UA77393C2 - Non-viral vector for introduction of nucleic acid and a process for preparation thereof, condensed complex polypeptide/nucleic acid and a process for insertion of nucleic acid of interest, into eukaryotic cell - Google Patents

Non-viral vector for introduction of nucleic acid and a process for preparation thereof, condensed complex polypeptide/nucleic acid and a process for insertion of nucleic acid of interest, into eukaryotic cell Download PDF

Info

Publication number
UA77393C2
UA77393C2 UA2002076053A UA2002076053A UA77393C2 UA 77393 C2 UA77393 C2 UA 77393C2 UA 2002076053 A UA2002076053 A UA 2002076053A UA 2002076053 A UA2002076053 A UA 2002076053A UA 77393 C2 UA77393 C2 UA 77393C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
polypeptide
nucleic acid
cells
transfection
complex
Prior art date
Application number
UA2002076053A
Other languages
English (en)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed filed Critical
Publication of UA77393C2 publication Critical patent/UA77393C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Description

Опис винаходу
Даний винахід стосується комплексів типу катіонний ліпід/протеїн/нуклеїнова кислота, які містять вірусні 2 упаковувальні протеїни, і їх застосування для ефективного введення нуклеїнових кислот в клітини, такі як нервові клітини.
При створенні винаходу були проведені дослідження вірусних протеїнів, зв'язаних із ДНК, у відношенні їх здатності підсилювати опосередковуване ліпосомами перенесення генів. Зокрема, проводили порівняння кодованого вірусом синтетичного пептиду Ми! і рекомбінантного протеїну Мр1 аденовірусу і вірусу поліоми 70 відповідно. Ми може відігравати роль у конденсації аденовірусної хромосоми, у той час як Мрі є лише структурним протеїном вірусу поліоми, який має ДНК-зв'язувальну активність (1-3). Мр1 на відміну від Миї! містить вбудований класичний сигнал ядерної локалізації (МІ 5), аналогічний до сигналу, виявленому в НМО-1,2 і пів-НІ (2). Було встановлено, що Ми! на відміну від Мр1і істотно підсилює опосередковуване катіонними ліпосомами перенесення генів у клітини, виділені з нервової системи і нирки. Було також встановлено, що 12 опосередковуване Ми! посилення проявлялося в більшому ступені в клітинах, які диференціюються, що свідчить про можливу застосовність даного підходу для нервових клітин іп мімо.
Одержані результати можна використовувати в експериментальних і терапевтичних цілях для опосередковуваного ліпосомами введення ДНК у клітини ЦНС.
Таким чином, об'єктом даного винаходу є невірусний вектор для введення нуклеїнової кислоти, який містить конденсований комплекс поліпептид/нуклеїнова кислота і катіонний ліпід, де комплекс включає (а) нуклеотидну послідовність (МОЇ), що представляє інтерес; і (б) один або декілька вірусних поліпептидів або їх похідних, які упаковують нуклеїнову кислоту, де поліпептиди або їх похідні (І) мають здатність зв'язуватися з МОЇ; і (ІЇ) мають здатність конденсувати МОЇ; і де МОЇ є гетерологічною стосовно поліпептиду. с 29 Переважно принаймні один поліпептид представляє собою аденовірусний поліпептид або його похідне, що Ге) упаковує нуклеїнову кислоту. Більш переважно аденовірусний поліпептид представляє собою Ми!1, рМ або РМІЇ або його похідне.
Поняття "гетерологічний стосовно поліпептиду" означає, що в цьому випадку відсутні вірусні МОЇ, які зустрічаються в природних умовах у комбінації з вірусним упаковувальним поліпептидом. о
У переважному варіанті вектор додатково включає поліпептид, який містить послідовність ядерної Ге»! локалізації (МІ/5). Більш переважно поліпептид, який містить послідовність ядерної локалізації (Мі 5), представляє собою аденовірусний рм або його похідне. о
Об'єктом даного винаходу є також конденсований комплекс поліпептид/нуклеїнова кислота, який включає ї- катіонний ліпід, поліпептидний компонент і компонент, що представляє собою нуклеїнову кислоту, призначений для введення компонента, що представляє собою нуклеїнову кислоту, у ядро еукаріотичної клітини, де: - (І) компонент, який представляє собою поліпептид, є вірусним поліпептидом або його похідним, що упаковує нуклеїнову кислоту; (І) компонент, який представляє собою поліпептид або його похідне, має здатність зв'язуватися з МОЇ; і « (ІП) компонент, що представляє собою поліпептид або його похідне має здатність конденсувати МОЇ; і де З 70 нуклеїнова кислота є гетерологічною стосовно поліпептиду. с Переважно принаймні один поліпептид представляє собою аденовірусний поліпептид або його похідне, що
Із» упаковує нуклеїнову кислоту. Більш переважно аденовірусний поліпептид представляє собою Ми, рмМ або рмі! або його похідне.
У переважному варіанті здійснення комплекс також містить послідовність ядерної локалізації (МІ 5). Більш переважно поліпептид, який містить послідовність ядерної локалізації (МІ 5), представляє собою аденовірусний це. ру або його похідне. -і Даний винахід стосується також способу одержання невірусного вектора, призначеного для введення нуклеїнової кислоти, що містить конденсований комплекс поліпептид/нуклеїнова кислота і катіонний ліпід, який о полягає в тому, що: (Те) 20 (а) нуклеотидну послідовність (МОЇ), що представляє інтерес, приводять у контакт із вірусним поліпептидом або його похідним, що упаковує нуклеїнову кислоту, де компонент, що представляє собою поліпептид або його с» похідне, (І) має здатність зв'язуватися з МО; і (І) має здатність конденсувати МОЇ; і де МОЇ є гетерологічною стосовно поліпептиду; і (б) утворений в результаті комплекс нуклеїнова кислота/поліпептид приводять у контакт із катіонним ліпідом. 29 Даний винахід стосується також способу вбудовування нуклеотидної послідовності (МОЇ), що представляє
ГФ) інтерес, у еукаріотичну клітину, який полягає в тому, що клітину приводять у контакт із комплексом за юю винаходом, який містить МОЇ. Переважно клітина представляє собою нервову, ракову або епітеліальну клітину.
В альтернативному варіанті замість або на додаток до вірусного поліпептиду, що упаковує нуклеїнову кислоту, можна використовувати вірусний поліпептид, що здійснює ядерну локалізацію/введення нуклеїнової 60 кислоти. У дійсності деякі вірусні поліпептиди мають обидві ці функції.
А. Поліпептидні компоненти 1. Вірусні поліпептиди, що упаковують нуклеїнову кислоту
Поняття "вірусний поліпептид, що упаковує нуклеїнову кислоту" звичайно включає поліпептиди, які кодуються вірусними геномами, які присутні в природних умовах у вірусних частинках, функція яких полягає в упакуванні, бо зокрема в конденсації, і введенні в ядро нуклеїнових кислот, які утворюють вірусний геном віріону. Під це поняття також підпадають описані нижче їх гомологи і похідні, а також фрагменти.
Прикладами вірусних поліпептидів, що упаковують нуклеїнову кислоту, є вірусні корові протеїни, такі як коровий антиген вірусу гепатиту В і аденовірусні корові протеїни, Мит, рм і рМмІІ, а також еквівалентні до них протеїни інших аденовірусів, таких як Мазіадепомігизез (аденовіруси ссавців) і Аміадепомігизез (аденовіруси птахів). Найбільш переважним для застосування згідно із даним винаходом вірусним поліпептидом, що упаковує нуклеїнову кислоту, є поліпептид Ми, послідовність якого:
МН2-МейАго-Аго-АІа-Нів-Ніз-Ага-Аго-Аго-Аго-АІа-Зег-Ніз-Ага-Ага-Меї-Ага-Сіу-сІу-ОН (5ЕО ІЮО МО: 1).
Вірусні поліпептиди, що упаковують нуклеїнову кислоту, які можна застосовувати відповідно до даного /о винаходу, мають здатність зв'язуватися з нуклеїновими кислотами, як правило, неспецифічним чином, переважно викликаючи при цьому конденсацію нуклеїнової кислоти. Для забезпечення оптимальної ефективності введення в клітину-мішень у цілому переважно, щоб довжина конденсованої МОЇ дорівнювала або не перевищувала 20Онм, наприклад, становила від 5Онм до 20Онм.
Здатність вірусних поліпептидів зв'язуватися з -"нуклеєїновими кислотами можна оцінювати в дослідах іп 7/5 Уйго за допомогою таких методів, як гель-електрофорез, у тому числі за допомогою аналізу на уповільнення рухливості в гелі, електрофоретичного аналізу зміни рухливості смуг у гелі, аналізу, заснованого на виділенні за допомогою броміду етидію, і афінної хроматографії, наприклад, з використанням одноланцюгової або дволанцюгової ДНК-целюлози.
Здатність вірусних поліпептидів конденсувати нуклеїнові кислоти можна оцінювати, наприклад, за допомогою 2о спектроскопії на основі методу циркулярного дихроїзму (ЦД) (41.
Як правило, при фізіологічних значеннях рН (наприклад, рН 7,4) вірусні поліпептиди або їх гомологи або похідні містять велику кількість позитивно заряджених амінокислотних залишків. Переважно чистий сумарний заряд вірусного поліпептиду при фізіологічному значенні рН є позитивним. Зокрема, переважно, щоб співвідношення заряд':кількість амінокислотних залишків складало принаймні 40,3, переважно принаймні 70,4, сч -0,5 або 0,6.
Переважно, щоб вірусні поліпептиди або їх гомологи або похідні містили залишки аргініну, а не залишки і) лізину, або їх суміш. Найбільш переважно, щоб вірусні поліпептиди або їх гомологи або похідні містили також один або декілька залишків гістидину, переважно два або більше залишки гістидину. Крім того, вірусні поліпептиди або їх гомологи або похідні, як правило, повинні містити велику кількість залишків амінокислот, с зо що мають високу гідрофобність, таких як аланін, наприклад, два або більше гідрофобні залишки.
Слід розуміти, що амінокислотні послідовності, . які можна застосовувати відповідно до винаходу, не Ме) обмежені вірусними поліпептидами, які зустрічаються в природних умовах і які упаковують нуклеїнову кислоту, а со також включають гомологічні послідовності, одержані з будь-якого джерела, наприклад, споріднені вірусні/бактеріальні протеїни, клітинні гомологи і синтетичні пептиди, а також їх варіанти і похідні, такі як - фрагменти. ї-
У контексті даного опису гомологічна послідовність означає послідовність, що містить амінокислотну послідовність, яка принаймні на 60-9095, переважно принаймні на 9595 або 9895, ідентична до принаймні 10, переважно до принаймні 20-50 амінокислот вірусного коревого поліпептиду, наприклад, послідовність Ми, представлену у вигляді ЗЕО ІЮ МО: 1. Гомологію слід оцінювати насамперед для тих ділянок, які як відомо є « 70 важливими для зв'язування нуклеїнової кислоти, а не для сусідніх ділянок, які не мають вирішального значення. шщ с Хоча гомологію можна оцінювати також з погляду подібності (тобто кількості амінокислотних залишків, які мають й подібні хімічні властивості/функції), у контексті даного опису переважно гомологію оцінювати з погляду и? ідентичності послідовностей.
Оцінку гомології можна проводити візуально або, що є більш зручним, за допомогою вже застосовуваних програм порівняння послідовностей. Такі доступні на комерційній основі комп'ютерні програми дозволяють -і розраховувати відсоток гомології двох або декількох послідовностей.
Відсоток гомології можна розраховувати для неперервних послідовностей, тобто коли одну послідовність - порівнюють з іншою послідовністю і кожну амінокислоту в одній послідовності безпосередньо зіставляють з
Ге) відповідною амінокислотою в іншій послідовності, кожного разу з один залишок з іншим залишком. Ця процедура 5ор називається "порівнянням послідовностей без урахування прогалин". Як правило, такі порівняння без іс, урахування прогалин здійснюють лише для відносно невеликої кількості залишків, наприклад, для менше ніж 50 се» суміжних амінокислот.
Хоча даний метод є дуже простим і несуперечливим, він виявляється непридатним, наприклад, при аналізі пар послідовностей, ідентичних за винятком однієї вставки або делеції, він приводити до виключення з розгляду наступних за ними амінокислотних залишків і до значного зменшення відсотку гомології при здійсненні глобального порівняння послідовностей. Внаслідок цього більшість методів порівняння послідовностей створені іФ) для того, щоб мати можливість здійснення оптимального порівняння, що враховує можливі вставки і делеції, при ко якому не відбувається надмірного зменшення загальної оцінки ступеня гомології. Це досягається шляхом введення "прогалин" при порівнянні послідовностей з метою максимізації локальної гомології. во Однак, оскільки при використанні цих більш складних методів для кожної прогалини, який зустрічається при проведенні порівняння, приписується "штраф за прогалину", то існує можливість, що для однієї і тієї ж кількості ідентичних амінокислот даний метод порівняння послідовностей у випадку мінімальної кількості прогалин, що відповідає більш високій подібності двох порівнюваних послідовностей, вони дають більш високу оцінку, ніж для послідовностей з великою кількістю прогалин. Для того, щоб зберегти відносно високу ціну за б5 Наявність прогалини і більш низький штраф за кожен наступний залишок у прогалині, як правило, застосовують "ціну за афінну прогалину". Такий метод представляє собою найбільш часто застосовувану систему оцінки з використанням прогалин. Природно, що високі штрафи за прогалину дозволяють робити більш оптимальні оцінки послідовностей, які мають невелику кількість прогалин. Для більшості програм порівняння послідовностей є можливість коректування штрафів за прогалину. Однак при використанні такого програмного забезпечення для порівняння послідовностей переважно застосовувати параметри, які задаються за умовчанням. Наприклад, при використанні пакета програм СО МУіпзсопзіп Везйнйї (5 штраф, що задається за умовчанням, за прогалину в амінокислотній послідовності складає -12, а за кожне подовження прогалини складає -4.
Таким чином, обчислення відсотка гомології, насамперед, вимагає проведення оптимального порівняння послідовностей з урахуванням штрафів за прогалину. Для здійснення такого порівняння можна використовувати 7/0 Комп'ютерну програму СО УуУіпзсопзіп Вевнії |5). Приклади інших програм, які дозволяють забезпечувати порівняння послідовностей, включають (але не обмежуючись ними) пакет програм ВІ АЗ5Т 6), ЕАЗТА 17) і набір для порівняння послідовностей СЕМЕМУОМКК5. Програми ВІАЗТ і РГАЗТА можна використовувати для дослідження як у режимі оїй-Ійпе, так і оп-ІІпе, однак переважно використовувати програму ССО МУіпзсопвіп Вевзнції.
Хоча кінцевий відсоток гомології можна оцінювати з погляду ідентичності, сам процес порівняння послідовностей звичайно не заснований на порівнянні пар за принципом "так-ні". Замість цього застосовують матрицю відносних балів подібності, відповідно до якої при кожному порівнянні пар на основі хімічної подібності або еволюційної відстані одержують певний бал. Прикладом такої звичайно використовуваної матриці є матриця ВІ О5БИМБб2 - матриця, що задається за умовчанням, для пакета програм ВІ А5Т. У програмах ОСО
МУ/іпзсопзіп Везійї, як правило, використовують або відомі значення, що задаються за умовчанням, або придатну для конкретного випадку таблицю порівняльних символів (більш докладно див. посібник для користувача). Для пакета програм СО переважно застосовувати відомі значення, які задаються за умовчанням, а у випадку використання іншого програмного забезпечення слід застосовувати матрицю, що задається за умовчанням, таку як ВГ ОЗИОМб62.
Після того, як за допомогою програмного забезпечення здійснене оптимальне порівняння послідовностей, сч об Можна розраховувати 79о гомології, переважно 905 ідентичності послідовностей. Звичайно це здійснюють за допомогою програмного забезпечення як певний етап порівняння послідовностей і видають у вигляді чисельного і) результату.
Поняття "похідне" стосовно до амінокислотних послідовностей за даним винаходом стосується будь-якого заміщення, зміни, модифікації, заміни, делеції або додавання однієї (або декількох) амінокислот у с
Зо послідовності, які дозволяють одержувати кінцеву амінокислотну послідовність, яка має активність у відношенні зв'язування з нуклеїновими кислотами і їх конденсації, що переважно має принаймні таку же активність, як і Ме немодифіковані поліпептиди. с
Для застосування згідно із даним винаходом можна модифікувати вірусні поліпептиди. Звичайно здійснюють такі модифікації, які зберігають здатність послідовності зв'язуватися з нуклеїнової кислотою і конденсувати ї- її. Кількість амінокислотних замін може складати, наприклад, від 1, 2 або З до 10, 20 або 30 за умови, що ї- модифікована послідовність зберігає здатність зв'язуватися з нуклеїнової кислотою і конденсувати (її.
Амінокислотні заміни можна робити з використанням аналогів, які не зустрічаються в природних умовах, наприклад, з метою збільшення часу напівжиття в плазмі поліпептиду, що вводитися з терапевтичною метою.
Зокрема, може виявитися доцільним здійснювати амінокислотні заміни для того, щоб збільшувати при « фізіологічному значенні рн чистий позитивний заряд вірусного упаковувального поліпептиду, який зустрічається з с в природних умовах. Позитивно заряджені амінокислоти включають аргінін, лізин і гістидин. Аргінін має . найбільший заряд серед амінокислот, які зустрічаються в природних умовах, і тому є найбільш переважним. и? Консервативні заміни можна здійснювати, наприклад, відповідно до Таблиці 1. -1 000 подяднюю 00 амноююслот, - Аліфатичні |Неполярні с
Полярні - які не мають електричного заряду
Ф нині зи е
Ароматичні! 77771111 НМ
Консервативні заміни можна здійснювати, наприклад, відповідно до наведеної вище таблиці. Амінокислоти, (Ф) вказані у Таблиці 1 в одному й тому ж блоці в другому стовпчику й переважно в одному й тому ж рядку в
ГІ третьому стовпчику, можна замінювати одну на одну.
