプチドと一緒にインキュベートした。インキュベーションの終了後、ベックマンＴＬＡ１００．３超遠心分離ローター（３０分間）を用いて１００．０００Ｇで粒子をペレットにし、未結合のペプチドの量を蛍光によって定量化した。コンジュゲートしたペプチドを粒子から切断するために、粒子をｐＨ１０、３７℃で一晩インキュベートした。上清中の遊離ペプチドの濃度は、蛍光を読みとることによって、および同じペプチドについて得られた較正曲線を用いて決定された。既知の量の粒子の蛍光強度をペプチドコンジュゲーション密度の関数としてプロットし、異なるバッチでコンジュゲーション密度を決定するために勾配の方程式を用いた。
リポソーム調製。リポソームを調製するために、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロールおよび１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−｛［Ｎ（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸］スクシニル｝（ニッケル塩）（全てＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ ＡＬから）を５７：３７：１０のモル比でクロロホルム中で混合し、乾燥するまで回転乾燥機で蒸発させた。最終ＤＳＰＣ濃度１０ｍＭまで脂質をＰＢＳで水和させた。リポソーム形成を促進するために、脂質混合物を５５℃で１０分間、広範囲に浴槽超音波処理した。プレーンリポソームについては、ＤＳＰＣおよびコレステロールだけを５７：３７のモル比で用いた。
ＣＲＥＫＡで修飾されたリポソームは、ＰＥＧ−ＤＳＰＥ−マレイミド（Ａｖａｎｔｉ）を２倍モル過剰のＣＲＥＫＡと反応させることによって調製された。ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４中で、窒素の下、室温で反応を実行した。反応が２時間で終了した後、生成物（黄色沈殿）を遠心分離によって洗浄し、エタノールに溶解した。エタノール溶液を、−２０℃で保存した。ＣＲＥＫＡ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥの乾燥フィルムにリポソーム懸濁液を加え、撹拌しながら５５℃まで１時間加熱することによって、ＣＲＥＫＡ−ＰＥＧを組み込んだ。対照リポソームは、ＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを代わりに用いたこと以外は上記のように調製した。リポソーム調製物は、使用時まで４℃で保存した。
ナノ粒子によるタンパク質結合の分析。ＳＰＩＯナノ粒子への可溶性血漿タンパク質の結合を試験するために、粒子をクエン酸塩加マウス血漿と一緒に１〜２ｍｇ鉄／ｍｌ血漿の濃度でインキュベートした。あるいは、粒子を動物に注射し、注射の５〜１０分後に血漿を収集した。結合していないタンパク質を除去するために粒子を磁気カラムの上で洗浄し、１０％ＳＤＳ中で粒子を２０分間煮沸させた。超遠心（１００．０００ｇ、１０分間）によって酸化鉄をペレットにし、上清中の溶出タンパク質は−２０℃で一晩アセトンによって沈殿させた。タンパク質ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、ゲルは銀染色した（ＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。質量分光分析のために、粒子から抽出されたタンパク質を水で再構成した；タンパク質のアリコートをトリプシンで消化し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＰＥ ＳＣＩＥＸ ＱＳＴＡＲＲ液体クロマトグラフＱ−ＴＯＦ質量分析計、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡを用いて分析した。データは、Ｍａｓｃｏｔサーチエンジン（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いて分析した。
ナノ粒子クリアランス。ナノ粒子注射後の異なる時間にヘパリン化毛細管を用いて眼窩周囲叢から５０μｌの血液を抜き、血液を３００ｇで２分間遠心分離し、血小板に富む血漿の１０μｌアリコートを６００μｌの１Ｍトリス溶液ｐＨ８．４に希釈した。蛍光をＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）ＬＳ５０Ｂ分光蛍光計で測定し、粒子が循環した時間の関数としてプロットした。
生体内鏡検。ＭＤＡ−ＭＢ４３５異種移植片を有するマウスでの腫瘍血流を、生体内鏡検によって観察した。Ｎｉ−リポソームおよび５×１０８個のＤｉＩ標識赤血球でマウスを事前注射した。皮膚弁を脇によけて腫瘍を露出させ、マウスに４ｍｇ／ｋｇのフルオレセイン−ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯを静脈内注射した（時間「０」）。ＩＶ−ＯＢ３５Ｆ２２Ｗ２９ ＭｉｃｒｏＰｒｏｂｅ対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｏｒｐ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いてＩＶ−１００生体内レーザー走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｏｒｐ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で腫瘍をスキャンした。注射の１２０分後まで１０分間隔で映像を記録した。
超伝導量子干渉素子（ＳＱＵＩＤ）磁力計を用いる組織試料の磁気測定。組織試料を収集の後直ちに冷凍し、凍結乾燥し、秤量し、ゼラチンカプセルに入れた。１５０Ｋで操作されるＱｕａｎｔｕｍ Ｄｅｓｉｇｎ ＭＰＭＳ２ ＳＱＵＩＤ磁力計（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて作製される磁気測定のために、透明なプラスチックストローの中央にカプセルを挿入した。１テスラまで段階的に増加させた直流磁場（ｄｉｒｅｃｔ ｃｕｒｒｅｎｔ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｉｅｌｄ）に試料を曝露させた。組織、カプセルおよびストローの反磁性寄与のための補正を行った。
