JPH11504329A - 細胞死の抑制および細胞中への作用物の分配に有用な組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、目標細胞を細胞死から再生する方法に関し、分裂した細胞膜を有する目標細胞を、特異な親和性試薬リポソーム接合に、効果的な量で、且つ前記接合が膜分裂に起因する細胞死を防止するに十分な時間接触させ、そして前記目標細胞の生育を決定することを特徴とする。診断及び療法のために、選択された作用物が損傷した目標細胞中に分配される方法も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞死の抑制および細胞中への作用物の 分配に有用な組成物および方法 発明の分野 本発明は、細胞死の抑制および細胞中への作用物の分配に有用な組成物および 方法に関する。 発明の背景 タンパク質とリン脂質は細胞膜の最も豊富な成分であり、リン脂質分子は１つ の極性ヘッド基と２つの無極性疎水性脂肪アシル鎖を有する。リン脂質は、水性 の内面を有する水性溶液中に異なる形態、例えば球状のリン脂質二重膜構造やリ ポソームとして存在できる。 リポソームは薬剤の分配キャリアとして有用であることが知られている。数多 くの論文がリポソームの製造方法論及び特性、特にリポソームの薬剤キャリアと しての使用と、種々のタイプの細胞との相互作用についての学習を記述している 。例えば、"Liposomes as Drug Carriers," Wiley and Sons，NY（1988）と "Li posomes from Biophysics to Therapeutics," Marcel Dekker，NY(1987)を参照 して欲しい。 リポソームを使用した薬剤の分配は、病気の処置を導入しないことを可能にす る。器官や組織への目標の設定は、免疫リポソーム、即ち器官特異の抗原又は組 織特異の抗原に対する抗体種と接合したリポソームを使用することにより更に効 果的になる。かくして、目標設定した薬剤の分配に対する１つのアプローチは、 リポソーム表面上の複数の特異抗体の結合により目標特定するように作られた薬 剤搭載のリポソームの使用にある。このようなシステムは、梗塞した心筋をリポ ソームの目標とする抗ミオシン抗体を使用して記述されている(Torchilin et al .，Biochem．Biorhys．Res．Comm．89:1114，1979 はここで参照文献として引用 する）。元の細胞膜を伴う通常の心筋細胞は、細胞膜を妨害したり細胞内成分と 干渉するための余剰な細胞の大きな分子、例えば抗ミオシン抗体を許容しない。 ところが、膜分裂を伴う壊死性筋細胞は、細胞膜の破れ目を通して外部に露出し た細胞内部のミオシンとの相互作用から、抗ミオシン抗体をもはや維持できない (Khaw et al.，Hybridoma 3:11-23，1984)。免疫リポソームに関連した試薬は、 最初は肝臓と脾臓によって、細網内皮系による隔離に起因してか、目標部位にお ける理想的な蓄積より少ない結果に終わることが報告されている。Torchilin et al.(FASEB Journal 6:2716，1992)は、ポリエチレングリコルで被覆した免疫リ ポソームを使用した循環回数の強化を報告している。 発明の要約 本発明は、特異な親和性試薬リポソーム接合が、死の過程にある細胞と接触す ることにより細胞死を抑制できるという発見に基づいている。本発明は、２つの 形態、即ち細胞膜のシーリングを経由して細胞死を抑制すること、および細胞膜 のシーリングを経由して細胞に作用物を分配することを包含する。本発明の両形 態は、特異な親和性試薬リポソーム接合を使用する。 かくして、本発明の第１の形態は、目標細胞を細胞死から救済する方法であっ て、分裂した細胞膜を有する目標細胞を、特異な親和性試薬リポソーム接合に、 効果的な量で、且つ前記接合が膜分裂に起因する細胞死を防止するに十分な時間 接触させ、そして前記目標細胞の生育を決定する方法を指向する。 本発明の上記形態はまた、特異な親和性試薬リポソーム接合を分裂細胞膜を有 する目標細胞と接触させ、特異な親和性試薬部分が細胞内抗原を認識して結合し 、前記特異な親和性試薬部分が前記細胞内抗原に固着することを許容する。この 固着は、前記細胞膜のシーリングが後続する前記膜の損傷部を先ず塞ぎ、壊死の 過程又は細胞死を抑制又は阻止する。 本発明の第２の形態は、リポソームで被包した生物学的作用物または核酸を、 健康な細胞と膜分裂した細胞の両方を含む組織に分配する方法を指向する。この 場合、前記膜分裂は自然に存在するものか、または特異に導入されたものである 。この方法は、前記組織を、前記生物学的作用物又は核酸を含み、且つ前記組織 の膜分裂した細胞を目標とする特異な親和性試薬リポソーム接合の効果的な量と 接触させることを含む。目標細胞との接合の接触は、前記組織の細胞中への前記 作用物の分配、および前記細胞膜の完全性の回復を生じさせる。 本発明の両形態の好ましい実施例では、前記特異な親和性試薬は抗体からなり 、そして前記抗体は特異であり、且つ細胞骨格抗原のような細胞内の抗原に結合 する。前記組織は心臓組織であり、前記抗体は心臓組織に細胞内抗原に特異であ る。前記組織は、癌性または通常のものである。 本発明はまた、心臓組織の細胞死を抑制する方法の形態をとる。この方法では 、細胞の外部に露出した細胞内ミオシンを有する心筋細胞を含む心臓組織を提供 し、前記心筋細胞の細胞内抗原に対し特異な抗体を有した免疫リポソームからな る接合と前記心筋細胞とを、前記接合が前記心筋細胞と固着するに十分な時間接 触させ、そして前記心筋細胞の生育を決定する。好ましくは、前記細胞内抗原は ミオシンからなる。 本発明はまた、遺伝的物質を細胞に分配する方法の形態をとる。この方法では 、遺伝的物質を含む特異な親和性試薬リポソーム接合を、分裂した細胞膜を有す る細胞に、前記遺伝的物質を前記細胞に分配し、且つ前記細胞の死を防止するに 十分な時間及び量接触させ、そして前記細胞の生育を決定する。 本発明はまた、生きている(in vivo)悪性細胞を殺す療法の効果を哺乳類にお いて強化する方法を包含する。この方法では、退化する腫瘍性細胞中に存在し、 その様な細胞の外部には存在しない細胞内部抗原に対し特異な免疫リポソームを 提供し、前記免疫リポソームは抗腫瘍剤を含み、生きている悪性細胞を殺す療法 を哺乳類において開始し、これにより前記悪性細胞の一部を壊死させ、そして前 記壊死性悪性細胞中に存在する前記細胞内部抗原に前記抗体を結合させることに より、前記哺乳類に対する前記免疫リポソームを管理し、これにより前記細胞に 対し前記抗腫瘍剤を分配する。 好ましくは、前記抗腫瘍剤は、細胞傷害剤、毒素、放射線増感化合物、α線放 射型放射性核種、β線放射型放射性核種、抗増殖剤及び遺伝子（IL-2 やTNFのよ うなサイトカイン用）からなる群から選択される。好ましくは、前記細胞は、放 射線、化学療法または免疫療法で殺される。 本書で使用される場合、「特異な親和性試薬」という用語は、目標としない物 質または分子に比べると、目標とする物質または分子に対して親和性を有する（ 即ち、実質的に大きな度合いで結合する）有機物質を意味する。本書で使用され る場合、この用語は、特定の器官、組織、細胞または細胞抗原、特に細胞内抗原 に特異する抗体を含み、そしてまた内部細胞受容体が存在する配位子（リガンド ）をも含む。 本発明の両形態の好ましい実施例では、特異な親和性試薬は、例えば細胞内抗 原に特異する抗体か、あるいは細胞内受容体に結合するリガンドである。 「細胞内抗原」は、腫瘍性細胞及び通常の細胞の両方に存在する抗原を含むが 、細胞死の一般的な循環に放出される抗原や、生存している細胞の外部にある抗 原は含まない。 「組織」は、互いに接触して生きる生きている細胞の塊を示し、また正常な組 織と、腫瘍、癌、前癌、新生物のような異常な組織の両方を指す。 「分裂細胞膜」は、ここでは、物理的な分裂、例えば細胞内容物を細胞外部か ら触れることができる損傷、切れ目、または穴を有する細胞膜と定義される。「 健康な」細胞は、一般的に分裂のある細胞膜を有せず、そしてその細胞内容物を 細胞の外部環境から触れることはできない。それ故、「不健康な」細胞は、分裂 細胞膜を有する細胞、即ち容易に死の過程の初期段階にいる細胞と定義される。 本書で使用される場合、「壊死」は、細胞が死ぬときに受ける過程に関し、前 記細胞膜の物理的な分裂を含むものである。壊死の開始時には、細胞膜が溶解し て損傷を形成するために、細胞膜の完全性は失われる。損傷の部位では、細胞膜 は生物学的に、酵素的に、そして化学的な崩壊によって次第に破壊される。壊死 の最終段階では、多くの細胞内組成物、例えば核抗原、細胞中の構造体要素、お よび細胞小器官が終局的に洗い出され、細胞を影（ゴースト）、即ち不要性の構 造体組成と細胞膜だけの状態にする。ここで使用される場合、壊死による細胞死 は、免疫リポソームによる分裂細胞膜のシーリング上で抑制され、防止され、ま たは反転される。 「再生可能な」膜分裂細胞とは、免疫リポソームに接触して、死の過程を反転 できる細胞である。かくて、「再生可能な」細胞とは、壊死の早期段階にある細 胞、即ち細胞膜にいくつかの損傷や穴を有して、１またはそれ以上の細胞内抗原 を細胞外部から触れることができるようにしているが、細胞核と細胞小器官は依 然として保持している細胞のことである。再生可能な細胞は、元のままの核を有 し、内部の核抗原を細胞外部に露出していない。 「再生不能な」細胞は、壊死の早期段階を越えて進行している膜分裂細胞、即 ち大きな膜の損傷が拡大し、細胞小器官のような細胞中の構造体要素を失ってい る、細胞ゴーストを残した細胞である。再生不能な細胞は、内部の核抗原を細胞 外部に露出し、かくして免疫リポソームに曝しても死を防止することができない 。 「健康な」細胞は、膜分裂しておらず、従ってそれらの細胞内抗原は細胞外の 環境に露出してしていない。かくて、健康な細胞と細胞内抗原に特異な免疫リポ ソームとの接触は、リポソームの抗体部分を抗原のそれに結合することにはなら ない。 「不健康な」細胞は、細胞膜に切れ目や分裂を有し、細胞内部の抗原を十分に 厳しく細胞外部の環境に露出している細胞である。かくて、不健康な細胞と細胞 内抗原に対し特異な免疫リポソームとの接触は、前記抗原と前記リポソームの抗 体部分との結合は生じさせる。 