Поліпептиди, призначені для застосування відповідно до винаходу, можна одержувати рекомбінантними бо Методами, наприклад, як описано нижче. Однак їх можна також одержувати синтетичним шляхом за допомогою добре відомих фахівцям у даній галузі методів, таких як метод твердофазного синтезу. Поліпептиди, призначені для застосування відповідно до винаходу, можна створювати також у вигляді злитих протеїнів, наприклад, для цілей екстракції й очищення. Прикладами компонентів злитих протеїнів є глутатіон-5-трансфераза (51), бхНів,
СА 4 (ДНК-зв'язувальні домени і/або домени, які активують транскрипцію ) і рд-галактозидаза. Може виявитися 65 доцільним вбудовувати сайт протеолітичного розщеплення між компонентом, що представляє собою злитий протеїн, і послідовністю протеїну, що представляє інтерес, для того, щоб мати можливість видаляти послідовності злитого протеїну. Переважно компонент, що представляє собою злитий протеїн, не знижує біологічну активність протеїну, який має послідовність, що представляє інтерес.
Поліпептиди, призначені для застосування відповідно до винаходу, можуть знаходитися в практично виділеній формі. Це означає, що поліпептиди можна змішувати з носіями або розріджувачами, які не впливають на цільову функцію поліпептидів і тому останні можна розглядати як практично виділені. Поліпептиди можуть знаходитися також у практично очищеній формі, де як правило більше 9095, наприклад, 95, 98 або 9995 протеїну в композиції містить поліпептиди, призначені для застосування відповідно до винаходу. 2. Поліпептиди, які містять послідовності ядерної локалізації 70 В переважному варіанті здійснення вектор для введення/комплекс за винаходом додатково включає поліпептид, який містить послідовність ядерної локалізації (МІ 5). У цілому М/З добре відомі в даній галузі
ІВІ. Однак найбільше переважно використовувати МІ З аденовірусного корового протеїну рМ. МІ 5 протеїну ру представляє собою послідовність
ЕРЕККАТТКВЛТТТОТКЕККААК (ЗЕО ІО МО: 2).
Послідовність БЕО ІЮО МО: 2 відповідає амінокислотам 315-337 (0. Мацем/в, не опубліковано).
Ще одна МІ 5 розташована на М-кінці: (КРЕКІ КЕУККККК ( 5ЕО ІО МО: 3), хоча переважно, щоб МІ 5 була розташована на С-кінці.
МІ 5 може бути присутнім на поліпептидній молекулі, відмінній від упакувального поліпептиду, або у вигляді го частини одного і того ж ланцюга такого поліпептиду, наприклад, у складі злитого протеїну.
Б. Нуклеотидні послідовності, які представляють інтерес
Нуклеотидні послідовності (МОЇ), що представляють інтерес, які потрібно вводити в клітини за допомогою призначеного для введення вектора або комплексу за винаходом, можуть містити ДНК або РНК. Вони можуть бути одноланцюговими або дволанцюговими. Вони можуть також представляти собою полінуклеотиди, які с містять одержані синтетичним шляхом або модифіковані нуклеотиди. У даній галузі відомо велика кількість різних типів модифікацій олігонуклеотидів. Вони включають використання метилфосфонатних і фосфортіоатних і) каркасів, введення акридинових або полілізинових ланцюгів на 3'- і/або 5-кінці молекули. Слід розуміти, що для цілей даного винаходу вказані в даному описі полінуклеотиди можна модифікувати будь-яким відомим в даній галузі методом. Такі модифікації можна здійснювати для того, щоб підвищувати активність іп мімо або с зо тривалість життєвого циклу МОЇ.
Як правило МОЇ містять гетерологічний ген. Поняття "гетерологічний ген" стосується будь-якого гена. Ме
Гетерологічний ген може представляти собою будь-який алельний варіант гена дикого типу або може со представляти собою мутантний ген. Поняття "ген" стосується нуклеотидних послідовностей, які мають принаймні здатність до транскрипції. Таким чином, вказане поняття включає послідовності, які кодують мРНК, тРНК і пРНК, в. зв а також антисмислові конструкції. Нуклеїнові кислоти можуть представляти собою, наприклад, рибонуклеїнову ї- кислоту (РНК) або дезоксирибонуклеїнову кислоту (ДНК) або їх аналоги. Послідовності, які кодують мРНК, можуть необов'язково містити деякі або всі 5- або 3'-транскрибовані, але не трансльовані фланкуючі послідовності, природним або іншим способом зв'язані з трансльованою кодувальною послідовністю. Вони можуть необов'язково додатково містити зв'язані з транскрипцією послідовності, як правило зв'язані з « транскрибованими послідовностями, наприклад, сигнали термінації транскрипції, сайти поліаденілювання і з с розташовані по ходу транкрипції енхансерні елементи.
Транскрибована послідовність гетерологічного гена переважно функціонально зв'язують з контролюючою з послідовністю, що дозволяє здійснювати експресію гетерологічного гена в клітинах ссавців, переважно в нервових клітинах, таких як клітини центральної і периферичної нервової системи, ракові або епітеліальні
КЛІТИНИ. -І Поняття "функціонально зв'язаний" стосується такого розташування розглянутих компонентів, яке дозволяє їм здійснювати свої функції необхідним чином. Контролюючу послідовність, функціонально зв'язану з
Ш- кодувальною послідовністю вбудовують шляхом лігування таким чином, щоб експресія кодувальної 2) послідовності відбувалася в умовах, які є прийнятними для контролюючої послідовності.
Контролююча послідовність містить промотор, який забезпечує експресію гетерологічного гена, і сигнал ік термінації транскрипції. Промотор вибирають з числа промоторів, які можуть функціонувати в клітинах ссавців, сю переважно в клітинах людини. Промотор можна одержувати з промоторних послідовностей еукаріотичних генів.
Наприклад, він може представляти собою промотор, одержаний з генома клітини, у якій може здійснюватися експресія гетерологічного гена, переважно клітини центральної або периферичної нервової системи ссавця. Промотори з еукаріотичних клітин можуть представляти собою промотори, які здійснюють свою функцію незалежно від типу тканини (такі як промотори р-актину, тубуліну), або в альтернативному варіанті іФ) тканинноспецифічним чином (такі як промотори генів піруваткінази). Вони можуть представляти собою також ко промотори, які реагують на певні стимули, наприклад, промотори, які зв'язуються з рецепторами стероїдних гормонів. Можна використовувати також вірусні промотори, наприклад, промотор довгого кінцевого повтору бо ДТК) вірусу мишиного лейкозу Молоні (ММІМ), або промотори генів вірусу герпесу.
Може виявитися переважним використовувати також такі індуцибельні промотори, які дозволяють регулювати рівні експресії гетерологічного гена протягом життєвого циклу клітини. Індуцибельність означає, що можна регулювати контрольовані промотором рівні експресії.
Крім того, будь-який з цих промоторів можна модифікувати шляхом введення додаткових регуляторних б5 послідовностей, наприклад, енхансерних послідовностей. Можна використовувати також химерні промотори, які містять елементи послідовностей із двох або більшої кількості різних вказаних вище промоторів. Крім того,
може виявитися доцільним використовувати ділянки контролю локусу (І СК).
Гетерологічний ген, як правило, кодує поліпептид, призначений для терапевтичних цілей. МОЇ послідовності за даним винаходом включають (але не обмежуючись ними) такі послідовності, які можна застосовувати для терапевтичних іабо діагностичних цілей: послідовності, які кодують цитокіни, хемокіни, гормони, антитіла, сконструйовані імуноглобулінподібні молекули, одноланцюгове антитіло, злиті протеїни, ферменти, молекули для імунної костимуляції, імуномодуляторні молекули, антисмислову РНК, трансдомінантний негативний мутант протеїну-мішені, токсин, умовний токсин, антиген, протеїн-супресор пухлини і фактори росту, мембранні протеїни, вазоактивні протеїни і пептиди, антивірусні протеїни і рибозими і їх похідні (такі, які містять /о зв'язану репортерну групу).
Прикладами поліпептидів, які можна застосовувати для терапевтичних цілей, є нейротрофні фактори, такі як фактор росту нервової тканини (МОРЕ), циліарний нейротрофічний фактор (СМТЕ), нейротрофічний фактор головного мозку (ВМТЕ) і нейтрофіни (такі як МТ-3, МТ-4/5), які потенційно можна застосовувати як терапевтичні агенти для лікування неврологічних захворювань, таких як хвороба Паркінсона.
МОЇ, що можна застосовувати відповідно до даного винаходу для лікування або профілактики раку, включають МОЇ, які кодують протеїни, які: руйнують клітину-мішень (наприклад, рибосомний токсин), діють як: супресори пухлини (такі як ро5З3З дикого типу); активатори протипухлинних імунних механізмів (такі як цитокіни, молекули для імунної костимуляції і імуноглобуліни); інгібітори ангіогенезу; або протеїни, які підсилюють чутливість до лікарських засобів (такі як ферменти, які активують проліки); непрямо стимулюють руйнування
Клітини-мішені природними ефекторними клітинами (наприклад, сильний антиген, який стимулює імунну систему або перетворюючий субстанцію-попередник у токсичну субстанцію, яка руйнує клітину-мішень (наприклад, фермент, який активує проліки)). Кодовані протеїни можуть також руйнувати присутні пухлинні клітини (наприклад, за допомогою секретованого злитого протеїну, який має протипухлинну активність: антитіло-рибосомний токсин), стимулювати непрямим чином руйнування присутніх пухлинних клітин (наприклад, с об цитокінами, стимулюючи імунну систему, або прокоагулянтними протеїнами, викликаючи місцеву закупорку судин) або перетворювати субстанцію-попередник у токсичну субстанцію, яка руйнує присутні пухлинні клітини і) (наприклад, фермент, який активує проліки, перетворюючи їх в лікарський засіб, який має здатність до дифузії).
Можна застосовувати МОЇ, які кодують антисмислові транскрипти або рибозими, які впливають на експресію клітинних або патогенних генів, наприклад, на експресію клітинних генів, які обумовлюють персистентність до с зр пухлини (наприклад, у відношенні аберрантних тус-транскриптів при лімфомі Беркітта або у відношенні рег-арі-транскриптів при хронічному мієлоїдному лейкозі). Можна застосовувати також комбінації таких МОЇ. Ме
Замість цього або разом з цим, МОЇ або декілька МОЇ, якщо вони вибірково експресуються в с тканинах-мішенях, можна використовувати для кодування ферменту або ферментів, що активує(ють) проліки, які не робить вираженої дії або не робить шкідливої дії доти, поки індивідуума не обробляють одним або декількома в. проліками, на які впливають фермент або ферменти. У присутності активної МОЇ обробка індивідуума ї- відповідними проліками приводить до більш значного зниження росту пухлини або підвищує виживання.
Для лікування раку фермент, який активує проліки, можна вводити в ділянку пухлини. У кожному випадку для лікування пацієнта застосовують необхідні проліки в сполученні з відповідним активувальним проліки ферментом. Відповідні проліки вводять у сполученні з вектором. Прикладами проліків є: етопозидфосфат (у « сполученні з лужною фосфатазою); 5-флуорцитозин (у сполученні з цитозиндеаміназою); пт) с доксорубіцин-М-пара-гідроксифеноксіацетамід (у сполученні з пеніцилін-М-амідазою); пара-М-біс(2-хлоретил)амінобензоїлглутамат (у сполученні з карбоксипептидазою (32); цефалоспоринові азотні ;» гірчичні карбамати (у сполученні з р-лактамазою); 5К4233 (у сполученні з редуктазою Р450); ганцикловір (у сполученні з тимідинкіназою Н5М); проліки на основі гірчиці, які містять нітроредуктазу і циклофосфамід (у сполученні з Р450). -і Прикладами ферментів, які активують проліки, які можна застосовувати відповідно до винаходу, є тимідинфосфорилаза, яка активує 5-флуорурацилові проліки капсетабін і фуртулон; тимідинкіназа вірусу герпесу
Ше простого, яка активує ганцикловір; цитохром Р450, які активує такі проліки, як циклофосфамід, з утворенням
Ге) агента, який пошкоджує ДНК; і цитозиндеаміназа, яка активує 5-флуорцитозин. Переважно використовують фермент, який виробляється в організмі людини. о МОЇ можуть також кодувати корові поліпептиди, які застосовують як вакцини. Переважно такі антигенні се» поліпептиди одержують з патогенних організмів, наприклад, з бактерій або вірусів. Прикладами таких антигенних поліпептидів є антигени вірусу гепатиту С, поверхневі або ядерні антигени вірусу гепатиту В, антигени ВІЛ, токсин коклюшу, токсин холери або токсин дифтерії.
МОЇ можуть включати також маркерні гени (наприклад, які кодують р-галактозидазу або зелений флуоресцентний протеїн) або гени, продукти яких регулюють експресію інших генів (наприклад, фактори, які о регулюють транскрипцію). іме) У тому випадку, якщо захворювання викликається дефектним геном, наприклад, у випадку кістозного фіброзу, можна вводити МОЇ, які кодують повний функціонально активний алель гена. В даний час виявлена 60 причина різних генетичних порушень на молекулярному рівні і клоновані функціональні послідовності дикого типу. Для заміни дефектного гена шляхом гомологічної рекомбінації може виявитися доцільним включати в МОЇ фланкуючі послідовності для генів, застосовуваних для терапевтичних цілей, які є гомологічними до відповідних фланкуючих послідовностей геному.
Для здійснення генної терапії, а також для інших цілей, може бути потрібним введення декількох генів. При 65 лікуванні різних станів може виявитися переважною експресія декількох генів. Оскільки немає обмежень на розмір МОЇ, яку можна вбудовувати в здійснюючий введення вектор або комплекс за винаходом, то може виявитися можливим здійснювати спрямоване перенесення у клітини одночасно декількох генів.
В. Катіонні ліпіди
У даній галузі відомо велика кількість катіонних ліпідів (9), деякі з яких наведені нижче. Приклади структур катіонних ліпідів, які можна застосовувати відповідно до даного винаходу, наведені в |З). У цілому в композиціях і способах за винаходом можна застосовувати будь-які катіонні ліпіди, як одновалентні, так і полівалентні. Як правило, переважними є полівалентні катіонні ліпіди. Катіонні ліпіди містять насичену і ненасичену алкільну групу та аліциклічні прості і складні ефіри амінів, амідів або їх похідних. Алкільні або алкенові групи катіонних ліпідів, які мають прямий або розгалужений ланцюг, можуть містити від 1 до приблизно 7/0 25 атомів вуглецю. Переважними є алкільні або алкенові групи з прямим або розгалуженим ланцюгом, які містять шість або більше атомів вуглецю. Аліциклічні групи можуть містити приблизно 6-30 атомів вуглецю. Переважно аліциклічні групи містять холестерин або інші стероїдні групи. Катіонні ліпіди можна одержувати з використанням різних протиїіонів (аніонів), які включають серед іншого: хлорид, бромід, йодид, фторид, ацетат, трифторацетат, сульфат, нітрит і нітрат.
Широко відомим катіонним ліпідом є хлорид М-(1-(2,3-діолеїлокси)пропіл|-М,М,М-триметиламонію (ДОТМА).
ДОТМА та аналогічний складний діефір ДОТАП (1,2-біс(олеїлокси)-3--триметиламоній)пропан) є в продажу.
Інші катіонні ліпіди, які мають подібну до ДОТАП структуру, описані у (10Ї, включеному в даний опис як посилання.
Інші групи катіонних ліпідів, споріднені ДОТМА і ДОТАП, які можна застосовувати відповідно до винаходу, звичайно називають простими БОКІ-ефірами або складними БОКІ-ефірами. БОКІ-ліпіди відрізняються від
ДОТМА і ДОТАП тим, що в них одна з метильних груп у групі триметиламонію заміщена гідроксіетильною групою.
Олеїлові групи БОКІ-ліпідів можна заміщувати іншими алкільними або алкеновими групами, такими як пальмітоїольна або стеароїльна групи. Гідроксильну групу ліпідів ООКІ-типу можна використовувати як сайт для наступної функціоналізації, наприклад, для етерифікації з утворенням амінів, таких як карбоксиспермін. сч
Інші катіонні ліпіди, які можна застосовувати в призначених для введення векторах або комплексах за даним винаходом, включають ліпіди, описані в (11) як вектори, придатні для трансфекції клітин. (8)
Згідно із даним винаходом можна застосовувати також катіонні стерольні похідні, наприклад,
Зр-ЇМ-(М';М'-диметиламіноетан)карбамоїл|холестерин (0С-Спої), у якому холестерин зв'язаний із триалкіламонійною групою. Є дані про те, що ЮС-Свпо! забезпечує для тих самих ліній клітин більш ефективну «о трансфекцію і меншу токсичність, ніж ліпосоми, які містять ДОТМА. Можна також застосовувати поліамінові похідні ОС-Сто)ї, такі як описані в (12). о
У призначених для введення векторах або комплексах за винаходом можна застосовувати також полікатіонні «У ліпіди, які містять карбоксиспермін. В І(13| описаний карбоксиспермін, який містить катіонні ліпіди, у тому числі 5-карбоксиспермілгліциндіоктадециламід (ДОГО) і - дипальмітоїлфосфатидилетаноламін-5-карбоксисперміламід (ДПФЕС). Інші катіонні ліпіди можна одержувати /|че шляхом заміщення октадецильних і пальмітоїльних груп ДОГС і ДПФЕС відповідно іншими алкільними або алкеновими групами.
У призначених для введення векторах або комплексах за винаходом катіонні ліпіди необов'язково можна « об'єднувати з некатіонними допоміжними ліпідами, переважно нейтральними ліпідами, з утворенням ліпосом або ліпідних агрегатів. Нейтральні ліпіди, які можна застосовувати відповідно до даного винаходу, включають серед - с іншого: лецитини; фосфатидилетаноламіни, такі як ДОФЕ (діолеглфосфатидилетаноламін), ПОФЕ ц (пальмітоїлолеїлросфатидилетаноламін) і ДСФЕ (дистеароїлросфатидилетаноламін); фосфатидилхолін; "» фосфатидилхоліни, такі як ДОФХ (діолеїлросфатидилхолін), ДПФХ (дипальмітоїлросфатидилхолін), ПОФХ (пальмітоїлолеїлфосфатидилхолін) і дсФх (дистеароїл фосфатидилхолін); фосфатидилгліцерин; фосфатидилгліцерини, такі як ДОФГ (діолеглросфатидилгліцерин), ДПФГ (дипальмітоїлфосфатидилгліцерин) і -І дсФг (дистеароїлфосфатидилгліцерин); фосфатидилсерини, такі як діолеоїл- або дипальмітоїлфосфатидилсерин; дифосфатидилгліцерини; ефіри жирних кислот; складні ефіри гліцерину; сфінголіпиди; кардоліпин; цереброзиди і цераміди; та їх суміші. Нейтральні ліпіди включають також холестерин о і інші ЗООН-стероли.
