JP2003518388A - ウイルスコアタンパク質−カチオン性脂質−核酸送達複合体 - Google Patents

ウイルスコアタンパク質−カチオン性脂質−核酸送達複合体

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Abstract

(57)【要約】 凝縮ポリペプチド／核酸複合体及びカチオン性脂質を含む核酸送達複合体が提供される。上記複合体は（ａ）目的とする核酸配列（ＮＯＩ）、及び（ｂ）１種以上のウイルス核酸パッケージングポリペプチド又はその誘導体を備えており、前記ポリペプチド又はその誘導体は（ｉ）ＮＯＩへ結合することができ、かつ（ｉｉ）ＮＯＩを凝縮させることができ、ＮＯＩは該ポリペプチドに対して異種である。さらにまた、送達ベクターを使用して細胞内へＮＯＩを導入する方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 ［発明の分野］ 本発明は、ウイルスパッケージングタンパク質を含むカチオン性脂質／タンパ
ク質／核酸複合体及び例えば神経細胞のような細胞へ核酸を効率的に送達する際
におけるそれらの使用に関する。
【０００２】 ［発明の背景］ 非ウイルス遺伝子導入は、細胞をトランスフェクションすることのできるカチ
オン性脂質を用いて調製される合成リポソームの産生の結果として、前途有望に
進歩してきた。しかし、これらの複合体の中でＣＮＳ細胞内へＤＮＡを効率的に
導入する能力、及び導入遺伝子の発現を入手できる能力について試験された複合
体はほとんどない。神経細胞を効率的かつ安全にトランスフェクションする能力
は、神経機能を解明するための強力なツールを提供することができ、神経疾患に
対する新規の治療法を生み出すきっかけとなる可能性がある。
【０００３】 あいにくなことに、ＣＮＳに対する遺伝子療法は分裂後ニューロンを形質導入
するための効率的な手段が欠如しているために阻まれてきた。ほとんどの試験は
遺伝子送達にはウイルスベクターを利用してきた。しかし、多くのウイルスベク
ターには免疫性及び細胞毒性の問題がつきまとっており、ウイルス学の専門家で
はない者が容易に操作することはできない1-3。そこで現在では、細胞形質導入
の代替法として非ウイルスベクターが登場している。非ウイルス遺伝子導入にお
ける最も前途有望な進歩は、細胞をトランスフェクションできるカチオン性脂質
（サイトフェクチン）を用いて調製される合成リポソームの産生にある。そのよ
うなカチオン性リポソームは、比較的容易に使用することができ、幅広い適用可
能性があり、その上に細胞毒性が欠如している4。
【０００４】 新規カチオンリポソーム調製物は、コンスタントに開発されている5。しかし
、これらの複合体の中でＣＮＳ内で効率的に細胞を形質導入できる能力について
試験されている複合体はほとんどない6-9。カチオン性リポソームは、負荷電Ｄ
ＮＡ及び引続いて緩徐なエンドサイトーシスのプロセスによってそこでそれらが
細胞膜を越えて取り込まれる細胞性膜との静電的相互作用によって機能する6,10 ,11 。それらは頻回に、エンドソームの緩衝及び破壊に極めて効率的である中性
脂質のジオレオイル−Ｌ−α−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を
使用して調製されている8,12。核周囲スペースからトランスフェクトされた遺伝
物質はこのリポソーム複合体から放出され、核内へ輸送され、発現させられる。
現在までにＣＮＳ中でのトランスフェクションを良好に媒介できることが証明さ
れているのはＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ
トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）及びＤＯＰＥから調製されたリ
ポソームだけである13-16。そこで遺伝子療法に有用であるためには高い効率で
ＣＮＳ細胞をトランスフェクトすることのできるリポソーム複合体が必要とされ
る。
【０００５】 非ウイルス媒介性遺伝子導入における大きな制限は、リポソーム：ＤＮＡ複合
体の生成中における大きな凝集分子の形成である5。これらの大きな凝集体は、
おそらく複合体のエンドサイトーシスを制限することによってトランスフェクシ
ョン効率を低下させる可能性がある。これを回避するための１つのアプローチは
、複合体形成の前にＤＮＡ凝縮（condensation）によってＤＮＡ分子のサイズを
減少させることである。ＤＮＡの前凝縮(pre-condensation)は、より小さな複合
体及びトランスフェクション効率の改良を生じさせる17-23。そこでリポソーム
媒介性トランスフェクションを改良することに有効である様々なポリカチオンが
同定されてきた。これらの中で、ポリ−Ｌ−リジン及びプロタミンは、様々な非
神経細胞系において前凝縮を行わなかった複合体と比較して３０倍以上の増加を
可能にする最も劇的な結果を生み出してきた17,21。
【０００６】 硫酸プロタミンは、リポソームトランスフェクションを増進することにおいて
特に優れている。プロタミンは、精子の頭部で発見された天然型ポリカチオンで
ある。プロタミンの役割は、精子中でＤＮＡを凝縮し、卵核への精子の輸送を助
けることにある。プロタミンの核ターゲティング特性は、遺伝子導入にとってプ
ロタミンを特に魅力的なものにしている。さらに、非常に広範囲の分子量（１８
，０００−１９，２００Ｄａ）を有する合成ポリ−Ｌ−リジンとは相違して、プ
ロタミンは天然型で、サイズがより小さくより一様（４，０００−４，２５０Ｄ
ａ）である。これらの性質は、標的組織において免疫原性反応が発生するチャン
スが少なく、凝縮をより容易にコントロールできることを意味している。他の天
然型ＤＮＡ凝縮タンパク質もまたカチオン性リポソーム媒介性ＤＮＡ遺伝子導入
を増進させるために使用されてきた。Ｆｒｉｔｚら22は、核内移行シグナルを組
み込んでいる組換えヒトＨ１ヒストンタンパク質（ｎｌｓ−Ｈ１）を使用してリ
ポフェクションにおける約３０倍の増加を達成した。同様に、非ヒストン染色体
高移動度群１，２タンパク質もまたリポフェクションを改良することが証明され
ており、ＨＶＪ−リポソーム法においてルーチン的に使用されている20,24。
【０００７】 ［発明の概要］ 我々は、リポソームに基づく遺伝子導入を改良する能力についてウイルス−Ｄ
ＮＡ関連タンパク質を試験した。特に我々は、アデノウイルス及びポリオーマウ
イルス各々のウイルスコード化合成ペプチドＭｕ１と組換えＶｐ１タンパク質と
を比較した。Ｍｕ１はアデノウイルス染色体凝縮において役割を果たす可能性が
あるが、他方ＶＰ１はポリオーマウイルスのＤＮＡ結合活性を示す唯一の構造タ
ンパク質である25-27。ＶＰ１はＨＭＧ−１，２及びｎｌｓ−Ｈ１において所見
されるものに類似する埋め込まれた伝統的核内移行シグナル（ＮＬＳ）を含有し
ているが、Ｍｕ１はＮＬＳを含有していない26。我々は、Ｍｕ１が神経系及び腎
臓に由来する細胞におけるカチオン性リポソーム媒介性遺伝子導入を重大に改良
するが、Ｖｐ１は改良しないことを発見した。さらに我々は、Ｍｕ１による増進
が分化細胞における方が大きいことも発見したが、これはインビボでの神経細胞
にとってこのアプローチに潜在的有益性があることを示している。
【０００８】 これらの発見は、ＤＮＡからＣＮＳ細胞へのリポソーム媒介性送達の実験的及
び治療的使用に対して重要な意味を有している。 したがって、本発明は凝縮ポリペプチド／核酸複合体及びカチオン性脂質を含
む非ウイルス核酸送達ベクターを提供するが、このとき該複合体は、 （ａ）目的とする核酸配列（ＮＯＩ）と、 （ｂ）１種以上のウイルス核酸パッケージングポリペプチド又はそれらの誘導体
であって、前記ポリペプチド又はそれらの誘導体が（ｉ）ＮＯＩへ結合すること
ができ、及び（ｉｉ）ＮＯＩを凝縮させることができ、かつＮＯＩが該ポリペプ
チドに対して異種であるウイルス核酸パッケージングポリペプチド又はそれらの
誘導体とを含む。
【０００９】 好ましくは、少なくとも１種のポリペプチドはアデノウイルス核酸パッケージ
ングポリペプチド又はそれらの誘導体である。より好ましくは、アデノウイルス
ポリペプチドは、Ｍｕ１、ｐＶもしくはｐＶＩＩ又はそれらの誘導体である。
【００１０】 用語「該ポリペプチドに対して異種である」は、該ウイルスパッケージングポ
リペプチドと結合して自然に発生するウイルスＮＯＩが除外されることを意味す
る。
【００１１】 ある好ましい実施形態では、ベクターはさらに核内移行配列（ＮＬＳ）を含む
ポリペプチドを含む。より好ましくは、核内移行配列（ＮＬＳ）を含むポリペプ
チドはアデノウイルスｐＶ又はそれの誘導体である。
【００１２】 本発明はさらに、真核細胞の核へ核酸成分を送達する際に使用するための、カ
チオン性脂質、ポリペプチド成分及び核酸成分を含む凝縮ポリペプチド／核酸複
合体を提供するが、このとき （ｉ）該ポリペプチド成分はウイルス核酸パッケージングポリペプチド、又はそ
の誘導体であり、 （ｉｉ）該ポリペプチド成分又はその誘導体はＮＯＩへ結合することができ、そ
して、 （ｉｉｉ）該ポリペプチド成分又はそれの誘導体はＮＯＩを凝縮させることがで
き、かつ上記核酸は該ポリペプチドに対して異種である。
【００１３】 好ましくは、少なくとも１種のポリペプチドはアデノウイルス核酸パッケージ
ングポリペプチド又はそれの誘導体である。より好ましくは、アデノウイルスポ
リペプチドは、Ｍｕ１、ｐＶもしくはｐＶＩＩ又はそれらの誘導体である。
【００１４】 ある好ましい実施形態では、該複合体はさらに核内移行配列（ＮＬＳ）を含む
ポリペプチドを含む。より好ましくは、核内移行配列（ＮＬＳ）を含む該ポリペ
プチドはアデノウイルスｐＶ又はその誘導体である。
【００１５】 本発明はさらにまた、凝縮ポリペプチド／核酸複合体及びカチオン性脂質を含
む非ウイルス核酸送達ベクターを産生する方法を提供するが、このとき該方法は
、 （ａ）目的とする核酸配列（ＮＯＩ）をウイルス核酸パッケージングポリペプチ
ド又はその誘導体と接触させ、ここに前記ポリペプチド成分又はその誘導体が（
ｉ）ＮＯＩへ結合することができ、かつ（ｉｉ）ＮＯＩを凝縮させることができ
、ＮＯＩがポリペプチドに対して異種であり、そして （ｂ）こうして形成された該核酸／ポリペプチド複合体をカチオン性脂質と接触
させることを含む。
【００１６】 本発明はさらに、目的とする核酸配列（ＮＯＩ）を真核細胞内へ導入する方法
を提供するが、該方法はその細胞を本発明の複合体と接触させることを備えてお
り、このとき該複合体はＮＯＩを含む。好ましくは、該細胞は神経細胞、癌細胞
又は上皮細胞である。
【００１７】 また別の実施形態では、ウイルス核酸パッケージングポリペプチドの代わりに
、又はそれに追加してウイルス核酸核内移行／送達ポリペプチドを使用すること
ができる。実際上、一部のウイルスポリペプチドは両方の機能を兼ね備えている
。
【００１８】 ［発明の詳細な説明］ 一般にここで言及する方法は当分野においてよく知られているが、特にＳａｍ
ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング、実験室マニュアル）（１９８９）及びＡ
ｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における簡潔なプロトコル）（１９９９）第４版
，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照することができる。
【００１９】 Ａ．ポリペプチド成分 １．ウイルス核酸パッケージングポリペプチド 用語「ウイルス核酸パッケージングポリペプチド」には、典型的には、そこで
のそれらの機能がパッケージする、特に凝縮する、及び核酸がウイルスゲノムを
ビリオン内に構成している核内へ送達することであるウイルス粒子中で自然に発
生するウイルスゲノムによってコードされたポリペプチドが含まれる。さらにま
た、下記で説明するようなホモログ及び例えばフラグメントのようなそれらの誘
導体も含まれる。
【００２０】 ウイルス核酸パッケージングポリペプチドの例には、Ｂ型肝炎コア抗原及びア
デノウイルスコアタンパク質のようなウイルスコアタンパク質、Ｍｕ１、ｐＶ及
びｐＶＩＩ並びに例えば乳腺炎ウイルス（哺乳類アデノウイルス）及びアビアデ
ノウイルス（鳥類アデノウイルス）のような他のアデノウイルス中の等価のタン
パク質が含まれる。本発明において使用するために特に好ましいウイルス核酸パ
ッケージングポリペプチドは配列番号１としてすぐ下に示されているＭｕ１ポリ
ペプチドである。 ＮＨ2−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号１）。
【００２１】 本発明において使用するためのウイルス核酸パッケージングポリペプチドは、
典型的には非特異的方法で、好ましくは核酸の凝縮を惹起することによって核酸
へ結合させることができる。一般には、凝縮ＮＯＩは標的細胞への最高効率の送
達のためには例えば５０〜２００ｎｍのような２００ｎｍ以下のサイズを有する
ことが好ましい。
【００２２】 ウイルスポリペプチドが核酸に結合する能力は、例えばゲル・リターデーショ
ン・アッセイ（ｇｅｌ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）（材料及び方法
の項並びに結果の項を参照）及び電気泳動バンドシフト移動度アッセイを含むゲ
ル電気泳動法、臭化エチジウム除外アッセイ及びアフィニティークロマトグラフ
ィー（例えば一本鎖又は二本鎖ＤＮＡセルロースを使用する）のような方法を使
用してインビトロで測定することができる。
【００２３】 ウイルスポリペプチドが核酸を凝縮させる能力は、例えば円偏光二色性（ＣＤ
）分光法（例えば、Ｓａｔｏ ａｎｄ Ｈｏｓｏｋａｗａ，１９８４，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．９５：１０３１−１０３９を参照）によって測定することがで
きる。
【００２４】 一般に、ウイルスポリペプチドもしくはそのホモログ又はそれらの誘導体は、
生理的ｐＨ（例、ｐＨ７．４）で多数の正荷電アミノ酸残基を含む。好ましくは
、そのウイルスポリペプチド上の総正味電荷は生理的ｐＨでは正である。特に、
電荷：アミノ酸比は少なくとも＋０．３、好ましくは少なくとも＋０．４、＋０
．５又は＋０．６であることが好ましい。
【００２５】 ウイルスポリペプチドもしくはそのホモログ又はそれらの誘導体は、リジン残
基よりむしろアルギニン残基又はその両方の混合物を含むことが好ましい。さら
にまた、ウイルスポリペプチドもしくはそのホモログ又はそれらの誘導体は、１
個以上のヒスチジン残基、好ましくは２個以上のヒスチジン残基を含むことが特
に好ましい。さらに、ウイルスポリペプチドもしくはそのホモログ又は誘導体は
、典型的には多数の高度に疎水性の例えばアラニンのような残基、例えば２個以
上の疎水性残基を含むであろう。
【００２６】 本発明において使用するためのアミノ酸配列は天然型ウイルス核酸パッケージ
ングポリペプチドに限定されておらず、さらに例えば関連ウイルス／細菌タンパ
ク質、細胞ホモログ及び合成ペプチド、並びに例えばフラグメントのようなそれ
らの変異体又は誘導体のようなあらゆる起源から入手される相同配列が含まれる
ことは理解されるであろう。
【００２７】 本発明の状況においては、ウイルスコアポリペプチドと少なくとも１０、好ま
しくは少なくとも２０、３０、４０又は５０個のアミノ酸に渡ってアミノ酸レベ
ルで少なくとも６０、７０、８０又は９０％同一である、好ましくは少なくとも
９５又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むために、１つの相同配列、例えば
配列番号１として示されているＭｕ１配列を例として挙げている。特に、相同性
は典型的には非必須隣接配列ではなく核酸結合に対して必須であることが知られ
ている配列領域に関連すると見なすべきである。相同性は類似性の観点（即ち、
