DE69736385T2

DE69736385T2 - Kationisches lipid und rezeptorligand erleichterte gabe von biologisch aktiven molekuelen

Info

Publication number: DE69736385T2
Application number: DE69736385T
Authority: DE
Inventors: Pi-Wan Cheng
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-02-09
Filing date: 1997-01-29
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2017-01-30
Also published as: EP0904100A4; AU2112697A; US6077834A; EP0904100B1; DE69736385D1; JP4512882B2; JP2000506519A; ATE333892T1; EP0904100A1; WO1997028817A1

Description

FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft das Gebiet des intrazellulären Transports von biologisch aktiven Molekülen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Derzeit werden bei den wichtigsten somatischen Gentransfer-Ansätze entweder virale (Morgan, J.R., Tompkins, R.G. und Yarmuch, M.L. (1993), "Advances in recombinant retroviruses for gene delivery", Adv. Drug Del., Rev. 12, 143-158; Colledge, W.H. (1994), "Cystic fibrosis gene therapy", Curr. Opin. Gene Develop., 4, 466-471; Trapnell, B.C. und Gorziglia, M. (1994), "Gene therapy using adenoviral vectors", Curr. Opin. Biotechnol., 5, 617-625) oder nicht-virale Vektoren (Cotten, M. und Wagner, E. (1993), "Non-viral approaches to gene therapy", Curr. Opin. Biotech., 4, 705-710; Ledley, F.D. (1994), "Non-viral gene therapy", Curr. Opin. Biotechnol., 5, 626-636) verwendet.
Der auf viralem Vektor basierte Gentransfer zeigt eine hohe Gentransferleistung, doch erweist sich in mehreren Bereichen als mangelhaft. Zum Beispiel integrieren einige virale Vektoren willkürlich DNA in die Wirtsgenome (Olsen, J.C., Huang, W., Johnson, L.G. und Boucher, R.C. (1994) "Persistence of adenoviral vector gene expression in CF airway cells is due to integration of vector sequences into chromosomal DNA", Pediatr. Pulm. S10, 230; Russel, D.W., Miller, A.D. und Alexander, I.E. (1994) "Adeno-associated virus vectors preferentially transduce cells in S phase", Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 8915-8919), was potentielle Risiken birgt, einschließlich einer neoplastischen Transformation (Colledge et al. (1994) supra; Fairbairn, L.J., Cross, M.A. und Arrand, J.R. (1994) "Paterson Symposium 1993-Gene therapy", Brit. J. Cancer, 59, 972-975). Außerdem rufen adenovirale Vektoren Entzündungs- und Immunreaktionen beim Wirt hervor, was diese Vektoren für eine wiederholte Anwendung unwirksam macht (Ginsburg, H.S., Moldawer, L.L., Schgal, P.B., Redimgton, M., Kilian, D.L., Chanock, R.M. und Prince, G.A. (1991), "A mouse model for investigating the molecular pathogenesis of adenovirus pneumonia", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1651-1655; Yang, Y.P., Nunes, F.A., Berencsi, K., Gonczol, E., Engelhardt, J.F. und Wilson, J.M. (1994), "Inactivation of E2a in recombinant adenovirus improves the prospect for gene therapy in cystic fibrosis", Nature Genetics 7, 362-369; Yei, S., Mittereder, N., Tany, K., O'Sullivan, C. und Trapnell, B.C. (1994) "Adenovirus-mediated gene transfer for cystic fibrosis: Quantitative evaluation of repeated in vivo vector administration to the lung", Gene Therapy 1, 192-200; Trapnell et al. (1994), supra). Retrovirale Vektoren benötigen sich teilende Zellen für eine stabile Integration (Miller, D.C., Adam, M.A. und Miller, A.D. (1990), "Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection", Mol. Cell Biol. 10, 4239-4242), was diese Vektoren für die Gentherapie von terminal differenzierten Zellen ungeeignet macht. In ähnlicher Weise bevorzugt das Adeno-assoziierte Virus für eine effiziente Transduktion Zellen in der S-Phase vor Zellen in stationärer Kultur (Russel et al. (1994) supra). Weiterhin hat das Erfordernis eines Adenovirus und einer hohen Multiplizität der Infektion des Adeno-assoziierten Virus für eine effiziente Transduktion (Russel et al., (1994) supra), gekoppelt mit der Schwierigkeit, Viruspräparate mit hohem Titer zu gewinnen, der Verwendung dieses Virus als einem routinemäßigen Gentherapie-Vektor Grenzen gesetzt.
Einige mit der Verwendung dieser viralen Vektoren verbundenen Probleme können durch Verwendung von Gentransferagentien umgangen werden, wie etwa molekularen Konjugaten (Wu, G.Y. und Wu, C.H. (1987) "Receptor-mediated in vitro gene transformation by a soluble DNA carrier system", J. Biol. Chem. 262, 4429-4432; Wagner, E., Zenke, M., Cotten, M., Beug, H. und Birnstiel, M.L., (1990) "Transferrinpolycation conjugates as carriers for DNA uptake into cells", Proc. Natl. Acad. Sci., USA 87, 3410-3414; Findeis, M.A., Merwin, J.R., Spitalny, G.L. und Chiou, H.C. (1993), "Targeted delivery of DNA for gene therapy via receptors", TIBTECH 11, 202-205; Ferkol, T., Kaetzel, C.S., und Davis, P.B. (1993), "Gene transfer into respiratory epithelial cells by targeting the polymeric immunoglobulin receptor", J. Clin. Invest. 92, 2394-2400; Monsigny, M., Roche, A.-C., Midous, P. und Mayer, R. (1994) "Gly coconjugates as carriers for specific delivery of therapeutic drugs und genes", Adv. Drug Del. Rev. 4, 1-24; Yin, W. und Cheng, P-W. (1994), "Lectin conjugate-directed gene transfer to airway epithelial cells", Biochem. Biophys. Res. Commun., 205, 826-833) und kationische Liposome (Felgner, J.H., Gadek, T.R., Holm, M., Roman, R., Chan, H.W., Wenz, M., Northro, J.P., Ringold, G.M. und Danielsen, M. (1987) "Lipofectin: A highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure", Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84: 7413-7417). Molekulare Konjugate werden durch chemisches Verknüpfen von Rezeptorliganden mit Polykationen hergestellt (Wagner, E., Curiel, D. und Cotten, M. (1994), "Delivery of drugs, proteins und genes into cells using transferrin as a ligand for receptor-mediated endocytosis", Adv. Drug Del., Rev. 14, 113-135). Molekulare Konjugate für den rezeptorvermittelten Gentransport können auch durch chemisches Verknüpfen von Antikörpern oder Fragmenten davon mit Polykationen hergestellt werden (Cotten, M. und Wagner, E. (1993) supra; die Literaturverweise darin und Ferkol, T. et al. (1993) supra). Die Polykationen dienen als Träger der DNA, wohingegen die Liganden die Rezeptoren auf Zelloberflächen anzielen. Auf die Bindung an die Rezeptoren hin werden die Konjugate, zusammen mit der DNA, über eine rezeptorvermittelte Endozytose internalisiert (Findeis (1993) supra; Wagner (1994) supra; Curiel, D.T. (1994), "High-efficiency gene transfer employing adenovirus-polylysine-DNA complex", Nat. Immun., 13, 141-164).
Bei dem durch kationische Liposome vermittelten Gentransfer binden Liposome an DNA über ionische Wechselwirkung, und Liposome erleichtern den Transport von DNA vermutlich durch Fusion mit der Plasmamembran (Felgner et al. (1987) supra) und/oder Endozytose (Zhou, X. und Huang, L., (1994) "DNA transfection mediated by cationic liposomes containing lipopolylysine: characterization und mechanism of action", Biochem. Biophys. Acta., 1189, 195-203). Diese Agentien sind einfach herstellbar, können DNA einer beliebigen Größe transportieren (Wagner et al. (1994) supra), leiden aber generell an einer geringen Transfektionsleistung (Colledge (1994) supra).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung verwendet ein Transportsystem für biologisch aktive Moleküle, die in Zellen eindringen müssen, um ihre biologische Wirkung auszuüben.
Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren für den in vitro-intrazellulären Transport eines biologisch aktiven Moleküls bereit, umfassend:

(a) Kombinieren eines Zelloberflächen-Rezeptor-Liganden und eines kationischen Lipids zum Erhalt eines Gemischs, so dass der Ligand und das Lipid nicht-kovalent gebunden werden;
(b) Zugeben zu dem Gemisch des biologisch aktiven Moleküls, so dass das Molekül mit dem Lipid assoziiert wird, und
(c) Einbringen des Gemischs in eine Zelle.

Zu solchen Molekülen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Peptide, Proteine oder Polynukleotide, wie DNA oder RNA. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Molekül ein Gen für die Transfektion in einem gentherapeutischen Protokoll. Das Transportsystem ist ein Gemisch, zusammengesetzt aus einem kationischen Lipid, welches vorzugsweise in einer Liposomenformulierung vorliegt, und einem Rezeptorliganden, wie etwa Transferrin, wobei der Ligand nicht-kovalent an eine liposomale Komponente gebunden ist. Der Rezeptorligand wird zunächst der kationischen Liposomformulierung hinzugefügt und inkubiert. Das zu den Zellen zu transportierende biologisch aktive Molekül wird dann der resultierenden Ligand-Liposom-Kombination hinzugefügt und das Gemisch nochmals inkubiert. Die Reihenfolge, in der die Komponenten kombiniert werden, also der Ligand mit der liposomalen Formulierung, gefolgt von der Nukleinsäure, ist für die Erzielung einer hohen Transfektionsleistung entscheidend.
Die Erfindung stellt ferner die Verwendung eines Zelloberflächen-Rezeptor-Liganden, kationischen Lipids und eines biologisch aktiven Moleküls in der Herstellung eines Medikaments bereit, worin:

(a) der Zelloberflächen-Rezeptor-Ligand und das kationische Lipid zum Erhalt eines Gemischs kombiniert werden, sodass der Ligand und das Lipid nicht-kovalent gebunden werden; und
(b) das biologisch aktive Molekül dem Gemisch zugegeben wird, sodass das Molekül mit dem Lipid assoziiert wird; welches Medikament zur Verwendung für den in vivo-intrazellulären Transport eines biologisch aktiven Moleküls in eine Zelle vorgesehen ist.

Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines Medikaments für den intrazellulären Transport eines biologisch aktiven Moleküls in eine Zelle bereit, welches Verfahren umfasst:

(a) Kombinieren eines Zelloberflächen-Rezeptor-Liganden und eines kationischen Lipids zum Erhalt eines Gemischs, sodass der Ligand und das Lipid nicht-kovalent gebunden werden; und
(b) Hinzugeben zu dem Gemisch eines biologisch aktiven Moleküls, sodass das Molekül mit dem Lipid assoziiert wird.

Generell kann jeglicher Ligand, der eine Affinität für einen Zelloberflächen-Rezeptor aufweist, verwendet werden. Der Begriff Ligand wird hierin breit verwendet und beinhaltet Rezeptorliganden wie Transferrin, Insulin, Choleratoxin, Adenovirus-Faser-KNOB-Peptid, als auch Antikörper und Antikörper-Fragmente (z.B. Fab-Fragmente) zu Rezeptoren, wie etwa antisekretorischen Komponenten, und Peptide und Proteine, wie etwa epidermaler Wachstumsfaktor und virale Proteine, insbesondere jene viralen Proteine, die der rezeptorvermittelte Endozytose-Mechanismus stimuliert. Der verwendete Ligand kann ein solcher sein, z.B. Transferrin oder Insulin, der einen breiten Bereich von Zelltypen anzielt, oder ein solcher, der einen spezifischen Zelltyp anzielt.
Ganz allgemein kann jegliches mono- oder polykationische Lipid und neutrale Lipid in einer kationischen Liposomformulierung verwendet werden. Zu kationischen Lipiden zählen DOTMA, DDAB, DOSPA, DORI, DORI-Ester, DORI-Ether, DMRIE, DOTAP, TM-TPS und kationische Lipide, die strukturell damit verwandt sind. [Die Definitionen für jedes dieser Acronyme sind hierin angegeben und sind im Fachgebiet wohlbekannt.]
Spezifischer stellt diese Erfindung Transfektionsagentien bereit, bei denen der Ligand Transferrin, Insulin, Choleratoxin oder Adenovirus-Faser-KNOB-Peptid ist, und von denen die kationische liposomale Formulierung die kationischen Lipide DOTMA (N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethyl) oder DDAB (Dimethyldioctadecylammonimumbromid) und ein entsprechendes neutrales Lipid umfasst. Zu nützlichen kationischen Liposomformulierungen zählen solche, in denen das neutrale Lipid DOPE (Dioleoylphosphatidylethanolamin) ist. Bevorzugte kationische Liposomformulierungen sind „Lipofectin" (Trademark), welches eine kommerziell verfügbare 1:1-liposomale Formulierung von DOTMA und DOPE ist, und „Lipofectace" (Trademark), welches eine kommerziell verfügbare 1:2,5-liposomale Formulierung von DDAB und DOPE ist.
Bestimmte Fraktionen und/oder Komponenten von Serum wurden als die Transfektionsleistung von kationischen Liposomen erhöhend befunden. Diese Fraktionen oder Komponenten erhöhen, wenn sie anstelle der Rezeptorliganden in den Protokollen dieser Erfindung verwendet werden, die liposomale Transfektionsleistung.
Diese Erfindung betrifft eine hoch effiziente Gentransfer-Methode, die Transfektions-Reagenzien verwendet, die leicht herstellbar sind. In den Beispielen der Ausführungsformen sind die Inhaltsstoffe der Reagenzien kommerziell verfügbar. Weiterhin können Rezeptorliganden, die aus einer tierischen Quelle erhalten sind, für die Gentherapie in derselben Tier-Spezies verwendet werden, wodurch Entzündungs- und Immunreaktionen beim Wirt abgeschwächt oder verhindert werden, die bisher einen Hauptnachteil der Humangentherapie unter Verwendung adenoviraler Vektoren darstellten. Liposome scheinen wenig oder keine apparente Entzündungs- und Immunreaktion beim Wirt zu verursachen. Die Nutzung von Humantransferrin oder anderen humanen Liganden in Kombination mit kationischen Liposomen kann die Wirtsimmunreaktion bei gleichzeitiger Erzielung einer hohen Gentransferleistung beim Menschen umgehen.
Die hierin beschriebenen Verfahren mit „Lipofectin" und Transferrin können eine 100%-ige Transfektionsleistung in HeLa-Zellen erzielen. Das „Lipofectin"-Transferrin- Transfektionsprotokoll dieser Erfindung kann auch zur Korrektur einer gestörten Chloridleitfähigkeit in immortalisierten CF-Atemwegsepithelzellen (CFT1) durch Transfer von CFTR cDNA verwendet werden. Transferrin erhöht auch die Transfektion durch „Lipofectace" von HeLa-Zellen signifikant.
Diese Erfindung kann bei in vitro- und in vivo-Transfektions-Anwendungen nützlich sein. Die Einfachheit der Formulierung und die hohe Transfektionsleistung durch diese Reagenzien erleichtern die Entwicklung geeigneter Transfektionsreagenzien für die Humangentherapie.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1(a)-(h) veranschaulichen die X-Gal-Färbung von HeLa-Zellen, transfiziert mit Transferrin und „Lipofectin", enthaltend entweder 16 oder 0 μg Transferrin (F0) (1a), und die transfizierten Zellen von sechs aufeinander folgenden Passagen (F1 bis F6) (1b-1g). Zellen, die mit „Lipofectin"-DNA transfiziert waren, d.h. 0 μg Transferrin, dienten als den Kontrollen (C) (1 Std.). Für jeden Satz von F0 wurden die Zellen in 9 Wells transfiziert. Nach dem Kultivieren für 48 Stunden im Anschluss an die Transfektion wurden die Zellen in 3 Wells mit X-gal gefärbt, die Zellen in anderen 3 Wells auf die β-Galactosidase-Aktivität analysiert und die Zellen in den verbliebenen 3 Wells zu 9 Wells subkultiviert und für die anschließende Untersuchung verwendet. Die subkultivierten Zellen wurden wie nachstehend beschrieben, doch ohne Transfektion, prozessiert. Lediglich F0(C) (1 Std.) ist gezeigt, da F1(C) und F2(C) ähnlich zu F5(1f) sind, und F3(C), F4(C), F5(C) und F6(C) ähnlich zu F6(1g) sind. Ein ausführliches experimentelles Protokoll ist in den Beispielen beschrieben.
2 zeigt die Steigerung des DNA-Transfers durch Transferrin in Gegenwart von „Lipofectin". Die Symbole
•, ⎕ und o stehen für ³⁵S-pCMVIacZ, das auf die Zellen mit DNA, DNA + Transferrin, DNA + „Lipofectin" bzw. DNA + „Lipofectin" + Transferrin übertragen war. Der Wert zu jedem Zeitpunkt stellte den Mittelwert aus zwei Messungen dar.
3 veranschaulicht die Sepharose 4B-Chromatographie des Gemischs aus (A) [¹²⁵I]-Transferrin, „Lipofectin" und DNA, (B) „Lipofectin", DNA und [¹²⁵I]-Transferrin, (C) „Lipofectin" und [¹²⁵I]-Transferrin und (D) DNA und [¹²⁵I]-Transferrin. Jede Komponente der Gemische wurde nacheinander zugegeben, gefolgt von einer 15-minütigen Inkubationszeit. Die % der im Leervolumen nachgewiesenen Radioaktivität sind angegeben.
4 zeigt das vorgeschlagene Schema für die Bildung effizienter und ineffizienter Gentransfer-Komplexe unter Verwendung des Gentransfer-Vektors, der sich aus Transferrin und „Lipofectin" zusammensetzt. Diese Komplexe sind bezeichnet als: (A) „Lipofectin"-Transferrin, (B) „Lipofectin"-DNA-Transferrin, (C) „Lipofectin"-DNA und (D) Transferrin-DNA. (C) und (D) sind ineffiziente Gentransfer-Komplexe, wohingegen (B) der effizienteste Gentransfer-Komplex ist. Die relative Stärke der Wechselwirkung zwischen jedem Paar von Komponenten ist: „Lipofectin"-DNA >> Transferrin-DNA >> Transferrin-„Lipofectin".
5 zeigt ein Schaubild der β-Galactosidase-Aktivität und % blaue Zellen als eine Funktion der Konzentration des Transferrins, was die Steigerung durch Transferrin der Transfektionsleistung des „Lipofectin"-vermittelten Gen-(pCMVIacZ)-Transfers veranschaulicht.
6 zeigt ein Schaubild der Korrektur des defekten Chloridionen-Efflux in CFT1-Zellen. Der Prozentsatz der verbliebenen ³⁶Cl^– ist als eine Funktion der Zeit aufgetragen. In dem Schaubild sind Zellen, die mit Transferrin, „Lipofectin" und pCMVCFTR transfiziert sind, durch eine leere Raute
angegeben, und Zellen, die mit „Lipofectin" und der DNA transfiziert sind, sind durch leere Quadrate (☐) angegeben. In einem separaten Experiment, dessen Ergebnisse nicht gezeigt sind, wurden dieselben Ergebnisse wie für die Transfektion mit pCMVIacZ plus „Lipofectin" gefunden, für CFT1-Zellen ohne Transfektion, CFT1-Zellen, die mit Transferrin, DNA und „Lipofectin" (in dieser Reihenfolge zugegeben) transfiziert waren, und CFT1-Zellen, die mit Transferrin plus DNA transfiziert waren, festgestellt.
7 zeigt ein Schaubild ähnlich dem aus 6, bei dem der Prozentsatz an verbliebenem ³⁶Cl^– als eine Funktion der Zeit in transfizierten Zellen aufgetragen ist. Leere Kreise (o) geben die Kontrolle an (CFT1-Zellen, transfiziert mit „Lipofectin"); schwarze Kreise (•), leere Quadrate (⎕) und schwarze Rauten
geben die Ergebnisse für Zellen an, die mit Choleratoxin, Insulin oder Transferrin, jeweils in Kombination mit „Lipofectin" und pCMVCFTR transfiziert sind. Die Zellen wurden vorab mit Na ³⁶Cl in Cl^–-enthaltendem Medium beladen. Medien wurden entnommen und mit frischem Cl^–-freiem Medium mit 0,1 mm Amelorid bei 1-minütigen Intervallen wieder aufgefüllt. Am Ende von 3 min wurden 10 μm Forskolin den Medien zugegeben.
8a und 8b zeigen Schaubilder, die die Transfektionsleistung von pCMVIacZ in HeLa-Zellen bzw. CFT1-Zellen als eine Funktion von zunehmenden Mengen an Insulin veranschaulichen. Das Transfektionsmittel ist Insulin plus „Lipofectin".
9a und 9b zeigen Schaubilder, die die Transfektionsleistung von pCMVIacZ in HeLa- bzw. CFT1-Zellen als eine Funktion der Choleratoxin-Konzentration veranschaulichen. Das Transfektionsmittel ist Choleratoxin plus „Lipofectin".
10 zeigt ein Schaubild, das die Tranfektionsleistung einer „Lipofectin"-Transfektion von pCMVIacZ in HeLa-Zellen als eine Funktion des Serumvolumens, das anstelle des Rezeptorliganden verwendet wurde, veranschaulicht.
11a und 11b zeigen Schaubilder, die die Transfektionsleistung einer „Lipofectin"-Transfektion von pCMVIacZ in HeLa-Zellen veranschaulichen, wobei Protein A-Fraktionen bzw. Con A-Fraktionen zur Ersetzung des Rezeptorliganden verwendet wurden.
12 zeigt ein Schaubild, das die Transfektionsleistung einer „Lipofectin"-Transfektion unter Verwendung von Größen-fraktionierten Serumproben zur Ersetzung des Rezeptorliganden veranschaulicht.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der Beobachtung einer 98-100% Transfektion von HeLa-Zellen unter Verwendung der kationischen Liposomformulierung „Lipofectin" und des Transferrin-Rezeptorliganden mit breitem Zellbereich zur Übertragung des exprimierbaren β-Galactosidase-Gens. Im Vergleich ergab eine einfache Lipofektion unter Verwendung von „Lipofectin" alleine eine geringe Transfektionsleistung (3-4%) desselben DNA-Konstrukts in HeLa-Zellen. Das β-Galactosidase-DNA-Konstrukt alleine oder in Kombination mit Transferrin ergab sogar noch geringere Transfektionsleistungen mit HeLa-Zellen (< 0,01 %), obschon die DNA einen Komplex mit Transferrin bilden konnte.
Die Reihenfolge der Kombinierung der Komponenten der Transfektionszusammensetzung war für die Transfektionsleistung entscheidend. Die kationische Liposomformulierung wird mittels herkömmlicher Methoden hergestellt. Der Rezeptorligand wird der Liposomformulierung zugegeben und das Gemisch bei Raumtemperatur inkubiert, um eine Äquilibrierung der Komplexbildung zu ermöglichen. Die zu übertragende Nukleinsäure, z.B. DNA-Konstrukt, wird dann zugegeben und das Gemisch ein zweites Mal bei Raumtemperatur inkubiert, um die Äquilibrierung der Komplexbildung zu ermöglichen. Die Zugabe von Nukleinsäure zur kationischen Liposomformulierung, gefolgt von der Zugabe von Transferrin, ergibt kein hoch effizientes Transfektionsagens. Entsprechend ergibt die gleichzeitige Kombination von Nukleinsäure, Liposomformulierung und Rezeptorligand kein hoch effizientes Transfektionsagens.
Eine Transferrinrezeptor-vermittelte Endozytose stellt einen normalen physiologischen Vorgang dar, mittels dessen Transferrin Eisen an die Zellen liefert (Hueber, H. A. und Finch, C. A., (1987) "The physiology of transferrin und transferrin receptors", Physiol. Rev. 67, 520-582). Der Prozess vermittelt die anfängliche Bindung von Holotransferrin an seinen Rezeptor auf der Zelloberfläche bei neutralem pH (Aisen, P. (1994), "The transferrin receptor and the release of iron from transferrin", Adv. Exp. Med. Biol., 356, 31-40). Der Transferrin-Rezeptor-Komplex wird dann internalisiert und bildet ein Clathrin-beschichtetes Bläschen. Nach der Freisetzung von gebundenem Eisen bei saurem pH in das Endosom verlässt das Transferrin, nach wie vor komplexiert an den Rezeptoren, das Endosom und kehrt zur Zelloberfläche zurück, wo es in den Kreislauf freigesetzt wird. Dieser effiziente Rezeptor-Recycling-Prozess wurde für den Transfer von Fremd-DNA zu Zellen unter Verwendung von Transferrin-Polykation-Konjugaten ausgenützt (Wagner et al., 1987; Cotten und Wagner (1993) supra; Wagner et al. (1994) supra; Yin und Cheng, (1994) supra). Allerdings zeigen diese molekularen Konjugate eine geringe Transfektionsleistung (Colledge, (1994) supra; Yin und Cheng, (1994) supra).
Der Grund für die enorme Erhöhung der Transfektionsleistung, die beobachtet wird, wenn Transferrin in das kationische Liposomen-Transfektionsreagenz aufgenommen wird, doch nicht an eine liposomale Komponente kovalent gebunden ist, ist derzeit nicht gänzlich aufgeklärt. Die Rolle des kationischen Liposoms in der Transfektion ist als in der Bindung an negativ geladene Gruppen an der Zelloberfläche und der Verschmelzung mit der Plasmamembran bestehend erachtet worden. Während dieses Prozesses verschaffte sich die DNA (und jegliche weitere Spezies), die durch das kationische Liposom getragen wurde, Eintritt in die Zellen (Felgner et al. (1987) supra). Ein alternativer Vorschlag besteht darin, dass das kationische Liposom die DNA an die Zellen über den Endozytose-Weg heranbrachte (Zhou und Huang (1994) supra).
Bei dieser Erfindung erleichtert Transferrin in Kombination mit Liposomen den Eintritt von DNA in die Zellen bei einer zweifachen Höhe gegenüber den Liposomen ohne Transferrin. Obschon wir uns nicht an irgendeine bestimmte Theorie zur Wirkungsweise binden wollen, wird der hoch effiziente Gentransfer als durch den „Lipofectin"-DNA-Transferrin-Komplex B vermittelt angenommen, wie in 4 dargestellt. Das vorgeschlagene Schema für die Bildung von effektiven und ineffektiven Gentransfer-Komplexen, wie in 4 veranschaulicht, basiert auf den folgenden Beobachtungen:

