DE60026164T2

DE60026164T2 - Virale kernproteine-kationische lipid-nukleinsäure-verabreichungkomplexe

Info

Publication number: DE60026164T2
Application number: DE60026164T
Authority: DE
Inventors: ToshiakiMitsubishi-Tokyo Pharmaceuti TAGAWA; A. D.Imper. College Genetic Therapie South Kensington MILLER; E.Imperial College Genetic Therapies South Kensington PEROUZEL; KarlUniversity of California-Davis Davis MURRAY; MichelleDepartment of Gene Therapy MANVELL; EricDepartment of Gene Therapy ALTON; DavidUniversity of Leeds MATTHEWS; WillieSchool of Biomedical Sciences RUSSELL
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1999-12-23
Filing date: 2000-12-12
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2020-12-13
Also published as: ATE318322T1; JP2003518388A; EP1566445A3; PT1244805E; DK1244805T3; WO2001048233A1; AU781356B2; CZ298353B6; CZ20022193A3; CN1434870A; DE60026164D1; AU1871601A; EP1244805B1; GB9930533D0; CA2395454A1; UA77393C2; RU2002119560A; ES2258986T3; US20030153081A1; EP1566445A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft kationische Lipid/Protein/Nukleinsäure-Komplexe, die adenovirale Mu1-Verpackungsproteine umfassen, sowie deren Verwendung bei der effizienten Auslieferung von Nukleinsäuren an Zellen, wie etwa neuronale Zellen.
Hintergrund der Erfindung
Viel versprechende Fortschritte bei der nicht-viralen Genübertragung sind als Ergebnis der Produktion von mit kationischen Lipiden formulierten synthetischen Liposomen, die zum Transfizieren von Zellen befähigt sind, gemacht worden. Jedoch sind nur wenige dieser Komplexe auf ihre Fähigkeit hin untersucht worden, DNA effizient in ZNS-Zellen zu übertragen und die Expression eines Transgens zu erhalten. Die Fähigkeit, neuronale Zellen sicher und effizient zu transfizieren, könnte ein wirkungsvolles Werkzeug für die Aufklärung neuronaler Funktion bereitstellen und könnte zu neuen Behandlungen für neurologische Erkrankungen führen.
Unglücklicherweise ist die Gentherapie für das ZNS durch das Fehlen effizienter Mittel für das Transduzieren postmitotischer Neuronen behindert worden. Die meisten Studien haben virale Vektoren für die Genübertragung verwendet. Jedoch leiden viele virale Vektoren an Problemen der Immunität und der Zytotoxizität und sind für Nicht-Virologen nicht leicht manipulierbar bzw. handhabbar^1–3. Nicht-virale Vektoren treten nun als alternatives Verfahren der zellulären Transduktion hervor. Die meisten viel versprechenden Fortschritte bei dem nicht-viralen Gentransfer liegen bei der Produktion synthetischer Liposomen, die mit kationischen Lipiden (Cytofectinen) formuliert werden, und die zur Transfektion von Zellen befähigt sind. Solche kationischen Liposomen sind relativ leicht handhabbar, besitzen eine breite Anwendbarkeit und zeigen keine Zytotoxizität⁴.
Es werden fortlaufend neue kationische Liposomenformulierungen entwickelt⁵. Jedoch sind nur wenige dieser Komplexe auf ihre Fähigkeit hin untersucht worden, Zellen innerhalb des ZNS effizient zu transduzieren^6–9. Kationische Liposomen wirken über elektrostatische Interaktionen mit negativ geladener DNA und nachfolgend mit zellulären Membranen, wo sie durch einen Prozess der langsamen Endozytose durch die Zellmembran geschleust werden^6,10,11. Ihre Formulierung erfolgt oft unter Verwendung des neutralen Lipids Dioleoyl-L-α-Phosphatidylethanolamin (DOPE), das extrem effizient beim endosomalen Abpuffern und Aufbrechen ist^8,12. Über den perinukleären Raum transfiziertes genetisches Material wird aus dem Liposomen-Komplex freigesetzt, in den Kern transportiert und exprimiert. Zum heutigen Zeitpunkt ist nur für Liposomen, die aus N-[1-(2,3- Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA) und DOPE formuliert wurden, gezeigt worden, dass sie eine erfolgreiche Transfektion im ZNS vermitteln^13–16. Um für die Gentherapie nutzbar zu sein, werden Liposomen-Komplexe benötigt, die befähigt sind, ZNS-Zellen mit hoher Effizienz zu transfizieren.
Eine wesentliche Einschränkung bei dem nicht-viral vermittelten Gentransfer ist die Bildung großer aggregierter Moleküle bei der Erzeugung von Liposomen-DNA-Komplexen⁵. Diese großen Aggregate können die Effizienz der Transfektion verringern, möglicherweise durch eine Begrenzung der Endozytose der Komplexe. Ein Ansatz, dies zu umgehen, besteht in der Verringerung der Größe der DNA-Moleküle über DNA-Kondensation vor der Komplexbildung. Die Prä-Kondensation der DNA erzeugt kleinere Komplexe und eine verbesserte Effizienz der Transfektion^17–23. Es sind verschiedene Polykationen identifiziert worden, die wirksam dabei sind, Liposomen-vermittelte Transfektionen zu unterstützen. Von diesen haben poly-L-Lysin und Protamin die dramatischsten Ergebnisse erzeugt, was bei einer Vielzahl nicht-neuronaler Zelllinien Steigerungen von mehr als dem 30-fachen im Vergleich zu Komplexen ohne Prä-Kondensation ermöglichte^17,21.
Protaminsulfat ist besonders gut beim Steigern der Liposomen-Transfektion. Protamin ist ein natürlich vorkommendes Polykation, das sich im Kopf von Spermatozoen findet. Die Rolle von Protamin besteht darin, DNA im Spermium zu kondensieren und deren Transfer in den Zellkern des Eis zu unterstützen. Die Kernzielsteuerungseigenschaft von Protamin macht dieses besonders attraktiv für den Gentransfer. Außerdem, anders als das synthetische poly-L-Lysin, das ein Spektrum großer Molekulargewichte (18.000–19.200 Da) aufweist, ist Protamin natürlich vorkommend, kleiner und gleichförmiger in seiner Größe (4.000–4.250 Da). Diese Qualitäten bedeuten, dass es eine geringere Wahrscheinlichkeit für immunogene Antworten im Zielgewebe gibt, und dass die Kondensation leichter zu kontrollieren ist. Es sind auch andere natürlich vorkommende DNA-kondensierende Proteine verwendet worden, um den von kationischen Liposomen vermittelten DNA-Transfer zu steigern. Fritz et al.,²² erreichten etwa 30-fache Steigerungen der Lipofektion unter Verwendung eines rekombinanten humanen H1-Histonproteins, das ein Kernlokalisationssignal einbezieht (nls-H1). Auch für das nicht zu den Histonen gehörende chromosomale Hochmobilitäts-Gruppen-1,2-Protein ist gezeigt worden, dass es die Lipofektion verbessert, und es wird routinemäßig in dem HVJ-Liposom-Verfahren verwendet^20,24.
Zusammenfassung der Erfindung
Wir haben mit viraler DNA assoziierte Proteine auf ihre Fähigkeit hin getestet, auf Liposomen basierenden Gen-Transfer zu verbessern. Insbesondere haben wir das viral codierte synthetische Peptid Mu1 und das rekombinante Protein Vp1 des Adenovirus bzw. Polyomavirus verglichen. Mu1 könnte eine Rolle bei der adenoviralen Chromosomenkondensation spielen, während Vp1 das einzige Strukturprotein des Polyomavirus ist, das DNA-bindende Aktivität zeigt^25–27. Vp1, nicht jedoch Mu1, enthält ein eingebettetes klassisches Kernlokalisierungs-Signal (NLS), das ähnlich zu demjenigen ist, das sich in HMG-1,2 und nls-H1 findet²⁶. Wir haben herausgefunden, dass Mu1, nicht jedoch Vp1, in signifikanter Weise den durch kationische Liposomen vermittelten Gentransfer in Zellen verbessert, die aus dem Nervensystem und der Niere stammen. Wir haben außerdem herausgefunden, dass die Steigerung durch Mu1 bei differenzierten Zellen größer war, was die mögliche Nützlichkeit dieses Ansatzes für neuronale Zellen in vivo anzeigt.
Diese Entdeckungen besitzen Implikationen für experimentelle und therapeutische Verwendungen von Liposomen-vermittelter Auslieferung von DNA an ZNS-Zellen.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung einen nicht-viralen Nukleinsäure-Auslieferungsvektor bereit, der einen kondensierten Polypeptid/Nukleinsäure-Komplex und ein kationisches Lipid umfasst, wobei der Komplex folgendes aufweist:

(a) eine interessierende Nukleinsäuresequenz (NOI) und
(b) ein oder mehrere Adenovirus-Mu1-Polypeptide oder homologe Polypeptide mit wenigstens 60% Identität hierzu, wobei die Polypeptide oder deren Homologe (i) in der Lage sind, an die NOI zu binden, und (ii) in der Lage sind, die NOI zu kondensieren, und wobei die NOI heterolog zu dem einen oder den mehreren Polypeptiden ist.

Der Begriff „heterolog zu dem Polypeptid" bedeutet, dass virale NOIs, die natürlich in Kombination mit dem viralen Verpackungs-Polypeptid vorkommen, ausgeschlossen sind.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Vektor weiterhin ein Polypeptid, das eine Kernlokalisierungssequenz (NLS) enthält. Bevorzugter ist das Polypeptid, das eine Kernlokalisierungssequenz (NLS) enthält, Adenovirus-pV oder ein Derivat davon.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen kondensierten Polypeptid-/Nukleinsäure-Komplex bereit, welcher ein kationisches Lipid, eine Polypeptidkomponente und eine Nukleinsäurekomponente umfasst, zur Verwendung bei der Auslieferung der Nukleinsäurekomponente an einen Zellkern einer eukaryotischen Zelle, wobei

(i) die Polypeptidkomponente ein Adenovirus-Mu1-Polypeptid oder ein homologes Polypeptid mit wenigstens 60% Identität hierzu ist,
(ii) die Polypeptidkomponente oder deren Homologes in der Lage ist, an die NOI zu binden, und
(iii) die Polypeptidkomponente oder deren Homologes in der Lage ist, die NOI zu kondensieren,

Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Komplex weiterhin ein Polypeptid, das eine Kernlokalisierungssequenz (NLS) enthält. Bevorzugter ist das Polypeptid, das eine Kernlokalisierungssequenz (NLS) enthält, Adenovirus-pV oder ein Derivat davon.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Herstellen eines nicht-viralen Nukleinsäure-Auslieferungsvektors bereit, welcher ein kationisches Lipid und einen kondensierten Polypeptid-/Nukleinsäure-Komplex umfasst, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

(a) Inkontaktbringen einer interessierenden Nukleinsäuresequenz (NOI) mit einem adenoviralen Mu1-Polypeptid oder einem homologen Polypeptid mit wenigstens 60% Identität hierzu, wobei die Polypeptidkomponente oder deren Homologes (i) in der Lage sind, an die NOI zu binden, und (ii) in der Lage sind, die NOI zu kondensieren, und wobei die NOI heterolog zu dem Polypeptid ist, und
(b) Inkontaktbringen des so gebildeten Nukleinsäure-/Polypeptid-Komplexes mit einem kationischen Lipid.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Einführen einer interessierenden Nukleinsäuresequenz (NOI) in eine eukaryotische Zelle bereit, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der Zelle mit einem Komplex gemäß der Erfindung umfasst und wobei der Komplex die NOI umfasst. Bevorzugt ist die Zelle eine neuronale Zelle, eine Krebszelle oder eine Epithelzelle.
Bei einer alternativen Ausführungsform kann ein virales Nukleinsäure-Kernlokalisierungs-/Auslieferungs-Polypeptid zusätzlich zu einem Mu1-Adenovirus-Polypeptid verwendet werden. Tatsächlich kombinieren einige virale Polypeptide beide Funktionen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Obwohl die hier genannten Techniken im Allgemeinen wohlbekannt sind, kann insbesondere auf Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) und Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999), 4. Auflage, John Wiley & Sons, Inc. Bezug genommen werden.
A. Polypeptidkomponenten
1. Virale Nukleinsäureverpackungs-Polypeptide
Der Begriff „virale Nukleinsäureverpackungs-Polypeptide" beinhaltet typischerweise Polypeptide, die von viralen Genomen codiert werden, die natürlich in viralen Partikeln vorkommen, wo ihre Funktion darin besteht, zu verpacken, insbesondere zu kondensieren, und die Nukleinsäuren, die das virale Genom in dem Virion ausmachen, in den Zellkern auszuliefern.
Das virale Nukleinsäureverpackungs-Polypeptid zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung ist das Adenovirus-Mu1-Polypeptid, das unmittelbar im Folgenden als SEQ ID No. 1 dargestellt ist:
Ein Adenovirus-Mu1-Nukleinsäureverpackungs-Polypeptid zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung ist befähigt, an Nukleinsäuren zu binden, typischerweise in einer nicht-spezifischen Weise, bevorzugt unter Bewirken einer Kondensation der Nukleinsäure. Es ist allgemein bevorzugt, dass die kondensierte NOI eine Größe gleich oder kleiner 200 nm besitzt, so etwa von 50 bis 200 nm, für eine optimale Effizienz der Auslieferung an eine Zielzelle.
Die Fähigkeit der Adenovirus-Mu1-Polypeptid, an Nukleinsäuren zu binden, kann in vitro unter Verwendung von Techniken, wie etwa Gelelektrophorese, einschließlich Gelretardations-Assays (siehe Abschnitt Materialien und Methoden und Abschnitt Ergebnisse) und elektrophoretischen Band Shift-Mobilitäts-Assays, Ethidiumbromid-Ausschluss-Assays und Affinitäts-Chromatographie (z.B. unter Verwendung einzelsträngiger oder doppelsträngiger DNA-Cellulose) bestimmt werden.
Die Fähigkeit von Adenovirus-Mu1-Polypeptiden, Nukleinsäuren zu kondensieren, kann beispielsweise mittels zirkularer Dichroismus (CD)-Spektroskopie bestimmt werden (siehe z.B. Sato und Hosokawa, 1984, J. Biol. Chem. 95: 1031–1039).
Generell werden die Adenovirus-Mu1-Polypeptide oder Homologe hiervon mit wenigstens 60% Identität hierzu bei physiologischem pH (wie etwa pH 7,4) eine Anzahl positiv geladener Aminosäurereste umfassen. Bevorzugt ist die allgemeine Netto-Ladung an dem Adenovirus-Mu1-Polypeptid bei physiologischem pH positiv. Insbesondere ist es bevorzugt, dass das Ladung: Aminosäure-Verhältnis wenigstens +0,3, bevorzugt wenigstens +0,4, +0,5 oder +0,6 beträgt.
Es ist bevorzugt, dass die Adenovirus-Mu1-Polypeptide oder Homologe hiervon mit wenigstens 60% Identität hierzu eher Argininreste als Lysinreste oder ein Gemisch von beiden enthalten. Es ist außerdem besonders bevorzugt, dass die Adenovirus-Mu1-Polypeptide oder Homologe hiervon mit wenigstens 60% Identität hierzu ein oder mehrere Histidinreste enthalten, bevorzugt zwei oder mehr Histidinreste. Zusätzlich werden die Adenovirus-Mu1-Polypeptide oder Homologe hiervon mit wenigstens 60% Identität hierzu, typischerweise eine Anzahl hochgradig hydrophober Reste umfassen, wie etwa Alanin, beispielsweise zwei oder mehr hydrophobe Reste.
Es wird verständlich sein, dass die Aminosäuresequenzen zur Verwendung bei der Erfindung nicht auf die natürlich vorkommenden Adenovirus-Mu1-Nukleinsäureverpackungs-Polypeptide beschränkt sind, sondern auch homologe Sequenzen mit wenigstens 60% Identität hierzu beinhalten, diese erhalten aus einer beliebigen Quelle, z.B. verwandten viralen/bakteriellen Proteinen, zellulären Homologen und synthetischen Peptiden.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist eine homologe Sequenz so zu verstehen, dass sie eine Aminosäuresequenz beinhaltet, die auf der Aminosäureebene zu wenigstens 60, 70, 80 oder 90%, bevorzugt zu wenigstens 95 oder 98% identisch ist mit wenigstens 10, bevorzugt wenigstens 20, 30, 40 oder 50 Aminosäuren der Mu1-Sequenz, wie sie in der SEQ ID No. 1 gezeigt ist. Insbesondere sollte Homologie typischerweise eher im Hinblick auf diejenigen Regionen der Sequenz berücksichtigt werden, die für die Nukleinsäurebindung als essentiell bekannt sind als für nicht-essentielle benachbarte Sequenzen. Obwohl Homologie auch in Begriffen von Ähnlichkeit (d.h. Aminosäureresten mit ähnlichen chemischen Eigenschaften/Funktionen) betrachtet werden kann, ist es im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bevorzugt, Homologie in Begriffen von Sequenzidentität auszudrücken.
Homologievergleiche können mit dem Auge durchgeführt werden, oder, üblicherer Weise, mit Hilfe eines leicht verfügbaren Sequenzvergleichsprogramms. Diese kommerziell erhältlichen Computerprogramme können die % Homologie zwischen zwei oder mehr Sequenzen berechnen.