Ｂ．（実施例２）−モジュール式の多官能性ミセルを用いるアテローム硬化症の標的化
アテローム硬化性プラークの管腔表面に生じるかすかな凝固は、ナノ粒子に基づく診断薬および治療薬のための新規標的を提供する。同じ粒子に標的化要素、フルオロフォアおよび、必要に応じて薬物構成成分を含有する、多官能性のモジュール式ミセルが開発された。高脂肪食を給餌したＡｐｏＥヌルマウスでアテローム硬化性プラークを標的化することが、凝固血漿タンパク質に結合するペンタペプチドＣＲＥＫＡ（配列番号１）（システイン−アルギニン−グルタミン酸−リジン−アラニン）で達成された。蛍光ミセルはプラークの表面全体に結合し、特に、破裂を起こしやすい場所であるプラークの肩（ｓｈｏｕｌｄｅｒ）に集中する。非標的化ミセルと比較すると、標的化ミセルは、増加した濃度の抗凝固薬、ヒルログもプラークに送達する。
１．結果
モジュール式多官能性ミセル。ミセルの一般構造を図１０に示す。個々のリポペプチドモノマーは、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）テール、ＰＥＧ（２０００）スペーサー、およびカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）−ＣＲＥＫＡペプチド、赤外線蛍光体またはヒルログペプチドのいずれかであった可変頭基で作製された。水溶液に入れたとき、これらの化合物は１７．０±１．０ｎｍの平均流体力学的直径を有するミセルを形成した。ミセルの組成は変更することができ、例えばＦＡＭ−ＣＲＥＫＡモノマーだけから、または３つのモノマーの全てを混合することによって標的化ミセルが作製された。非標的化対照ミセルは、ＦＡＭ標識モノマーをＮ−アセチルシステインモノマーと混合して得られた。循環中のＦＡＭ−ＣＲＥＫＡミセルの半減期は蛍光によって測定され、１３０分であった。蛍光ＣＲＥＫＡ／ヒルログ混合ミセルの循環中の半減期は抗トロンビン活性を用いて測定され、約９０分であることが見出された。
アテローム硬化症マウスの大動脈樹のｅｘ ｖｉｖｏ画像化。ＡｐｏＥヌルマウスでのアテローム硬化性プラークは、マウスを高脂肪食で維持することによって得られた（Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｙら、（１９９４年）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ １４巻、１３３〜１４０頁、Ｒｅｄｄｉｃｋ ＲＬら、（１９９４年）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ １４巻、１４１〜１４７頁）。以前の試験は、他の動物モデルでのアテローム硬化性プラークの表面および内部ならびにヒトプラークでのフィブリン蓄積を明らかにした（Ｅｉｔｚｍａｎ ＤＴら（２０００年）Ｂｌｏｏｄ ９６巻、４２１２〜４２１５頁）。類似した結果が、ＡｐｏＥモデルで示される；抗フィブリン（フィブリノーゲン）抗体はこのモデルでプラークを染色したが、見かけ上正常な血管壁を染色せず（図１２Ａを参照）、これらの部位での凝固血漿タンパク質の存在を示した。これらのフィブリン沈着物は、画像化のための標的の役目を果たした。フルオレセイン標識ＣＲＥＫＡミセルをマウスに注射し、ｅｘ ｖｉｖｏで単離された大動脈樹を画像化した。大部分のアテローム硬化性病変を含有した領域で、高い蛍光強度が観察された。ＡｐｏＥヌルマウスでは、これらの領域には腕頭動脈および大動脈弓下部（ｌｏｗｅｒ ａｏｒｔｉｃ ａｒｃｈ）が含まれた（Ｍａｅｄａ Ｎら、（２００７年）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １９５巻、７５〜８２頁）。蛍光非標的化ミセルとの定量的な比較は、標的化されたミセル（任意の単位の蛍光強度：２７７，０００±１０，０００）と標的化されなかったミセル（５，１００±３，３００；図１１）との間の大きな差を明らかにした。差は、統計的に有意であった（ｐ≦０．００１）。過剰の非標識ＣＲＥＫＡミセルが事前注射された場合、ＣＲＥＫＡ標的化ミセルからの大動脈樹での蛍光は消失した（５，２００±５，０００；ｐ≦０．００１）が、非標識の非標的化ミセルは、ＣＲＥＫＡミセルのホーミングを有意に阻害しなかった（１８６，０００±５６，０００）。ＣＲＥＫＡミセルは、アテローム硬化症マウスで罹患血管系を特異的に標的化し、アテローム硬化性プラーク形成を起こしやすい領域に集中することができることをこれらの結果は示す。
アテローム硬化性プラークへのＣＲＥＫＡミセルの結合。ＣＲＥＫＡミセルを注射したマウスからの血管樹の組織学的検査は、プラークの管腔表面の蛍光を示したが、顕微鏡薄片では血管の組織学的に健康な部分への有意な結合はなかった（図１２Ａ）。驚くことに、ミセルは、プラークが破裂を起こしやすいことが公知であるプラークの肩領域に集中する（挿入図、図１２Ａ）（Ｆａｌｋ Ｅら、（２００７年）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２７巻、９６９〜９７２頁、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ＰＤら、（１９８９年）Ｌａｎｃｅｔ ２巻、９４１〜９４４頁）。抗ＣＤ３１（内皮細胞）および抗ＣＤ６８（マクロファージおよびリンパ球）免疫蛍光検査で示されるように、ミセルからの蛍光は高炎症領域のプラークの内皮層の下に見られた。凝固血漿タンパク質は、抗フィブリノーゲン抗体を用いてプラークの表面および内部全体で可視化された。ＣＲＥＫＡミセルは、心臓および肺を含む他の組織に実質的に結合しなかったが、肝臓、脾臓および腎臓、すなわちナノ粒子を非特異的に捕捉することが公知の組織では少量が見出された（図１２Ｂ）。また、正常なマウスの大動脈におけるＣＲＥＫＡミセルの蓄積はなかった（図１４）。したがって、ＣＲＥＫＡミセルはアテローム硬化性プラークを特異的に標的化し、健康な血管系へ認識可能に結合することなく破裂を起こしやすい領域に集中する。