Крім того, у призначені для введення вектор або комплекси за винаходом необов'язково можна включати ї-о одну або декілька амфіфільних сполук для модифікації їх поверхневих властивостей. Амфіфільні сполуки, які се» можна застосовувати відповідно до даного винаходу, включають серед іншого неогліколіпиди, такі як СІ 04 і
ГИ, наведені на Фіг.22, поліетиленглікольні ліпіди, такі як
М-(о-метокси(поліоксіетилен)оксикарбоніл)росфатидилетаноламін,
М-монометокси(поліоксіетилен)сукцинілфосфатидилетаноламін і простий ефір поліоксіетилену і холестерину; о неіоногенні поверхнево-активні речовини, такі як алкілглікозиди, алкілметилглюкаміди, складні ефіри сахарози, прості алкілові ефіри полігліцерину, прості алкілові ефіри поліоксіетилену і прості алкілові ефіри сорбітану їмо) й оксіетилену і стероїдні прості ефіри оксіетилену; блок-співполімери, такі як блок-співполімери поліоксіетилену і поліоксипропілену. 6о0 Відповідно до одного з варіантів здійснення катіонний ліпід за даним винаходом модифікують за допомогою фрагмента цукру або фрагмента поліетиленгліколю (ПЕГ). Ще одним об'єктом винаходу є комплекс за винаходом, який додатково містить сполуку, яка має здатність функціонувати як катіонний ліпід, причому сполука містить холестеринову групу, приєднану за допомогою аміногрупи, фрагмента цукру або поліетиленгліколевого фрагмента. Як це продемонстровано в прикладах, при створенні винаходу було б5 встановлено, що найбільш переважно застосовувати катіонні ліпіди, модифіковані з використанням цукру/ПЕГ.
Таким чином, ще одним об'єктом даного винаходу є сполука, яка має здатність функціонувати як катіонний ліпід,
де сполука містить холестеринову групу, приєднану за допомогою аміногрупи, фрагмента цукру або поліетиленгліколевого фрагмента. Переважна сполука містить 1-7 залишків цукру або залишків поліетиленгліколю. Сполука може містити суміш залишків цукру і залишків поліетиленгліколю. Переважно фрагмент цукру представляє собою глюкозу або ЮО-глюкозу або є її похідним.
Г. Комплекси катіонний ліпід/МО/упаковувальний поліпептид
Призначений для введення вектор/комплекс за даним винаходом, як правило, одержують, здійснюючи спочатку контакт упаковувального поліпептиду з МОЇ у стерильній пробірці протягом приблизно 1Охв. при кімнатній температурі, у результаті чого утворюється конденсований комплекс поліпептид/МОї|. Стандартний 7/0 метод полягає в тому, що в пробірці наносять паралельно одна до одної плями нуклеїнової кислоти і протеїну, які не контактують одна з одною, і потім ініціюють змішування шляхом додавання декількох сотень мікролітрів рідкого носія, такого як фармацевтично прийнятний носій, ексципієнт або розріджувач.
Ще одним переважним способом одержання призначеного для введення вектора/комплексу за даним винаходом є приведення упаковувального поліпептиду у контакт із МОЇ шляхом безперервного обертання.
Як правило, використовують співвідношення МОЇ і поліпептиду, що складає принаймні 1:11, переважно від 1:1 до 2:1, більш переважно від 1,411 до 1,91, найбільш переважно від 1,5:1 до 1,8:1. При створенні винаходу було встановлено, що найбільш ефективно використовувати співвідношення МОЇ і поліпептиду, що складає приблизно 1:0,6 (-1,7:1). У деяких варіантах здійснення винаходу звичайно використовується співвідношення поліпептиду до МОЇ від 0,2 до 1,5, переважно від 0,3 до 1,2 (мас./мас.), більш переважно від 0,2 до 0,7. В інших варіантах здійснення співвідношення поліпептиду і МОЇ звичайно складає принаймні 10:1 або принаймні 20:11 (мас./мас.). Однак оптимальне співвідношення може залежати від співвідношення заряд кількість амінокислоти в упаковувальному поліпептиді. Як правило чим нижче співвідношення заряд'кількість амінокислот, тим більш високе співвідношення поліпептид:МОЇ слід використовувати.
Потім у комплекс додають катіонні ліпіди. Відповідно до одного з варіантів здійснення катіонні ліпіди сч г Можуть представляти собою частину заздалегідь сформованих ліпосом, що включає два або декілька ліпідних компонентів, таких як ОС-Стної і ДОФЕ. Катіонні ліпіди звичайно інкубують з комплексом поліпептид/МОї! протягом (8) приблизно 20Охв. при кімнатній температурі Ще один і переважний метод додавання катіонних ліпідів представляє собою додавання у вигляді суспензії катіонних ліпосом. Такий кінцевий комплекс із додаванням 10965 сахарози (мас./мас.) можна зберігати до застосування при температурі приблизно -80960. с
Співвідношення кількості ліпосом і МОЇ звичайно складає приблизно від 3:1 до 20:11, переважно від 6:1 до 15:11, більш переважно від 8:11 до 14:1. При створенні винаходу було встановлено, що найбільш переважне іа співвідношення кількості ліпосом і МОЇ складає 12:11. В інших варіантах здійснення співвідношення кількості со ліпосом і МОЇ звичайно складає приблизно від 2:11 до 10:11 або від 3:1 до 6:1. Якщо катіонні ліпіди застосовують у сполученні з нейтральними ліпідами, то співвідношення як правило складає приблизно 1:1. -
У найбільш переважному варіанті співвідношення кількостей ліпосоми: МОІ:поліпептид складає 3-20:1:0,5-1, ї- переважно 8-14:1:0,5-0,7, більш переважно «12:1: 6.
Після цього призначений для введення вектор/комплекс готовий до застосування. Хоча переважно змішувати різні компоненти в вказаному вище порядку, можна об'єднувати компоненти в довільному порядку. Якщо необхідно додавати інші поліпептидні компоненти, то їх можна додавати на будь-якій стадії, однак переважно « додавати в сполученні з упаковувальним поліпептидом. 8 с Може виявитися доцільним включати до складу векторів/комплексів інші компоненти, наприклад, ліганди, які й здійснюють зв'язування з рецепторами на поверхні клітин, для того, щоб надати векторам/комплексам певну и? ступінь вибірковості у відношенні типу клітин. Ліганди включають пептиди, глікопротеїни, олігосахариди, лектини й антитіла та їх фрагменти.
Д. Введення -і Для одержання фармацевтичної композиції (яку можна застосовувати для людини або тварини) призначений для введення вектор/комплекс за винаходом переважно об'єднують з фармацевтично прийнятним носієм або
Ше розріджувачем. Придатні носії і розріджувачі включають ізотонічні соляні розчини, наприклад, забуферений
Ге) фосфатом соляний розчин. Композицію за винаходом можна вводити безпосередньо шляхом ін'єкції. Композицію можна виготовляти у формі, придатній для парентерального, внутрішньом'язового, о внутрішньовенного, підшкірного, інтраокулярного або трансдермального введення або введення шляхом се» інгаляції. Як правило, кожну МОЇ можна вводити в дозі, що складає від 1Онг/(кг ваги тіла) до 1Омкг/(кг ваги тіла), переважно від О,Тмкг/(кг ваги тіла) до 1Омкг/(кг ваги тіла), більш переважно від 0О,1мкг/(кг ваги тіла) до мкг/кг ваги тіла).
В альтернативному варіанті трансфекцію клітин пацієнта можна здійснювати ех мімо шляхом виділення тканини пацієнта, здійснення її трансфекції з використанням призначеного для введення вектора/комплексу за іФ) винаходом, і наступної повторної імплантації трансфектованої тканини. ко Описані шляхи введення і дози наведені лише як приклад, оскільки фахівець у даній галузі може легко визначати оптимальний шлях введення і дози для конкретного пацієнта і стану. во Е. Застосування
Призначені для введення вектори/комплекси за даним винаходом можна застосовувати для здійснення ефективної трансфекції МОЇ еукаріотичних клітин, зокрема клітин ссавців. Було встановлено, що призначені для введення вектори/комплекси більш ефективні в порівнянні з існуючими композиціями для трансфекції нервових клітин. їх можна застосовувати конкретно, по-перше, для наукових досліджень, у яких використовуються нервові 65 Клітини, і, по-друге, у клінічній практиці, коли необхідно здійснювати введення МОЇ у клітини центральної або периферичної нервової системи людини або тварини. Більш конкретно призначені для введення вектори/комплекси за даним винаходом можуть знайти застосування в галузях, пов'язаних із введенням МОЇ, таких як генна терапія, введення ДНК-вакцини і дослідження, пов'язані з трансфекцією іп міго.
Прикладами захворювань, які можна лікувати з використанням комплексів/векторів за винаходом, є захворювання периферичної або центральної нервової системи, такі як нейродегенеративні захворювання і порушення нервової тканини вв результаті пошкодження/травми, у тому числі внаслідок "Уударів".
Нейродегенеративні захворювання включають, зокрема, прогресуючу м'язову атрофію, деякі вроджені захворювання, такі як сімейна вегетативна дисфункція і спінальна м'язова атрофія дітей раннього віку, а також нейродегенеративні захворювання, які розвиваються в похилому віці, такі як хвороби Паркінсона і Альцгеймера. 70 Призначені для введення вектори/комплекси за винаходом можна використовувати також для введення в терапевтичних цілях генів пацієнту, що страждає від злоякісних захворювань. Прикладами злоякісних захворювань, які можна лікувати таким чином, є рак молочної залози, шийки матки, ободової кишки, прямої кишки, ендометрію, нирки, легені, яєчника, підшлункової залози, передміхурової залози, шкіри, шлунка, сечового міхура, ЦНС, стравоходу, голови або шиї, печінки, яєчок, тимусу або щитовидної залози. Об'єктом 7/5 Лікування можуть бути також злоякісні захворювання кров'яних клітин, клітин кісткового мозку, В-лімфоцитів,
Т-лімфоцитів, попередників лімфоцитів або попередників мієлоїдних клітин.
Пухлина може представляти собою тверду пухлину або нетверду пухлину, і вона може бути основною пухлиною або дисемінованою метастатичною (вторинною) пухлиною. Нетверді пухлини включають мієлому; лейкоз (гострий або хронічний, лімфозний або мієломний), такий як гострий мієлобластний, гострий 2о промієлозний, гострий мієломоноцитарний, гострий моноцитарний лейкоз, еритролейкоз; і лімфоми, такі як лімфома Ходжкіна, не-ходжкінска лімфома і лімфома Беркітта. Тверді пухлини включають карциному, карциному ободової кишки, дрібноклітинну карциному легені, недрібноклітинну карциному легені, аденокарциному, меланому, базально-клітинну або плоскоклітинну карциному. мезотеліому, нейробластому, гліому, астроцитому, медуллобластому, ретинобластому, саркому, остеосаркому, рабдоміосаркому, фібросаркому, остеогенну с ов саркому, гепатому і семіному.
До інших захворювань, які представляють інтерес, належать захворювання, які викликаються мутаціями і) (вродженими або соматичними) нормальних клітинних генів, такі як кістозний фіброз, таласемії і т.п.
Інші галузі застосування, що представляють інтерес, включають лікування пов'язаних з імунною системою порушень, таких як відторгнення трансплантата органа та аутоімунні захворювання. Спектр аутоїмунних со зо захворювань охоплює як специфічні для органа захворювання (такі як тиреоїдит, інсуліт, розсіяний склероз, іридоцикліт, увеїт, орхіт, гепатит, хвороба Аддісона, важка псевдопаралітична міастенія), так і системні Ме) хвороби, такі як ревматоїдний артрит і інші ревматичні захворювання, або системний червоний вовчок. До інших с порушень належать імунна гіперреактивність, наприклад, алергічні реакції, зокрема пов'язані з виробленням гістаміну, і астма. в.
Нижче винахід більш докладно пояснений за допомогою прикладів, які наведені лише з метою ілюстрації і не ї- служать для обмеження обсягу винаходу.
Опис креслень
На Фіг.1 наведене зображення пластини;
На Фіг.2 наведений графік; «
На Фіг.3 наведене зображення пластини; з с На Фіг.4 наведений графік;
На Фіг.5 наведений графік; з На Фіг.6 наведений графік;
На Фіг.7 наведений графік;
На Фіг.8 наведений графік; -І На Фіг.9 наведені структури;
На Фіг.10 наведений графік; - На Фіг.11 наведений графік; 2) На Фіг.12 наведений графік;
На Фіг.13 наведений графік; се) На Фіг.14 наведений графік; 4) На Фіг.15 наведений графік;
На Фіг.16 наведене зображення пластини;
На Фіг.17 наведений графік;
На Фіг.18 наведений графік;
На Фіг.19 наведена структура; (Ф) На Фіг.20 наведена реакційна схема; ка На Фіг.21 наведена реакційна схема;
На Фіг.22 наведена структура; во На Фіг.23 представлений принцип включення міцел;
На Фіг.24 наведений графік;
На Фіг.25 наведений графік.
Докладний опис креслень (фігури 1-6)
Фіг.1 - Аденовірусний коровий протеїн Ми! має більшу ефективність у відношенні зв'язування з плазмідною 65 ДНК (пДнНК), ніж коровий протеїн Мр1 вірусу поліоми.
А) Присутність БСА (бичачий сироватковий альбумін) не впливало на електрофоретичну рухливість пДНК.
рРСОММД (Імкг) інкубували з Омкг (смуга 2), 5мкг (смуга 3), 1Омкг (смуга 4), 15мкг (смуга 5), 20мкг (смуга 6), 25мкг (смуга 7) і ЗОмкг (смуга 8) БСА протягом 10хв. при кімнатній температурі в їхНВ5. Потім зразки аналізували в 195 агарозному гелі у відношенні зміни рухливості. Не було виявлено ніяких змін електрофоретичної рухливості при додаванні БСА.
Б) На відміну від БСА пептид Ми1 сильно впливав на рухливість пДНК. Аналогічно до методу, описаному в розділі А, рРСММр (Імкг) інкубували з 0,25мкг (смуга 2), О,5мкг (смуга З), мкг (смуга 4), 2мкг (смуга 5), 4мкг (смуга 6), бмкг (смуга 7) і Омкг (смуга 8) рекомбінантного пептиду. Хоча при співвідношенні кількості протеїну і пДНК, яке дорівнює 0,25 (мас/мас.) (смуга 2), рухливість релаксованої форми рСММУдД не змінювалася 70 (верхня смуга), спостерігалася невелике сповільнення рухливості суперспіральної пДНК (нижня смуга). Однак при співвідношеннях вказаних кількостей, які дорівнюють або перевищують 0,5 (мас/мас), міграція обох форм пДНК істотно сповільнюється.
В) Протеїн Мр11 вірусу поліоми мав набагато меншу ефективність у відношенні зниження рухливості пДНК.
РСОММУдД (Імкг) інкубували з 2мкг (смуга 2), 4мкг (смуга З), бмкг (смуга 4), мкг (смуга 5), 1бмкг (смуга 6), 75 З2мкг (смуга 7) і Омкг (смуга 8) Мр1. Лише при співвідношеннях протеїн:ПДНК (мас/мас), які дорівнюють або перевищують 6, спостерігалося істотне уповільнення рухливості суперспіральної пДНК (смуга 6, нижня зона). Так само, доти, поки вказане співвідношення не досягало 32 (мас/мас), не спостерігалося впливу на міграцію релаксованої форми пДНК (смуга 7, верхня зона). Для всіх описаних гель-електрофоретичних дослідів смуга 1 відповідала ДНК-маркеру довжиною 1 т.п.н (фірма ВКІ).
Фіг.2 - Д-Галактозидазна активність у клітинах лінії МО7, трансфектованих комплексами пДдНК-Мит1-катіонна ліпосома
Клітини лінії МО7 висівали з щільністю 5х107 клітин/лунку в 24-лункові культуральні планшети за 24год. до здійснення трансфекції. Безпосередньо перед трансфекцією клітини промивали безсироватковим середовищем.
Комплекси одержували шляхом спільної інкубації РОММ р ії Ми1 і наступного додавання катіонної ліпоми с
ОС-Спо/ДдоОФЕ. Для кожного варіанта їмкг рРСММ Д поєднували з 0,6, 6, 12 і 21мкг пептиду Ми1. Після цього Го) кожну з вказаних комбінацій поєднували з 3, 4 і 6 мкг ОС-Спо/ДОФЕ. Клітини лінії МО7 приводили в контакт із призначеними для трансфекції комплексами протягом 2год., після чого витримували при 372 в атмосфері, яка містить 595 СО», ще протягом 24год., після чого їх збирали й обробляли для аналізу р-галактозидазної с активності. Наведені дані представляють собою середні значення -С.К.В., п-3.
Фіг3 - Миї збільшує опосередковувану катіонними ліпосомами ефективність трансфекції лінії нервових 93 клітин МО7. со
Нейрони лінії МО7 висівали в 24-лункові культуральні планшети з щільністю 4х107 клітин/лунку і вирощували протягом 24год. Потім недиференційовані нейрони лінії МО7 трансфектували або лише рСММ р (А), або рСММ р, ї-
Зз5 об'єднаної в комплекс із ОС-Спо/ДдОФЕ (1:3 мас./мас.) (Б), або рСММр, об'єднаної в комплекс із Ми! і М.