類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）で考えることもできるが、本発
明の状況においては配列同一性の点で相同性を示すことが好ましい。
【００２８】 相同性の比較は、目で見て、又はより普通には容易に入手できる配列比較プロ
グラムを用いて実施できる。これらの市販で入手できるコンピュータープログラ
ムは２種以上の配列間の相同率（％）を計算することができる。
【００２９】 相同率（％）は、隣接配列に渡って計算できる、即ち１つの配列が他の配列と
アラインメントさせられ、１回に１残基ずつ１つの配列内の各アミノ酸が他の配
列内の対応するアミノ酸と直接に比較される。これはいわゆる「ギャップを入れ
ない」アラインメントである。典型的には、このようなギャップを入れないアラ
インメントは相当に少数の残基（例えば、５０個未満の隣接アミノ酸）に渡って
のみ実施される。
【００３０】 これは極めて単純かつ一貫性のある方法ではあるが、例えばその他の点では同
一の対の配列では１個の挿入又は欠失が引続いてのアミノ酸残基がアラインメン
トから締め出されることを引き起こす、したがって総合的アラインメントが実施
されたときに相同率（％）における大きな低下を生じさせることを考慮に入れる
ことができない。その結果、大多数の配列比較法は総合相同性スコアへ不当にペ
ナルティーを科すことなく可能性のある挿入及び欠失を考慮に入れた最適なアラ
インメントを作り出すように設計されている。これは局所的相同性を最高化する
ことを試みて配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成さ
れる。
【００３１】 しかし、これらの相当に複雑な方法はアラインメントにおいて発生する各ギャ
ップに「ギャップペナルティ」を割り当てるので、同一数の同一アミノ酸につい
ては、２つの比較される配列間でより高度の関連性を反映して、可能な限り少な
いギャップを有する配列アラインメントが多数のギャップを有する配列アライン
メントより高いスコアを達成するであろう。典型的には、ギャップの存在に対し
て相当に高いコスト及びギャップ内の次の各残基に対するより小さなペナルティ
を課す「アフィンギャップコスト」が使用される。これは最も一般的に使用され
ているギャップ・スコアリングシステムである。高度のギャップペナルティは当
然ながらより少ないギャップを有する最適化されたアラインメントを作り出すで
あろう。ほとんどのアラインメントプログラムでは、ギャップペナルティの修正
を行うことができる。しかし、配列比較のためにそのようなソフトウエアを使用
するときにはデフォルト値を使用するのが好ましい。例えばＧＣＧウィスコンシ
ン・ベストフィットパッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔ）（下記
参照）を使用するときには、アミノ酸配列に対するデフォルトギャップペナルテ
ィはギャップに対しては−１２及び各伸長に対しては−４である。
【００３２】 このため最高相同率（％）の計算には、ギャップペナルティを考慮に入れて、
まず最初に最適アラインメントの作成が必要である。そのようなアラインメント
を実施するために適切なコンピュータープログラムは、ＧＣＧウィスコンシン・
ベストフィットパッケージ（ウィスコンシン大学、米国、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、
１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（核酸研究）１２：
３８７）である。配列比較を実行できるその他のソフトウエアの例には、ＢＬＡ
ＳＴパッケージ（上記のＡｕｓｕｂｅｌら、１９９９の第１８章を参照）、ＦＡ
ＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３−４１
０）及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較用ツール一式が含まれるが、それらに限定され
ない。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡはどちらもオフライン及びオンライン検索に利
用できる（上記のＡｕｓｕｂｅｌら、１９９９の第７−５８〜７−６０頁を参照
）。しかし、ＧＣＧベストフィットプログラムを使用するのが好ましい。
【００３３】 最終相同率（％）は同一性に関して測定できるが、アラインメントプロセス自
体は、典型的には全か無かの対比較には基づいていない。その代わりに、化学的
類似性又は進化的間隔に基づく各ペアワイズ比較へスコアを割り当てる計量類似
性スコアマトリックスが使用される。一般に使用されるそのようなマトリックス
の例はＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス−ＢＬＡＳＴプログラム一式のためのデフ
ォルトマトリックスである。ＧＣＧウィスコンシンプログラムは、一般に公衆デ
フォルト値又は供給されている場合は特注シンボル比較表のどちらかを使用する
（詳細についてはユーザー・マニュアルを参照）。ＧＣＧパッケージ用の公衆デ
フォルト値、又は他のソフトウエアの場合は例えばＢＬＯＳＵＭ６２のようなデ
フォルトマトリックスを使用するのが好ましい。
【００３４】 ソフトウエアが最適なアラインメントを作り出したら、相同率（％）、好まし
くは配列同一性率（％）を計算することができる。ソフトウエアは、これを配列
比較の一部として実行し、数値での結果を生成する。
【００３５】 本発明で使用するアミノ酸配列に関連する用語「誘導体」には、結果として生
じるアミノ酸配列が核酸結合及び凝縮活性を有する、好ましくは未修飾ポリペプ
チドと少なくとも同一の活性を有することを生じさせる、配列からの、又は配列
への１個（以上）のアミノ酸の配列からの、又は配列への置換、変化、修飾、交
換、欠失又は付加が含まれる。
【００３６】 ウイルスポリペプチドは本発明に使用するために修飾することができる。典型
的には、核酸結合及び配列の凝縮特性を維持する修飾が行われる。アミノ酸置換
は、例えば修飾された配列が核酸結合及び凝縮特性を保持することを条件に１、
２もしくは３〜１０、２０又は３０回の置換から行うことができる。アミノ酸置
換には、例えば治療用として投与されるポリペプチドの血漿中半減期を増加させ
るための非天然型アナログの使用を含むことができる。
【００３７】 特に、天然型ウイルスパッケージングポリペプチドの生理的ｐＨでの正味正電
荷を増加させるためにアミノ酸置換を行うことが望ましい場合がある。正荷電ア
ミノ酸にはアルギニン、リジン及びヒスチジンが含まれる。アルギニンは天然型
アミノ酸の中で最も高度に荷電しており、特に好ましい。
【００３８】
【表１】
【００３９】 同類置換は、例えば上記の表に従って行うことができる。第２欄内の同一ブロ
ック内かつ好ましくは第３欄における同一線上にあるアミノ酸は相互に置換する
ことができる。
【００４０】 本発明で使用するためのポリペプチドは、例えば下記で説明するような組換え
手段で作製できる。しかし、それらは例えば固相合成法のような当業者によく知
られている方法を使用して合成手段によって作製することもできる。本発明で使
用するためのポリペプチドは、さらにまた例えば抽出及び精製において役立つよ
うに融合タンパク質として生成することもできる。融合タンパク質パートナーの
例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡ
Ｌ４（ＤＮＡ結合及び／又は転写活性化ドメイン）及びβ−ガラクトシダーゼが
含まれる。さらにまた融合タンパク質配列を除去できるように融合タンパク質パ
ートナーと当該タンパク質配列との間のタンパク質分解性開裂部位を含めること
も便利である。好ましくは、融合タンパク質パートナーは当該配列のタンパク質
の生物学的活性を妨害しないであろう。
【００４１】 本発明で使用するためのポリペプチドは、実質的に単離形であってよい。これ
らのポリペプチドは、それらのポリペプチドの所期の目的を妨害しない担体又は
希釈剤と混合することができ、それでもなお実質的に単離されていると見なすこ
とができることは理解されるであろう。これらのポリペプチドはさらにまた、そ
の場合に調製物中のタンパク質の一般に９０％以上、例えば９５％、９８％又は
９９％が本発明で使用するためのポリペプチドを備えている実質的な精製形であ
ってよい。
【００４２】 ２．核内移行配列を含むポリペプチド ある好ましい実施形態では、本発明の送達ベクター／複合体はさらに核内移行
配列（ＮＬＳ）を含むポリペプチドを備えている。一般に、ＮＬＳｓは当分野に
おいてよく知られている（例えば、Ｄｉｎｇｗａｌｌ ａｎｄ Ｌａｓｋｅｙ，
１９９１，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１６：４７８−４８１を参
照）。しかし、アデノウイルスコアタンパク質ｐＶのＮＬＳを使用するのが特に
好ましい。ｐＶのＮＬＳはアミノ酸３１５−３３７に対応する配列ＲＰＲＲＲＡ
ＴＴＲＲＲＴＴＴＧＴＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号２）を有している（Ｄ．Ｍａｔ
ｔｈｅｗｓ、提出済み）。また別のＮＬＳがＮ−末端（ＫＰＲＫＬＫＲＶＫＫＫ
ＫＫ−配列番号３）に存在するが、Ｃ−末端ＮＬＳが好ましい。
【００４３】 ＮＬＳは、パッケージングポリペプチドへの個別ポリペプチド分子上又は例え
ば融合タンパク質中の同一ポリペプチド鎖の一部として存在している場合がある
。
【００４４】 Ｂ．目的とする核酸配列 本発明の送達ベクター又は複合体を使用して細胞へ送達することを目的とする
目的とする核酸配列（ＮＯＩ）はＤＮＡ又はＲＮＡを備えていてよい。それらは
一本鎖であっても二本鎖であってもよい。それらはさらにまた、それらの中に合
成又は修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレ
オチドへの多数の様々なタイプの修飾は当分野において知られている。これらに
はメチルホスフォネート及びホスホロチオエートバックボーン、分子の３’及び
／又は５’末端でのアクリジン又はポリリジン鎖の付加が含まれる。本発明のた
めには、ここで説明するポリヌクレオチドは当分野で利用できるいずれかの方法
によって修飾できると理解されるべきである。そのような修飾は、ＮＯＩのイン
ビボ活性又は寿命を増進又は延長させるために実施できる。
【００４５】 ＮＯＩは、典型的には異種遺伝子を含む。用語「異種遺伝子」にはあらゆる遺
伝子が含まれる。異種遺伝子は野生型遺伝子のいずれかの対立突然変異体であっ
ても、又は突然変異遺伝子であってもよい。用語「遺伝子」は、少なくとも転写
が可能な核酸配列を含むことが意図されている。したがって、ｍＲＮＡ、ｔＲＮ
Ａ及びｒＲＮＡ並びにアンチセンス構成体をコードする配列はこの定義の範囲内
に含まれる。核酸は、例えばリボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（Ｄ
ＮＡ）又はそのアナログであってよい。ｍＲＮＡをコードする配列は、任意で天
然の、又はさもなければ翻訳コーディング配列と関連している５’及び／又は３
’末端の転写されているが、しかし非翻訳フランキング配列の一部又は全部を含
むであろう。ｍＲＮＡをコードする配列は、さらにまた任意で転写された配列、
例えば転写終止シグナル、ポリアデニル化部位及び下流エンハンサーエレメント
と正常に関連している関連転写制御配列を含んでいてよい。
【００４６】 異種遺伝子の転写配列は、好ましくは、例えば中枢神経系や末梢神経系の細胞
のような神経細胞、癌細胞又は上皮細胞のような哺乳類細胞中での異種遺伝子の
発現を許容する制御配列に操作可能に連結されている。用語「操作可能に連結さ
れている」とは並列を意味するが、このときここで説明する成分はそれらがそれ
らの所定の方法で機能することを許容する関係にある。コーディング配列へ「操
作可能に連結されている」制御配列は、コーディング配列の発現が制御配列と適
合する条件下で達成されるような方法でが結紮される。
【００４７】 制御配列は、異種遺伝子の発現を許容するプロモーター及び転写を終了させる
ためのシグナルを含む。プロモーターは哺乳類、好ましくはヒト細胞中で機能性
であるプロモーターから選択される。プロモーターは、真核細胞遺伝子のプロモ
ーター配列に由来するものであってよい。例えば、それは異種遺伝子の発現が発
生する細胞、好ましくは哺乳類中枢神経系又は末梢神経系の細胞のゲノムに由来
するプロモーターであってよい。真核細胞プロモーターに関しては、それらはど
こにでもある方法で機能するプロモーター（例えばβ−アクチン、チューブリン
）、あるいはまた組織特異的方法で機能するプロモーター（例、ピルビン酸キナ
ーゼに対する遺伝子のプロモーター）であってよい。それらはさらにまた、特異
的刺激に応答するプロモーター、例えばステロイドホルモンレセプターに結合す
るプロモーターであってもよい。例えばモロニーマウス白血病ウイルスレトロウ
イルス（ＭＭＬＶＬＴＲ）プロモーター又はヘルペスウイルス遺伝子のプロモー
ターのようなウイルスプロモーターもまた使用することができる。
【００４８】 さらに異種遺伝子の発現レベルを細胞の生存期間中に調節できるようにプロモ
ーターを誘導できることも有益な可能性がある。誘導できるとは、プロモーター
を使用して入手される発現のレベルを調節できることを意味する。
【００４９】 さらに、例えばエンハンサー配列のようなまた別の調節配列を付加することに
よってこれらのプロモーターのいずれかを修飾することもできる。上記の２種以
上の相違するプロモーターからの配列エレメントを含むキメラプロモーターを使
用することもできる。さらにその上、遺伝子座制御領域（ＬＣＲｓ）の使用が望
ましい場合がある。
【００５０】 異種遺伝子は、典型的には治療用途のポリペプチドをコードするであろう。本
発明に従うと、適切なＮＯＩ配列は例えば下記のような治療用途及び／又は診断
用途の配列を含むが、それらに限定されない：サイトカイン類、ケモカイン類、
ホルモン類、抗体類、工学的免疫グロブリン様分子類、一本鎖抗体類、融合タン
パク質類、酵素類、免疫共刺激性分子類、免疫調節分子類、アンチセンスＲＮＡ
類、標的タンパク質類、毒素のトランス優性（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔ）陰
性突然変異体類、条件毒素類、抗原類、腫瘍サプレッサータンパク質類及び成長
因子類、膜タンパク質類、血管活性タンパク質類及びペプチド類、抗ウイルスタ
ンパク質類及びリボザイム類、並びにそれらの誘導体（例、関連レポーター群を
伴うような）をコードする配列。
【００５１】 治療使用のポリペプチドの例には、例えばパーキンソン病のような神経疾患の
治療のための治療薬としての可能性を有する神経成長因子（ＮＧＦ）、毛様体神
経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＮＴＦ）及びニューロトロフ
ィン（例、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５）が含まれる。
【００５２】 癌の治療又は予防において本発明で使用するために適切なＮＯＩには、下記で
あるタンパク質：標的細胞（例、リボソーム毒素）を破壊する、下記として機能
する：腫瘍サプレッサー（例、野生型ｐ５３）、抗腫瘍免疫機序のアクチベータ
ー（例、サイトカイン、共刺激分子及び免疫グロブリン）、血管形成の阻害剤、
又は、薬物感受性の強化を提供する（例、プロドラッグ活性化酵素）、天然エフ
ェクター細胞によって標的細胞の破壊を間接的に刺激する（例、免疫系を刺激す
る強力な抗原）又は標的細胞を破壊する毒性物質へ前駆物質を転換させる（例、
プロドラッグ活性化酵素）タンパク質をコードするＮＯＩが含まれる。コードさ
れたタンパク質は、バイスタンダー腫瘍細胞を破壊する（例、分泌された抗腫瘍