アテローム硬化性プラークへのＣＲＥＫＡミセルの結合における凝固の役割。腫瘍血管へのＣＲＥＫＡ酸化鉄ナノ粒子の結合は、これらの血管の内腔で凝固を誘導し、粒子の結合を増幅することが前に示された（Ｓｉｍｂｅｒｇ Ｄら、（２００７年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４巻、９３２〜９３６頁）。その試験では、これらの腫瘍ホーミングは、凝固によって誘発される増幅を阻止するヘパリンの事前注射によって大いに低減された。可能性としては癌の診断および処置で有益であるが、凝固媒介増幅はアテローム硬化症の管理では望ましくないであろう。ＣＲＥＫＡミセルの注射の後の顕微鏡薄片では、アテローム硬化性血管の内腔で凝固は観察されなかった。さらに、ヘパリンの事前注射の後にＦＡＭ−ＣＲＥＫＡミセルを注射したアテローム硬化症マウスの大動脈では、高い蛍光強度がなお観察された（図１５Ａ）。プラーク表面でのＣＲＥＫＡによる凝固誘導の非存在がミセルまたはプラーク微小環境の特性であるか否かを決定するために、ＣＲＥＫＡ酸化鉄ナノ粒子が血管内凝固を引き起こす２２ＲＶ１腫瘍を有するマウスにＣＲＥＫＡミセルを注射した。ＣＲＥＫＡミセルは腫瘍血管の壁に蓄積したが、検出可能な血管内凝固を引き起こさなかった（図１５Ｂ）。したがって、ＣＲＥＫＡ酸化鉄粒子とは異なり（Ｒｏｓａｍｏｎｄ Ｗら、（２００７年）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１５巻、ｅ６９〜１７１頁）、ＣＲＥＫＡミセルは標的血管で凝固を誘導せず、アテローム硬化性プラークへのナノ粒子標的化のためにＣＲＥＫＡミセルプラットホームが適することを示す。
アテローム硬化性プラークへの抗トロンビンペプチド、ヒルログの標的化。抗凝血物質であるヘパリンは、さらなる血餅の形成を予防するために、不安定狭心症患者で用いられる。しかし、この薬剤はトロンビンを間接的に阻害し、フィブリンに既に結合しているトロンビンを阻害することができない。さらに、その使用は、重大な出血事象および血小板減少を含む深刻な合併症をもたらし得る。トロンビンの直接的な阻害剤は副作用がより少なく、血餅に既に結合しているトロンビンを阻害することができる。小さな合成ペプチドであるヒルログは、天然のトロンビン阻害剤、ヒルジンからの活性部位を、可撓性グリシンリンカーを通して単一の２０アミノ酸ペプチドと組み合わせることによって設計された（Ｍａｒａｇａｎｏｒｅ ＪＭら、（１９９０年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９巻、７０９５〜７１０１頁）。ヒルログはミセルナノ粒子とコンジュゲートされ、それがトロンビン活性についての発色性アッセイで完全な活性を保持することを示した（図１３Ａ）。アテローム硬化性プラークへヒルログを送達するために、ＣＲＥＫＡ標的化ミセルが用いられた。ＣＲＥＫＡ／ＦＡＭ／ヒルログ混合ミセルをアテローム硬化症マウスに注射し、３時間循環させた。アテローム硬化性大動脈での蛍光の蓄積は、上記のＣＲＥＫＡ／ＦＡＭミセルのそれと同一であった。切除された大動脈樹での抗トロンビン活性は、非標的化ミセルを受容したマウスよりも、ＣＲＥＫＡ標的化ミセルを注射されたマウスの大動脈で有意に高かった（組織１ｍｇにつき１．８μｇおよび１．２μｇ、ｐ≦０．０５）。ＣＲＥＫＡ標的化ミセルは、野生型マウスよりアテローム硬化症マウスの大動脈で有意に高い抗トロンビン活性も引き起こした（組織１ｍｇにつき０．８μｇ、ｐ≦０．０５、図１３Ｂ）。ＣＲＥＫＡ標的化ミセルがヒルログをプラークへ選択的に送達することができることを、これは証明する。
２．考察
標的化ミセルナノ粒子は、ｉｎ ｖｉｖｏで化合物および組成物（例えば、診断用画像化色素および治療化合物）をアテローム硬化性プラークに向けるために用いることができる。標的化要素として脂質テール付き血餅結合ペプチドＣＲＥＫＡ、標識剤として蛍光色素、および場合によっては抗凝血物質としてヒルログで構成される混合ミセルは、プラークに特異的に結合した。プラークは蛍光を蓄積し、およびヒルログがミセルに含まれた場合は、抗トロンビン活性の増加したレベルが罹患血管で見られた。このミセルナノ粒子プラットホームの特性であるモジュラリティは、複数の機能をナノ粒子に組み入れることを可能にする。
ＣＲＥＫＡペプチドでコーティングされたミセルは、ＡｐｏＥヌルマウスで罹患血管系を特異的に標的化することができた。標的化の特異性は、いくつかの観察から明白であった。最初に、アテローム硬化症マウスの大動脈樹でのミセルからの蛍光は、プラーク形成の公知の領域に局在化され、野生型マウスで蛍光は観察されなかった。第二に、ＣＲＥＫＡミセルは組織学的切片ではプラークの全表面に結合するが、血管の健康な部分に結合しない。第三に、過剰の非標識ＣＲＥＫＡミセルは、蛍光ＣＲＥＫＡミセルのプラーク結合を阻害した。したがって、ＣＲＥＫＡペプチドで標的化したミセルは、アテローム硬化性プラークを標的化するための潜在的に有用な手法を提供する。
ＣＲＥＫＡミセルはプラークの全表面を修飾したが、ミセルの最も強力な蓄積は、プラークと血管壁の組織学的に健康な部分との間の接合部である肩で起き、そこは最も破裂を起こしやすい部位である（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ＰＤら、（１９８９年）Ｌａｎｃｅｔ ２巻、９４１〜９４４頁）。病変部肩での高濃度の標的化ミセルは、破裂を起こしやすいプラークに化合物を送達することでこれらのミセルが有効である可能性を示す。
画像化では、蛍光ＣＲＥＫＡミセルの注射の後、アテローム硬化症マウスの大動脈樹で増加した蛍光が観察された。しかし、赤外線色素Ｃｙ７で標識されたＣＲＥＫＡミセルは、ｉｎ ｖｉｖｏでプラークを可視化するのに十分なシグナルを発生しなかったが、この原因はおそらく励起シグナルおよび放出シグナルの不十分な組織透過のためであろう。ミセルのモジュラリティは、より感度が高く透過性である画像化技術、例えばＰＥＴまたはＭＲＩのためのプローブの構築を可能にする。
ＣＲＥＫＡでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の腫瘍へのホーミングは、腫瘍血管内で粒子によって誘導される血液凝固に一部依存している（Ｄａｖｉｅｓ ＭＪ（１９９２年）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８５巻、１１９〜２４頁）。重要なことに、ミセルは、腫瘍血管に向かうもののそれらの中でいかなる検出可能なさらなる凝固を誘導しなかったので、ＣＲＥＫＡミセルはＣＲＥＫＡでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子よりも血栓を形成しない。さらに、アテローム硬化症マウスで血液凝固をヘパリンで阻害することは、プラークでのＣＲＥＫＡミセルの蓄積に有意な影響を及ぼさなかった。したがって、ＣＲＥＫＡミセルの血栓形成性は低く、それらは腫瘍およびプラークで予め形成された凝固物質だけを有意に標的化する。
抗凝血物質であるヘパリンの存在がプラークへのＣＲＥＫＡミセルの標的化を有意に低減しなかったので、ＣＲＥＫＡミセルはこれらの病変へ抗凝血物質を送達するように機能した。ＣＲＥＫＡ／ＦＡＭミセルと同様に、ＣＲＥＫＡ／ヒルログ混合ミセルは罹患血管系でプラークの破裂を起こしやすい肩領域に蓄積し、抗トロンビン活性を有意に増加させた。したがって、ＣＲＥＫＡミセルプラットホームは、プラークで凝固傾向を低減するために用いることができ、プラーク破裂時の血栓形成のリスクを低減することもできる。さらに、標的化は用量を低下させることを可能にし、そのことは出血合併症のリスクを低減するはずである。
３．材料および方法
ミセル。ミセル脂質テールへの共有結合性コンジュゲーションのために、Ｎ末端（Ｃｙｓ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−（Ｇｌｙ）４−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ）にシステイン残基を加えることによって抗凝血性ペプチドヒルログ−２を改変した。全てのペプチドの合成は、マイクロ波支援自動ペプチド合成機（Ｌｉｂｅｒｔｙ、ＣＥＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にＦｍｏｃ／ｔ−Ｂｕストラテジを適合させることによって実行された。アセトニトリル−水混合物中の０．１％ＴＦＡを用いるＨＰＬＣによって、ペプチド粗原料を精製した。得られたペプチドはＨＰＬＣによって９０％〜９５％純粋であり、Ｑ−ＴＯＦ質量分光分析によって特徴付けされた。
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）−マレイミド）および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）−アミン）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．から購入した。Ｃｙ７モノＮＨＳエステルは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。
ペプチドを含有する水：メタノール溶液（容積で９０：１０）に１０％モル過剰の脂質を加えることによって、チオエーテル結合を通してシステイン含有ペプチドをＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）−マレイミドとコンジュゲートさせた。室温で４時間の反応の後、Ｎ−アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ）の溶液を加えて遊離のマレイミド基と反応させた。生じた生成物は、次に６０℃においてＣ４カラム（Ｖｙｄａｃ）で逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製された。
１０容量％メタノールを含有する１０ｍＭ水性炭酸緩衝液（ｐＨ＝８．５）に溶解させた脂質に３倍のモル過剰のＣｙ７モノＮＨＳエステルを加えることによって、ペプチド結合を通してＣｙ７をＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）−アミンとコンジュゲートさせた。４℃で８時間の反応の後、混合液を上記のようにＨＰＬＣによって精製した。
メタノールに各純粋な構成成分を溶解し、構成成分を混合し、混合溶液を窒素の下で蒸発させることによって、フルオロフォアおよびペプチド含有ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）両親媒性物質の混合物をガラス培養試験管内で調製した。生じたフィルムを減圧下で８時間乾燥させ、次に８０℃において１０ｍＭのＮａＣｌの塩濃度の水で水和させた。試料を８０℃で３０分の間インキュベートし、室温まで６０分の間冷却させた。次に２２０ｎｍのポリ（ビニリデンフルオリド）注射器フィルター（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通して、溶液を濾過した。
動的光散乱によって測定されたミセルサイズ。動的光散乱（ＤＬＳ）を用いる粒径測定によって、小さな球状ミセルの存在を確認した。ＤＬＳシステム（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）は、遅延時間の関数として６３２．８ｎｍのＨｅＮｅレーザー（Ｍｅｌｌｅｓ Ｇｒｉｏｔ）からの散乱強度を測定するためのアバランシェフォトダイオード検出器からなった。測定角度、したがって散乱波数ベクトルｑを変更するために、ゴニオメーターを用いた。
０．０１５ｎｍ−１から０．０２５ｎｍ−１の範囲の散乱波数ベクトルの関数として、一次自己相関関数の最初のキュムラントΓを測定した。凝集体の並進拡散係数を決定するために量Γ／ｑ２をｑ＝０に線形に外挿し、測定された拡散係数に基づいてミセルの流体力学的直径を推定するために、ストークス−アインシュタイン［おそらく、物理科学にあまり詳しくない人のための参考文献］関係を用いた。