ОС-Спо/ДдОФЕ (1:12:6) (В). Через 48год. клітини фіксували й обробляли для здійснення виявлення Х-за!1 гістохімічним методом. Як видно на панелі В, включення Ми! у комплекс в оптимальному співвідношенні приводило до істотного збільшення кількості Х-За1-позитивних клітин (пофарбовані в синій колір). «
Фіг4 - Миї1 має більшу ефективність у відношенні посилення опосередковуваної катіонними ліпосомами 470 трансфекції клітин лінії МО7, ніж Мр1. - с ДНК плазміди рСММр об'єднували в комплекс із різними кількостями полікатіонного пептиду і потім а змішували з катіонними ліпосомами в співвідношенні 1:3 (рСММр:ліпосоми, мас./мас). Після швидкого є» промивання безсироватковими середовищами клітини лінії МО7 приводили в контакт із комплексами ліпосома-полікатіон-ліпосома протягом 2год. і потім знову поміщали в безсироваткові середовища. Через 24год. клітини збирали й обробляли для виявлення р-галактозидазної активності. Кожен варіант умов відтворювали в - трьох повторах і кожен експеримент повторювали три рази. Дані представляють собою середні значення -С.К.В. -І Фіг.5 - Ми! підсилює опосередковувану ОС-Спо/ДОФЕ трансфекцію клітин лінії СО5-7
Клітини СО висівали з щільністю, яка забезпечує 60-8095 конфлюентність, у 24-лункові культуральні і планшети за 24год. до здійснення трансфекції. Безпосередньо перед трансфекцією клітини промивали о 20 безсироватковим середовищем. Шляхом інкубації рСММ р разом з Ми! і наступного додавання катіонної ліпосоми ОС-Спо/ДОФЕ одержували комплекси, які дозволяють здійснювати трансфекцію клітин. Для кожного с» варіанта їмкг рРСММ (р об'єднували в комплекс із 12мкг пептиду Ми, який, як було встановлено, є оптимальним для клітин лінії МО7. Після цього комплекси РСММ р:Ми1 змішували з 3, 4 і бмкг ОС-Спо/ДОФЕ. Клітини СОЗ приводили в контакт із призначеними для трансфекції комплексами протягом 2год., після чого витримували при 99 ЗТоСв атмосфері, яка містить 595 СО», ще протягом 24год., після чого їх збирали й обробляли для проведення
ГФ) аналізу рД-галактозидазної активності. Наведені дані представляють собою середні значення «С.К.В., п-З.
Ге Фігб - Ефективність трансфекції диференційованих клітин лінії МО за допомогою комплексів рСММУрД -Ми1-катіонна ліпосома 60 Клітини лінії МО7 висівали в 24-лункові культуральні планшети з щільністю 4х107 клітин/лунку в нормальне середовище для росту (яке містить сироватку). Через 24год. середовище заміняли середовищем для диференціювання і клітини вирощували ще протягом 24год. Використовували три різні середовища для диференціювання: безсироваткове середовище (-сироватка), нормальне середовище для росту, доповнене 1мм
ЦАМФ (середовище цАМФ) або середовище, яке містить знижену кількість сироватки (0,595), доповнене 1мм 65 цАМФ і 5Онг/мл фактора росту нервової тканини (МОР). Потім клітини трансфектували рСММр, об'єднаною в комплекс або лише з ОС-Спо/ДОФЕ, або з Ми! і ОС-Спо/ДОФЕ. Через 48год. клітини фіксували й обробляли для гістохімічного аналізу з метою виявлення Х-сзаї1 і оцінювали відсоток позитивних клітин. В усіх випадках присутність Ми! приводило до збільшення кількості позитивних клітин.
Представляє інтерес той факт, що кількість трансфектованих клітин як у присутності Ми, так і без нього,
Виявлялося великим у тому випадку, якщо клітини вирощували в присутності ЦАМФ.
Приклади
Матеріали і методи
Синтез пептидів
Пептиди Мр і Ми! синтезували за допомогою твердофазного синтезатора пептидів типу Зпітад2и РОЗМ-8 з 7/0 використанням 5-кратного надлишку І--амінокислот, які мають захисні групи Гтос ((9-фтореніл)метоксикарбоніл) (фірма Момабріоспет), і реагентів ЕавіМостм (гексафторфосфат/гідроксибензотриазол 2-(1Н-бензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилуронію (ГБЕТУ/ГОБТ) (фірма Адмапсей Спетіса! Еийгоре) як агента для здійснення амідного сполучення. Після відщеплення від смоли і видалення захисних груп здійснювали знесолення шляхом гель-фільтрації з використанням колонки типу Р2 Віодеї! (2х28см, фірма Віогад), приєднаної 75 до системи для рідинної експрес-хроматографії білків (ЕРІС) (фірма Атегепат РпНагтасіа Віоіеси,
Великобританія), з використанням як елюента 0,195 водного розчину ТФК (трифтоцтова кислота) при швидкості потоку 0,5-0,75мл/хв. Остаточне очищення за допомогою препаративної хроматографії із оберненою фазою здійснювали на колонці типу Мудас (С18, 5мкм, 2х25см, фірма Ніспгот), приєднаної до системи для РХВР типу сіївоп (фірма Апаспет). Пептиди елюювали при швидкості потоку 5мл/хв. із використанням лінійного градієнта го ацетонітрилу в 0,190 водному розчині ТФК і спостереження за процесом елюювання здійснювали при довжині хвилі 220-23Онм.
Пептид Мрі одержували з використанням суперкислотної лабільної смоли, попередньо завантаженої
ІЇ-Рго-2-хлортритилом (фірма Момаріоспет) (10Омг, 1,05ммол/г, О,їммол). Для того, щоб включити всі амінокислотні залишки від шостого (І уз) до М-кінцевого залишку, використовували більш тривалі проміжки часу с для здійснення реакції сполучення. Після автоматичного видалення М-кінцевої захисної групи Етос за допомогою піперидину (20 об. 95) у диметилформаміді смолу виділяли, промивали диметилформамідом (1Омл) і о метанолом (15мл), після чого сушили у вакуумі. Неочищений пептид відщдеплювали від смоли з використанням охолодженої на льоду ТФК (мл), що містить фенол (790 мас./об.), етандитіол (2 об. 9о), тіоанізол (4 об. 9рб) і воду (4 об. 90) (позначена як суміш А), і потім осаджували за допомогою охолодженого на льоді со Мметил-трет-бутилового ефіру (МТБЕ) (ЗОмл). Потім утворені пелети знесолювали і неочищену пептидну суміш очищали за допомогою РХВР із оберненою фазою. Після елюювання фракцій, які містять цільовий пептид о (елюювання здійснювали з використанням ацетонітрилу 68,5 об. 95), об'єднували і ліофілізували, одержуючи со пептид у вигляді порошку білого кольору. Загальний вихід: З2мг (1бмкмол, 15965); МС (МАГОІ-ТОР)
СввНеівіМовОзовЗа: (МАНІ, розраховано 2049,5, виявлено 2050,2. Послідовність перевіряли шляхом аналізу - складу амінокислот і аналізу послідовності. За даними аналізу з використанням РХВР гомогенність їч- складала 29595.
Пептид Миї1 одержували з використанням смоли сСіу-УУапд (фірма Момаріоспет) (4Омг, 0,б7ммол/г, 0,ОЗммол). У цьому процесі використовували звичайні проміжки часу для здійснення реакції сполучення. Після « автоматичного видалення відповідно до описаного вище методу М-кінцевої захисної групи Етос смолу виділяли, промивали дихлорметаном (20мл) і метанолом (20мл), після чого смолу сушили у вакуумі. Неочищений пептид /-- с відщеплювали від смоли з використанням суміші А (мл) і осаджували за допомогою МТБЕ (ЗОмл), повністю ц дотримуючись описаного вище процесу. У завершення неочищену пептидну суміш знесолювали й очищали за ,» допомогою РХВР із оберненою фазою. Після елюювання фракції, які містять цільовий пептид (еглюювання здійснювали з використанням ацетонітрилу, 17,295), об'єднували і ліофілізували, одержуючи пептид у вигляді порошку білого кольору. Загальний вихід: бб5мг (2бмкмол, 8095); МС (Е5) СовН.7оМек2О»245»: МАНІ", розраховано -і 2440,7, виявлено 2440,6. За даними аналізу з використанням РХВР гомогенність складала 295905. -1 Аналіз зв'язування ДНК
Очищені пептиди відновлювали в стерильній дистильованій НО до концентрації Змг/мл. Пептид і пдНК (95) об'єднували в комплекс у 20мкл забуференого НЕРЕ5 фізіологічного розчину (137мМ Масі, 5мМ КСІ, 0,75ММ с 50 МаоНРО,, 19ММ НЕРЕБ5, рН 7,4) протягом 20Охв. при кімнатній температурі. Потім комплекси пептид'одНК аналізували за допомогою електрофорезу на агарозному гелі (1905). Контрольні інкубації для оцінки звичайних с» макромолекулярних взаємодій пДНК здійснювали з використанням різних кількостей бичачого сироваткового альбуміну, який має достатню для застосування в галузі молекулярної біології чистоту (фірма Зідта).
Клітинні культури
МО7 представляє собою добре вивчену лінію клітин, одержану шляхом злиття клітин нейробластоми о (М18Т92) із сенсорними нейронами новонароджених щурів (14). Лінію клітин підтримували в нормальному середовищі для росту (МОМ) (середовище Лейбовіца І-15 (фірма ВК), доповнене 1095 фетальної бичачої ко сироватки (фірма ВК/), 4г/л глюкози, 4г/л бікарбонату натрію (фірма ВКІ), 100мод/мл пеніциліну/стрептоміцину (фірма ВКІ)) при 372С в атмосфері, яка містить 595 СО 5. Клітини висівали в 24-лункові планшети (фірма 60 Созвзіаг) з такою щільністю, яка забезпечувала через 24год. 7095 конфлюентність.
Диференціювання клітин лінії МО7 здійснювали за допомогою трьох описаних раніше методів (14, 15). Клітини лінії МО7 висівали в МОМ з щільністю 4х107 клітин на лунку в 24-лункові культуральні планшети (фірма Мипс).
Через 24год. середовище замінювали або а) МОМ, доповнене 1мММ циклічним аденозин-3'5'монофосфатом (цапф, фірма Зідта), або б) безсироватковим середовищем для диференціювання (5095 середовища Хама Е12, бо БОЮ ОМЕМ, Бмкг/мл трансферину, 25Онг/мл інсуліну, О,3мкМ селеніт натрію) або в) середовищем для фактора росту нервової тканини (МОР) з низьким вмістом (середовище 1-15, доповнене 2ММ глутаміном, 4г/л глюкози, 4г/л бікарбонату натрію, 10од./мл пеніциліну, 1Ог/мл стрептоміцину, 0,590 ФТС, ІММ ЦАМФ, 5Онг/мл МОБ (фірма
АІотопе І арз)). Диференційовані клітини лінії МО7 перед здійсненням трансфекції вирощували у відповідному середовищі протягом 24год. при 372С в атмосфері, яка містить 595 СО».
Клітини лінії СО5-7 (одержані з нирки зеленої мавпи) вирощували в середовищі КРМІ 1640 (фірма ВКІ), доповненому 1095 фетальної бичачої сироватки (фірма ВК) і 100од./мл пеніциліну/стрептоміцину (фірма ВК).
Плазмідні конструкції
Усі трансфекції здійснювали з використанням репортерної плазміди РСММ р (фірма Сіопіесн, Пало Альта, 70 штат Каліфорнія), яка містить повнорозмірну послідовність р-галактозидази Е.соїї, розташовану по ходу транскрипції відносно безпосереднього раннього промотора/(енхансера людського цитомегаловірусу (фірма
Сіопіесіп). Лінії плазмідної ДНК одержували за допомогою стандартного методу молекулярного клонування й очищали з використанням системи очищення плазмід, яка не містить ендотоксин, фірми Оіадеп (фірма Оіадеп,
Доркінг, Великобританія).
Ліпосоми
Ліпосоми ОС-Спо/ДОФЕ одержували відповідно до описаного вище методу (16, 17). У цілому метод полягав у тому, що до продистильованого перед дослідом СНоСі» (5мл) додавали в атмосфері азоту бмкмол ЮС-Стної і 4мл
ДОФЕ (у вигляді розчину з концентрацією 1Омг/мл у СНьЬС.2). До суміші додавали 5мл 20мМ Нерез (РН 7,8) і її опромінювали ультразвуком протягом Зхв. Органічні розчинники видаляли при зниженому тиску і утворену суспензію ліпосом опромінювали ультразвуком ще протягом Зхв. Ліпосомні препарати зберігали при 426.
Протокол трансфекції
Оскільки в перших експериментах було встановлено, що присутність фетальної бичачої сироватки інгібує трансфекцію клітин лінії МО7, то для усіх варіантів трансфекції використовували безсироваткове середовище для диференціювання. На дні стерильного контейнера типу Віои (фірма Вірбу Зіепіп Ца., Стаффордшир, Ге
Великобританія) розміщували різні кількості ДНК і ліпосом так, щоб вони не знаходилися в контакті одна з (5) одною. ДНК і ліпосоми об'єднували шляхом додавання 40Омкл безсироваткового середовища для диференціювання й обережного струшування. Суміш ДНК:ліпосоми інкубували при кімнатній температурі протягом 20-3Охв. перед її додаванням до клітин. Потім суміш ДНК/ліпосоми додавали до клітин і інкубували при 372С в атмосфері, яка містить 595 СО», протягом 2год., після чого це середовище замінювали свіжим повним (зе) середовищем. Після закінчення 24-48год. клітини фіксували й обробляли для гістохімічного аналізу з Фо використанням Х-да1 відповідно до методу, описаному в |17), або їх збирали для аналізу р-галактозидазної активності (фірма Рготеда Согр.). і)
Підрахунок клітин здійснювали при 40-кратному збільшенні з використанням інвертованого мікроскопа типу їм-
Мікоп Оіарої. Кожен варіант трансфекції повторювали принаймні тричі і для кожної лунки виконували принаймні
Зо три незалежних підрахунки. в.
Комплекси для трансфекції, які містять тестовані поліпептиди, створювали в такий спосіб. На дні стерильних полістиролових контейнерів розташовували різні кількості пептиду таким чином, щоб вони знаходилися поруч, але не контактували з їмкг рРСМУ р, після чого здійснювали змішування шляхом додавання « 400мкл безсироваткового середовища МОМ. Комплекси інкубували при кімнатній температурі протягом 1Охв., після чого додавали ЮС-Спо/ДОФЕ. Комплекс пДНК/пептид/ліпосома додатково інкубували при кімнатній в) с температурі протягом 20ОХхв. і потім додавали до клітин як описано вище. "з Приклад 1. Аналіз зв'язування ДНК " Ми! представляє собою полікатіонний пептид, який містить 19 амінокислот, зв'язаних з коровим комплексом аденовірусу (Таблиця 2) ІЗ, 18). При створенні винаходу було проведене порівняння ДНК-зв'язувальної активності Ми! і основного капсидного протеїну Мрі вірусу поліоми миші, яке здійснювали з використанням - взаємодії з плазмідною ДНК за допомогою аналізу сповільнення рухливості в гелі. Мр! представляє собою -і пептид, який складається з 19 амінокислот, що містить сигнал ядерної локалізації |2| і містить менше амінокислот, які мають позитивний заряд, у порівнянні з амінокислотами Ми1. Тому передбачалося, що він має о меншу ДНК-зв'язувальну активність. о 50 сю амінокислот ов -Смв-СІШ-Тпг-Гув-Сув-Тиг-Рго-Рго-ОН ій Пенн пед му дееня
Примітка: - Послідовність МІ. З у Мр1 підкреслена 60 Різні кількості очищеного пептиду інкубували при кімнатній температурі в НВ протягом приблизно 10Ххв. і потім піддавали аналізу за допомогою гель-електрофорезу на агарозі. При відсутності пептиду рухливості суперспіральної і релаксованої кільцевих плазмідних ДНК (пДНК) виявилися очікуваними (смуга 8 на Фіг.1).
Починаючи зі співвідношення ДНК:поліпептид Ми, яке дорівнює 1:0,25 (мас./мас.) міграція плазмідної ДНК сповільнювалася (Фіг.1). При співвідношеннях 1:0,25 (мас./мас.) вплив на рухливість була слабкою, однак при бо співвідношенні, яке дорівнює 1:0,5 (мас./мас), рухливість плазмідної ДНК істотно сповільнювалася і лише дуже невелика кількість була здатна мігрувати з лунок. При співвідношеннях 2:1 і вище пДНК не мала здатність мігрувати в агарозний гель і здатність броміду етидію проникати в плазміду знижувалася. На відміну від Ми! для Мрі не були виявлено впливу на електрофоретичну рухливість плазмідної ДНК при співвідношеннях пДНК:протеїн аж до 1,8 мас. 9о (Фіг.1). Додавання мкг Мр1 до 1мкг плазмідної ДНК приводило до розширення зони, що відповідає суперспіральній пДНК. Однак для смуги, яка відповідає релаксованій пДНК, вплив Мр1 не виявлялося аж до співвідношення пДНК:протеїн, яке дорівнює 1:32 (мас./мас). При такому співвідношенні спостерігалося істотне сповільнення смуг, які відповідають як суперспіральній, так і релаксованій пДНК, і було встановлено, що деяка кількість ДНК залишалася в лунці. При інкубації пДНК із БСА не були виявлені 7/0 Впливу на електрофоретичну рухливість при співвідношеннях пДНК:протеїн аж до 1:30 (мас./мас.) (Фіг.1).