抗体−リボソーム毒素融合タンパク質を用いて）、バイスタンダー腫瘍細胞（例
、免疫系を刺激するサイトカイン又は局所血管閉塞を惹起する凝血促進性タンパ
ク質）の破壊を間接的に刺激する、又は前駆物質をバイスタンダー腫瘍細胞を破
壊する毒性物質（例、プロドラッグを核酸性薬物へ活性させる酵素）へ転換させ
ることができよう。
【００５３】 例えば腫瘍持続性のための細胞遺伝子の発現のような細胞又は病原菌遺伝子の
発現を妨害するアンチセンス転写体又はリボザイムをコードするＮＯＩ（ｓ）を
使用することができる（例えば、バーキットリンパ腫における異所性ｍｙｃ転写
体に対して、又は慢性骨髄性白血病におけるｂｃｒ−ａｂｌ転写体に対して）。
そのようなＮＯＩの組み合わせの使用もまた予想されている。
【００５４】 標的組織中で選択的に発現させる代わりに、又はそれとともに、ＮＯＩもしく
はＮＯＩｓは、それに酵素もしくは酵素が作用する１種以上のプロドラッグを用
いて個体が治療されるまでは重大な作用又は有害な作用を全く有していないプロ
ドラッグ活性化酵素もしくは酵素をコードすることができる。活性ＮＯＩの存在
下では、適切なプロドラッグを用いた個体の治療は腫瘍増殖又は生存の減少の増
進をもたらす。
【００５５】 プロドラッグ活性化酵素は、癌の治療のために腫瘍部位へ送達することができ
る。各場合において、患者の治療には適切なプロドラッグ活性化酵素と組み合わ
せて適切なプロドラッグを使用する。適切なプロドラッグはベクターと一緒に投
与する。プロドラッグの例には次のものが含まれる：エトポシドホスフェート（
アルカリホスファターゼと共に）、５−フルオロサイトシン（サイトシンデアミ
ナーゼと共に）、ドキソルビシン−Ｎ−ｐ−ヒドロキシフェノキシアセトアミド
（ペニシリン−Ｖ−アミダーゼと共に）、パラ−Ｎ−ビス（２−クロロエチル）
アミノベンゾイルグルタメート（カルボキシペプチターゼＧ２と共に）、セファ
ロスポリンナイトロジェンマスタードカルバメート（β−ラクタマーゼと共に）
、ＳＲ４２３３（Ｐ４５０ Ｒｅｄｕｃａｓｅと共に）、ガンシクロビル（ＨＳ
Ｖチミジンキナーゼと共に）、ニトロレダクターゼ及びシクロホスファミドと含
むマスタードプロドラッグ（Ｐ４５０と共に）。
【００５６】 本発明で使用するために適切なプロドラッグ活性化酵素の例には、５−フルオ
ロ−ウラシルプロドラッグであるカプセタビン及びフルツロンを活性化するチミ
ジンホスフォリラーゼ、ガンシクロビルを活性化する単純ヘルペスウイルス由来
のチミジンキナーゼ、例えばシクロホスファミドのようなプロドラッグをＤＮＡ
損傷薬へ活性化するチトクロームＰ４５０、及び５−フルオロシトシンを活性化
するシトシンデアミナーゼが含まれる。好ましくは、ヒト起源の酵素を使用する
。
【００５７】 ＮＯＩはさらにまたワクチンとして使用するための抗原性ポリペプチドをコー
ドすることもできる。好ましくは、そのような抗原性ポリペプチドは、例えば細
菌又はウイルスのような病原微生物に由来する。そのような抗原性ポリペプチド
の例には、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、Ｂ型肝炎表面抗原もしくはコア抗原、ＨＩＶ
抗原、百日咳毒素、コレラ毒素又はジフテリア毒素が含まれる。
【００５８】 ＮＯＩはさらにまたマーカー遺伝子（例、β−ガラクトシダーゼ又は緑色蛍光
タンパク質をコードするもの）又はそれらの産物が他の遺伝子の発現を調節する
遺伝子（例、転写調節因子）を含むことができる。
【００５９】 疾患が欠陥遺伝子によって惹起される場合は、例えば嚢胞性線維症の症例にお
けるように、遺伝子の十分に機能的な対立遺伝子をコードするＮＯＩを投与する
ことができる。様々な遺伝障害についての分子的基礎は同定されており、野生型
機能的配列がクローニングされている。相同的組換えによって欠陥遺伝子を交換
できるように、治療的遺伝子へのＮＯＩフランキング配列にはゲノム内の対応す
るフランキング配列に対して相同である配列を含めることが望ましい可能性があ
る。
【００６０】 遺伝子療法及びその他の治療用途は複数の遺伝子の投与を明確に必要とする可
能性がある。複数の遺伝子の発現は様々な状態の治療のために有益な場合がある
。本発明の送達ベクター又は複合体内に組み込むことのできるＮＯＩのサイズに
制限はないので、同時に複数の遺伝子を含む細胞を標的とすることは可能なはず
である。
【００６１】 Ｃ．カチオン性脂質 当分野においては様々なカチオン性脂質が知られている−例えばその開示が参
照して組み込まれており、その一部は下記に再現されているＷＯ９５／０２６９
８を参照。本発明において有用なカチオン性脂質の構造の例はＷＯ９５／０２６
９８の表１に提供されている。一般に、一価又は多価のいずれであっても、あら
ゆるカチオン性脂質を本発明の組成物及び方法において使用できる。多価カチオ
ン性脂質が一般に好ましい。カチオン性脂質の例には飽和及び不飽和アルキル及
びアミンの脂環式エーテル及びエステル、アミド又はそれらの誘導体が含まれる
。カチオン性脂質の直鎖及び側鎖アルキル及びアルケン基は１〜約２５炭素原子
を含むことができる。好ましい直鎖又は側鎖アルキル又はアルケン基は６個以上
の炭素原子を有する。脂環基は約６〜３０個の炭素原子を含有することができる
。好ましい脂環基はコレステロール及びその他のステロイド基を含む。カチオン
性脂質は、特に次のものを含む様々な対イオン（アニオン）を用いて調製できる
：塩化物、臭化物、ヨウ化物、フッ化物、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、硫酸塩
、亜硝酸塩及び硝酸塩。
【００６２】 よく知られているカチオン性脂質は、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ
プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）であ
る。
【００６３】 ＤＯＴＭＡ及び類似ジエステルＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ
）−３（トリメチルアンモニウム）プロパン）は市販で入手できる。ＤＯＴＭＡ
に構造的に関連している追加の脂質は、参照してここに組み込まれる米国特許第
４，８９７，３５５号に開示されている。
【００６４】 ＤＯＴＭＡ及びＤＯＴＡＰに関連するまた別のカチオン性脂質の有用な群は、
一般にいわゆるＤＯＲＩエーテル及びＤＯＲＩエステルである。ＤＯＲＩ脂質は
ＤＯＴＭＡ及びＤＯＴＡＰとは、トリメチルアンモニウム基のメチル基の１つが
ヒドロキシエチル基と置換されている点が相違している。ＤＯＲＩ脂質のオレオ
イル基は、たとえばパルミトイル基もしくはステアロイル基のような他のアルキ
ル基又はアルケン基と置換することができる。ＤＯＲＩ型脂質のヒドロキシル基
は、例えばカルボキシスペルミンのようなアミンへのエステル化のためのような
また別の機能化のための部位として使用することができる。
【００６５】 本発明の送達ベクター又は複合体として使用できるまた別のカチオン性脂質に
は、細胞のトランスフェクションのために有用であるようなＷＯ９１／１５５０
１に記載されているものが含まれる。
【００６６】 その中でコレステロールがトリアルキルアンモニウム基に連結されている例え
ば３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロ
ール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）もまた本発明において使用できる。ＤＣ−Ｃｈｏｌは、
一部の細胞系に対してはＤＯＴＭＡ含有リポソームより効率的なトランスフェク
ション及びより低い毒性を提供すると報告されている。ＷＯ９７／４５４４２に
記載されているもののようなＤＣ−Ｃｈｏｌポリアミン変異体もまた使用できる
。
【００６７】 カルボキシスペルミンを含有するポリカチオン性脂質もまた本発明の送達ベク
ター又は複合体として有用である。欧州特許第Ａ−３０４１１１号は、５−カル
ボキシスペルミルグリシンジオクタデシル−アミド（ＤＯＧＳ）及びジパルミト
イルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミルアミド（ＤＰＰ
ＥＳ）を含むカチオン性脂質を含有するカルボキシスペルミンを記載している。
追加のカチオン性脂質はＤＯＧＳ及びＤＰＰＥＳのオクタデシル基及びパルミト
イル基を各々他のアルキル基又はアルケン基と置換することによって入手できる
。
【００６８】 本発明の送達ベクター又は複合体においては、カチオン性脂質はリポソーム又
は脂質凝集体を形成するために任意で非カチオン性補脂質、好ましくは中性脂質
と組み合わせることができる。本発明において有用な中性脂質は特に次の脂質で
ある：レシチン、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、
ＰＯＰＥ（パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン）及びＤＳ
ＰＥ（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）のようなホスファチジ
ルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファ
チジルコリン）、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）、ＰＯＰＣ
（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）及びＤＳＰＣ（ジステアロイ
ルホスファチジルコリン）のようなホスファチジルコリン、ホスファチジルグリ
セロール、ＤＯＰＧ（ジオレオイルホスファチジルグリセロール）、ＤＰＰＧ（
ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）、及びＤＳＰＧ（ジステアロイル
ホスファチジルグリセロール）のようなホスファチジルグリセロール、ジオレオ
イル−又はジパルミトイルホスファチジルセリンのようなホスファチジルセリン
、ジホスファチジルグリセロール、脂肪酸エステル、グリセロールエステル、ス
フィンゴ脂質、カルドリピン、セレブロシド、及びセラミド、及びそれらの混合
物。中性脂質にはさらにコレステロール及びその他の３ＤＯＨ−ステロールが含
まれる。
【００６９】 さらに本発明の送達ベクター又は複合体においては、表面特性を変更するため
に１種以上の両親媒性化合物を任意に組み込むことができる。本発明において有
用な両親媒性化合物には、特に次のものが含まれる：図２２に示されているＧＬ
Ｕ４及びＧＬＵ７のようなネオ糖脂質、Ｎ−（ω−メトキシ（ポリオキシエチレ
ン）オキシカルボニル）−ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−モノメトキシ
（ポリオキシエチレン）スクシニルホスファチジルエタノールアミン及びポリオ
キシエチレンコレステリルエーテルのようなポリエチレングリコール脂質、アル
キルグリコシド、アルキルメチルグルカミド、スクロースエステル、アルキルポ
リグリセロールエーテル、アルキルポリオキシエチレンエーテル及びアルキルソ
ルビタンオキシエチレンエーテル及びステロイドオキシエチレンエーテルのよう
な非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコ
ポリマーのようなブロックコポリマー。
【００７０】 ある態様では、本発明のカチオン性脂質は、糖部分又はポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）部分を用いて修飾させられる。また別の態様では、本発明の複合体
はさらにカチオン性脂質として機能することのできる化合物を含むが、その化合
物はアミン基を通してそれに連結されているコレステロール基、糖部分又はポリ
エチレングリコール部分を備えている。実施例で示されているように、我々はそ
のような糖／ＰＥＧ修飾カチオン性脂質が特に有益であることを発見した。した
がってまた別の態様では、本発明はカチオン性脂質として機能することのできる
化合物を提供するが、その化合物はアミン基を通してそれに連結されているコレ
ステロール基、糖部分又はポリエチレングリコール部分を備えている。好ましく
は、その化合物は１〜７個の糖部分又はポリエチレングリコール部分を備えてい
る。その化合物は糖部分とポリエチレングリコール部分の混合物を含むことがで
きる。好ましくは、糖部分はグルコース又はＤ−グルコースである、又はそれら
に由来する。
【００７１】 Ｄ．カチオン性脂質／ＮＯＩ／パッケージングポリペプチド複合体 本発明の送達ベクター／複合体は、典型的にはまず最初にパッケージングポリ
ペプチド及びＮＯＩを室温の無菌試験管内で約１０分間接触させることによって
作製され、その結果として凝縮ポリペプチド／ＮＯＩ複合体が生じる。一般的方
法は、試験管内に核酸及びタンパク質を相互に平行して、しかし接触させずにス
ポットし、さらに例えば数百マイクロリットルの薬学的に許容できる担体、賦形
剤又は希釈剤のような液状担体を添加することによって混合を開始することであ
る。
【００７２】 本発明の送達ベクター／複合体を調製するまた別のかつ好ましい方法は、ボル
テックスミキサーで連続的に攪拌している間にパッケージングポリペプチドとＮ
ＯＩとを接触させることによる方法である。
【００７３】 典型的には、少なくとも１：１、好ましくは１：１から２：１、より好ましく
は１．４：１から１．９：１、より好ましくは１．５：１から１．８：１のＮＯ
Ｉ対ポリペプチドの比率を使用する。我々は、約１：０．６（〜１．７：１のＮ
ＯＩ対ポリペプチドの比率が特に有効であることを発見した。一部の態様では、
典型的には０．２〜１．５、好ましくは０．３〜１．２（ｗ／ｗ）、より好まし
くは０．５〜０．７のポリペプチド対ＮＯＩの比率を使用する。他の実施形態で
は、典型的にはポリペプチド対ＮＯＩの比率は少なくとも１０：１、又は少なく
とも２０：１（ｗ／ｗ）である。しかし、最適な比率はパッケージングポリペプ
チドの電荷：アミノ酸比に依存する可能性がある。一般に、電荷：アミノ酸比が
低ければ低いほど、高いポリペプチド対ＮＯＩの比率を使用する。
【００７４】 次に、カチオン性脂質を複合体へ添加する。カチオン性脂質は、ある実施形態
では、例えばＤＣ−Ｃｈｏｌ及びＤＯＰＥのような２種以上の脂質成分を含む前
形成リポソームの一部であってよい。カチオン性脂質は、典型的には室温で約２
０分間に渡ってポリペプチド／ＮＯＩ複合体と一緒にインキュベートする。カチ
オン性脂質を添加するまた別のかつ好ましい方法は、カチオン性リポソーム懸濁
液の形態である。この最終複合体は、使用時まで１０％スクロース（ｗ／ｖ）を
添加して約−８０℃で保存することができる。
【００７５】 リポソーム量対ＮＯＩは、典型的には約３：１から２０：１、好ましくは６：
１から１５：１、より好ましくは８：１から１４：１である。我々は１２：１の
リポソーム対ＮＯＩの比率が特に有効であることを発見した。他の実施形態では
リポソーム量対ＮＯＩは、典型的には約２：１から１０：１又は３：１から６：
１である。カチオン性脂質を中性脂質と一緒に使用する場合は、その比率は典型
的には約１：１である。
【００７６】 高度に好ましい実施形態での比率は下記の通りである。
【００７７】
【表２】
【００７８】 送達ベクター／複合体はこれで使用準備が整う。上記の順で種々の成分を混合
するのが好ましいが、あらゆる順序でそれらの成分を結合することが可能である
。また別のポリペプチド成分を添加しなければならない場合は、それらはいずれ
の段階で添加することもできるが、好ましくはパッケージングポリペプチドと一
緒に添加する。
【００７９】 ベクター／複合体に細胞タイプに対するある程度の選択性を提供するために、
ベクター／複合体内に例えば細胞表面レセプターへ結合するリガンドのような他