1) „Lipofectin" geht leicht eine Komplexbildung mit einem Polynukleotid wie DNA durch Ladungs-Ladungs-Interaktionen ein, wobei dieser Typ von Interaktion stark genug ist, um Elektrophorese-Bedingungen zu überleben. Gershon N., Ghirlando R., Guttman, S.B. und Minsky, A. (1993) "Mode of formation and structural features of DANN-cationic liposome complexes used for transfection" Biochemistry 32: 7143-7151, berichteten, dass die Wechselwirkung von „Lipofectin" mit DNA zur Bildung kondensierter Strukturen als Folge einer wechselseitig bezogenen Lipidfusion und eines DNA-Kollapses führte, wie bei Komplex C der 4 dargestellt. Die exponier te Oberfläche der kondensierten Struktur ist beträchtlich kleiner als die des verlängerten DNA-Moleküls.
2) DNA kann einen Komplex mit Transferrin bilden, wie durch Sepharose 4B-Chromatographie demonstriert (siehe 3D). Da Transferrin ein Ampholyt mit einem isoelektrischen Punkt von 5,9 ist, mag die geringe Anzahl an positiv geladenen Gruppen, die in Transferrin bei pH 7,4 vorhanden ist, für diese Wechselwirkung verantwortlich sein. Ein Versagen des Transferrins darin, die Mobilität von DNA in der Agarose-Gelelektrophorese zu verzögern, unterstützt ebenfalls die Vorstellung, dass die Bindung zwischen DNA und Transferrin nicht sehr stark ist.
3) „Lipofectin" bindet Transferrin schwach (3C) vermutlich durch die negativ geladenen Gruppen in Transferrin bei physiologischem pH. Diese Wechselwirkung ist möglicherweise nicht stark genug, um dem „Lipofectin"-Transferrin-Komplex das Überleben der Bedingungen zu erlauben, die für die Sepharose 4B-Chromatographie angelegt werden. Allerdings ist sie möglicherweise stark genug, um dem Transferrin eine teilweise Abschirmung der positiv geladenen Gruppen des „Lipofectins" vor der Bindung an die DNA zu erlauben, und gleichzeitig die DNA in die Lage zu versetzen, an „Lipofectin" und Transferrin zu binden. Als Ergebnis wird ein effizienter Gentransfer-Komplex gebildet (4, Komplex B).
4) Die Transfektionsreagenzien, die durch Aussetzen von „Lipofectin" einer DNA, gefolgt von a) Transferrin, b) gleichzeitig zugesetztem DNA und Transferrin, oder c) zuvor gebildetem DNA-Transferrin-Komplex, präpariert werden, weisen alle eine geringe Transfektionsleistung auf. Diese Beobachtungen sind möglicherweise das Ergebnis der Bildung von ineffektiven Gentransfer-Komplexen, wie in 4 dargestellt (Komplex C). Sind alle drei Komponenten vorhanden, so wird der „Lipofectin"-DNA-Komplex vor der Bildung anderer Komplexe gebildet, was zur Bildung der ineffizienten Gentransfer-Komplexe führt.

Über seine Rolle beim Erleichtern des Eintritts der DNA in die Zellen hinaus kann Transferrin wichtige Rollen bei anderen Schritten des Genexpressions-Prozesses spielen. Zum Beispiel kann Transferrin, nach der Internalisierung des „Lipofectin"- DNA-Transferrin-Transferrinrezeptor-Komplexes, das Verlassen der DNA des Endosoms erleichtern. Da das Verlassen des Endosoms einen normalen physiologischen Prozess für Transferrin und seinen Rezeptor-Komplex darstellt (Hueber (1987) supra; Aisen, (1994) supra), kann die eingefangene DNA das Endosom durch Folgen dem Transferrin und seinem Rezeptor-Komplex vermutlich über einen Bystander-Effekt verlassen. Ob die Steigerung der Transfektionsleistung durch Transferrin das Ergebnis dieses Bystander-Effekts ist oder durch andere Mechanismen erfolgt, bleibt noch aufzuklären. Der Mechanismus kann möglicherweise ebenso mit anderen Zellrezeptorliganden funktionieren, wie etwa mit Insulin.
Es wird angenommen, dass das in 4 veranschaulichte Schema für „Lipofectin" und Transferrin allgemein gültig und auf jeglichen Rezeptorliganden anwendbar ist, einschließlich Insulin, Choleratoxin und das KNOB-Peptid und jegliche mono- oder polykationische Liposomformulierung, und insbesondere auch für „Lipofectace"-Formulierungen und DC-Cholesterol-kationische Liposome mit Transferrin gilt.
Die Verwendung einer Kombination der monokationischen Lipide „Lipofectin" oder „Lipofectace" mit Rezeptorliganden bietet mehrere Vorteile. Dieses Transfektionsreagenz ist leicht herstellbar, wobei in mehreren Fällen alle der Inhaltsstoffe kommerziell verfügbar sind. Aus einer Tierquelle präparierte Liganden können für die Gentherapie in derselben Tierspezies verwendet werden, wodurch Wirtsimmunreaktionen auf den Vektor verhindert werden. Die Entzündungs- und Immunreaktionen beim Wirt haben einen Hauptnachteil für die Humangentherapie unter Verwendung adenoviraler Vektoren dargestellt. (Ginsburg et al. (1991) supra; Trapnell et al. (1994) supra; Yang et al. (1994) supra; Yei et al. (1994) supra). Neuere Liposom-Toxizitätsstudien in den Lungen von Menschen zeigen, dass Liposom scheinbar eine minimale oder keine Entzündungs- und Immunreaktion beim Wirt bewirkt (Thomas, D. A., Myers, M. A., Wichert, B., Schreier, H. und Gonzalez, R. J. (1991), "Acute effects of liposome aerosol inhalation on pulmonary function in healthy human volunteers", Chest. 99, 1268-1270) und von mehreren Tierspezies (Stribling, R., Brunette, E., Liggitt, D., Gaensler, K. und Debs, R. (1992), "Aerosol gene delivery in vivo", Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89, 11277-11281; Alton, E.W.F.W., Middleton, O. G., Caplen, N. J., Smith, S. N., Steel, D. M., Munkonge, F. M., Jeffery, P. K., Geddes, D. M., Hart, S. L., Williamson, R., Fasold, K. I., Miller, A. D., Dickinson, P., Stevenson, B.J., McLachlan, G., Dorin, J. R. und Porteous, D. J. (1993), "Non-invasive liposomemediated gene delivery can correct the ion transport defect in cystic fibrosis mutant mice", Nature Genetics, 5, 135-142; Canonico, A. E., Plitman, J. D., Conary, J. T., Meyrick, B. O. und Brigham, K. L. (1994), "No lung toxicity after repeated aerosol or intravenous delivery of plasmid-cationic liposome complexes", J. Appl. Physiol., 77, 415-419; San, H., Yang, Z.-Y., Pompili, V. J., Jaffe, M. L., Plautz, G. E., Xu, L., Felgner, J. H., Wheeler, C. J., Felgner, P. L., Gao, X., Huang, L., Gordon, D., Nabel, G. J. und Nabel, E. G. (1993), "Safety und short-term toxicity of a novel cationic lipid formulation for human gene therapy"; Hum. Gene Ther. 4, 781-788). Die Verwendung von Humantransferrin oder anderen humanen Liganden in Kombination mit kationischen Liposomen kann die Wirtsimmunreaktion umgehen bei gleichzeitiger Erzielung einer hohen Gentransferleistung beim Menschen.
Die Steigerung der Transfektionsleistung, die mit Transferrin erreicht wird, variiert innerhalb verschiedener kationischer Liposome. Wie in Tabelle 4 gezeigt, steigert Transferrin die Transfektion mit „Lipofectin"- und „Lipofectace"-Liposomformulierungen signifikant (10fache oder mehr Steigerung der % blauen Zellen oder β-Gal-Aktivität). Die Steigerung wird auch mit DC-Cholesterol-Liposomen beobachtet, doch wird keine messbare Steigerung mit „Lipofectamin" beobachtet, welches das polykationische Lipid DOSPA enthält.
US-Patent 4,897,355 (Eppstein et al.), erteilt im Jahre 1990, beschreibt kationische Lipide, die strukturell dem DOTMA verwandt sind. Die darin beschriebenen kationischen Lipide und repräsentativen neutralen Lipide sind in den kationischen Liposomformulierungen dieser Erfindung nützlich.
DDAB ist das monokationische Lipid Dimethyldioctadecylammoniumbromid. Siehe US-Patent 5,279,833 und WO 91/15501 (veröffentlicht am 17.10.1991 für DDAB und verwandte kationische Lipide). Verwandte kationische Typen, zum Beispiel jene, in denen die Octadecylgruppen durch andere höhere Alkylgruppen (Alkylgruppen mit 8 oder mehr Kohlenstoffatomen) ersetzt sind; jene, in denen die Methylgruppen durch andere niederere Alkylgruppen (Alkylgruppen mit 1 bis etwa 3 Kohlenstoffatomen) ersetzt sind; oder jene, in denen das Bromidanion durch ein anderes Anion ersetzt ist, sind in den kationischen Liposomformulierungen dieser Erfindung nützlich.
Singhal, A. und Huang, L. (1994) "Direct Gene Transfer by Liposomes" J. Liposome Res. 4(1): 289-299) beschreiben kationische Derivate von Cholesterol, die zur Präparierung der kationischen Liposome nützlich sind. Cholesterol-Derivate, in denen eine tertiäre Aminogruppe an einen Lipidanker mit einer Amid- oder Carbamoylbindung geknüpft ist und durch einen Abstandshalter von 3-6 Atomen getrennt ist, können zur Präparierung der Liposome mit hoher Transfektionsleistung, erhöhter Haltbarkeit und geringer Toxizität verwendet werden. Siehe auch: Gao, X. und Huang, L. (1991) "A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells" Biochem. Biophys. Res. Commun. 179: 280-285; Farhood, H., Bottega, R., Epand, R.M. und Huang, L. (1992) "Effect of cationic cholesterol derivatives on gene transfer and protein kinase C activity" Biochem. Biophys. Acta 1111: 239-246. DC-Cholesterol ist das derivatisierte Cholesterol: 3β-[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)-carbamoyl]-cholesterol. DC-Cholesterol-Liposome werden durch Kombinieren des kationischen Lipids mit einem neutralen Lipid, zum Beispiel DOPE, hergestellt.
„Lipofectamin" ist eine 3:1-Liposomformulierung des polykationischen Lipids 2,3-Dioleyloxy-N-[2(spermincarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminiumtrifluoracetat (DOSPA) und DOPE. Siehe US-Patent 5,334,761.
„Cellfecin" (Trademark) ist eine kommerziell verfügbare kationische Liposomformulierung, welche eine 1:1,5 (w/w) Formulierung des polykationischen Lipids N,N',N'',N'''-Tetrapalmitylsperrnin (TM-TPS) und DOPE ist. TM-TPS und in dieser Erfindung nützliche verwandte polykationische Lipide sind beschrieben in WO 95/17373 (veröffentlicht am 29. Juni 1995).
US-Patentanmeldung der laufenden Nummer 08/195,866, eingereicht am 11. Februar 1994 (veröffentlicht als US-Patent Nr. 6,075,012) (Gebeyehu et al.), beschreibt weitere kationische Lipide, die bei der vorliegenden Erfindung nützlich sind. Von besonderem Interesse sind die hierin beschriebenen Urethan-Derivate.
US-Patent 5,264,618 beschreibt kationische Lipide, wie etwa DOTAP (1,2-Bis-(oleoyloxy)-3-(trimethylammonio)propan. Diese Lipide weichen von DOTMA darin ab, dass die Oleoyl-Komponenten über Ester und nicht über Etherbindungen an das Propylamin geknüpft sind. Eine Gruppe von kationischen Lipiden, die in ihrer Struktur zu DOTMA und DOTAP verwandt sind, ist jene, in der eine der Methylgruppen der Trimethylammoniumgruppe durch eine Hydroxyethylgruppe ersetzt ist. Verbindungen dieses Typs sind ähnlich dem Rosenthal-Inhibitor (RI) von Phospholipase A (Rosenthal, A.F. und Geyer, R.P. (1960) J. Biol. Chem. 235: 2202-2206), welches Stearoylester in Bindung an den Propylamin-Kern aufweist. Die Dioleoyl-Analoga von RI werden allgemeinhin als DORI-Ether oder DORI-Ester in Abhängigkeit von der Bindung der Fettsäure-Komponenten an den Propylamin-Kern bezeichnet. Die Hydroxyethylgruppe dieser Analoga kann ebenfalls zum Beispiel durch Veresterung weiter funktionalisiert werden. Alle diese kationischen Lipide, die strukturell dem DOTMA verwandt sind, sind in den kationischen Liposomformulierungen dieser Erfindung nützlich. Ein anderes in den Liposomformulierungen dieser Erfindung nützliches kationisches Lipid ist 1,2-Dimyristyloxypropanol-3,3-dimethylhydroxymethylammoniumbromid, welches häufig mit dem Acronym DMRIE bezeichnet ist.
Wie hierin angemerkt, ist diese Gentransfermethode allgemein auf jeglichen Rezeptorliganden anwendbar. Cotten und Wagner (1993), supra, stellen in einem Überblick über die nicht-viralen Ansätze der Gentherapie in der darin enthaltenen Tabelle 1 eine nicht erschöpfende Liste von Spezies bereit, die als Rezeptorliganden für die Konjugat-Bildung im rezeptorvermittelten Gentransfer nützlich sind. Die Spezifitäten der einzelnen Liganden sind in den darin zitierten Literaturstellen beschrieben. Weitere Beispiele der Rezeptorliganden für das Zell-Targeting sind in anderen darin zitierten Literaturstellen zu finden. Die gesteigerte Transfektion dieser Erfindung ist unter Verwendung von Transferrin, Insulin und Choleratoxin als Rezeptorliganden nachgewiesen worden. Alle der Liganden, die in der Cotton und Wagner (1993)-Referenz und anderen darin zitierten Literaturstellen beschrieben sind, können ebenfalls auf eine erhöhte Transfektion ohne kovalente Bindung des Liganden, wie in dieser Erfindung beschrieben, hinwirken. Daher ist dieses Gentransfer-Protokoll generell auf Liganden anwendbar, die auf die Bindung an Zellobertlächen-Rezeptoren hin internalisiert werden können.
Die hierin angegebenen spezifischen Beispiele zeigen eine vorübergehende Expression der DNA, die auf Zellen durch Rezeptor-erleichterte Liposomtransfektion übertragen ist. Kein Nachweis einer Population der transfizierten Zellen, die β-Galactosidase exprimierten, legt nahe, dass trotz des hoch effizienten Gentransfers, wie unter Verwendung dieses Transfektionsagens erzielt, die Integration der Plasmid-DNA in das Wirtsgenom nach wie vor ein seltenes Ereignis ist. Das Rezeptorligand-erleichterte Gentransfer-Protokoll dieser Erfindung kann mit jeglichen der bekannten Techniken zur Erzielung der Integration von Nukleinsäure, z.B. DNA, in die wirtsgenomische DNA angewendet werden.
Diese Erfindung kann mit jeglichen bekannten Techniken zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäure, z.B. DNA, die in die Zelle eingeführt ist, angewendet werden. Zum Beispiel kann die gleichzeitige Einführung von nukleärem Protein zusammen mit DNA in Liposome zu einer erhöhten Expression der DNA führen. Kaneda, Y., Iwai, K. und Uchida, T. (1989) "Increased Expression of DNA Cointroduced with Nuclear Protein in Adult Rat Liver" Science 243: 375-378; Kaneda, Y., Iwai, K. und Uchida, T. (1989) "Introduction und Expression of the Human Insulin Gene in Adult Rat Liver" J. Biol. Chem. 264(21): 12126-12129. Von nukleärem Protein, wie etwa Nicht-Histonen-chromosomales Protein, High-Mobility-Group 1 (HMG-1), wird angenommen, dass es die Übertragung von DNA auf Zellkerne erleichtert und somit die Expression erhöht. Diese Erfindung kann zur gleichzeitigen Einführung von DNA und nukleärem Protein angewendet werden, um eine weitere Erhöhung der Expression zu erzielen.
Fachleute des Gebiets werden bei üblicher Sachkenntnis erkennen, dass bestimmte Einzelheiten der Präparierung der Transfektionsagentien dieser Erfindung und Einzelheiten der Transfektions-Protokolle routinemäßig variiert werden können, um eine optimale Transfektionsleistung und Genexpression für einen gegebenen Rezeptorliganden, kationisches Lipid/neutrales Lipid-Liposomformulierung, Nukleinsäure und Zielzelltyp zu erzielen. Diese routinemäßige Optimierung befindet sich innerhalb des Geistes und Rahmens dieser Erfindung.
Fachleute des Gebiets werden bei üblicher Sachkenntnis ebenfalls erkennen, dass alle Rezeptorliganden, kationischen Lipide und neutralen Lipide, die andere als die hierin spezifisch veranschaulichten sind, im Hinblick auf die hierin angegebenen Beschreibungen verwendet werden können.
Das Transferrin-kationisches Lipid-Protokoll dieser Erfindung ist zur Anwendung bei der Einführung von Nukleinsäuren in Zellen beschrieben worden. Das Transferrinkationisches Liposom-Protokoll dieser Erfindung lässt sich ohne Weiteres unter Bezugnahme auf diese Beschreibung und auf im Fachgebiet wohlbekannte Techniken und Methoden zur Einführung von Wirkstoffen und Proteinen als auch Genen in Zellen adaptieren. Wagner et al. (1994), supra, geben einen Überblick über den Transfer einer Vielzahl von Spezies unter Anwendung der rezeptorvermittelten Endozytose.
Die zitierten Literaturstellen bieten unter anderem die Einzelheiten zu den Strukturen verschiedener kationischer Lipide und neutraler Lipide, die bei der Präparierung der kationischen Liposomen nützlich sind, Verfahren zur Präparierung der Liposome und Liposomformulierungen, Quellen der Zelloberflächen-Rezeptorliganden einschließlich der Verfahren zur Isolierung oder anderweitigen Präparierung dieser Liganden, Beschreibungen der Zellwachsturns-Bedingungen, Einzelheiten zur Anwendung der Rezeptorliganden für die gezielte Transfektion und Beschreibungen von in vitro- und in vivo-Anwendungen der Transfektionsagentien und Methoden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung und sollen in keiner Weise den Umfang der Erfindung beschränken.
Die Beispiele
BEISPIEL 1: Transfektion von HeLa-Zellen mit „Lipofectin" und Transferrin
Verfahren:
Bestimmung der optimalen Verhältnisse von „Lipofectin" und DNA
Die anfängliche Agarose-Gelelektrophorese wurde an Gemischen mit variierenden Mengen (0,5-10 μg) an „Lipofectin" (Trademark) (GIBCO/BRL, Gaitherburg, MD) bei fixierten Mengen (1,5 μg) an DNA (pCMVIacZ) (Clontech Lab, Inc., Palo Alto, CA) zur Bestimmung des optimalen Verhältnisses von „Lipofectin" und DNA vorgenommen. Die DNA in Agarosegel wurde mit Ethidiumbromid angefärbt und unter UV-Licht sichtbar gemacht. Wenn sie mit „Lipofectin" komplexiert war, so drang die DNA nicht in das Gel ein. Dieselbe Vorgehensweise bei der Agarose-Gelelektrophorese wurde zur Bewertung dessen angewendet, ob Transferrin die DNA-Mobilität verzögern könnte, indem Gemische von 1,5 μg DNA und 2-32 μg Transferrin analysiert wurden.
Sepharose 4B-Chromatographie:
Um zu bewerten, ob Transferrin mit „Lipofectin"-DNA-Komplex komplexiert wurde, wurden eine Transfektionslösung (500 μl), die 32 μg an [¹²⁵I]-Transferrin (7 × 10⁴ cpm) in 100 μl HEPES-gepufferter Salzlösung (HBS) (20 mM HEPES, pH 7,4 und 100 mM NaCl) enthielt, 3 μg „Lipofectin", 1,5 μg pCMVIacZ und 300 μl DMEM-H (GIBCO/BRL) auf eine Sepharose 4B-Säule (1 × 12 cm) aufgebracht. Die Reihenfolge der Zugabe von Transferrin, „Lipofectin" und DNA variiert gemäß dem spezifischen experimentellen Protokoll. Das Gemisch wurde vorsichtig vermischt und dann für 15 min nach der Zugabe jedes Reagenz inkubiert. Dann wurde die Säule mit HBS entwickelt, Fraktionen von 0,5 ml entnommen und die Radioaktivität in einem Gammazähler gemessen. „Lipofectin" wurde bei dem Leervolumen (3 ml) eluiert und ungebundenes [¹²⁵I]-Transferrin bei 8,4-9,0 ml Elutionsvolumen. DNA-„Lipofectin"-Transferrin- und DNA-Transferrin-Komplexe erschienen im Leervolumen.
Gentransfer-Protokoll:
HeLa-Zellen (American Type Culture, Rockville, MD), die zur Konfluenz in einer 48-Well-Kulturplatte in DMEM-H-Medium, enthaltend 10% fötales Rinderserum (FBS), gezüchtet worden waren, wurden zweimal mit Serum-freiem DMEM-H gespült. Diese Zellen wurden dann 500 μl der wie nachstehend beschrieben hergestellten Transfektionslösung ausgesetzt. In 12 × 75 mm Polystyrol-Röhrchen (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) wurden die folgenden Reagenzien nacheinander zugegeben, vorsichtig vermischt und für 15 min bei Raumtemperatur nach jeder Zugabe inkubiert: 100 μl HBS, enthaltend zuvor festgelegte Mengen an frisch zubereitetem humanem Transferrin (eisengesättigt, hitzeinaktiviert (Collaborative Biomedial Products, Becton Dickinson, Bedford, MA) (32 μg für routinemäßige Experimente), 3 μl „Lipofectin" (1 mg/ml) und 100 μl HBS, enthaltend 1,5 μg pCMVIacZ. Das Gemisch wurde in jedes Well übertragen, das mit 300 μl Serum-freiem DMEM-H ohne Antibiotika bedeckt worden war, und dann vorsichtig vermischt. Die Platte wurde für einen zuvor festgelegten Zeitraum (18-24 Stunden für routinemäßige Experimente) unter wassergesättigter Umgebung und 5% CO₂ inkubiert. Die entsprechenden, einer „Lipofectin"-DNA ausgesetzten Kulturen dienten als einer Kontrolle. Die anderen beiden Kontrollen umfassten DNA und DNA plus Transferrin. Die konditionierten Medien wurden dann durch 1,0 ml an DMEM-H, enthaltend 10% FBS und Antibiotika (50 E/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin), ersetzt. Nach 48 Stunden der Anzucht wurden die Zellen in drei Wells in 300 μl eiskaltem 2% Paraformaldehyd-0,20% Glutaraldehyd für 10 min fixiert, gefolgt von der Entfernung des konditionierten Mediums und zweimaligem Waschen mit PBS. Die Zellen wurden dann 0,5 ml an 1,0 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal) (GIBCO/BRL) (Yin und Cheng (1994) "Lectin conjugated-directed gene transfer to airway epithelial cells", Biochem. Biophys. Res. Commun. 205: 826-833) bei 37°C für zwei Tage ausgesetzt, nachdem die Fixiermittel entfernt worden waren, und zweimal mit PBS gespült. Der Prozentsatz an blauen Zellen wurde durch Auszählen der Zahl an blauen Zellen aus der Gesamtzahl von 2.500-3.000 Zellen in 20-30 willkürlich gewählten Feldern unter einem Phasenkontrast-Mikroskop gemessen. Die Zellen in drei anderen Wells wurden dreimal mit PBS gespült, durch Trypsinierung dissoziiert, dreimal mit PBS gespült und dann mittels dreier Zyklen von Einfrieren und Auftauen lysiert. Diese Lysate wurden auf die β-Galactosidase-Aktivität in Lichteinheiten (Beate et al. (1992) "A rapid and simple chemiluminescent assay for Escherichia coli β-galactosidase," Biotechniques 120: 320-324) auf einem Lummat LB9501-Spektrofluorimeter gemessen (EG&G Berthold, Nashua, NH) und auf das Protein (Bradford Reagent, Bio-Rad, Melville, NY) unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) als dem Standard gemessen. Die Daten wurden als Lichteinheiten pro μg Protein ausgedrückt.
Transfer von ³⁵S-pCMVIacZ zu HeLa-Zellen:
³⁶S-markiertes wurde durch willkürliches Priming (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) nach Linearisierung durch EcoRI-Verdau präpariert. Jede der vier Transfektionslösungen, DNA, DNA + Transferrin (32 μg), DNA + "Lipofectin" (3 μg) und DNA + "Lipofectin" + Transferrin, enthielt 1,5 μg an ³⁵S-markiertem pCMVIacZ (1,4 × 10⁴ cpm). 0, 0,5, 1, 3, 6 und 24 Stunden nach Transfektion wurden die Medien entfernt. Dann wurden die Zellen einmal mit 1 ml HBS gewaschen, durch Trypsinierung rückgewonnen und zweimal mit 1,5 ml HBS gewaschen. Die pelletierten Zellen wurden in 60 μl destilliertem Wasser suspendiert und durch dreimaliges Einfrieren und Auftauen aufgebrochen. Aliquots wurden auf die Reaktivität und das Protein gemessen. Die Daten wurden als cpm/mg Protein ausgedrückt.
Weitere Methoden:
pCMVIacZ wurde aus Escherichia coli, welches diese Plasmid-DNA beherbergt, unter Verwendung eines QiaGen-Plasmidisolierungs-Kits (Chatsworth, CA) ausgereinigt. [¹²⁵I]-Transferrin wurde mittels einer Chloramin-T-Methode präpariert, wie unten beschrieben. 5 μl an 100 mCi/ml Na¹²⁵I (Amersham, Arlington Hts., IL) und 5 μl an 2 mg/ml Chloramin T (Eastman Kodak Company, Rochester, NY) wurden 100 μl HBS, enthaltend 100 μg Transferrin, zugegeben. Nach Inkubation für 20-30 sec wurden 5 μl Natriummetabisulfit (Sigma, St. Louis, MO) zugegeben, um die Reaktion zum Stopp zu bringen. Das [¹²⁵I]-Transferrin wurde auf Sephadex G-25 (0,5 × 4 cm) isoliert.
Statistische Analyse:
Die statistische Analyse wurde mittels eines ungepaarten two-tailed t-Test-Programms vorgenommen (GraphPAD InPlot Software, San Diego, CA).
ERGEBNISSE:
Gentransferleistung als eine Funktion der Transfektionszeiten:
Das Aussetzen der HeLa-Zellen der Transfektionslösung, die sich aus Transferrin, „Lipofectin" und pCMVIacZ zusammensetzte, für verschiedene Zeitdauern von 0,5 bis 24 Stunden führte zu einer erhöhten Expression von β-Galactosidase, wie sowohl durch die β-Galactosidase-Aktivität als auch den Prozentsatz an blauen Zellen ausgewertet (Tabelle 1). Eine 2,5-fache Zunahme der β-Galactosidase-Aktivität in den mit dem Reagenz transfizierten Zellen, das aus Transferrin, „Lipofectin" und DNA hergestellt war, gegenüber der Kontrolle (p = 0,0005) wurde nach 0,5-stündiger Exposition beobachtet, obschon die % blaue Zellen zwischen diesen beiden Gruppen nicht differierten. Eine 1-stündige Exposition ergab eine 13-fache Zunahme der β-Galactosidase-Aktivität und 30% blaue Zellen. Nach 5-stündiger Exposition waren im Wesentlichen alle der Zellen transfiziert. Entsprechend nahm die β-Galactosidase-Aktivität für bis zu 5 Stunden beständig zu und begann anschließend, sich einzupendeln. Für routinemäßige Gentransfer-Experimente wurde eine Übernacht-Transfektion gewählt, um die Expression der β-Galactosidase-Aktivität zu maximieren. Bei anderen Kontrollen, die DNA oder DNA plus Transferrin verwendeten, waren < 0,01 % der Zellen transfiziert.
Transfektionsleistung als eine Funktion der Transferrinmengen:
Die mit dem Gemisch aus Transferrin, „Lipofectin" und DNA erhaltene Transfektionsleistung hing von den Mengen an verwendetem Transferrin ab. Wie in Tabelle 2 gezeigt, waren der Prozentsatz an transfizierten Zellen und die in den transfizierten Zellen exprimierten β-Galactosidase-Aktivitäten erhöht, wenn ≥ 3 μg Transferrin verwendet wurden. Erreichten darüber hinaus die verwendeten Mengen an Transferrin 8 μg und mehr, so waren mindestens 97% der HeLa-Zellen transfiziert. Eine maximale Expression der β-Galactosidase-Aktivität wurde nicht erreicht, bis 16 μg Transferrin verwendet wurden.
Expression von transfiziertem Reportergen als eine Funktion der Passagenanzahl:
Die hohe Transfektionsleistung in HeLa-Zellen, wie durch „Lipofectin" plus Transferrin vermittelt, erbrachte eine ausgezeichnete Gelegenheit, die Frage zu untersuchen, für wie viele Passagen die Expression des übertragenen Reportergens erhalten bleiben würde. Wie in 1 und Tabelle 3 gezeigt, nahm der Prozentsatz an transfi zierten Zellen, die blau gefärbt waren, progressiv von 70% nach einer Passage auf < 0,01 % nach 6 Passagen ab. Eine progressive Abnahme der β-Galactosidase-Aktivität als eine Funktion der Passagenanzahl wurde ebenfalls beobachtet.
Charakterisierung des Transfektionsagens:
Die Agarose-Gelelektrophorese der Gemische, die fixierte Mengen an DNA (1,5 μg) und variierende Mengen an „Lipofectin" (0,5-10 μg) enthielten, zeigte, dass die gesamte DNA mit „Lipofectin" komplexiert war, wenn die Menge an „Lipofectin" zumindest das zwei- bis dreifache der DNA-Mengen (w/w) betrug. Dieses Ergebnis bildete die Grundlage für das experimentelle Protokoll unter Verwendung von 3 μg „Lipofectin" und 1,5 μg DNA für jedes Well der 48-Well-Platte.
Um auszuwerten, ob die beobachtete erhöhte Expression von β-Galactosidase das Ergebnis eines erhöhten Transfers von DNA war, wurde ein Gentransfer-Experiment unter Verwendung von [³⁵S]DNA durchgeführt. Wie in 2 gezeigt, erhöhte Transferrin in Abwesenheit von „Lipofectin" den DNA-Transfer gegenüber dem mit DNA alleine nicht. Die Maximalmenge an durch den „Lipofectin"-DNA-Komplex übertragener DNA war zumindest zweimal so hoch wie durch DNA alleine. Die Inkubation von Transferrin mit „Lipofectin" vor der Zugabe von DNA verdoppelte die Menge an DNA, die durch den „Lipofectin"-DNA-Komplex übertragen wurde. Nach 24 Std. nahm die Menge an DNA, die in den mit einem Reagenz transfizierten Zellen gefunden wurde, das durch sequentielle Zugabe von Transferrin, „Lipofectin" und DNA hergestellt war, um 40% ab.
Um die Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Komponenten in der Transfektionslösung zu bewerten, wurde eine Sepharose 4B-Säulenchromatographie vorgenommen. Eine Analyse der Transfektionslösung, die durch sequentielle Zugabe von 32 μg [¹²⁵I]-Transferrin, 3 μg „Lipofectin" und 1,5 μg DNA hergestellt war, ergab, dass 6,8% der Gesamtradioaktivität in das Leervolumen eluiert wurden (3A). Keine Radioaktivität wurde im Leervolumen nachgewiesen, wenn die Lösung in der Reihenfolge DNA, „Lipofectin", gefolgt von [¹²⁵I]-Transferrin hergestellt wurde (3B). Die Transfektionsleistung (3,2%) unter Verwendung eines Reagenz, das in derselben Weise hergestellt war, unterschied sich nicht vom Kontrollwert (3,9%), der durch Transfektion mit „Lipofectin" plus DNA erhalten wurde. Lediglich eine geringe Menge (0,2%) an Radioaktivität wurde im Leervolumen nachgewiesen, wenn das Gemisch von [¹²⁵I]-Transferrin und „Lipofectin" analysiert wurde (3C). Wurde außerdem [¹²⁵I]-Transferrin mit DNA gemischt, so wurden ebenfalls 6,8% an Radioaktivität im Leervolumen gefunden (3D). Die Transfektionsleistung (2,8%) unter Verwendung von Transferrin plus DNA war dieselbe wie bei der Kontrolle (Daten nicht gezeigt). Außerdem verminderte die Zugabe von 2-32 μg Transferrin zu 1,5 μg DNA die Mobilität und die Bandenintensität der DNA bei der Agarose-Gelelektrophorese nicht.
Variation der Transferrin-erleichterten gCMVIacZ-Transfektionsleistung mit verschiedenen kationischen Liposomen
Die Transfektionsleistung des Transferrin-erleichterten Gentransfers in HeLa-Zellen variierte mit verschiedenen kationischen Liposomen. Wie in Tabelle 4 gezeigt, war „Lipofectin" das wirksamste Liposom unter den untersuchten vier verschiedenen kationischen Liposomen. Dem folgte „Lipofectace" und dann DC-Cholesterol. „Lipofectamin" ergab keine Verbesserung bei den in Tabelle 4 aufgelisteten Ergebnissen. Es kann jedoch sein, dass das Experiment mit „Lipofectamin", dessen Ergebnisse in Tabelle 4 aufgelistet sind, die Nützlichkeit von „Lipofectamin" als einer kationischen Liposom-Komponente bei den Verfahren dieser Erfindung nicht exakt widerspiegelt. „Lipofectamin" allein wird allgemein als ein angemessen wirksames Transfektionsagenz in HeLa-Zellen befunden. Transfektionsleistungen von 40% der DNA werden routinemäßig mit „Lipofectamin" allein beobachtet. Siehe Hawley-Nelson, P. et al. (1993) FOCUS 15: 73. Der Prozentsatz an im Experiment der Tabelle 4 beobachteten blauen Zellen für „Lipofectamin" alleine erscheint als signifikant geringer, als normalerweise zu erwarten wäre. Dies legt einige Probleme mit dem Transfektions-Experiment nahe.
BEISPIEL 2: Korrektur des gestörten Chlorid-Transports von CFT1-Zellen durch Transferrin-erleichterten Gentransfer, wie durch kationische Liposomen vermittelt
Zur Konfluenz in 48-Well-Platten gezüchtete CFT1-Zellen wurden für 24 Std. einer Transfektionslösung ausgesetzt, die „Lipofectin", DNA und Transferrin enthielt.
Die Transfektionslösung wurde wie in Beispiel 1 hergestellt. Spezifisch wurde Transferrin dem „Lipofectin" zugegeben und das Gemisch bei Raumtemperatur für etwa 15 min inkubiert. Daraufhin wurde die DNA zugegeben und das Gemisch nochmals für etwa 15 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Die transfizierten Zellen wurden für 2-3 Tage weiter kultiviert, bevor sie in Glutaraldehyd fixiert und dann mit X-gal für 2-3 Tage entwickelt wurden. Die Transfektionsleistung (% blaue Zellen) hing von der Transferrin-Konzentration ab (μg/0,5 ml Transfektionslösung); 0 μg, 0,1 %; 1 μg, 0,4 %; 2 μg, 5,5 %; 4 μg, 7 %; 8 μg, 8 %; 16 μg, 10 %; und 32 μg, 11 %. Die mittels der Lumigal-Methode gemessenen β-Galactosidase-Aktivitäten folgten ebenfalls derselben Tendenz (siehe 5). Unter Anwendung des Protokolls, das die höchste Transfektionsleistung beim Übertragen von pCMVIacZ auf CFT1-Zellen, gezüchtet in 35 mm Schalen, erbrachte, wurde eine 33 % Transfektionsleistung erzielt. Mit pCMVCFTR unter Anwendung dieses Protokolls transfizierte CFT1-Zellen zeigten eine größere Rate des ³⁶Cl^–-Efflux als CFT1-Zellen, die durch „Lipofectin" ohne Transferrin transfiziert waren, oder als CFT1-Zellen ohne Transfektion (siehe 6). Diese Ergebnisse zeigen, dass der durch Liposome vermittelte Transferrin-erleichterte CFTR-Gentransfer den gestörten Chlorid-Transport durch die CF-Atemwegsepithelzellen korrigieren kann. Eine signifikante Korrektur des gestörten Chlorid-Transports wurde beobachtet, wenn Insulin oder Choleratoxin für die Transfektion mit „Lipofectin" verwendet wurden (siehe 7).
METHODEN:
Transfektions-Protokoll und Messung der Transfektionsleistung:
Die in einer 48-Well-Platte gezüchteten konfluenten CFT1-Zellen wurden über Nacht einer Transfektionslösung (0,5 ml) ausgesetzt, die 3 μg „Lipofectin", 1,5 μg DNA und 1-32 μg Transferrin enthielt. Die transfizierten Zellen wurden dann in F-12-Medium, ergänzt mit 7 verschiedenen Hormonen und Wachstumsfaktoren für 2-3 Tage kultiviert. Dann wurden die Zellen in 2 Wells in 4% Parafomaldehyd bei 4°C für 10 min fixiert und X-gal für 2-3 Tage ausgesetzt. Die Transfektionsleistung wurde anhand der Anzahl an blauen Zellen pro 100 gezählter Zellen unter einem Phasenkontrast-Mikroskop bestimmt. Die Zellen in 3 anderen Wells wurden durch Trypsinierung rückgewonnen und deren Homogenate auf die β-Galactosidase-Aktivitäten durch die Lumigal-Methode gemessen (Beate et al. (1992) supra). Die Daten wurden als Lichteinheiten/μg Protein ausgedrückt. Siehe 5.
³⁶Cl^–-Efflux-Assay
CFT1-Zellen wurden in einer 6-Well-Platte zur Konfluenz gezüchtet. Die Zellen in einem Well wurden mit „Lipofectin" und pCMVCFTR plus Transferrin behandelt, und die Zellen in 2 anderen Wells wurden mit „Lipofectin" und pCMVIacZ plus Transferrin behandelt, wie oben beschrieben. Die ersten beiden Wells wurden auf den ³⁶Cl^–-Efflux gemessen, und das dritte Well wurde fixiert, mit X-gal behandelt und auf die % blaue Zellen gemessen. Die ersten beiden Wells wurden mit 5-10 μCi an ³⁶Cl^– beladen, gefolgt von einer schnellen Spülung mit Cl^–-freiem Medium. Dann wurden 1 ml-Aliquots von Isotop-freiem und Cl^–-freiem Medium plus 0,1 mM Amilorid zugegeben und bei einminütigen Intervallen für bis zu 10 min entfernt. Nach dem 3 Minuten-Zeitpunkt wurden 10 μM Forskolin zugegeben, um die cAMP-vermittelte Cl^–-Permeabilität auszuwerten. Am Ende der 10 Minuten wurde das Zell-assoziierte Isotop in 0,1 % SDS-Extrakt der Zellen gemessen. Die Daten wurden durch Auftrag des Prozentsatzes an verbliebenem ³⁶Cl^– als eine Funktion der Zeit analysiert. Siehe 6.
Transfektion unter Verwendung von ³⁶Cl^–-Insulin oder Choleratoxin
Unter Verwendung von 6 ml der Transfektionslösung, die 36 μg „Lipofectin" plus 380 μg Transferrin, 0,2 mg Insulin oder 160 μg Choleratoxin enthielt, zur Übertragung von 18 μg pCMVCFTR auf konfluente CFT1-Zellen in jedem Well einer 6 × 35 mm-Platte wurde eine signifikante Korrektur des gestörten Chlorid-Transports beobachtet (7). Bei einem gleichzeitig durchgeführten Experiment unter Anwendung des identischen Protokolls zur Übertragung von 18 μg pCMVIacZ auf CFT1-Zellen ergaben sich signifikante Zahlen an blau gefärbten Zellen, d.h. „Lipofectin", 0,5 %; „Lipofectin" + Transferrin, 33 %; „Lipofectin" + Insulin, 13 %; und „Lipofectin" + Choleratoxin, 31 %. Diese Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, die cAMP-abhängige Chloridleitfähigkeit in CF-Atemwegsepithelzellen unter Verwendung einer Wildtyp-CFTR-cDNA und der Transfektionsvektoren, zusammengesetzt aus Rezeptoren und einem kationischen Liposom, wiederherzustellen.
BEISPIEL 3. Liposom-vermittelte Transfektion, erleichtert durch Insulin und Choleratoxin.
Transfektionslösungen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, wobei der Rezeptorligand Insulin oder Choleratoxin war. 8a und 8b zeigen die Insulinkonzentrations-abhängige Transfektionsleistung in HeLa-Zellen bzw. CFT1-Zellen. 9a und 9b zeigen die Choleratoxinkonzentrations-abhängige Transfektionsleistung in HeLa-Zellen bzw. CFT1-Zellen. Die Transfektions-Protokolle wurden wie in Beispiel 1 für HeLa-Zellen und wie in Beispiel 2 für CFT1-Zellen durchgeführt.
Die Transfektionsleistung stieg nicht, wenn CFT1-Zellen mit einer Lösung transfiziert waren, die ein Gemisch aus den drei unterschiedlichen Liganden (Transferrin, Insulin und Choleratoxin) enthielt. Dies legt eine Behinderung der Gentransfektion eines Rezeptorliganden durch einen anderen nahe.
BEISPIEL 4: Komponenten von Humanserum, die den durch „Lipofectin" vermittelten Gentransfer erleichtern
Die Transferrin-Konzentration in Humanserum liegt um 2,2-3,7 mg/ml. Eine hohe Transfektionsleistung wurde durch die Verwendung von 5-10 μl Serum anstelle des Transferrin-Rezeptorliganden erwartet. Eine lediglich marginale Transfektionsleistung wurde jedoch beobachtet, was eine Behinderung der Transferrin-erleichterten Gentransfektion durch andere Humanserum-Komponenten nahe legt. Eine maximale Gentransferleistung wurde beobachtet, wenn 0,01 μl Serum anstelle von Transferrin im Protokoll des Beispiels 1 verwendet wurden (10).
Um verschiedene Serumkomponenten zu charakterisieren, die eine hohe Transfektionsleistung erbringen, wurde eine Humanserumprobe mittels einer Protein A-Säule in IgG-depletierte (Protein A: Durchlauf) und IgG-angereicherte (Protein A+: gebunden und rückgewonnen durch niedrigen pH) Fraktionen fraktioniert. Dieselbe Serumprobe wurde außerdem mittels einer Concanavalin A-Säule in eine Durchlauf- oder Con A-Fraktion fraktioniert, die Proteine und Mannose-freie Glycoproteine enthält, und die aus Con A rückgewonnene Fraktion, die Mannose-gebundene (Con A+) Gly coproteine enthält. Die Transfektionsleistungen der Protein A-Fraktionen sind in 11a und der Con A-Fraktionen in 11b gezeigt.
Die für die hohe Transfektionsleistung, die mit 0,01 μl Serum festgestellt wurde, verantwortliche(n) Komponente(n) scheint/en in Protein A– und Con A-Fraktionen vorhanden zu sein, jedoch nicht in den anderen beiden Fraktionen. Diese Ergebnisse zeigen, dass einige IgG's und Mannose-enthaltende Glycoproteine den „Lipofectin"vermittelten Gentransfer wirksam erleichtern können. Da die geringe Transfektionsleistung unter Verwendung einer Menge der Protein A-Fraktion festgestellt wurde, die 11-37 μg Transferrin enthielt (diese Konzentration von Transferrin sollte eine Transfektionsleistung von > 80% ergeben), sind die Serumkomponenten, die den Transferrin-erleichterten Gentransfer behindern, im Wesentlichen in der Protein A-Fraktion, doch nicht in der Con A+-Fraktion vorhanden.
Die Serumproben wurden ebenfalls entsprechend der Größe unter Verwendung von Zentrifugationsfiltern mit einer Molekulargewichts-Abscheidegrenze von 100 und 30 Kd fraktioniert. Wie in 12 gezeigt, scheint/en die Komponente(n), die für die hohe Transfektionsleistung verantwortlich ist/sind, wie mit 0,01 μl Serum erhalten, ein MG größer als 100 Kd aufzuweisen. Sowohl die 30-100 Kd- als auch die < 30 Kd-Fraktionen enthalten Verbindungen, die eine hohe Transfektionsleistung erbringen. Transferrin, das ein MG von 89 Kd aufweist, ist zumindest zum Teil für den hoch effizienten Gentransfer verantwortlich, den die 30-100 Kd-Fraktion erbringt. Außerdem waren Verbindungen, die den Tf-erleichterten Gentransfer behindern, in der > 100 Kd-Fraktion und ebenso in der < 30 Kd-Fraktion vorhanden.
TABELLE 1. Transferrin und Lipofectin-gelenkter Gentransfer zu HeLa-Zellen: Gentransferleistung als eine Funktion der Transfektionszeiten (0,5-24 Std.).
Ein ausführliches experimentelles Protokoll ist in den Beispielen beschrieben. Am Ende einer 48-stündigen Kulturperiode nach Transfektion mit dem Agens, das aus 16 μg Transferrin, 3 μg „Lipofectin" und 1,5 μg pCMVIacZ hergestellt war, wurden Lysate der Zellen in 3 Wells separat auf die β-Galactosidase-Aktivität mittels der Lumigal-Methode gemessen (Beale et al., 1992). Die β-Galactosidase-Aktivität wurde als Lichteinheiten (Mittelwert ± S.E.M.) pro μg Protein ausgedrückt. Die HeLa-Zellen in 3 anderen Wells wurden mit X-gal gefärbt und die % blaue Zellen gemessen.