Приклад 2. Трансфекція недиференційованих клітин лінії МО7
При створенні винаходу за допомогою аналізу, заснованого на використанні репортерного гена р-галактозидази, були проведені дослідження здатності Ми! і Мр1 підсилювати трансфекцію лінії нервових клітин катіонними ліпосомами. Клітини лінії МО7 трансфектували рСММр, об'єднаної в комплекс із різними 75 кількостями пептиду їі ЮОС-СпоЇ/ДОФЕ. Раніше було встановлено, що катіонна ліпосома ЮОС-Спо!/ДОФЕ має здатність здійснювати ефективну трансфекцію клітин лінії МО7, які походять з нервових клітин (17). При створенні винаходу в цьому дослідженні було встановлено, що оптимальна ефективність (240905) для цієї лінії клітин, які походять з нервових клітин, досягається при використанні їмкг плазмідної ДНК, об'єднаної в комплекс із Змкг ОС-Спо/ДОФЕ (17). При вивченні часової залежності було встановлено, що максимальні рівні експресії трансгена досягалися Через 48-60год. після трансфекції. Таким чином, для того, щоб збільшити до максимуму імовірність виявлення посилення трансфекції, у всіх дослідженнях, проведених при створенні винаходу, аналізи проводили через 12-20год. після здійснення трансфекції, тобто в той час, коли рівні експресії репортерного гена були зниженими. Раніше було встановлено, що для трансфекції клітин лінії МО7 оптимальне співвідношення пДНК:ліпосома, складає 1:3 (мас./мас). Тому порівняння впливу різних кількостей Ге пептиду на трансфекцію проводили при співвідношеннях пдНК: ЮОС-Спо!/ДОФЕ, які складають 1:3, 1:4 і 1:6. о
Результати аналізу уповільнення рухливості в гелі дозволили припустити, що для того, щоб відбувалося зв'язування всієї плазмідної ДНК, досить, щоб співвідношення пДНК:Ми1 складало приблизно 1:0,5 (мас./мас.) (Фіг.1). Однак, у перших експериментах з використанням цього співвідношення і ліпосом не було виявлено впливу на ефективність трансфекції (дані не наведені). Причина полягала в тому, що об'єми, які со використовувалися для одержання комплексів для трансфекції, були набагато більше за ті, які використовуються при здійсненні аналізу уповільнення рухливості в гелі (40О0мкл у порівнянні з 2О0мкл). Тому були проведені Ф дослідження з використанням великих кількостей Ми!ї, що дозволяли одержувати концентрацію в розчині, Го) аналогічну до тієї, яка використовувалася в аналізі уповільнення рухливості в гелі. Була зроблена порівняльна оцінка впливу присутності 0,6, 6, 12 і 21мкг пептиду Ми! на опосередковувану ОС-Спо/ДОФЕ трансфекцію. Було - встановлено, що Ми! мав здатність підсилювати ефективність опосередковуваної катіонною ліпосомою ч- трансфекції більше ніж у 4 рази. Найбільше посилення трансфекціїспостерігалося при використанні відносного співвідношення РСММ Д:Ми1(0С-Спо/ДОФЕ) (мас./мас./мас.), що складає 1:12:6. Така комбінація приводила до посилення трансфекції в 11 разів у порівнянні з трансфекцією при використанні лише ДНК (Фіг.2). «
Аналіз на основі застосування репортерного гена р-галактозидази дозволяв оцінювати загальний рівень продукованої р-галактозидази, однак він не давав інформації про кількість трансфектованих клітин. Внаслідок т с цього при створенні винаходу також проводили досліди, які дозволяють здійснювати підрахунок кількості з» трансфектованих клітин лінії МО7. Клітини висівали з щільністю 4х107 у 24-лункові планшети для культур клітин. Через 24год. клітини швидко промивали безсироватковим середовищем і трансфектували ромМмр, об'єднаної в комплекс із ЮС-Спо/ДОФЕ і пептидом Миї7. При цьому використовували співвідношення -1 395 рРОММУд:Ми1(ОС-СпоІ/ДОФЕ), яке було виявлено як оптимальне в аналізі з використанням репортерного гена, а саме 1:12:6. При використанні такого співвідношення було виявлено б-кратне збільшення кількості позитивних у -і відношенні р-галактозидази клітин (Фіг.3, 6). Не було виявлено помітного зменшення кількості клітин при о використанні комплексу з Ми! у всіх досліджених концентраціях. Аналогічно до цього, концентрація протеїну в 5 /- Клітинних лізатах, застосовуваних в аналізі з використанням репортерного гена р-галактозидази, не змінювалися се) істотно в порівнянні з нетрансфектованими клітинами (дані не наведені). с» На відміну від цього при використанні Мр1 не було виявлено ніякого посилення ефективності трансфекції (Фіг.4). Не було виявлено ніякого посилення ефективності трансфекції при використанні РОММ р у комплексі лише з одним Ми"! у порівнянні з використанням "оголеної" ДНК.
Для того, щоб встановити, чи можна досягти посилення трансфекції в інших типах клітин, були проведені аналогічні аналізи з використанням клітин лінії СО5-7. Присутність Ми! також підсилювало опосередковувану (Ф, ліпосомою трансфекцію клітин лінії СО5-7 (Фіг.5). Було встановлено, що співвідношення пдНК:Мг ліпосома, яке ка є оптимальним для клітин лінії МО7, також є оптимальним і для клітин лінії СО5-7. Був виявлений аналогічний ступіньпосилення трансфекції (у 3,7 рази) у порівнянні з трансфекцією, здійснюваною при використанні лише бор Катіонної ліпосоми.
Приклад 3. Трансфекція диференційованих клітин лінії МО7
При створенні винаходу були проведені також дослідження здатності Ми! підсилювати опосередковувану катіонною ліпосомою трансфекцію диференційованих клітин лінії МО7. Клітини лінії МО7 одержували шляхом злиття первинних нейронів спинномозкового вузла (ОКО) щурів і клітин мишиної нейробластоми лінії М18Т92 65 (14). Клітини лінії МО7 можна піддавати диференціюванню різними методами, наприклад, шляхом видалення сироватки, введення ЦАМФ або піддаючи їх впливу середовища зі зниженим вмістом сироватки з додаванням
ЦАМФ і фактора росту нервової тканини. Диференціювання клітин лінії МО7 приводить до появи властивостей клітин, пов'язаних з їх батьківськими ноцицептивними сенсорними нейронами, що включають зменшення поділу клітин і початок росту аксонів нервової клітини. Клітини лінії МО7 висівали в 24-лункові культуральні планшети і через 24год. ініціювали диференціювання. Через 15-20год. після початку диференціювання їх піддавали трансфекції відповідно до описаного вище методу. Через 15-20год. після здійснення трансфекції клітини фіксували й обробляли для гістохімічного аналізу з використанням Х-да!Ї. Відповідно до одержаних раніше даних ефективність трансфекції в значній мірі змінювалась між трьома групами диференційованих клітин.
Для клітин лінії МО7, які диференціювалися в результаті видалення сироватки, були виявлені найбільш низькі 7/о Вівні трансфекції (1,990), У той час як для групи, яка була піддана впливу ЦАМФ, спостерігалися максимальні рівні (895), для групи, обробленої середовищем з низьким вмістом сироватки/цАМФ/МОЕ були виявлені проміжні рівні (4,790) (Фіг.5). Однак у всіх трьох випадках введення поліпептиду Ми! у комплекс для трансфекції приводило до посилення трансдукції диференційованих клітин лінії МО7. Ефективність трансфекції клітин лінії
МО7, диференційованих під дією або лише цАМФ, або під дією середовища з низьким вмістом 7/5 бироватки/цАМФ/МОР, підвищувалася більше ніж у 6 разів (Фіг.5). Однак, найбільше посилення ефективності трансфекції спостерігалося для групи, яка піддавалася диференціюванню в результаті видалення сироватки. У даному випадку спостерігалося посилення більш ніж у 10 раз.
Комплекси, які містять пептид Ми! і ДНК
Як продемонстровано в прикладі 1 за допомогою гель-електрофорезу (аналіз зв'язування ДНК), при співвідношенні Ми1:ДНК, яке перевищує 0,5:1,0 (мас./мас.) рухливість плазмідної ДНК істотно сповільнювалася і лише невелика кількість ДНК мігрувала з лунки. Це свідчить про те, що пептид Ми! сильно взаємодіє з ДНК і може привести до нейтралізації і конденсації нуклеїнових кислот з утворенням невеликих частинок, які можна застосовувати для введення генів. Була проведена оцінка розмірів частинок Ми17:ДНК (МД) у діапазоні співвідношень Ми1:ДНК, вказаних на Фіг.7. сч
Частинки МД одержували шляхом змішування. У цілому метод полягав у тому, що відповідні аліквоти пептиду
Ми У деїіонізованій воді додавали до плазмідної ДНК (рСММр) (у кінцевій концентрації 220мкг/мл) у 20мММ і) буфері Неревз, рН 7,0. Після ретельного перемішування кожну суміш інкубували протягом ТОхв. при 20 20.
Відразу після інкубації кожну суміш розбавляли буфером Нерез (кінцева концентрація ДНК 24мкг/мл) і проводили аналіз розмірів частинок методом фотонно-кореляційної спектроскопії (аналізатор типу М4 рів, фірма со СоцШег). Усі вимірювання проводили при 202С, дані одержували при куті, що дорівнює 902. Для обчислення середнього розміру частинок і стандартного відхилення (С.В.) застосовували унімодальний аналіз. Ф
Становить інтерес той факт, що, хоча Ми1 мав здатність зв'язувати ДНК і утворювати комплекси у всьому «о дослідженому діапазоні, розмір частинок істотно змінювався залежно від співвідношення Ми1:ДНК. Стабільні малі частинки розміром порядку нанометра утворювалися в діапазоні співвідношень Ми1:ДНК від 0,3 до 1,2 - (діапазон І) і величинах цього співвідношення, що перевищують 5 (діапазон Н). При проміжних величинах цього /-Їче співвідношення відбувалася виражена агрегація, при цьому розмір частинок комплексу зростав протягом періоду інкубації, досягаючи більше ніж 2мкм (Фіг.7).
Приклад 4. Одержання І МО у діапазоні І «
При створенні винаходу було проведене дослідження того, чи можуть комплекси ліпосома-Ми1-ДНК, що 70 характеризуються низьким співвідношенням МО:ДНК, утворювати стабільні частинки з розміром порядку - с нанометра і чи можуть утворюючі комплекс частинки мати високу ефективність у відношенні трансфекції. а Одержання ліпосом: ЮС-Спої! (ЗОмкмоль) і ДОФЕ (20мкмоль) об'єднували в дихлорметані. Органічний "» розчинник видаляли при зниженому тиску за допомогою роторного випарника і залишок сушили в вакуумі протягом Згод. Після цього до ліпідної плівки при змішуванні шляхом обертання додавали 4мм буфер Нерез, рН 7,0 (Змл). Після короткочасного опромінення ультразвуком (2-3хв.) утворену суспензію катіонних ліпосом тричі -і екструдували за допомогою екструдера (фірма Іірех Віотетргапез) через два накладених один на одного -1 полікарбонатних фільтри (типу МіПроге 0,2мкм), а потім десять разів через два накладених один на одного полікарбонатних фільтри (типу Мійїроге 0,1мкм), у результаті чого утворювалися ліпосоми малого розміру (95) (середній діаметр 109нм за даними РОЗ) (приблизно 8-1Омг/мл, що визначалося розкидом при використанні с 50 даного методу одержання).
Одержання комплексів ліпосома:Ми1:ДнНКкК (МО): Пептид Ми1 (0,12мг у деїіонізованій воді, концентрація сю пептиду З,5мг/мл) додавали при безперервному перемішуванні до розчину плазмідної ДНК (рСЕ1-САТ) (0,2мг, типова концентрація плазміди 1,0мг/мл) у 4мММ буфері Неревз. Потім вносили суспензію катіонних ліпосом (загальний вміст ліпідів 2,4мг, 4мкмоль), у результаті чого відбувалося утворення частинок малого розміру, які характеризуються вузьким діапазоном розподілу (168 -58нм) за даними аналізу за допомогою РОБ. о Одержаний комплекс МО (кінцева концентрація ДНК 0,14мг/мл) з додаванням 1095 сахарози (9омас./об.) зберігали до застосування при -802С. Протягом місяця не були виявлені зміни розмірів частинок. де Комплекси ліпосома:ДНК (І 0) (ліпокомплекси) для контрольних експериментів одержували з використанням співвідношення ліпосома"ДНК, що складає 3:1 (мас./мас.), характерного для оптимальної композиції для 60 трансфекції клітин лінії МО7.
Трансфекція клітин лінії МО7: Клітини лінії МО7 висівали в нормальне середовище для росту (МОМ) (що містить 1095 сироватки) із щільністю приблизно 4х107 клітин на лунку в 24-лункові культуральні планшети.
Через 24год. клітини швидко промивали середовищем МОМ (безсироватковим) і потім обробляли протягом вказаних проміжків часу розчинами, які містили комплекси ЇМО або 0, попередньо розведеними ММО бо (безсироватковим) (у всіх випадках кінцева концентрація ДНК складала 3,2мкг/мл). Потім клітини знову промивали і інкубували протягом ще 48год, після чого їх збирали. Рівні трансфекції оцінювали за допомогою ферментного аналізу на основі хлорамфеніколтрансферази (САТ) з використанням як субстрату ""С-САМ (фірма
Рготеда). Активність трансфекції виражали у вигляді відсотка (95) перетворення ферментом внесеного "С-САМ.
При використанні опосередковуваної І МО трансфекції була виявлена значно більша експресія репортерного гена, ніж при опосередковуваній І О трансфекції. Так, опосередковувана І МО трансфекція викликала через 10 хв після здійснення трансфекції в 16 разів більш високу ферментативну активність САТ, а через бОхв. після здійснення трансфекції - у 6 разів більш високу активність у порівнянні з опосередковуваною І О трансфекцією (Фіг.8). При використанні І МО значні рівні трансфекції були виявлені навіть у тому випадку, якщо тривалість 70 трансфекції була менше 7Охв. Ці дані служать ілюстрацією того, наскільки швидко І МО-частинки здатні проникати в клітини.
Приклад 5. Варіанти катіонного ліпіду (цитофектину)
При створенні винаходу було проведене вивчення можливості поліпшення характеристик комплексів | МО шляхом вбудовування полікатіонних холістеринових ліпідів (18). Замість ОС-СпоЇ для одержання катіонних 75 ліпосом використовували СЮАМ (0198), АСНХ (СОЕ52) і СТАР (8232) (Фіг.9). Кожна система катіонних ліпосом містила бО мол. 905 катіонного ліпіду і 40 мол. 96 ДОФЕ, і їх одержували відповідно до методу, описаному в прикладі 4. Одержували і порівнювали наступні різні системи комплексу на основі МО: ЇМО (00-Спо!), ГМО (8198), МО (СОЕ52) і МО (8232). Усі системи ЇМО одержували відповідно до описаного вище методу з використанням катіонних ліпосом (загальний вміст ліпідів 2Омкмоль) і 0,бмг пептиду Миї на 1,0мг ДНК (рСММВ). Було встановлено, що частинки мають діаметр менше 200нм.
Для контрольних експериментів одержували суміші комплексів ліпосома"їДНК (10) (ліпоплекси) зі співвідношенням ліпосома:ДНК, що складає 3:1 (мас./мас.), яке є оптимальним для композиції для трансфекції клітин лінії МО7.
Трансфекція клітин лінії МО7: Клітки лінії МО7 висівали в середовище МОМ (що містить 1095 сироватки) із с щільністю приблизно 4х107 клітин на лунку в 24-лунковий культуральний планшет. Через 24год. клітини швидко Ге) промивали МОМ (безсироватковим) і потім протягом год. обробляли розчинами, які містять комплекси І МО або
ГО, попередньо розведеними ММ (безсироватковим) (у всіх випадках кінцева концентрація ДНК складала 2,5мкг/мл). Потім клітини знову промивали і інкубували ще протягом 48год. для обробки з метою фарбування за допомогою Х-да! для гістохімічного аналізу. Кількість клітин, пофарбованих у блакитний колір, підраховували і, за допомогою інвертованого мікроскопа. Ге!
В усіх випадках композиції, які містять ЇМО, мали більшу ефективність, ніж відповідні І О-системи, одержані з використанням тих же самих полікатіонних холестеринових ліпідів (Фіг.10). Рівні ефективності і, трансфекції розташовувалися в такий спосіб: ЇМО (8198) Ь.МО (00-Спо)»Ії МО (СОЕ52)2І.МО (8232). Такеж Кк. розташування, а саме В198200-СпоІ»В232, спостерігалося при використанні відповідних систем на основі ГО.
Зо Приклад 6. Кількість пептиду Ми! у діапазоні І -
При створенні винаходу проводилося дослідження впливу співвідношення Ми1:ДНК (у діапазоні І, вказаному на Фіг.7) на ефективність трансфекції.
Катіонні ліпосоми, які містять катіонний ліпід 8198 і ДОФЕ (3:2 мас./мас.), одержували тим же методом, що « описаний у прикладі 4. Готували серії сумішей МО-комплексу (співвідношення Ми1:ДНК змінювалося від 0,3 до 490 1,23 і їх об'єднували в комплекс із катіонними ліпосомами. Одержані І МО-системи характеризувалися З с співвідношеннями ліпосома:Ми1!"ДНнНкК(рСММ Д), що складали 12:0,3:1, 12:0,6:0,6, 12:0,9:1..ї 121,21
Із» мас./мас./мас. відповідно. Виміряні розміри І! МО-частинок складали приблизно 15Онм.
Ефективність трансфекції оцінювали в дослідах іп мійго з використанням клітин лінії Рапс-1 (лінія клітин раку підшлункової залози людини). Клітини висівали з щільністю приблизно 5х107 клітин на лунку в - 15 24-лунковий культуральний планшет у середовище КРМІ, доповнене 1095 ФТС, і вирощували протягом 24год. в атмосфері, яка містить 595 СО», при 3720. Клітини швидко промивали середовищем КРМІ і потім протягом ЗОхв. -і обробляли розчинами І МО-комплексів, попередньо розведених КРМІ (у всіх випадках кінцева концентрація ДНК сю складала 5,Омкг/мл). Після цього клітини знову промивали і інкубували ще протягом 48год. у середовищі КРМІ, доповненим 1095 ФТС, після чого їх збирали і піддавали аналізу у відношенні р-галактозидазної активності з іс), використанням стандартного набору для аналізу (фірма Рготеда). «со Як показано на Фіг.11, оптимальне для трансфекції клітин лінії Рапс-1 співвідношення ліпосома:Ми1:ДнНкК складало 12:0,6:0,6. В інших варіантах з використанням цих І МО-комплексів з низьким вмістом Ми! також були одержані дуже високі значення ефективності трансфекції.
Приклад 7. Кількість і склад ліпідів
Для того, щоб досліджувати, як впливає зміна співвідношення кількостей катіонних ліпідів і ДОФЕ, а також (Ф; співвідношення кількостей усіх ліпідів до Ми1 і ДНК, одержували серії | МО-систем з використанням В198 як
ГІ переважного катіонного ліпіду. Одержували катіонні ліпосоми, які містять 60 мол. 906 В198 і 40 мол. 96 ДОФЕ (3:2 моль/моль), 50 мол. 96 В198 і 50 мол. 96 ДОФЕ (1:11 моль/моль) і 33 мол. 96 В198 і 67 мол. 96 ДОФЕ (1:2 во моль/моль), і об'єднували їх відповідно до методу, описаному в прикладі 4, зі стандартною сумішшю
МО-комплексу (Ми1:ДНК як 0,61 мас./мас.) у співвідношеннях, вказаних на Фіг.12.