の成分を含めるのが望ましい場合がある。リガンドには、ペプチド、糖タンパク
質、オリゴ糖、レクチン及び抗体並びにそれらのフラグメントが含まれる。
【００８０】 Ｅ．投与 本発明の送達ベクター／複合体は、医薬組成物（ヒト又は動物に使用できる）
を生成するために好ましくは薬学的に許容できる担体又は希釈剤と結合する。適
切な担体及び希釈剤には、例えば、リン酸緩衝食塩液のような等張性生理食塩液
が含まれる。本発明の組成物は直接注射によって投与できる。組成物は、非経口
、筋肉内、静脈内、皮下、眼内もしくは皮内投与又は吸入用に調製することがで
きる。典型的には、各ＮＯＩは１０ｎｇ〜１０μｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは
０．１ｎｇ〜１０μｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１ｎｇ〜１μｇ／ｋｇ（体重
）の用量で投与することができる。
【００８１】 あるいはまた、患者の細胞のトランスフェクションを患者の組織の除去、本発
明の送達ベクター／複合体を使用したトランスフェクション、及びその後にトラ
ンスフェクトされた組織の再移植によってエクスビボで実施することができる。
【００８２】 上記の投与経路及び用量は、当業者であればあらゆる特定の患者及び状態のた
めの最適の投与経路及び用量を容易に決定することができるので、１つの指針と
することだけを目的としている。
【００８３】 Ｆ．使用 本発明の送達ベクター／複合体は、ＮＯＩを用いて真核細胞、特に哺乳類細胞
を効率的にトランスフェクションするために使用できる。送達ベクター／複合体
は、神経細胞をトランスフェクションすることにおいて先行技術組成物と比較し
て特に効率的であることが証明されている。これは、（ｉ）神経細胞を使用する
研究のため、及び（ｉｉ）ＮＯＩをヒト又は動物の中枢又は末梢神経系の細胞内
へ導入することが望ましい臨床用途のために特別に重要な意味を有している。よ
り一般的には、本発明の送達ベクター／複合体は、例えば遺伝子療法、ＤＮＡワ
クチン送達及びインビトロトランスフェクション研究のような様々なＮＯＩ送達
用途において使用できる。
【００８４】 本発明の送達ベクター／複合体を使用する治療のための標的にすることのでき
る疾患の例には、神経変性性疾患及び傷害／外傷（脳卒中を含む）の結果として
の神経組織の損傷のような末梢又は中枢神経系の疾患が含まれる。特に、神経変
性性疾患には、運動ニューロン疾患、例えば家族性自律神経失調症及び乳児脊髄
性筋萎縮症のような数種の遺伝性疾患、及び例えばパーキンソン病及びアルツハ
イマー病のような晩発性神経変性性疾患が含まれる。
【００８５】 本発明の送達ベクター／複合体は、さらにまた悪性腫瘍に苦しむ患者へ治療的
遺伝子を投与するためにも使用できる。治療の標的とすることのできる悪性腫瘍
の例には、乳癌、子宮癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、肺癌、卵巣癌
、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、膀胱癌、ＣＮＳ癌、食道癌、頭部又は頸部
癌、肝臓癌、精巣癌、胸腺癌又は甲状腺癌が含まれる。血球、骨髄細胞、Ｂ−リ
ンパ球、Ｔ−リンパ球、リンパ球性前駆細胞又は骨髄細胞前駆細胞の悪性腫瘍も
また治療の標的とすることができる。
【００８６】 腫瘍は充実性腫瘍であっても非充実性腫瘍であってもよく、さらに原発性腫瘍
であっても播種性転移性（続発性）腫瘍であってもよい。非充実性腫瘍には、骨
髄腫、急性骨髄芽球性、急性前骨髄性、急性骨髄単球性、急性単球性、赤白血病
のような白血病（球性又は慢性、リンパ球性又は骨髄性）、及び例えばホジキン
病、非ホジキン病及びバーキット病のようなリンパ腫が含まれる。充実性腫瘍に
は、胃癌、結腸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、腺癌、黒色腫、基底又は扁平上
皮癌、中皮腫、腺癌、神経芽細胞腫、神経膠腫、星状細胞腫、骨芽細胞腫、網膜
芽細胞腫、肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨原性肉腫、肝臓癌及び精上
皮腫が含まれる。
【００８７】 その他の目的とする疾患には、例えば嚢胞性線維症、サラセミア症等のような
正常細胞遺伝子中の遺伝性又は体細胞の突然変異によって惹起される疾患が含ま
れる。
【００８８】 さらにまた別の当該領域には、例えば移植臓器拒絶及び自己免疫反応のような
免疫関連疾患の治療が含まれる。自己免疫疾患の範囲は、臓器特異的疾患（例、
甲状腺炎、インスリン炎、多発性硬化症、虹彩毛様体炎、ブドウ膜炎、精巣炎、
肝炎、アジソン病、重症筋無力症）から例えば慢性関節リウマチ及び他のリウマ
チ障害、又は紅斑性狼蒼のような全身性疾患に及ぶ。その他の疾患には、特にヒ
スタミン産生に関連する反応である例えばアレルギー反応及び喘息のような免疫
過敏性が含まれる。
【００８９】 以下に、例示することを目的として限定することは意図していない下記の実施
例によって本発明を具体的に説明する。
【００９０】 ［図１から６の詳細な説明］ ＜図１−アデノウイルスコアタンパク質Ｍｕ１はプラスミドＤＮＡを結合するこ
とに関してポリオーマウイルスコアタンパク質Ｖｐ１よりもより有効である＞ Ａ）ＢＳＡはｐＤＮＡの電気泳動度へ影響を及ぼさない。１マイクログラムの
ｐＣＭＶβを０μｇ（レーン２）、５μｇ（レーン３）、１０μｇ（レーン４）
、１５μｇ（レーン５）、２０μｇ（レーン６）、２５μｇ（レーン７）及び３
０μｇ（レーン８）のＢＳＡと一緒に１Ｘ ＨＢＳ中で室温で１０分間インキュ
ベートした。サンプルをその後、移動度の変化について１％アガロースゲル上で
分析した。ＢＳＡによる電気泳動度の変化は検出されなかった。
【００９１】 Ｂ）ＢＳＡとは対照的に、Ｍｕ１ペプチドはｐＤＮＡの移動度を劇的に妨害し
た。ｐＣＭＶβ（１μｇ）を０．２５μｇ（レーン２）、０．５μｇ（レーン３
）、１μｇ（レーン４）、２μｇ（レーン４）、４μｇ（レーン６）、６μｇ（
レーン７）及び０μｇ（レーン８）の組換えＭｕ１と一緒にＡにおけると同様に
インキュベートした。０．２５（ｗ／ｗ）のタンパク質：ｐＤＮＡの比率（レー
ン２）はｐＣＭＶβのリラックス型移動を変化させなかったが（上方のバンド）
、スーパーコイルｐＤＮＡの軽微な遅延は所見された（下方のバンド）。しかし
、０．５（ｗ／ｗ）以上の比率を使用すると、ｐＤＮＡの両方の形態の移動が重
度に遅延させられた。
【００９２】 Ｃ）ポリオーマウイルスタンパク質Ｖｐ１は、ｐＤＮＡ移動を妨害することに
関してはるかに有効ではなかった。ｐＣＭＶβ（１μｇ）を２μｇ（レーン２）
、４μｇ（レーン３）、６μｇ（レーン４）、８μｇ（レーン５）、１６μｇ（
レーン６）、３２μｇ（レーン７）及び０μｇ（レーン８）のＶｐ１と一緒にイ
ンキュベートした。６以上の比率（タンパク質：ｐＤＮＡ、ｗ／ｗ）だけがスー
パーコイルｐＤＮＡの有意な遅延を惹起した（レーン６、下方のバンド）。さら
に、３２の比率（ｗ／ｗ）まではリラックス型ｐＤＮＡへの影響は見られなかっ
た（レーン７、上方のバンド）。全ゲルにおいて、レーン１は１Ｋｂ ＤＮＡマ
ーカー（ＢＲＬ製）に対応している。
【００９３】 ＜図２−ｐＤＮＡ−Ｍｕ１−カチオン性リポソーム複合体を用いてトランスフェ
クションされたＮＤ７細胞中のβガラクトシダーゼ活性＞ トランスフェクションの２４時間前に、２４ウェル培養プレートにおいて５×
１０4ｃｅｌｌｓ／ウェルの密度でＮＤ７細胞を播種した。トランスフェクショ
ンの直前に、細胞は無血清培地中で洗浄した。複合体は、カチオン性リポソーム
ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥの添加前にｐＣＭＶβをＭｕ１と一緒にインキュベー
トすることによって形成した。各場合において、１μｇのｐＣＭＶβを０．６、
６、１２及び２１μｇのＭｕ１ペプチドと複合させた。その後これらの組み合わ
せ各々を３、４及び６μｇのＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥと一緒に複合させた。Ｎ
Ｄ７細胞は２時間に渡ってトランスフェクション複合体に暴露させ、さらに採取
前に２４時間に渡って３７℃、５％ＣＯ2下で維持し、β−ガラクトシダーゼ酵
素活性のために処理した。数字は平均値±ＳＤを表わしており、ｎ＝３である。
【００９４】 ＜図３−Ｍｕ１は神経細胞系ＮＤ７中のカチオン性リポソーム媒介性トランスフ
ェクション効率を増進する＞ ＮＤ７ニューロンを４×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェルの密度で２４ウェル培養プ
レートにおいてプレーティングし、２４時間増殖させた。その後未分化ＮＤ７ニ
ューロンをｐＣＭＶｂ単独（Ａ）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥと複合させたｐＣ
ＭＶｂ（１／３、ｗ／ｗ）（Ｂ）又はＭｕ１及びＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥと複
合させたｐＣＭＶｂ（１／１２／６、ｗ／ｗ）（Ｃ）のいずれかを用いてトラン
スフェクションした。４８時間後、細胞を固定し、Ｘ−Ｇａｌの組織化学的検出
のために処理した。パネルＣから読み取れるように、最適比での複合体内へのＭ
ｕ１の包含はＸ−Ｇａｌ陽性細胞（青色）の数を重大に増加させた。
【００９５】 ＜図４−Ｍｕ１はＶｐ１に比較してＮＤ７細胞中のカチオン性リポソーム媒介性
トランスフェクション効率を増進することに関してより有効である＞ ｐＣＭＶβプラスミドＤＮＡを様々な量のポリカチオン性ペプチドへ複合させ
、その後１：３の比率でカチオン性リポソームと混合した（ｐＣＭＶβ：リポソ
ーム、ｗ／ｗ）。無血清培地中で簡単に洗浄した後、ＮＤ７細胞を２時間に渡っ
てリポソーム−ポリカチオン性リポソーム複合体へ暴露させ、その後血清含有培
地へ戻した。２４時間後、細胞を採取し、β−ガラクトシダーゼ酵素活性のため
に処理した。各条件を３回ずつ実施し、各実験は３回ずつ反復した。数値は平均
値±ＳＤを表わしている。
【００９６】 ＜図５−Ｍｕ１はＣＯＳ７細胞中のＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥトランスフェクシ
ョンを増進する＞ ＣＯＳ細胞をトランスフェクションの２４時間前に２４ウェル培養プレートに
おいて密度６０〜８０％のコンフルエンスな状態に播種した。トランスフェクシ
ョンの直前に、細胞は無血清培地中で洗浄した。カチオン性リポソームＤＣ−Ｃ
ｈｏｌ／ＤＯＰＥの添加前にｐＣＭＶβをＭｕ１と一緒にインキュベートするこ
とによって細胞トランスフェクションが可能な複合体を形成した。各場合におい
て、１μｇのｐＣＭＶβをＮＤ７細胞に対して最適であることが発見されていた
１２μｇのＭｕ１ペプチドと複合させた。その後ｐＣＭＶβ：Ｍｕ１複合体を３
、４及び６μｇのＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥと複合させた。ＣＯＳ細胞は２時間
に渡ってトランスフェクション複合体に暴露させ、さらに採取前にさらに２４時
間に渡って３７℃、５％ＣＯ2の存在下で維持し、β−ガラクトシダーゼ酵素活
性のために処理した。数字は平均値±ＳＤを表わしており、ｎ＝３である。
【００９７】 ＜図６−ｐＣＭＶβ−Ｍｕ１−カチオン性リポソーム複合体を用いた分化ＮＤ７
細胞中のトランスフェクション効率＞ ＮＤ７細胞は標準増殖培地（＋血清）を入れた２４ウェル培養プレートにおい
て４×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェルの密度でプレーティングした。２４時間後、培
地を分化培地と取り替え、細胞をさらに２４時間増殖させた。３種の分化培地を
使用した：無血清（−血清）、標準増殖培地＋１ｍＭ ｃＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、
又は還元培地（０．５％）＋１ｍＭ ｃＡＭＰ＋５０ｎｇ／ｍＬの神経成長因子
（ＮＧＦ）。細胞はその後、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ単独又はＭｕ１＋ＤＣ−
Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥのどちらかと複合させたｐＣＭＶｂを用いてトランスフェク
ションさせた。４８時間後、細胞を固定し、Ｘ−Ｇａｌ組織化学検査のために処
理し、陽性細胞のパーセンテージを測定した。全部の場合において、Ｍｕ１の存
在は陽性細胞の数を増加させた。興味深いことに、トランスフェクションされた
細胞数はｃＡＭＰで増殖させた細胞についてＭｕ１を含む場合も含まない場合も
どちらも多かった。
【００９８】 ［実施例］ ＜材料及び方法＞ ペプチド合成 ペプチドのＶｐ１及びＭｕ１は５倍過剰の（９−フルオレニル）メトキシカル
ボニル（Ｆｍｏｃ）−保護Ｌ−アミノ酸（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ製）及びアミ
ド結合剤としてのＦａｓｔＭｏｃ（商標）試薬２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール
−１−イル）−１，１，３，３−テトラ−メチルウロニウムヘキサフルオロホス
フェート／ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ）（Ａｄｖａｎ
ｃｅｄ Ｃｈｅｍｏｔｅｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ製）を使用してＳＨｉｍａｄｚｕ
ＰＳＳＭ−８固相ペプチドシンセサイザー上で合成した。樹脂の開裂及び保護除
去後に、０．５−０．７５ｍＬ／ｍｉｎの流速で溶離剤として０．１％水性ＴＦ
Ａを使用してＦＰＬＣシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ ＵＫ製）ヘ取り付けたＰ２ Ｂｉｏｇｅｌ（２×２８ｃｍ、Ｂｉｏ
ｒａｄ製のカラムを使用するゲル浸透法によって脱塩を実施した。最終分離用逆
相精製は、Ｇｉｌｓｏｎ ＨＰＬＣシステム（Ａｎａｃｈｅｍ製）へ取り付けた
Ｖｙｄａｃカラム（Ｃ１８、５μｍ、２×２５ｃｍ、Ｈｉｃｈｒｏｍ製）を用い
て達成した。ペプチドは、０．１％水性ＴＦＡ中のアセトニトリルの線形勾配に
よって５ｍＬ／ｍｉｎで溶離し、溶離は２２０−２３０ｎｍで監視した。
【００９９】 Ｖｐ１ペプチドは、前配合Ｌ−Ｐｒｏ−２−クロロトリチル超酸不安定性樹脂
（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ製）（１００ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ／ｇ、０．１ｍ
ｍｏｌ）を使用して調製した。第６（Ｌｙｓ）からＮ−末端残基までの全アミノ
酸残基を組み込むために長い結合時間を使用した。ジメチルホルムアミドにおけ
るピペリジン（２０％、ｖ／ｖ）を用いた自動Ｎ−末端Ｆｍｏｃ保護除去の後、
樹脂を単離し、ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）及びメタノール（１５ｍＬ）
を用いて洗浄し、その後真空中で乾燥させた。粗ペプチドは、フェノール（７％
、ｗ／ｖ）、エタンジチオール（２％、ｖ／ｖ）、チオアニソール（４％、ｖ／
ｖ）及び水（４％、ｖ／ｖ）を含有する氷温に冷却したＴＦＡ（８ｍＬ）（混合
液Ａとして知られている）を使用して樹脂から開裂させ、その後氷温のメチル−
ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）（３０ｍＬ）を用いて沈降させた。結果