Die prozentuale Homologie kann über zusammenhängende Sequenzen berechnet werden, d.h. eine Sequenz wird einem Alignment mit der anderen Sequenz unterzogen, und jede Aminosäure in einer Sequenz wird direkt mit der korrespondieren Aminosäure in der anderen Sequenz verglichen, bei jeweils einem Rest zur gleichen Zeit. Dies wird als „lückenloses" Alignment bezeichnet. Typischerweise werden solche lückenlosen Alignments nur über eine relativ kurze Anzahl von Resten durchgeführt (z.B. weniger als 50 zusammenhängende Aminosäuren).
Obwohl dies ein sehr einfaches und konsistentes Verfahren ist, berücksichtigt es nicht, dass z.B. bei einem ansonsten identischen Sequenzpaar eine Insertion oder Deletion bewirken wird, dass die folgenden Aminosäurereste aus dem Alignment herausgenommen werden, was somit potentiell in einer großen Verringerung der prozentualen Homologie resultiert, wenn ein allgemeines Alignment durchgeführt wird. Demzufolge sind die meisten Sequenzvergleichsverfahren so gestaltet, dass sie optimale Alignments produzieren, die mögliche Insertionen und Deletionen berücksichtigen, ohne dabei das allgemeine Homologieergebnis unnötig zu belasten. Dies wird erreicht, indem man „Lücken" in das Sequenz-Alignment einführt, um eine Maximierung der lokalen Homologie zu versuchen.
Jedoch ordnen diese komplexeren Verfahren jeder Lücke, die im Alignment auftritt, „Lückenstrafen" zu, sodass bei der gleichen Anzahl identischer Aminosäuren ein Sequenz-Alignment mit möglichst wenig Lücken – was eine höhere Verwandtschaft zwischen den zwei verglichenen Sequenzen widerspiegelt – ein höheres Ergebnis erzielen wird als ein Alignment mit vielen Lücken. Es werden typischerweise „affine Lückenkosten" verwendet, die für die Existenz einer Lücke relativ hohe Kosten veranschlagen, und eine kleinere Strafe für jeden nachfolgenden Rest in der Lücke. Dies ist das am weitesten verwendete System zur Bewertung von Lücken. Hohe Lückenstrafen werden natürlich optimierte Alignments mit weniger Lücken ergeben. Die meisten Alignmentprogramme erlauben es, dass die Lückenstrafen modifiziert werden. Jedoch ist es bevorzugt, die Default-Werte zu verwenden, wenn solche Software für Sequenzvergleiche verwendet wird. Wenn beispielsweise das GCG Wisconsin Bestfit Paket (siehe unten) verwendet wird, so ist die Default-Lückenstrafe bei Aminosäuresequenzen –12 für eine Lücke und –4 für jede Erweiterung.
Die Berechnung der maximalen prozentualen Homologie erfordert deshalb zunächst die Herstellung eines optimalen Alignments, das Lückenstrafen berücksichtigt. Ein geeignetes Computerprogramm zur Durchführung solcher Alignments ist das GCG Wisconsin Bestfit Paket (University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12: 387). Beispiele für andere Software, die Sequenzvergleiche durchführen kann, beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, das BLAST-Paket (siehe Ausubel et al., 1999 ibidem, Kapitel 18), FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 403–410) und die GENEWORKS-Reihe von Vergleichswerkzeugen. Sowohl BLAST als auch FASTA sind für die Offline- und Online-Suche verfügbar (siehe Ausubel et al., 1999 ibidem, Seiten 7–58 bis 7–60). Es ist jedoch bevorzugt, das GCG Bestfit-Programm zu verwenden.
Obwohl die endgültige prozentuale Homologie in Begriffen der Identität gemessen werden kann, basiert der Alignment-Prozess selbst typischerweise nicht auf einem Alles-oder-Nichts-Paarvergleich. Stattdessen wird allgemein eine skalierte Ähnlichkeitsergebnis-Matrix verwendet, die jedem paarweisen Vergleich auf Basis einer chemischen Ähnlichkeit oder einer evolutionären Distanz Ergebniswerte zuordnet. Ein Beispiel für eine solche üblicherweise verwendete Matrix ist die BLOSUM62-Matrix, die Default-Matrix für die Reihe der BLAST-Programme. Die GCG-Wisconsin-Programme verwenden generell entweder die allgemeinen Default-Werte oder eine Gebrauchs-Symbolvergleichstabelle, sofern geliefert (siehe Benutzerhandbuch für weitere Details). Es ist bevorzugt, die allgemeinen Default-Werte für das GCG-Paket zu verwenden, oder, im Falle anderer Software, die Default-Matrix, wie etwa BLOSUM62.
Sobald die Software ein optimales Alignment erstellt hat, ist es möglich, den %-Wert der Homologie, bevorzugt die prozentuale Sequenzidentität, zu berechnen. Die Software tut dies typischer Weise als Teil des Sequenzvergleichs und erzeugt ein numerisches Ergebnis.
Der Begriff „Derivat" im Bezug auf die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Adenovirus-pV-Aminosäuresequenzen beinhaltet jedwede Substitution, Variation, Modifikation, jedweden Austausch, jedwede Deletion oder Addition an bzw. von einer (oder mehreren) Aminosäuren aus oder an der Sequenz, vorausgesetzt, dass die resultierende Aminosäuresequenz Nukleinsäurebindungs- und Kondensationsaktivität besitzt, wobei sie bevorzugt wenigstens die gleiche Aktivität wie die unmodifizierten Polypeptide besitzt.
Adenovirus-Mu1-Polypeptide können für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung modifiziert werden. Typischerweise werden Modifikationen durchgeführt, die die Nukleinsäurebindungs- und Kondensationseigenschaften der Sequenz erhalten. Aminosäuresubstitutionen können z.B. aus 1, 2 oder 3 bis zu 10, 20 oder 30 Substitutionen bestehen, vorausgesetzt, dass die modifizierte Sequenz Nukleinsäurebindungs- und Kondensationseigenschaften beibehält. Aminosäuresubstitutionen können die Verwendung nicht natürlich vorkommender Analoga beinhalten, z.B. zur Erhöhung der Blutplasma-Halbwertszeit eines therapeutisch verabreichten Polypeptids.
Insbesondere kann es wünschenswert sein, Aminosäuresubstitutionen an einem natürlich vorkommenden Adenovirus-Mu1-Verpackungspolypeptid durchzuführen, um die positive Nettoladung bei physiologischem pH zu erhöhen. Positiv geladene Aminosäuren beinhalten Arginin, Lysin und Histidin. Arginin ist die am höchsten geladene der natürlich vorkommenden Aminosäuren und ist besonders bevorzugt.
Konservative Substitutionen können z.B. gemäß der obigen Tabelle durchgeführt werden. Aminosäuren im selben Block in der zweiten Spalte und bevorzugt in derselben Linie in der dritten Spalte können gegeneinander ausgetauscht werden.
Polypeptide zur Verwendung bei der Erfindung können durch rekombinante Mittel hergestellt werden, z.B. gemäß unten stehender Beschreibung. Sie können jedoch auch durch synthetische Ansätze unter Verwendung von Fachleuten wohlbekannten Techniken, wie etwa Festphasensynthese, hergestellt werden. Polypeptide zur Verwendung bei der Erfindung können auch als Fusionsproteine hergestellt werden, z.B. um die Extraktion und Reinigung zu unterstützen. Beispiele für Fusionsprotein-Partner beinhalten Glutathion-S-Transferase (GST), 6 × His, GAL4 (DNA-Bindungs- und/oder Transkriptionsaktivierungsdomäne) und β-Galactosidase. Es kann auch günstig sein, eine proteolytische Spaltstelle zwischen dem Fusionsproteinpartner und der Proteinsequenz von Interesse einzufügen, um eine Entfernung der Fusionsproteinsequenzen zu erlauben. Vorzugsweise wird der Fusionsproteinpartner die biologische Aktivität der interessierenden Proteinsequenz nicht behindern.
Polypeptide zur Verwendung bei der Erfindung können in einer weitgehend isolierten Form vorliegen. Es versteht sich, dass die Polypeptide mit Trägern oder Verdünnungsmitteln gemischt werden können, die sich nicht störend auf den beabsichtigten Zweck der Polypeptide auswirken, und dabei nach wie vor als weitgehend isoliert betrachtet werden. Die Polypeptide können auch in einer weitgehend gereinigten Form vorliegen, wobei in diesem Fall allgemein mehr als 90%, z.B. 95%, 98% oder 99% des Proteins in der Präparation Polypeptide zur Verwendung bei der Erfindung beinhaltet.
2. Polypeptide mit Kernlokalisierungssequenzen
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Auslieferungsvektor/-Komplex der Erfindung weiterhin ein Polypeptid mit einer Kernlokalisierungssequenz (NLS). Allgemein sind NLSs in der Technik wohlbekannt (siehe z.B. Dingwall und Laskey, 1991, Trends Biochem. Sci.: 16: 478–481). Es ist jedoch besonders bevorzugt, die NLS des Adenovirus-Kernproteins pV zu verwenden. Die NLS von pV besitzt die Sequenz RPRRRATTRRRTTTGTRRRRRRR (SEQ ID NO. 2), die den Aminosäuren 315–337 entspricht (D. Matthews, vorgelegt). Eine weitere NLS befindet sich am N-Terminus (KPRKLKRVKKKKK – SEQ ID NO. 3), obwohl die C-terminale NLS bevorzugt ist.
Die NLS kann an einem separaten Polypeptidmolekül an dem Verpackungspolypeptid oder als Teil derselben Polypeptidkette, z.B. in einem Fusionsprotein, vorliegen.
B. Nukleinsäuresequenzen von Interesse
Interessierende Nukleinsäuresequenzen (NOIs), die unter Verwendung des Auslieferungsvektors oder -Komplexes der Erfindung an Zellen ausgeliefert werden sollen, können DNA oder RNA umfassen. Sie können einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Sie können auch Polynukleotide sein, die synthetische oder modifizierte Nukleotide in sich enthalten. Es ist eine Anzahl verschiedener Typen von Modifikation an Oligonukleotiden in der Technik bekannt. Diese beinhalten Methylphosphonat- und Phosphorthioat-Rückgrate, die Anfügung von Acridin oder Polylysinketten am 3'- und/oder 5'-Ende des Moleküls. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung versteht es sich, dass die hier beschriebenen Polynukleotide mittels jedweden in der Technik verfügbaren Verfahrens modifiziert werden können. Derartige Modifikationen können durchgeführt werden, um die in vivo-Aktivität oder Lebensspanne der NOIs zu erhöhen.
Die NOIs umfassen typischerweise ein heterologes Gen. Der Begriff „heterologes Gen" umfasst jedes beliebige Gen. Das heterologe Gen kann jedwede allelische Variante eines Wildtypgens sein, oder es kann ein mutantes Gen sein. Der Begriff „Gen" soll Nukleinsäuresequenzen abdecken, die befähigt sind, zumindest transkribiert zu werden. Somit werden Sequenzen, die für mRNA, tRNA und rRNA codieren, ebenso wie Antisense-Konstrukte in diese Definition einbezogen. Nukleinsäuren können z.B. Ribonukleinsäuren (RNA) oder Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder Analoga hiervon sein. Sequenzen, die für mRNA codieren, können optional etwas oder alles der 5'- und/oder 3'-transkribierten, jedoch untranslatierten flankierenden Sequenzen, in natürlicher oder anderer Weise assoziiert mit der translatierten codierenden Sequenz, beinhalten. Sie kann optional weiterhin die assoziierten transkriptionellen Kontrollsequenzen beinhalten, die normalerweise mit den transkribierten Sequenzen assoziiert sind, z.B. transkriptionelle Stopp-Signale, Polyadenylierungsstellen und stromabwärtige Enhancer-Elemente.
Die transkribierte Sequenz des heterologen Gens ist vorzugsweise funktionsfähig mit einer Kontrollsequenz verbunden, die die Expression des heterologen Gens in Säugerzellen erlaubt, bevorzugt in neuronalen Zellen, wie etwa Zellen des zentralen und peripheren Nervensystems, Krebs- oder Epithelzellen. Der Begriff „funktionsfähig verbunden" bezieht sich auf eine benachbarte Anordnung, bei der die beschriebenen Komponenten in einer Beziehung zueinander stehen, die es ihnen erlaubt, in ihrer beabsichtigten Weise zu funktionieren. Eine mit einer codierenden Sequenz „funktionsfähig verbundene" Kontrollsequenz wird in einer solchen Weise anligiert, dass die Expression der codierenden Sequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit der Kontrollsequenz kompatibel sind.
Die Kontrollsequenz umfasst einen Promotor, der die Expression des heterologen Gens ermöglicht, sowie ein Signal für die Beendigung der Transkription. Der Promotor ist aus Promotoren ausgewählt, die in Säugerzellen, bevorzugt in humanen Zellen, funktionell sind. Der Promotor kann von Promotorsequenzen eukaryotischer Gene abgeleitet sein. Beispielsweise kann es ein Promotor sein, der aus dem Genom einer Zelle abgeleitet wird, in der die Expression des heterologen Gens erfolgen soll, bevorzugt einer Zelle des zentralen oder peripheren Nervensystems eines Säugers. Im Hinblick auf eukaryotische Promotoren können dies Promotoren sein, die in einer ubiquitären Weise funktionieren (wie etwa Promotoren von β-Actin, Tubulin), oder, alternativ, die in einer gewebespezifischen Weise funktionieren (wie etwa Promotoren der Gene für Pyruvat-Kinase). Es können auch Promotoren sein, die auf spezifische Stimuli reagieren, z.B. Promotoren, die Steroidhormon-Rezeptoren binden. Es können außerdem virale Promotoren verwendet werden, z.B. der Promotor aus der langen terminalen Wiederholungssequenz des murinen Moloney Leukämievirus (MMLVLTR) oder Promotoren von Herpesvirus-Genen.
Es kann auch vorteilhaft für die Promotoren sein, induzierbar zu sein, sodass die Expressionsniveaus des heterologen Gens während der Lebensdauer der Zelle reguliert werden können. Induzierbar bedeutet, dass die unter Verwendung des Promotors erhaltenen Expressionsniveaus reguliert werden können.
Zusätzlich kann jeder dieser Promotoren durch die Anfügung weiterer regulatorischer Sequenzen, z.B. von Enhancer-Sequenzen, modifiziert werden. Es können auch chimäre Promotoren verwendet werden, die Sequenzelemente von zwei oder mehr der oben beschriebenen Promotoren beinhalten. Weiterhin kann die Verwendung von Locus-Kontrollregionen (LCRs) wünschenswert sein.
Das heterologe Gen wird typischerweise für ein Polypeptid von therapeutischem Nutzen codieren. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung beinhalten geeignete NOI-Sequenzen diejenigen, die von therapeutischer und/oder diagnostischer Anwendung sind, wie etwa, ohne hierauf beschränkt zu sein: Sequenzen, die codieren für Zytokine, Chemokine, Hormone, Antikörper, künstlich hergestellte Immunglobulin-artige Moleküle, einen Einzelkettenantikörper, Fusionsproteine, Enzyme, co-stimulierende Immunmoleküle, immunmodulatorische Moleküle, antisense-RNA, eine transdominant negative Mutante eines Zielproteins, ein Toxin, ein konditionelles Toxin, ein Antigen, ein Tumorsuppressor-Protein und Wachstumsfaktoren, Membranproteine, vasoaktive Proteine und Peptide, antivirale Proteine und Ribozyme und Derivate hiervon (wie etwa mit einer assoziierten Reportergruppe).
Beispiele für Polypeptide von therapeutischem Nutzen beinhalten neurotrophe Faktoren, wie etwa Nervenwachstumsfaktor (NGF), ciliären neurotrophen Faktor (CNTF), Gehirn-abgeleiteten neurotrophen Faktor (BNTF) und Neurotrophine (wie etwa NT-3, NT-4/5), die Potential als therapeutische Mittel für die Behandlung neurologischer Störungen, wie etwa der Parkinson-Krankheit, besitzen.
Geeignete NOIs für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Krebs beinhalten NOIs, die für Proteine codieren, die: die Zielzelle zerstören (z.B. ein ribosomales Toxin); die wirken als: Tumor-Suppressoren (wie etwa Wildtyp-p53); Aktivatoren von Anti-Tumor-Immunmechanismen (wie etwa Zytokine, co-stimulierende Moleküle und Immunglobuline); Inhibitoren der Angiogenese; oder die eine erhöhte Arzneimittel-Empfindlichkeit bewirken (wie etwa Aktivierungsenzyme für Pro-Wirkstoffe); die indirekt die Zerstörung einer Zielzelle durch natürliche Effektorzellen stimulieren (z.B. ein starkes Antigen zum Stimulieren des Immunsystems oder zum Umsetzen einer Vorläufersubstanz zu einer toxischen Substanz, die die Zielzelle zerstört (z.B. ein Prowirkstoff-aktivierendes Enzym)). Die codierten Proteine können auch „Bystander"-Tumorzellen zerstören (z.B. mit sekretiertem Antitumorantikörper-ribosomales Toxin-Fusionsprotein), die Zerstörung von Bystander-Tumorzellen indirekt stimulieren (z.B. durch Zytokine, die das Immunsystem stimulieren oder prokoagulierende Proteine, die lokale Gefäßverschlüsse verursachen) oder eine Vorläufersubstanz zu einer toxischen Substanz umsetzen, die in Nachbarschaft befindliche Tumorzellen zerstört (z.B. ein Enzym, das einen Prowirkstoff zu einem diffundierbaren Wirkstoff aktiviert).
Es können NOIs verwendet werden, die für Antisense-Transkripte oder Ribozyme codieren, die in die Expression zellulärer oder pathogener Gene eingreifen, z.B. mit der Expression zellulärer Gene für Tumor-Persistenz (z.B. gegen fehlerhafte myc-Transkripte beim Burkitt-Lymphom oder gegen bcr-abl-Transkripte bei chronischer myeloider Leukämie). Die Verwendung von Kombinationen solcher NOIs wird auch ins Auge gefasst.