Для контрольних експериментів одержували суміші (ліпоплекси), які містять комплекс ліпосома:ДНК (І 0) зі співвідношенням ліпосома"ДНК, що складає 3:1 (мас./мас.) Було встановлено, що всі Ї/МО-системи мали більший середній розмір у тому випадку, коли до складу МО-комплексів вводили менші кількості катіонних 65 ліпосом. Однак розмір І! МО-частинок, що містять понад 12мкмоль ліпідів на їмг ДНК, залишався менше 200мкм, у той час як розмір частинок, що містять від 12 до 6 мкмоль ліпідів на їмг ДНК, перевищував це значення. У процесі одержання І МО-систем, що містять 6 мкмоль ліпідів на мг ДНК, іноді спостерігалася агрегація.
З використанням клітин лінії Рапс-ї оцінювали ефективність трансфекції (Фіг.12). Клітини висівали з щільністю приблизно 5х10" клітин на лунку в 24-лунковий планшет у середовище ОМЕМ, доповнене 1095 ФТС, і вирощували протягом 24год. в атмосфері, яка містить 590 СО 5, при 372С. Клітини промивали протягом невеликого періоду часу середовищем ОМЕМ і потім обробляли протягом 2год. розчинами, що містять І! МО- або
ГО-комплекси, попередньо розведені ОМЕМ (у всіх випадках кінцева концентрація ДНК складала 5,Омкг/мл).
Потім клітини знову промивали і інкубували ще протягом 48год. у середовищі ОМЕМ, доповненим 1095 ФТС, після чого збирали і піддавали аналізу у відношенні р-галактозидазної активності з використанням стандартного 70 набору для аналізу (фірма Рготеда).
Максимальна ефективність трансфекції не істотно відрізнялася від тієї, яка спостерігалася для трьох досліджених композицій з різними співвідношеннями катіонний ліпід:ДОФЕ. У випадку І! МО-систем, одержаних з використанням В198:ДОФЕ (1:2 моль/моль) максимальний рівень трансфекції спостерігали при співвідношенні ліпосома:ДНК, що складає приблизно 12,5 мкмоль ліпіду на їмг ДНК. Ефективності трансфекції для І МО-систем, 75 одержаних з використанням катіонних ліпосом, що мають співвідношення В198:ДОФЕ як 3:2 ммоль/ммоль і
ВІ98ДОФЕ яко 2:2 ммоль/ммоль, виходили на постійний рівень при співвідношеннях ліпосома:"ДНК, що перевищують 12,5 мкмоль ліпіду на їмг ДНК. Для всіх проаналізованих | МО-систем виявлена тенденція до меншої ефективності трансфекції при низьких співвідношеннях ліпосома:ДНК (Фіг.12). Це свідчить про те, що для
І МО-композицій, які містять невеликі кількості пептиду Ми!, повинні вимагатися великі кількості катіонних ліпосом у порівнянні з композиціями, одержаними з використанням великих кількостей пептиду Ми, для того, щоб відповідні | МО-системи виявляли свою максимальну активність у відношенні трансфекції.
Приклад 8. Порівняння пептиду Ми! і протаміну
Протамін представляє собою катіонний пептид, який зустрічається в природних умовах, що є присутнім у великій кількості в спермі риб, який має сильну здатність нейтралізувати і конденсувати ДНК. Проводили Ге порівняння активності протаміну у відношенні трансфекції і пептиду Ми1. Пептид Ми! або сульфат протаміну (5) (фірма Зідта, ступінь чистоти Х, одержаний з лосося) об'єднували в комплекс із ДНК (рСММ р) і потім з катіонними ліпосомами (8198:ДОФЕ в співвідношенні 3:2), одержуючи співвідношення ліпосома:пептид:ДНК 12:0,6:1 (мас./мас./мас.).
Активність у відношенні трансфекції досліджували з використанням клітин лінії Зм/ів85 273. Клітини висівали со з щільністю приблизно 2х107 клітин на лунку в 24-лункові культуральні планшети в середовище ОМЕМ, б доповнене 1095 ФТС, і вирощували протягом 48год. до конфлюентності в атмосфері, яка містить 5906 СО», при 372С. Клітини швидко промивали середовищем ЮМЕМ і потім обробляли протягом 1 або 2год. розчинами, які Ше містять ГМО- або І ЮО-комплекси, попередньо розведеними ОМЕМ (у всіх випадках кінцева концентрація ДНК - складала 5,Омкг/мл). Після цього клітини знову промивали і інкубували ще протягом 48год. у середовищі ОМЕМ, 3о доповненим 1095 ФТС, після чого збирали. Рівень Др-галактозидазної активності визначали за допомогою - стандартного набору для аналізу (фірма Рготеда).
Як показано на Фіг.13, комплекси, які містять Ми, мали більшу ефективність у відношенні трансфекції таких конфлюентних клітин, ніж комплекси, які містять протамін. «
Приклад 9. Інші катіонні пептиди 7 70 Для дослідження впливу різних інших катіонних пептидів на ефективність трансфекції одержували серії с комплексів ліпосома:катіонний пептид"ДНК і досліджували іп мйго їх відносні здатності здійснювати з трансфекцію. Як пептиди використовували гідрохлорид полілізину (середня молекулярна маса 3970, фірма
Зідта), гідрохлорид поліаргініну (середня молекулярна маса 1180, фірма Зідта), пептид, одержаний із протеїну
М, рм (р5, послідовність наведена нижче), пептид, який є аналогом Ми! (М, послідовність наведена нижче) і сам пептид Ми1. Пептид р5 і пептид М синтезували з використанням того ж методу твердофазного синтезу пептидів, їв. який застосовували для одержання пептиду Ми. - І Кожен пептид об'єднували з катіонної ліпосомою (0ОС-Спо1-ДОФЕ, 3:2 ммоль/ммоль) і ДНК (рСММрД) У сю співвідношенні ліпосома: пептид:ДНК, що складає 12:0,6:1 (мас./мас./мас.) відповідно до описаного в прикладі 4 методу. Активності у відношенні трансфекції досліджували з використанням клітин лінії Не! а (людські іс) епітеліальні клітини). Клітини висівали з щільністю приблизно 5х107 клітин на лунку в 24-лунковий с культуральний планшет у середовище ОМЕМ, доповнене 1095 ФТС, і вирощували протягом 24год. в атмосфері, яка містить 5956 СО», при 3720. Клітини швидко промивали середовищем ЮОМЕМ і потім обробляли протягом ЗОхв. розчинами, які містять І МО- або І О-комплекси, попередньо розведені середовищем ОРТІМЕМ (фірма бірсо) (у 5Б всіх випадках кінцева концентрація ДНК складала 1,Омкг/мл). Потім клітини знову промивали і інкубували ще протягом 48год. у середовищі ОМЕМ, доповненим 1095 ФТС, після чого їх збирали. Рівень ферментативної (Ф. активності р-галактозидази визначали з використанням стандартного набору для аналізу (набір для вимірювання ко хемілюмінесценції, фірма Коспе).
Як показано на Фіг.14, катіонні пептиди, одержані з аденовірусу (Ми! і рб5), і аналог Ми! (М) мали дуже бо високу активність у відношенні трансфекції в порівнянні з комплексами, одержаними з використанням синтетичних катіонних поліпептидів, полілізину і поліаргініну.
Амінокислотні послідовності роб, М і Ми: ро: ЕРЕКЕКАТТККАТТТОТеКеККАК
М: МКЕМННЕККеУЗнНеКУКОоО 65 Ми1: МеЕКАННКЕКККАЗНККМКОО
Приклад 10. Порівняння з комплексом Тгапвгаві з використанням лінії клітин Рапс-1
ЇМО ї ГО одержували відповідно до методу, описаному в прикладі 4, за винятком того, що не використовували рСМУр. Комплекс Тгапвгаві (фірма Рготеда) одержували відповідно до протоколу виробника.
Активності у відношенні трансфекції оцінювали в дослідах іп мйго з використанням клітин лінії Рапс-1.
Клітини висівали з щільністю приблизно 5х107 клітин на лунку в 24-лунковий культуральний планшет у середовище КРМІ, доповнене 10956 ФТС, і вирощували протягом 24год. в атмосфері, яка містить 595 СО 5, при 372С. Клітини швидко промивали середовищем КРМІ і потім обробляли протягом вказаних періодів часу розчинами, які містять ЇМО- і ЇО-комплекси, попередньо розведені середовищем КРМІ (у всіх випадках концентрація ДНК складала 5,Омкг/мл). Після цього клітини знову промивали і інкубували ще протягом 48год. у 70 середовищі КРМІ, доповненим 1095 ФТС, після чого збирали. Рівень ферментативної активності р-галактозидази визначали з використанням стандартного набору для аналізу (фірма Рготеода).
Трансфекцію з використанням комплексу ТгапезїазіДНК здійснювали протягом год. у безсироватковому середовищі (оптимальні умови).
Як продемонстровано на Фіг.15, ЇМО мав більш високу активність у відношенні трансфекції, ніж комплекс 72 ТгтапевїавіДНК і ГО. Ці результати знаходяться в повній відповідності з результатами, одержаними з використанням клітин лінії МО-7.
Приклад 11. Порівняння з ліпофектаміном при використанні людських бронхіальних клітин
Активність | МО-комплексів у відношенні трансфекції порівнювали з активністю ліпофектаміну (фірма бірсо) у комплексі з ДНК із використанням клітин НВЕ (епітеліальні клітини бронхів людини).
Клітини висівали в 12-лунковий культуральний планшет у середовище ЮМЕМ, доповнене 1095 ФТС, і вирощували протягом 24год. в атмосфері, яка містить 596 СО 5, при 372С Клітини швидко промивали середовищем ОМЕМ і потім обробляли протягом вказаних проміжків часу розчинами, що містять або
І МО-комплекс (одержаний відповідно до методу, описаному в прикладі 4), або І О-комплекс (одержаний з використанням співвідношення ліпофектамін-"ДНК, що дорівнює 12:1 (мас./мас.)) попередньо розведені с середовищем ОРТІМЕМ (фірма бірсо) (у всіх випадках кінцева концентрація складала 5,Омкг/мл) (Фіг.16). Після (9 цього клітини знову промивали і інкубували ще протягом 48год. у середовищі ОМЕМ, доповненим 1095 ФТС, після чого піддавали обробці для фарбування для проведення гістохімічного аналізу з використанням Х-аоаї.
Було встановлено, що І МО мав більш високу активність у відношенні трансфекції, ніж ліпофектамін (Фіг.16) ії більш швидко поглинався клітинами лінії НВЕ. Аналогічні результати були одержані для клітин ліній МО?7 і і.
Рапс-1. Ф
Приклад 12. Порівняння з І Т1 з використанням головного мозку щурів: експеримент ех мімо
При створенні винаходу були проведені дослідження активності у відношенні трансфекції на органотипічних і. культурах клітин з головного мозку щурів з використанням репортерної ДНК (рРСММ р) з метою імітації умов, ре які існують іп мімо. Зрізи головного мозку поміщали на прозорі пористі мембрани і вживали заходів для того, щоб зберегти в максимальному ступені властиві цій тканині зв'язність і цитоархітектуру. -
ЇМО ї ГО одержували відповідно до описаного в прикладі 4 методу. ЇТ1 представляє собою поліамінний реагент для трансфекції, який виробляється фірмою Рапмега Со. Одержували комплекс, який містить катіонні ліпосоми (0С-Спо/ДОФЕ, 3:2 ммоль/моль), ЇТ-1 і плазміду РСММр у співвідношенні 3:3,2:1 (мас./мас./мабс.). « дю Зрізи головного мозку обробляли протягом 2год. розчинами, які містять І МО, І О або комплекс ліпосоми:Ї Т1:ДНК -о (19). В усіх випадках у ході експерименту не було виявлено морфологічних змін у зрізах. Після завершення с трансфекції й інкубації протягом 48год. клітини збирали, фарбували за допомогою Х-да! і підраховували :з» кількість клітин блакитного кольору в зрізі (Фіг.17).
При використанні ДНК у дозі 5,Омкг (об'єм культури 2мл) у присутності ЇМО після фарбування з використанням Х-да! була виявлена істотно більша кількість пофарбованих у блакитний колір клітин, ніж у -1 395 присутності ГО або І Т1-комплексу. При використанні в кількості, що складає всього 129нг, ЇМО мав значну активність у відношенні трансфекції, яка все ще перевищувала активність І О (ОС-Спо/ДОФЕ в комплексі з ДНК, - І співвідношення 3:1 (мас./мас.) (доза ДНК 5,Омкг). Було виявлено, що експресія репортерного гена в присутності о була набагато більшою, ніж у випадку трансфекції, опосередковуваної комплексами І О або ліпосома:! Т1:ДНК.
Так, при використанні порівнянних доз ефективність опосередковуваної | МО трансфекції перевищувала в 19 (Се) 50 разів ефективність трансфекції, опосередковуваної ГО, і в 4 рази перевищувала ефективність трансфекції, со опосередковуваної комплексом ліпосома:! Т1:ДНК.
Приклад 13. Порівняння з катіонними ліпосомами 01-67: експеримент іп мімо з використанням легені миші
Активність ЇМО (одержаного відповідно до методу, описаному в прикладі 4, з використанням катіонних ліпосом на основі ОС-Спо/ДОФЕ (3:2моль/моль) і плазміди рСЕ1-САТ) у відношенні трансфекції оцінювали в 59 дослідах іп мімо з використанням легені миші шляхом порівняння з активністю у відношенні трансфекції
ГФ) катіонних ліпосом (І -67:ДОФЕ:ОМРЕ-ПЕГ»оро (1:2:0,05 моль/моль/моль), об'єднаних у комплекс із плазмідою 7 рСЕ1-САТ (10) (співвідношення ліпосома:"ДНК 5,4:1мас./мас.), які використовували для підвищення дії при проведенні клінічних досліджень на легені (201.
ГМО (кінцева концентрація ДНК 0,14мг/мл; об'єм 10Омкл; доза ДНК 14мкг) вводили у вигляді крапель у легені 60 мишей лінії Ваїб/с. І -67:ДОФЕ:ОМРЕ-ПЕГ»оро «1:2:0,05моль/моль/моль) об'єднували в комплекс із плазмідою рСЕ1-САТ (кінцева концентрація ДНК О,8мг/мл; об'єм 10Омкл; доза ДНК 8Омкг) і цей І О-комплекс вводили аналогічним чином у вигляді крапель у легені мишей лінії Ваї1р/с. Через 48год. легені гомогенізували і проводили аналіз у відношенні активності САТ. "Вуси" представляють собою С.К.В.
Одержані результати (Фіг.18) свідчать про те, що система ЇМО і система 01-67, яка містить І0, бо забезпечували практично еквівалентні рівні трансфекції іп мімо, хоча за допомогою системи І МО вводили в п'ять разів більш низьку дозу ДНК.
Приклад 14. Системи І МО, модифіковані з використанням цукру
Для застосувань іп мімо необхідно мінімізувати неспецифічні взаємодії ЇМО з біологічним навколишнім середовищем. Наприклад, при внутрішньовенному введенні істотними перешкодами є небажані взаємодії з компонентами крові (солями, протеїнами і т.д.) і клітинами, які не є мішенями. Так, одним з перших етапів існуючого в природних умовах процесу видалення чужорідних частинок за допомогою вродженої імунної системи є опсонізація чужорідних частинок протеїнами плазми. Для того, щоб зменшити зв'язування протеїнів і індуковану присутністю солей агрегацію, з ЇМО можна зв'язати полісахариди, які зустрічаються в природних /о умовах. Такі модифікації ГМО, здійснювані з використанням вуглеводів, можна успішно застосовувати для здійснення спрямованого перенесення І МО до вуглеводних рецепторів.
Для досягнення необхідної дії були сконструйовані неогліколіпіди, представлені на Фіг.19. Основою цих сполук є три різних домени.
АСНхХ (СОЕ 52): Цей ліпід (Фіг.9У) був вибраний як загальний ліпідний каркас для розглянутих 7/5 неогліколіпідів. Аліфатична- кільцева холестеринова система представляє собою ділянку, яка має виражену гідрофобність, що знаходиться всередині ліпідної оболонки І МО і ГО частинок, яка діє як неогліколіпідний якір.
Вуглеводний мотив: Вибір олігосахаридів був обмежений внаслідок складності будь-якого хімічного методу, у якому використовуються модифікації вуглеводів. При створенні винаходу для доказу принципової можливості застосування вуглеводів використовували вуглеводи, які надходять у продаж, з довгим ланцюгом, такі як 2о мальтотетраоза і мальтогептаоза.
Лінкер: Застосування хемоселективного зв'язку виявилося ефективним і зручним, і це при створенні винаходу дозволило синтезувати велику різноманітність неогліколіпідів. Такий хемоселективний метод заснований на перетворенні СОЕ52 у гідроксиламіноліпід, який здатний безпосередньо зв'язуватися з незахищеними вуглеводами. Схема синтезу типового комплексу гідроксиламіно-С)Е52 представлена на Фіг.20 (схема 1), при сч ов цьому реакція сполучення вуглеводного фрагмента з лінкером заснована на глікозилюванні О-заміщеного гідроксиламіну (принцип взаємодії з глюкозою проілюстрований на Фіг.21 (схема 2)). З використанням цієї і) стратегії здійснювали реакцію сполучення з мальтотетраозою і мальтогептаозою, одержуючи сполуки І 04 і
ОЦ? (структури наведені на Фіг.22).
Модифікації /МО за допомогою глікозилювання засновані на природній здатності неогліколіпідних міцел с зо піддаватися дисоціації, після чого вільні ліпіди вбудовуються в мембрани МО. Спочатку готували ЇМО з використанням катіонних ліпосом ЮОС-Спо1-ДОФЕ, пептиду Ми! і плазміди рСММ Др відповідно до методу, Ме) описаному в прикладі 4. Потім до сумішей, які містять І М, додавали суспензію неогліколіпідних міцел у буфері со
Нерез, рН 7,0, і інкубували протягом ЗОхв. при 202С, після чого поміщали на зберігання при -802С (Фіг.23).