として生じたペレットをその後脱塩させ、粗ペプチド混合物を逆相ＨＰＬＣによ
って精製した。溶離後、所望のペプチドを含有する分画（アセトニトリル６８．
５％，ｖ／ｖを用いて溶離する）を結合し、凍結乾燥させて白色粉末としてのペ
プチドを得た。総収量：３２ｍｇ（１５μｍｏｌ、１５％）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ
−ＴＯＦ）Ｃ85Ｈ151Ｎ26Ｏ26Ｓ3：［Ｍ＋Ｈ］+ 計算値２０４９．５、実測値
２０５０．２。配列はアミノ酸組成及び配列解析によって確認した。同質性はＨ
ＰＬＣ解析によって＞９５％であると判定された。
【０１００】 Ｍｕ１ペプチドはＧｌｙ−Ｗａｎｇ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ製）（４０
ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ／ｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を使用して調製した。全体を
通して標準結合時間を使用した。上記と同様に自動Ｎ−末端Ｆｍｏｃ保護除去の
後、樹脂を単離してジクロロメタン（２０ｍＬ）及びメタノール（２０ｍＬ）を
用いて洗浄し、その後樹脂を真空中で乾燥させた。粗ペプチドは、すべて上記と
同様に混合液Ａ（８ｍＬ）を用いて樹脂から開裂させ、ＭＴＢＥ（３０ｍＬ）を
用いて沈降させた。最後に、粗ペプチド混合物を脱塩させ、逆相ＨＰＬＣによっ
て精製した、溶離後、所望のペプチドを含有する分画（アセトニトリル１７．２
％を用いて溶離する）を結合し、凍結乾燥させて白色粉末としてのペプチドを得
た。総収量：６５ｍｇ（２６μｍｏｌ、８０％）、ＭＳ（ＥＳ）Ｃ95Ｈ170Ｎ52
Ｏ21Ｓ2：［Ｍ＋Ｈ］+ 計算値２４４０．７、実測値２４４０．７。同質性はＨ
ＰＬＣ解析によって＞９５％であると判定された。
【０１０１】 ＤＮＡ結合分析 精製したペプチドを３ｍｇ／ｍＬで無菌蒸留水Ｈ2Ｏ中で再構成させた。ペプ
チド及びｐＤＮＡを室温で２０分間かけて２０μＬ ＨＥＰＥＳ緩衝液（１３７
ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．７５ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１９ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中で複合させた。ペプチド：ｐＤＮＡ複合体を引続いて
アガロースゲル電気泳動法（１％）によって分析した。一般高分子ｐＤＮＡ相互
作用についての対照インキュベーションは様々な量の分子生物学等級の精製ウシ
血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ製）を用いて実施した。
【０１０２】 細胞培養 ＮＤ７ｓは、神経芽細胞種（Ｎ１８Ｔｇ２）とラット新生児感覚ニューロンと
の融合に由来する明確に特徴付けられた細胞系である28。この細胞系は、３７℃
及び５％ＣＯ2の存在下での標準増殖培地（ＮＧＭ）（１０％ウシ胎児血清（Ｂ
ＲＬ製）、４ｇ／Ｌグルコース、４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム（ＢＲＬ製）、１０
０ＩＵ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（ＢＲＬ製）で強化されたレーボ
ヴィッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ）Ｌ−１５培地（ＢＲＬ製））中で維持した
。細胞は、２４時間後に７０％のコンフルエンスを産生する密度で２４ウェルプ
レート（Ｃｏｓｔａｒ製）上でプレーティングした。
【０１０３】 ＮＤ７細胞の分化は、以前に報告した３種の方法を使用して実施した28,29。
ＮＤ７細胞は、ＮＧＭを入れた２４ウェル培養プレート（Ｎｕｎｃ製）において
４×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェルの密度で播種した。２４時間後、培地を次のいず
れかと取り替えた：ａ）１ｍＭ アデノシン３’：５’−環状モノリン酸塩（ｃ
ＡＭＰ、Ｓｉｇｍａ製）、又はｂ）無血清分化培地（５０％ Ｈａｍｓ Ｆ１２
、５０％ ＤＭＥＭ、５μｇ／ｍＬ トランスフェリン、２５０ｎｇ／ｍＬ イ
ンスリン、０．３μＭ 亜セレン酸ナトリウム）、又はｃ）低血清神経成長因子
（ＮＧＦ）培地（２ｍＭ グルタミン、４ｇ／Ｌ グルコース、４ｇ／Ｌ 重炭
酸ナトリウム、１０μ／ｍＬ ペニシリン、１０ｇ／ｍＬ ストレプトマイシン
、０．５％ ＦＣＳ、１ｍＭ ｃＡＭＰ、５０ｎｇ／ｍＬ ＮＧＦを補給したＬ
−１５（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ製））。分化ＮＤ７細胞は、トランスフェク
ションの前に３７℃、５％ ＣＯ2の存在下で２４時間に渡って適切な培地中で
増殖させた。
【０１０４】 ＣＯＳ−７細胞（サバンナモンキー（Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｎｋｅｙ）の腎臓に由
来する）は、１０％ウシ胎児血清（ＢＲＬ製）及び１００ＩＵ／ｍＬ ペニシリ
ン／ストレプトマイシン（ＢＲＬ製）を補給したＲＰＭＩ １６４０培地（ＢＲ
Ｌ製）中で増殖させた。
【０１０５】 プラスミド構成体 すべてのトランスフェクションに、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモー
ター／エンハンサーの大腸菌β−ガラクトシダーゼ下流に対する全長配列を含有
するレポータープラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製、パロアルト、カリ
フォルニア州）を利用した。プラスミドＤＮＡのストックは、標準分子クローニ
ング技術を使用して調製し、Ｑｉａｇｅｎ エンドトキシン無含有プラスミド精
製システム（Ｑｉａｇｅｎ製、ドーキング、英国）を使用して精製した。
【０１０６】 リポソーム ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥリポソームは以前に報告した通りに調製した30,31
。手短には、窒素下で新たに蒸留したＣＨ2Ｃｌ2（５ｍＬ）ヘ６μｍｏｌのＤＣ
−Ｃｈｏｌ及び４μｍｏｌのＤＯＰＥ（ＣＨＣｌ3中に１０ｍｇ／ｍＬで補給し
た）を添加した。５ｍＬの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．８）を混合液へ添加
し、これを３分間に渡り超音波処理した。有機溶媒を減圧下で除去し、結果とし
て生じたリポソーム懸濁液をさらに３分間に渡り超音波処理した。リポソーム調
製物は４℃で保管した。
【０１０７】 トランスフェクションプロトコール 初期の実験でウシ胎児血清の存在がＮＤ７細胞のトランスフェクションを阻害
することが決定されたので、全トランスフェクションに対して無血清分化培地を
使用した。様々な量のＤＮＡ及びリポソームを７ｍＬの無菌Ｂｉｊｏｕ容器（Ｂ
ｉｂｂｙ Ｓｔｅｒｉｌｉｎ Ｌｔｄ．製、スタフォードシャー、英国）の底部
ヘ、しかし相互に接触しないように入れた。ＤＮＡ及びリポソームは、４００μ
Ｌの無血清分化培地の添加及び穏やかにな攪拌によって結合させた。ＤＮＡ：リ
ポソーム混合物は細胞に適用する前に２０〜３０分間に渡って室温でインキュベ
ートした。ＤＮＡ／リポソーム混合物はその後細胞に適用し、３７℃、５％ Ｃ
Ｏ2の存在下で２時間に渡ってインキュベートし、その後この培地を完全培地と
取り替えた。２４〜４８時間後、細胞を固定し、以前に説明したように31、Ｘ−
ｇａｌ組織化学検査のために処理するか、又はβ−ガラクトシダーゼ酵素活性（
Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．製）のために採取した。
【０１０８】 細胞計数はニコン・ダイアフォト（Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ）倒立顕微鏡
を使用して４０倍の倍率で実施した。各トラスフェクションは少なくとも３回ず
つ繰返し、各ウェルについて少なくとも３回の個別計数を行った。
【０１０９】 被験ペプチドを含むトランスフェクション複合体は下記の方法で生成した。様
々な量のペプチドを１μｇ ｐＣＭＶβと平行して、だが接触させずに無菌ポリ
スチレン容器の底部に入れ、４００μＬの無血清ＮＧＭ培地を添加することによ
って混合した。複合体は室温で１０分間インキュベートし、その後ＤＣ−Ｃｈｏ
ｌ／ＤＯＰＥを添加した。このｐＤＮＡ／ペプチド／リポソーム複合体はさらに
室温で２０分間インキュベートし、その後上記の通りに細胞へ適用した。
【０１１０】 ＜実施例１ ＤＮＡ結合解析＞ Ｍｕ１は、アデノウイルスのコア複合体と関連する１９アミノ酸からなるポリ
カチオン性ペプチドである（表１）27,32。我々は、Ｍｕ１とマウスポリオーマ
ウイルス主要カプシドタンパク質Ｖｐ１とのＤＮＡ結合能力をゲル・リターデー
ションアッセイにおけるプラスミドＤＮＡとの相互作用によって比較した。Ｖｐ
１は核内移行シグナルを含有する１９アミノ酸ペプチドであり26、Ｍｕ１より少
ない数の正荷電アミノ酸を含有する。このため、より低いＤＮＡ結合能力を有す
ると予測された。
【０１１１】
【表３】
【０１１２】 様々な量の精製ペプチドを約１０分間に渡ってＨＢＳ中で室温でインキュベー
トし、その後アガロースゲル電気泳動法で分析した。ペプチドを添加しないと、
スーパーコイル型及びリラックス型リング状プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）は予
想された方法で移動した（図１、レーン８）。
【０１１３】 １：０．２５（ｗ／ｗ）のＤＮＡ：Ｍｕ１ペプチド比を起点として、プラスミ
ドＤＮＡの移動が遅延した（図１）。プラスミドＤＮＡの移動は、１：０．２５
の比率（ｗ／ｗ）では軽微に影響を受けたが、１：０．５の比率（ｗ／ｗ）では
プラスミドＤＮＡの移動は重度に緩徐化され、ウェルから移動することはほとん
どできなかった。２：１を超える比率では、ｐＤＮＡはアガロースゲル内へ移動
することはできず、プラスミド内へ相互キレート化する臭化エチジウムの能力が
低下した。Ｍｕ１とは対照的に、Ｖｐ１を用いた場合には１：８（ｗ／ｗ）まで
のｐＤＮＡ：タンパク質比ではプラスミドＤＮＡの電気泳動度への影響は全く検
出されなかった（図１）。１μｇのプラスミドＤＮＡへの８μｇのＶＰ１の添加
はスーパーコイル型ｐＤＮＡバンドの広がりを生じさせた。しかし、１：３２の
ｐＤＮＡ：タンパク質比（ｗ／ｗ）が使用されるまではＶｐ１を使用してリラッ
クス型ｐＤＮＡバンドへの作用は全く所見されなかった。この比率では、スーパ
ーコイル型及びリラックス型両方のｐＤＮＡバンドは重大に遅延し、一部のＤＮ
Ａはウェル内に保持されているのを所見できた。１：３０（ｗ／ｗ）のｐＤＮＡ
：タンパク質比まではｐＤＮＡをＢＳＡと一緒にインキュベートしたときに電気
泳動度への影響は検出されなかった（図１）。
【０１１４】 ＜実施例２ 未分化ＮＤ７ｓ中でのトランスフェクション＞ 我々は、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子アッセイを使用して、Ｍｕ１
及びＶｐ１がカチオン性リポソームによる神経細胞系のトランスフェクションを
増進する能力を試験した。ＮＤ７細胞は様々な量のペプチド及びＤＣ−Ｃｈｏｌ
／ＤＯＰＥヘ複合させたｐＣＭＶβを用いてトランスフェクションした。我々は
以前に、カチオン性リポソームであるＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥがニューロン由
来ＮＤ７細胞系を効果的にトランスフェクションできることを証明している31。
この試験では、我々は３μｇのＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥと複合させた１μｇの
プラスミドＤＮＡを使用してこのニューロン由来細胞系において最適効率（＞４
０％）が入手されることを発見した31。時間的に、導入遺伝子発現の最高レベル
はトランスフェクション後４８〜６０時間に入手される。このため、トランスフ
ェクションにおける改善を検出する機会を最高化するために、我々は全部のアッ
セイをレポーター遺伝子発現のレベルがより低い時点であるトランスフェクショ
ンから１２〜２０時間以内に実施した。以前に、我々は１：３（ｗ／ｗ）のｐＤ
ＮＡ：リポソーム比がＮＤ７細胞中でのトランスフェクションのために最適であ
ることを発見した31。このため、我々は様々な量のペプチドが１：３、１：４及
び１：６のｐＤＮＡ：ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥの比率でのトランスフェクショ
ンに及ぼす影響を比較した。ゲル・リターデーション解析は、プラスミドＤＮＡ
の全部に実質的に結合するために十分な適切な比率が１：０．５（ｗ／ｗ）のｐ
ＤＮＡ：Ｍｕ１であることを示唆した（図１）。しかし、この比率及びリポソー
ムを使用した初期の実験はトランスフェクションの効率に影響を及ぼさなかった
（示されていない）。トランスフェクション複合体を生成するために使用した量
は、ゲル・リターデーションアッセイを実行するために使用した量よりはるかに
多かった（４００μＬ対２０μＬ）。このため、我々はゲル・リターデーション
アッセイで使用したものと溶液中で類似の濃度のより大量のＭｕ１を試験した。
我々は０．６、６、１２及び２１μｇのＭｕ１ペプチドがＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯ
ＰＥ媒介性トランスフェクションに及ぼしたであろう影響を比較した。その結果
、Ｍｕ１が４倍以上カチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション効率を改
良することを発見した。トランスフェクション抗率における最大の改良は、１／
１２／６、ｐＣＭＶβ／Ｍｕ１／（ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ）（ｗ／ｗ／ｗ）
の相対比率を使用したときに発生した。この組み合わせは、ＤＮＡ単独に比較し
てトランスフェクションにおける１１倍の増加をもたらした（図２）。
【０１１５】 β−ガラクトシダーゼ・レポーター遺伝子アッセイは産生したβ−ガラクトシ
ダーゼの全レベルの尺度を提供するが、トランスフェクションされた細胞の数に
関する情報は提供しない。このため、我々はさらにトランスフェクションされた
ＮＤ７細胞に関する細胞計数を実施した。細胞は２４ウェル培養プレートにおい
て４×１０4の密度で播種した。２４時間後、細胞は無血清培地中で短時間洗浄
し、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ及びＭｕ１ペプチドへ複合させたｐＣＭＶβを用
いてトランスフェクションした。使用した比率は、レポーター遺伝子アッセイに
おいて最適であることが発見されていた比率の１：１２：６のｐＣＭＶβ：Ｍｕ
１：ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥであった。この比率を用いて、我々はβ−ガラク
トシダーゼ陽性細胞の数における６倍の増加を発見した（図３＆６）。使用した
いずれの濃度でもＭｕ１複合体を用いて明白な細胞消失は検出されなかった。同
様に、β−ガラクトシダーゼ・レポーター遺伝子アッセイのために使用した細胞
溶解液中のタンパク質濃度はトランスフェクションされていない細胞によって統
計的有意に変化しなかった（データは示されていない）。
【０１１６】 対照的に、Ｖｐ１を用いた場合にはトランスフェクション効率における改良を
発見することはできなかった（図４）。Ｍｕ１単独へ複合させたｐＣＭＶβを用