循環中のミセルの半減期。Ｂａｌｂ／ｃ野生型マウスにミセルの１ｍＭ溶液の１００μＬを静脈内注射することによって、循環中のＦＡＭ−ＣＲＥＫＡミセルの半減期を測定した。注射後の様々な時点で同じマウスからヘパリン化毛細管を用いて後眼窩洞（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ ｓｉｎｕｓ）から血液を収集した。血液を１０００ｇで２分間遠心分離し、血漿の１０μＬのアリコートをＰＢＳで１００μＬまで希釈した。血漿の蛍光は、４８５ｎｍの励起波長および５２８ｎｍの放出波長で蛍光光度計を用いて測定した。
Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスに１００μｌの１ｍＭミセルを静脈内注射することによって、循環中のＦＡＭ−ＣＲＥＫＡ／Ｃｙ７／ヒルログ混合ミセルの半減期を測定した。様々な時点で心臓穿刺によって異なるマウスから血液を３．２％クエン酸ナトリウム緩衝液に収集し、１０００ｇで１０分間遠心分離した。次に、ヒルジンのための公表されたプロトコル（ｄｉａＰｈａｒｍａ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、オハイオ州）に従ってＳ−２３６６発色基質によるアッセイを用いて、抗トロンビン活性について血漿を分析した。
アテローム硬化性プラークへのミセルの標的化。腕頭動脈および大動脈弓でステージＶ病変（２４）を生成するために、ＡｐｏｅｔｍｌＵｎｃ変異にホモ接合であるトランスジェニックマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）に高脂肪食（４２％脂肪、ＴＤ８８１３７、Ｈａｒｌａｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を６カ月間給餌した。マウスを収容し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｄｏｒｎｉａ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの基準に従って全ての手順を実行した。頭基としてＦＡＭ−ＣＲＥＫＡまたはＦＡＭおよびＮ−アセチルシステインの１：１混合物のいずれかを含む１ｍＭミセルの１００μｌを、尾静脈を通してマウスに静脈内注射した。ミセルをマウスで３時間循環させ、次に、あらゆる未結合のミセルを除去するために左心室を通して氷冷ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）でマウスを潅流した。心臓、大動脈樹、肝臓、脾臓、肺および腎臓を切除し、４℃で一晩、４％パラホルムアルデヒドで固定した。ｅｘ ｖｉｖｏ画像化は、５３０ｎｍ観察フィルター、ｉｌｌｕｍａｔｏｏｌ光源（Ｌｉｇｈｔ Ｔｏｏｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ、ＣＡ）およびＣａｎｏｎ ＸＴｉ ＤＳＬＲカメラを用いて実施された。次に組織を３０％ショ糖溶液で８時間処理し、凍結切片作製（ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ）のためにＯＣＴに冷凍した。蛍光強度の定量化は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて実施した。
ＣＲＥＫＡミセルによる腫瘍標的化。雄ヌードマウスの前立腺に２２Ｒｖ−１（３０μｌのＰＢＳ中に２×１０６個の細胞）ヒト前立腺癌細胞を移植することによって、正常位前立腺癌異種移植を生成した。腫瘍容積が約５００ｍｍ３に到達したとき、尾静脈を通して１００μｌの１ｍＭ ＦＡＭ−ＣＲＥＫＡミセルをマウスに静脈内注射した。ミセルを３時間循環させ、次に左心室を通してマウスを氷冷ＤＭＥＭで潅流した。腫瘍を切除し、切片作製のためにＯＣＴに冷凍した。
免疫蛍光検査。腕頭動脈、大動脈弓、健康な血管、対照器官または２２Ｒｖ−１前立腺腫瘍の厚さ５μｍの連続薄片をシラン処理顕微鏡スライド（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｄｅｖｉｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｄｅｓ Ｐｌａｉｎｅｓ、ＩＬ）にマウントして、風乾させた。切片を氷冷アセトンで５分間固定し、次にＩｍａｇｅ−ｉＴ ＦＸシグナルエンハンサー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）でブロックした。内皮細胞ならびにマクロファージおよび他のリンパ球をそれぞれ視覚化するために、ＣＤ３１およびＣＤ６８に対するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７コンジュゲートラット抗マウス抗体（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃｈ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）を用いた。ヤギで作製された一次ポリクローナル抗体およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７コンジュゲート抗ヤギ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で、フィブリノーゲンを染色した。ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄフェーディング防止マウント剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中のＤＡＰＩで、切片を同時染色した。共焦点顕微鏡を用いて血管の画像を撮影した。
プラーク表面のヒルログ活性の定量化。頭基としてＦＡＭ−ＣＲＥＫＡ、ＣＲＥＫＡ、Ｃｙ７およびヒルログをそれぞれ３：３：０．３：３．７の比で含む１ｍＭ（全脂質含量）混合ミセルの１００μｌを、尾静脈を通してマウスに静脈内注射した。ミセルをマウスで３時間循環させ、次に、あらゆる未結合のミセルを除去するために左心室を通して氷冷ＤＭＥＭでマウスを潅流した。大動脈樹を切除し、１ｍｌのクエン酸ナトリウムを含む正常なヒト血漿中でホモジナイズした（ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ、ＭＡ）。次に、ヒルジンのための公表されたプロトコルに従ってＳ−２３６６発色基質によるアッセイを用いて、ヒルログの抗トロンビン活性を定量化した（ｄｉａＰｈａｒｍａ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、Ｏｈｉｏ）。