Стабілізація | МО за допомогою неогліколіпідів: Стабілізуюча дія на ЇМО, модифікований за допомогою в неогліколіпіду, оцінювали при введенні в ЇМО 7,5 мол. 95 БІ 04 або 51 Ш7. Відомо, що ліпідний шар І О-систем - піддається агрегації після впливу солей. Тому були зроблені оцінки розмірів частинок І О (кінцева концентрація
ДНК Імкг/мл) після витримування протягом ЗОхв. при 37 «С в середовищі ОРТІМЕМ, які проводили методом фотонно-кореляційної спектроскопії (пристрій типу МА різ, фірма СоцМег). Для оцінки середнього розміру « частинок застосовували метод унімодального аналізу. Збільшення середнього розміру І ЮО-частинок у відсотках 470 представлено на Фіг.24. Таку ж процедуру здійснювали для основної | МО-системи, ЇМО (5 0431 МО (51 07) - с (кінцеві концентрації ДНК мкг/мл). а Результати свідчать про те, що ЇМО є більш стабільним у розчині, ніж ГО, однак вони також показують, що "» присутність СІ 04 і БІ 07 виявляє підвищену антиагрегуючу стабілізуючу дію на І МО-частинки при 7,5 мол. 90.
Ефективність трансфекції іп міго: Активність у відношенні трансфекції визначали з використанням клітин лінії Не/ а, які висівали з щільністю 5х107 клітин на лунку в 24-лункові культуральні планшети і вирощували до -і досягнення 7095 конфлюентності в середовищі ОМЕМ, доповненим ФТС, при 372С в атмосфері, яка містить 590 -1 СО». Клітини промивали ЗФР і потім протягом ЗОхв. обробляли розчинами, які містять І! МО-комплекси, попередньо розведеними середовищем ЮМЕМ, що містить ФТС у вказаній концентрації (90) (у всіх випадках о кінцева концентрація ДНК складала 5,Омкг/мл). Після цього клітини ще раз промивали і потім інкубували ще со 20 протягом 48год. у нормальному середовищі (МОМ), після чого збирали. Рівень експресії р-галактозидази визначали за допомогою стандартного набору для аналізу (набір для хемілюмінесцентного аналізу, фірма с» Коснпе).
Результати свідчать про збільшення ефективності трансфекції у випадку модифікації з використанням цукру як в умовах, коли середовище містило Об, так і в умовах, коли середовище містило 5095 сироватки (Фіг.25). 59 Обговорення результатів
ГФ) Раніше було встановлено, що ліпосоми ОС-Спо/ДОФЕ, мають ефективність у відношенні трансфекції клітин лінії МО7, одержаної з нервових клітин (17). Відомо, що ЮС-Спо! успішно застосовували для різних тканин, о відмінних від тканин ЦНС, і проводили клінічні дослідження можливості застосування для генної терапії кістозного фіброзу (21, 22). Було встановлено також, що ліпосоми, які містять ЮС-СпоЇї, не мали побічних 60 цитотоксичних дій (23, 24). Внаслідок цього була поставлена задача розробити композиції цих ліпосом, які мають поліпшені характеристики, які можна застосовувати для нервових клітин.
Даний винахід стосується застосування кодованого вірусом протеїну для трансфекції клітин. Було встановлено, що Ми! при його застосуванні в комбінації з катіонною ліпосомою ЮС-Спо!/ДОФЕ має здатність істотно підсилювати трансфекцію клітин. Найбільш імовірно, що це зумовлюється тим, що Ми! має здатність бо конденсувати пДНК, і вказану дію можна оптимізувати шляхом зміни співвідношень поліпептиду, ПДНК і катіонної ліпосоми. Важливо, що посилення ефективності трансфекції є більш вираженим у випадку диференційованих клітин. Як вказувалося вище, клітини лінії МО7 були одержані з первинних ОКО. При диференціюванні клітин лінії МО7 виникає фенотип, аналогічний до фенотипу батьківських периферичних чутливих нейронів, що включає індукцію росту аксону нервової клітини, зменшення загальної проліферації і зменшення здатності до трансфекції (14, 25). Посилення ефективності трансфекції диференційованих клітин лінії МО7 може відображати підвищену здатність стимулювати трансфекцію первинних нейронів іп мімо.
Успіх застосування невірусних носіїв, які забезпечують введення генів, як реальну альтернативу для систем, заснованих на використанні вірусних векторів, залежить від створення комплексів, які мають більш 7/0 високу ії більш тривалу ефективність у відношенні трансфекції. Відтоді, коли вперше було встановлено, що катіонні ліпосоми можна застосовувати як носії для перенесення генетичного матеріалу в клітини, були докладені значні зусилля з метою створення композицій на основі катіонних ліпосом, які мають поліпшені характеристики (26, 27). Більшість підходів до поліпшення характеристик катіонних ліпосом базувалися на структурних модифікаціях самої молекули |16Ї. Були розроблені нові композиції, які характеризуються 7/5 підвищеною ефективністю трансфекції |(16). Однак для різних типів клітин ефективність трансфекції, здійснюваної з використанням катіонних ліпосом, є різною. Наприклад, при створенні винаходу було встановлено, що поліпептид Ми! підсилює опосередковувану катіонними ліпосомами трансфекцію в більшому ступені, ніж Мр1. Це може бути зумовлене тим, що Ми! має більше співвідношення заряд/маса. У той час, як обидва пептиди мають приблизно однакову молекулярну масу, загальне співвідношення заряду і маси для Ми! більше ніж у два рази перевищує відповідне значення для Мр1 (Таблиця 2). Відповідно до цього Ми! мав здатність сповільнювати електрофоретичну рухливість плазмідної ДНК у 60 разів більш низької концентрації, що свідчить про те, наскільки сильно Ми! здатний зв'язуватися з ДНК. Хоча в тому випадку, коли 0,25мкг Ми! об'єднували в комплекс із 1мкг рРСМУр, була виявлена невелика зміна рухливості пДНК, після додавання 0,5мкг
Ми! майже всі плазміди залишалися поблизу лунки, у яку вони були завантажені (Фіг.1). Співвідношення Ми! і с рРСММр, що складає 0,5:1,0 (мас./мас.), відповідає молярному співвідношенню 1000:1. Кожна молекула Ми! містить 12 залишків, які потенційно можуть нести позитивний заряд. Теоретичне співвідношення зарядів Ми! і і) рОМУд повинне складати 1,6 (12000 катіонів Ми! стосовно 7500 аніонів РСММрД). Таке співвідношення повинне повністю нейтралізувати негативні заряди рСММ р і тим самим повністю виключити його міграцію, як це видно з представлених результатів. со
Пряме порівняння кількості Миї, яка істотно сповільнює міграцію плазмідної ДНК, і кількості, яка Ф оптимальним чином підсилює трансфекцію, не проводилося, оскільки використовувалися різні методи одержання. Призначені для трансфекції комплекси пептид-пДНК-ліпосома одержували в більш великих об'ємах (зе) (див. розділ Матеріали і методи). Хоча для досягнення оптимального посилення ефективності трансфекції була м потрібна в 24 рази більша кількість Ми1 (12мкг на 1 мкг рСММр), ніж для сповільнення міграції в агарозному гелі, концентрація в розчині була аналогічною (25нг/мл для сповільнення міграції пДНК; ЗОнг/мл для і - оптимальної трансфекції). Присутність Ми!ї приводила також до зміни взаємодії катіонних ліпосом і пДНКк.
Оптимальне співвідношення ОС-Спо/ДОФЕ і рСОММ р у присутності Ми! складало 6:11, що в два рази перевищувало оптимальне співвідношення, встановлене раніше для нервових клітин |17, 28). З теоретичної « точки зору використовувана кількість Ми! повинна повністю нейтралізувати позитивні заряди, які є на РСММ Д, що могли перешкоджати подальшому утворенню комплексів з ОС-Спо/ДОФЕ. Очевидно, що це не мало місця, З с оскільки виявилося можливим одержати набагато більш високі ефективності трансфекції. Імовірно, це зумовлено "з тим, що при використанні вказаного в розглянутих дослідженнях буфера не всі можливі заряджені амінокислоти " були депротоновані. Невідомо, чому для посилення трансфекції потрібно більша кількість катіонних ліпосом, тому в даний час проводяться дослідження для вирішення даного питання.
Нарешті, слід зробити зауваження, які стосуються сигналу ядерної локалізації, що міститься в Мр1. Останні - дані, одержані при створенні винаходу (дані не опубліковані), а також наведені в інших роботах 129-321, -І дозволяють припустити, що при ліпофекції транспорт трансфектованого продукту в ядро може виявитися неефективним. Внаслідок цього для посилення поглинання трансфектованої ДНК ядром були розпочаті спроби і здійснити попередню конденсацію ДНК за допомогою полікатіонів, що містять послідовності пептидів, для яких
Ге) 20 відомо, що вони мають здатність здійснювати ядерну локалізацію І33-35). Однак при створенні винаходу було встановлено, що з погляду підвищення ефективності трансфекції більш ефективна здатність Ми! конденсувати с» ДНК значно переважує здатність Мр1 здійснювати ядерну локалізацію. Аналогічно до цього Егії2 зі співавторами
ЇЗ5Ї не виявили відмінностей в ефективностях трансфекції, здійснюваних з використанням рекомбінантного людського гістону (НІ) і модифікованої версії, яка містить велику послідовність ядерної локалізації т 252 антигену 5М40. Результати інших досліджень дозволяють припустити, що наявність МІ З може поліпшувати
ГФ) нагромадження трансфектованої пДНК у ядрі, хоча це здійснюється специфічними внутрішньоклітинними шляхами (Зб, 37. ді В цей опис як посилання, влючені і інші публікації (38-55). Для фахівця в даній галузі повинно бути очевидно, що можуть бути зроблені різні модифікації і варіації описаних методів і систем без відхилення від 60 обсягу і суті винаходу. Хоча винахід був описаний з посиланням на конкретні переважні варіанти здійснення, слід розуміти, що заявлений винахід не обмежений цими конкретними варіантами здійснення. В обсязі наведеної нижче формули винаходу можуть бути зроблені різні модифікації описаних варіантів здійснення винаходу, що є очевидними для фахівців в галузі молекулярної біології і споріднених галузей.
Список джерел інформації б5 1. ОСійоск Е.Т. еї а). Роїуотамігив та|ог сарзід ргоївіп МРІЇ ів сараріе ої расКіпуд сеїїшаг ОМА мпеп ехргеззеай іп (Не расціомігив зувіет // 9. Мігої!. - 1997. - 71. -- Р. 2857-2865. 2. Спапд О., Саії Х., Сопвідії К.А. СПагасіегігайоп ої (Ше ОМА бБіпаіпод ргорепієез ої роїуотамігивз сарвій ргоїеїіпз // дошигпаї ої Мігоіоду. - 1993. - 67. - Р. 6327-6331.
З. Апдеггоп СЛУ. Моцпуд М.Е., БРііпб о 5.9У. СВагасіегігайоп ої їйе адепомігив 2 мігоп ргоївіп, ти //
Мігоіоду. - 1989. - 172. - Р. 506-512. 4. Заю, НозоКкама // 9. Віої. Спет. - 1984. - 95. - Р. 1031-1039. 5. Оемегеих еї аї. // Мисівїс Асідз Кезеагсі. - 1984. - 12. - Р. 387. 6. АйЄзибеї! еї а). Зногі Ргоосоїв іп Моіесшіаг Віоіоду. 4" Ед. - допп Уміеу 4 Зопв, Іпс., 1999, 7. Аїївспи! еї аї. // У. Мої. Віої. -- 1990. - Р. 403-410. 8. РіпоммаїЇ, І азКеу // Ттепаз. Віоспет. Зсі. - 1991. - 16. - Р. 478-481. 9. МО, 95/02698, 1995. 10. 05, 4,897,355. 11. МО, 91/15501, 1991. 12. МО, 97/45442, 1997. 13. ЕР, 304111, А. 14. Мооа .М. еї аі. Моме! СеїІ-/іпез Оізріау Ргорепіез ої Мопсісеріме Зепзогу Мецгопе // Ргосееадаіпдв5 ої (пе Коуаї 5осієейу ої І опаоп бегіеєз В-Віоіодіса! Зсіепсев. - 1990. - 241. - Р. 187-194. 15. Видпгаттанадео М., І Шусгор К. А. Тпе Іемеіїз ої (Ше Апіадопівіс Ро Ратійу Тгапзсгіріоп Расіогв Вт-За апа Вгп-ЗЬ іп Мешгопа! СеїЇїв Аге Кедшайеай іп Оррозіе Оігесіопе Ву Зегит ОСгоулй-Расіоге // Месшговсі.
Іеф..- 1995. - 185. - Р. 48-51. 16. Соорег К.О. еї а). Роїуатіпе апаодцевз ої З-ре(а-(М-(М';М'-діте(уіІатіпотеїпап)сагратоїіЦспоїевіегої (00-Стпої) аз адепів їог депе деїїмегу // Спетівігу-а Епгореап доишгпаї. - 1998. - 4. - Р. 137-151. 17. МесОціЦп А. ей аїЇ. Оріійтігайоп ої Прозоте тедіаєей(й (гапеіесіоп ої опецгопаі! осей пе / су
Меишгогерогі. - 1997. - 8. - Р. 1481-1484. 18. МО, 97/45442. і) 19. Митгау еї аї. / Сепе Тег. - 1999, - 6. - Р. 190-197. 20. Ап еї аїЇ. // апсеї. - 1999. - 353. - Р. 947-954. 21. Саріеєп М.Ю. еїг а). Пірозоте-Медіаїй СЯ Сепе-Тгапвіег о Ше Маза! Еріїейнт ої райепів МУйй со
Сузіїс-Рірговів // Маїшге Меа. - 1995. - 1. - Р. 39-46. 22. Маре! б., Спапуд А., Маре! Е. Сіїпіса! Ргоїосо!: Іттипоїпегару ої таїїдпапсу ру іп мімо депе Іігапвгтег о іп штогз // Нит. Сепе Тег. - 1992. - 3. - Р. 399-4100. со 23. Маре! с. еї аїЇ. Оігесїі депе-ігапеїег мйй ОМА Ірозоте сотріехез іп теїіапота-ехргеззіоп, Біоіодісаї асіїмну, апа ої іохісйу іп питапзв // Ргос. Май). Асай. 5сі. ОА. - 1993. - 90. - Р. 11307-11311. - 24. Зіежапй М.). ей а). Сепе-(гапвієг іп мімо мйй ОМА Ірозоте сотрієхев - взаїєїу апа асшіе іохісйу іп ря тісе // Нит. Сепе Тег. - 1992. - 3. - Р. 267-275. 25. Митау К.О. ег а ОС-СпоМООРЕ тедіаєеа (ігапетесіопе іп айегепіагеай звепзогу пецгопе // Іп ргерагайопв. - 1999. « 26. ее К.)., Ниапд Ї. Ііріадіс месіог вувіетве їог депе ігапебіег // Стйіса! Кеміемв іп Тпегашмреїйс Огид Сатіег Зувіетв. - 1997. - 14. - Р. 173-206. - с 27. БЕеіїдпег Р.Ї. ей аїЇ. Ііроїесйіоп - а Ніодніу ЕйНісіепі, І іріа-тедіаєей ОМА-ТгапеГесіоп Ргоседиге // й Ргос. Май). Асад. сі. ОБА. - 1987. - 84. - Р. 7413-7417. "» 28. Митау К.О. еї аїЇ. Сайопіс Ірозоте-теаіайей (гапветесіоп іп огдапоїїріс ехріапі сиМигев // Сепе
Тег. - 1999, - 6. - Р. 190-197. 29. ІарасМоївеиг Р. еї а). Ап еїесігоп тісгозсору віцау іпіо їШе теспапізт ої депе ігапвїег м йй -І ГПророїуатіпез // Сепе ТНег. 1996. - 3. - Р. 1010-1017.
ЗО. 7арпег у. ей а). Сеїїшаг апа тоїЇесціаг бБагієгз (0 депе ігапеїег Бу а сайопіс рій // 9. Віої. і Спет. 1995. - 270. - Р. 18997-19007. оз З1. Тпіепту А.К. еї аїЇ. СпПагасіегігайоп ої ІПрозоте-тедіаїєу! депе деїїмегу: Ехргезвіоп, віарійу апа рпаптасокіпеїййсз ої ріазтій ОМА // Сепе ТНег. - 1997. - 4. - Р. 226-237. о 32. Соопгод А., її РБ.О, Нопмий»2 М. Оп Ше теспапізт ої ОМА (ігапзіесіоп: епПісіепі депе ігапеГег м/йпоцї с» міговез // Сепе ТПег. - 1997. - 4. - Р. 1313-1321. 33. Богді Р.Г., Впацаспагуа 5., Ниапд І. Ргоїатіпе зиМа(е еппапсез Іірій-тедіаїей депе ігапеїег // Сепе
Тпег. - 1997. -4.- Р. 961-968. 34. Матікі М., ТаКапйазпі Т., Ойпо Т. Сепе (ігапздисіоп їог аіззетіпаїейд іпігарепіопеа! (Штог ивіпд сайопіс ІПрозотевз сопіаіпіпуд поп-пізвіопе спготайп ргоївіпе: сайопіс Прозота! депе (пегару ої о сагсіпотайза // Сепе Тег. - 1998. - 5. - Р. 240-246. ко З5. Егй2 9.0. е( аЇ. Сепе ігапеїег іпію таттаїіап сеїЇв ивіпуд Ппізіопе-сопдепзей ріазтій ОМА // Нит. Сепе
Тпег. - 1996. - 7. - Р. 1395-1404. во Зб. Зеревзіуеп М.О. ей а. ОМА месіог спетізігу: (йе сомаіепі айасптепі ої відпа! реріїдев юю ріазтій ОМА // Маї. Віоїесппої!. - 1998. - 16. - Р. 80-85. 37. Надвігопг 9У.В. ей а). Мисієваг ітрог ої ОМА іп аіднопіп-рептеарійгей сеїв // 9. Сей Зсі. - 1997. - 11О(РІ. 18). - Р. 2323-2331. 38. Мооа М.).А. еї аЇ. Іпйаттайогу еПесів ої депе-ігапетег іпіо СМ5 м/йй деїтсіменемМ-1 месіогв // Сепе 65 Тег. -- 1994. - 1. - Р. 283-291. 39. Вугпез А.Р. еї аЇ. Адепомігиз депе-їгапеїег сацвзез іпйаттаййоп іп (Ше Бгаіїп // Мецйгозсіепсе. - 1995.