いた場合には裸ＤＮＡより優れたトランスフェクション効率における改良は所見
されなかった。
【０１１７】 改良したトランスフェクションが他の細胞タイプにおいても達成できるかどう
かを判断するために、我々はＣＯＳ−７細胞について同様の解析を実施した。Ｍ
ｕ１は、ＣＯＳ−７細胞においても同様にリポソーム媒介性トランスフェクショ
ンを改良した（図５）。ＮＤ７細胞に最適なｐＤＮＡ：Ｍｕ１：リポソームの同
一の比率がＣＯＳ−７細胞についても最善であった。カチオン性リポソーム単独
に比較して同程度の改良（３．７倍）が所見された。
【０１１８】 ＜実施例３ 分化ＮＤ７ｓ中におけるトランスフェクション＞ 我々はさらにまた、Ｍｕ１が分化ＮＤ７ｓ中におけるカチオン性リポソーム媒
介性トランスフェクションを改良する能力も試験した。ＮＤ７細胞系は原発性ラ
ット第一後根神経節（ＤＲＧ）ニューロン及びマウス神経芽細胞種Ｎ１８Ｔｇ２
の融合に由来する28。ＮＤ７細胞は血清の除去、ｃＡＭＰ投与又は減少血清＋ｃ
ＡＭＰ及び神経成長因子への暴露を含む様々な方法で分化させることができる。
ＮＤ７ｓの分化は細胞分割の減少及び神経突起成長を含むそれらの親の侵害受容
感覚ニューロンと関連する細胞特性の発現を引き起こす。ＮＤ７細胞は２４ウェ
ル培養プレート内に播種し、２４時間後に分化させた。分化開始１５〜２０時間
後、それらを上記の通りにトランスフェクションした。トランスフェクションの
１５〜２０時間後、細胞を固定し、Ｘ−ｇａｌ組織化学検査のために処理した。
以前の観察と一致して、トランスフェクション効率は３種の分化群間で大きく変
動した。血清の除去によって分化させたＮＤ７細胞は最低レベルのトランスフェ
クション（１．３％）を示したが、他方最高レベルはｃＡＭＰ群（８％）で、そ
して中間レベルは低血清／ｃＡＭＰ／ＮＧＦ群（４．７％）で所見された（図５
）。しかしこれら全３種の条件において、トランスフェクション複合体へのＭｕ
１ポリペプチドの包含は分化ＮＤ７細胞の形質導入を改良した。ｃＡＭＰ単独又
は低血清／ｃＡＭＰ／ＮＧＦへの暴露のいずれかによって分化させたＮＤ７ｓは
６倍以上の効率の増大を示した（図５）。しかし、効率における最大の改良は血
清除去によって分化させた群において所見された。この場合には、１０倍以上の
増加が観察された。
【０１１９】 Ｍｕ１ペプチド及びＤＮＡの複合体 ゲル電気泳動法を使用して実施例１（ＤＮＡ結合解析）において示されたよう
に、プラスミドＤＮＡの移動は重度に遅延し、Ｍｕｌ：ＤＮＡ ０．５：１．０
（ｗ／ｗ）を越えてウェルから移動したＤＮＡはほとんどなかった。これは、Ｍ
ｕ１ペプチドがＤＮＡと強度に相互作用していること、及び核酸を中性化かつ凝
縮して遺伝子送達に適合する小さな粒子を形成する可能性があることを意味した
。Ｍｕｌのサイズ：ＤＮＡ（ＭＤ）粒子サイズを図７に示したＭｕｌ：ＤＮＡ比
率範囲に渡って試験した。
【０１２０】 ＭＤ粒子は混合によって調製した。手短には、脱イオン水中のＭｕ１ペプチド
の適切なアリコートを２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中のプラスミ
ドＤＮＡ（ｐＣＭＶβ）（最終濃度２２０μｇ／ｍＬ）へ添加した。しっかりと
混合した後、各混合液を２０℃で１０分間インキュベートした。インキュベーシ
ョンの直後に、各混合液はＨｅｐｅｓ緩衝液（最終ＤＮＡ濃度２４μｇ／ｍＬ）
を用いて希釈し、光子相関分光法（Ｎ４ ｐｌｕｓ、Ｃｏｕｌｔｅｒ製）による
粒子サイズ解析を受けさせた。すべての測定は２０℃で実施し、データは９０°
の角度で収集した。単一モード解析を使用して平均粒子サイズ及び標準偏差（Ｓ
．Ｄ．）を計算した。
【０１２１】 興味深いことに、Ｍｕ１はＤＮＡに結合して試験した全範囲に渡って複合体を
形成したが、粒子サイズはＭｕ１：ＤＮＡ比に反応して相当に大きく変動した。
安定性の小さなナノ粒子が０．３〜１．２（範囲Ｌ）内の及び５の上方（範囲Ｈ
）のＭｕ１：ＤＮＡで形成された。中間の比率は、サイズで２μｍより大きく到
達するインキュベーション時間に渡って大きくなる複合体粒子のサイズを伴う重
度の凝集を生じさせた（図７）。
【０１２２】 ＜実施例４ 範囲ＬにおけるＬＭＤの調製＞ 我々は、低いＭＤ：ＤＮＡ比を有するリポソーム−Ｍｕ１−ＤＮＡ複合体が安
定したナノ粒子を形成できるかどうか、及び結果として生じた複合体粒子が良好
なトランスフェクション活性を有することができるかどうかを測定した。
【０１２３】 リポソームの調製：ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３０μｍｏｌ）及びＤＯＰＥ（２０μｍ
ｏｌ）はジクロロメタン中で結合した。ロータリー・エバポレーターを使用して
減圧下で有機溶媒を除去し、残留物を真空中で３時間に渡り乾燥させた。この後
、４ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．０（３ｍＬ）をボルテックスミキサーで
攪拌しながら脂質フィルムへ添加した。短時間（２〜３分間）の超音波処理後、
結果として生じたカチオン性リポソーム懸濁液を押出し装置（Ｌｉｐｅｘ Ｂｉ
ｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ製）によって２個の積み重ねポリカーボネート製フィルタ
ー（０．２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を通して３回押出し、その後さらに２
個の積み重ねポリカーボネート製フィルター（０．１μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
製）を通して１０回押出し、小さなリポソーム（ＰＣＳによって測定した平均径
１０９ｎｍ）を形成した（調製物に依存して約８〜１０ｍｇ／ｍＬ）。
【０１２４】 リポソーム：Ｍｕ１：ＤＮＡ（ＬＭＤ）複合体の調製：Ｍｕ１ペプチド（脱イ
オン水中で０．１２ｍｇ、ペプチド濃度３．５ｍｇ／ｍＬ）をボルテックスミキ
サーで連続的に攪拌している間に４ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液中のプラスミドＤＮ
Ａ（ｐＣＦ１−ＣＡＴ）（０．２ｍｇ、ペプチド濃度は典型的には１．０ｍｇ／
ｍＬ）の溶液へ添加した。その後カチオン性リポソーム懸濁液（総脂質２．４ｍ
ｇ、４μｍｏｌ）を導入すると、ＰＣＳで測定した狭いサイズ分布（１６８ｎｍ
±５８ｎｍ）を有する小さな粒子の形成が生じた。このＬＭＤ（最終ＤＮＡ濃度
０．１４ｍｇ／ｍＬ）は使用時まで１０％スクロース（ｗ／ｖ）を添加して−８
０℃で保管した。１ヵ月間に渡って粒子サイズの偏差は観察されなかった。
【０１２５】 対照実験のために、ＮＤ７細胞のトランスフェクションのための最適組成物と
して３：１（ｗ／ｗ）のリポソーム：ＤＮＡ比を用いてリポソーム：ＤＮＡ（Ｌ
Ｄ）複合体（リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘｅｓ））を調製した。
【０１２６】 ＮＤ７細胞中のトランスフェクション：ＮＤ７細胞は、標準増殖培地（ＮＧＭ
）（１０％血清を含む）を入れた２４ウェル培養プレートにおいて約４×１０4
ｃｅｌｌｓ／ウェルの密度で播種した。２４時間後、細胞はＮＧＭ（無血清）へ
の短時間の暴露によって洗浄し、その後指示された時間に渡って、ＮＧＭ（無血
清）を用いて前希釈（全部の場合において最終ＤＮＡ濃度３．２μｇ／ｍＬ）し
たＬＭＤ又はＬＤ複合体を含有する溶液を用いて処理した。その後細胞を再び洗
浄し、採取前にさらに４８時間に渡りインキュベートした。トランスフェクショ
ンのレベルは、基質として14Ｃ−ＣＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を使用してクロラ
ムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素アッセイによって測定した。
トランスフェクション活性は付加14Ｃ−ＣＡＭの酵素による転換率（％）として
表わした。
【０１２７】 我々はＬＤ媒介性トランスフェクションに比較してＬＭＤを用いた場合の方が
はるかに高度のレポーター遺伝子発現が発生することを発見した。実際に、ＬＭ
ＤトランスフェクションはＬＤ媒介性トランスフェクションと比較して１０分間
のトランスフェクション時間後には１６倍高いＣＡＴ酵素活性、及び６０分間の
トランスフェクション時間後には６倍高いＣＡＴ酵素活性を生じさせた（図８）
。ＬＭＤを用いた場合には、トランスフェクションが１０分間と短い場合でさえ
統計的有意なトランスフェクションが観察された。このデータは、ＬＭＤ粒子が
いかに急速に細胞内に進入できるのかを例示している。
【０１２８】 ＜実施例５ カチオン性脂質（サイトフェクチン）の変動＞ 我々は、ポリカチオン性コレステロール脂質を組み込むことによってＬＭＤ複
合体を改善できるかどうかを測定した（ＷＯ９７／４５４４２）。ＤＣ−Ｃｈｏ
ｌに代わるカチオン性リポソームを作製するためにＣＤＡＮ（Ｂ１９８）、ＡＣ
Ｈｘ（ＣＪＥ５２）及びＣＴＡＰ（Ｂ２３２）（図９）を使用した。使用した各
カチオン性リポソーム系は６０ｍｏｌ％のカチオン性脂質及び４０ｍｏｌ％のＤ
ＯＰＥから構成し、実施例４で記載した通りに調製した。次の様々なＬＭＤ複合
体系を調製し、比較した：ＬＭＤ（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ＬＭＤ（Ｂ１９８）、Ｌ
ＭＤ（ＣＪＥ５２）及びＬＭＤ（Ｂ２３２）。全ＬＭＤ系は、１．０ｍｇのＤＮ
Ａ（ｐＣＭＶβ）当たりカチオン性リポソーム（総脂質２０μｍｏｌ）及び０．
６ｍｇのＭｕ１ペプチドを用いて上記の通りに調製した。粒子は径が２００ｎｍ
より小さいことが証明された。
【０１２９】 対照実験のために、ＮＤ７細胞のトランスフェクションのための最適組成物と
して３：１（ｗ／ｗ）のリポソーム：ＤＮＡ比を用いてリポソーム：ＤＮＡ（Ｌ
Ｄ）複合体（リポプレックス）を調製した。
【０１３０】 ＮＤ７細胞中のトランスフェクション、ＮＤ７細胞は、標準増殖培地（ＮＧＭ
）（１０％血清を含む）を入れた２４ウェル培養プレートにおいて約４×１０4
ｃｅｌｌｓ／ウェルの密度で播種した。２４時間後、細胞はＮＧＭ（無血清）へ
の短時間の暴露によって洗浄し、その後１時間に渡って、ＮＧＭ（無血清）を用
いて前希釈（全部の場合において最終ＤＮＡ濃度２．５μｇ／ｍＬ）したＬＭＤ
又はＬＤ複合体を含有する溶液を用いて処理した。その後細胞を再び洗浄し、Ｘ
−ｇａｌを用いた組織化学的染色のために処理する前にさらに４８時間に渡りイ
ンキュベートした。青色に染色した細胞数を倒立顕微鏡下で計数した。
【０１３１】 全部の場合に、ＬＭＤ調製物は同一ポリカチオン性コレステロール脂質類を用
いて調製した対応するＬＤ系に比較して良好に機能した（図１０）。トランスフ
ェクションにおける効率順序は、ＬＭＤ（Ｂ１９８）＞ＬＭＤ（ＤＣ−Ｃｈｏｌ
）＞ＬＭＤ（ＣＪＥ５２）＞＞ＬＭＤ（Ｂ２３２）であった。対応するＬＤ系を
用いた場合に、同一の順序Ｂ１９８＞ＤＣ−Ｃｈｏｌ＞＞Ｂ２３２が観察された
。
【０１３２】 ＜実施例６ 範囲ＬにおけるＭｕ１ペプチドの量＞ 我々はＭｕ１：ＤＮＡ比（図７における範囲Ｌで）がトランスフェクション活
性に及ぼす影響を試験した。
【０１３３】 カチオン性脂質Ｂ１９８及びＤＯＰＥ（３：２ ｍ／ｍ）から構成されたカチ
オン性リポソームを実施例４に記載した同一方法で調製した。一連のＭＤ複合体
混合物（Ｍｕ１：ＤＮＡ比が０．３〜１．２）を調製し、カチオン性リポソーム
と複合させた。結果として生じたＬＭＤ系は、各々１２：０．３：１、１２：０
．６：０．６、１２：０．９：１及び１２：１．２：１ ｗ／ｗ／ｗの比率でＭ
ｕ１：ＤＮＡ（ｐＣＭＶβ）から構成された。ＬＭＤ粒子の測定サイズはほぼ１
５０ｎｍであった。
【０１３４】 トランスフェクション活性は、Ｐａｎｃ−１細胞（ヒト膵臓癌細胞系）を使用
してインビトロで評価した。細胞は、１０％ ＦＣＳを補給したＲＰＭＩを入れ
た２４ウェル培養プレートにおいて約５×１０4／ウェルの密度で播種し、５％
【０１３５】 ＣＯ2の存在下で２４時間に渡り３７℃で増殖させた。細胞はＲＰＭＩへの短
時間の暴露によって洗浄し、その後ＲＰＭＩを用いて前希釈した（全部の場合に
おいて最終ＤＮＡ濃度５．０μｇ／ｍＬ）ＬＭＤ複合体の溶液を用いて３０分間
に渡り処理した。その後細胞を再び洗浄し、採取及び標準アッセイキット（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ製）を用いたβ−ガラクトシダーゼ酵素活性アッセイの前に１０％
【０１３６】 ＦＣＳを補給したＲＰＭＩ中でさらに４８時間インキュベートした。
【０１３７】 図１１に示されているように、Ｐａｎｃ−１細胞のトランスフェクションのた
めに最適なリポソーム：Ｍｕ１：ＤＮＡ比は１２：０．６：０．６であることが
発見された。別な方法でも、これらの低い比率のＭｕ１ ＬＭＤ複合体を用いて
優秀なトランスフェクション結果が得られた。
【０１３８】 ＜実施例７ 脂質の量及び組成＞ ＤＯＰＥに対するカチオン性脂質の比率並びにＭｕ１及びＤＮＡに対する総脂
質の比率を変化させることの影響を調査するために、好ましいカチオン性脂質と
してＢ１９８を使用して一連のＬＭＤ系を調製した。６０％ｍｏｌのＢ１９８及
び４０％ｍｏｌのＤＯＰＥ（３：２ ｍ／ｍ）、５０％ｍｏｌのＢ１９８及び５
０％ｍｏｌのＤＯＰＥ（１：１ ｍ／ｍ）及び３３％ｍｏｌのＢ１９８及び６７
％ｍｏｌのＤＯＰＥ（１：２ ｍ／ｍ）から構成されるカチオン性リポソームを
調製し、実施例４に記載の方法に従って、図１２に示した比率で標準ＭＤ複合体
混合物（Ｍｕ１：ＤＮＡ ０．６：１ ｗ／ｗ）と結合した。
【０１３９】 対照実験のために３：１（ｗ／ｗ）のリポソーム：ＤＮＡ比を有するリポソー
ム：ＤＮＡ（ＬＤ）複合体混合物（リポプレックス）を調製した。全ＬＭＤ系は
、少ない量のカチオン性リポソームをＭＤ複合体と比較したときにはより大きな
平均サイズを有することが発見された。しかし、１２μｍｏｌ／ｍｇを越える脂
質／ＤＮＡから構成されるＬＭＤ粒子のサイズは２００ｎｍ未満のままであった
が、他方１２から６μｍｏｌ／ｍｇの脂質／ＤＮＡから構成されるＬＭＤ粒子の
サイズはその数値より上方へ増加した。ときどき、６μｍｏｌ／ｍｇの脂質／Ｄ
ＮＡから構成されるＬＭＤ系の調製中には目に見える凝集が観察された。
【０１４０】 トランスフェクション活性は、Ｐａｎｃ−１細胞を使用して測定した（図１２
）。細胞は、１０％ ＦＣＳを補給したＤＭＥＭを入れた２４ウェル培養プレー
トにおいて約５×１０4／ウェルの密度で播種し、５％ ＣＯ2の存在下で２４時
間に渡り３７℃で増殖させた。細胞はＤＭＥＭへの短時間の暴露によって洗浄し
、その後ＤＭＥＭを用いて前希釈した（全部の場合において最終ＤＮＡ濃度５．
０μｇ／ｍＬ）ＬＭＤ又はＬＤ複合体の溶液を用いて２時間に渡り処理した。そ
の後細胞を再び洗浄し、採取及び標準アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用
いたβ−ガラクトシダーゼ酵素活性アッセイの前に１０％ ＦＣＳを補給したＤ
ＭＥＭ中でさらに４８時間インキュベートした。
【０１４１】 最高トランスフェクション活性は、試験した３種の比率の脂質：ＤＯＰＥ調製
物に関して統計的有意には相違しなかった。Ｂ１９８：ＤＯＰＥ（１：２ ｍ／
ｍ）を用いて調製したＬＭＤ系の場合は、約１２．５μｍｏｌ／ｍｇの脂質／Ｄ
ＮＡのリポソーム：ＤＮＡ比で最高トランスフェクションが達成された。Ｂ１９
８：ＤＯＰＥ（３：２ ｍ／ｍ）及びＢ１９８：ＤＯＰＥ（２：２ ｍ／ｍ）を
用いて調製されたＬＭＤ系のトランスフェクション活性は１２．５μｍｏｌ／ｍ
ｇの脂質／ＤＮＡより大きなリポソーム：ＤＮＡ比でプラトーに達した。分析し
た全ＬＭＤ系は低いリポソーム：ＤＮＡ比では低いトランスフェクション活性を
示す傾向が見られた（図１２）。各ＬＭＤ系が十分なトランスフェクション活性