生物学的作用物または核酸の細胞中への「分配」は、分配する物質に依存する 、直接的または間接的な方法によって決定される。例えば、核酸が分配されると ころでは、育成している細胞が核酸（例えば、混成を介して）の存在または不存 在のために、あるいは遺伝子発現及び発現された生成物の検出のために評価され る。 生物学的「薬剤」または「作用物」は共に療法的作用物と修飾因子分子を含む 。「療法的作用物」とは、例えば抗腫瘍剤や他の薬剤及び遺伝子（組織の形質転 換と分化のための）を指す。「修飾因子分子」とは、例えば細胞障害分子、放射 性核種、撮像剤、環境指示基、感染症の原因剤、放射性核種または常磁性金属イ オンに対する金属キレート化剤、および免疫修飾因子細胞に可動性を与える遺伝 子（例えば、IL-2，TNF）を指す。 「効果的な量」とは、目標部位において希望する効果を生じさせるに十分な量 を指す。例えば、分裂膜の膜シーリングが必要な部位に関すれば、目標とする膜 損傷部へ到達し、且つ細胞死を効果的な量に抑制するに十分な免疫リポソームの 量である。換言すれば、薬剤や遺伝子が目標とする細胞、組織または器官に分配 されることが望まれる場合は、ある量の遺伝子や薬剤が免疫リポソームにローデ ィングされ、これをローディングしたある量の免疫リポソームが目標部位へ分配 される。２つの量は、薬剤や遺伝子が分配された部位において希望する効果が観 察されるに十分なように組み合わされる。 本発明の方法の療法的な用法は、血栓溶解薬処置、遺伝子療法用の遺伝子物質 の強化した分配、および癌療法用の改善した分配の後の療法的介入を含む。 異なる形態は、後述されるこの発明の実施例の説明中において、および添付し た請求の範囲から、より一層明らかにされる。 図面の簡単な説明 図面において、 図１は、サルコレンマ修復の提案されたメカニズムを模式的に示す； 図２は、トリパンブル−排除試験で評価された本発明の方法による心筋細胞Ｈ ９Ｃ２の生存度を示す、 図３は、3Ｈ-チミジンの摂取で評価された本発明の方法による心筋細胞Ｈ９Ｃ ２の生存度を示す、 図４は、蛍光／共焦点顕微鏡分析により評価された本発明の方法による心筋細 胞の固着したリポソームを示す、 図５は、蛍光／共焦点顕微鏡分析により評価された本発明の方法による心筋細 胞の固着したリポソームを示す、 図６は、蛍光／共焦点顕微鏡分析により評価された本発明の方法による心筋細 胞の固着したリポソームを示す、 図７は、蛍光／共焦点顕微鏡分析により評価された本発明の方法による心筋細 胞の固着したリポソームを示す、 図８は、本発明の方法による免疫リポソームを含む銀粒の局在化の超構造試験 を示す。 発明の詳細な説明 本発明は、細胞抗原に特異な免疫リポソームが、目標細胞内へ物質を分配する 目的のために使用され得ること、および細胞が死にかけている過程を抑制または 反転するために使用され得るという発見に基づいている。 ［細胞死］ 壊死と腫瘍は、細胞が崩壊し、次第に死ぬ過程である。体内の器官の細胞死は 、組織に対する虚血性、炎症性、免疫学的及び／または毒素発作の結果である。 細胞死の場所と重さに依存して、結果は良性であるか、または重い病気または死 を招くに十分なものとなる。腫瘍は、酸素喪失または他の化学的媒介に起因する 細胞膜の物理的な分裂を含む。腫瘍の初期段階では、細胞膜の完全性は、膜が溶 解して損傷を形成するときに失われる。損傷の部位においては、細胞膜は食細胞 活動及び酵素的崩壊によって次第に破壊され、そして核抗原、細胞中の構造体要 素および細胞内小器官を含む細胞内組成物は終局的に洗い出される。 再灌流障害はまた、大量な細胞死を生じさせるものと考えられている。再灌流 障害の期間に血液が血管領域に回復する時、酸素は酸素欠乏領域に戻り、そして スーパーオキシドラジカルが形成されて、細胞膜に損傷を与える。 細胞死と生存度は、本発明によれば、複数の異なる方法の１つによって決定さ れる。死んだ細胞は、通常のトリパンブルー排除試験によって青色になるため、 、生存している細胞から区別できる（例えば、Sigma Chemical Co.，1995，p.16 81のカタログに記載されている試薬を使用する）。加えて、死んだ細胞は、細胞 を培養皿またはフラスコで培養することにより決定できる。死んだ細胞は媒体中 に自由に浮かび、生きている細胞はフラスコの壁面に固着するからである。換言 すれば、細胞の生存度は、当業者には周知の標準的な手法による3Ｈ-チミジンの 摂取により決定される。 ［リポソーム］ リポソームは、水性物質の周りを包囲し、外部の媒体から隔離した２層の脂質 母材（マトリクス）によって構成される。中心の水性コアは、その直径が２０ｎ ｍから２〜３μｍの範囲で変化する。本書で使用される「リポソーム」という用 語はまた、独立した複数の水性区分を形成する複数の（例えば、２〜３）同心的 な二重膜から構成されるリポソームをも含む。熱力学的には、リポソームは、二 重膜構造の各単層内のリン脂質の密度が等しくなるように、最小の自由エネルギ ーを有する。 本発明で使用されるリポソームは、リン脂質分子から構成される。リン脂質分 子は、１つの極性ヘッド基と２つの無極性疎水性脂肪酸アシル鎖を有する。水性 の環境では、リン脂質が最もエネルギー的に安定できる形態は、脂肪酸アシル鎖 が水と接触することを避けることができる構造体内にあることである。脂質の二 重膜はその様な構造体の１つである。多くのリン脂質は、水に分散された時、自 発的に脂質の二重膜構造を形成する。 リン脂質分子の極性ヘッド基は、コリン、例えばレシチン（ホスファチルジル コリン）およびスフィンゴミエリンを含む。その様な分子はまた、アミノ基、例 えばホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含む。他の 極性ヘッド基は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシートおよ びカルジオリピンを含む。 本発明は、免疫リポソームを、細胞死の抑制や反転するために、あるいは作用 物を目標細胞に分配するために使用することを意図する。免疫リポソームは、上 述したように、その極性ヘッド基を経由して免疫リポソーム分子のカルボキシ端 に接合するリポソーム組成を含む。ほとんどの細胞膜がタンパク質とリン脂質の 二重膜で構成されているため、細胞膜と免疫リポソームとの融像が起こる。免疫 リポソームは、死にかけている細胞を目標とするリポソームとして使用できる。 ［作用のメカニズム］ 如何なる論理にも拘束されないとすれば、膜分裂した細胞中の細胞死は、導入 された免疫リポソームが分裂した部位の細胞膜をシーリングする結果として、抑 制または反転される、ということが仮設される。図１は、サルコレンマ修復の提 案されたメカニズムを模式的に示している。図１には、正常な心臓細胞の部位１ ０が示されている。部位１０では、細胞膜脂質二重膜１２が元のままであり、ミ オシン１４に重なっている。図１はまた、分裂細胞膜１６を示している。脂質二 重膜１８には切れ目ができ、ミオシンストランド２０は露出している。前記仮設 は、切れ目１８の部位を特異として目標化する免疫リポソームを熟考している。 この特異性は、抗体／抗原の相互作用を介して与えられる。即ち、ミオシン（抗 ミオシン抗体２４）を特異とする抗体を含む免疫リポソーム２２は、切れ目の領 域に露出したミオシンを特異として目標化し、結合する。かくして、免疫リポソ ームを切れ目２６の部位の分裂細胞に係留することができる。その様な係留は、 膜分裂を効果的に塞ぐことにより、細胞死を抑制し、細胞死へつながる継続した 工程、例えば細胞内容物の流出を妨害するものと考えられる。分裂細胞膜に対す る免疫リポソームの融像２８は係留に後続し、細胞の多くの領域にわたる抗ミオ シン抗体とミオシンとの間の相互作用を許容し、膜分裂の修復を開始させる。確 実なメカニズムではないが、リポソーム内部の内容物が細胞内空間へ終局的に分 配される。それ故、本発明の方法は、一般的な分配技術、例えば生物学的作用物 または核酸用の技術に適用できる。 ［リポソームと免疫リポソームの準備］ リポソームと免疫リポソームは種々の技術、例えば界面活性剤透析または油中 に水を入れた乳剤の形成、非電解液中での緩やかな膨張、再水和が後続する脱水 、カオトロピックイオンの存在下における脂質の希釈や透析、および凍結融解法 のような機械的な準備技術によって準備される。 リン脂質／界面活性剤混合のミセルの水性分散系から界面活性剤分子を除去す るには、リポソームを製造する１つの方法がある（J．Biol Chem．246:5477（19 71）ここではこれを引用して参照する）。界面活性剤が除去されたとき、ミセル はリン脂質に富むようになり、ついには一体化して閉鎖した単一の二重膜の小水 疱になる。この目的で一般的に使用される界面活性剤は、胆汁塩およびオクチル グルコシドを含む。この方法は有機溶剤および超音波処理を使用しないため、高 分子、例えば有機溶剤に感度が良いか、あるいは超音波処理で構造を変更できる タンパク質や核酸を捉えるために特に有用である。 リポソームを準備する他の方法は、米国特許第４，２３５，８７１に詳述され ている反転相蒸発法であり、この文献をここで引用する。この方法により準備さ れるリポソームは、典型的に約２〜４ミクロンの平均サイズを有し、圧倒的にオ リゴラメラー、即ち１または複数の脂質二重膜の殻を有する リポソームはまた、溶媒の存在下での水和によって準備される。高い包囲性能 を有する多重層小胞(MLV)は、有機溶媒の存在下で脂質を水和する事によって準 備される。２つの相は活発な混合（渦巻）によって乳化され、それから有機相は 乳剤に窒素ガスの流れを通過させることにより除去される。溶媒が蒸発したとき 、リポソームは水性相で形成される。 機械的な準備方法、例えば手により振る方法、超音波処理法、フレンチ圧力凍 結乾燥法、膜押し出し法、凍結融解法、ｐＨ変更法、カルシウム導入法、および マイクロ乳化技術、リポソームの準備のために使用されてきた。基本的なことは 、揮発性の有機溶媒中で小胞を形成した脂質の混合物が、フラスコの底部の周り の表面に成長し、そして溶媒が減圧下で回転蒸発により除去されることである。 乾燥した脂質に過剰な体積の水性緩衝剤が添加され、攪拌されたとき、１／１０ ミクロンから数１０ミクロンの範囲の小胞が自然に形成される。