Anstelle von oder ebenso wie die selektive Expression in Zielgeweben kann/können die NOI oder NOIs für ein Prowirkstoff-Aktivierungsenzym oder -Enzyme codieren, die keinen signifikanten Effekt oder keinen schädlichen Effekt haben, bis das Individuum mit einem oder mehreren Prowirkstoffen behandelt wird, auf die das Enzym bzw. die Enzyme einwirkt/einwirken. In Gegenwart der aktiven NOI führt die Behandlung eines Individuums mit dem geeigneten Prowirkstoff zu einer gesteigerten Reduzierung des Tumorwachstums oder Tumorüberlebens.
Ein Prowirkstoff-Aktivierungsenzym kann für die Behandlung eines Krebses an eine Tumorstelle ausgeliefert werden. In jedem Fall wird ein geeigneter Pro-Wirkstoff für die Behandlung des Patienten in Kombination mit dem geeigneten Prowirkstoff-Aktivierungsenzym verwendet. Ein geeigneter Prowirkstoff wird in Verbindung mit dem Vektor verabreicht. Beispiele für Prowirkstoffe beinhalten: Etoposid-Phosphat (mit alkalischer Phosphatase); 5-Fluorcytosin (mit Cytosin-Deaminase); Doxorubicin-N-p-hydroxyphenoxyacetamid (mit Penicillin-V-Amidase); para-N-bis(2-Chlorethyl)aminobenzoyl-Glutamat (mit Carboxypeptidase G2); Cephalosporin-Stickstoff-Senf-Carbamate (mit β-Lactamase); SR4233 (mit P450 Reduktase); Ganciclovir (mit HSV-Thymidinkinase); Senf-Prowirkstoffe mit Nitroreduktase und Cyclophosphamid (mit P450).
Beispiele geeigneter Prowirkstoff-Aktivierungsenzyme zur Verwendung bei der Erfindung beinhalten eine Thymidin-Phosphorylase, die die 5-Fluoruracil-Prowirkstoffe Capcetabin und Furtulon aktiviert; Thymidinkinase aus Herpes simplex-Virus, die Ganciclovir aktiviert; ein Cytochrom P450, das einen Prowirkstoff, wie etwa Cyclophosphamid, zu einem DNA-schädigenden Mittel aktiviert; und Cytosin-Deaminase, die 5-Fluorcytosin aktiviert. Bevorzugt wird ein Enzym menschlichen Ursprungs verwendet.
NOIs können auch antigene Polypeptide zur Verwendung als Impfstoffe codieren. Bevorzugt stammen solche antigenen Polypeptide aus pathogenen Organismen, z.B. aus Bakterien oder Viren. Beispiele für solche antigenen Polypeptide beinhalten Hepatitis C Virus-Antigene, Hepatitis B Oberflächen- oder Kern-Antigene, HIV-Antigene, Keuchhusten-Toxin, Cholera-Toxin oder Diphtherie-Toxin.
NOIs können auch Markergene beinhalten (z.B. codierend für β-Galactosidase oder grünes Fluoreszenzprotein) oder Gene, deren Produkte die Expression anderer Gene regulieren (z.B. Transkriptions-Regulationsfaktoren).
Da, wo eine Krankheit durch ein defektes Gen verursacht wird, können NOIs verabreicht werden, die für ein vollständig funktionelles Allel des Gens codieren, wie etwa im Fall von cystischer Fibrose. Die molekulare Basis für eine Vielzahl genetischer Störungen ist identifiziert worden, und wildtypische funktionelle Sequenzen sind kloniert worden. Es kann wünschenswert sein, in die NOI flankierende Sequenzen im Bezug auf das therapeutische Gen einzubeziehen, die homolog zu den korrespondierenden flankierenden Sequenzen im Genom sind, um den Ersatz des defekten Gens durch homologe Rekombination zu erlauben.
Gentherapie und andere therapeutische Anwendungen können durchaus die Verabreichung multipler Gene erforderlich machen. Die Expression multipler Gene kann für die Behandlung einer Vielzahl von Zuständen vorteilhaft sein. Da es keine Begrenzung bei der Größe der NOI gibt, die in einen Auslieferungs-Vektor oder Komplex der Erfindung eingebaut werden kann, sollte es möglich sein, gleichzeitig mehrere Gene auf die Zielzellen abzuzielen.
C. Kationische Lipide
Es ist eine Vielzahl kationischer Lipide in der Technik bekannt – siehe z.B. WO 95/02698, deren Offenbarungsgehalt hier durch Referenz in Bezug genommen wird, wovon einiges unten reproduziert wird. Beispielstrukturen kationischer Lipide, die für diese Erfindung nützlich sind, werden in der Tabelle 1 der WO 95/02698 bereitgestellt. Generell kann jedwedes kationische Lipid, entweder einwertig oder mehrwertig, in den Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung verwendet werden. Mehrwertige kationische Lipide sind allgemein bevorzugt. Kationische Lipide beinhalten gesättigte und ungesättigte Alkyl- und alicyclische Ether und Ester von Aminen, Amiden oder Derivate hiervon. Geradkettige und verzweigte Alkyl- und Alkengruppen von kationischen Lipiden können 1 bis etwa 25 Kohlenstoffatome enthalten. Bevorzugte geradkettige oder verzweigte Alkyl- oder Alkengruppen besitzen sechs oder mehr Kohlenstoffatome. Alicyclische Gruppen können von etwa 6 bis 30 Kohlenstoffatome enthalten. Bevorzugte alicyclische Gruppen beinhalten Cholesterol und andere Steroidgruppen. Kationische Lipide können mit einer Vielzahl von Gegenionen (Anionen) hergestellt werden, einschließlich u.a.: Chlorid, Bromid, Iodid, Fluorid, Acetat, Trifluoracetat, Sulfat, Nitrit und Nitrat.
Ein wohlbekanntes kationisches Lipid ist N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA).
DOTMA und der analoge Diester DOTAP (1,2-Bis-(oleoyloxy)-3(trimethylammonium)propan) sind kommerziell erhältlich. Zusätzliche kationische Lipide, die DOTMA strukturell verwandt sind, sind beschrieben im US-Patent 4,897,355, das hier durch Referenz in Bezug genommen ist.
Eine weitere nützliche Gruppe kationischer Lipide, die mit DOTMA und DOTAP verwandt sind, werden gewöhnlich als DORI-Ether oder DORI-Ester bezeichnet. DORI-Lipide unterscheiden sich von DOTMA und DOTAP dadurch, dass eine der Methylgruppen der Trimethylammoniumgruppe durch eine Hydroxyethyl-Gruppe ersetzt ist. Die Oleoyl-Gruppen der DORI-Lipide können durch andere Alkyl- oder Alkengruppen, wie etwa durch Palmitoyl- oder Stearoyl-Gruppen, ersetzt werden. Die Hydroxylgruppe der DORI-Typ-Lipide kann als Stelle für weitere Funktionalisierung verwendet werden, z.B. zur Veresterung an Amine, wie etwa Carboxyspermin.
Weitere kationische Lipide, die in den Auslieferungsvektoren oder -Komplexen dieser Erfindung verwendet werden können, beinhalten diejenigen, die in der WO 91/15501 als nützlich für die Transfektion von Zellen beschrieben sind.
Kationische Sterolderivate, wie etwa 3β-[N(N',N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterol (DC-Chol), bei denen Cholesterol mit einer Trialkylammoniumgruppe verbunden ist, können ebenfalls bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Von DC-Chol wird berichtet, dass es für einige Zelllinien eine effizientere Transfektion und geringere Toxizität als die DOTMA-enthaltenden Liposomen bereitstellt. DC-Chol-Polyamin-Varianten, wie etwa die in der WO 97/45442 beschriebenen, können ebenfalls verwendet werden.
Polykationische Lipide, die Carboxyspermin enthalten, sind ebenfalls nützlich in den Auslieferungsvektoren oder Komplexen dieser Erfindung. Die EP-A-304111 beschreibt Carboxyspermin enthaltende kationische Lipide, einschließlich 5-Carboxyspermylglycin-Dioctadecylamid (DOGS) und Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-5-carboxyspermylamid (DPPES). Zusätzliche kationische Lipide können erhalten werden, indem man die Octadecyl- und Palmitoyl-Gruppen von DOGS bzw. DPPES durch andere Alkyl- oder Alkengruppen ersetzt.
Bei den Auslieferungsvektoren oder Komplexen der Erfindung können kationische Lipide optional mit nicht-kationischen Co-Lipiden kombiniert werden, bevorzugt mit neutralen Lipiden, um Liposomen oder Lipidaggregate auszubilden. Für diese Erfindung nützliche neutrale Lipide beinhalten, unter vielen anderen: Lecithine; Phosphatidylethanolamine, wie etwa DOPE (Dioleoylphosphatidylethanolamin), POPE (Palmitoyloleoylphosphatidylethanolamin) und DSPE (Distearoylphosphatidylethanolamin); Phosphatidylcholin, Phosphatidylcholine, wie etwa DOPC (Dioleoylphosphatidylcholin), DPPC (Dipalmitoylphosphatidylcholin), POPC (Palmitoyloleoylphosphatidylcholin) und DSPC (Distearoylphosphatidylcholin); Phosphatidylglycerol; Phosphatidylglycerole, wie etwa DOPG (Dioleoylphosphatidylglycerol), DPPG (Dipalmitoylphosphatidylglycerol), und DSPG (Distearoylphosphatidylglycerol); Phosphatidylserine, wie etwa Dioleoyl- oder Dipalmitoylphospatidylserin; Diphosphatidylglycerole; Fettsäureester; Glycerolester; Sphingolipide; Cardolipin; Cerebroside; und Ceramide; und Gemische hiervon. Neutrale Lipide beinhalten auch Cholesterol und andere 3DOH-Sterole.
Darüber hinaus können bei den Auslieferungsvektoren oder Komplexen der Erfindung eine oder mehrere amphiphile Verbindungen optional eingebaut werden, um deren Oberflächeneigenschaft zu modifizieren. Für diese Erfindung nützliche amphiphile Verbindungen beinhalten, unter vielen anderen, Neoglycolipide, wie etwa GLU4 und GLU7, die in 22 gezeigt sind, Polyethylenglycol-Lipide, wie etwa N-(ω-Methoxy(polyoxyethylen)oxycarbonyl)-phosphatidylethanolamin, N-Monomethoxy(polyoxyethylen)succinylphosphatidylethanolamin und Polyoxyethylencholesterylether; nicht-ionische Detergentien, wie etwa Alkylglykoside, Alkyl-Methyl-glucamide, Sucroseester, Alkyl-Polyglycerolether, Alkylpolyoxyethylenether und Alkylsorbitanoxyethylenether und steroidale Oxyethylenether; Block-Copolymere, wie etwa Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Block-Copolymere.
Bei einem Aspekt wird das kationische Lipid der vorliegenden Erfindung mit einer Zuckergruppierung oder einer Polyethylenglykol-(PEG)-Gruppierung modifiziert. Bei einem weiteren Aspekt umfasst der Komplex der Erfindung weiterhin eine Verbindung, die befähigt ist, als kationisches Lipid zu wirken, wobei die Verbindung eine Cholesterolgruppe umfasst, die daran, über eine Amingruppe gebunden, eine Zuckergruppierung oder eine Polyethylenglykolgruppierung umfasst. Wie in den Beispielen demonstriert, haben wir herausgefunden, dass solche Zucker/PEG-modifizierten kationischen Lipide besonders vorteilhaft sind. Somit stellt die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt eine Verbindung bereit, die befähigt ist, als kationisches Lipid zu wirken, wobei die Verbindung eine Cholesterolgruppe umfasst, die daran, über eine Amingruppe angebunden, eine Zuckergruppierung oder eine Polyethylenglykolgruppierung umfasst. Bevorzugt umfasst die Verbindung 1 bis 7 Zuckergruppierungen oder eine Polyethylenglykolgruppierung. Die Verbindung kann ein Gemisch von Zuckergruppierungen und Polyethylenglykolgruppierungen umfassen. Bevorzugt ist die Zuckergruppierung Glucose oder D-Glukose oder ist davon abgeleitet.
D. Kationische Lipid/NOI/Verpackungspolypeptid-Komplexe
Ein Auslieferungsvektor/-Komplex der vorliegenden Erfindung wird typischerweise hergestellt, indem man zuerst ein Adenovirus-Mu1-Verpackungspolypeptid und eine NOI in einem sterilen Röhrchen für etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur in Kontakt bringt, was in einem kondensierten Polypeptid/NOI-Komplex resultiert. Es ist eine gebräuchliche Technik, die Nukleinsäure und das Protein nebeneinander in dem Röhrchen aufzutupfen, jedoch nicht in Kontakt, und das Mischen zu starten, indem man wenige hundert Mikroliter eines flüssigen Trägers, wie etwa eines pharmazeutisch verträglichen Trägers, Arzneiträgers oder Verdünnungsmittels zugibt.
Ein weiteres und bevorzugtes Verfahren zur Herstellung eines Auslieferungsvektors/-Komplexes der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Adenovirus-Mu1-Verpackungspolypeptid und eine NOI unter kontinuierlichem Vortexen in Kontakt zu bringen.
Typischerweise wird ein Verhältnis von NOI zu Polypeptid von wenigstens 1:1, bevorzugt von 1:1 bis 2:1, bevorzugter von 1,4:1 bis 1,9:1, bevorzugter von 1,5:1 bis 1,8:1 verwendet. Wir haben herausgefunden, dass ein Verhältnis von NOI zu Polypeptid von etwa 1:0,6 (~1,7:1) besonders effektiv ist. Bei einigen Aspekten wird typischerweise ein Verhältnis von Polypeptid zu NOI (w/w) von 0,2 bis 1,5, bevorzugt von 0,3 bis 1,2, bevorzugter von 0,5 bis 0,7 verwendet. Bei anderen Ausführungsformen beträgt das typische Verhältnis von Polypeptid zu NOI wenigstens 10:1 oder wenigstens 20:1 (w/w). Jedoch kann das optimale Verhältnis abhängen von dem Ladung:Aminosäure-Verhältnis des Adenovirus-Mu1-Verpackungspolypeptids. Allgemein, je niedriger das Ladung:Aminosäure-Verhältnis ist, umso höher ist das verwendete Polypeptid:NOI-Verhältnis.
Danach werden kationische Lipide zu dem Komplex hinzugegeben. Die kationischen Lipide können bei einer Ausführungsform Teil eines vorgeformten Liposoms sein, das zwei oder mehr Lipid-Bestandteile, wie etwa DC-Chol und DOPE, beinhaltet. Die kationischen Lipide werden typischerweise für etwa 20 Minuten bei Raumtemperatur mit dem Polypeptid/NOI-Komplex inkubiert. Ein weiteres und bevorzugtes Verfahren zum Zugeben kationischer Lipide ist in Form einer kationischen Liposomensuspension. Dieser endgültige Komplex kann unter Zugabe von 10% Sucrose (w/v) bei etwa –80°C bis zur Verwendung gelagert werden.
Die Menge an Liposom zu NOI liegt typischerweise im Bereich von 3:1 bis 20:1, bevorzugt von 6:1 bis 15:1, bevorzugter von 8:1 bis 14:1. Wir haben ein Verhältnis von Liposom zu NOI von 12:1 als besonders effektiv ermittelt. Bei anderen Ausführungsformen liegt die Menge von Liposom zu NOI typischerweise im Bereich von 2:1 bis 10:1 oder von 3:1 bis 6:1. Wenn kationische Lipide zusammen mit neutralen Lipiden verwendet werden, liegt das Verhältnis typischerweise in der Größenordnung von 1:1.
Bei einer hochgradig bevorzugten Ausführungsform beträgt das Verhältnis
Der Auslieferungsvektor/-Komplex ist nun einsatzbereit. Obwohl es bevorzugt ist, die verschiedenen Bestandteile in der oben beschriebenen Reihenfolge zu mischen, ist es möglich, die Komponenten in jeder Reihenfolge zu kombinieren. Wenn weitere Polypeptidkomponenten zugegeben werden sollen, können sie auf jeder Stufe zugegeben werden, jedoch bevorzugt zusammen mit dem Adenovirus-Mu1-Verpackungspolypeptid.
Es kann wünschenswert sein, andere Komponenten in die Vektoren/Komplexe einzubeziehen, z.B. Liganden, die an Zelloberflächenrezeptoren binden, um die Vektoren/Komplexe mit einem Ausmaß an Selektivität für den Zelltyp auszustatten. Liganden beinhalten Peptide, Glykoproteine, Oligosaccharide, Lektine und Antikörper und Fragmente hiervon.
E. Verabreichung
Der Auslieferungsvektor/-Komplex der Erfindung wird bevorzugt mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel kombiniert, um eine pharmazeutische Zusammensetzung herzustellen (die für den Gebrauch beim Menschen oder Tier sein kann). Geeignete Träger und Verdünnungsmittel beinhalten isotonische Salinelösungen, z.B. Phosphat-gepufferte Saline. Die Zusammensetzung der Erfindung kann durch direkte Injektion verabreicht werden. Die Zusammensetzung kann für die parenterale, intramuskuläre, intravenöse, subkutane, intraokulare oder transdermale Verabreichung oder Inhalation formuliert sein. Typischerweise kann jede NOI in einer Dosis von 10 ng bis 10 μg/kg Körpergewicht, bevorzugt von 0,1 bis 10 μg/kg, bevorzugter von 0,1 bis 1 μg/kg Körpergewicht verabreicht werden.