を示すためには少ない量のＭｕ１ペプチドから構成されたＬＭＤ調製物は多量の
Ｍｕ１ペプチドを用いて調製した調製物に比較してより多量のカチオン性リポソ
ームを必要とすると考えられる。
【０１４２】 ＜実施例８ Ｍｕ１ペプチドとプロタミンとの比較＞ プロタミンは魚の精子中に富裕な天然型カチオン性ペプチドであり、ＤＮＡを
中性化かつ凝縮する際に効力がある。プロタミンのトランスフェクション活性を
Ｍｕ１ペプチドのトランスフェクション活性と比較した。Ｍｕ１ペプチド又は硫
酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ製、サケからのグレードＸ）をＤＮＡ（ｐＣＭＶβ）
及びその後カチオン性リポソーム（３：２ ｍ／ｍの比率でＢ１９８：ＤＯＰＥ
）と複合させ、１２：０．６：１（ｗ／ｗ／ｗ）のリポソーム：ペプチド：ＤＮ
Ａ比を得た。
【０１４３】 トランスフェクション活性はＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞中で試験した。細胞は、
１０％ ＦＣＳを補給したＤＭＥＭを入れた２４ウェル培養プレートにおいて約
２×１０4／ウェルの密度で播種し、５％ ＣＯ2の存在下で２４時間に渡り３７
℃で増殖させた。細胞はＤＭＥＭへの短時間の暴露によって洗浄し、その後ＤＭ
ＥＭを用いて前希釈した（全部の場合において最終ＤＮＡ濃度５．０μｇ／ｍＬ
）ＬＭＤ又はＬＤ複合体の溶液を用いて１又は２時間に渡り処理した。その後細
胞を再び洗浄し、採取前に１０％ ＦＣＳを補給したＤＭＥＭ中でさらに４８時
間インキュベートした。β−ガラクトシダーゼ酵素活性のレベルは標準アッセイ
キット（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて測定した。
【０１４４】 図１３に示されているように、Ｍｕ１ペプチドを含む複合体はプロタミンを含
む複合体よりこれらのコンフルエントな細胞のより良好なトランスフェクション
を示した。
【０１４５】 ＜ 実施例９ また別のカチオン性ペプチド＞ また別の様々なカチオン性ペプチドがトランスフェクション活性に及ぼす影響
を試験するために、一連のリポソーム：カチオン性ペプチド：ＤＮＡ複合体を調
製し、それらの相対トランスフェクション能力をインビトロで分析した。使用し
たペプチドは、塩酸ポリリジン（平均分子量３９７０、Ｓｉｇｍａ製）、塩酸ポ
リアルギニン（平均分子量１１８００、Ｓｉｇｍａ製）、タンパク質Ｖ由来のペ
プチド、ｐＶ（ｐ５、配列は下記に示されている）、Ｍｕ１のペプチドアナログ
（Ｖ、配列は下記に示されている）及びＭｕ１ペプチド自体。ｐ５ペプチド及び
ＶペプチドはＭｕ１ペプチドを調製するために使用したものと同一固相ペプチド
合成法を使用して合成した。
【０１４６】 各ペプチドは、実施例４に記載した通りに１２：０．６：１（ｗ／ｗ／ｗ）の
リポソーム：ペプチド：ＤＮＡ比でカチオン性リポソーム（ＤＣ−Ｃｈｏｌ：Ｄ
ＯＰＥ ３：２ ｍ／ｍ）及びＤＮＡ（ｐＣＭＶβ）と結合させた。トランスフ
ェクション活性はＨｅＬａ細胞（ヒト）上皮細胞を用いて試験した。細胞は、１
０％ ＦＣＳを補給したＤＭＥＭを入れた２４ウェル培養プレートにおいて約５
×１０4／ウェルの密度で播種し、５％ ＣＯ2の存在下で２４時間に渡り３７℃
で増殖させた。細胞はＤＭＥＭへの短時間の暴露によって洗浄し、その後ＯＰＴ
ＩＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いて前希釈した（全部の場合において最終ＤＮＡ
濃度１．０μｇ／ｍＬ）ＬＭＤ又はＬＤ複合体の溶液を用いて３０分間に渡り処
理した。その後細胞を再び洗浄し、採取前に１０％ ＦＣＳを補給したＤＭＥＭ
中でさらに４８時間インキュベートした。β−ガラクトシダーゼ酵素活性のレベ
ルは標準アッセイキット（化学発光法、Ｒｏｃｈｅ製）を用いて測定した。
【０１４７】 図１４に示されているように、アデノウイルス由来のカチオン性ペプチド（Ｍ
ｕ１及びｐ５）及びＭｕ１アナログ（Ｖ）は、合成カチオン性ポリペプチドであ
るポリリジン及びポリアルギニンを使用して調製された複合体に比較して素晴ら
しいトランスフェクション活性を顕示した。 ｐ５、Ｖ及びＭｕ１ペプチドのアミノ酸配列 ｐ５： ＲＰＲＲＲＡＴＴＲＲＲＴＴＴＧＴＲＲＲＲＲＲＲ Ｖ： ＶＲＲＶＨＨＲＲＲＲＶＳＨＲＲＶＲＧＧ Ｍｕ１： ＭＲＲＡＨＨＲＲＲＲＡＳＨＲＲＭＲＧＧ
【０１４８】 ＜実施例１０ Ｐａｎｃ−１を用いてのトランスファスト（Ｔｒａｎｓｆａｓｔ
）との比較＞ ｐＣＭＶβの使用を除いて実施例４に記載と同一方法によってＬＭＤ及びＬＤ
を調製した。トランスファスト（Ｔｒａｎｓｆａｓｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ製）ＤＮ
Ａ複合体は製造業者のプロトコールに従って調製した。
【０１４９】 トランスフェクション活性をＰａｎｃ−１細胞を使用してインビトロで評価し
た。細胞は、１０％ ＦＣＳを補給したＲＰＭＩを入れた２４ウェル培養プレー
トにおいて約５×１０4／ウェルの密度で播種し、５％ ＣＯ2の存在下で２４時
間に渡り３７℃で増殖させた。細胞はＲＰＭＩへの短時間の暴露によって洗浄し
、その後ＲＰＭＩを用いて前希釈した（全部の場合において最終ＤＮＡ濃度５．
０μｇ／ｍＬ）ＬＭＤ又はＬＤ複合体を含有する溶液を用いて指示した時間に渡
り処理した。その後細胞を再び洗浄し、採取前に１０％ ＦＣＳを補給したＲＰ
ＭＩ中でさらに４８時間インキュベートした。β−ガラクトシダーゼ酵素活性の
レベルは標準アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて測定した。トランス
ファスト：ＤＮＡ複合体を用いたトランスフェクションは、１時間に渡って無血
清培地（最適条件）で実施した。
【０１５０】 図１５に示されているように、ＬＭＤはトランスファスト：ＤＮＡ及びＬＤ複
合体より優れたトランスフェクション活性を示した。これらの結果は、ＮＤ−７
細胞を用いて所見された結果と完全に一致している。
【０１５１】 ＜実施例１１ ヒト気管支細胞を使用したリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃ
ｔａｍｉｎｅ）との比較＞ ＨＢＥ細胞（ヒト気管支上皮細胞）を使用して、ＬＭＤ複合体のトランスフェ
クション活性をＤＮＡと複合させたリポフェクトアミン（Ｇｉｂｃｏ製）のトラ
ンスフェクション活性と比較した。
【０１５２】 細胞は、１０％ ＦＣＳを補給したＤＭＥＭを入れた１２ウェル培養プレート
において約５×１０4／ウェルの密度で播種し、５％ ＣＯ2の存在下で２４時間
に渡り３７℃で増殖させた。細胞はＤＭＥＭへの短時間の暴露によって洗浄し、
その後ＯＰＴＩＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いて前希釈した（全部の場合におい
て最終ＤＮＡ濃度５．０μｇ／ｍＬ）ＬＭＤ（実施例４と同様に調製）又はＬＤ
（リポフェクトアミン：ＤＮＡ １２：１ ｗ／ｗから調製）複合体のどちらか
を含有する溶液を用いて指示された時間（図１６を参照）に渡り処理した。その
後細胞を再び洗浄し、Ｘ−ｇａｌを用いた組織化学的染色のための処理前に１０
％ ＦＣＳを補給したＤＭＥＭ中でさらに４８時間インキュベートした。
【０１５３】 ＬＭＤはリポフェクトアミンより良好なトランスフェクション活性を示し（図
１６）、ＨＢＥ細胞によるより急速な取り込みを示した。ＮＤ７及びＰａｎｃ−
１細胞を用いた場合にも同様の結果が所見された。
【０１５４】 ＜実施例１２ ラット脳を用いたＬＴ１との比較：エクスビボ実験＞ 我々は、インビボモデルを模倣するためにレポーターＤＮＡ（ｐＣＭＶβ）を
使用してラット脳からの臓器特有培養におけるトランスフェクション活性を評価
した。脳スライスは透明な多孔性膜上で保持し、高度にそれらの内在的連結性及
び細胞構造を維持していることが観察された。
【０１５５】 ＬＭＤ及びＬＤは実施例４に示した通りに調製した。ＬＴ１はＰａｎ Ｖｅｒ
ａ Ｃｏ．によって製造されたポリアミントランスフェクション試薬である。３
：３．２：１（ｗ／ｗ／ｗ）の比率でカチオン性リポソーム（ＤＣ−Ｃｈｏｌ：
ＤＯＰＥ ３：２ ｍ／ｍ）、ＬＴ−１及びｐＣＭＶβプラスミドを含有する複
合体を調製した。脳スライスはＬＭＤ、ＬＤ又はリポソーム：ＬＴ１：ＤＮＡを
含有する溶液を用いて２時間に渡り処理した（Ｍｕｒｒａｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈ
ｅｒ．１９９９，６，１９０−１９７）。全部の場合に、実験中に切片中の形態
学的変化は観察されなかった。トランスフェクション後の４８時間のインキュベ
ーション後に、細胞を採取し、Ｘ−ｇａｌ染色し、青色細胞の数をスライス上で
計数した（図１７）。
【０１５６】 ５．０μｇ（２ｍＬ培養）のＤＮＡ用量では、ＬＭＤはＸ−ｇａｌ染色後にＬ
Ｄ又はＬＴ１複合体より明らかに多数の青色染色細胞を生じさせた。１２９ｎｇ
という低用量では、ＬＭＤはＬＤ（ＤＮＡへ複合させたＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰ
Ｅ、３：１ ｗ／ｗ比）（ＤＮＡ用量５．０μｇ）よりまだ高い相当に大きなト
ランスフェクション活性を示した。我々は、ＬＤ及びリポソーム：ＬＴ１：ＤＮ
Ａ複合体によって媒介されるトランスフェクションに比較してＬＭＤを用いた場
合の方がはるかに高度のレポーター遺伝子発現を発見した。実際に、匹敵する用
量では、ＬＭＤ媒介性トランスフェクションはＬＤより１９倍以上効果的であり
、リポソーム：ＬＴ１：ＤＮＡより４倍以上効果的であった。
【０１５７】 ＜実施例１３ ＧＬ−６７カチオン性リポソームとの比較；マウス肺でのインビ
ボ実験＞ 我々は、ＬＭＤ（ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥカチオン性リポソーム［３：２
ｍ／ｍ］及びｐＣＦ１−ＣＡＴプラスミドを使用して実施例４に記載した通りに
調製）のマウス肺におけるインビボでのトランスフェクション活性を評価し、こ
れを肺臨床試験において大きく機能させるために使用したｐＣＦ１−ＣＡＴプラ
スミド（ＬＤ）（リポソーム：ＤＮＡ比 ５．４：１ ｗ／ｗ）と複合させたカ
チオン性リポソームＧＬ−６７：ＤＯＰＥ：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ5000（１：２：０
．０５ ｍ／ｍ／ｍ）のトランスフェクション活性と比較した（Ａｌｔｏｎら、
Ｌａｎｃｅｔ，１９９９，３５３，９４７−９５４）。
【０１５８】 ＬＭＤ（最終ＤＮＡ濃度 ０．１４ｍｇ／ｍＬ、容積１００μｌ、ＤＮＡ用量
１４μｇ）をＢａｌｂ／ｃマウスの肺内に注入した。ＧＬ−６７：ＤＯＰＥ：Ｄ
ＭＰＥ−ＰＥＧ5000（１：２：０．０５ ｍ／ｍ／ｍ）をｐＣＦ１−ＣＡＴプラ
スミド（最終ＤＮＡ濃度 ０．８ｍｇ／ｍＬ、容積１００μｌ、ＤＮＡ用量８０
μｇ）と複合させ、このＬＤ複合体を同様にＢａｌｂ／ｃマウスの肺内に注入し
た。４８時間後、肺をホモジナイズし、ＣＡＴ活性についてアッセイした。エラ
ーバーは平均値標準誤差を示している。
【０１５９】 結果（図１８）は、ＬＭＤ系が５分の１のＤＮＡ用量を送達するにもかかわら
ず、ＬＭＤ及びＧＬ−６７含有ＬＤ系がインビボで実質的に同等レベルのトラン
スフェクションを生じさせることを示している。
【０１６０】 ＜実施例１４ 糖修飾ＬＭＤ系＞ インビボ適用のためには、ＬＭＤと生物学的環境との非特異的相互作用を最小
限に抑えなければならない。例えば、静脈内投与中には、血液成分（塩、タンパ
ク質．．．）と非標的細胞との望ましくない相互作用は重要な障害である。異物
粒子と血漿タンパク質とのオプソニン作用は先天性免疫系による異物粒子除去の
自然過程における初期のステップの１つを表わしている。タンパク質結合及び塩
誘発性凝集を減少させるために、天然型多糖類はＬＭＤへ結合させることができ
る。このＬＭＤの炭水化物修飾は、ＬＭＤを炭水化物レセプターへターゲティン
グさせるためにも同様に適用できる。
【０１６１】 所望の作用を入手するために、我々は図１９に示したネオ糖脂質類を設計した
。それらの化合物は３種の別個のドメインに基づいている。
【０１６２】 ＡＣＨｘ（ＣＪＥ５２）：この脂質（図９参照）は所望のネオ糖脂質のための
一般的脂質プラットフォームとして選択した。このコレステロール脂肪族環系は
ネオ糖脂質アンカーとして機能するＬＭＤ又はＬＤ粒子の脂質コートの内側へ挿
入する極めて疎水性領域を表わしている。
【０１６３】 炭水化物モチーフ：オリゴ糖の選択は炭水化物修飾を含む化学の複雑さによっ
て制限された。我々は、原理を証明するために長鎖の市販で入手可能な炭水化物
であるマルトテトラオース及びマルトヘプタオースを使用することを決定した。
【０１６４】 リンカー：化学選択的リンケージの使用は、我々が広範囲のネオ糖脂質類を合
成することを可能にしたので、効果的かつ柔軟性であることを証明した。この化
学選択的方法は、ＣＪＥ５２の非保護炭水化物へ直接に結合することのできたヒ
ドロキシルアミノ脂質への転換に基づいた。典型的なヒドロキシルアミノ−ＣＪ
Ｅ５２の合成は図２０−スキーム１に示されており、リンカーへの炭水化物部分
の結合はＯ−置換ヒドロキシルアミンのグリコシル化に基づいている（グルコー
スとの反応の原理は図２１−スキーム２に例示されている）。この戦術に従って
、マルトテトラオース及びマルトヘプタオースを結合させてＧＬＵ４及びＧＬＵ
７化合物を入手した（構造は図２２に示されている）。
【０１６５】 ＬＭＤの糖修飾は、脂質を解離させてＬＭＤ膜内に遊離させて組み込むネオ糖
脂質ミセルの自然能力に基づいていた。まず最初に、ＬＭＤは実施例４に記載し
た通りにＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥカチオン性リポソーム、Ｍｕ１ペプチド及び
ｐＣＭＶβプラスミドから調製した。その後、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．０中
のネオ糖脂質ミセルの懸濁液をＬＭＤ混合物へ添加し、全体を２０℃で３０分間
インキュベートし、−８０℃で保管した（図２３）。
【０１６６】 ＬＭＤのネオ糖脂質安定化：ＬＭＤ内へ７．５％ｍｏｌのＧＬＵ４又はＧＬＵ
７を組み込むことによってネオ糖脂質修飾ＬＭＤの安定化作用を評価した。ＬＤ
系の脂質層は、塩暴露後に凝集することが知られている。このため、ＬＤ（最終
ＤＮＡ濃度 １μｇ／ｍＬ）粒子のサイズは光子相関分光法（Ｎ４ ｐｌｕｓ、
Ｃｏｕｌｔｅｒ製）によってＯＰＴＩＭＥＭ中で３７℃で３０分間後に評価した
。平均粒子サイズを評価するためには単一モード解析を使用した。ＬＤ粒子サイ
ズにおける平均増加率は図２４に示されている。基本ＬＭＤ系、ＬＭＤ（ＧＬＵ
４）及びＬＭＤ（ＧＬＵ７）についても同一方法を実施した（最終ＤＮＡ濃度
１μｇ／ｍＬ）。
【０１６７】 結果は、ＬＭＤがＬＤに比較して溶液中でより安定性であることを示している
が、さらにＧＬＵ４及びＧＬＵ７の存在が７．５ｍｏｌ％でＬＭＤ粒子への強化
抗凝集安定化作用を有することも示している。
【０１６８】 インビトロトランスフェクション効率：トランスフェクション活性は、Ｈｅｌ
ａ細胞を、１０％ ＦＣＳを補給したＤＭＥＭを入れた２４ウェル培養プレート
において約５×１０4／ウェルの密度で播種し、中に５％ ＣＯ2の存在下で約７
０％コンフルエンスへ２４時間に渡り３７℃で増殖させて測定した。細胞はＰＢ
Ｓ中で洗浄し、その後指示されたパーセンテージ（％）でＦＣＳを含有するＤＭ
ＥＭを用いて前希釈した（全部の場合において最終ＤＮＡ濃度５．０μｇ／ｍＬ
）ＬＭＤ複合体を含有する溶液を用いて３０分間に渡り処理した。その後細胞を
再び洗浄し、採取前に標準培地（ＮＧＭ）中でさらに４８時間インキュベートし
た。β−ガラクトシダーゼ発現のレベルは標準アッセイキット（化学発光法、Ｒ