取り込むべき薬 剤には、脂質フィルム（親油性の薬剤用）や水性水和媒体（親水性の薬剤用）が 含まれる。 リポソームのサイズを制御する方法には種々のものがあり、押し出し法や均質 化法が含まれる。１つの効果的なサイズ制御法は、リポソームの水性分散を、０ ．２〜０．６ミクロンの範囲、典型的には０．１〜０．２ミクロンの範囲から選 択された一様な穴を有するポリカーボネート膜を連続して通過させて押し出す方 法である。前記膜の穴のサイズは、その膜を通して押し出されることで製造され るリポソームの最大サイズに概ね対応する。この準備は、特に同じ膜を２回また はそれ以上の回数押し出すことにより行われる。リポソームの押し出しはまた、 ここで参照する米国特許第４，７３７，３２３に開示されているように、不斉セ ラミックフィルターを通して達成される。粒子サイズを減少させる他の方法は、 フレンチ圧力法のようなリポソームへの高圧の適用か、リポソームの均質化法で ある ［免疫リポソーム］ 抗体、特にモノクローナル抗体は、癌研究の分野における関心の中心である。 抗体は、数多くの悪性細胞用の細胞表面抗原として開発されてきた。しかし、そ れらは腫瘍の範疇でのみ有用である。その様な抗体を薬理学的に活性剤あるいは ラベルと接合させ、診断、局在化、およびその様な腫瘍を指向する療法を可能に する技術は知られている。 最近の研究は、独創的な核抗原の認識およびそれに対するモノクローナル抗体 の開発に向けられている。例えば、Esptein and Clevenger，Exp．Cell．Res．1 51:194（1984）and J．Histochem．and Cytochem．32:757(1984)を参照して欲し い。その様な抗体はラベルされ、核内の構造を認識するために使用されている。 抗体／抗原の認識に基づいて目標化するリポソームは、従来から目標部位に対 する種々のバイオ活性剤の目標化した分配システムの開発において使用されてき た。抗体を指向するリポソーム、即ち免疫リポソームは、この目的のために使用 されている。抗体分子は、疎水性のリポソーム膜とは親和性のない、圧倒的に親 水性の組成物である。 本書で使用される場合、免疫リポソームは、免疫グロブリン分子と接合したリ ポソームから構成される。一般的に、そして本書で使用される場合、リポソーム ／免疫グロブリン接合は、直接的または間接的な手段を経由し、且つ共有的にま たは非共有的にリン脂質分子と連結した免疫グロブリンから構成される。一般的 に、リポソームのリン脂質分子の２００毎に約１つが、リポソームのリン脂質分 子の２０〜２０，０００毎に１つの受容できる範囲で、抗体分子に連結する。 目標部位に対する免疫リポソームの特異性を強化する場合、免疫リポソームは 数種の異なる特異性を持つ抗体を含み、それぞれの同系統の抗原が目標部位で見 出される。その様な複数の特異性は、２重機能または３重機能抗体を使用するこ とにより参照される（例えば、ここで引用する米国特許第５，２３７，７４３を 参照）。 免疫リポソームを準備する方法は従来から知られている。例えば、リポソーム 表面上のタンパク質（例えば、免疫グロブリン）の吸着により、天然タンパク質 のリポソーム膜中への形成期間中の取り込みにより（例えば、超音波処理法、界 面活性剤透析法または反転相蒸発法により）、タンパク質とリポソーム膜中に取 り込まれた反応組成物との共有結合（直接またはスペーサ基を介して）により、 リポソームが形成される期間の、または中間加工されたリポソームを伴う培養期 間の修飾されたタンパク質の非共有疎水性結合により、そしてポリマーを介した 免疫グロブリンとリポソームとの共有結合を含む間接的に結合により（ここで引 用する Torchilin，V.P．CRC Critical reviews in therapeutic Drug Carrier Systems，vol．2(1)を参照）、免疫リポソームは準備される。 免疫リポソームは、以下の処置により準備される。 １．抗体とＮＧＰＥとの共有結合 ０．６ｍｇのＮ−グリタリル・ホスファチジルエタノール（ＮＧＰＥ）が、０ ．５ｃｃの２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸ヘミソディウム塩（ＭＥＳ ）の緩衝剤に（５０ｍＭのＭＥＳ中の０．０１６Ｍのオクチルグルコシド中に） 溶解された。４．８ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）− カルボジイミド（ＥＤＣ）と６ｍｇのＮ−ヒドロキシスルホン酸スクシンイミド （ＨＳＳＩ）とが添加された後、結果の混合物が室温で５分間培養された。それ から、抗体溶液（後述するように、抗ミオシン抗体２Ｇ４２Ｄ７または他の抗体 を含む）が加えられた（０．３６ｍｇ／ｍｌ）。その後、混合物のｐＨが１Ｍの ＮａＣｌにより８．０に調整された。反応混合物は、混合されながら４°Ｃで８ 〜１２時間培養された。結果として得られるＮＧＰＥ−抗体の接合は、１晩中Ｐ ＢＳに対し透析され、オクチルグルコシドと他の余剰な試薬が除去された。 ２．界面活性剤透析法による免疫リポソームの準備 リポソームは、卵白ホスファチジルコリン（ＰＣ）とコレステロール（Ｃｈ） をクロロフォルム中で１：１のモル比で混合させたものから準備された。その脂 質混合物（３０ｍｇ ＰＣ／１７．９６ｍｇ Ｃｈ）は、アルゴンで乾燥され、そ の後真空中で２時間乾燥され、０．０１６Ｍのオクチルグルコシドを含む４ｃｃ のリン酸塩緩衝セイリーン（ＰＢＳ）中で僅かに超音波処理しながら再懸濁され た。ＮＧＰＥ修飾抗体（０．７ｍｇ／ｍｌ）が、脂質を溶解するために添加され た。この混合物は、界面活性剤を除去するために、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を使用 して１晩透析された。得られたリポソームは、ヌクレオポア(Nucleopore)型フィ ルタ（０．６，０．４，０．２μｍ）を通して押し出された。この方法は、ＮＧ ＰＥ抗体溶液を用いずにリポソームを準備する場合も使用された。 ３．蛍光リポソームの準備 リポソームは、卵白ホスファチジルコリン（ＰＣ）、コレステロール（Ｃｈ） およびＬ−αホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−フルオレセイン（ＦＬ）を クロロフォルム中で混合させたものから準備された。その脂質混合物（３０ｍｇ ＰＣ／１７．９６ｍｇ Ｃｈ／０．１ｍｇ ＦＬ）は、アルゴンで乾燥され、そ の後真空中で２時間乾燥され、０．０１６Ｍのオクチルグルコシドを含む４ｃｃ のＰＢＳ中で僅かに超音波処理しながら再懸濁された。ＮＧＰＥ修飾抗体（０． ７ｍｇ／ｍｌ）が、脂質を溶解するために添加された。この混合物は、界面活性 剤を除去するために、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を使用して１晩透析された。得られ たリポソームは、ヌクレオポア型フィルタ（０．６，０．４，０．２μｍ）を通 して押し出された。この方法は、ＮＧＰＥ抗体溶液を用いずにリポソームを準備 する場合も使用された。 ４．電子密型の抗ミオシン免疫リポソームの準備 抗ミオシン免疫リポソームの超構造的特性のために、電子密型の(electron-de nse)抗ミオシン免疫リポソームが準備された。脂質混合物（３０ｍｇ ＰＣ／１ ７．９６ｍｇ Ｃｈ）は、アルゴンで乾燥され、その後真空中で２時間乾燥され 、ＮＧＰＥ抗体溶液（０．７ｍｇ／ｍｌ）中で再懸濁された。２ｍｇのＡｇＮＯ 3が溶液に添加され、それは僅かに攪拌及び音波処理された。得られたリポソー ムは、フィルタ（０．６，０．４，０．２μｍ）を通して押し出された。混合物 は水に対して１晩透析された。０．１４５ＭのＮａＣｌが２００μｌ加えられ、 その混合物は光に１時間曝された。電子顕微鏡特性の工程のために、媒体を含む リポソームが除去され、細胞はＰＢＳ（ｐＨ７．４）によって洗い出された。細 胞は、 その後２．５％のグリタルアルデヒドと２％のパラホルムアルデヒドを加えたｐ Ｈ７．２の０．１ＭのＮａカコジル酸塩緩衝剤中で固定された。固定され錠剤化 された細胞はアルコール系で脱水された。ウラニルアセテート及び鉛クエン酸塩 と比べて超薄型の断面が、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により確認された。 ［免疫リポソームのローディング］ リポソームへの化合物のローディングは、種々の能動的な方法及び受動的な方 法のいくつかによって達成される。捕捉による受動的なローディング法は、相対 的に低い薬剤服用量での療法的に活性である化合物用に、または水溶液に非常に 溶解しやすい薬剤用に、あるいは目標細胞に非常に効果的に発現するＤＮＡ用に 使用される。ある種の疎水性薬剤にとって、受動的なローディング法によって達 成される被包された物質の最高濃度が、それらの低い真性水溶度によって制限さ れることが見いだされた。リポソーム内に収容できる疎水性薬剤の濃度は、膜中 の薬剤／脂質の相互作用に依存するが、一般には約２０ｍｃｇ薬剤／ｍｇ脂質よ り低い薬剤濃度に制限される。正電荷を有する両親媒性薬剤の場合、２０〜３０ モル％のアニオンリン脂質をリポソーム膜中に含ませると、膜界面における負に 荷電されたリン脂質を伴う「イオン対」混合物の形成によって、ローディング係 数が顕著に増加するが見いだされている。 リポソームへの高濃度の薬剤のローディングは、能動的なローディング法、例 えばここで引用する米国特許第５，１２９，５４９に述べられている方法を必要 とする。その方法では、リポソーム膜を横切って化学的な勾配が生成され、その 結果リポソームの内部水性相内への薬剤の捕獲が生ずる。 リポソーム／薬剤の公式化は、粒子サイズ、脂質濃度、およびｐＨを上述した 標準的な手法で測定することにより特徴付けられる。化合物中に含まれた薬剤濃 度は、その化合物内に放射線標識トレーサーを含有させることにより決定するこ とができる。リポソームを捕捉した薬剤の量は、ＢｉｏＲａｄ Ａ−１５Ｍ を使 用するゲル浸透クロマトグラフによって決定される。リポソーム薬剤の分別は、 カラムの空き容積内に存在する放射線標識の量から計算される。また、前記リポ ソーム薬剤のパーセントは、前記カラムから溶出して残存している標識に対する 前記空き容積内に溶出した標識の比から計算される。 ［抗体の準備］ 本発明で使用される免疫グロブリン分子は、全ての抗体、またはどのような抗 体破片、例えば抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂおよび／またはＦｖ破片を含 む。加えて、抗体分子の種々の領域特異性が、本発明よれば有用になる。Ｆ（ａ ｂ’）２破片は、完全な抗体結合した部位を含む抗体分子の一部であって、２つ の軽鎖と各重鎖の一部からなる。これは、酵素による消化作用、例えばペプシン によって生成され、重鎖のジスルフィド結合がＦ（ａｂ’）２破片中にそのまま 残る。Ｆａｂ破片は、単一の軽鎖および共にジスルフィド結合した重鎖の一部か らなる。Ｆａｂは酵素の消化作用で製造され、例えばパパインを使用すると、約 １／２のＦ（ａｂ’）２の抗原結合した破片が生成される。Ｆｃ破片は、細胞上 の抗体レセプターと補体のＣｌｑ成分に結合する抗体の一部である。Ｆｃ破片は 、パパイン消化した残りの抗体分子の一部である。Ｆｖ破片は、Ｆａｂ破片の種 々の領域からなる抗体の一部である。 本発明で使用される抗体は、従来のポリクローナルまたはモノクローナル抗体 の準備技術によって得ることができる。抗原は、指向される抗体に向けた種の細 胞から得ることができる。その様な種は、好ましくは脊椎動物、より好ましくは 哺乳動物、最も好ましくは人間である。人間の細胞内抗原を指向する抗体用とし て、不滅の細胞系統がその様な抗原の便利な供給源となる。 モノクローナル抗体を生成するために、免疫化された動物のマウス脾臓細胞が 適当な骨髄腫細胞系統と融合された。融合された細胞は、ハイブリドーマコロニ ーを形成するために選択成長媒体中で培養され、各コロニーは関心のある抗体を 分泌した。各コロニーからの培養上澄み液は、抗体特異性の試験を受けた。陽性 の培養物が識別され、拡張された。ここで引用するKohler et al.，Nature 256: 495(1975)を参照して欲しい。 ［目標抗原］ 本発明で使用する抗原は、処置を受ける特異な細胞タイプ用の細胞内抗原、好 ましくは細胞骨格抗原を含む。これらの細胞タイプは、細胞再生または遺伝子療 法用の目標として使用される細胞のタイプを含み、限定はされないが、心筋細胞 、骨格筋細胞、肝臓細胞、および脾臓細胞を含む。抗原は、細胞内抗原、および 病気または健康な状態より不健康な状態にある細胞、組織、または器官の結合用 として利用できる他の抗原を含む。細胞内細胞骨格抗原は膜損傷部を塞ぐために 使用される免疫リポソームの係留に特に有用である。 その様な抗原を目標とするために有用な抗体としては、限定されるものではな いが、抗ミオシン抗体（例えば、Ｒ１１Ｄ１０、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、Ｍａｌｖｅ ｒｎ、ＰＡまたは２６４２Ｄ（後述する））、抗アクチン抗体、抗細胞骨格抗体 、抗ヒストン抗体、抗核種抗体、抗小胞体抗体、および抗タンパク質キナーゼＣ 抗体がある。全ての上述した抗体は、American Type Culture Collection，1230 1 Parklawn Drive，Rockville，MD 20853，U.S.Aを通して公に入手できる。 細胞死の過程にある細胞に特異して結合した、即ち細胞内抗原に結合したモノ クローナル抗体を審査するために、細胞培養によって等しいアリコートが準備さ れた。１つのアリコートは健康な細胞を含み、他の１つのアリコートは細胞膜を 分裂する活発なピペッティングを複数回繰り返している細胞を含んでいる。膜分 裂が進行している細胞は、膜損傷がない状態での認識用としては通常利用できな い抗体認識用の細胞内組成を露出する。各試験アリコートからの、健康な細胞ま たは膜分裂した細胞を結合するモノクローナル抗体の能力は、例えば放射線免疫 評価法、あるいは直接または間接的な蛍光抗体スクリーニング法で定量的に測定 される。細胞内抗原に対する特異性は、複数の試験アリコートへの結合度の比較 から決定される。膜分裂した細胞のみに結合し、健康な細胞には結合しない抗体 は、細胞内抗原に対し特異性を移すための良き志願者であるとみなされる。 健康な細胞培養でさえも相対的に大きな比率の壊死性細胞を含むのであるから 、細胞内抗原に特異した抗体は、健康な細胞培養に対するある程度の結合を呈示 することができる。抗体が、スクリーニング処理で使用される細胞系統の表面タ ンパク質または抗原に対し特異できないにも係わらず、ある種の腫瘍細胞系統（ 組織球細胞系統のような）は、免疫グロブリンの生成された結合を呈示する表面 組成を備えている、という点が認識されるべきである。それ故、細胞内抗原に対 する抗体用の第２のスクリーニングステップを遂行することが好ましく、上述し たように、この第２のステップは、生きてはいるが細胞膜が分裂している細胞と 比較して、健康で生きている同様の細胞に結合する志願者抗体を審査するための ものである。 ［本発明で使用される標識と標識法］ 以下に列挙される種々の標識は抗体の標識法に限定されるものではない。抗体 の代わりに、他のキャリア（合成のまたは自然の）が標識の受容体として使用さ れ得る。 （１）放射性標識 画像処理の目的のために、周知の医療用放射性核種が使用できる。好ましい放 射性核種は、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉ−１２５、Ｉｎ−１１１、Ｉｎ−１１３ｍ、Ｇａ −６７、または他の好ましいガンマ線放射体である。 例えば、ヨウ化(iodination)は、Mills et al.，Hybridoma 5:265-275(1986) に記載されているように、クロラミン−Ｔ法により達成できる。この方法は、抗 体の放射性パック(radiopaque)を表現したり、あるいはＩ−１２５やＩ−１３１ のような放射性核種を付着させるヨウ化に効果がある。 他の放射性核種が、ベンジルＥＤＴＡまたはＤＰＴＡとのキレート化接合処理 を通して、疑いのある抗体に付着させることができる。他の好ましい方法として は、Pimm et al.，Int．J．Cancer 30:75(1982)に開示されているイオドゲン(io dogen)法と、放射性ヨウ化ナトリウムを伴う直接ヨウ化法がある。 （２）放射性パック物質 放射性パック物質はまた、抗体の標識に使用される。好ましい放射性パック物 質としては、周知のヨウ素化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、タリウム 化合物等がある。放射性パックの特異な例としては、バリウム、ジアトリゾエー ト(diatrizoate)、エチオダイズド(ethiodized)油、クエン酸ガリウム、イオカ ーミ(iocarmic)酸、イオセタミ(iocetamic)酸、イオダミド(iodamide)、イオジ パミド(iodipamide)、イオドザミ(iodoxamic)酸、イオグラミド(iogulamide)、 イオヘキソル(iohexol)、イオパミドル(iopamidol)、イオパノ(iopanoic)酸、イ オタス ル(iotasul)、イオテトリ(iotetric)酸、イオサラミ(iothalamic)酸、イオトロ キシ(iotroxic)酸、イオザグリ(ioxaglic)酸、イオクソトリゾ(ioxotrizoic)酸 、イポデイト(ipodate)、メグルミン(meglumine)、メトリザミド(metrizamide) 、メトリゾエイト(metrizoate)、プロピルイオドン(propyliodone)、サラス(tha llous)塩化物がある。 （３）磁気共鳴強化物質 検出される物質、あるいは磁気共鳴画像処理装置の効果を強化する物質はまた 、抗体に対し接合する。好ましい従来の磁気共鳴強化化合物は、ガドリニュウム 、銅、鉄、およびクロムである。好ましくは、これらの金属原子が従来の有機金 属キレートの形態で準備され、抗体に結合されることである。 ［抗体または他の担体に対する標識および治療化合物の結合］ 種々の分子を抗体または他の担体に結合させるのに適した多数の技術が確立さ れている。多数の技術が種々の分子、酵素および蛋白質を抗体に付着させるのに 利用できる。例えば、化合物をＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよびジソクロヘ キシルカルボジイミドと反応させることによって形成された活性エステル中間体 を介して、（メトトレキセートのごとき）多くのカルボン酸含有化合物を免疫グ ロブリンに結合させることができる。T．Deguchiら，Effect of Methotrexate-M onoclonal Anti-Ptostatic Acid Phosphatase Antibody Conjugate on Human Pr ostate Tumor，Cancer Res．46:3751-3755(1986)参照。クロラムブシルのごとき 他のものは低ｐＨで抗体に直接結合するであろう。例えば、Ghoseら，Immunoche motherapy of Human Malignant Malanoma with Chloroambucil-Carryine Antibo dy，Europ．J．Cancer 11:321-326(1975)。 アドリアマイシンおよびダウノマイシンのごときアミノ糖含有薬物は、薬物の 過ヨウ素酸酸化、続いての、酸化された薬物の免疫グロブリンへの結合、および 生成物の水素化ホウ素ナトリウムでの還元によって、抗体に共有結合することが できる。E．Hurwitzら，The Covalent Binding of Daunomycin and Adriamycin to Antibodies，Cancer Res．35:1175-1181(1975)。 また、生物学的に活性な分子または他の蛋白質を抗体に結合させるために慣用 的技術も存在する。抗体をＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ） プロピオネート（ＳＰＯＰ）と反応させて、２−ピリジルジスルフィド基を生じ させることによって、遊離チオール基を抗体に導入することができる。抗体に結 合させるべき蛋白質はＳＰＤＰと共にインキュベートする。ＳＰＤＰ−修飾蛋白 質を遊離チオール基を含有する抗体と混合するに際して、２種の物質は結合状態 となる。 