参考文献
配列
配列番号１ ＣＲＥＫＡ
配列番号２ ＣＧＬＩＩＱＫＮＥＣ
配列番号３ ＣＮＡＧＥＳＳＫＮＣ
配列番号４ ＣＸＸＸＸＸＸＸＣ、式中Ｃはシステインであり、Ｘは任意のアミノ酸である
配列番号５ ＣＲＫＤＫＣ
配列番号６ ＣＡＲＳＫＮＫＤＣ。

Claims (86)

  1. 両親媒性分子を含む組成物であって、前記両親媒性分子の少なくとも１つは血餅結合頭基を含み、前記血餅結合頭基は凝固血漿タンパク質に選択的に結合し、前記組成物は凝固を引き起こさない、組成物。
  2. 前記両親媒性分子の少なくとも１つは機能的頭基を含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記機能的頭基が検出頭基である、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記機能的頭基が処置頭基である、請求項２に記載の組成物。
  5. 前記両親媒性分子の少なくとも１つは検出頭基を含み、前記両親媒性分子の少なくとも１つは処置頭基を含む、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記両親媒性分子が親水性媒体にさらされた、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
  7. 前記両親媒性分子が前記親水性媒体中で凝集体を形成した、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記凝集体がミセルを含む、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記血餅結合頭基が、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）またはその保存的な改変体を含むアミノ酸セグメント、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含むアミノ酸セグメント、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなるアミノ酸セグメント、またはアミノ酸配列ＲＥＫからなるアミノ酸セグメントより独立して選択されるアミノ酸セグメントを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記アミノ酸セグメントがアミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）またはその保存的な改変体を各々独立して含む、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記アミノ酸セグメントがアミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を各々独立して含む、請求項９に記載の組成物。
  12. 前記アミノ酸セグメントの少なくとも１つはアミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなる、請求項９に記載の組成物。
  13. 前記アミノ酸セグメントの少なくとも１つはアミノ酸配列ＲＥＫからなる、請求項９に記載の組成物。
  14. 前記両親媒性分子が検出可能である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 前記両親媒性分子が、蛍光、ＰＥＴまたはＭＲＩによって検出可能である、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記両親媒性分子が蛍光によって検出可能である、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記検出頭基がＦＡＭまたはその誘導体を含む、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記処置頭基が心血管疾患を処置するための化合物または組成物を含む、請求項４から１７のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 前記処置頭基がアテローム硬化症を処置するための化合物または組成物を含む、請求項４から１８のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 前記処置頭基がトロンビンの直接的な阻害剤を含む、請求項４から１９のいずれか一項に記載の組成物。
  21. 前記処置頭基がヒルログまたはその誘導体を含む、請求項４から２０のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 前記処置頭基が癌を処置するための化合物または組成物を含む、請求項４から２１のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記両親媒性分子を含むミセルを含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 前記両親媒性分子を含むリポソームを含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 請求項１から２４のいずれか一項に記載の組成物と、被験体の中のプラークとのコンジュゲート。
  26. 請求項１から２４のいずれか一項に記載の組成物と、被験体の中の腫瘍とのコンジュゲート。
  27. 両親媒性分子を含む組成物を被験体に投与するステップを含む方法であって、前記両親媒性分子の少なくとも１つは血餅結合頭基を含み、前記血餅結合頭基は凝固血漿タンパク質に選択的に結合し、前記組成物は凝固を引き起こさず、前記組成物は前記被験体の中の凝固血漿タンパク質に結合する、方法。