- 66.- Р. 1015-1024. 40. Маїдіпі ГГ. еф а). й мімо депе деїймегу апа віаріеє ігапздисіоп ої попаїмідіпд сеїйв Бу а Іепіїміга! месіог // Зсіепсе. - 1996. - 272. - Р. 263-267. 41. МіШег А.О. Сацйопіс Прозотевз їог депе деїїмегу // Апдежапафе СпПНептіе-Іпіегпайопа! Есайіоп. - 1998. -37.- Р. 1769-1785. 42. Сао Х., Нцапа Г.. Сайопіс Ірозоте-теавіаеай депе-ігапвіег // Сепе Тег. - 1995. -2.- Р. 710-722. 43. Ратпоой Н., Зегріпа М., Ниапуд ЇЇ. Те гоїе ої айоіеу! рпозрпацайегшапоіатіпе іп сайопіс Ірозоте теадіагеай депе ігапзгег // Віоспіт. Віорпуз. Асіа. - 1995. - 1235. - Р. 289-295. 70 44. Сарієп М.). ей аїЇ. Іп-мімо Ійрозоте-тедіаєшай ОМА (гапетесіоп ої еріїпеїїаІ-се!Ї ІПпевз цвіпд сайопіс
Прозоте ОС-СпО/ООРЕ // Сепе Тег. - 1995. - 2. - Р. 603-613. 45. Реідпег Р.Г. е( ам. Епрапсей Сепе ЮОеїїмегу апа Меспапізт 5іцадіез МУЙйй а Моме! Зегіеєв ОЇ Саїйопіс
Орій Рогтиавопв // 9). Віої. Спет. - 1994, - 269. - Р. 2550-2561. 46. Запепк 7. еї аії. Сепе Оеїїмегу ю ріпа! Мойїог Мешйгопз // Вгаіп Кев. - 1993. - 606. - Р. 126-129. 47. Іматоїю У. еї аїЇ. Іірозоте-МедіаФєй Вапїі Сапа Тгапеїег по Іпфіасі апа Іпішгей Каї-Вгаіїп //
Меигогерогі. - 1996. - 7. - Р. 609-612. 48. Коезвіеєг В.)., ЮОамідвоп В.Ї. Оігесі ріавтіад-птеадіаєеай (гапетесіоп ої адшї тигіпе Бгаїп-сеїІв іп мімо ивіпд сайопіс ІПрозотез // Мешйговсі. | ей. - 1994. - 167. - Р. 5-10. 49. йо Х, Ницапд ЇЇ. ОМА (ігапеїесіоп тедіабай ру сайопіс Ірозотевз сопіаіпіпд Іроро|уузіпе: спагасіегігайоп апа теспапізт ої асіоп // Віоспіт. Віорпуз. Асіа. - 1994. - 1189. - Р. 195-203. 50. 11 5., Ниапуд Ї. Ргоїатіпе зицМафїе ргомідез еппапсей апа гергодисіріе іпігамепоиз депе ігапеїег Бу сайопіс Ірозоте/ОМА сотріех // дошигпаї ої І ірозоте Кезеагсй. - 1997. - 7.- Р. 207-219. 51. Мейо ї!. ей а). Сопдепвайоп ої ріазтіій ОМА м/йй роїуїувіпе ітргомез Ірозоте-теадіаїєйд депе ігапетег іпіо евіаріїзнеа апа ргітагу тизсіє сеїЇв // Сепе Тег. - 1996. - 3. - Р. 396-404. сч 52. бао Х., Ниапд І. Роїіепііацоп ої сайопіс Ірозоте-тедіаге(й депе деїїмегу ру роїусайопе // Віоспет. - 1996. - 35. - Р. 9286-9286. і) 53. Надвігот У.Е. еї а). Сотріехев ої поп-сайопіс розотевз апа Ппівопе Ні тесдіафе ейісіепі ігапеТесіоп ої ОМА м/йпоці епсарзшіацйоп // Віоспіт. Віорпуз. Асіа. - 1996. - 1284. - Р. 47-55. 54. Івака У. Те НУ) Іїтрозоте теїййпоай // Ехр. Мернгої. - 1998. - 6. - Р. 144-147. с зо 55. Нозокажа К., Зипд М.Т. ІвоЇїайоп апа спагасіегігайоп ої ап ехігетеїу Бразіс ргоївіп їот адепомігив іуре 5 // 9). Мігої. - 1976. - 17. - Р. 924-934. б» со

Claims (13)

Формула винаходу ч- 35 , о . . о, о і -
1. Невірусний вектор для введення нуклеїнової кислоти, який містить конденсований комплекс поліпептид/нуклеїнова кислота і катіонний ліпід, де комплекс включає (а) нуклеотидну послідовність (МОЇ), що представляє інтерес; і (б) один або декілька аденовірусних поліпептидів або їх похідних, які упаковують нуклеїнову кислоту, де « поліпептиди або їх похідні (І) мають здатність зв'язуватися з МОЇ; і (ІІ) мають здатність конденсувати МОЇ; і з с де МОЇ є гетерологічною стосовно поліпептиду.
2. Вектор за п. 1, де аденовірусний поліпептид являє собою Ми, рм або рмі! або його похідне. :з» З.
Вектор за п. 1 або п. 2, який додатково включає поліпептид, який містить послідовність ядерної локалізації (МІ 5).
4. Вектор за п. З, де поліпептид, який містить послідовність ядерної локалізації (МІ 5), являє собою - аденовірусний рм або його похідне.
5. Конденсований комплекс поліпептид/нуклеїнова кислота, який містить катіонний ліпід, поліпептидний і компонент і компонент, що являє собою нуклеїнову кислоту, призначений для введення компонента, що являє с собою нуклеїнову кислоту, у ядро еукаріотичної клітини, де (І) поліпептидний компонент є аденовірусним поліпептидом або його похідним, який упаковує нуклеїнову се) кислоту; с» (І) поліпептидний компонент або його похідне має здатність зв'язуватися з МОЇ; і (ПП) поліпептидний компонент або його похідне має здатність конденсувати МОЇ; і де нуклеїнова кислота є гетерологічною стосовно поліпептиду.
6. Комплекс за п. 5, де аденовірусний поліпептид являє собою Ми, ру або рМмі! або його похідне
7. Комплекс за п. 5 або п. б, який додатково включає поліпептид, який містить послідовність ядерної (Ф) локалізації (МІ 5). ГІ
8. Комплекс за п. 7, де поліпептид, який містить послідовність ядерної локалізації (МІ 5), являє собою аденовірусний рм або його похідне. во
9. Комплекс за будь-яким з пп. 5-8, де співвідношення катіонний ліпід:МОІ:поліпептид складає 2-20:1:0,5-1, переважно 10-14:1:0,5-0,7, більш переважно 12:1:0,6.
10. Спосіб одержання невірусного вектора, призначеного для введення нуклеїнової кислоти, який містить конденсований комплекс поліпептид/нуклеїнова кислота і катіонний ліпід, який полягає в тому, що (а) нуклеотидну послідовність (МОЇ), що представляє інтерес, приводять у контакт із аденовірусним 65 поліпептидом або його похідним, який упаковує нуклеїнову кислоту, де поліпептидний компонент або його похідне, (І) має здатність зв'язуватися з МОЇ; і (І) має здатність конденсувати МОЇ; і де МОЇ є гетерологічною стосовно поліпептиду; і (б) утворений у результаті цей комплекс нуклеїнова кислота/поліпептид приводять у контакт із катіонним ліпідом.
11. Спосіб вбудовування нуклеїнової кислоти (МОЇ), що являє інтерес, у еукаріотичну клітину, який полягає в тому, що клітину приводять у контакт із комплексом за будь-яким з пп. 5-9, де комплекс містить МОЇ.
12. Спосіб за п. 11, де клітина являє собою нервову клітину, ракову клітину або епітеліальну клітину.
13. Застосування аденовірусного поліпептиду або його похідного, який упаковує нуклеїнову кислоту, де поліпептид або його похідне (І) мають здатність зв'язуватися з МОЇ; і (ІЇ) мають здатність конденсувати МОЇ; 70 і де МОЇ є гетерологічною стосовно поліпептиду, для одержання невірусного вектора для введення нуклеїнової кислоти за п. 1. с щі 6) (зе) (о) (зе) ча і - -
с . и? -І -І (95) се) сю» іме) 60 б5
UA2002076053A 1999-12-23 2000-12-12 Non-viral vector for introduction of nucleic acid and a process for preparation thereof, condensed complex polypeptide/nucleic acid and a process for insertion of nucleic acid of interest, into eukaryotic cell UA77393C2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9930533.6A GB9930533D0 (en) 1999-12-23 1999-12-23 Nucleic acid delivery
PCT/GB2000/004767 WO2001048233A1 (en) 1999-12-23 2000-12-12 Viral core protein-cationic lipid-nucleic acid-delivery complexes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA77393C2 true UA77393C2 (en) 2006-12-15

Family

ID=10866964

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA2002076053A UA77393C2 (en) 1999-12-23 2000-12-12 Non-viral vector for introduction of nucleic acid and a process for preparation thereof, condensed complex polypeptide/nucleic acid and a process for insertion of nucleic acid of interest, into eukaryotic cell

Country Status (16)

Country Link
US (2) US20030153081A1 (uk)
EP (2) EP1244805B1 (uk)
JP (1) JP2003518388A (uk)
CN (1) CN100354426C (uk)
AT (1) ATE318322T1 (uk)
AU (1) AU781356B2 (uk)
CA (1) CA2395454A1 (uk)
CZ (1) CZ298353B6 (uk)
DE (1) DE60026164T2 (uk)
DK (1) DK1244805T3 (uk)
ES (1) ES2258986T3 (uk)
GB (1) GB9930533D0 (uk)
PT (1) PT1244805E (uk)
RU (1) RU2267536C2 (uk)
UA (1) UA77393C2 (uk)
WO (1) WO2001048233A1 (uk)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0118517D0 (en) * 2001-07-30 2001-09-19 Mitsubishi Tokyo Pharm Inc Compound
FR2829136B1 (fr) * 2001-08-29 2006-11-17 Aventis Pharma Sa Derives lipidiques d'aminoglycosides
WO2003018603A1 (fr) * 2001-08-29 2003-03-06 Aventis Pharma S.A. Derives lipidiques d'aminoglycosides_pour la transfection
BRPI0411505A (pt) 2003-06-18 2006-07-25 Yissum Res Dev Co uso de um composto, método para modular a resposta imune de um indivìduo, composição farmacêutica, vacina, complexo, e, kit para a captura de uma molécula biologicamente ativa
US7906122B2 (en) 2003-06-18 2011-03-15 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jersusalem Sphingoid polyalkylamine conjugates for Hepatitis B virus vaccination
GB0418172D0 (en) * 2004-08-13 2004-09-15 Ic Vec Ltd Vector
US20090155853A1 (en) * 2005-11-18 2009-06-18 Gary Nabel Non-viral gene delivery complex
US20110002851A1 (en) * 2006-11-03 2011-01-06 Medigene Ag Cationic Colloidal Carriers for Delivery of Active Agents to the Blood-Brain Barrier in the Course of Neuroinflammatory Diseases
WO2008056623A1 (fr) * 2006-11-09 2008-05-15 Daiichi Sankyo Company, Limited Composition pour l'introduction d'acide nucléique
EP2105145A1 (en) 2008-03-27 2009-09-30 ETH Zürich Method for muscle-specific delivery lipid-conjugated oligonucleotides
WO2010042751A2 (en) * 2008-10-08 2010-04-15 Chimeros Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
JP5747282B2 (ja) * 2008-11-10 2015-07-15 テクミラ ファーマシューティカルズ コーポレイションＴｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 治療薬を送達するための新規な脂質及び組成物
WO2010120874A2 (en) * 2009-04-14 2010-10-21 Chimeros, Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
WO2013036973A2 (en) 2011-09-09 2013-03-14 Biomed Realty, L.P. Methods and compositions for controlling assembly of viral proteins
CA3165769A1 (en) 2011-12-07 2013-06-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable lipids for the delivery of active agents
EP3160938B1 (en) 2014-06-25 2020-09-16 Acuitas Therapeutics Inc. Novel lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
EP3313829B1 (en) 2015-06-29 2024-04-10 Acuitas Therapeutics Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
JP2018532404A (ja) * 2015-10-14 2018-11-08 ライフ テクノロジーズ コーポレーション リボ核タンパク質トランスフェクション薬剤
HRP20230209T1 (hr) 2015-10-28 2023-04-14 Acuitas Therapeutics Inc. Novi lipidi i lipidne formulacije nanočestica za isporuku nukleinskih kiselina
MX2018013919A (es) 2016-06-09 2019-04-15 Curevac Ag Portadores hibridos para cargas de acido nucleico.
WO2017212006A1 (en) * 2016-06-09 2017-12-14 Curevac Ag Hybrid carriers for nucleic acid cargo
US11357856B2 (en) 2017-04-13 2022-06-14 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for delivery of active agents
AU2018256867A1 (en) 2017-04-27 2019-11-14 The Johns Hopkins University Nucleoside-modified mRNA-lipid nanoparticle lineage vaccine for hepatitis C virus
CA3061612A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Acuitas Therapeutics, Inc. Novel carbonyl lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
JP7355731B2 (ja) 2017-08-16 2023-10-03 アクイタス セラピューティクス インコーポレイテッド 脂質ナノ粒子製剤における使用のための脂質
WO2019036030A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS
US11542225B2 (en) 2017-08-17 2023-01-03 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
US11453639B2 (en) 2019-01-11 2022-09-27 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents
JP2021016370A (ja) * 2019-07-23 2021-02-15 株式会社東芝 核酸導入キャリア、核酸導入キャリアセット、核酸導入組成物及び核酸導入方法
CN110408656A (zh) * 2019-07-29 2019-11-05 成都朴名生物科技有限公司 脂多聚物体及其制备方法、采用脂多聚物体将基因编辑质粒导入真核细胞的方法
CN110452303B (zh) * 2019-08-08 2022-03-04 中国科学院武汉病毒研究所 共价连接核酸和肽或蛋白的方法及应用
CN111394313A (zh) * 2020-04-01 2020-07-10 河南科技学院 一种人造细胞及其制备方法
EP4182297A1 (en) 2020-07-16 2023-05-24 Acuitas Therapeutics, Inc. Cationic lipids for use in lipid nanoparticles
CN114656422B (zh) * 2022-04-22 2023-05-23 重庆理工大学 一种新型氮杂冠醚化合物及其阳离子脂质体、制备方法与应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH574396A5 (uk) * 1969-12-29 1976-04-15 Richter Gedeon Vegyeszet
US4189431A (en) * 1975-08-04 1980-02-19 The Board of Trustees of Leland Stanford Junior University Alkinyl terminating groups in biogenetic-like cyclizations to steroids
US5283185A (en) * 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
IL112372A (en) * 1994-02-07 2001-08-26 Res Dev Foundation Non-viral vector for the delivery of genetic information to cells
US5510510A (en) * 1994-05-10 1996-04-23 Bristol-Meyers Squibb Company Inhibitors of farnesyl protein transferase
US6051429A (en) * 1995-06-07 2000-04-18 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
US5736392A (en) * 1995-06-07 1998-04-07 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
CN1181422A (zh) * 1996-10-31 1998-05-13 上海市肿瘤研究所 与生长因子受体结合的多肽所构建的基因转移载体
AU3285000A (en) * 1999-03-09 2000-09-28 Akzo Nobel N.V. 22r-hydroxycholesta-8,14-diene derivatives for the inhibition of meiosis

Also Published As

Publication number Publication date
DE60026164T2 (de) 2006-11-16
PT1244805E (pt) 2006-07-31
DK1244805T3 (da) 2006-06-26
EP1566445A2 (en) 2005-08-24
GB9930533D0 (en) 2000-02-16
ATE318322T1 (de) 2006-03-15
AU1871601A (en) 2001-07-09
CA2395454A1 (en) 2001-07-05
WO2001048233A1 (en) 2001-07-05
AU781356B2 (en) 2005-05-19
JP2003518388A (ja) 2003-06-10
EP1244805A1 (en) 2002-10-02
US20090209037A1 (en) 2009-08-20
EP1566445A3 (en) 2005-08-31
RU2267536C2 (ru) 2006-01-10
CZ20022193A3 (cs) 2003-02-12
CN1434870A (zh) 2003-08-06
CN100354426C (zh) 2007-12-12
RU2002119560A (ru) 2004-03-27
EP1244805B1 (en) 2006-02-22
US20030153081A1 (en) 2003-08-14
DE60026164D1 (de) 2006-04-27
ES2258986T3 (es) 2006-09-16
CZ298353B6 (cs) 2007-09-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA77393C2 (en) Non-viral vector for introduction of nucleic acid and a process for preparation thereof, condensed complex polypeptide/nucleic acid and a process for insertion of nucleic acid of interest, into eukaryotic cell
EP2604255B1 (en) Novel reagents for transfection of eukaryotic cells
US8759499B2 (en) Lipids for transfection of Eukaryotic cells
US6245427B1 (en) Non-ligand polypeptide and liposome complexes as intracellular delivery vehicles
EP3371315A1 (en) Phagemid vector
US20170029448A1 (en) Polycationic methyl phospholipids for improveddelivery of nucleic acids to eukaryotic cells
WO1998018951A1 (fr) Systeme de transfert de genes par l'intermediaire de recepteurs pour therapie genique ciblee de tumeurs
Lee et al. Enhancement of adenoviral transduction with polycationic liposomes in vivo
Madon et al. Receptor–Mediated Delivery of Hepatitis B Virus Dna and Antisense Oligodeoxynucleotides to Avian Liver Cells
WO2000062815A2 (en) Novel pharmaceutical composition suitable for gene therapy
Dai et al. Construction of an EGF receptor-mediated histone H1 0-based gene delivery system
AU2012268867B2 (en) Novel reagents for transfection of eukaryotic cells
Nakanishi et al. Liposome-mediated introduction of macromolecules into living animal cells with the aid of HVJ (Sendai virus)