薬物結合の混合酸無水物方法が可能なように、デキストランＴ−１０スペーサ ーを使用して抗体分子に結合する薬物部位の数を増加させるごとき他の公知の技 術を使用できる。化合物１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル ボジイミド塩酸塩（ＥＣＤＩ）を用いて、アミノ含有薬物を抗体のカルボキシル 基に結合させることができる。別法として、抗体の遊離アミノ基とそれに結合さ せるべき化合物中のアミノ基との間を架橋させるためにグルタルアルデヒドを用 いることができる。 ［心臓細胞における細胞死滅の阻害または逆行］ 心臓のごとき器官における細胞死滅は、心臓のある種の細胞、例えば心筋細胞 が、増殖しかくしてそれ自体を置き換えることができないために、かなり有害で あろう。心筋細胞は分裂できない高度に分化した細胞である。 心臓蛋白質ミオシンはよく知られている。この蛋白質は心臓細胞内部に見い出 され、細胞壁には見い出されない細胞内筋肉蛋白質である。ミオシン−特異的抗 体が開発され、心筋梗塞によって損傷した心臓組織をイン・ビボでイメージング するために標識されている(Khawら，J．Clin．Invest．58:439,1976参照)。 心臓壊死は、例えば、心臓ミオシンに特異的な免疫リポソームを、細胞死滅を 阻害し、または逆行させるのに十分な量および時間で患者に投与することによっ て阻害し、または逆行させることができる。免疫リポソームは、単一投与量とし て、間欠的に、例えば１−１０分、あるいは必要であれば数時間または数日間に わたって連続的に静脈内投与することができる。ミオシン特異的免疫リポソーム の投与は、例えば、当該療法の間に起こる組織に対する損傷を補うための潅流療 法の間に特に有用である。また、血管形成術または血栓崩壊に対する共療法とし て、危険な領域への直接的冠内潅流によって、治療用免疫リポソームを送達する こともできる。 ［治療剤］ カプセル化でき、かくして、送達のために本発明に従って使用できる治療剤を 表１に示す。表１は代表的な有用な剤のリストであって、限定的なことを意図す るものではない。一般に、リポソーム中にカプセル化可能であって、標的送達で 使用する場合に治療的に効果的ないずれの治療剤も本発明の方法に含まれる。ま た、表Ｉに示すごとく、抗ミオシン免疫リポソームは、虚血により危い心筋層に 効果的であるような薬物の標的化で特に使用できる。 ［本書で述べたように、表１の第２部分は本発明へと導く調査から得られた］ 免疫リポソームに担わせることができ、本発明で使用できると考えられる非常 に多数の抗腫瘍剤が知られている。前記リストの剤に加えて、抗腫瘍剤は葉酸阻 害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、アルキル化剤、抗生物質および放射線 増感剤を含む。かかる抗腫瘍剤の特別の例はアシビシン、アクラルビシン、アコ ダゾール、アドリアマイシン、アメタントロン、アミノグルテチミド、アントラ マイシン、アスパラギナーゼ、アザシチジン、アゼテパ、ビサントレン、ブレオ マイシン、ブスファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルボ プラチン、カルムスチン、カルビシン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロ ホスファミド、シタラビン、デカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン 、デザグアニン、ジアジクオン、ドキソルビシン、エピプロピジン、エトポシド 、エトプリン、フロクリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルオロシタ ビン、ヒドロキシウレア、イプロプラチン、ロイプロリド酢酸、ロムスチン、メ クロレタミン、メゲストロール酢酸、メレンゲストロール酢酸、メルカプトプリ ン、メトトレキセート、メトプリン、マイトクロミン、マイトギリン、マイトマ イシン、マイトスペル、マイトキサントロン、マイコフェノール酸、ノコダゾー ル、ノガラマイシン、オキシスラン、ペリオマイシン、ペンタムスチン、ポルフ ィロマイシン、プレドニムスチン、プロカルバジン塩酸、プロマイシン、ピラゾ フリン、リボプリン、セムスチン、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム、ス ピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトゾシン、タリソマイシン、テガフル 、テノポシド、テロキシロン、チアミプリン、チオグアニン、チアゾフリン、ト リシリビンリン酸、トリエチレンメラミン、トリメトレキセート、ウラシルマス タード、ウレデパ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビネピジン 、ビンロシジン、ビンゾリジン、ジノスタチンおよびゾルビシンを含む。 加えて、アルファ線放出およびベータ線放出放射性核種を使用できる。かかる 化合物はＩ−１３１、Ｙｔ−９９、Ｃｕ−６７、Ａｕ−１９８、Ｒｅ−１８６、 Ｒｅ−１８８、Ｐ−３２および他の細胞傷害性放射性核種を含む。 本発明によると、免疫リポソームは、インターロイキン−２のごときサイトカ イン、血管拡張剤、いずれかのインターフェロン、腫瘍壊死因子等を含めた、生 物学的応答修飾剤の担体であってもよい。 本発明の免疫リポソームによって輸送できる化合物のさらにもう１つのカテゴ リーは、リシン、破傷風、ジフテリア、アブリン、ゲロニン、ヤドリギおよび局 所壊死を引き起こし得る他の物質のごときトキシンである。 ［ＤＮＡの膜損傷細胞への送達のための免疫リポソーム］ 本発明に従って調製される免疫リポソームは、２つのユニークな方法にて、標 的細胞へのＤＮＡの送達で使用できる。 １．押し込みシールする送達：細胞内標的を求める免疫リポソーム、続いての 細胞の効果的な救済を用いる細胞内ＤＮＡ送達 ＤＮＡを含有する免疫リポソームは、損傷細胞膜を有する細胞において、細胞 内抗原を特異的に標的化するように調製できる。本明細書で例示する１つの免疫 リポソーム／抗体コンジュゲートは細胞内抗原ミオシンに特異的である；しかし ながら、本発明は、抗体が標的のいずれかの細胞内抗原、例えば、細胞骨格また は収縮蛋白質に特異的である免疫リポソーム／抗体コンジュゲートの使用を含む 。 免疫リポソームからの遺伝子コピーの細胞内環境への正味の送達は、細胞内抗 原濃度が高いためにかなり高いであろう。細胞内遺伝子送達に伴い、リポソーム は細胞膜中の破損箇所を効果的にシールし、かくして、細胞の生存可能性を維持 する。 ２．局所デポ剤送達：周囲の組織への遺伝子送達のためのアンカーとしての不 可逆的に損傷した細胞の細胞内標的を用いる免疫リポソーム また、ＤＮＡ送達を、不可逆的に損傷した細胞、すなわち、それがリポソーム のシーリングを介して救済できる段階を超えている細胞に対して標的化できる。 免疫リポソームは、不可逆的に損傷した細胞の細胞内抗原を標的化し、細胞内抗 原に繋がれる。次いで、ＤＮＡを負荷したリポソームはアンカーの回りに遺伝子 断片を放出し、遊離した介在性ＤＮＡ断片は種々の介在性細胞によって貧欲に吸 着される。 例えば、ＤＮＡは不可逆的に損傷した心筋層に送達できる。もし細胞を急性心 筋梗塞に標的化すれば、NIH Research 6:57-61(1994)のTaylor，J.において報告 されているような、ｍｙｏＤおよびミオゲニンのごときＤＮＡを摂取する周囲の 細胞は、外来性ＤＮＡの取り込みおよび発現に際して、骨格筋細胞として発育で き、かくして、他の線維性瘢痕に対して収縮性要素を回復させる。かくして、本 発明のＤＮＡ送達の態様は、部分的に損傷した標的組織に対する非侵入性で効果 的な送達を提供する。 「押し込み栓をする送達」および「局所的デポ剤送達」方法は、共に、標的化 送達のために適当なＤＮＡ暗号配列を選択することによって、癌または嚢胞性線 維症のごとき病気の治療に適用することもできる。例えば、サイトカインおよび ／または成長因子を癌細胞に送達することができる。腫瘍は多くの微小壊死中心 、すなわち、膜損傷細胞の領域を含有する。ＴＮＦまたはＩＬ−２をコードする ＤＮＡを含有する免疫リポソームを、腫瘍中の微小壊死中心を介して、腫瘍細胞 中の細胞骨格構造に標的化することができる。遺伝子構築体の微小壊死中心への 送達は、損傷した細胞膜の修復および密閉も開始するであろう。次いで、蘇った 細胞は必要なサイトカインをイン・サイチュ産生して遺伝子治療を開始すること ができる。免疫治療リポソームを繋ぐために、局所デポ剤送達アプローチを用い て、ＤＮＡ含有免疫リポソームを腫瘍関連抗原に標的化することもできる。かく して、前記２つの様式の遺伝子治療、すなわち、損傷しているが救済可能な細胞 への、または損傷し救済できない細胞へのＤＮＡの送達のための免疫リポソーム の使用は、腫瘍遺伝子治療への、心血管適用を含めた種々の治療適用のための遺 伝子治療を開始させることができる。 ［負荷した免疫リポソームを用いる化学療法］ 癌の非外科的処置のための現代の技術は、化学療法、放射線照射療法、化学療 法および放射線照射療法の併用、および免疫療法を含めた臨床的および試験的技 術を共に含む。各々の場合において、治療の目的は、悪性細胞を殺すことにある 。かかる療法において現在または潜在的に有用な抗腫瘍剤は、細胞傷害性薬物、 生物学的応答修飾剤、放射線増感剤化合物、トキシンおよび放射性核種を含む。 また、本明細書に開示したごとき標的薬剤を含有する免疫リポソームを用い、 放射性薬剤を標的部位の微小壊死領域、例えば腫瘍に送達することによって、あ るいは抗腫瘍剤を含有する免疫リポソームを標的部位に送達することによって、 負荷した免疫リポソームを癌療法で使用することもできる。 本発明で有用な抗腫瘍剤は、限定されるものではないが、細胞傷害剤、トキシ ン、生物学的応答修飾剤、放射線増感剤化合物、アルファ線放出放射性核種、ベ ータ線放出放射性核種、抗増殖剤を含む。 ［免疫リポソームを用いる診断手法］ 本発明の１つの診断方法は、器官または組織における壊死の部位を診断するこ とを含む。この手法は、細胞内抗原に特異的であって、診断剤、例えばイメージ ング剤のごとき検出可能な分子を含有する免疫リポソームを利用する。