Alternativ kann die Transfektion von Patientenzellen ex vivo durchgeführt werden, indem man Patientengewebe entnimmt, unter Verwendung eines Auslieferungsvektors/-Komplexes der Erfindung transfiziert, gefolgt von der Reimplantation des transfizierten Gewebes.
Die beschriebenen Verabreichungsrouten und Dosierungen sind nur als Leitfaden gedacht, da ein begabter Anwender in der Lage sein wird, problemlos die optimale Verabreichungsroute und Dosierung für jedweden bestimmten Patienten und einen bestimmten Zustand zu bestimmen.
F. Verwendungen
Die Auslieferungsvektoren/-Komplexe der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um eukaryotische Zellen effizient mit NOIs zu transfizieren, insbesondere Säugerzellen. Es ist für die Auslieferungsvektoren/-Komplexe gezeigt worden, dass diese im Vergleich zu Zusammensetzungen aus dem Stand der Technik besonders effizient beim Transfizieren neuronaler Zellen sind. Dies hat spezifische Implikationen für (i) die Forschung, bei der neuronale Zellen verwendet werden und (ii) klinische Anwendungen, wo es erwünscht ist, NOIs in Zellen des zentralen oder peripheren Nervensystems eines Menschen oder Tiers einzuführen. Allgemeiner ausgedrückt, können die Auslieferungsvektoren/-Komplexe der vorliegenden Erfindung bei einer Vielzahl von NOI-Auslieferungsanwendungen verwendet werden, wie etwa bei der Gentherapie, der Übertragung von DNA-Impfungen und bei in vitro-Transfektionsstudien.
Beispiele für Erkrankungen, die unter Verwendung der Komplexe/Vektoren der Erfindung unter Zielsteuerung behandelt werden können, beinhalten Erkrankungen des peripheren oder zentralen Nervensystems, wie etwa neurodegenerative Erkrankungen und den Schaden am Nervengewebe als Ergebnis von Verletzung/Trauma (einschließlich Schlaganfällen). Insbesondere beinhalten neurodegenerative Erkrankungen die Erkrankung von Motor-Neuronen, mehrere erbliche Krankheiten, wie etwa familiäre Dysautonomie und Spinalmuskelatrophie des Kindesalters und spät einsetzende neurodegenerative Erkrankungen, wie etwa Parkinson- und Alzheimererkrankung.
Die Auslieferungsvektoren/-Komplexe der Erfindung können auch verwendet werden, um einem Patienten therapeutische Gene zu verabreichen, der an einer malignen Erkrankung leidet. Beispiele für maligne Erkrankungen, die zur Behandlung zielgerichtet angesteuert werden können, beinhalten den Krebs der Brust, des Cervix, Colons, Rektums, Endometriums, der Niere, Lunge, Eierstöcke, Pankreas, Prostata, Haut, des Magens, der Blase, des ZNS, Ösophagus, Kopfs oder Hals, der Leber, Hoden, des Thymus oder der Schilddrüse. Maligne Erkrankungen von Blutzellen, Knochenmarkzellen, B-Lymphozyten, T-Lymphozyten, Lymphozytenvorläufern oder myeloiden Zellvorläufern können ebenfalls zur Behandlung angesteuert werden.
Der Tumor kann ein solider Tumor oder ein nicht-solider Tumor sein und kann ein primärer Tumor oder ein gestreuter metastatischer (sekundärer) Tumor sein. Nicht-solide Tumoren beinhalten Myelome; Leukämien (akut oder chronisch, lymphozytär oder myelozytär), wie etwa akute myeloblastische, akute promyelozytäre, akute myelomonozytäre, akute monozytäre Leukämie oder Erythroleukämie; und Lymphome, wie etwa Hodgkins-, Nicht-Hodgkins- und Burkitts Lymphom. Solide Tumoren beinhalten Karzinome, Colonkarzinom, kleinzelliges Lungenkarzinom, nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom, Adenokarzinom, Melanom, Basalzell- oder Schuppenzellkarzinom, Mesotheliom, Adenokarzinom, Neuroblastom, Gliom, Astrozytom, Medulloblastom, Retinoblastom, Sarkome, Osteosarkom, Rhabdomyosarkom, Fibrosarkom, osteogenes Sarkom, Hepatom und Seminom.
Andere Erkrankungen von Interesse beinhalten Erkrankungen, die, erblich oder somatisch, durch Mutationen in normalen zellulären Genen verursacht werden, wie etwa zystische Fibrose, Thalassämien und dergleichen.
Weitere Gebiete von Interesse beinhalten die Behandlung von Erkrankungen mit Immunbezug, wie etwa Organtransplantatabstoßung und Autoimmunerkrankungen. Das Spektrum der Autoimmunerkrankungen reicht von organspezifischen Erkrankungen (wie etwa Thyroiditis, Insulitis, multiple Sklerose, Iridocyclitis, Uveitis, Orchitis, Hepatitis, Addison-Krankheit, Myasthenia gravis) bis hin zu systemischen Erkrankungen, wie etwa rheumatoider Arthritis und anderen rheumatischen Erkrankungen oder Lupus erythematodes. Andere Krankheiten beinhalten Immun-Hyperreaktivität, wie etwa allergische Reaktionen, insbesondere mit Histaminproduktion in Zusammenhang stehende Reaktionen, und Asthma.
Die vorliegende Erfindung wird nun mittels der folgenden Beispiele veranschaulicht, die rein erläuternd und nicht einschränkend sind.
Beschreibung der Figuren
1 zeigt eine Platte;
2 zeigt einen Graph;
3 zeigt eine Platte;
4 zeigt einen Graph;
5 zeigt einen Graph;
6 zeigt einen Graph;
7 zeigt einen Graph;
8 zeigt einen Graph;
9 zeigt Strukturen;
10 zeigt einen Graph;
11 zeigt einen Graph;
12 zeigt einen Graph;
13 zeigt einen Graph;
14 zeigt einen Graph;
15 zeigt einen Graph;
16 zeigt eine Platte;
17 zeigt einen Graph;
18 zeigt einen Graph;
19 zeigt eine Struktur;
20 zeigt ein Reaktionsschema;
21 zeigt ein Reaktionsschema;
22 zeigt Strukturen;
23 zeigt Prinzipien miscellaren Einbau;
24 zeigt einen Graph;
25 zeigt einen Graph.
Detaillierte Beschreibung der 1 bis 6
1 – Das Adenovirus-Kernprotein Mu1 ist effizienter beim Binden von Plasmid-DNA als das Polyomavirus-Kernprotein Vp1

A) BSA besitzt keine Wirkung auf die elektrophoretische Mobilität von pDNA. Ein Mikrogramm von pCMVβ wurde mit 0 μg (Spur 2), 5 μg (Spur 3), 10 μg (Spur 4), 15 μg (Spur 5), 20 μg (Spur 6), 25 μg (Spur 7) und 30 μg (Spur 8) an BSA für 10 Minuten bei Raumtemperatur in 1 × HBS inkubiert. Die Proben wurden dann auf einem 1% Agarosegel auf veränderte Mobilität hin untersucht. Es wurde keine Veränderung der elektrophoretischen Mobilität durch BSA detektiert.
B) Im Gegensatz zu BSA griff das Mu1-Peptid dramatisch in die Mobilität von pDNA ein. pCMVβ (1 μg) wurde mit 0,25 μg (Spur 2), 0,5 μg (Spur 3), 1 μg (Spur 4), 2 μg (Spur 5), 4 μg (Spur 6), 6 μg (Spur 7) und 0 μg (Spur 8) an rekombinantem Mu1-Peptid wie in A inkubiert. Während Protein-zu-pDNA-Verhältnisse von 0,25 (w/w) (Spur 2) die Migration der entspannten Form von pCMVβ (obere Bande) nicht veränderten, war bei pDNA mit Supercoiling eine geringfügige Verlangsamung zu sehen (untere Bande). Wenn Verhältnisse von 0,5 (w/w) oder größer verwendet wurden, wurde jedoch die Migration beider Formen von pDNA stark verlangsamt.
C) Das Polyomavirusprotein Vp1 war viel weniger wirksam beim Verhindern der pDNA-Migration. pCMVβ (1 μg) wurde mit 2 μg (Spur 2), 4 μg (Spur 3), 6 μg (Spur 4), 8 μg (Spur 5), 16 μg (Spur 6), 32 μg (Spur 7) und 0 μg (Spur 8) an Vp1 inkubiert. Nur Verhältnisse von 6 oder höher (Protein:pDNA, w/w) verursachten eine signifikante Verlangsamung von pDNA mit Supercoiling (Spur 6, untere Bande). Außerdem zeigte sich erst ab der Verwendung eines Verhältnisses von 32 (w/w) irgendein Effekt auf entspannte pDNA (Spur 7, obere Bande). Bei allen Gelen entspricht Spur 1 einem 1 kb-DNA-Marker (BRL).

2 – β-Galactosidase-Aktivität in ND7-Zellen, die mit pDNA-Mu1-kationischen Liposomenkomplexen transfiziert wurden
ND7-Zellen wurden 24 Stunden vor der Transfektion mit einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen/Well in 24 Well-Kulturschalen ausgesät. Unmittelbar vor der Transfektion wurden die Zellen in serumfreiem Medium gewaschen. Es wurden Komplexe gebildet, indem man pCMVβ vor der Zugabe des kationischen Liposoms aus DC-Chol/DOPE mit Mu1 inkubierte. In jedem Fall wurde 1 μg pCMVβ komplexiert, und zwar mit 0,6; 6; 12 und 21 μg Mu1-Peptid. Jede dieser Kombinationen wurde dann mit 3; 4 und 6 μg DC-Chol/DOPE komplexiert. ND7-Zellen wurden den Transfektionskomplexen für 2 Stunden ausgesetzt und dann für weitere 24 Stunden auf 37°C, 5% CO₂ gehalten, bevor sie geerntet und für den β-Galactosidase-Enzymassay weiterverarbeitet wurden. Die Zahlen repräsentieren die Mittelwerte ± Standardabweichung, n = 3.
3 – Mu1 steigert die Effizienz der durch kationische Liposomen vermittelten Transfektion bei der neuronalen Zelllinie ND7
ND7-Neuronen wurden mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/Well in 24 Well-Kulturschalen ausplattiert und für 24 Stunden wachsen gelassen. Die undifferenzierten ND7-Neuronen wurden dann entweder mit pCMVβ alleine (A), pCMVβ, komplexiert mit DC-Chol/DOPE (1/3, w/w) (B) oder mit pCMVβ, komplexiert mit Mu1 und DC-Chol/DOPE (1/12/6) (C) transfiziert. 48 Stunden später wurden die Zellen fixiert und für die histochemische Detektion von X-Gal weiterverarbeitet. Wie in Tafel C zu sehen ist, steigerte die Einbeziehung von Mu1 in den Komplex bei einem optimalen Verhältnis signifikant die Anzahl X-Gal positiver Zellen (blau).
4 – Mu1 ist wirksamer beim Steigern der durch kationische Liposomen vermittelten Transfektionen bei ND7-Zellen als Vp1
pCMVβ-Plasmid-DNA wurde mit verschiedenen Mengen an polykationischem Peptid komplexiert und dann mit kationischen Liposomen in einem Verhältnis von 1:3 (pCMVβ:Liposom; w/w) gemischt. Nachdem sie kurz mit serumfreiem Medium gewaschen worden waren, wurden die ND7-Zellen für zwei Stunden den Liposom-Polykation-Liposom-Komplexen ausgesetzt und dann wieder in serumhaltiges Medium überführt. 24 Stunden später wurden die Zellen geerntet und für den β-Galactosidase-Enzymtest weiterverarbeitet. Jede Bedingung wurde im Dreifachansatz durchgeführt, und jeder Versuch wurde dreimal wiederholt. Die Zahlen repräsentieren die Mittelwerte ± Standardabweichung.
5 – Mu1 steigert die DC-Chol/DOPE-Transfektion bei COS-7-Zellen
COS-Zellen wurden 24 Stunden vor der Transfektion mit einer Dichte von 60–80% Konfluenz in 24 Well-Kulturschalen ausgesät. Unmittelbar vor der Transfektion wurden die Zellen in serumfreiem Medium gewaschen. Die Inkubation von pCMVβ mit Mu1 vor der Zugabe der aus DC-Chol/DOPE bestehenden kationischen Liposomen bildete Komplexe, die zur zellulären Transfektion befähigt waren. In jedem der Fälle wurde 1 μg an pCMVβ mit 12 μg Mu1-Peptid komplexiert, was für ND7-Zellen als optimal ermittelt wurde. Die pCMVβ:Mu1-Komplexe wurden dann mit 3, 4 und 6 μg an DC-Chol/DOPE gemischt. COS-Zellen wurden den Transfektionskomplexen für 2 Stunden ausgesetzt und dann auf 37°C, 5% CO₂ für weitere 24 Stunden gehalten, bevor sie geerntet und für den β-Galactosidase-Enzymtest weiterverarbeitet wurden. Die Zahlen repräsentieren die Mittelwerte ± Standardabweichung, n = 3.
6 – Effizienz der Transfektion bei differenzierten ND7-Zellen mit pCMVβ-Mu1-kationischen Liposomenkomplexen
ND7-Zellen wurden mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen pro Well in normalem Wachstumsmedium (+ Serum) in einer 24 Well-Kulturplatte ausplattiert. 24 Stunden später wurde das Medium durch Differenzierungsmedium ersetzt, und die Zellen wurden für weitere 24 Stunden herangezüchtet. Es wurden drei verschiedene Differenzierungsmedien verwendet: serumfrei (– Serum), normales Wachstumsmedium plus 1 mM cAMP (cAMP) oder reduziertes Serum (0,5%) plus 1 mM cAMP und 50 ng/ml Nervenwachstumsfaktor (NGF). Die Zellen wurden dann transfiziert mit pCMVβ, komplexiert entweder mit DC-Chol/DOPE alleine oder mit Mu1 plus DC-Chol/DOPE. 48 Stunden später wurden die Zellen fixiert und für die X-Gal-Histochemie weiterverarbeitet, und der Prozentsatz positiver Zellen wurde bestimmt. In allen Fällen steigerte die Anwesenheit von Mu1 die Anzahl positiver Zellen. Interessanter Weise war die Anzahl der transfizierten Zellen sowohl mit als auch ohne Mu1 bei in cAMP gewachsenen Zellen größer.
BEISPIELE
Materialien und Methoden
Peptidsynthese
Die Peptide Vp1 und Mu1 wurden auf einem Shimadzu PSSM-8 Festphasen-Peptidsynthese-Gerät unter Verwendung eines fünffachen Überschusses an (9-Fluorenyl)methoxycarbonyl(Fmoc)-geschützten L-Aminosäuren (Novabiochem) und der FastMoc^TM-Reagenzien 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetra-methyluronium-hexafluorphosphat/Hydroxybenzotriazol (HBTU/HOBt) (Advanced Chemtech Europe) als Amidkopplungsmittel synthetisiert. Nach der Harzspaltung und Entschützung erfolgte das Entsalzen mittels Gelfiltration unter Verwendung einer Säule von P2 Biogel (2 × 28 cm; Biorad), diese angeschlossen an ein FPLC-System (Amersham Pharmacia Biotech UK), mit 0,1% wässriger TFA als Elutionsmittel bei einer Flussrate von 0,5–0,75 ml/min. Eine endgültige präparative Reversphasenreinigung wurde mit einer Vydac-Säule (C18, 5 μm, 2 × 25 cm; Hichrom), diese angeschlossen an ein Gilson HPLC-System (Anachem), erreicht. Die Peptide wurden mit 5 ml/min mittels eines linearen Gradienten von Acetonitril in 0,1% wässriger TFA eluiert, und die Elution wurde bei 220–230 nm überwacht.
Das Vp1-Peptid wurde unter Verwendung eines vorab geladenen L-Pro-2-Chlortrityl-Supersäure-labilen Harzes (Novabiochem) (100 mg, 1,05 mmol/g, 0,1 mmol) hergestellt. Es wurden ausgedehnte Kopplungszeiten verwendet, um alle Aminosäurereste, von den 6 (Lys) bis zu dem N-terminalen Rest, einzubauen. Nach der automatisierten N-terminalen Fmoc-Entschützung mit Piperidin (20%, v/v) in Dimethylformamid wurde das Harz isoliert, mit Dimethylformamid (10 ml) und Methanol (15 ml) gewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Die Abspaltung des Rohpeptids von dem Harz erfolgte unter Verwendung von eiskalter TFA (8 ml), enthaltend Phenol (7%, w/v), Ethandithiol (2%, v/v), Thioanisol (4%, v/v) und Wasser (4%, v/v) (bekannt als Gemisch A), wonach mit eiskaltem Methyl-tert-Butylether (MTBE) (30 ml) präzipitiert wurde. Das sich daraus ergebende Pellet wurde dann entsalzt, und das Rohpeptidgemisch wurde mittels Reversphasen-HPLC gereinigt. Nach der Elution wurden Fraktionen, die das gewünschte Peptid enthalten (Elution mit Acetonitril 68,5% v/v) vereint und lyophilisiert, um das Peptid als ein weißes Pulver zu ergeben. Gesamtausbeute: 32 mg (15 μmol, 15%); MS (MALDI-TOF) C₈₅H₁₅₁N₂₆O₂₆S₃: [M + H]⁺ berechnet 2049,5, gefunden 2050,2. Die Sequenz wurde durch Analyse der Aminosäurezusammensetzung und durch Sequenzanalyse bestätigt. Die Homogenität wurde mittels HPLC-Analyse mit > 95% bewertet.