  28. 前記両親媒性分子の少なくとも１つは機能的頭基を含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記機能的頭基が検出頭基である、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記機能的頭基が処置頭基である、請求項２８に記載の方法。
  31. 前記両親媒性分子の少なくとも１つは検出頭基を含み、前記両親媒性分子の少なくとも１つは処置頭基を含む、請求項２７に記載の方法。
  32. 前記被験体が、凝固血漿タンパク質に関連するおよび／またはそれを生じる疾患または状態の処置を必要とする、請求項２７から３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記組成物を投与するステップが、凝固血漿タンパク質に関連するおよび／またはそれを生じる前記疾患または状態を処置する、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記被験体が心血管疾患の処置を必要とする、請求項２７から３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記組成物を投与するステップが前記心血管疾患を処置する、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記心血管疾患がアテローム硬化症である、請求項３４または３５に記載の方法。
  37. 前記被験体が癌の処置を必要とする、請求項２７から３３のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記組成物を投与するステップが前記癌を処置する、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記被験体が、凝固血漿タンパク質に関連するおよび／またはそれを生じる疾患または状態の検出、視覚化またはその両方を必要とする、請求項２７から３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 凝固血漿タンパク質に関連するおよび／またはそれを生じる前記疾患または状態を検出するステップ、視覚化するステップ、またはその両方をさらに含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記被験体が心血管疾患の検出、視覚化、またはその両方を必要とする、請求項２７から４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記心血管疾患を検出するステップ、視覚化するステップ、またはその両方をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記心血管疾患がアテローム硬化症である、請求項４１または４２に記載の方法。
  44. 前記被験体が、癌、腫瘍またはその両方の検出、視覚化またはその両方を必要とする、請求項２７から４０のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記癌、腫瘍またはその両方を検出するステップ、視覚化するステップ、またはその両方をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
  46. 投与するステップの前に、前記両親媒性分子を親水性媒体にさらすステップをさらに含む、請求項２７から４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記両親媒性分子が前記親水性媒体中で凝集体を形成する、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記凝集体がミセルを含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記血餅結合頭基が、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）またはその保存的な改変体を含むアミノ酸セグメント、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含むアミノ酸セグメント、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなるアミノ酸セグメント、またはアミノ酸配列ＲＥＫからなるアミノ酸セグメントより独立して選択されるアミノ酸セグメントを含む、請求項２７から４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記アミノ酸セグメントがアミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）またはその保存的な改変体を各々独立して含む、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記アミノ酸セグメントがアミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を各々独立して含む、請求項４９に記載の方法。
  52. 前記アミノ酸セグメントの少なくとも１つはアミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなる、請求項４９に記載の方法。
  53. 前記アミノ酸セグメントの少なくとも１つはアミノ酸配列ＲＥＫからなる、請求項４９に記載の方法。
  54. 投与するステップに続いて、前記両親媒性分子を検出するステップをさらに含む、請求項２７から５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記両親媒性分子が、蛍光、ＰＥＴまたはＭＲＩによって検出される、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記両親媒性分子が蛍光によって検出される、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記検出頭基がＦＡＭまたはその誘導体を含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記処置頭基が心血管疾患を処置するための化合物または組成物を含む、請求項３０から５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記処置頭基がアテローム硬化症を処置するための化合物または組成物を含む、請求項３０から５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記処置頭基がトロンビンの直接的な阻害剤を含む、請求項３０から５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記処置頭基がヒルログまたはその誘導体を含む、請求項３０から６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記処置頭基が癌を処置するための化合物または組成物を含む、請求項３０から６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記組成物が被験体の中のプラークとコンジュゲートする、請求項２７から６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記組成物が被験体の中の腫瘍とコンジュゲートする、請求項２７から６２のいずれか一項に記載の方法。
  65. 両親媒性分子を混合するステップを含む組成物を作製する方法であって、前記両親媒性分子の少なくとも１つは血餅結合頭基を含み、前記血餅結合頭基は凝固血漿タンパク質に選択的に結合し、前記組成物は凝固を引き起こさない、方法。
  66. 前記両親媒性分子を親水性媒体にさらすステップをさらに含む、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記両親媒性分子が前記親水性媒体中で凝集体を形成する、請求項６６に記載の組成物。
  68. 前記凝集体がミセルを含む、請求項６７に記載の組成物。
  69. 前記両親媒性分子の少なくとも１つは機能的頭基を含む、請求項６５から６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記機能的頭基が検出頭基である、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記機能的頭基が処置頭基である、請求項６９に記載の方法。
  72. 前記両親媒性分子の少なくとも１つは検出頭基を含み、前記両親媒性分子の少なくとも１つは処置頭基を含む、請求項６５から６８のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記血餅結合頭基が、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）またはその保存的な改変体を含むアミノ酸セグメント、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含むアミノ酸セグメント、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなるアミノ酸セグメント、またはアミノ酸配列ＲＥＫからなるアミノ酸セグメントより独立して選択されるアミノ酸セグメントを含む、請求項６５から７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記アミノ酸セグメントがアミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）またはその保存的な改変体を各々独立して含む、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記アミノ酸セグメントがアミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を各々独立して含む、請求項７３に記載の方法。
  76. 前記アミノ酸セグメントの少なくとも１つはアミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなる、請求項７３に記載の方法。
  77. 前記アミノ酸セグメントの少なくとも１つはアミノ酸配列ＲＥＫからなる、請求項７３に記載の方法。
  78. 前記両親媒性分子が検出可能である、請求項６５から７８のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記両親媒性分子が、蛍光、ＰＥＴまたはＭＲＩによって検出可能である、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記両親媒性分子が蛍光によって検出可能である、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記検出頭基がＦＡＭまたはその誘導体を含む、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記処置頭基が心血管疾患を処置するための化合物または組成物を含む、請求項７１から８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記処置頭基がアテローム硬化症を処置するための化合物または組成物を含む、請求項７１から８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記処置頭基がトロンビンの直接的な阻害剤を含む、請求項７１から８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記処置頭基がヒルログまたはその誘導体を含む、請求項７１から８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記処置頭基が癌を処置するための化合物または組成物を含む、請求項７１から８５のいずれか一項に記載の方法。
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