かかる剤 の１つの例は前記したタイプのガンマ線放出放射性核種である。該放射性核種は キレート形成性ポリマーのごとき便利な担体に結合させることができる。放射性 核種を含有する免疫リポソームは、細胞死滅を受けている器官または組織を有す ることが疑われる患者、例えば、化学療法、放射線照射療法、または双方を受け た患者に（好ましくは静脈内）注射する。この手法は、好ましくは、該療法の開 始後少なくとも１日または２日後に行って、腫瘍組織の得られた壊死を、合理的 数の壊死細胞が存在する十分な地点まで進めることを可能とする。標識抗体の投 与後３０分および３日の間に、適当なシンチグラフィーイメージング技術を使用 して、壊死組織に局在する標識をイメージする。適当なイメージング技術はガン マカメラおよびＳＰＥＣＴ（単一フォトン放射コンピューター断層撮影法）技術 を含む。 １つの別のイメージング技術はラジオグラフィーイメージングである。この技 術では、放射線不透過性物質で標識された細胞内抗原に特異的な免疫リポソーム を、化学療法または放射線照射療法の開始後の適当な時点で注射する。抗体が壊 死組織の領域に局在化した後に、ラジオグラフィーイメージングを行う。他の適 当な技術はＣＡＴ（コンピューター軸断層撮影法）スキャン、透視検査法および 慣用的Ｘ線イメージングを含む。 ［免疫リポソームを用いる治療方法］ 本発明の免疫リポソームに治療剤、例えば、抗腫瘍化合物を負荷することによ って、これらの治療剤を、全身効果を大いに低下させつつ、新生物に直接送達す ることができる。２つのアプローチを使用することができ；最初のものは、腫瘍 の全てまたは一部を殺すであろう現行治療様式の使用後における増大療法として のものであり；第２のものは、既にある程度の異常浸透性を示している新生物細 胞に焦点を当てる治療の一次的デ・ノボ様式としてのものである。 増大アプローチにおいては、腫瘍壊死は、化学療法、免疫療法、放射線照射療 法等のごときいずれかの慣用的技術によって開始される。 かかる療法の開始の後、腫瘍塊で壊死が開始する。この時点で（通常、一次療 法の開始後少なくとも２日において）、治療化合物、好ましくは抗腫瘍剤を含有 する免疫リポソームを患者に投与する。腫瘍の近くへの直接的注射も考えられる が、静脈内投与が好ましい。 負荷した免疫リポソームの投与の後、免疫リポソームは腫瘍塊中の壊死領域に 結合状態となり、抗腫瘍剤を送達して細胞を破壊する。 もし致死量の抗腫瘍剤を壊死領域に送達すれば、この領域の回りの健康で生き た腫瘍細胞が壊死され得るのであり、さらなる量の抗腫瘍剤を新しい壊死領域に 浸透させることが可能となる。このようにして、拡散効果が可能であり、腫瘍細 胞の破壊は、壊死腫瘍組織から健康な腫瘍組織に容易に進行する。この拡散効果 を達成するには、ベータ線放出またはアルファ線放出放射性核種のごとき細胞傷 害剤を使用できる。 第２のアプローチ（一次療法）において、該方法は、（壊死細胞の最初の集団 を生じさせる）いくつかの他の様式での前処置の必要性がない以外は、全く前記 した通りである。 患者に投与される抗腫瘍剤を負荷した免疫リポソームの量は、使用する抗腫瘍 剤および腫瘍のサイズに依存して変化するであろう。しかしながら、一般に、投 与量は、選択した特定の薬剤の通常の治療投与量と等しいかまたは少ない抗腫瘍 剤の全用量を投与するように選択される。全用量は通常の治療投与量の１％およ び５０％の間であるのが好ましく、投与量は化合物の通常の治療投与量の２％お よび２５％の間であるのが最も好ましい。しかしながら、全ての癌療法に関して は、最適投与量は、療法に対する個々の患者およびそれに由来する副作用に基づ いて治療する医者によって決定されることとなろう。 ［免疫リポソームは細胞膜病巣の十分なシーラーである］ 免疫リポソームは細胞膜病巣の十分なシーラーであり、かくして、さらなる損 傷および死滅から膜損傷細胞を保護するのに有用である。膜損傷細胞の免疫リポ ソームによる十分なシーリングの実験的証拠は以下の通りである。本明細書で提 供する例は、心臓病で起こり得る心臓細胞に対する損傷を模擬するモデル系にお いて心臓細胞を利用する。 培養中のAmerican Type Culture Collection(ATCC)からのＨ９Ｃ２心筋細胞を 低酸素症損傷に付した。次いで、低酸素症筋肉細胞を、抗ミオシン免疫リポソー ム、非特異的抗体免疫リポソーム、および抗体を含有するリポソームのうちの１ つと共にインキュベートした。いずれのリポソームまたは抗体も含まない正規培 地中で対照心筋細胞をインキュベートし、もう１つの組の対照を酸素正常状態状 態下に維持した。３７℃における２４時間のインキュベーションの後、筋肉細胞 生き残り／生活力を、トリパンブルー排除（図２）または３Ｈ−チミジン摂取（ 図３）によって、各培養フラスコ中の細胞の全数のパーセントとして評価した。 損傷筋肉細胞のリポソームでのシーリングを証明するために、フルオレセイン− 標識リン脂質を、抗体を含まない免疫リポソームおよびリポソームのごとき種々 のリポソーム調製物の生成で使用した。 リポソームの心筋細胞への接着は蛍光および共焦点顕微鏡によって評価した； また、以下のプロトコルによって、処理した低酸素症心筋細胞の超構造特徴付け のために、電子高密度免疫リポソームおよびリポソームも調製した。 ５％ＣＯ２濃度を持つ湿潤インキュベーター中、３７℃にて、ＤＭＥＭおよび 胎児ウシ血清を含む２５ｍｌ培養フラスコ中で２００万のＨ９Ｃ２筋肉細胞を培 養した。細胞を３７℃のインキュベーションにて一晩安定化させた後、細胞をリ ン酸緩衝液（ｐＨ７.４）で洗浄し、続いて、リポソーム（免疫または非免疫） または抗体を含むまたは含まない３ｍｌの新鮮な培地を添加した。中程度の低酸 素症損傷を生じさせるために、フラスコの底から細胞を動かすことなく、高度に 精 製した窒素を４分間培地に通気し、フラスコを密封し、３７℃で２４時間一晩イ ンキュベートした。重篤な損傷を誘導するために、窒素流を向けて、ほとんどの 細胞を培養ウェルの底表面から動かした。 一晩の低酸素症損傷の後、対照筋肉細胞の１４％のみを、トリパンブルー排除 基準によって生きたものであることを評価した（図２）。死滅した細胞のほとん どは上清中に回収された。結果は、抗体を含まないリポソーム（４２.３％）お よび非特異的免疫リポソームはが低酸素症損傷からの細胞にいくらかの保護を供 したことを示した。これは、脂質二重層であるリポソームが細胞表面に非特異的 に接着し、細胞膜分岐のいくらかを偶発的にシールできることを示唆した。しか しながら、抗体および非特異的免疫リポソームなしのリポソームによって供され る中程度の保護とは対照的に、ミオシンを特異的に標的化する本発明に従って調 製された免疫リポソームの結果、損傷した細胞を死滅から大いに救済した。これ らの免疫リポソームは、正常に増殖した細胞の９８％に対して、ほとんど完全に 細胞死滅を妨げた（図２に示す通り９６.２％生存）。これらの結果は、細胞内 抗原の免疫リポソーム標的化が、ミオシン暴露の領域の選択的標的化を生じ、膜 破壊の部位を効果的にシールすることを示す。また、これらのひど重篤な低酸素 症の細胞は、３Ｈ−チミジン摂取によって測定すると、免疫リポソームで処理し た場合に細胞生存を示した（図３）。免疫リポソーム処理細胞は、酸素正常状態 対照（１００％）に対して８３−８５％の生存率を有した。対照的に、３Ｈ−チ ミジン摂取によって評価すると、抗体を含まないリポソームで処理した細胞は、 １９.４％の生存率を有したのに過ぎず、対照低酸素症細胞は５.２％の生存率を 有したにすぎなかった。 重篤な低酸素症損傷の後、蛍光免疫リポソームで処理した筋肉細胞は、筋肉細 胞の培養フラスコへの再付着を示し、これは、細胞の生存および筋肉細胞の喪失 のないことを示す。通常の形状の筋肉細胞は、通常、密集して観察され、しっか りと接着した培養では、細胞のほとんどで蛍光が見えた。他方、抗体を含まない リポソームで処理した培養筋肉細胞は、蛍光を発する培養フラスコ中の散らばっ た細胞、または蛍光を発する細胞の少数のクラスターを示した。これらの細胞の ほとんどは正常に細胞の形態および形状を維持せず、健康なようには見えなかっ た。細胞形態が保持された細胞表面上の免疫リポソームの存在が共焦点顕微鏡で 確認された。免疫リポソームの蛍光強度または分布は、筋肉細胞間で変化し、細 胞に対する損傷の重症度に依存した。 図４を参照し、Ｈ９Ｃ２ラット心筋細胞を、抗体を含まない蛍光リポソーム（ 左側パネル）または抗ミオシン免疫リポソーム（右側パネル）いずれか共に、低 酸素状態で２４時間インキュベートした。免疫リポソームは、細胞膜破損箇所を 通じるミオシン暴露の部位にて、低酸素状態筋肉細胞（灰色のバックグラウンド ）に繋ぎ止められていた（緑色のドット）。免疫リポソームと共にインキュベー トした筋肉細胞は、フラスコの底に接着により付着し、ほとんど完全に生存を表 した。対照的に、低酸素状態条件におけるプレーンリポソームと共に培養した筋 肉細胞のほとんどは死滅し、上清から回収された。左側パネルは、いくらかの非 特異的プレーンリポソーム（緑色）で被覆されたいくらかのゴースト筋肉細胞を 示す。この実験の結果は、もしリポソームが細胞内細胞骨格蛋白質に対して特異 的に向けられたならば、それは細胞膜破壊を正確に求め、破損箇所に栓をし、細 胞生存の喪失を防ぐであろうことを明瞭に示す。 図５を参照し、リポソームを擬着色して、抗体を含まない免疫リポソームおよ びリポソームの位置の可視化を増強させた。免疫リポソームの低酸素状態筋肉細 胞への付着を示すことができる。左側パネルにおいて、抗体を含まないリポソー ムは、無定形非生存細胞上のいくらかの非特異的摂取を示した。 図６に示す通り、抗ミオシン免疫リポソームと共にインキュベートしたもう１ つの組のＨ９Ｃ２心筋細胞は同一の保護現象を示した。左側のパネルは灰色心筋 細胞上への免疫リポソームの緑色蛍光の重畳を示す。リポソームの分布は、免疫 リポソームの高密度局所化を有する同一細胞における領域と比較して、正常であ って、リポソームを引き付けなかった心筋細胞の領域を示す。異なるリポソーム 分布が、同一視野の擬着色（右側パネル）によって明瞭に可視化できる。実験は 免疫リポソーム局所化の選択性および特異性を示す。