Das Mu1-Peptid wurde unter Verwendung von Gly-Wang-Harz (Novabiochem) (40 mg, 0,67 mmol/g, 0,03 mmol) hergestellt. Es wurden dabei normale Kopplungszeiten verwendet. Nach der automatisierten N-terminalen Fmoc-Entschützung wie oben, wurde das Harz isoliert und mit Dichlormethan (20 ml) und Methanol (20 ml) gewaschen, wonach es im Vakuum getrocknet wurde. Das Rohpeptid wurde unter Verwendung von Gemisch A (8 ml) von dem Harz abgespalten und, genau wie oben, mit MTBE (30 ml) präzipitiert. Schließlich wurde das Rohpeptidgemisch entsalzt und mittels Reversphasen-HPLC gereinigt. Nach der Elution wurden die Fraktionen, die das gewünschte Peptid enthielten (Elution mit Acetonitril 17,2%), vereint und lyophilisiert, um das Peptid als weißes Pulver zu ergeben. Gesamtausbeute: 65 mg (26 μmol, 80%); MS (ES) C₉₅H₁₇₀N₅₂O₂₁S₂: [M + H]⁺ berechnet 2440,7; gefunden 2440,6. Die Homogenität wurde mittels HPLC-Analyse mit > 95% bewertet.
DNA-Bindungsanalyse
Die gereinigten Peptide wurden in sterilem destilliertem H₂O mit 3 mg/ml wiederhergestellt. Peptid und pDNA wurden in 20 μl HEPES-gepufferter Saline (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,75 mM Na₂HPO₄, 19 mM HEPES, pH 7,4) für 20 min bei Raumtemperatur komplexiert. Die Peptid:pDNA-Komplexe wurden nachfolgend durch Agarosegelelektrophorese (1%) analysiert. Es wurden Kontrollinkubationen für allgemeine makromolekulare pDNA-Interaktionen mit verschiedenen Mengen an gereinigtem Rinderserum-Albumin von molekularbiologischer Qualitätsstufe (Sigma) durchgeführt.
Zellkulturen
ND7-Zellen sind eine gut charakterisierte Zelllinie, die aus der Fusion eines Neuroblastoms (N18Tg2) mit neonatalen sensorischen Neuronen der Ratte stammt²⁸. Die Zelllinie wurde in normalem Wachstumsmedium (NGM) (Leibovitz L-15-Medium (BRL), angereichert mit 10% fetalem Rinderserum (BRL), 4 g/l an Glukose, 4 g/l an Natriumbicarbonat (BRL), 100 IU/ml an Penicillin/Streptomycin (BRL)) bei 37°C und 5% CO₂ gehalten. Die Zellen wurden mit einer Dichte, die nach 24 Stunden 70% Konfluenz ergab, auf 24-Well-Platten (Costar) ausplattiert.
Die Differenzierung der ND7-Zellen erfolgte unter Verwendung dreier zuvor beschriebener Verfahren^29,29. Die ND7-Zellen wurden mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen pro Well in NGM in einer 24-Well-Kulturschale (Nunc) inokuliert. 24 Stunden später wurde das Medium ersetzt, und zwar entweder durch a) NGM, supplementiert mit 1 mM Adenosin-3':5'-zyklischem Monophosphat (cAMP; Sigma), oder b) serumfreiem Differenzierungsmedium (50% Hams F12, 50% DMEM, 5 μg/ml Transferrin, 250 ng/ml Insulin, 0,3 μM Natriumselenit) oder c) Niedrigserum-Nervenwachstumsfaktor(NGF)-Medium L-15, supplementiert mit 2 mM Glutamin, 4 g/l Glucose, 4 g/l Natriumbicarbonat, 10 U/ml Penicillin, 10 U/ml Streptomycin, 0,5% FCS, 1 mM cAMP, 50 ng/ml NGF (Alomone Labs)). Differenzierte ND7-Zellen wurden vor der Transfektion für 24 Stunden bei 37°C, 5% CO₂ in geeignetem Medium herangezogen.
COS-7-Zellen (stammend aus der Niere der grünen Meerkatze) wurden in RPMI 1640 Medium (BRL), supplementiert mit 10% fetalem Rinderserum (BRL) und 100 IU/ml Penicillin/Streptomycin (BRL), herangezogen.
Plasmidkonstrukte
Alle Transfektionen verwendeten das Reporter-Plasmid pCMVβ (Clontech, Palo Alto, CA), das die Sequenz voller Länge für E. coli β-Galactosidase stromabwärts des sehr frühen humanen Cytomegalievirus Promotors/Enhancers (Clontech) enthielt. Stammansätze von Plasmid-DNA wurden unter Verwendung molekularer Standard-Klonierungstechniken hergestellt und unter Verwendung des Qiagen Endotoxin-freien Plasmidreinigungssystems (Qiagen, Dorking, UK) gereinigt.
Liposomen
DC-Chol/DOPE-Liposomen wurden hergestellt wie zuvor beschrieben^30,31. Kurz dargestellt, wurden 6 μmol an DC-Chol und 4 μmol an DOPE (bereitgestellt mit 10 mg/ml in CHCl₃) unter Stickstoff zu frisch destilliertem CH₂Cl₂ (5 ml) hinzugegeben. Es wurden 5 ml an 20 mM HEPES (pH 7,8) zu dem Gemisch hinzugegeben, und dieses wurde für 3 Minuten einer Ultraschallbehandlung unterzogen. Die organischen Lösungsmittel wurden unter reduziertem Druck entfernt, und die resultierende Liposomensuspension wurde dann für weitere 3 Minuten ultraschallbehandelt. Die Liposomen-Präparationen wurden bei 4°C gelagert.
Transfektionsprotokoll
Da anfängliche Experimente festgestellt haben, dass die Gegenwart von fetalem Rinderserum die Transfektion von ND7-Zellen hemmt, wurde für alle Transfektionen serumfreies Differenzierungsmedium verwendet. Verschiedene Mengen an DNA und Liposomen wurden in den Boden eines 7 ml fassenden sterilen Bijou-Behälters (Bibby Sterilin Ltd., Staftordshire, U.K.) gegeben, jedoch nicht in Kontakt miteinander.
Die Verbindung von DNA und Liposomen erfolgte durch die Zugabe von 400 μl serumfreiem Differenzierungsmedium und unter sanftem Schütteln. Das DNA/Liposomen-Gemisch wurde für 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bevor es zu den Zellen hinzugegeben wurde. Das DNA/Liposomen-Gemisch wurde dann auf die Zellen aufgebracht und für 2 Stunden bei 37°C, 5% CO₂ inkubiert, wonach dieses Medium durch Vollmedium ersetzt wurde. 24 bis 48 Stunden später wurden die Zellen fixiert und gemäß Beschreibung³¹ für die X-Gal-Histochemie weiterverarbeitet oder für den β-Galactosidase-Enzymassay (Promega Corp.) geerntet.
Die Zellzählungen erfolgten unter ×40-Vergrößerung unter Verwendung eines Nikon Diaphot Inversmikroskops. Jede Transfektion wurde wenigstens dreimal wiederholt, und es wurden wenigstens drei separate Zählungen für jedes Well durchgeführt.
Transfektionskomplexe unter Einbeziehung der Testpeptide wurden auf folgende Weise erzeugt. Verschiedene Mengen an Peptid wurden auf dem Boden steriler Polystyrolbehälter neben, nicht jedoch in Kontakt mit 1 μg pCMVβ angeordnet und durch die Zugabe von 400 μl serumfreiem NGM-Medium gemischt. Die Komplexe wurden bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert, wonach DC-Chol/DOPE hinzugegeben wurde. Der pDNA/Peptid/Liposom-Komplex wurde bei Raumtemperatur für 20 Minuten weiter inkubiert und dann wie oben auf Zellen aufgebracht.
Beispiel 1 – Vergleich der DNA-Bindungsfähigkeit von Mu1 und Vp1
Mu1 ist ein polykationisches Peptid, das aus 19 Aminosäuren zusammengesetzt und mit dem Kernkomplex des Adenovirus assoziiert ist (Tabelle 1)^27,32. Wir haben die DNA-Bindungsfähigkeit von Mu1 mit der des Maus-Polyomavirus Haupt-Capsid-Proteins Vp1 durch die Interaktion mit Plasmid-DNA in einem Gel-Retardations-Assay verglichen. Vp1 ist ein 19 Aminosäuren großes Peptid, das ein Kernlokalisierungssignal enthält²⁶ und weniger positiv geladene Aminosäuren als Mu1 beinhaltet. Es wurde daher vorhergesagt, dass es eine geringere Befähigung zur DNA-Bindung besitzt. Tabelle 1: Proteinsequenzen von Mu1 und Vp1
Die NLS-Sequenz in Vp1 ist unterstrichen
Variierende Mengen an gereinigtem Peptid wurden bei Raumtemperatur für etwa 10 Minuten in HBS inkubiert und dann durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Ohne die Zugabe von Peptid wanderten mit Supercoiling versehene und entspannte zirkuläre Plasmid-DNA (pDNA) in der erwarteten Weise (1, Spur 8).
Beginnend bei einem DNA:Mu1-Peptidverhältnis von 1:0,25 (w/w) wurde die Wanderung von Plasmid-DNA verlangsamt (1). Die Wanderung von Plasmid-DNA wurde bei einem Verhältnis von 1:0,25 (w/w) geringfügig beeinflusst, jedoch wurde die Wanderung von Plasmid-DNA bei einem Verhältnis von 1:0,5 (w/w) stark verlangsamt, und nur sehr wenig schaffte es, sich aus den Wells hinauszubewegen. Bei Verhältnissen von 2:1 und darüber war die pDNA nicht imstande, in das Agarosegel einzuwandern, und die Fähigkeit von Ethidiumbromid, in das Plasmid zu interkalieren, wurde reduziert. Im Gegensatz zu Mu1 wurde bei Vp1 bis zu pDNA:Protein-Verhältnissen von 1:8 (w/w) kein Effekt auf die elektrophoretische Mobilität von Plasmid-DNA detektiert (1). Die Zugabe von 8 μg Vp1 zu 1 μg Plasmid-DNA resultierte in einer Verbreiterung der Bande der Supercoil-pDNA. Es wurde jedoch bei Vp1 kein Effekt auf die entspannte pDNA-Bande beobachtet, bis ein Verhältnis von 1:32 (w/w) für pDNA:Protein verwendet wurde. Bei diesem Verhältnis wurden die Banden sowohl von Supercoil-pDNA als auch von entspannter pDNA signifikant retardiert, und es konnte etwas DNA als im Well zurückgehalten beobachtet werden. Es wurde keine Auswirkung auf die elektrophoretische Mobilität detektiert, wenn pDNA mit BSA in pDNA:Protein-Verhältnissen von bis zu 1:30 (w/w) inkubiert wurde (1).
Beispiel 2 – Vergleich der Befähigung von Mu1 und Vp1 zur Steigerung der Transfektion bei undifferenzierten ND7-Zellen
Wir untersuchten die Fähigkeit von Mu1 und Vp1 zur Steigerung der Transfektion einer neuronalen Zelllinie durch kationische Liposomen unter Verwendung eines β-Galactosidase-Reportergen-Assays. ND7-Zellen wurden mit pCMVβ transfiziert, das mit verschiedenen Mengen an Peptid und DC-Chol/DOPE komplexiert worden war. Wir haben zuvor gezeigt, dass das kationische Liposom DC-Chol/DOPE befähigt ist, die Zelllinie ND7 mit neuronaler Abstammung effizient zu transfizieren³¹. Bei dieser Studie haben wir herausgefunden, dass optimale Effizienzen (> 40%) bei dieser neuronal abstammenden Zelllinie erhalten wurden, wenn 1 μg Plasmid-DNA mit 3 μg DC-Chol/DOPE komplexiert wurde³¹. Temporär werden maximale Niveaus der Transgenexpression zwischen 48–60 Stunden nach der Transfektion erhalten. Daher, um die Wahrscheinlichkeit der Detektion von Verbesserungen der Transfektion zu maximieren, haben wir alle unsere Tests innerhalb von 12–20 Stunden der Transfektion zu einer Zeit durchgeführt, bei der die Niveaus der Reportergen-Expression niedriger waren. Zuvor hatten wir ein pDNA:Liposomen-Verhältnis von 1:3 (w/w) als optimal für die Transfektion bei den ND7-Zellen ermittelt³¹. Wir haben daher die Wirkung verschiedener Mengen an Peptid auf die Transfektionen bei pDNA:DC-Chol/DOPE-Verhältnissen von 1:3, 1:4 und 1:6 verglichen. Die Gel-Retardationsanalyse legte nahe, dass ein ungefähres Verhältnis von 1:0,5 (w/w) für pDNA:Mu1 hinreichend war, um weitestgehend die gesamte Plasmid-DNA zu binden (1). Jedoch führten anfängliche Versuche, die dieses Verhältnis und Liposomen verwendeten, nicht zu einer Beeinflussung der Transfektionseffizienzen (nicht gezeigt). Die Volumina, die verwendet wurden, um Transfektionskomplexe zu erzeugen, waren viel größer als diejenigen, die verwendet wurden, um den Gel-Retardations-Assay durchzuführen (400 μl gegenüber 20 μl). Daher haben wir größere Mengen an Mu1 getestet, die von ähnlicher Konzentration in Lösung waren, wie diejenige, die bei dem Gel-Retardations-Assay verwendet wurde. Wir verglichen die Wirkung, die 0,6, 6, 12 und 21 μg an Mu1-Peptid auf durch DC-Chol/DOPE vermittelte Transfektionen haben würden. Wir haben herausgefunden, dass Mu1 befähigt war, die durch kationische Liposomen vermittelten Transfektionseffizienzen mehr als 4-fach zu steigern. Die größte Verbesserung der Transfektionseffizienzen trat auf, wenn relative Verhältnisse von 1/12/6 für pCMVβ/Mu1/(DC-Chol/DOPE) (w/w/w) verwendet wurden. Diese Kombination führte zu einer 11-fachen Steigerung der Transfektionen im Vergleich zu DNA alleine (2).
Der β-Galactosidase-Reportergen-Assay lieferte ein Maß für das allgemeine Mengenniveau der produzierten β-Galactosidase, liefert jedoch keine Information hinsichtlich der Anzahl der transfizierten Zellen. Aus diesem Grund haben wir außerdem Zellzählungen an transfizierten ND7-Zellen durchgeführt. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 4 × 10⁴ in 24-Well-Kulturplatten inokuliert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen kurz in serumfreiem Medium gewaschen und mit pCMVβ, das mit DC-Chol/DOPE und Mu1-Peptid komplexiert worden war, transfiziert. Die verwendeten Verhältnisse waren diejenigen, die bei dem Reportergen-Assay als optimal ermittelt worden waren, 1:12:6 für pCMVβ:Mu1:DC-Chol/DOPE. Unter Verwendung dieser Verhältnisse fanden wir einen 6-fachen Anstieg der Anzahl β-Galactosidase-positiver Zellen (3 und 6). Es wurde bei allen verwendeten Konzentrationen kein offensichtlicher Zellverlust für den Mu1-Komplex detektiert. Entsprechend unterschied sich die Proteinkonzentration in den Zelllysaten, die für den β-Galactosidase-Reportergen-Assay verwendet wurden, nicht signifikant von der bei untransfizierten Zellen (Daten nicht gezeigt).
Im Gegensatz dazu konnte für Vp1 keine Verbesserung der Transfektionseffizienz ermittelt werden (4). Bei pCMVβ, das nur mit Mu1 alleine komplexiert war, wurde keine Verbesserung der Transfektionseffizienzen gegenüber nackter DNA beobachtet.
Um festzustellen, ob verbesserte Transfektionen in anderen Zelltypen erreicht werden könnten, führten wir eine entsprechende Analyse an COS-7-Zellen durch. Mu1 verbesserte auch die Liposomen-vermittelte Transfektion bei COS-7-Zellen (5). Dasselbe Verhältnis von pDNA:Mu1:Liposomen, das für die ND7-Zellen optimal war, war auch für die COS-7-Zellen am besten. Es wurde außerdem ein ähnliches Ausmaß der Verbesserung (3,7-fach) gegenüber kationischen Liposomen alleine beobachtet.
Beispiel 3 – Transfektion in differenzierten ND7-Zellen
Wir haben außerdem die Fähigkeit von Mu1 zur verbesserten, durch kationische Liposomen vermittelten Transfektion bei differenzierten ND7-Zellen untersucht. Die ND7-Zelllinie stammt aus einer Fusion primärer Spinalganglion(DRG)-Neuronen der Ratte und dem Maus-Neuroblastom N18Tg2²⁸. ND7-Zellen können auf vielfältige Weise ausdifferenziert werden, einschließlich dem Entzug von Serum, der Verabreichung von cAMP oder der Exposition gegenüber verringertem Serum plus cAMP und Nervenwachstumsfaktor. Die Differenzierung von ND7-Zellen führt zur Expression zellulärer Eigenschaften, die mit ihren parentalen, der Schmerzempfindung dienenden sensorischen Neuronen assoziiert sind, einschließlich einer Verringerung der Zellteilung und dem Einsetzen des Neuriten-Auswachsens. ND7-Zellen wurden in 24-Well-Kulturplatten ausgesät und differenzierten 24 Stunden später. Fünfzehn bis 20 Stunden nach dem Einsetzen der Differenzierung wurden die Zellen wie oben transfiziert. Fünfzehn bis 20 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen fixiert und für die X-Gal-Histochemie weiterverarbeitet. In Übereinstimmung mit vorherigen Beobachtungen variierten die Transfektionseffizienzen stark zwischen den drei differenzierten Gruppen. ND7-Zellen, die durch den Entzug von Serum differenziert waren, zeigten die geringsten Niveaus der Transfektion (1,3%), während die höchsten Niveaus bei der cAMP-Gruppe zu sehen waren (8%), und intermediäre Niveaus bei der Gruppe mit niedrigem Serum/cAMP/NGF (4,7%) (5). Unter allen drei Bedingungen jedoch verbesserte die Einbeziehung von Mu1-Polypeptid in den Transfektionskomplex die Transduktion differenzierter ND7-Zellen. ND7-Zellen, die entweder durch cAMP alleine oder durch Exposition gegenüber niedrigem Serum/cAMP/NGF differenziert waren, zeigten Steigerungen der Effizienzen von mehr als dem 6-fachen (5). Die größte Verbesserung der Effizienzen zeigte sich jedoch in der Gruppe, die durch Serumentzug differenziert war. Hier wurden Steigerungen von mehr als dem 10-fachen beobachtet.