ｏｃｈｅ製）を用いて測定した。
【０１６９】 結果は、０％及び５０％血清条件の両方で糖修飾のためにトランスフェクショ
ン効率の増進が発生したことを示している（図２５）。
【０１７０】 ［考察］ 我々は以前に、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥリポソームがニューロン由来ＮＤ７
細胞系をトランスフェクションすることに有効であることを証明している31。Ｄ
Ｃ−Ｃｈｏｌは、ＣＮＳ以外の様々な組織において成功理に使用されてきており
、嚢胞性線維症の遺伝子療法のための臨床試験を受けてきた33,34。さらに、Ｄ
Ｃ−Ｃｈｏｌリポソームは、細胞毒性副作用を示さないことも証明されている35 ,36 。これらの理由から、我々は神経細胞において使用するためにこれらのリポ
ソームの改良調製物を開発したいと考える。
【０１７１】 本明細書で我々は、細胞トランスフェクションのためのウイルスコード化タン
パク質の使用を記載している。我々は、Ｍｕ１が、カチオン性リポソームＤＣ−
Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥと結合して使用した場合には細胞トランスフェクションが重
大に改良することを発見した。この作用は、きっとおそらくＭｕ１のｐＤＮＡを
凝縮させる能力によるものであり、ポリペプチド、ｐＤＮＡ及びカチオン性リポ
ソームの比率を変化させることによって最適化することができた。重要なことに
、トランスフェクション効率における増進は分化細胞上でより顕著であった。上
記のように、ＮＤ７細胞は原発性ＤＲＧｓに由来した。ＮＤ７細胞を分化させる
と神経突起成長の誘発、総合的増殖の減少及びトランスフェクション能力の減少
を含むそれらの親末梢感覚ニューロンに類似する表現型を誘発する28,37。分化
されたＮＤ７ｓにおけるトランスフェクション効率の増進は、原発性ニューロン
又はインビボにおけるトランスフェクションを促進する能力の強化を反映してい
る可能性がある。
【０１７２】 ウイルスベクターに基づく系に対する実行可能な代替物としての非ウイルス遺
伝子送達賦形剤の成功は、より高度かつより長期間持続するトランスフェクショ
ン効率を有する複合体の開発に左右される。細胞内へ遺伝物質を移行させるため
の賦形剤としてカチオン性リポソームが最初に確認されて以降、より優れたカチ
オン性リポソーム調製物を開発することへ大きな圧力が加えられてきた5,7。カ
チオン性リポソームを改良するための多くの試みは、分子自体への構造的修飾に
基づいていた30。トランスフェクション効率を改良した新規調製物が開発されて
きた30。しかし、特定の細胞タイプはカチオン性リポソームトランスフェクショ
ンに関しては様々に挙動する。例えば、我々はポリペプチドのＭｕ１がカチオン
性リポソーム媒介性トランスフェクションを増進することに関してＶｐ１より優
れていることを発見した。これはおそらくＭｕ１の方が電荷比が高いためであっ
た。どちらのペプチドもほぼ同様の分子量を有するが、Ｍｕ１の総電荷はＶｐ１
の総電荷率の２倍以上であった（表１）。これに一致して、Ｍｕ１は６０分の１
未満の濃度でプラスミドＤＮＡの電気泳動度を遅延させることができ、これはい
かに密接にＭｕ１がＤＮＡに結合できるのかを証明していた。０．２５μｇのＭ
ｕ１を１μｇのｐＣＭＶβに複合させた場合にはｐＤＮＡ移動度における小さな
変化が検出されたが、０．５μｇのＭｕ１の添加後にはほぼ全部のプラスミドが
負荷近くにしっかりと保持されていた（図１）。０．５／１．０（ｗ／ｗ）のＭ
ｕ１対ｐＣＭＶβの比率は１，０００／１のモル比に相当する。Ｍｕ１の各分子
は、潜在的に正電荷を運ぶことのできる１２残基を含有している。したがってＭ
ｕ１対ｐＣＭＶβの理論上の電荷比は１．６であろう（１２，０００ Ｍｕ１カ
チオン対７，５００ ｐＣＭＶβアニオン）。この比率はｐＣＭＶβ上の負電荷
を完全に中性化させ、したがって所見されたようにその移動を完全に遅延させる
はずである。
【０１７３】 プラスミドＤＮＡ移動を重大に遅延させたＭｕ１の量とトランスフェクション
を最適に強化させたＭｕ１の量との直接比較は、調製方法が相違するために実施
できなかった。ペプチド−ｐＤＮＡ−リポソームトランスフェクション複合体は
より多量で調製された（材料及び方法の項を参照）。アガロースゲルにおける移
動を遅延させたような最適のトランスフェクション効率を達成するためには２４
倍の量のＭｕ１（１２μｇ／１μｇ ｐＣＭＶβ）を必要としたが、溶液中の濃
度は類似であった（２５ｎｇ／ｍＬ、 ｐＤＮＡ遅延、３０ｎｇ／ｍＬ、 最適
のトランスフェクション）。Ｍｕ１の存在はさらにカチオン性リポソームｐＤＮ
Ａ相互作用も変化させた。Ｍｕ１の存在下でのＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ対ｐＣ
ＭＶβの最適比は６／１で、神経細胞中で最適であると以前に発見された比率の
２倍であった31,38。理論上では、使用したＭｕ１の量はｐＣＭＶβ上の正電荷
を完全に中性化させるはずで、これはＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥとのそれ以上の
複合化を防止したであろう。明らかにこれは当てはまらなかったが、それは大き
く改良したトランスフェクション効率を達成可能であったためである。我々の使
用した緩衝条件において可能性のあるすべての荷電アミノ酸がプロトン化される
ことはありそうもない。なぜトランスフェクションを改良するためにより多くの
カチオン性リポソームが必要であるのかは明白ではなく、我々は現在この問題を
解決するべく研究中である。
【０１７４】 最後に、Ｖｐ１内の埋込み核内移行シグナルに関して述べておかなければなら
ない。我々の研究所（未公表の観察所見）及び他の場所で最近得られた証拠10,1 1,39,40 は、トランスフェクトされた物質の核内輸送がリポフェクションにおい
ては非効率的な可能性があることを示唆した。このために、トランスフェクトさ
れたＤＮＡの核取り込みを改良する目的で、核内移行能力を有することが知られ
ているペプチド配列を含有するポリカチオンを用いてＤＮＡを前凝縮することが
試みられてきた17,20,22。しかし我々は、Ｍｕ１のより効率的なＤＮＡ凝縮特性
がトランスフェクション効率を改良することに関してＶｐ１の核内移行能力をは
るかに優っていることを発見した。同様に、Ｆｒｉｔｚら22は、組換えヒトヒス
トン（Ｈ１）とＳＶ４０ラージＴ抗原核内移行配列を含有する修飾バージョンと
の間にトランスフェクション効率の相違がないことを発見している。他の試験は
、ＮＬＳの存在が特異的細胞内経路によるにもかかわらずトランスフェクトされ
たｐＤＮＡの核内蓄積を改良することを示唆している41,42。
【０１７５】 上記の明細書中で言及したすべての刊行物は本明細書の記載の一部としてここ
に組み込まれる。当業者には、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発
明の記載した方法及び系の様々な修飾及び変更が可能であることは明白であろう
。本発明を特定の好ましい実施形態と結び付けて記載してきたが、要求された本
発明はこのような特定の実施形態に不当に限定するべきではないと理解されなけ
ればならない。実際に、分子生物学又は関連分野の当業者には明白であるここに
記載した本発明を実行するための様式の様々な変形は添付のクレームの範囲内に
含まれることが意図されている。
【０１７６】 ［文献］
【表４】
【０１７７】
【表４（つづき）】
【０１７８】
【表４（つづき）】
【図面の簡単な説明】
【図１】 プレートを示している。
【図２】 グラフを示している。
【図３】 プレートを示している。
【図４】 グラフを示している。
【図５】 グラフを示している。
【図６】 グラフを示している。
【図７】 グラフを示している。
【図８】 グラフを示している。
【図９】 構造を示している。
【図１０】 グラフを示している。
【図１１】 グラフを示している。
【図１２】 グラフを示している。
【図１３】 グラフを示している。
【図１４】 グラフを示している。
【図１５】 グラフを示している。
【図１６】 プレートを示している。
【図１７】 グラフを示している。
【図１８】 グラフを示している。
【図１９】 構造を示している。
【図２０】 反応スキームを示している。
【図２１】 反応スキームを示している。
【図２２】 構造を示している。
【図２３】 様々な組み込みの原理を示している。
【図２４】 グラフを示している。
【図２５】 グラフを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ 35/02 Ｃ０７Ｋ 14/075 43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ // Ｃ０７Ｋ 14/075 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ミラー，アンドリュー・デイヴィッド イギリス国、エスダブリュー７ ２エイワ イ ロンドン、サウス・ケンジントン、イ ンペリアル・カレッジ・オヴ・サイエン ス，テクノロジー・アンド・メディシン、 デパートメント・オヴ・ケミストリー、イ ンペリアル・カレッジ・ジェネティック・ セラピーズ・センター内 (72)発明者 ペルゼル，エリク イギリス国、エスダブリュー７ ２エイワ イ ロンドン、サウス・ケンジントン、イ ンペリアル・カレッジ・オヴ・サイエン ス，テクノロジー・アンド・メディシン、 デパートメント・オヴ・ケミストリー、イ ンペリアル・カレッジ・ジェネティック・ セラピーズ・センター内 (72)発明者 マーレイ，カール アメリカ合衆国カリフォルニア州95916、 デイヴィス、ニュートン・コート 1544、 ユニヴァーシティ・オヴ・カリフォルニ ア‐デイヴィス、センター・オヴ・ニュー ロサイエンス内 (72)発明者 マンヴェル，ミシェル イギリス国、エスダブリュー３ ６エルア ール ロンドン、マンレサ・ロード、イン ペリアル・カレッジ・オヴ・スクール・オ ヴ・メディシン・アット・ザ・ナショナ ル・ハート・アンド・ラング・インスティ テュート、デパートメント・オヴ・ジー ン・セラピー内 (72)発明者 アルトン，エリック イギリス国、エスダブリュー３ ６エルア ール ロンドン、マンレサ・ロード、イン ペリアル・カレッジ・オヴ・スクール・オ ヴ・メディシン・アット・ザ・ナショナ ル・ハート・アンド・ラング・インスティ テュート、デパートメント・オヴ・ジー ン・セラピー内 (72)発明者 マシューズ，デイヴィッド イギリス国、エルエス９ ７ティーエフ リーズ、ユニヴァーシティ・オヴ・リー ズ、モレキュラー・メディシン・ユニッ ト、セント・ジェイムズ・ユニヴァーシテ ィ・ホスピタル内 (72)発明者 ラッセル，ウィリー イギリス国、ケイワイ16 ９エスティー ファイフ、ユニヴァーシティ・オヴ・セン ト・アンドリューズ、スクール・オヴ・バ イオメディカル・サイエンシズ内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA02 EA10 FA20 4C084 AA03 AA06 AA13 BA34 BA35 BA36 BA44 CA01 CA59 DA40 NA14 ZA011 ZA021 ZA151 ZA161 ZB211 ZB212 ZB261 ZB271 4H045 AA10 AA20 AA30 BA09 BA53 BA54 BA55 BA61 CA01 EA20 EA21 FA34

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 凝縮ポリペプチド／核酸複合体及びカチオン性脂質を含む非
    ウイルス核酸送達ベクターであって、該複合体が、 （ａ）目的とする核酸配列（ＮＯＩ）と、 （ｂ）１種以上のウイルス核酸パッケージングポリペプチド又はそれらの誘導体
    であって、前記ポリペプチド又はその誘導体が（ｉ）ＮＯＩへ結合することがで
    き、かつ（ｉｉ）ＮＯＩを凝縮させることができ、かつこのときＮＯＩが該ポリ
    ペプチドに対して異種であるウイルス核酸パッケージングポリペプチド又はそれ
    らの誘導体とを 含むベクター。
  2. 【請求項２】 少なくとも１種のポリペプチドがアデノウイルス核酸パッケ
    ージングポリペプチド又はそれらの誘導体である請求項１に記載のベクター。
  3. 【請求項３】 アデノウイルスポリペプチドがＭｕ１、ｐＶ又はｐＶＩＩ又
    はそれらの誘導体である請求項２に記載のベクター。
  4. 【請求項４】 さらに核内移行配列（ＮＬＳ）を含むポリペプチドを含む請
    求項１から３のいずれか一項に記載のベクター。
  5. 【請求項５】 核内移行配列（ＮＬＳ）を含むポリペプチドがアデノウイル
    スｐＶ又はそれの誘導体である請求項４に記載のベクター。
  6. 【請求項６】 真核細胞の核へ核酸成分を送達する際に使用するための、カ
    チオン性脂質、ポリペプチド成分及び核酸成分を含む凝縮ポリペプチド／核酸複
    合体であって、 （ｉ）該ポリペプチド成分がウイルス核酸パッケージングポリペプチド又はそれ
    の誘導体であり、 （ｉｉ）該ポリペプチド成分又はそれの誘導体がＮＯＩへ結合することができ、
    そして （ｉｉｉ）該ポリペプチド成分又はそれの誘導体がＮＯＩを凝縮させることがで
    きる、かつ上記核酸が該ポリペプチドに対して異種である複合体。
  7. 【請求項７】 少なくとも１種のポリペプチドがアデノウイルス核酸パッケ
    ージングポリペプチド、又はそれの誘導体である請求項６に記載の複合体。
  8. 【請求項８】 アデノウイルスポリペプチドがＭｕ１、ｐＶ又はｐＶＩＩ又
    はそれらの誘導体である請求項７に記載の複合体。
  9. 【請求項９】 さらに核内移行配列（ＮＬＳ）を含むポリペプチドを含む請
    求項６から８のいずれか一項に記載の複合体。
  10. 【請求項１０】 核内移行配列（ＮＬＳ）を含むポリペプチドがアデノウイ
    ルスｐＶ又はその誘導体である請求項９に記載の複合体。
  11. 【請求項１１】 リポソーム：ＮＯＩ：ポリペプチドの比が２−２０：１：
    ０．５〜１、好ましくは１０〜１４：１：０．５〜０．７、より好ましくはほぼ
    １２：１：０．６である請求項６から１０のいずれか一項に記載の複合体。
  12. 【請求項１２】 カチオン性脂質及び凝縮ポリペプチド／核酸複合体を含む
    非ウイルス核酸送達ベクターを産生する方法であって、 （ａ）目的とする核酸配列（ＮＯＩ）をウイルス核酸パッケージングポリペプチ
    ド又はそられの誘導体と接触させ、ここに前記ポリペプチド成分又はそれらの誘
    導体が（ｉ）ＮＯＩへ結合することができ、かつ（ｉｉ）ＮＯＩを凝縮させるこ
    とができ、ＮＯＩがポリペプチドに対して異種であり、そして （ｂ）このようにして形成された核酸／ポリペプチド複合体をカチオン性脂質と
    接触させることを含む方法。
  13. 【請求項１３】 目的とする核酸配列（ＮＯＩ）を真核細胞内へ導入する方
    法であって、該方法が該細胞を請求項６から１１のいずれか一項に記載の複合体
    と接触させることを備え、該複合体がＮＯＩを含む方法。
  14. 【請求項１４】 該細胞が神経細胞、癌細胞又は上皮細胞である、請求項１
    ３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１に記載の核酸送達ベクターの製造におけるウイル
    ス核酸パッケージングポリペプチド又はその誘導体の使用。
JP2001548745A 1999-12-23 2000-12-12 ウイルスコアタンパク質−カチオン性脂質−核酸送達複合体 Pending JP2003518388A (ja)

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