というのは、（予測される ミオシン暴露での）損傷領域は免疫リポソームを引き付け、無傷筋細胞膜を持つ 正常領域（従って予期せぬミオシン）はいずれの局所化も示さなかったからであ る。 図７は、抗ミオシンリポソームと共に５日間インキュベートした低酸素状態Ｈ ９Ｃ２筋細胞のもう１つの組を示す。擬着色顕微鏡写真で観察されるごとく、免 疫リポソーム処理細胞は、低酸素状態で培養した場合に５日目で依然生存してい た。細胞形状は幾分変化したが、細胞膜は依然として明らかに無傷である。この 時点における蛍光脂質は核周辺で観察され、共焦点顕微鏡によると細胞質内にあ るようであった。抗体を含まないリポソームで処理した生存筋肉細胞は５日後に は観察されなかった。 透過型電子顕微鏡は、免疫リポソームの細胞膜への付着を示すことによって、 ならびに不統一な電子密度リポソーム内密度の非染色筋肉細胞への送達を示すこ とによって、免疫リポソームの膜との融合が起こったことを示した。図８を参照 し、低酸素状態筋肉細胞中の免疫リポソームを含有する銀粒の局所化の超構造精 査を示す。リポソーム内含有量の細胞内送達の確認は、この電子顕微鏡写真にお いて明らかである。この実験で使用した抗ミオシン免疫リポソームはリポソーム コアに銀粒を含有した。低酸素実験心筋細胞とのインキュベーションの２４時間 後、銀粒（暗い黒色ドット）が筋肉フィラメント上方の膜と会合していることが 観察されるか（矢印の頭）、あるいは細胞内空間の中央部分に向けて観察された （細い矢印）。この実験は、銀粒を、標的化細胞内送達の評価のための、モデル 薬物／遺伝子ベクターとして利用した。この細いセクションで見えるこの細胞に 送達された銀粒の程度は、細胞骨格蛋白質に向けられた免疫リポソームが、細胞 への遺伝子送達のための高度に効果的なツールを提供し得ることを示唆する。該 方法は、細胞膜破損箇所に栓をすることによって緊張した細胞を救済するという さらなる利点を有するであろう。 ［免疫リポソームの効率のイン・ビボ測定］ 免疫リポソーム効率をイン・ビボ(in vivo)でテストするために、例えば、筋 肉細胞壊死の低下において、共に出典明示して本明細書の一部とみなすKhawら， Circulation 60:1527(1979)およびNarulaら，Jour．Nuclear Med．35:1076(1994 )に記載されているごとくに、イヌ心筋梗塞モデルを使用する。梗塞部分の抗ミ オシンイメージング、組織化学および病理学的評価を行って、梗塞サイズを減少 さ せる治療の効果を比較する。 １．イヌモデル 体重２０ないし３０ｋｇの両性の雑種犬を静脈内ペントバルビタールナトリウ ム（３０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、Harvard正圧呼吸器(Harvard Apparatus，South Natick，MA)で通気する。右大腿動脈および静脈を摘出し、カテーテル処理して 、動脈圧および薬物投与のモニタリングを容易とする。動脈圧および多リード線 心電図を連続的にモニターする。左開胸を行い、心臓を心膜離被架中に吊り下げ る。左前下行冠動脈（ＬＡＤ）の近位および中央点を摘出し、ポリエチレンチュ ーブに包んだ外科モノフィラメントスネアを第１対角分岐の丁度末端側に入れる 。閉塞部位の丁度末端側の小分岐に、抗ミオシン免疫リポソームをＬＡＤに投与 するための２２−ゲージカテーテルを挿入する。スネアをきつくすることによっ てＬＡＤを閉塞し、０.１ｍｇ／ｋｇの予防リドカイン輸液を１時間維持する。 １.５時間において、スネアを除去することによって、ＬＡＤ領域を再潅流する 。再潅流の時点において、ほぼ半分の動物をランダムに選択して、１.１ｍｌ／ 分の速度にて、ＬＡＤカニューレを通じて１０ｍｌの０.９パーセントの生理食 塩水に溶解させた免疫リポソームの単一用量を摂取させた。残りの動物には冠動 脈内に同量の生理食塩水を投与した。梗塞心筋層の組織化学的および組織学的特 徴付けのため、２０ないし４０ｍＥｑの塩化カリウムの動脈注射によって、該動 物を２４時間または７日後に殺す。心臓を切開し、心房を除去し、心室塊をグラ ム単位で記録し、心室を１ｃｍ厚みのスライスとした。 細胞膜のシーリングは、ニトロブルー染色を用い、組織の生き残り／生存テス トによって評価する。別法として、損傷細胞のリポソームシーリングを証明する ために、ここに教示されるごとく、フルオレセイン−標識リン脂質を免疫リポソ ームの調製で用い、心筋細胞へのリポソームの接着の検出をフルオレセイン顕微 鏡および共焦点顕微鏡観察によって評価する。光学顕微鏡、続いての透過型電子 顕微鏡観察は細胞生存の評価の他の方法である。イン・ビボにおける心臓の機能 的評価は、ゲーティッド結合プールイメージングまたは心エコー検査を用いる行 うことができる。免疫リポソーム処理および生理食塩水処理動物を比較する。 ２．抗ミオシン抗体 免疫ネズミ脾臓細胞とＳｐ２／ＯＡネズミ骨髄腫細胞とのハイブリダイゼーシ ョンによって、抗ミオシンモノクローナル抗体を生じさせ、従前に記載され(Kha wら，Hybridoma 3:11-23,1984，出典明示して本明細書の一部とみなす)、番号２ Ｇ４２Ｄ７(ここに引用)が付されている方法によって精製した。抗ミオシン−Ｆ ａｂとのカップリングのため、Hnatowichら（Hnatowichら，Science 220: 613-6 15，1983，出典明示して本明細書の一部とみなす）の方法によって、ジエチレン トリアミン四酢酸の二環無水物を調製する。Ｆａｂに対するＤＴＰＡのモル比は １：１である。２つのアプローチを用いて、抗ミオシンＦａｂを標識し、ＤＴＰ Ａに１１１Ｉｎカップリングさせ、クロラミン−Ｔを用いて直接的に蛋白質へ１ ２３Ｉカップリングすることができる。 インジウム標識。１１１ＩｎＣｌのほぼ３７ＭＢｑ（１ｍＣｉ）を用いて、１ ００μｇのＤＴＰＡ−Ｒ１１Ｄ１０−Ｆａｂを標識する。１１１ＩｎＣｌの１− ｍＣｉアリコット（５０μｌ）に等容量の１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ５.５ ）を添加し、続いて抗ミオシン−Ｆａｂのアリコットを添加する。反応混合物を 室温で３０分間インキュベートする。SEPHADEX(Sigma Chemical，セントルイス ，ミズリー州)Ｇ−２５カラム（１０ｍｌ）クロマトグラフィーによって、抗体 結合１１１Ｉｎを遊離１１１Ｉｎから分離する。放射性標識抗体を含有するボイ ド容量におけるピークチューブをプールし、放射性標識から１時間内に使用する 。初期抗体濃度の平均８０％が放射性標識抗体を含有するピークチューブ中に回 収される。 ヨウ素化。抗ミオシンＦａｂを１２３Ｉで標識するためのHunterおよびGreenw ood（Hunterら，Nature 194:495-496，1962）によって記載されているクロラミ ン−Ｔ方法によって放射性ヨウ素化を達成する。０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７. ４）中のＤＴＰＡ−結合抗ミオシンＦａｂ抗体の１００μｇアリコットに、３７ ＭＢｑ（１ｍＣｉ）の１２３Ｉを添加し、完全に混合する。クロラミン−Ｔ（０ .５Ｍリン酸緩衝液中２６ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７.４）の１０μｌのアリコットを添 加し、続いて２分間混合する。２５μｌの０.１Ｍメチオニン＋０.１Ｍクレゾー ルの 添加によってヨウ素化を終了する。次いで、反応混合物を１０ｍｌのSEPHADEX Ｇ−２５カラムに適用して、遊離および蛋白質結合放射性ヨウ素を分離する。 抗ミオシン抗体イメージング。各動物において、以下のイメージのセットを記 録する。エクス・ビボにて全心臓および左心室の長軸に対して垂直の１−ｃｍ環 スライスカットとして、イン・ビボ実験。中エネルギーコリメーターを備えたガ ンマカメラ(Ohio-Nuclear 100，Solon，OH)を用いて、シンチグラフィーイメー ジを得る。各々、１１１Ｉｎおよび１２３Ｉ放射性同位体のための２０％ウィン ドウにての２４７および１５９ｋｅＶのセンターラインに、パルス高アナライザ ーをセットする。抗体注射に伴って、順次の１分間の獲得イメージを合成８分間 記録する。両放射性同位体につき、切除した心臓を全て、および１ｃｍ厚みスラ イスとしてイメージする。同一獲得時間につき、バックグラウンドイメージも各 放射性同位体セッティングにて収集する。バックグラウンド修正し、ピークを正 規化した組のイメージをフロッピーディスクに記録し、１１１Ｉｎ−および１２ ３Ｉ−標識抗ミオシン抗体の実験番号、処理および配列を盲検とする。梗塞部位 を３人の観察者によって個々に２回評価する。従前に記載されているごとくに(K hawら，J．Nucl．Med．28:76-82，1987)、半自動面積計測をTechnicare 560コン ピュータ(technicare Corp.，Solon，OH)で行って、絵素の数として梗塞サイズ を決定する。絵素サイズを較正し、梗塞組織の絶対容量を決定する（面積×スラ イス厚み）。この値に心筋層の比重（1.05）を乗じ、これを用いて、グラム単位 で梗塞組織の重量を決定する(Ostrzegaら，Am．Heart J．117 444-452，1989)。 次いで、心室塊に対するパーセント梗塞を統計解析のために計算する。 ［ＤＮＡの標的化送達］ 細胞へのＤＮＡの送達のために、ポリ−Ｌ−リシン結合脂質(Zhouら，Biochim ．Biophys．Acta．1065:8-14，1991)、ｐＨ感受性免疫リポソーム(Gregoriadis ，G.，Liposome Technology,Vol I，II，III，CRC，1993)、およびカチオン性リ ポソーム(Felgnerら，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，84:7413-7417，1987)を含 めたいくつかの方法を使用した。しかしながら、これらの方法の全てに伴う欠点 は、不十分な摂取および選択された遺伝子（ＤＮＡ）の発現である。遺伝子送達 およびトランスフェクションは、標的化様式として低酸素状態損傷および免疫リ ポソームの使用によって増強できる。透過型電子顕微鏡写真は、免疫リポソーム を用いて、数１００またはそれ以上の単位のリポソーム内含有量を個々の標的細 胞に送達できることを示した（図８）。 ［投与量および投与様式］ 本発明に従い、リポソームによってカプセル化した生物剤または遺伝物質の量 に適する投与量にて、免疫リポソームを標的組織または器官に静脈内、腹腔内ま たは直接的に投与する。従って、免疫リポソーム投与量は、約５ｍｇ／ｋｇ体重 から約１ｍｇ／ｋｇ体重まで変化し、１００ｍｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲 とすることができる。 ［他の具体例］ 他の具体例は当業者に明らかであろう。これまでの詳細な記載は明瞭性のため にだけ提供し、単に例示的なものであることが理解されるべきである。本発明の 精神および範囲はそれに限定されず、以下に記載された請求の範囲によって規定 される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年４月１０日 【補正内容】 請求の範囲 １．目標細胞を細胞死から再生する方法であって、 分裂した細胞膜を有する目標細胞を、特異な親和性試薬リポソーム接合に、効 果的な量で、且つ前記接合が膜分裂に起因する細胞死を防止するに十分な時間接 触させ、そして 前記目標細胞の生育を決定することを特徴とする方法。 ２．目標細胞を細胞死から再生する方法であって、 分裂した細胞膜を有する目標細胞を、前記目標細胞の細胞内抗原に対し特異で 結合可能な特異な親和性試薬リポソーム接合に、効果的な量で、且つ前記接合が 膜分裂に起因する細胞死を防止するに十分な時間接触させることを特徴とする方 法。 ３．組織の目標細胞に対しリポソームで被包した生物学的作用物を分配する方法 であって、 分裂した細胞膜を有した再生可能な目標細胞からなる組織を、生物学的作用物 を含む特異な親和性試薬リポソーム接合の効果的な量に接触させ、これにより前 記目標細胞に対する前記接合の接触は、前記組織の細胞中に前記作用物を分配し 、前記細胞の修復を生じさせ、 前記作用物の分配と前記目標細胞の育成とを決定することを特徴とする方法。 ４．組織の目標細胞に対しリポソームで被包した生物学的作用物を分配する方法 であって、 分裂した細胞膜を有した再生可能な目標細胞からなる組織を、生物学的作用物 を含む特異な親和性試薬リポソーム接合に接触させ、前記接合は前記目標細胞の 細胞内抗原に対し特異で結合可能であり、前記接合は効果的な量で、前記組織の 細胞中に前記作用物を分配するに十分な時間接触し、前記細胞の修復を生じさせ ることを特徴とする方法。 ５．請求項１〜４の方法において、特異な親和性試薬は抗体からなることを特徴 とする方法。 ６．請求項５の方法において、前記抗体は特異であり、且つ細胞内の抗原に結合 することを特徴とする方法。 ７．請求項６の方法において、前記細胞内抗原は細胞骨格抗原であることを特徴 とする方法。 ８．請求項１〜４の方法において、前記組織は心臓組織であり、前記抗体は心臓 組織に細胞内抗原に特異であることを特徴とする方法。 ９．請求項１〜２の方法において、前記接合は生物学的作用物からなることを特 徴とする方法。 １０．請求項１〜４の方法において、前記接合は核酸からなることを特徴とする 方法。 １１．心臓組織の細胞死を抑制する方法であって、 前記細胞の外部に露出した細胞内抗原を有する損傷した心筋細胞からなる心臓 組織を提供し、 前記損傷した心筋細胞の前記細胞内抗原に対し特異な抗体を有した免疫リポソ ームからなる接合と前記心筋細胞とを、前記接合が前記細胞内抗原と固着するに 十分な時間接触させ、そして 前記心筋細胞の生育を決定することを特徴とする方法。 １２．請求項１１の方法において、前記細胞内抗原はミオシンからなることを特 徴とする方法。 １３．遺伝的物質を細胞に分配する方法であって、 遺伝的物質を含む特異な親和性試薬リポソーム接合を、分裂した細胞膜を有す る細胞に、前記遺伝的物質を前記細胞に分配し、且つ前記細胞の死を防止するに 十分な時間及び量接触させ、そして 前記細胞の生育を決定することを特徴とする方法。 １４．生きている腫瘍細胞を殺す療法の効果を哺乳類において強化する方法であ って、 生きている腫瘍細胞を殺す療法を哺乳類において開始し、これにより前記腫瘍 細胞の一部を細胞膜を崩壊させることで壊死させ、 退化する腫瘍細胞中に存在し、その様な細胞の外部には存在しない細胞内部抗 原に対し特異な親和性試薬リポソーム接合を提供し、前記接合は抗腫瘍剤を含み 、そして 前記哺乳類に対する前記接合を管理して、前記壊死性腫瘍細胞中に存在する前 記細胞内部抗原に前記接合を結合させ、前記接合は、前記哺乳類の他の腫瘍細胞 内に前記抗腫瘍剤を分配するに十分な時間と量が管理されることを特徴とする方 法。 １５．請求項１４の方法において、前記抗腫瘍剤は、細胞傷害剤、毒素、放射線 増感化合物、α線放射型放射性核種、β線放射型放射性核種、及び抗増殖剤から なる群から選択されたものであることを特徴とする方法。 １６．請求項１４の方法において、前記細胞は化学療法の放射線により殺される ことを特徴とする方法。 １７．組織の健康な細胞に対しリポソームで被包した生物学的作用物を分配する 方法であって、 分裂した細胞膜を有する腫瘍細胞と健康な細胞とからなる組織を、生物学的作 用物を含む特異な親和性試薬リポソーム接合に接触させ、前記接合は前記腫瘍目 標細胞の細胞内抗原に対し特異で結合可能であり、前記接合は効果的な量で、前 記組織の健康な細胞中に前記作用物を分配するに十分な時間接触することを特徴 とする方法。 １８．組織の健康な細胞に対し遺伝子物質を分配する方法であって、 分裂した細胞膜を有する腫瘍細胞と健康な細胞とからなる組織を、生物学的作 用物を含む特異な親和性試薬リポソーム接合に接触させ、前記接合は前記腫瘍目 標細胞の細胞内抗原に対し特異で結合可能であり、前記接合は効果的な量で、前 記組織の健康な細胞中に前記遺伝子物質を分配するに十分な時間接触することを 特徴とする方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ナルラ，ジャガト アメリカ合衆国 02146 マサチューセッ ツ州 ブルックリン ロングウッド アベ ニュー 116 アパートメント ナンバー １ (72)発明者 ブラル，イムラン アメリカ合衆国 02146 マサチューセッ ツ州 ブルックリン ウインスロップ ロ ード 89

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．目標細胞を細胞死から再生する方法であって、 分裂した細胞膜を有する目標細胞を、特異な親和性試薬リポソーム接合に、効 果的な量で、且つ前記接合が膜分裂に起因する細胞死を防止するに十分な時間接 触させ、そして 前記目標細胞の生育を決定することを特徴とする方法。 ２．目標細胞を細胞死から再生する方法であって、 分裂した細胞膜を有する目標細胞を、前記目標細胞の細胞内抗原に対し特異で 結合可能な特異な親和性試薬リポソーム接合に、効果的な量で、且つ前記接合が 膜分裂に起因する細胞死を防止するに十分な時間接触させることを特徴とする方 法。 ３．損傷した又は健康な組織の細胞に対しリポソームで被包した生物学的作用物 を分配する方法であって、 分裂した細胞膜を有した再生可能な目標細胞からなる組織を、生物学的作用物 を含む特異な親和性試薬リポソーム接合の効果的な量に接触させ、これにより前 記目標細胞に対する前記接合の接触は、前記組織の細胞中に前記作用物を分配し 、前記細胞の修復を生じさせ、 前記作用物の分配と前記目標細胞の育成とを決定することを特徴とする方法。 ４．損傷した又は健康な組織の細胞に対しリポソームで被包した生物学的作用物 を分配する方法であって、 分裂した細胞膜を有した再生可能な目標細胞からなる組織を、生物学的作用物 を含む特異な親和性試薬リポソーム接合に接触させ、前記接合は前記目標細胞の 細胞内抗原に対し特異で結合可能であり、前記接合は効果的な量で、前記組織の 細胞中に前記作用物を分配するに十分な時間接触し、前記細胞の修復を生じさせ ることを特徴とする方法。 ５．請求項１〜４の方法において、特異な親和性試薬は抗体からなることを特徴 とする方法。 ６．請求項５の方法において、前記抗体は特異であり、且つ細胞内の抗原に結合 することを特徴とする方法。 ７．請求項６の方法において、前記細胞内抗原は細胞骨格抗原であることを特徴 とする方法。 ８．請求項１〜４の方法において、前記組織は心臓組織であり、前記抗体は心臓 組織に細胞内抗原に特異であることを特徴とする方法。 ９．請求項１〜４の方法において、前記接合は生物学的作用物からなることを特 徴とする方法。 １０．請求項１〜４の方法において、前記接合は核酸からなることを特徴とする 方法。 １１．心臓組織の細胞死を抑制する方法であって、 損傷した心筋細胞からなる心臓組織を提供し、心筋細胞の細胞内抗原に対し特 異な抗体を有した免疫リポソームからなる接合と前記心筋細胞とを、前記接合が 前記心筋細胞と固着するに十分な時間接触させ、そして 前記心筋細胞の生育を決定することを特徴とする方法。 １２．請求項１１の方法において、前記細胞内抗原はミオシンからなることを特 徴とする方法。 １３．遺伝的物質を細胞に分配する方法であって、 遺伝的物質を含む特異な親和性試薬リポソーム接合を、分裂した細胞膜を有す る細胞に、前記遺伝的物質を前記細胞に分配し、且つ前記細胞の死を防止するに 十分な時間及び量接触させ、そして 前記細胞の生育を決定することを特徴とする方法。 １４．生きている悪性細胞を殺す療法の効果を哺乳類において強化する方法であ って、 退化する腫瘍性細胞中に存在し、その様な細胞の外部には存在しない細胞内部 抗原に対し特異な免疫リポソームを提供し、前記免疫リポソームは抗腫瘍剤を含 み、 生きている悪性細胞を殺す療法を哺乳類において開始し、これにより前記悪性 細胞の一部を壊死させ、そして 前記哺乳類に対する前記免疫リポソームを管理して、前記壊死性悪性細胞中に 存在する前記細胞内部抗原に前記抗体を結合させ、これにより前記細胞に対し前 記抗腫瘍剤を分配することを特徴とする方法。 １５．請求項１４の方法において、前記抗腫瘍剤は、細胞傷害剤、毒素、放射線 増感化合物、α線放射型放射性核種、β線放射型放射性核種、及び抗増殖剤から なる群から選択されたものであることを特徴とする方法。 １６．請求項１４の方法において、前記細胞は化学療法の放射線により殺される ことを特徴とする方法。