Komplexe von Mu1-Peptid und DNA
Wie in Beispiel 1 (DNA-Bindungsanalyse) unter Verwendung von Gelelektrophorese gezeigt, wurde die Wanderung von Plasmid-DNA stark verzögert, und oberhalb eines Mu1:DNA-Verhältnisses von 0,5:1,0 (w/w) wanderte nur wenig DNA aus den Wells heraus. Dies impliziert, dass das Mu1-Peptid stark mit der DNA interagierte und Nukleinsäuren neutralisieren und kondensieren kann, um kleine Partikel auszubilden, die für die Genübertragung geeignet sind. Die Größe der Mu1:DNA (MD)-Partikel wurde über den in 7 angezeigten Mu1:DNA-Verhältnis-Bereich untersucht.
Die MD-Partikel wurden durch Mischen hergestellt. Kurz gesagt, wurden geeignete Aliquots von Mu1-Peptid in deionisiertem Wasser zu Plasmid-DNA (pCMVβ) (Endkonzentration 220 μg/ml) in 20 mM HEPES-Puffer, pH 7,0, hinzugegeben. Nach gründlichem Mischen wurde jedes Gemisch für 10 Minuten bei 20°C inkubiert. Unmittelbar nach der Inkubation wurde jedes Gemisch mit HEPES-Puffer verdünnt (DNA-Endkonzentration 24 μg/ml) und durch Photonen-Korrelations-Spektroskopie (N4 Plus, Coulter) einer Partikelgrößenanalyse unterzogen. Alle Messungen erfolgten bei 20°C, und die Daten wurden bei einem Winkel von 90° gesammelt. Es wurde unimodale Analyse verwendet, um die mittlere Partikelgröße und die Standardverteilung (S.D.) zu berechnen.
Interessanter Weise, obwohl Mu1 DNA band und Komplexe über den vollständigen untersuchten Bereich bildete, variierte die Partikelgröße in Reaktion auf das Mu1:DNA-Verhältnis beträchtlich. Stabile, kleine Nano-Partikel wurden im Bereich eines Mu1:DNA-Verhältnisses von 0,3 bis 1,2 (Bereich L) und von über 5 (Bereich H) gebildet. Dazwischen liegende Verhältnisse resultierten in einer schweren Aggregation, wobei die Größe der komplexen Partikel über die Inkubationszeit wuchs, um mehr als 2 μm in der Größe zu erreichen (7).
Beispiel 4 – Herstellung von LMD im Bereich L
Wir bestimmten, ob Liposomen-Mu1-DNA-Komplexe mit einem niedrigen MD:DNA-Verhältnis stabile Nanopartikel ausbilden können und ob die resultierenden komplexen Partikel gute Transfektionsaktivitäten besitzen können.
Herstellung von Liposomen: Es wurden DC-Chol (30 μmol) und DOPE (20 μmol) in Dichlormethan zusammengebracht. Das organische Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck unter Verwendung eines Rotationsverdampfers entfernt, und der Rückstand wurde für 3h im Vakuum getrocknet. Danach wurden 4 mM HEPES-Puffer, pH 7,0 (3 ml) unter Mischen durch Vortexen zu dem Lipidfilm hinzugegeben. Nach einer kurzen Ultraschallbehandlung (2–3 min) wurde die resultierende kationische Liposomensuspension mittels einer Extrusionsvorrichtung (Lipex Biomembranes) dreimal über zwei gestapelte Polycarbonatfilter (0,2 μm, Millipore) und dann zehnmal durch zwei gestapelte Polycarbonatfilter (0,1 μm, Millipore) extrudiert, um kleine Liposomen zu bilden (109 nm durchschnittlicher Durchmesser durch PCS) (etwa 8–10 mg/ml in Abhängigkeit von der Herstellung).
Herstellung von Liposom:Mu1:DNA (LMD)-Komplexen:Mu1-Peptid (0,12 mg in deionisiertem Wasser, Peptidkonzentration 3,5 mg/ml) wurde zu einer Lösung von Plasmid-DNA (pCF1-CAT) (0,2 mg, Plasmidkonzentration typischerweise 1,0 mg/ml) in 4 mM HEPES-Puffer bei kontinuierlichem Vortexen hinzugegeben. Die kationische Liposomensuspension (Gesamt-Lipid 2,4 mg, 4 μmol) wurde dann eingeführt, was in der Bildung kleiner Partikel mit enger Größenverteilung (168 nm ± 58 nm), wie durch PCS gemessen, resultierte. Diese LMD (DNA-Endkonzentration 0,14 mg/ml) wurde unter Zugabe von 10% Sucrose (w/v) bis zur Verwendung bei –80°C gelagert. Es wurde über einen Monat keine Partikelgrößenveränderung beobachtet.
Liposom:DNA (LD)-Komplexe (Lipoplexe) wurden für Kontrollversuche mit einem Liposom:DNA-Verhältnis von 3:1 (w/w), der optimalen Zusammensetzung für die Transfektion von ND7-Zellen, hergestellt.
Transfektion in ND7-Zellen: ND7-Zellen wurden in normalem Wachstumsmedium (NGM) (mit 10% Serum) bei einer Dichte von etwa 4 × 10⁴ Zellen pro Well in einer 24-Well-Kulturplatte ausgesät. Nach 24 Stunden wurden die Zellen durch kurze Exposition gegenüber NGM (serumfrei) gewaschen und dann für die angegebenen Zeitspannen mit Lösungen behandelt, die LMD oder LD-Komplexe enthielten, wobei die Lösungen mit NGM (serumfrei) vorverdünnt waren (DNA-Endkonzentration 3,2 μg/ml in allen Fällen). Die Zellen wurden dann wiederum gewaschen und vor der Ernte für weitere 48 h inkubiert. Die Bestimmung der Transfektionsniveaus erfolgte durch Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Enzymassay unter Verwendung von ¹⁴C-CAM als Substrat (Promega). Die Transfektionsaktivität wurde ausgedrückt als Prozentsatz (%) der Umsetzung des zugegebenen ¹⁴C-CAM durch das Enzym.
Wir fanden eine viel höhere Reportergen-Expression bei LMD als bei der durch LD vermittelten Transfektion. Tatsächlich resultierte die LMD-Transfektion nach einer Transfektionszeit von 10 Minuten in einer 16-fach erhöhten CAT-Enzymaktivität und nach einer Transfektionszeit von 60 Minuten in einer 6-fach höheren CAT-Enzymaktivität im Vergleich zu der LD-vermittelten Transfektion (8). Mit LMD wurde sogar dann eine signifikante Transfektion beobachtet, wenn die Transfektionszeit nur 10 min betrug. Diese Daten zeigen, wie rasch LMD-Partikel in der Lage sind, in Zellen einzutreten.
Beispiel 5 – Kationische Lipid(Cytofectin)-Variationen
Wir bestimmten, ob LMD-Komplexe verbessert werden können, indem man polykationische Cholesterol-Lipide (WO 97/45442) einbaut. CDAN (B198), ACHx (CJE52) und CTAP (B232) (9) wurden verwendet, um anstelle von DC-Chol kationische Liposomen zu bilden. Jedes der verwendeten kationischen Liposomensysteme bestand aus 60 Mol-% des kationischen Lipids und 40 Mol-% DOPE und wurde hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben. Es wurden die folgenden verschiedenen LMD-Komplexsysteme hergestellt und verglichen: LMD (DC-Chol), LMD (B198), LMD (CJE52) und LMD (B232). Alle LMD-Systeme wurden mit kationischen Liposomen (Gesamt-Lipid 20 μmol) und 0,6 mg an Mu1-Peptid pro 1,0 mg an DNA (pCMVβ) hergestellt, wie oben beschrieben. Es wurde für die Partikel gezeigt, dass diese einen Durchmesser von unter 200 nm besaßen.
Liposom:DNA (LD)-Komplex-Gemische (Lipoplexe) wurden für Kontrollversuche mit einem Liposom:DNA-Verhältnis von 3:1 (w/w) hergestellt, der optimalen Zusammensetzung für die Transfektion von ND7-Zellen.
Transfektion von ND7-Zellen: ND7-Zellen wurden in NGM (mit 10% Serum) mit einer Dichte von etwa 4 × 10⁴ Zellen/Well in einer 24-Well-Kulturplatte ausgesät. Nach 24 h wurden die Zellen durch kurze Exposition gegenüber NGM (serumfrei) gewaschen und dann für 1 h mit Lösungen behandelt, die LMD- oder LD-Komplexe beinhalten, vorverdünnt mit NGM (serumfrei) (DNA-Endkonzentration in allen Fällen 2,5 μg/ml). Die Zellen wurden dann wiederum gewaschen und für weitere 48 h inkubiert, bevor sie für die histochemische Färbung mit X-Gal weiterverarbeitet wurden. Die Anzahl der blau gefärbten Zellen wurde unter einem Inversmikroskop ausgezählt.
In allen Fällen arbeiteten die LMD-Formulierungen besser als die korrespondierenden LD-Systeme, die mit den gleichen polykationischen Cholesterol-Lipiden hergestellt worden waren (10). Die Rangfolge der Transfektionseffizienz war LMD (B198) > LMD (DC-Chol) > LMD (CJE52) >> LMD (B232). Dieselbe Rangfolge, B198 > DC-Chol > B232, wurde bei den entsprechenden LD-Systemen beobachtet.
Beispiel 6 – Menge an Mu1-Peptid im Bereich L
Wir untersuchten die Auswirkung des Mu1:DNA-Verhältnisses (im Bereich L in 7) auf die Transfektionsaktivität.
Kationische Liposomen, die aus dem kationischen Lipid B198 und DOPE (3:2, m/m) zusammengesetzt waren, wurden in derselben Weise hergestellt, wie in Beispiel 4 beschrieben. Es wurde eine Reihe von MD-Komplexgemischen (Mu1:DNA-Verhältnis variierend von 0,3 bis 1,2) hergestellt und mit dem kationischen Liposom komplexiert. Die resultierenden LMD-Systeme waren zusammengesetzt aus Liposom:Mu1:DNA (pCMVβ) in Verhältnissen von 12:0,3:1, 12:0,6:0,6, 12:0,9:1 bzw. 12:1,2:1 (w/w/w). Die gemessenen Größen der LMD-Partikel betrugen etwa 150 nm.
Die Transfektionsaktivitäten wurden in vitro unter Verwendung von Panc-1-Zellen (humane Pankreaskrebs-Zelllinie) bewertet. Die Zellen wurden mit einer ungefähren Dichte von 5 × 10⁴ pro Well in einer 24-Well-Kulturplatte in RPMI, supplementiert mit 10% FCS, ausgesät und für 24 h in Gegenwart von 5% CO₂ bei 37°C wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch kurze Exposition gegenüber RPMI gewaschen und dann für 30 min mit Lösungen von LMD-Komplexen behandelt, vorverdünnt mit RPMI (DNA-Endkonzentration in allen Fällen 5,0 μg/ml). Die Zellen wurden dann wiederum gewaschen und für weitere 48 h in RPMI, supplementiert mit 10% FCS, inkubiert, bevor sie geerntet wurden und der Assay auf β-Galactosidase-Enzymaktivität unter Verwendung eines Standardassay-Kits (Promega) erfolgte.
Wie in 11 gezeigt, wurde das optimale Verhältnis von Liposom:Mu1:DNA für die Transfektion von Panc-1-Zellen mit 12:0,6:0,6 ermittelt. Ansonsten wurden exzellente Transfektionsergebnisse mit Mu1-LMD-Komplexen mit diesem niedrigen Verhältnis erhalten.
Beispiel 7 – Menge und Zusammensetzung der Lipide
Um die Wirkung von Variationen des Verhältnisses kationischer Lipide zu DOPE ebenso wie das Verhältnis von Gesamt-Lipid zu Mu1 und DNA zu untersuchen, wurde eine Reihe von LMD-Systemen unter Verwendung von B198 als dem bevorzugten kationischen Lipid hergestellt. Es wurden kationische Liposomen hergestellt, die aus 60 Mol-% B198 und 40 Mol-% DOPE (3:2, m/m), aus 50 Mol-% B198 und 50 Mol-% DOPE (1:1, m/m) bzw. aus 33 Mol-% B198 und 67 Mol-% DOPE (1:2, m/m) bestehen, und diese wurden gemäß dem Verfahren aus Beispiel 4 mit einem Standard-MD-Komplexgemisch (Mu1:DNA 0,6:1, w/w) in den in 12 angezeigten Verhältnissen zusammengebracht.
Es wurden Liposom:DNA(LD)-Komplexgemische (Lipoplexe) mit einem Liposom:DNA-Verhältnis von 3:1 (w/w) für Kontrollexperimente hergestellt. Es wurde für alle LMD-Systeme herausgefunden, dass diese eine größere mittlere Größe besitzen, wenn geringere Mengen an kationischen Liposomen mit MD-Komplexen komplexiert wurden. Jedoch bleibt die Größe der LMD-Partikel, die aus mehr als 12 μmol Lipiden/mg DNA zusammengesetzt sind, unterhalb von 200 nm, während diejenigen mit 12 bis 6 μmol Lipiden/mg DNA über diesen Wert kletterten. Gelegentlich wurde eine sichtbare Aggregation bei der Herstellung von LMD-Systemen beobachtet, die aus 6 μmol Lipiden/mg DNA zusammengesetzt sind.
Die Transfektionsaktivitäten wurden mit Panc-1-Zellen bestimmt (12). Die Zellen wurden mit einer ungefähren Dichte von 5 × 10⁴ pro Well in einer 24-Well-Kulturplatte in DMEM, supplementiert mit 10% FCS, ausgesät, und für 24 h in Gegenwart von 5% CO₂ bei 37°C herangezogen. Die Zellen wurden durch kurze Exposition gegenüber DMEM gewaschen und dann für 2 Stunden mit Lösungen behandelt, die LMD- oder LD-Komplexe enthalten, wobei diese mit DMEM vorverdünnt waren (DNA-Endkonzentration 5,0 μg/ml in allen Fällen). Die Zellen wurden dann wiederum gewaschen und für weitere 48 h in DMEM inkubiert, das mit 10% FCS supplementiert war, bevor sie geerntet wurden und der Test auf β-Galactosidase-Enzymaktivität unter Verwendung eines Standard-Assay-Kits (Promega) erfolgte.
Die maximale Transfektionsaktivität war bei den drei unterschiedlichen getesteten kationischen Lipid-zu-DOPE-Formulierungen nicht signifikant verschieden. Im Fall der LMD-Systeme, die mit B198:DOPE (1:2, m/m) hergestellt worden waren, wurde die maximale Transfektion bei einem Liposom:DNA-Verhältnis von etwa 12,5 μmol Lipid/mg DNA erreicht. Die Transfektionsaktivitäten von LMD-Systemen, die mit kationischen Liposomen aus B198:DOPE (3:2, m/m) und B198:DOPE (2:2, m/m) hergestellt worden waren, erreichten ein Plateau bei Liposom:DNA-Verhältnissen von über 12,5 μmol Lipid/mg DNA. Alle analysierten LMD-Systeme neigten dazu, bei niedrigen Liposom:DNA-Verhältnissen niedrige Transfektionsaktivitäten zu zeigen (12). Es wird berücksichtigt, dass LMD-Formulierungen, die aus geringen Mengen an Mu1-Peptid zusammengesetzt sind, höhere Mengen an kationischen Liposomen im Vergleich zu den Formulierungen benötigen sollten, die mit höheren Mengen an Mu1-Peptid hergestellt wurden, damit die jeweiligen LMD-Systeme eine volle Transfektionsaktivität zeigen.
Beispiel 8 – Vergleich von Mu1-Peptid mit Protamin
Protamin ist ein natürlich vorkommendes kationisches Peptid, das in Fischsperma überreich vorkommt und wirkungsstark darin ist, DNA zu neutralisieren und zu kondensieren. Die Transfektionsaktivität von Protamin wurde mit der von Mu1-Peptid verglichen. Mu1-Peptid oder Protaminsulfat (Sigma, Güteklasse X vom Lachs) wurde mit DNA (pCMVβ) und dann mit kationischen Liposomen (B198:DOPE in einem Verhältnis von 3:2, m/m) komplexiert, um ein Liposom:Peptid:DNA-Verhältnis von 12:0,6:1 (w/w/w) zu ergeben.