* < 0,01 % blaue Zellen wurden gefunden, wenn die Zellen mit 1,5 μg DNA oder DNA plus 32 μg Transferrin behandelt waren.

TABELLE 2. Transferrin und Lipofectin-gelenkter Gentransfer zu HeLa-Zellen: Gentransferleistung als eine Funktion der Mengen (1-32 μg) an Transferrin.
Die Transfektionslösung (500 μl) enthielt 3 μg „Lipofectin", 1,5 μg pCMVIacZ und die angegebenen variierenden Mengen an Transferrin. Die Transfektionszeit war 18 Stunden. Das ausführliche experimentelle Protokoll ist in den Beispielen und Tabelle 1 beschrieben.

* Die Transfektionsleistung, die von Experiment zu Experiment variierte, betrug zwischen 55 und 100 %. Diese Variation ist möglicherweise den verschiedenen Chargen der Reagenzien zuzuschreiben.

TABELLE 3. Expression von β-Galactosidase in HeLa-Zellen, zu 100 % transfiziert mit Transferrin, Lipofectin und pCMVIacZ (F0) und in den transfizierten Zellen von sechs aufeinander folgenden Passagen (F1 bis F6).
Die Transfektionslösung enthielt 3,0 μg Lipofectin, 16 μg Transferrin und 1,5 μg DNA. Zellen, die mit „Lipofectin" plus DNA transfiziert, jedoch ohne Transferrin waren, dienten als der Kontrolle. Die Transfektionszeit war 18 Std. Das experimentelle Protokoll ist in den Beispielen und 1 beschrieben.
TABELLE 4. Transferrin-erhöhte pCMVIacZ-Transfektionsleistung in HeLa-Zellen unter Verwendung verschiedener kationischer Liposome
Ein ausführliches experimentelles Protokoll ist in Tabelle 1 und 1 beschrieben. Die Mengen an Transferrin und die verwendeten vier verschiedenen kationischen Liposome waren: Transferrin, 32 μg; „Lipofectin", 3 μg; „Lipofectace" 4,2 μg; „Lipofectamin" 4 μg; und DC-Cholesterol, 4 nmol.

Claims

Verfahren für den in vitro-intrazellulären Transport eines biologisch aktiven Moleküls, umfassend: (a) Kombinieren eines Zelloberflächen-Rezeptor-Liganden und eines kationischen Lipids zum Erhalt eines Gemischs, so dass der Ligand und das Lipid nicht-kovalent gebunden werden; (b) Zugeben zu dem Gemisch des biologisch aktiven Moleküls, so dass das Molekül mit dem Lipid assoziiert wird, und (c) Einbringen des Gemischs in eine Zelle.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend den Schritt des Inkubierens des Gemischs vor der Zugabe des biologisch aktiven Moleküls.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, außerdem umfassend den Schritt des Inkubierens des Gemischs vor der Einbringung des Gemischs in die Zelle.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das kationische Lipid N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethyl, Dimethyldioctadecylammoniumbromid, 2,3-Dioleyloxy-N-[2-(spermincarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminiumtrifluoracetat (DOSPA), DL-1,2-Dioleoyl-3-dimethylaminopropyl-B-hydroxyethylammonium, DL-1,2-O-Dioleyl-3-dimethylaminopropyl-B-hydroxyethylammonium, DL-1-O-Oleyl-2-oleyl-3-dimethylaminopropyl-B-hydroxyethylammonium, 1,2-Dimyristyloxypropanol-3,3-dimethylhydroxymethylammoniumbromid (DMRIE), DL-1,2-Dioleoyl-3-propyl-N,N,N-trimethylammonium oder N,N',N'',N'''-Tetrapalmitylspermin (TM-TPS) ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das kationische Lipid in einer liposomalen Formulierung mit einem neutralen Lipid, um eine kationische liposomale Formulierung zu bilden, vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das neutrale Lipid Dioleoylphosphatidylethanolamin ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die liposomale Formulierung eine Formulierung ist von: (i) N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-timethyl, 2,3-Dioleyloxy-N-[2(spermincarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminiumtrifluoracetat (DOSPA) oder N,N',N'',N'''-Tetrapalmitylspermin (TM-TPS); und (ii) Dioleoylphosphatidylethanolamin.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Formulierung 2,3-Dioleyloxy-N-[2(spermincarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminiumtrifluoracetat (DOSPA) und Dioleoylphosphatidylethanolamin aufweist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Zelloberflächen-Rezeptor-Ligand Transferrin, Insulin, Choleratoxin, Adenovirus-Faser-KNOB-Peptid oder ein Antikörper oder ein Antikörper-Fragment zu einem Rezeptor ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das biologisch aktive Molekül ein Polynukleotid, ein Peptid oder ein Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Polynukleotid eine Desoxyribonukleinsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Polynukleotid eine Ribonukleinsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Polynukleotid ein Genprodukt codiert.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Polynukleotid ein Gen umfasst, dessen Expression in der Zelle gewünscht wird.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das Gen ein Zystische Fibrose-Transmembran-Regulatorprotein codiert.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zelle eine tierische Zelle ist.
Verwendung eines Zelloberflächen-Rezeptor-Liganden, eines kationischen Lipids und eines biologisch aktiven Moleküls in der Herstellung eines Medikaments, wobei: (a) der Zelloberflächen-Rezeptor-Ligand und das kationische Lipid kombiniert werden, um ein Gemisch zu erhalten, so dass der Ligand und das Lipid nicht-kovalent gebunden werden; und (b) das biologisch aktive Molekül dem Gemisch zugegeben wird, so dass das Molekül mit dem Lipid assoziiert wird; wobei das Medikament zum in vivo-intrazellulären Transport eines biologisch aktiven Moleküls in eine Zelle ist.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei der intrazelluläre Transport für die Gentherapie ist.
Verwendung nach Anspruch 17 oder 18, wobei das kationische Lipid N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethyl, Dimethyldioctadecylammoniumbromid, 2,3-Dioleyloxy-N-[2-(spermincarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminiumtrifluoracetat (DOSPA), DL-1,2-Dioleoyl-3-dimethylaminopropyl-B-hydroxyethyl ammonium, DL-1,2-O-Dioleyl-3-dimethylaminopropyl-B-hydroxyethylammonium, DL-1-O-Oleyl-2-oleyl-3-dimethylaminopropyl-B-hydroxyethylammonium, 1,2-Dimyristyloxypropanol-3,3-dimethylhydroxymethylammoniumbromid (DMRIE), DL-1,2-Dioleoyl-3-propyl-N,N,N-trimethylammonium oder N,N',N'',N'''-Tetrapalmitylspermin (TM-TPS) ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei der Zelloberflächen-Rezeptor-Ligand Transferrin, Insulin, Choleratoxin, Adenovirus-Faser-KNOB-Peptid oder ein Antikörper oder ein Antikörper-Fragment zu einem Rezeptor ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei das biologisch aktive Molekül ein Polynukleotid, ein Peptid oder ein Protein ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 21, wobei das kationische Lipid in einer liposomalen Formulierung mit einem neutralen Lipid, um eine kationische liposomale Formulierung zu bilden, vorliegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 22, wobei das neutrale Lipid Dioleoylphosphatidylethanolamin ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 23, wobei die liposomale Formulierung ein Gemisch ist von: (i) N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethyl, 2,3-Dioleyloxy-N-[2(spermincarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminiumtrifluoracetat (DOSPA) oder N,N',N'',N'''-Tetrapalmitylspermin (TM-TPS); und (ii) Dioleoylphosphatidylethanolamin.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei das Polynukleotid ein Zystische Fibrose-Transmembran-Regulatorprotein codiert.
Verfahren zur Herstellung eines Medikaments für den intrazellulären Transport eines biologisch aktiven Moleküls in eine Zelle, welches Verfahren umfasst: (a) Kombinieren eines Zelloberflächen-Rezeptor-Liganden und eines kationischen Lipids zum Erhalt eines Gemischs, so dass der Ligand und das Lipid nicht-kovalent gebunden werden; (b) Zugeben zu dem Gemisch des biologisch aktiven Moleküls, so dass das Molekül mit dem Lipid assoziiert wird.