Die Transfektionsaktivitäten wurden in Swiss 3T3-Zellen untersucht. Die Zellen wurden mit einer ungefähren Dichte von 2 × 10⁴ pro Well in einer 24-Well-Kulturplatte in DMEM, supplementiert mit 10% FCS, ausgesät, und für 48 h herangezogen, um die Konfluenz in Anwesenheit von 5% CO₂ bei 37°C zu vervollständigen. Die Zellen wurden durch kurze Exposition gegenüber DMEM gewaschen und dann für 1 oder 2 h mit Lösungen behandelt, die LMD- oder LD-Komplexe enthielten, wobei die Lösungen mit DMEM vorverdünnt waren (DNA-Endkonzentration in allen Fällen 5,0 μg/ml). Die Zellen wurden dann wiederum gewaschen und für weitere 48 h in DMEM inkubiert, das mit 10% FCS supplementiert war, bevor sie geerntet wurden. Das Niveau der β-Galactosidase-Enzymaktivität wurde unter Verwendung eines Standard-Assay-Kits (Promega) bestimmt.
Wie in 13 gezeigt, zeigten die Komplexe, die Mu1-Peptid enthielten, eine bessere Transfektion dieser konfluenten Zellen als diejenigen, die Protamin enthielten.
Beispiel 9 – alternative kationische Peptide
Um die Wirkungen verschiedener alternativer kationischer Peptide auf die Transfektionsaktivitäten zu untersuchen, wurde eine Reihe von Liposom:kationischem Peptid:DNA-Komplexen hergestellt und ihre relativen Transfektionsfähigkeiten wurden in vitro analysiert. Die verwendeten Peptide waren poly-Lysin-Hydrochlorid (mittleres Molekulargewicht 3970, Sigma), poly-Arginin-Hydrochlorid (mittleres Molekulargewicht 11800, Sigma), ein von Protein V, pV abgeleitetes Peptid (p5, Sequenz unten dargestellt), ein Peptid-Analogon von Mu1 (V, Sequenz unten dargestellt) und Mu1-Peptid selbst. Das p5-Peptid und das V-Peptid wurden unter Verwendung der gleichen Festphasen-Peptidsynthese-Methodik synthetisiert, wie sie zur Herstellung von Mu1-Peptid verwendet wurde.
Jedes Peptid wurde mit kationischen Liposomen (DC-Chol:DOPE 3:2, m/m) und DNA (pCMVβ) in einem Liposom:Peptid:DNA-Verhältnis von 12:0,6:1 (w/w/w) zusammengebracht, wie in Beispiel 4 beschrieben. Die Transfektionsaktivitäten wurden unter Verwendung von HeLa-Zellen (humane Epithelzellen) untersucht. Die Zellen wurden mit einer ungefähren Dichte von 5 × 10⁴ pro Well in einer 24-Well-Kulturplatte in DMEM, supplementiert mit 10% FCS, ausgesät, und für 24 h in Anwesenheit von 5% CO₂ bei 37°C herangezogen. Die Zellen wurden durch kurze Exposition gegenüber DMEM gewaschen und dann für 30 min mit Lösungen behandelt, die LMD- oder LD-Komplexe enthielten, wobei die Lösungen mit OPTIMEM (Gibco) vorverdünnt waren (DNA-Endkonzentration in allen Fällen 1,0 μg/ml). Die Zellen wurden dann wiederum gewaschen und für weitere 48 h in DMEM inkubiert, das mit 10% FCS supplementiert war, bevor sie geerntet wurden. Der Test auf das Niveau der β-Galactosidase-Enzymaktivität erfolgte unter Verwendung eines Standard-Assay-Kits (chemilumineszent, Roche).
Wie in 14 gezeigt, zeigten die kationischen Peptide, die von Adenovirus abgeleitet wurden (Mu1 und p5) und das Mu1-Analogon (V) eine exzellente Transfektionsaktivität im Vergleich zu Komplexen, die unter Verwendung der synthetischen kationischen Polypeptide poly-Lysin und poly-Arginin hergestellt worden waren.
Aminosäuresequenzen von p5, V und Mu1-Peptid:
Beispiel 10 – Vergleich mit Transfast unter Verwendung von Panc-1
LMD und LD wurden mittels der gleichen Methodik hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben, mit Ausnahme der Verwendung von pCMVβ. Der Transfast (Promega) DNA-Komplex wurde gemäß dem Herstellerprotokoll hergestellt.
Die Transfektionsaktivitäten wurden in vitro unter Verwendung von Panc-1-Zellen bewertet. Die Zellen wurden mit einer ungefähren Dichte von 5 × 10⁴ pro Well in einer 24-Well-Kulturplatte in RPMI, supplementiert mit 10% FCS, ausgesät, und für 24 h in Anwesenheit von 5% CO₂ bei 37°C herangezogen. Die Zellen wurden durch kurze Exposition gegenüber RPMI gewaschen und dann für die angezeigten Zeitspannen mit Lösungen behandelt, die LMD- oder LD-Komplexe enthielten, wobei die Lösungen mit RPMI vorverdünnt waren (DNA-Endkonzentration in allen Fällen 5,0 μg/ml). Die Zellen wurden dann wiederum gewaschen und für weitere 48 h in RPMI inkubiert, das mit 10% FCS supplementiert war, bevor sie geerntet wurden. Das Niveau der β-Galactosidase-Enzymaktivität wurde unter Verwendung eines Standard-Assay-Kits (Promega) bestimmt. Die Transfektion mit Transfast:DNA-Komplex erfolgte in serumfreiem Medium (Optimalbedingungen) für 1 h.
Wie in 15 gezeigt, zeigte LMD eine bessere Transfektionsaktivität als der Transfast:DNA-Komplex und LD. Diese Ergebnisse stimmen vollständig mit denjenigen überein, die für ND-7-Zellen ermittelt wurden.
Beispiel 11 – Vergleich mit Lipofectamin unter Verwendung humaner bronchialer Zellen
Die Transfektionsaktivität von LMD-Komplexen wurde mit der von Lipofectamin (Gibco), das mit DNA komplexiert war, verglichen, wobei hierfür HBE-Zellen (humane bronchiale Epithelzellen) verwendet wurden.
Die Zellen wurden in einer 12-Well-Kulturplatte in DMEM, supplementiert mit 10% FCS, ausgesät, und für 24 h in Anwesenheit von 5% CO₂ bei 37°C herangezogen. Die Zellen wurden durch kurze Exposition gegenüber DMEM gewaschen und dann für die angezeigten Zeitspannen mit Lösungen behandelt, die entweder LMD-Komplexe (hergestellt wie in Beispiel 4) oder LD-Komplexe (hergestellt aus Lipofectamin:DNA 12:1, w/w) enthielten, wobei die Lösungen mit OPTIMEM (Gibco) vorverdünnt waren (DNA-Endkonzentration in allen Fällen 5,0 μg/ml) (siehe 16). Die Zellen wurden dann wiederum gewaschen und für weitere 48 h in DMEM inkubiert, das mit 10% FCS supplementiert war, bevor sie für die histochemische Färbung mit X-Gal weiterverarbeitet wurden.
LMD zeigte eine bessere Transfektionsaktivität als Lipofectamin (16) und zeigte eine raschere Aufnahme durch HBE-Zellen. Ähnliche Ergebnisse wurden bei ND7- und Panc-1-Zellen beobachtet.
Beispiel 12 – Vergleich mit LT1 unter Verwendung von Rattenhirn; ex vivo-Versuch
Wir bestimmten die Transfektionsaktivitäten in organotypischen Kulturen aus dem Rattenhirn unter Verwendung einer Reporter-DNA (pCMVβ), um ein in vivo-Modell nachzuahmen. Hirnschnitte wurden auf transparenten porösen Membranen gehalten und überwacht, um ihren inneren Zusammenhalt und ihre Zellarchitektur in einem großen Maß zu erhalten.
LMD und LD wurden hergestellt, wie in Beispiel 4 gezeigt. LT1 ist ein Polyamin-Transfektionsmittel, das von der Pan Vera Co hergestellt wird. Es wurde ein Komplex hergestellt, der kationische Liposomen (DC-Chol:DOPE 3:2, m/m), LT1 und pCMVβ-Plasmid in einem Verhältnis von 3:3,2:1 (w/w/w) enthielt. Gehirnscheiben wurden für 2 h mit Lösungen behandelt, die LMD, LD oder Liposom:LT1:DNA enthielten (Murray et al., Gene Ther. 1999, 6, 190–197). In allen Fällen wurden während des Versuchs keine morphologischen Veränderungen bei den Schnitten beobachtet. Nach 48 h Inkubation nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet, mit X-Gal angefärbt, und die Anzahl der blauen Zellen auf einer Scheibe wurde ausgezählt (17).
Bei einer DNA-Dosis von 5,0 μg (2 ml-Kultur) ergab LMD nach der X-Gal-Färbung eine offensichtlich größere Anzahl an blau gefärbten Zellen als der LD- oder LT1-Komplex. Bei einer Dosis von nur 129 ng zeigte LMD eine beträchtliche Transfektionsaktivität, die immer noch höher war als die von LD (DC-Chol:DOPE, komplexiert mit DNA, 3:1, w/w) (DNA-Dosis 5,0 μg). Wir fanden eine viel höhere Reportergen-Expression bei LMD im Vergleich zu der durch LD- und Liposom:LT1:DNA-Komplexen vermittelten Transfektion. Tatsächlich war die durch LMD vermittelte Transfektion über 19-mal effektiver als bei LD und über 4-mal effektiver als Liposom:LT1:DNA in vergleichbaren Dosen.
Beispiel 13 – Vergleich mit GL-67 kationischen Liposomen; in vivo-Versuch in Mauslunge
Wir bestimmten die Transfektionsaktivität in Mauslunge in vivo für LMD (hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben, unter Verwendung von kationischen DC-Chol:DOPE-Liposomen [3:2, m/m] und pCF1-CAT-Plasmid), wobei diese verglichen wurde mit der Transfektionsaktivität von kationischen Liposomen aus GL-67:DOPE:DMPE-PEG₅₀₀₀ (1:2:0,05 m/m/m), komplexiert mit pCF1-CAT-Plasmid (LD) (Liposom:DNA-Verhältnis 5,4:1 w/w), die mit großer Wirkung in klinischen Lungenstudien verwendet wurden (Alton et al., Lancet, 1999, 353, 947–954).
LMD (DNA-Endkonzentration 0,14 mg/ml; 100 μl-Volumen; DNA-Dosis 14 μg) wurde in die Lungen von Balb/c-Mäusen eingeflößt. GL-67:DOPE:DMPE-PEG₅₀₀₀ (1:2:0,05 m/m/m) wurde mit pCF1-CAT-Plasmid (DNA-Endkonzentration 0,8 mg/ml; 100 μl Volumen; DNA-Dosis 80 μg) komplexiert, und dieser LD-Komplex wurde in entsprechender Weise in die Lungen von Balb/c-Mäusen eingeflößt. Nach 48 Stunden wurden die Lungen homogenisiert und auf CAT-Aktivität hin getestet. Die Fehlerbalken zeigen den mittleren Standardfehler an.
Die Ergebnisse zeigen (18), dass LMD und das GL-67 enthaltende LD-System im wesentlichen äquivalente Transfektionsniveaus in vivo ergaben, obwohl das LMD-System eine 5-fach niedrigere DNA-Dosis auslieferte.
Beispiel 14 – Zucker-modifizierte LMD-Systeme
Für in vivo-Applikationen sollten unspezifische Interaktionen von LMD mit der biologischen Umgebung minimiert werden. Beispielsweise sind bei intravenösen Applikationen unerwünschte Interaktionen mit Blutbestandteilen (Salze, Proteine, ...) und Nicht-Zielzellen wichtige Hindernisse. Diese Opsonisierung von Fremdpartikeln mit Plasmaproteinen stellt einen der ersten Schritte beim natürlichen Prozess der Entfernung von Fremdpartikeln durch das angeborene Immunsystem dar. Um die Bindung von Proteinen und durch Salz induzierte Aggregationen zu reduzieren, können natürlich vorkommende Polysaccharide mit LMD gekoppelt werden. Diese Kohlenhydratmodifizierung von LMD kann ebenso verwendet werden, um LMD zielgerichtet zu Kohlenhydratrezeptoren zu lenken.
Um den gewünschten Effekt zu erzielen, haben wir die in 19 beschriebenen Neoglykolipide entworfen. Diese Verbindungen basieren auf drei abgegrenzten Domänen.
ACHx (CJE 52): Dieses Lipid (siehe 9) wurde als allgemeine Lipidplattform für die gewünschten Neoglykolipide ausgewählt. Das aliphatische Cholesterol-Ringsystem stellt einen sehr hydrophoben Bereich dar, der sich ins Innere der Lipidhülle der LMD oder LD-Partikel einschiebt und dabei als Neoglykolipid-Anker fungiert.
Kohlenhydrat-Motiv: Die Auswahl der Oligosaccharide wurde begrenzt durch die Komplexität jeder Chemie, die Kohlenhydrat-Modifikationen einbezieht. Wir entschieden uns dafür, die langkettigen, kommerziell erhältlichen Kohlenhydrate Maltotetraose und Maltoheptaose zum Nachweise des Prinzips zu verwenden.
Linker: Die Verwendung einer chemoselektiven Verknüpfung erwies sich als effizient und flexibel, was es uns ermöglichte, ein breites Spektrum von Neoglykolipiden zu synthetisieren. Diese chemoselektive Technik basierte auf einer Umsetzung von CJE52 zu einem Hydroxylamino-Lipid, das befähigt war, direkt an ungeschützte Kohlenhydrate anzukoppeln. Die Synthese eines typischen Hydroxylamino-CJE52 ist in 20 – Schema 1 dargestellt, und die Ankopplung der Kohlenhydratgruppierung an den Linker basiert auf der Glykosylierung eines O-substituierten Hydroxylamins (Das Prinzip der Reaktion mit Glukose ist in 21 – Schema 2 dargestellt). Unter Verfolgen dieser Strategie wurden Maltotetraose und Maltoheptaose gekoppelt, um GLU4- und GLU7-Verbindungen zu erhalten (Struktur in 22).
Die Glyko-Modifizierung von LMD basierte auf der natürlichen Fähigkeit von Neoglykolipid-Micellen zu dissoziieren, und freie Lipide bauen sich in die LMD-Membranen ein. Zunächst wurde LMD aus kationischen DC-Chol:DOPE-Liposomen, Mu1-Peptid und pCMVβ-Plasmid formuliert, wie in Beispiel 4 beschrieben. Danach wurde eine Suspension von Neoglykolipid-Micellen in HEPES-Puffer, pH 7,0, zu den LMD-Gemischen hinzugegeben, und das Ganze wurde für 30 min bei 20°C inkubiert, bevor es bei –80°C gelagert wurde (23).
Neoglykolipid-Stabilisation von LMD: Der Stabilisierungseffekt von Neoglykolipid-modifiziertem LMD wurde durch den Einbau von 7,5 Mol-% an GLU4 oder GLU7 in LMD bewertet. Die Lipidschicht von LD-Systemen ist dafür bekannt, dass sie nach Salzexposition aggregiert. Daher wurden die Größen von LD-Partikeln (DNA-Endkonzentration 1 μg/ml) nach 30 Minuten bei 37°C in OPTIMEM durch Photonenkorrelations-Spektroskopie (N4 plus, Coulter) bewertet. Es wurde unimodale Analyse verwendet, um die mittlere Partikelgröße zu bewerten. Der mittlere prozentuale Anstieg der LD-Partikelgröße ist gezeigt (24). Die entsprechende Prozedur wurde für das basale LMD-System, LMD(GLU4) und LMD(GLU7) (DNA-Endkonzentrationen 1 μg/ml) verfolgt.
Die Ergebnisse zeigen an, dass LMD in Lösung stabiler als LD ist, sie zeigen jedoch auch, dass die Gegenwart von GLU4 und GLU7 bei 7,5 Mol-% einen gesteigerten stabilisierenden Anti-Aggregationseffekt auf LMD-Partikel besitzt.
In vitro-Transfektionseffizienz: Die Transfektionsaktivität wurde mit Hela-Zellen bestimmt, die mit 5 × 10⁴ Zellen pro Well in 24-Well-Kulturplatten ausgesät und in DMEM, supplementiert mit FCS, bei 37°C und in Gegenwart von 5% CO₂ bis zu etwa 70% Konfluenz herangezogen wurden. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und dann für 30 Minuten mit Lösungen behandelt, die LMD-Komplexe enthielten, wobei diese Lösungen mit DMEM, das FCS in den angegebenen Prozentsätzen (%) enthielt, vorverdünnt waren (DNA-Endkonzentration in allen Fällen 5,0 μg/ml). Die Zellen wurden weiter gewaschen und dann vor der Ernte für weitere 48 h in Normalmedium (NGM) inkubiert. Das Niveau der β-Galactosidase-Expression wurde mit einem Standard-Assay-Kit (chemilumineszent, Roche) bestimmt.
Die Ergebnisse zeigten eine Steigerung der Transfektionseffizienz aufgrund der Zuckermodifizierung sowohl unter Bedingungen mit 0% als auch mit 50% Serum (25).
Diskussion
Wir haben zuvor gezeigt, dass DC-Chol/DOPE-Liposomen effizient beim Transfizieren der ND7-Zelllinie neuronaler Herkunft sind³¹. DC-Chol ist außerhalb des ZNS erfolgreich bei einer Vielzahl von Geweben verwendet worden und hat klinische Studien für die Gentherapie-Behandlung der cystischen Fibrose durchlaufen^33,34. Außerdem ist für DC-Chol-Liposomen gezeigt worden, dass diese keine zytotoxischen Nebenwirkungen zeigen^35,36. Aus diesen Gründen möchten wir verbesserte Formulierungen dieser Liposomen zur Verwendung in neuralen Zellen entwickeln.
Wir beschreiben hier die Verwendung eines Virus-codierten Proteins für die zelluläre Transfektion. Wir haben herausgefunden, dass Mu1, wenn es in Kombination mit dem kationischen Liposom DC-Chol/DOPE verwendet wird, in der Lage ist, die zelluläre Transfektion signifikant zu verbessern. Dieser Effekt war am wahrscheinlichsten durch die Fähigkeit von Mu1 begründet, pDNA zu kondensieren und kann durch Variieren der Verhältnisse von Polypeptid, pDNA und kationischen Liposomen optimiert werden. Signifikanter Weise war die Steigerung der Transfektionseffizienz bei differenzierten Zellen ausgeprägter. Wie oben erwähnt, wurden die ND7-Zellen von primären DRGs (Spinalganglien) abgeleitet. Differenzierende ND7-Zellen induzieren einen Phänotyp, der ähnlich ihren parentalen peripheren sensorischen Neuronen ist, einschließlich des Induzierens des Neuritenauswachsens, einer Verringerung der allgemeinen Proliferation und einer Verringerung der Transfizierbarkeit^28,37. Eine Verbesserung der Transfektionseffizienz bei differenzierten ND7-Zellen kann eine gesteigerte Befähigung zur Unterstützung von Transfektionen bei primären Neuronen oder von Transfektionen in vivo widerspiegeln.
Der Erfolg nicht-viraler Genauslieferungsvehikel als lebensfähige Alternativen zu auf Virus-Vektoren basierenden Systemen ist abhängig von der Entwicklung von Komplexen mit höheren und länger anhaltenden Transfektionseffizienzen. Daher war die anfängliche Identifizierung kationischer Liposomen als Vehikel für den Transfer von genetischem Material in Zellen dort ein großer Schub für die Entwicklung besserer kationischer Liposomenformulierungen^5,7. Die meisten Ansätze zur Verbesserung kationischer Liposomen basierten auf strukturellen Modifikationen an dem Molekül selbst³⁰. Es sind neue Formulierungen entwickelt worden, die verbesserte Transfektionseffizienzen aufweisen³⁰. Jedoch verhalten sich bestimmte Zelltypen unterschiedlich im Hinblick auf die durch kationische Liposomen vermittelte Transfektion. Beispielsweise haben wir herausgefunden, dass das Polypeptid Mu1 besser beim Steigern der durch kationische Liposomen vermittelten Transfektion ist als Vp1. Dies lag vermutlich am größeren Ladungsverhältnis von Mu1. Obwohl beide Peptide ungefähr das gleiche Molekulargewicht besitzen, betrug das Gesamtladungsverhältnis von Mu1 mehr als das Zweifache von VP1 (Tabelle 1). In Übereinstimmung hiermit war Mu1 befähigt, die elektrophoretische Mobilität von Plasmid-DNA bei weniger als 1/60 der Konzentration zu verlangsamen, was anzeigt, wie fest Mu1 DNA binden kann. Während eine kleine Verschiebung der Mobilität von pDNA detektiert wurde, wenn 0,25 μg Mu1 mit 1 μg pCMVβ komplexiert wurde, so wurde nach der Zugabe von 0,5 μg Mu1 nahezu die gesamte Plasmidmenge nahe der Beladungsvertiefung festgehalten (1). Ein 0,5/1,0-Verhältnis (w/w) von Mu1 zu pCMVβ entspricht einem molaren Verhältnis von 1000/1. Jedes Molekül von Mu1 enthält 12 Reste, die potentiell eine positive Ladung tragen können. Das theoretische Ladungsverhältnis von Mu1 zu pCMVβ wäre dann 1,6 (12.000 Mu1-Kationen zu 7500 pCMVβ-Anionen). Dieses Verhältnis sollte die negativen Ladungen an pCMVβ vollständig neutralisieren und somit, wie gesehen, seine Wanderung vollständig retardieren.
Ein direkter Vergleich zwischen der Menge an Mu1, die die Wanderung der Plasmid-DNA signifikant verzögerte, und derjenigen, die Transfektionen optimal steigerte, konnte nicht durchgeführt werden, da das Herstellungsverfahren anders war. Die Transfektionskomplexe aus Peptid-pDNA-Liposom wurden in größeren Volumina hergestellt (siehe Materialien und Methoden). Obwohl es 24-mal soviel Mu1 (12 μg/1 μg pCMVβ) erforderte, um eine optimale Verstärkung der Transfektionseffizienzen zu erreichen, als dafür, um die Wanderung in ein Agarosegel zu retardieren, war die Konzentration in Lösung ähnlich (25 ng/ml für die pDNA-Retardation; 30 ng/ml für optimale Transfektionen). Die Gegenwart von Mu1 veränderte auch die Interaktionen von kationischen Liposomen und pDNA. Das optimale Verhältnis von DC-Chol/DOPE zu pCMVβ in Gegenwart von Mu1 war 6/1, das zweifache dessen, das zuvor bei neuronalen Zellen als optimal ermittelt wurde^31,38. Theoretisch sollte die Menge an verwendetem Mu1 die positiven Ladungen an pCMVβ vollständig neutralisiert haben, was eine weitere Komplexierung mit DC-Chol/DOPE verhindert hätte. Dies war eindeutig nicht der Fall, da stark verbesserte Transfektionseffizienzen erreichbar waren. Es ist wahrscheinlich, dass nicht alle der möglichen geladenen Aminosäuren unter unseren Pufferbedingungen protoniert wurden. Warum mehr kationische Liposomen benötigt werden, um die Transfektionen zu verbessern, ist nicht klar, und wir arbeiten derzeit daran, diese Frage anzugehen.
Schließlich sollte noch etwas zu dem Kernlokalisierungssignal gesagt werden, das in Vp1 eingebettet ist. Jüngste Hinweise aus unserem Labor (unveröffentlichte Beobachtungen) sowie anderenorts^10,11,39,40 haben nahegelegt, dass der Kerntransport von transfiziertem Material bei der Lipofektion ineffizient sein kann. Aus diesem Grund sind Anstrengungen unternommen worden, DNA vorab mit Polykationen enthaltenden Peptidsequenzen zu kondensieren, von denen bekannt ist, dass sie Kernlokalisierungsfähigkeiten besitzen, mit dem Ziel, die Kernaufnahme transfizierter DNA zu verbessern^17,20,22. Wir haben jedoch herausgefunden, dass die effizienteren DNA-Kondensierungseigenschaften von Mu1 im Hinblick auf eine Verbesserung der Transfektionseffizienzen die Kernlokalisierungsfähigkeit von Vp1 bei weitem überwogen. In ähnlicher Weise haben Fritz et al.,²² keinen Unterschied zwischen den Transfektionseffizienzen von rekombinantem humanem Histon (H1) und einer modifizierten Version, die die Kernlokalisierungssequenz des großen T-Antigens von SV40 enthält, gefunden. Andere Studien haben nahegelegt, dass die Gegenwart einer NLS die Kernakkumulation transfizierter pDNA dennoch über spezifische intrazelluläre Wege verbessert^41,42.
Literaturstellen:

1. Wood M J A et al. Inflammatory effects of gene-transfer into the CNS with defective HSV-1 vectors. Gene Ther 1994; 1: 283–291.
2. Byrnes A P et al. Adenovirus gene-transfer causes inflammation in the brain. Neuroscience 1995; 66: 1015–1024.
3. Naldini L et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector [siehe Kommentare]. Science 1996; 272: 263–267.
4. Miller A D. Cationic liposomes for gene delivery. Angewandte Chemie-Infernational Edition 1998; 37: 1769–1785.
5. Lee R J, Huang L. Lipidic vector systems for gene transfer. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1997; 14: 173–206.
6. Gao X, Huang L. Cationic liposome-mediated gene-transfer. Gene Ther 1995; 2: 710–722.
7. Felgner P L et al. Lipofection-a Highly Efficient, Lipid-Mediated Dna-Transfection Procedure. Proceedings Of the National Academy Of Sciences Of the United States Of America 1987; 84: 7413–7417.
8. Farhood H, Serbina N, Huang L. The role of dioleoyl phosphatidylethanolamine in cationic liposome mediated gene transfer. Biochim Biophys Acta 1995; 1235: 289–295.
9. Caplen N J et al. In-vitro liposome-mediated DNA transfection of epithelial-cell lines using the cationic liposome DC-Chol/DOPE. Gene Ther 1995; 2: 603–613.
10. Labat-Moleur F et al. An electron microscopy study into the mechanism of gene transfer with lipopolyamines. Gene Ther 1996; 3: 1010–1017.
11. Zabner J et al. Cellular and molecular barriers to gene transfer by a cationic lipid. J Biol Chem 1995; 270: 18997–19007.
12. Felgner J H et al. Enhanced Gene Delivery and Mechanism Studies With a Novel Series Of Cationic Lipid Formulations. J Biol Chem 1994; 269: 2550–2561.
13. Sahenk Z et al Gene Delivery to Spinal Motor Neurons. Brain Res 1993; 606: 126–129.
14. Iwamoto Y et al Liposome-Mediated Bdnf Cdna Transfer In Intact and Injured Rat-Brain. Neuroreport 1996; 7: 609–612.
15. Roessler B J, Davidson B L. Direct plasmid-mediated transfection of adult murine brain-cells in-vivo using cationic liposomes. Neurosci Lett 1994; 167: 5–10.
16. Zhou X, Huang L. DNA transfection mediated by cationic liposomes containing lipopolylysine: characterization and mechanism of action. Biochim Biophys Acta 1994; 1189: 195–203.
17. Sorgi F L, Bhattacharya S, Huang L. Protamine sulfate enhances lipid-mediated gene transfer. Gene Ther 1997; 4: 961–968.
18. Li S, Huang L. Protamine sulfate provides enhanced and reproducible intravenous gene transfer by cationic liposome/DNA complex. Journal of Liposome Research 1997; 7: 207–219.
19. Vitiello L et al. Condensation of plasmid DNA with polylysine improves liposome-mediated gene transfer into established and primary muscle cells. Gene Ther 1996; 3: 396–404.
20. Namiki Y, Takahashi T, Ohno T. Gene transduction for disseminated intraperitoneal tumor using cationic liposomes containing non-histone chromatin proteins: cationic liposomal gene therapy of carcinomatosa. Gene Ther 1998; 5: 240–246.
21. Gao X, Huang L. Potentiation of cationic liposome-mediated gene delivery by polycations. Biochem 1996; 35: 9286–9286.
22. Fritz J D et al. Gene transfer into mammalian cells using histone-condensed plasmid DNA. Hum Gene Ther 1996; 7: 1395–1404.
23. Hagstrom J E et al. Complexes of non-cationic liposomes and histone H1 mediate efficient transfection of DNA without encapsulation. Biochim Biophys Acta 1996; 1284: 47–55.
24. Isaka Y et al. The HVJ liposome method. Exp-Nephrol 1998; 6: 144–147.
25. Gillock E T et al. Polyomavirus major capsid protein VP1 is capable of packaging cellular DNA when expressed in the baculovirus system. J-Virol 1997; 71: 2857–2865 ISSN: 0022-2538X.
26. Chang D, Cai X, Consigli R A. Characterization of the DNA binding properties of polyomavirus capsid proteins. Journal of Virology 1993; 67: 6327–6331.
27. Anderson C W, Young M E, Flint S J. Characterization of the adenovirus 2 virion protein, mu Virology 1989; 172: 506–512.
28. Wood J N et al. Novel Cell-Lines Display Properties of Nociceptive Sensory Neurons. Proceedings of the Royal Society of London Series B-Biological Sciences 1990; 241: 187–194.
29. Budhrammahadeo V, Lillycrop K A, Latchman D S. The Levels of the Antagonistic Pou Family Transcription Factors Brn-3a and Brn-3b in Neuronal Cells Are Regulated in Opposite Directions By Serum Growth-Factors. Neurosci Lett 1995; 185: 48–51.
30. Cooper R G et al. Polyamine analogues of 3 beta-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)carbomoyl]cholesterol (DC-Chol) as agents for gene delivery. Chemistry-a European Journal 1998; 4: 137–151.
31. McQuillin A et al. Optimization of liposome mediated transfection of a neuronal cell line. Neuroreport 1997; 8: 1481–1484.
32. Hosokawa K, Sung M T. Isolation and characterization of an extremely basic protein from adenovirus type 5. Journal of Virology 1976; 17: 924–934.
33. Caplen N J et al. Liposome-Mediated Cftr Gene-Transfer to the Nasal Epithelium of Patients With Cystic-Fibrosis. Nature Med 1995; 1: 39–46.
34. Nabel G, Chang A, Nabel E. Clinical Protocol: Immunotherapy of malignancy by in vivo gene transfer into tumors. Hum Gene Ther 1992; 3: 399–410.
35. Nabel G J et al. Direct gene-transfer with DNA liposome complexes in melanoma-expression, biological activity, and lack of toxicity in humans. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 11307–11311.
36. Stewart M J et al. Gene-transfer in vivo with DNA liposome complexes-safety and acute toxicity in mice. Hum Gene Ther 1992; 3: 267–275.
37. Murray K D et al. DC-Chol/DOPE mediated transfections in differentiated sensory neurons. In Vorbereitung, 1999.
38. Murray K D et al. Cationic liposome-mediated transfection in organotypic explant cultures. Gene Ther 1999; 6: 190–197.
39. Thierry A R et al. Characterization of liposome-mediated gene delivery: Expression, stability and pharmacokinetics of plasmid DNA. Gene Ther 1997; 4: 226–237.
40. Coonrod A, Li F Q, Horwitz M. On the mechanism of DNA transfection: efficient gene transfer without viruses. Gene Ther 1997; 4: 1313–1321.
41. Sebestyen M G et al. DNA vector chemistry: the covalent attachment of signal peptides to plasmid DNA. Nat Biotechnol 1998; 16: 80–85.
42. Hagstrom J E et al. Nuclear import of DNA in digitonin-permeabilized cells. J Cell Sci 1997; 110 (Pt 18): 2323–2331.

Claims

Nicht-viraler Nukleinsäure-Auslieferungsvektor, welcher einen kondensierten Polypeptid-/Nukleinsäure-Komplex und ein kationisches Lipid umfaßt, wobei der Komplex folgendes aufweist: (a) eine interessierende Nukleinsäuresequenz (NOI) und (b) ein oder mehrere Adenovirus-Mu1-Polypeptide oder homologe Polypeptide mit wenigstens 60% Identität hierzu, wobei die Polypeptide oder deren Homologe (i) in der Lage sind, an die NOI zu binden, und (ii) in der Lage sind, die NOI zu kondensieren, und wobei die NOI heterolog zu dem einen oder den mehreren Polypeptiden ist.
Vektor nach Anspruch 1, welcher weiterhin ein Polypeptid umfaßt, das eine Kernlokalisierungssequenz (NLS) enthält.
Vektor nach Anspruch 2, wobei das Polypeptid, das eine Kernlokalisierungssequenz (NLS) enthält, Adenovirus-pV oder ein Derivat davon ist.
Kondensierter Polypeptid-/Nukleinsäure-Komplex, welcher ein kationisches Lipid, eine Polypeptidkomponente und eine Nukleinsäurekomponente umfaßt, zur Verwendung bei der Auslieferung der Nukleinsäurekomponente an einen Zellkern einer eukaryontischen Zelle, wobei (a) die Polypeptidkomponente ein Adenovirus-Mu1-Polypeptid oder ein homologes Polypeptid mit wenigstens 60% Identität hierzu ist, (b) die Polypeptidkomponente oder deren Homologes in der Lage ist, an die NOI zu binden, und (c) die Polypeptidkomponente oder deren Homologes in der Lage ist, die NOI zu kondensieren, und wobei die Nukleinsäure heterolog zu dem Polypeptid ist.
Komplex nach Anspruch 4, welcher weiterhin ein Polypeptid umfaßt, das eine Kernlokalisierungssequenz (NLS) enthält.
Komplex nach Anspruch 5, wobei das Polypeptid, das eine Kernlokalisierungssequenz (NLS) enthält, Adenovirus-pV oder ein Derivat davon ist.
Komplex nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei das Verhältnis von Liposom:NOI:Polypeptid 2–20:1:0,5–1, bevorzugt 10–14:1:0,5–0,7 und ganz besonders bevorzugt etwa 12:1:0,6 beträgt.
Komplex nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei der Komplex einen Durchmesser von weniger als 200 nm hat.
Verfahren zum Herstellen eines nicht-viralen Nukleinsäure-Auslieferungsvektors, welcher ein kationisches Lipid und einen kondensierten Polypeptid-/Nukleinsäure-Komplex umfaßt, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: (a) Inkontaktbringen einer interessierenden Nukleinsäuresequenz (NOI) mit einem Mu1-Polypeptid oder einem homologen Polypeptid mit wenigstens 60% Identität hierzu, wobei die Polypeptidkomponente oder deren Homologes (i) in der Lage sind, an die NOI zu binden, und (ii) in der Lage sind, die NOI zu kondensieren, und wobei die NOI heterolog zu dem Polypeptid ist, und (b) Inkontaktbringen des so gebildeten Nukleinsäure-/Polypeptid-Komplexes mit einem kationischen Lipid.
Verfahren zum Einführen einer interessierenden Nukleinsäuresequenz (NOI) in eine eukaryontische Zelle, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der Zelle in vitro mit einem Komplex gemäß einem der Ansprüche 4 bis 8 umfaßt und wobei der Komplex die NOI umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Zelle eine Neuronenzelle, eine Krebszelle oder eine Epithelzelle ist.
Verwendung eines Adenovirus-Mu1-Polypeptids oder eines homologen Polypeptids mit wenigstens 60% Identität hierzu bei der Herstellung eines Nukleinsäure-Auslieferungsvektors, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert.