CZ20032805A3 - Použití peptidových sloučenin, způsob zlepšení směrování a absorpce lipozómů, způsob léčby a diagnostiky pacientů, diagnostická nebo zobrazovací testovací sada a přípravek - Google Patents

Použití peptidových sloučenin, způsob zlepšení směrování a absorpce lipozómů, způsob léčby a diagnostiky pacientů, diagnostická nebo zobrazovací testovací sada a přípravek Download PDF

Info

Publication number
CZ20032805A3
CZ20032805A3 CZ20032805A CZ20032805A CZ20032805A3 CZ 20032805 A3 CZ20032805 A3 CZ 20032805A3 CZ 20032805 A CZ20032805 A CZ 20032805A CZ 20032805 A CZ20032805 A CZ 20032805A CZ 20032805 A3 CZ20032805 A3 CZ 20032805A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
liposomes
peptides
peptide
motif
group
Prior art date
Application number
CZ20032805A
Other languages
English (en)
Inventor
Medina Oula Penate
Erkki Koivunen
Paavo Kinnunen
Original Assignee
Ctt Cancer Targeting Technologies Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ctt Cancer Targeting Technologies Oy filed Critical Ctt Cancer Targeting Technologies Oy
Publication of CZ20032805A3 publication Critical patent/CZ20032805A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/12—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules
    • A61K51/1217—Dispersions, suspensions, colloids, emulsions, e.g. perfluorinated emulsion, sols
    • A61K51/1234—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/12—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules
    • A61K51/1282—Devices used in vivo and carrying the radioactive therapeutic or diagnostic agent, therapeutic or in vivo diagnostic kits, stents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

POUŽITÍ PEPTIDOVÝCH SLOUČENIN, ZPŮSOB ZLEPŠENÍ SMĚROVÁNÍ A ABSORPCE LIPOZÓMŮ, ZPŮSOB LÉČBY A DIAGNOSTIKY PACIENTŮ, DIAGNOSTICKÁ NEBO ZOBRAZOVACÍ TESTOVACÍ SADA A PŘÍPRAVEK
OBLAST TECHNIKY
Navrhovaný vynález popisuje cílenou protinádorovou terapii a zaměřuje se zejména na použití malých inhibitorů metaloproteáz mezibuněčné hmoty pro zlepšení směrování lipozómů k nádorovým buňkám a zvýšením jejich absorpce léčiv těmito buňkami. Navrhovaný vynález tedy popisuje způsob léčby rakoviny, stejně jako způsob zlepšení směrování lipozómů proti nádorovým buňkám, způsob zlepšení absorpce lipozómů nádorovými buňkami a způsob zvoleného transportu chemoterapeutik do nádorových buněk.
DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY
Metaloproteázy mezibuněčné hmoty (MMP) představují rodinu enzymů schopných degradovat bazální membránu a mezibuněčnou hmotu (extracelulámí matrix - ECM) a tím přispívají k přestavbě tkání a buněčné migraci (Koivunen et al., 1999, Shapiro, 1997). Metaloproteázy mezibuněčné hmoty je možné rozdělit do několika podskupin, z nichž jedna je zastoupena kolagenázou typu IV nebo gelatinázou, MMP-2 a MMP-9. Exprese gelatinázy v normálních buňkách jako jsou trofoblasty, osteoklasty, neutrofily a makrofágy je přísně regulována. Podobně jako jiné metaloproteázy mezibuněčné hmoty je gelatináza sekreto vána v neaktivní formě (proenzym) a pro její aktivaci je nezbytné proteolytické štěpení.
Zvýšená nebo neregulovaná exprese gelatinázy a dalších metaloproteáz mezibuněčné hmoty může přispívat kpatogenezi některých chorob včetně angiogeneze a metastázování nádorů, reumatoidní artritidy, mnohočetné sklerózy a periodontitidy. Látky snižující aktivitu gelatinázy mohou být tedy použity pro léčbu rakoviny a některých zánětlivých onemocnění (Sorsa et al., 1994, Lauhio et al., 1991). Ačkoliv byla popsána celá řada inhibitorů metaloproteáz mezibuněčné hmoty, žádný z nich nebyl dosud specifický pro gelatinázu (Lauhio et al., 1991). Proto jsme podrobně testovali náhodné fágové peptidové knihovny s cílem najít specifický inhibitor této podskupiny metaloproteáz mezibuněčné hmoty. Peptid s nejvyšší aktivitou, označený jsko CTT, specificky inhibuje aktivitu MMP-2 a MMP-9 z rodiny metaloproteáz mezibuněčné hmoty kterou studujeme (Koivunen et al., 1999). CTT rovněž inhibuje migraci endoteiiálních a • · · · nádorových buněk in vitro, stejně jako růst nádorů in vivo na myších nádorových modelech, což je přímý důkaz důležitosti gelatináz pro nádorovou invazivitu.
Experimenty na myších nesoucích nádorový xenotransplantát ukazují, že po intravenózní aplikaci do nemocné myši jsou fágy exprimující CTT akumulovány v nádorové vaskulatuře. Směrování fágů do místa nádoru bylo potlačeno současnou aplikací peptidu CTT (Koivunen et al., 1999). Tyto závěry ukazují, že CTT, kromě toho že se jedná o účinné protinádorové agens, které samo o sobě blokuje migraci nádorových buněk a angiogenezi v nádoru, je rovněž použitelné pro směrování chemoterapeutik do nádoru.
Při klasické chemoterapii pouze část léčiva zasáhne nádorové buňky, zatímco zbylé léčivo poškodí normální zdravou tkáň. Nežádoucí vedlejší účinky mohou být sníženy enkapsulaci protinádorových léčiv do lipozómů (Lasic et al., 1995). Byly již popsány zlepšené lipozomální komplexy se zvýšenou stabilitou a s prodlouženou dobou setrvání v krevním oběhu (Tardi et al., 1996). Byly již publikovány jak in vitro tak in vivo studie vývoje lipozomálního směrování proti nádorovým buňkám (Northfeld et al., 1996, Adlakha-Hutcheon et al., 1999). Zvýšené selektivity může být dosaženo navázáním specifických protilátek rozeznávajících antigeny plazmatické membrány nádorových buněk, což vede ke zvýšení absorpce lipozómů cílovými buňkami (Storm and Crommelin, 1998). Jelikož MMP-2 (Toth et al., 1997) a MMP-9 (Brooks et al., 1996) jsou vázány specifickými povrchovými receptory, představují tyto enzymy možnost směrování lipozómů na invazivní buňky, jako jsou nádorové buňky a angiogenní endotheliální buňky.
Navíc, fosfolipidy konjugované s monomethoxy polyethylen glykolem (PEG) jsou v široké míře používány od roku 1984, kdy Sears navázal přes amidovou spojku karboxy-PEG a přečištěný sojový fosfatidyl ethanolamin (PE) (Sears, 1984). Připojení PEGu na povrch lipozómů vytvoří ve vodě ochrannou vrstvu. Tato ochranná vrstva zabrání navázání celé řady plazmatických proteinů (opsoninů) na povrch lipozómů takže lipozómy nejsou rozeznávány a pozřeny buňkami retikuloendotheliálního systému.
PODSTATA VYNÁLEZU
Navržený vynález je založen na zjištění, že některé inhibiční peptidy metaloproteáz mezibuněčné hmoty jsou schopny zajistit směrování lipozómů k nádorovým buňkám a zvýšit míru jejich absorpce těmito buňkami.
Dále navrhovaný vynález popisuje použití peptidů s cyklickým motivem C(X)yHWGFXXC (sekvence č. 1 nebo 3) nebo peptidové složky s lineárním motivem S(X)yHWGFXXS (sekvence č. 4 nebo 5), kde X je jakýkoliv aminokyselinový zbytek a y je celé číslo 2 nebo 3, pro zlepšení
9999 • ·· ···· ·· « • · ······ · · · *······ ·· ··· ··· «· ·· ·· směrování lipozómů k nádorovým buňkám a nebo zvýšení míry jejich absorpce nádorovými buňkami.
Dalším předmětem navrhovaného vynálezu je odpovídající technika , tzn. technika zlepšování směrování lipozómů k nádorovým buňkám pacientů a způsob zvýšení absorpce lipozómů nádorovými buňkami, přičemž alespoň jeden peptid obsahující cyklický motiv C(X)yHWGF XXC nebo peptidovou složku s lineárním motivem S(X)yHWGFXXS, kde X je jakýkoliv aminokyselinový zbytek a y je celé číslo 2 nebo 3, je smíchán s lipozómy a získaná směs je podána pacientům.
Dalším předmětem navrhovaného vynálezu je způsob specifického lipozomálního směrování chemoterapeutik do nádorových buněk pacientů, kdy alespoň jeden peptid obsahující cyklický motiv C(X)yHWGFXXC nebo peptidovou složku s lineárním motivem S(X)yHWGFXXS, kde X je jakýkoliv aminokyselinový zbytek a y je celé číslo 2 nebo 3, je smíchán s lipozómy nesoucími alespoň jedno chemoterapeutické agens a získaná směs je podána pacientům.
Navrhovaný vynález tedy popisuje způsob léčby rakoviny u pacientů pomocí lipozómů nesoucích alespoň jedno chemoterapeutické agens, smícháním lipozómů s alespoň jedním peptidem patřícím do skupiny zahrnující peptidy s cyklickým motivem C(X)yHWGFXXC nebo peptidové složky s lineárním motivem S(X)yHWGFXXS, kde X je jakýkoliv aminokyselinový zbytek a y je celé číslo 2 nebo 3 a získaná směs je podána pacientům.
V nej vhodnějších variantách navrhovaného vynálezu jak je definován výše, probíhá příprava tak aby bylo možné na povrch lipozómů navázat polyethylen glykol (PEG), a to nejlépe na jeho povrch, před tím než je přidána do směsi peptidová složka.
Další vhodnou variantou navrhovaného vynálezu je diagnostická technika , kdy peptid, který je zde popisován jako směrovací struktura je použit pro označení předpokládaného nádoru. Na peptid C(X)yHWGFXXC je možné připojit radioaktivní nebo magnetickou značku, kterou je rovněž možné navázat dovnitř lipozómů nebo na jeho povrch a to v případě, že tento lipozóm je směrován do místa růstu nádoru pomocí C(X)yHWGFXXC peptidů. Diagnóza nádoru je pak prováděna pomocí i.v. injekce značeného peptidů nebo lipozómů obsahujícího peptid a stanovena pomocí gama zobrazení nebo autoradiografie.
Dalším předmětem navrhovaného vynálezu je diagnostický nebo zobrazovací prostředek obsahující lipozómy a alespoň peptid obsahující cyklický motiv C(X)yHWGFXXC nebo peptidovou složku s lineárním motivem S(X)yHWGFXXS, kde X je jakýkoliv aminokyselinový zbytek a y je celé číslo 2 nebo 3 a detekovatelnou značku.
Vhodná detekovatelná značka pro účely navrhovaného vynálezu je radioaktivní značka, magnetická kulička nebo fluorescenční značka.
Navrhovaný vynález je dále popsán detailněji pomocí připojených kreseb.
PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH
Obr. IA. Inhibice aktivity MMP-2 pomocí CTT, CLP, STT a CWL peptidů při koncentraci 85 μΜ stanovená pomocí zymografie kaseinu. Výsledek je zobrazen jako procentuální podíl štěpené plochy, kdy neinhibovaný MMP-2 je bráno jako 100 %. Chybové značky představují standartní odchylku ze tří nezávislých experimentů.
Obr. IB. Inhibice aktivity MMP-9 pomocí volného CTT (o) a CTT navázaného na lipozóm (?) měřená pomocí fluorogenního substrátu jak je popsáno v materiálu a technikách. Celková koncentrace fosfolipidu byla 200 μΜ POPC/POPE (80/20 mol/mol). Datové body představují průměr hodnot tří experimentů se značkou představující směrodatnou odchylku.
Obr. 2. Průnik CTT (?), CLP ([) a STT (A) do vaječného PC monovrstvy, prokazatelný jako nárůst povrchového napětí (?ir) po přidání uvedeného peptidů do vodné fáze. Data jsou uvedena jako funkce počátečního povrchového napětí (7r0).
Obr. 3A. Anisotropa (r) pro Trp zbytek CTT jako funkce POPC/POPE (80/20 mol/mol) koncentrace. Datové body představují průměr hodnot pěti experimentů se značkou představující směrodatnou odchylku. Pro zlepšení poměru signál - šum byl signál průměrován v průběhu 15 sekund. Koncentrace CTT byla 5 μΜ v PBS a teplota byla 37 °C.
Obr 3B. Intenzita emise Trp pro volný peptid CTT (o) a CTT navázaný na lipozóm (?) byla měřena pomocí Γ jako ve vodě rozpustného kolizního zhášedla. Datové body představují průměr hodnot dvou nezávislých experimentů.
Obr 4A až 4F. Obrázky z fluorescenčního mikroskopu zobrazující vstup rhodaminu B do buněk U937, CHO a HT1080 inkubovaných s PC/PE (80/20 mol/mol) lipozómy s enkapsulovanou fluorescenční značkou a směrovacím peptidem CTT, jak bylo popsáno výše. Panely A a B ukazují buňky U937, které byly inkubovány s lipozómy s a bez CTT. Panely C a D ukazují stejný • · · · · · · ······· ·· ··· ··· ·· ·· «· experiment sHT1080 buňkami a panely E a F ukazují CHO buňky (doba inkubace byla prodloužena desetkrát).
Obr. 5A. Účinek popsaných peptidů na absorpci lipozómů obsahujících rhodamin B (PC/PE 80/20 mol/mol) buňkami U937. Koncentrace celkových lipidů, rhodaminu B a peptidů byla 200 μΜ, 2 μΜ a 100 μΜ. Data byla normalizována porovnáním fluorescence rhodaminu v buňkách inkubovaných s lipozómem s přidaným peptidem (I) vzhledem k fluorescenci buněk inkubováných s lipozómy bez peptidů (lo = kontrola). Chybové čárky označují směrodatnou odchylku, (n = 3)
Obr 5B. K lipozómům obsahujícím rozpustnou fluorescenční sondu rhodamin B byl přidán peptid CTT. Absorpce tohoto fluorochromu HT1080 buňkami byl stanoven po 30 minutách inkubace s lipozómy při 37 °C a 4 °C. Datové body představují průměr a +/- směrodatnou odchylku z trojice měření.
Obr. 6. Účinek uvedených protilátek na absorpci lipozómů obsahujících rhodamin B (PC/PE 80/20 mol/mol) buňkami H1080. Výsledky jsou uvedeny jako procenta, kde fluorescence rhodaminu v buňkách inkubovaných s lipozómy a CTT peptidem v médiu bez protilátek byla brána jako 100 %. Byly použity protilátky anti-MMP-2, anti-MMP-9 a protilátky proti cytoplazmatické doméně integrinu /33, která byla použita jako kontrolní protilátka. Konečná koncentrace uvedeného peptidů, rhodamin B, protilátek a lipozómů (uvedená jako celkový fosfolipid) byla 85 μΜ, 0,2 mM, 20 μg/ml a 0,4 μΜ. Chybové značky označují směrodatnou odchylku ze čtyř nezávislých experimentů.
Obr. 7. Účinek uvedených inhibitorů gelatinázy na absorpci lipozómů obsahujících rhodamin B (PC/PE 80/20 mol/mol) buňkami H1080. Výsledky jsou uvedeny jako procenta, kde fluorescence rhodaminu v buňkách inkubovaných s lipozómy a CTT peptidem v médiu bez protilátek byla brána jako 100 %. Byly použity inhibitory TIMP-2 (10 μg/kg). Marimasat (50 μΜ) je syntetická látka inhibující rodinu MMP, EDTA je chelatační činidlo pro Zn2+ (500 μΜ) a aprotinin (1 μg/ml) je inhibitor šeřinových proteáz. Konečná koncentrace uvedeného peptidů, rhodaminu a lipozómů (uvedená jako celkový fosfolipid) byla 85 μΜ, 0,2 mM, a 0,4 μΜ. Chybové značky označují směrodatnou odchylku ze čtyř nezávislých experimentů.
• · · · · « 9
9 9 9 9 9 »····· · • · · · · · · • 9 9 9 · 9 9 9 9 9
Obr. 8. Srovnání účinku CTT, CLP, STT a CWL na zabíjení U937 buněk vyvolané lipozómy obsahujícími adriamycin a stanovené pomocí EthD-1 fluorescence. Buňky byly inkubovány s adriamycinem (200 ng/ml) uzavřeným v lipozómech (200 μΜ celkový fosfolipid, PC/PE 80/20 mol/mol) a s uvedenými peptidy. Konečná koncentrace uvedeného peptidu, adriamycinu, protilátek a lipozómů (uvedená jako celkový fosfolipid) byla 85 μΜ, 0,2 mM, 20 μβ/ηιΐ a 0,4 μΜ. Výsledky jsou uvedeny jako RFI/RFIo, kde RFIo je hodnota získaná z buněk inkubovaných s lipozómy obsahujícími adriamycin bez přítomnosti peptidu. Koncentrace peptidu byla 85 μΜ. Chybové značky představují směrodatnou odchylku (n = 3).
Obr. 9. Absorpce komplexu CTT-lipozóm je v krátkých inkubačních časech úměrné přidanému množství forbol esteru, který jak známo stimuluje expresi gelatinázy a tak je zvyšováno množství gelatinázy na povrchu buněk. Pokud se indukční doba prodlužuje je gelatináza detekovatelné rovněž v médiu. Jak se množství volné gelatinázy v médiu zvyšuje, absorpce lipozómů je snížena.
Obr. 10. Směrování cytochromu C do buněk HT1080 pomocí komplexu lipozóm-PEG-CTT. Buněčná životaschopnost je testována pomocí MTT techniky a výsledky jsou udávány jako relativní fluorescenční intenzita při 590 nm. „Bez přídavku“ znamená buněčnou životaschopnost bez toxického agens. „Agens bez lipozómů“ je situace, kdy cytochrom C je přidán k buňkám bez lipozómů. „Nesměřované agens s lipozómy“ představuje pegylované lipozómy bez CTT a „CTTagens-lipozóm“ představuje pegylované lipozómy kde CTT je navázáno na vzdálený konec PEG.
Obr 11A až 11C. Směrování Tc99m-značeného CTT a/nebo lipozómů k nádorovým buňkám u modelu nahých myší pomocí modelového nádoru KS. (A) lipozómy s CTT, (B) značené CTT samo o sobě, (C) I-125-značené lipozómy.
Zkratky:
CLP CLPGHWGFPSC (sekvence č. 7)
CTT CTTHWGFTLC (sekvence č. 6)
CWL CWLTFTHGTC (sekvence č. 9)
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DMSO dimethylsulfoxid
DPPE dipalmitoylfosfatidylethanolamin
• * • · · ·
DPPRho l,2-dihexadekanoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamino-trikarbamoyl-N-6- tetramethylrhodamin
ECM extracelulámí matrix - mezibuněčná hmota
EGF epidermální růstový faktor
eggPC fosfatidylcholin z vaječného žloutku
LUV velké jednolamelámí váčky
MLV mnoholamelámí váčky
MMP metaloproteázy mezibuněčné hmoty
NBD-PE 1 -acyl-2-((7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino)dodekanoyl-1 -sn-glycero-3- fosfoethanolamin
NHS N-hydroxysulfosukcinimid
PA kyselina fosfatidylová
PC fosfatydylcholin
PE fosfatydylethanolamin
PEG polyethylenglykol
POPC l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholin
POPE l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholin
RFI relativní intenzita fluorescence
SDS dodecylsulfát sodný
STT STTHWGFTLS (SEKVENCE Č. 8)
TIMP-2 tkáňový inhibitor metalopeoteináz 2
PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU
PŘÍKLAD 1. Peptidy inhibující gelatinázu
Pro tuto studii byly vybrány tri peptidy (tabulka 1). CTT je již dříve popásaný cyklický inhibitor kolagenázy, který, jak bylo prokázáno je směrován do nádorů (Koivunen et al., 1999). STT je odpovídající lineární sekvence CTT kde pouze koncové cysteiny jsou nahrazeny šeřiny. Třetí peptid CLP je homolog CTT, který byl nalezen díky sekvenční homologii v databázi SWISSPROT a EMBL pomocí programu Blast 1.4.11. Jelikoó náš největší zájem se soustředil na konzervativní sekvenci CTT, byla dotazovanou sekvencí sekvence CXXHWGFTXC (sekvence č. 2) (Koivunen et al., 1999). Počítačové vyhledávání označilo devět homologů a mezi nimi byla i sekvence CLP, která je částí domény EGF-7 v /3-1 řetězci lidského lamininu (LMB1). Tři další
sekvence byly homology laminů jiných živočišných druhů, jeden byl z těžkého řetězce imunoglobulinu a čtyři byly na thiazid citlivé kotransportéry sodík-chlor z člověka a jiných živočišných druhů. Neboť tato poslední skupina měla nižší podobnost k CTT, zaměřili jsme se na CLP, CTT podobnou sekvenci z EGF-7 domény lidského lamininu. Je zřejmé, že všechny tři peptidy (CTT, CLP a STT) inhibují aktivitu MMP-2 jak bylo prokázáno pomocí kaseinové zymografie (Obr. 1). Míra inhibice byla asi 70 % pro 85 μΜ CTT. Také CLP je účinným inhibitorem MMP-2 dosahující 50 % inhibice při 85 μΜ peptidů. Lineární analog CTT - STT (85 μΜ) snížil aktivitu MMP-2 přibližně o 30 %. Podobných výsledků bylo dosaženo i v případě MMP-9.
Volné CTT a CTT v komplexu s lipozómy inhibovalo MMP-9 také v případě, že byla gelatinázová aktivita sledována pomocí štěpení fluorogenního peptidů jako substrátu (obr. 1B) což podporuje výsledky kaseinové zymografie. Hodnoty IC50 pro CTT a CTT-lipozóm byla 8 μΜ v obou technikách. Tyto výsledku rovněž demonstrují interakci MMP-9 s epitopem peptidů CTT i v případě že je navázán na lipidickou membránu aje stále schopen vázat se na enzym. Kompletní inhibice MMP-9 (5 nM)v této technice bylo dosaženo pomocí 100 μΜ EDTA která vychytala ionty Zn2+ nezbytné pro katalýzu.
PŘÍKLAD 2. Interakce s jednoduchou vrstvou fosfolipidů
Aminokyselinové složení CTT naznačuje že tento peptid bude hydrofobní. Proto je zajímavé sledovat zda se CTT váže na lipidy. Pro srovnání jsme rovněž sledovali CLP a STT. Pro tento účel jsme použili jednoduchou vrstvu fosfolipidů umístěnou na rozhraní pufr/vzduch, jako model biomembrány, který je široce používán pro studii interakcí lipid-protein a účinku proteinů na laterální organizaci lipidové vrstvy (Sóderlund et al., 1999).
Penetrace peptidů injikovaného pod lipidovou membránu zvyšuje povrchové napětí π zatímco peptidy, které se membrány neinkorporují nezpůspbí v povrchovém napětí žádné změny. Původní povrchové napětí (πο) eggPC mono vrstvy je v rozmezí od 10 do 40 mN/m a byl stanovován přírůstek povrchového napětí (Δπ) vyvolaný přidáním peptidů (konečná koncentrace byla 200 μΜ) do subfáze (obr. 2).Všechny tři peptidy pronikají do membrány a nárůst Δπ vůči π0 je kvantitativně velmi podobný. Při původním napětí přesahujícím 38, 31 a 33 nM/m pro CTT, STT a CLP bylo membránové pronikání těchto peptidů zrušeno.
v r
PŘIKLAD 3. Interakce s lipozómy
Výše popsané experimenty za použití eggPC lipidové membrány potvrdili vazbu CTT, CLP a STT na membránu. To bylo potvrzeno měřením anisotropní emisní fluorescence Trp pro CTT v přítomnosti narůstající koncentrace lipozómů (obr. 3A). Podobně, v nepřítomnosti lipozómů hodnota r byla 0,065, což odráží Brownovskou rotační difúzi peptidu v roztoku. Zvýšení koncentrace lipozómů tedy způsobí progresivní nárůst r až ne 0,349, měřeno při 230 μΜ fosfolipidu. Přibližně poloviční efekt byl pozorován při molámím poměru CTT/lipozómy 5:90. Vlastní fluorescence tryptofanu umožní sledovat změny v mikroprostředí tohoto fluorochromu během asociace peptidu s lipozómy. Hodnota I350/I330 měřená v PBS pro Trp zbytky CTT je 1,4, zatímco přítomnost LUV (0,5 mM celkový fosfolipid) tento poměr zvyšuje na 1,00. Trp tedy přechází v přítomnosti lipozómů přechází do hydrofóbnějšího prostředí během interakcí CTT s lipidovou membránou. Navíc zhasínání Trp pomocí Γ je sníženo v přítomnosti lipozómů, a prokazuje že pouze část Trp v CTT je přístupná tomuto koliznímu zhášeči Γ. Stem-Volmerova konstanta byla 0,0087 a 0,0034 v nepřítomnosti a přítomnosti lipozómů.
Některé peptidy a proteiny vázající se na lipidy mohou zvýšit fůzi lipidových vezikulů. Pro otestování této možnosti, byly smíchány značené a neznačené LUV v přítomnosti či nepřítomnosti peptidů a směs lipidů byla poté měřena jak bylo uvedeno výše. Přesto bylo zjištěno, že ani CTT ani STT a CLP nezpůsobují měřitelné změny v intenzitě fluorescencenční emise NBD-PE po 15 minutách, což prokazuje že nedochází k fůzi ani hemifuzi vezikulů (data nejsou uvedena).
PŘÍKLAD 4. Vliv na absorpci lipozómů buňkami
Výše popsaná data ukazují, že CTT se váže na fosfolipidy ale nevyvolává buněčnou fůzi. Dále bylo zajímavé zjistit možnost, zdaje CTT použitelné pro směrování lipozómů.Nejprve jsme to testovali pomocí uzavření fluorescenční lipidové sondy DPPRho do lipozómů jak je popsáno v postupu. Následně bylo k lipozómům přidáno CTT a ty byly poté přidány k U937 leukemickým buňkám, které zde slouží jako model buněk exprimujících gelatinázu. Po pěti minutách byly buňky promyty a fluorescence na buňkách byla stanovena pomocí čtečky mikrotitračních destiček. CTT zlepšovala asociaci lipozómů s buňkami U937, v případě že byl přítomý CTT peptid byla fluorescence sondy DPPRho až 3,7 krát vyšší.
Dále jsme sledovali schopnost CTT zvýšit absorpci vodorozpustné fluorescenční sondy rhodamin B, uzavřené v lipozómech, buňkami U9370, CHO, NKR52E a HT1080. Stejné lipozómy ale bez CTT byly použity jako kontroly. Pět minut poté co byly lipozómy s CTT přidány k buňkám ,
9999
9 9
9 9 9 9
99 rozpustný rhodamin B byl detekovatelný uvnitř buněk pomocí fluorescenční mikroskopie. CTT zvyšuje absorpci lipozómů nesoucích rhodamin B u buněk U937 a HT1080 ale ne u CHO buněk (obr. 4). Všechny U937 a HT1080 buňky měly patrnou fluorescenci, taje ale distribuována mezi buňkami nerovnoměrně, tzn. některé buňky emitují silněji než jiné. Pro absorpci lipozómů je klíčová exprese MMP-2 a MMP-9. Z toho také vyplívá, že ovariální buňky čínského křečka (CHO) které neexprimují gelatinázu, jak prokázala naše zymo grafická technika, nevykazují absorpci CTT-lipozómů za podmínek kdy zvýšená absorpce byla patrná u HT1080 a U937 buněk.
Absorpce rhodaminu uzavřeného v lipozómů byla kvantifikována pomocí čtečky mikrotitračních destiček. Absoipce rhodaminu uzavřeného v lipozómů buňkami U937 byla zvýšena 3,6 krát pomocí CTT, v porovnání s absorpcí lipozómů postrádajících CTT peptid (obr. 5A). Pouze minimální účinek byl zaznamenán v případě STT a CLP, a signál byl příliš slabý na to aby byl statisticky významný v porovnání s lipozómy neobsahujícími peptid. Cyklický peptid CWL byl pro zvýšení absorpce lipozómů rovněž neúčinný. Podobný účinek CTT na absorpci lipozómů byl evidentní pro lidský HT1080 fibrosarkom a NKR52E krysí ledvinové epitheliím podobné buňky (data nejsou uvedena). CTT neovlivňuje absorpci volného rhodaminu B. Zvýšená absorpce lipozómů pomocí CTT je prokazatelná pouze při 37 °C ale ne už při 4 °C, což ukazuje, že jsou nezbytné aktivní mechanismy receptorem mediované endocytózy (obr. 5B). Účinek TPA na absorpci CTT-lipozómů je dvoj fázový a po krátkém období inkubace (15 minut) je absorpce lipozómů zvýšena, zatímco po delší inkubaci (75 minut) je absorpce lipozómů potlačena. To může být vysvětleno tak, že při nízkých koncentracích je gelatináza navázána na buněčném povrchu, zatímco při vyšších koncentracích je nadbytek gelatinázy odvržen do mezibuněčného prostoru (Toth et al., 1997).
PŘIKLAD 5. Gelatináza jako cíl komplexů CTT-lipozómy
Dále jsme sledovali, zda gelatináza navázaná na povrch buněk je receptorem pro lipozómy obsahující CTT. Buňky byly promyty aby byly odstraněny rozpustné formy gelatinázy a poté preinkubovány 30 minut s inhibitory MMP nebo specifickými protilátkami před tím, než byly přidány lipozómy. Tyto experimenty ukazují, že intemalizace lipozómů obsahujících CTT buňkami HT1080 je možné poměrně dobře zabránit protilátkami proti MMP-9. Konkrétně, dvě protilátky proti MMP-9, pokud jsou použity současně zcela zablokují intemalizaci fluorescenčního barviva uzavřeného v lipozómech (obr. 6). Inhibice protilátkami proti MMP-2 je ····
póze částečná. Protilátky proti cytoplazmatické části integrinů /31 nemá žádný účinek. Tyto závěry ukazují specifitu blokování absorpce lipozómů protilátkami proti MMP-9 a MMP-2. Studie s panelem inhibitorů proteináz ukázaly, že inhibitory MMP ale ne inhibitory setinových proteáz inhibují absorpci lipozómů. Inibitory MMP TIMP-2 a Marimastad a chelatátor kationtů EDTA mají podobný účinek mají podobný účinek a způsobují přibližně 50 % inhibicí přenosu lipozómů do buněk (obr. 7). Sérové inhibitory trypsinu nebo aprotinin nemají žádný pozorovatelný účinek na buňky kultivované v 10 % fetálním telecím séru co se týče inhibice absorpce lipozómů.
Adriamycin, běžně používané protinádorové léčivo, bylo uzavřeno do lipozómů s vysokou účinností (Gokhale et al., 1996). Účinnost CTT pro zvýšení absorpce lipozómů a pro směrování terapeutického agens k nádorovým buňkám bylo studováno na kultuře buněk U937CTT bylo přidáno k roztoku lipozómů o koncentraci 200/xM, což odpovídá molámímu poměru přibližně 1:2 CTT/fosfolipidy. Tento roztok byl přidán k buňkám U937 tak aby byla konečná koncentrace CTT a adriamycinu 85 μΜ a 0,4 μΜ. Až do koncentrací použitých v této studii nebyly syntetické peptidy a lipozómy toxické pro použité buněčné linie (údaje nejsou uvedeny). Lipozómy bez přídavku CTT byly použity jako kontroly a zabíjení buněk bylo stanoveno pomocí EthD-1 techniky. Po 24 hodinách byl pozorován 4,1 násobek v zabíjení buněk (p<0,001) po přidání komplexu CTT-lipozómy v porovnání s lipozómy bez CTT (obr. 8) Také další peptidy STT a CLP , ale ne CWL peptid, zvyšují zabíjení buněk lipozómy obsahujícími adriamycin nicméně ne na stejné úrovni jako v případě CTT. Podobně STT a CLP zvyšují množství mrtvých buněk 1,7 a 1,3 krát (p<0,01).
PŘÍKLAD 6. PEG-lipozómy
Rovněž jsme připravili komplexy PEG-lipozómy, kde deriváty PEG-lipid jsou připojené na karboxy konec peptidu CTTHWGFTLC pomocí l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid hydrochloridu (Grabarek and Gergely, 1990). DPPE, který má karbamátovou vazbu sPEG (2000), má amino skupinu na jednom konci. Použití derivátů PEG-lipid prodlužuje in vivo cirkulaci lipozómů. Rovněž upevňuje peptidy na povrchu lipozómů , zabraňuje asociaci lipozómů z lipozómů během cirkulace v krvi. Může být použit pro směrování proti nádorovým buňkám, nádorovým cévám, lézím rheumatoidní arthritidy a jiným chorobám tkání, kde dochází ke zvýšené expresi gelatinázy. Molární hmotnost většiny běžně používaných polymerů PEG je 2000 a 5000, jsou používány i polymery PEG v rozmezí 600 až 12 000. Lipidová část konjugátů může být v rozmezí nenasycených nebo nasycených PE až k cholesterolu a ceramidům s krátkým
• 4 4 ·· 44 4 4
4 4 4 4 4 · 4 4 4 4 • 444444 4
4 4 4 4 4 4 • 444 44 4444 řetězcem (C8), s vloženým řetězcem (Cl4) a dlouhým řetězcem (C20) mastné kyseliny. Na lipidové straně je možné použít neomezené množství lipidových kotev od PE k PA, kardiolipinu, cholesterolu nebo ceramidům. Jako funkční skupina je zde použita aminová skupina, nicméně je rovněž možno použít jakékoliv jiné reaktivní skupiny, které vážou peptidy nebo modifikované peptidy na deriváty EG, jako jsou biotin, maleimid nebo karboxy-NHS-ester.
Komplex CTT-lipozómy jsou absorpovány buňkami v závislosti na přidání forbolesteru o kterém je známo, že stimuluje expresi gelatinázy (obr. 9). To ukazuje, že míra exprese gelatinázy přímo ovlivňuje absorpci komplexu CTT-lipozóm buňkami. V našich studiích jsme používali ovariální buňky čínských křečků, které za normálních podmínek neexprimují detekovatelná množství gelatináz, jak prokázala technika zymografie gelatiny. V našich výsledcích není prokazatelné směrování lipozómů v případě CHO buněk. To ukazuje, že absorpce komplexů CTT-lipozómy je závislá na buněčném typu koreluje s mírou exprese gelatinázy na příslušných buňkách.
Experimenty se směrováním lipozómů, které nesou na svém povrchu peptid CTT, a uvnitř lipozómů se nachází uzavřený rhodamin prokazují, že směrování lipozómů je úspěšné při 37 °C ale ne při 4 °C. To prokazuje, že aktivní mechanismus jako receptorem mediovaná endocytózaje pro absorpci lipozómů nezbytná.
Absorpce komplexů CTT-lipozómy po přidání forbolesteru v krátkých indukčních časech, o kterém je známé, že zvyšuje expresi gelatinázy na povrchu buněk. Pokud e indukční čas prodloužen, gelatináza se objeví i v médiu. Množství volné gelatinázy v médiu se zvyšuje a potlačuje pak absorpci lipozómů (obr. 10).
Byly rovněž provedeny in vivo experimenty se směrováním lipozómů. Obr 11A ukazuje gama zobrazení nahých myší léčených komplexy CTT-lipozóm označenými radiovou značkou. CTT bylo označeno Techneciem-99m, které je chelatováno mezi dvěma cysteinovými zbytky. Gama zobrazení bylo provedeno 30 minut po injekci do ocasní cévy. V místě nádoru (implantovaný KS 1767 Kaposiho sarkom) je označeno šipkou. Obr. 11B ukazuje gama zobrazení pomocí CTTpeptidu bez lipozómů a obr. 11C ukazuje použití lipozómů bez CTT peptidu značených radioaktivním jódem I125 na BSA, které bylo uzavřeno uvnitř lipozómů.
PŘÍKLAD 7. Materiál
Fosfatidylcholin z vaječného žloutku (eggPC), l-palmitoyl-2-sn-glycero-3-fosfoethanolamin (POPE), adriamycin (doxorubicin), rhodamin B a 0,01 M fosfátový pufr s 2,7 mM KC1 a 0,137 M NaCl, pH 7,4 při 25 °C (PBS) byly zakoupeny od firmy Sigma a l-acyl-2-((7-nitro-2-l,3benzoxadiazol-4-yl)amino)-dodecanoyl-l-sn-glycero-3-fosfoethanolamin (NBD-PE) a 113
palmytoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (POPC) od firmy Avanti (Birmingham, AL). Od firmy Moiecular Probes (Leithen, Holandsko) pocházejí fluorescenční lipid 1,2-dihexadekanoylsn-glycero-3-fosfoethanolamino-thiokarbamoyl-N-6-tetramethylrhodamin (DPPRho) a fluorescenční sondy fenanthridin, 5,5'-[l,2-ethanediylbis(imino-3,l-propanediyl)]bis(3,8diamino-6-fenyl)-dichlorid, dihydrochlorid (EthD-1). MMP-2 byla zakoupena od Boehringer Mannheim GmbH (Něměcko). Kultivační média DMEM a RPMI 1640 s Glutamax-1 pocházeli od Gibci Life Technologies (Paisley, Scotland). Roztok fosfolipidů byl připraven v chloroformu. Čistota lipidů byla kontrolována chromatografií v tenké vrstvě na destičkách potažených křemičitou kyselinou (Merck Darmstadt, Německo) ve směsi chloroform/methanol/voda (65:25:4) jako v rozpouštědle. Po kontrole vzorků po označení jódem, nebo popřípadě, po fluorescenčním ověření nevykázalo žádné nečistoty. Koncentrace nefluorescenčních fosfolipidů byla stanovena gravimetricky pomocí vysoce přesné elektrováhy (Cahn Instruments, lne., Cerritos, CA, USA) a jejich fluorescenčních analogů spektrofotometricky pomocí molámího extinkčního koeficientu e = 93 000 při 540 nm pro DPPRho a e = 21 000 při 463 nm pro NBDPE s methanolem jak rozpouštědlem. Protilátky proti MMP-9 a MMP-2 byly laskavý dar od Dr. Timo Sorsa (Department of Medical Chemistry and Periodontology, University Of Helsinki, Finland). Marisamat byl získán od British Biotech. TIMP-2 a fluorogenní substrát pro MMP-2, MCA-Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa—Ala-Arg od Calbiochem (La Jolla, CA, USA).
PŘIKLAD 8. Vyhledávání sekvenční homologie
Homology CTT (CTTHWGFTLC) (sekvence č. 6) byly vyhledávány pomocí programu BLAST 1.4.11 MP pomocí strategie (matrix identity, velikost slova jedna a předpokladatelné hodnoty 1000) doporučené pro malé peptidy návodem National Centre of Bioinformation. Dáši parametry byly udržovány na jejich předvolených hodnotách. Námi dotazovaná sekvence byla CXXHWGFTXC (sekvence č. 2). Bylo nalezeno 9 analogů, mezi nimi část EGF-7 domény prekurzoru řetězce lidského lamininu /3-1 CLPGHWGFPSC (označeno jako CLP, sekvence č. 7). Byly rovněž vyhledávány homology CLP a porovnány pomocí SWISS-PROT SIM programu.
PŘÍKLAD 9. Syntetické peptidy
Peptidy byly syntetizovány na automatickém syntetizátoru Applied Biosystems 433 A (Foster City, CA, USA) pomocí Fmoc-chemie. Disulfidové můstky byly vytvořeny v 5 % kyselině octové (pH 6,0) s obsahem 20 % dimethylsulfoxidu (DMSO) po inkubaci přes noc při pokojové teplotě za stálého míchání (Domingo et al., 1995). Po naředění 1:2 v 0,1 % kyselině • 0 0 · · · trifluorooctové byly peptidy přeneseny na HPLC kolonu s peptidovou reverzní fází a vymyty gradientem acetonitrilu. Identita peptidů byla ověřena hmotnostní spektrometrií. Peptidy použité v této studii, včetně jejich aminokyselinových sekvencí a příslušných zkratek, jsou uvedeny v tabulce 1.
• 0 · • 0 · • · · • 0 0 ·
00
Tabulka 1.
Aminokyselinové sekvence CTT, CLP, STT a CWL s konzervativními sekvencemi jsou zvýrazněna. Molární váhaje v závorce.
CTT: Cys-Thr-Thr-His-Trp-Gly-Phe-Thr-Leu-Cys (1168) (sekvence č. 6)
CLP: Cys-Leu-Pro-Gly-His-Trp-Gly-Phe-Pro-Ser-Cys (1203) (sekvence ě. 7) STT: Ser-Thr-Thr-His-Trp-Gly-Phe-Thr-Leu-Cys
CWL: Cys-Trp-Leu-Thr-Phe-Thr-His-Gly-Thr-Cys (1136) (sekvence č. 8) (1168) (sekvence č. 9)
PŘÍKLAD 10. Stanovení aktivity gelatinázy
Inhibice MMP-9 a MMP-2 různými syntetickými peptidy bylo stanoveno pomocí zymografie kaseinu (Halinen et al., 1996). MMP-9 byla přečištěna jak bylo popsáno dříve (Sorsa et al., 1997). Následně bylo MMP-2 (2,5 Mg) nebo MMP-9 (2,5 μg) děleno na 10 % SDS-PAGE obsahující 2 mg/ml kaseinu. Gel byl nejprve promyt v pufru obsahujícím Triton X-100 tak aby byl odstraněn SDS a poté byl rozřezán na 5 pruhů, které byly ponořeny do roztoků (85 μΜ) obsahujících peptidy (CTT, CLP, CWL nebo STT). Po inkubaci po dobu 48 při 37 °C byly gely barveny pomocí Coomassie Blue, skenovány a rozštěpené oblasti byly kvantifikovány pomocí obrazové analýzy (Global Lab Image 3.2, Data Translation lne. a Acuity Imaging lne., Marlboro, MA, USA).
Aktivita MMP-9 byla měřena také pomocí fluorogenního peptidového substrátu MCA-Pro-LeuAla-Nva-Dpa-Ala-Arg (Calbiochem, San Diego, CA, USA). Konkrétně 50 ng MMP-9 bylo inkubováno v PBS po dobu 30 minut při pokojové teplotě v nepřítomnosti nebo přítomnosti CTT nebo jeho komplexu s lipozómy. Následně byl přidán fluorogenní substrát v konečné koncentraci 0,1 mM a inkubace probíhala dalších 15 minut při 37 °C a intenzity fluorescence byly stanoveny při excitaci 340 nm a emisi 390 nm na čtečce mikrotitračních destiček.
φ· φφφφ
ΦΦ φ φφφ φφφ • φφφφφφ φ φφφ φφφφ φφφ φφ φφ φφ v r t
PŘIKLAD 11. Interakce peptidů s lipidovou vrstvou
Prostup peptidů do monomolekulámí vrstvy lipidů byl stanovován pomocí magneticky míchaných kruhových jamek (objem subfáze byl 400 μϊ). Povrchové napětí (π) bylo monitorováno pomocí Wilhelmova vodiče, který byl připojen k měřícímu zařízení (μ TroughS, Kibron Inc., Helsinki, Finsko) připojenému k počítači Pentium. Lipidy byly rozptýleny na rozhraní vzduch-pufr (PBS, pH 7) v chloroformu (přibližně 1 mg/ml) za různých počátečních povrchových napětí (πο) a po dobu 15 minut byly ponechány aby se stav ustálil před tím než byly do subfáze přidány uvedené peptidy (4μ1, 10 mg/ml vFLO a CWL v DMSO). Nárůst π od počátečního povrchového napětí (tto) po přidání peptidů byl kompletní přibližně za 20 minut a rozdíl mezi ttq a hodnotou pozorovanou po navázání peptidu na lipidovou vrstvu byl označen jako Δπ. Všechna měření proběhla za pokojové teploty (~ +24 °C). Hodnoty jsou uvedeny jako Δπ vzhledem k 7To (Brockman, 1999).
PŘÍKLAD 12. Příprava lipozómů
Zásobní roztok lipidů byl míchán v chloroformu tak aby byl připraven požadovaný roztok. Rozpouštědlo bylo odstraněno pod jemným proudem dusíku a zbytek lipidů byl následně udržován za sníženého tlaku alespoň 2 hodiny. Multilamelámí lipozómy byly připraveny hydratováním suchých lipidů při pokojové teplotě v 1 ml PBS obsahujícího rhodamin B (10 μΜ) nebo adriamycin (1,8 μΜ) tak aby byly tyto látky uzavřeny v lipozómech a tak aby byla koncentrace lipidu 1 mM. Multilamelámí lipozómy byly zamraženy-roztaveny pětkrát tak aby se zvýšila míra uzvření požadovaných látek v lipozómech (Clifford et al., 1990). Velké jednovrstevné váčky (LUV) byly získány protlačením suspenze MLV 19-krát přes polykarbonátovou membránu s velikostí otvorů 100 nm (Nucleapore, Pleasanton, CA, USA) pomocí LiposoFast pneumatického tlakovače plynů napojeného na maloobjemový homogenizátor (Avestin, Ottawa, Canada). Tlak použitý pro protlačení váčků skrz filtr byla 25 psi (~ 170 kPa). Jak bylo uvedeno, peptidy (2 mg/1 v PBS, kromě CWL v DMSO) byly míchány s LUV tak aby bylo dosaženo celkové koncentrace lipidů a peptidů 1 mM a 0,5 mg/ml.
PŘÍKLAD 13. Příprava PEG-lipozómů
DPPE s karbamátovou vazbou na PEG (2000) má aminovou skupinu na jednom konci. Derivát PEG-lipid je napojen na karboxy konec CTTHWGFTLC peptidu prostřednictvím l-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl) karbodiimidhydrochlorid (Grabarek and Gergely, 1990). Komplex CTT·· »*··
PEG-PE je přečištěn gelovou filtrací. Roztok 4 % komplexu CTT-PEG-PE je přidán k 16 %
POPE a 80 % POPC (mol/mol) a připraven stejně jako bylo výše popsáno pro lipozómy.
PŘÍKLAD 14, Fluorescenční spektroskopie
Prostředí tryptofanových zbytků CTT, STT, CLP a CWL v lipozómech bylo studováno fluorescenční spektroskopií. Střed fluorescenčního maxima Trp je ~ 350 nm ve vodě, zatímco v hydrofóbním prostředí je střed maxima okolo 330 nm. Z toho vyplývá, že změny prostředí ve kterém se Trp nachází může být monitorováno stanovením I350/I330 - poměrem hodnot emise na 350 nm k hodnotě 330 nm (Lakowicz, 1999). Fluorescence tryptofanu byla stanovována na spektrofluorometru Perkin Elmer LS 50 B vybaveném magneticky míchaným a termostatovaným oddílem pro kyvetu. Všechna měření probíhala při 37 °C v pufru obsahujícím 5 mM Hepes, 0,1 mM EDTA, pH 7,4. Excitační a emisní rozsahy byly 10 nm a 10 nm. Excitační vlnová délka byla 295 nm a emisní spektra byla zaznamenávána v rozmezí od 300 do 400 nm. Emisní spektra Trp z peptidů CTT, STT, CLP a CWL byla zaznamenávána jak v přítomnosti tak v absenci POPC/POPE (80/20 mol/mol) LUV a konečná koncentrace lipidu byla 10 μΜ a 100 μΜ jak bylo uvedeno.
Fluorescenční polarizace zbytků Trp v CTT jako funkce narůstající koncentrace lipozómů byla měřena pomocí rotačních polarizátorů s excitačním a emisním paprskem v rozmezí 10 nm. Výsledky jsou vyjádřeny jako emisní anizotropie (Lakowicz, 1999) vypočtena následovně:
r = (In - II) / (In + II)
V této rovnici II a In představuje emisní intenzitu kolmou a paralelní k excitačnímu polarizéru.
Z ýšení vystavení Trp vodné fázi bylo studováno pomocí Γ jako kolizního zhášeče (Lakowicz, 1999). Zvýšení zhášení bylo vypočteno pomocí rovnice:
F0/F=l+k[Q] = l+kqTO[Q]
Kde Fo a F jsou intenzity fluorescence Trp při 345 nm v nepřítomnosti nebo přítomnosti zhášedla, Q a To představují životnost fluorescence v absenci zhášedla, k je Stem-Volmerova konstanta (získaná z hodnot lineárního vynesení dat). Fluorescence Trp v CTT (5 μΜ) a její zhášení bylo měřeno v přítomnosti nebo nepřítomnosti POPC/POPE (80:20 mol/mol) LUV (konečná koncentrace lipidů byla 0,5 mM) Výsledky byly korigovány vzhledem k pozadí způsobenému PBS a lipozómy.
ΦΦΦΦ · « Φ· φφ φφφφ • φφ φφφφ φφ φ φ · «φφφφφ « ·« «φφφφφ φ «φφ «φφφφφφ φφ φφφ «φφφφ ΦΦ φφ
V ζ
PŘIKLAD 15. Technika mixování lipidů
Schopnost CTT, CLP, STT a CWL peptidů indukovat fůzi lipozómů byla stanovena jako míchání lipidů, jak bylo popsáno výše (Struck et al., 1981). Obecně, NBD-PE (X = 0.01) a DPPRho (X = 0,01) byly uzavřeny do lipozómů (POPC/POPE, 78/20 mol/mol). Díky spektrálnímu přesahu emise NBD-PE (dárce) a absorpce DPPRho (příjemce) je rezonanční energetický přenos mezi těmito dvěma barvivý vysoce účinný. Po smíchání lipozómů obsahujících NBD-PE a DPPRho s neznačenými lipozómy, je fůze pozorována jako nárůst emisní intensity NBD-PE díky naředění sond. Excitace a emise NBD-PE byla 43 nm a 530 nm. Všechny měření fluorescence probíhaly při 37 °C.
PŘIKLAD 16. Technika stanovení absorpce lipozómů buňkami
Pro studium účinku různých peptidů na absorpci lipozómů buňkami , byl rhodaminem značený analog fosfolipidu (DPPRho) uzavřen do lipozómů jako značka tak aby vznikla směs POPC/POPEDPPRho (80:19:1 mol/mol). Uvedené peptidy byly smíchány s LUV a následně přidány do buněčné kultury na mikrotitračních destičkách. Po inkubaci po dobu 5 minut při 38 °C byly lipozómy, které nebyly navázané na buňky odstraněny promytím buněčné suspense třikrát ledovým PBS. Příslušné množství DPPRho navázaného na buňky bylo stanoveno pomocí Tecan Spectrafluor Plus čtečky mikrotitračních destiček (Tecan Hombrechtigton, Švýcarsko), s excitací při 535 nm a emisí 595 nm.
V další sérii experimentů byla vodorozpustná značka rhodamin B uzavřena do lipozómů a byla stanovována její absorpce buňkami. Vzorky pro stanovování absorpce rhodaminu B byly připraveny smícháním 60 μΐ POPC/POPE (80/20 mol/mol 1 mM) lipozómů obsahujících 10 μΜ rhodaminu B s 300 μΐ media DMEM doplněného 10 % fetálním telecím sérem, Glutamax I, penicillin 100 U/ml a streptomycinem 0,1 mg/ml. Peptidy byly poté přidány k suspenzi tak aby konečná koncentrace byla 8,5 μΜ. 10 μΐ média (105 buněk) obsahujícího uvedené buňky bylo smícháno s LUV. Po inkubaci po dobu 15 minut při 37 °C nebo + 4 °C byly nenavázané lipozómy odstraněny z 96-jamkové destičky promytím třikrát ledovým PBS. Inkubace při 4 °C slouží jako kontrola pro neendocytickou absorpci lipozómů (Oess and Hildt, 2000). Relativní množství rhodaminu B obsažené v buňkách bylo stanoveno pomocí čtečky mikrotitračních destiček při excitaci 535 nm a emisi 595 nm.
Rovněž jsme preinkubovali buňky s forbolesterem (TPA) (50 nM).Čas inkubace byl v rozsahu od 15 do 75 minut. Ošetření buněk forbolesterem (TPA) zvyšuje jak expresi tak sekreci MMP-9 (Toth et al., 1997). Výsledky jsou uvedeny jako RFI = Elo kde RFI je relativní intenzita fluorescence, Io je emisní intenzita pro kontrolu, 2 μΜ rhodamin B v LUV bez peptidů, I je intenzita emise rhodaminu v komplexech peptid-lipozóm absorpovaných buňkami. Účinek uvedených protilátek (anti-MMP-9 a anti-MMP-2) a inhibitorů gelatinázy (TIMP-2, Marimastad a EDTA) na absorpci lipozómů obsahujících rhodamin B (PC/PE, 80/20 molární poměr) buňkami HT1080 byl stanovován jak bylo popsáno výše. M-17 potlačuje vazbu MMP-9 na substrát a tato inhibice je podle předpokladů závislá na použité koncentraci. Není známo, zda králičí polyklonální protilátka blokuje lidskou MMP-2 (Murphy et al., 1994). Konečné koncentrace uvedeného peptidů, adriamycinu, protilátek a lipozómů byla 85 μΜ, 0,2 mM, 20 /xg/ml a 0,4 μΜ.
PŘÍKLAD 17. Buněčné kultury a fluorescenční mikroskopie
U937 (ECACC 85011440), HT1080 (ECACC 85111505) a CHO (ECACC 85050302) buňky byly kultivovány v RPMI nebo DMEM médiu doplněném 10 % fetálním telecím sérem, Glutamax I, penicilín (100 U/ml) a streptomycin (0,1 mg/ml). Absorpce lipozómů obsahujících rhodamin B kultivovanými buňkami byla stanovena fluorescenční mikroskopií. Byl použit invertovaný fluorescenční mikroskop (Zeiss IM 35) vybavený objektivem Nikon s velmi dlouhou pracovní vzdáleností (20x a 40x). Vzorky byly připraveny tak, jak bylo popsáno pro techniku stanovení absorpce rhodaminu. Proto byly namísto promytí, byly buňky U937, HT1080 a CHO s lipozómy obsahujícími rhodamin přeneseny na Nunclon 48 destičku. Excitační a emisní vlnové délky byly zvoleny pomocí vhodného bandpass filtru (Melles-Griot) propouštějícího v rozsahu 535 nm a vice než 600 nm.Fluorescenční obrazy byly zobrazeny pomocí Peltier chlazené digitální kamery (C4742-95, Hamamatsu, Japonsko) napojené na počítač a ovládané softwarem (Hipic 5.0) dodávaným výrobcem přístroje.
PŘÍKLAD 18. Technika stanovení životaschopnosti
Komplexy peptid-lipozóm s uzavřeným adriamycinem byly připraveny tak, jak bylo popsáno výše, kdy konečná koncentrace uvedeného peptidů, lipidu a adriamycinu byla 85 μΜ, 0,2 mM a 0,4 μΜ a byly následně přidány k 10 μΐ (105 buněk) U937 buněk. Pro detekci mrtvých buněk byl použit EthD-1. Tento fluorochrom neprostupuje membránami a emituje fluorescence pouze pokud je navázán na DNA (Paqpadopoulos et al., 1994). Z toho vyplývá, že EthD-1 vstoupí do mrtvých buněk a naváže se na jejich DNA a intenzita fluorescence pak odpovídá množství mrtvých buněk. Emise EthD-1 byla měřena pomocí čtečky mikrotitračnich destiček s excitací 495 nm a emisí 635 nm. Pro stanovení statistické významnosti byl použit Studentův t-test.
• · · ·
PŘÍKLAD 19. In vivo směrování lipozómů
Jodace BSA byla provedena Iodogenem l,3,4,6-tetrachloro-3,6-difenylglykouryl. 100 μΐ (10 mg/ml) BSA a 125I (50 MBg) byl smíchán ve zkumavce potažené Iodogenem. Pro oddělení volného Iodogenu byla použita gelová kolona PD-10 tak aby rozdělila produkty reakce. Příprava lipozómů POPC/POPE (80/20 mol/mol) a uzavření jodovaného BSA byla provedena jak bylo posáno výše. CTT-peptid značený 99mTc byl připraven doc. SL Karonen z Helsinki University Hospital. Injikované koncentrace CTT a lipidů byly 8,5 až 85 μΜ a 0.2 mM. Injekce byla podána ocasní cévou v objemu od 50 μΐ do 200 μΐ. Konečná koncentrace peptidu v plasmě byla 0.085 μΜ až 17 μΜ.
Gama zobrazování proběhlo 30 minut po injekci. Gama zobrazování bylo provedeno pomocí Picker Prism 1500XP single-head gama kamerou napojenou na počítač Odyssey (Picker International Highlands Heights, OH). Bylo použito 25 nahých NMRI myší v rozmezí váhy 16 až 21 g s implantovaným Kaposiho sarkomem na zádech.
Výpis sekvencí:
Pro sekvence č. 1 až sekvence č. 5
Proměnná aa, Xaa v pozici 2 (3, 4, 8, 9, 10) může být jakákoliv aminokyselina.
REFERENCE
Adlakha-Hutcheon, G., Bally, M.B., Shew, C.R., and Madden, T.D. Controlled destabilization of a liposomal drug delivery systém enhances mitoxantrone antitumor activity. Nátuře Biotechnol. 17: 775-779, 1999.
Brockman, H. Lipid monolayers: why use half a membrane to characterize proteinmembrane interactions? Curr. Opin. Struct. Biol. 9:425-427, 1999.
Brooks, P.C., Stromblad, S. Sanders, L.C., von Schalscha, T.L. Aimes, R.T. StetlerStevenson, W.G. Quigley, J.P., and Cheresh, D.A. Localization of matrix metalloproteinase MMP-2 to the surface of invasive cells by interaction with integrin avft· Cell 85: 683-693, 1.996.
Clifford, C.J., Warren, E.L. Richard, T.W., and Pfeiffer, D.R. Factors affecting solute entrapment in phospholipid vesicles prepared by the freeze-thaw extrusion method: a possible generál method for improving the efficiency of entrapment. Chem. Phys. Lipids 55: 73-83, 1990.
Domingo, G.J., Leatherbarrow, R.J., Freeman, N., Patel, S., and Weir, M. Synthesis of a mixture of cyclic peptides based on the Bowman-Birk reactive site loop to screen for serine protease inhibitors. Int. J. Peptide Protein Res. 46: 79-87, 1995.
Gokhale, P.C., Radhakrishnan, B., Husain, S.R., Abemethy, D.R., Sacher, R., Dritschilo, A., and Rahman, A. An improved method of encapsulation of doxorubicin in liposomes: pharmacological, toxicological and therapeutic evaluation. Br. J. Cancer 74: 43-48, 1996.
Grabarek, Z. and Gergerly, J. Zero-length crosslinking proceduře with the use of active esters. Anal. Biochem. 185, 131-135, 1990.
Halinen, S., Sorsa, T., Ding, Y., Ingman, T., Sálo, T., Konttinen, Y.T., and Saari, H. Characterization of matrix metalloproteinase (MMP-8 and -9) activities in the saliva and in gingival crevicular fluid of children with Down's syndrome. J. Periodontology 67: 748-754,1996.
I
Koivunen, E., Arap, W,. Valtanen, H., Raininsato, A., Penáte Medina, 0., Heikkila, P., Kantor, C., Gahmberg, C. G., Sálo, T., Konttinen, Y.T., Sorsa, T., Ruoslahti, E., and Pasqualini, R. Cancer therapy with a novel tumor-targeting gelatinase inhibitor selected by phage peptide display. Nátuře Biotechnol. 17: 768-774, 1999.
Lakowicz, J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Plenům Press, New York and London, Ch 5, pp. 111-153,1999.
Lasic, D.D., Ceh, B., Stuart, M.C., Guo, L., Frederik, P.M., and Barenholz, Y. Transmembrane gradient driven phase transitions within vesicles: lessons for drug delivery. Biochim. Biophys. Acta 1239:145-156, 1995.
• · · ·
Lauhio, A., Leirisalo-Repo, M., Lahdevirta, J., Saikku, P., and Řepo, H. Doubleblind, placebocontrolled study of the three month treatment with lymecyclinein reactive arthritis, with speciál reference to Chlamydia arthritis. Arthritis Rheum. 24: 6-14, 1991.
Murphy, G., Nguyen, Q., Cockett, M., Atkinson, S., Allan, J., Knight, C., Wille F., Docherty, A. Assessment of the role of the fibronectin-like domain of gelatinase analysis of a deletion mutant. J. Biol. Chem. 269:6632-6636, 1994.
Northfelt, D.W., Martin, F.J., Working, P., Volberding, P.A., Russell, J., Newman, M., Amantea, M.A., and Kaplan, L.D. Doxorubicin encapsulated in liposomes containing' surface-bound polyethylene glycol: pharmacokinetics, tumor 'localization, and safety in patients with AIDSrelated Kaposi's sarcoma. J. Clin. Pharmacol. 36: 55-63, 1996.
Oess, S., and Hildt, E. Novel cell permeable motif derived from the PreS2-domain of hepatitis-B virus surface antigens. Gene Therapy. 7:750-758, 2000.
Papadopoulos, N. G., Dedoussis, G.V., Spanakos, G., Gritzapis, A.D., Baxevanis, C.N., and Papamichail, M. An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotoxity using flow cytomethry. J. Immunol. Meth. 177: 101, 1994.
\
Sears, B.D. (1984). Synthetic Phospholipid Compounds. US Patent 4,426,330.
Shapiro, S.D. Mighty mice: transgenic technology knocks out questions of matrix metalloproteinase function. Matrix Biol. 15:527-533, 1997.
Sorsa, T., Ding, Y., Sálo, T., Lauhio, A., Teronen, 0., Ingman, T., Ohtani, H., Andoh, N., Takeha, S., and Konttinen, Y. T. Effects of tetracyclines on neutrophil, gingival, and salivary collagenases. A functional and westem-blot assessment with speciál reference to their cellular sources in periodontal diseases. Ann. N. Y. Acad. Sci. 732: 112-131, 1994.
Sorsa, T., Sálo, T., Koivunen, E., Tyynela, J., Konttinen, Y.T., Bergmann, U., Tuuttila, A., Niemi, E., Teronen, 0., Heikkila, P., Tschesche, H., Leinonen, J., Osman, S., and Stenman.
a · • ·· φφφ· « « * · ···*·· • · ♦ ······ ··· · » · φφφ ·φ φφφ φφφ φφ «φ φφ
Activation of type IV procollagenases by human tumor-associated trypsin-2. J.Biol. Chem. 272: 21067-21074,1997.
Storm, G., and Crommelin, D. J. A. Liposomes: quo vadis? Pharm. Sci. & Tech. Today 1: 19-31, 1998.
Struck, D.K., Hoekstra, D., and Pagano, R.E. Use of resonance energy transfer to monitor membrane fusion. Biochemistry 20: 4093-4099, 1981.
Soderlund, T., Lehtonen, J.Y.A., and Kinnunen, P.K.J. Interactions of cyclosporin A with phospholipid membranes: effect of cholesterol. Mol. Pharm. 55: 32-38, 1999.
Tardi, P.G., Boman, N.L., and Cullis, P.R. Liposomal doxorubicin. J. Drug Target. 4:129140, 1996.
Toth, M., Gervasi, D.C., and Fridman, R. Phorbol ester-induced cell surface association of matrix metalloproteinase-9 in human. MCF1 OA breast epithelial cells_ Cancer Res. 57: 31593167, 1997.

Claims (25)

1. Použití peptidových sloučenin zahrnujících struktury vybrané ze skupiny složené z peptidů obsahujících cyklický motiv C(X)yHWGFXXC a peptidů obsahujících lineární motiv S(X)yHWGFXXS, kde X je jakýkoliv aminokyselinový zbytek a y je v intervalu od 2 do 3, pro zlepšení směrování lipozómů proti nádorovým buňkám.
2. Použití peptidových sloučenin zahrnujících struktury vybrané ze skupiny složené z peptidů obsahujících cyklický motiv C(X)yHWGFXXC a peptidů obsahujících lineární motiv S(X)yHWGFXXS, kde X je jakýkoliv aminokyselinový zbytek a y je v intervalu od 2 do 3, pro zvýšení absorpce lipozómů nádorovými buňkami.
3. Použití podle nároků 1 nebo 2, vyznačuj ící se tím, že peptidová sloučenina je vybraná ze skupiny složené z peptidů CTTHWGFTLC, CLPGHWGFPSC a STTHWGFTLS.
4. Použití podle jakéhokoliv z nároků 1 až 3 vyznačující se tím, že nádorové buňky jsou nádorové buňky exprimující metaloproteázy mezibuněčné hmoty.
5. Způsob zlepšení směrování lipozómů proti nádorovým buňkám pacientů, vyznačuj ící se tím, že zahrnují kroky:
(a) smíchání lipozómů s alespoň jednou peptidovou látkou vybranou ze skupiny složené z peptidů obsahujících cyklický motiv C(X)yHWGFXXC a peptidů obsahujících lineární motiv S(X)yHWGFXXS, kde X je jakýkoliv aminokyselinový zbytek a y je v intervalu od 2 do 3 (b) podání získané směsi pacientovi
6. Způsob zvýšení absorpce lipozómů nádorovými buňkami pacientů, vyznačující se tím, že zahrnují kroky:
(a) smíchání lipozómů s alespoň jednou peptidovou látkou vybranou ze skupiny složené z peptidů obsahujících cyklický motiv C(X)yHWGFXXC a peptidů obsahujících lineární motiv S(X)yHWGFXXS, kde X je jakýkoliv aminokyselinový zbytek a y je v intervalu od 2 do 3 (b) podání získané směsi pacientovi
7. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že lipozómy nesou alespoň jedno chemoterapeutické agens.
« · · · · 0 · ·
99 9 99 9 9 9 9 9
9 999 9 9999
9 9 9 9 · 9 9 9 9 ·· ·«··
8. Způsob zvoleného lipozomálního transportu chemoterapeutických agens do nádorových buněk pacientů vyznač uj ící se tím, že zahrnuj í kroky:
(a) smíchání lipozómů nesoucích alespoň jedno chemoterapeutické agens s alespoň jednou peptidovou látkou vybranou ze skupiny složené z peptidů obsahujících cyklický motiv C(X)yHWGFXXC a peptidů obsahujících lineární motiv S(X)yHWGFXXS, kde X je jakýkoliv aminokyselinový zbytek a y je v intervalu od 2 do 3 (b) podání získané směsi pacientovi
9. Způsob podle nároku 7 nebo 8, vyznačující se tím, že cheoterapeutickým agens je adriamycin.
10. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 5 až 9 vyznačuj ící se tím, že dále zahrnuje krok připojení polyethylenglykolu (PEG) na lipozómy.
11. Způsob podle j akéhokoliv z nároků 5ažl0vyznačující se tím, že peptidová sloučenina je vybraná ze skupiny složené z peptidů CTTHWGFTLC, CLPGHWGFPSC a STTHWGFTLS.
12. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 5ažllvyznačující se tím, že nádorové buňky jsou nádorové buňky exprimující metaloproteázy mezibuněčné hmoty.
13. Způsob léčby pacientů vyznačující se tím, že zahrnuj e kroky (a) získání lipozómů obsahujících alespoň jedno chemoterapeutické agens (b) smícháni lipozómů s alespoň jednou peptidovou látkou vybranou ze skupiny složené z peptidů obsahujících cyklický motiv C(X)yHWGFXXC a peptidů obsahujících lineární motiv S(X)yHWGFXXS, kde X je jakýkoliv aminokyselinový zbytek a y je v intervalu od 2 do 3 (c) podání získané směsi pacientovi
14. Způsob podle jakéhokoliv nároku 13 vyznačuj ící se tím, že dále zahrnuje krok připojení polyethylenglykolu (PEG) na lipozómy.
15. Způsob podle nároků 13 nebo 14 vyznačující se tím, že peptidová sloučenina je vybraná ze skupiny složené z peptidů CTTHWGFTLC (sekvence č. 6), CLPGHWGFPSC (sekvence č. 7) a STTHWGFTLS (sekvence č. 8).
16. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 13 až 15, vyznačující se tím, že chemoterapeutickým agens je adriamycin.
17. Způsob diagnostiky pro detekci předpokládaného nádoru pacientů vyznačuj ící se tím, že zahrnuje kroky (a) smíchání lipozómů s alespoň jednou peptidovou látkou vybranou ze skupiny složené z peptidu obsahujících cyklický motiv C(X)yHWGFXXC a peptidů obsahujících lineární motiv S(X)yHWGFXXS, kde X je jakýkoliv aminokyselinový zbytek a y je v intervalu od 2 do 3, (b) přidání detekovatelné značky do směsi, (c) podání získané směsi pacientovi a (d) detekce značky pomocí autoradiografie nebo gama zobrazení.
18. Způsob podle nároku 17 vyznačující se tím, že peptidová sloučenina je vybraná ze skupiny složené z peptidů CTTHWGFTLC, CLPGHWGFPSC a STTHWGFTLS.
19. Způsob podle nároku 17 vyznačující se tím, že detekovatelná značka je radioaktivní značka, magnetická částice nebo fluorescenční značka.
20. Diagnostická nebo zobrazovací testovací sada pro provedení techniky podle nároku 17 vyznačující se tím, že obsahuje
- lipozómy
- alespoň jednu peptidovou látkou vybranou ze skupiny složené z peptidů obsahujících cyklický motiv C(X)yHWGFXXC a peptidů obsahujících lineární motiv S(X)yHWGFXXS, kde X je jakýkoliv aminokyselinový zbytek a y je v intervalu od 2 do 3,
- detekovatelnou značku
21. Diagnostická nebo zobrazovací testovací sada podle nároku 20 vyznačuj ící se tím, že peptidová sloučenina je vybraná ze skupiny složené z peptidů CTTHWGFTLC, CLPGHWGFPSC a STTHWGFTLS.
22. Diagnostická nebo zobrazovací testovací sada podle nároku 20 vyznačující se tím, že detekovatelná značka je radioaktivní značka, magnetická částice nebo fluorescenční značka.
23. Diagnostický nebo zobrazovací přípravek vyznačuj ící se tím, že obsahuje
- lipozómy
0000
000
00 0···
0 0 0 0 • 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
000 00 00
- alespoň jednu peptidovou látkou vybranou ze skupiny složené z peptidů obsahujících cyklický motiv C(X)yHWGFXXC a peptidů obsahujících lineární motiv S(X)yHWGFXXS, kde X je jakýkoliv aminokyselinový zbytek a y je v intervalu od 2 do 3,
- detekovatelnou značku
24. Diagnostický nebo zobrazovací přípravek podle nároku 23 vyznačující se tím, že peptidová sloučenina je vybraná ze skupiny složené z peptidů CTTHWGFTLC, CLPGHWGFPSC a STTHWGFTLS.
25. Diagnostický nebo zobrazovací přípravek podle nároku 23 vyznačující se tím, že detekovatelná značka je radioaktivní značka, magnetická částice nebo fluorescenční značka.
CZ20032805A 2001-03-26 2002-03-26 Použití peptidových sloučenin, způsob zlepšení směrování a absorpce lipozómů, způsob léčby a diagnostiky pacientů, diagnostická nebo zobrazovací testovací sada a přípravek CZ20032805A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20010620A FI113840B (fi) 2001-03-26 2001-03-26 Matriisi-metalloproteinaasi-inhibiittorien käyttö liposomien kohdentamisessa

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20032805A3 true CZ20032805A3 (cs) 2004-06-16

Family

ID=8560842

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20032805A CZ20032805A3 (cs) 2001-03-26 2002-03-26 Použití peptidových sloučenin, způsob zlepšení směrování a absorpce lipozómů, způsob léčby a diagnostiky pacientů, diagnostická nebo zobrazovací testovací sada a přípravek

Country Status (23)

Country Link
US (2) US20040213833A1 (cs)
EP (1) EP1372694B1 (cs)
JP (1) JP2004529127A (cs)
KR (1) KR20040000414A (cs)
CN (1) CN1250279C (cs)
AT (1) ATE331526T1 (cs)
BR (1) BR0208681A (cs)
CA (1) CA2441227A1 (cs)
CZ (1) CZ20032805A3 (cs)
DE (1) DE60212814T2 (cs)
DK (1) DK1372694T3 (cs)
EE (1) EE200300467A (cs)
ES (1) ES2266458T3 (cs)
FI (1) FI113840B (cs)
HU (1) HUP0303649A3 (cs)
IL (1) IL158114A0 (cs)
NO (1) NO20034280L (cs)
NZ (1) NZ528043A (cs)
PL (1) PL365248A1 (cs)
RU (1) RU2003131332A (cs)
SK (1) SK12982003A3 (cs)
WO (1) WO2002076491A1 (cs)
YU (1) YU74703A (cs)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7279150B2 (en) 2002-01-24 2007-10-09 Barnes-Jewish Hospital Chelating agents with lipophilic carriers
IL152609A0 (en) * 2002-11-03 2003-06-24 Hapto Biotech Inc Liposomal compositions comprising haptotactic peptides and uses thereof
CN1314704C (zh) * 2002-11-20 2007-05-09 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 基质金属蛋白酶2的小肽抑制剂
EP1594550A4 (en) * 2003-01-24 2007-07-11 Barnes Jewish Hospital CHELATBILDNER WITH LIPOPHILES
FI115035B (fi) * 2003-05-02 2005-02-28 Ctt Cancer Targeting Tech Oy In vivo -kuvantaminen käyttäen peptidijohdannaisia
FI20031528A0 (fi) * 2003-10-17 2003-10-17 Ctt Cancer Targeting Tech Oy Terapeuttinen liposomikoostumus ja menetelmä sen valmistamiseksi
FI20040572A0 (fi) * 2004-04-23 2004-04-23 Ctt Cancer Targeting Tech Oy Matriisi-metalloproteinaasin aktiviteetin inhibiittorit
FI20040682A0 (fi) * 2004-05-14 2004-05-14 Ctt Cancer Targeting Tech Oy Tuumorien ja mestastaasien kuvantaminen käyttäen gelatinaasiin targetoituvaa peptidiä
FR2870741B1 (fr) 2004-05-25 2008-03-14 Coletica Sa Phase lamellaires hydratees ou liposomes, contenant une monoamine grasse ou un polymere cationique favorisant la penetration intercellulaire, et composition cosmetique ou pharmaceutique la contenant.
JP2006248978A (ja) 2005-03-10 2006-09-21 Mebiopharm Co Ltd 新規なリポソーム製剤
WO2008005514A2 (en) * 2006-07-06 2008-01-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Polychromatic, diversely-sized particles for angiography
CN102114000B (zh) * 2009-12-31 2013-08-21 复旦大学 一种载药的共输送脂质纳米递药系统
US8871189B2 (en) * 2011-11-30 2014-10-28 Mallinckrodt Llc MMP-targeted therapeutic and/or diagnostic nanocarriers
EP3538546A1 (en) 2016-11-14 2019-09-18 Novartis AG Compositions, methods, and therapeutic uses related to fusogenic protein minion

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5158760A (en) * 1990-05-30 1992-10-27 Board Of Regents, The University Of Texas System 99m TC labeled liposomes
ATE244572T1 (de) * 1996-10-15 2003-07-15 Liposome Co Inc Peptid-lipid konjugate, liposomen und liposomale arzneimittelverabreichung
FI980604A0 (fi) * 1998-03-18 1998-03-18 Univ Helsinki Licensing Nya matrismetalloproteinasinhibitorer och -regulatorer

Also Published As

Publication number Publication date
JP2004529127A (ja) 2004-09-24
PL365248A1 (en) 2004-12-27
NO20034280D0 (no) 2003-09-25
EP1372694B1 (en) 2006-06-28
RU2003131332A (ru) 2005-04-10
FI113840B (fi) 2004-06-30
HUP0303649A3 (en) 2005-12-28
IL158114A0 (en) 2004-03-28
CN1250279C (zh) 2006-04-12
FI20010620A0 (fi) 2001-03-26
HUP0303649A2 (hu) 2004-01-28
ES2266458T3 (es) 2007-03-01
SK12982003A3 (sk) 2004-08-03
FI20010620A (fi) 2002-09-27
EE200300467A (et) 2003-12-15
DE60212814D1 (de) 2006-08-10
US20040213833A1 (en) 2004-10-28
NZ528043A (en) 2005-08-26
WO2002076491A1 (en) 2002-10-03
KR20040000414A (ko) 2004-01-03
YU74703A (sh) 2006-05-25
DE60212814T2 (de) 2007-02-08
BR0208681A (pt) 2004-03-30
DK1372694T3 (da) 2006-10-30
CN1531439A (zh) 2004-09-22
EP1372694A1 (en) 2004-01-02
US20050271588A1 (en) 2005-12-08
ATE331526T1 (de) 2006-07-15
CA2441227A1 (en) 2002-10-03
NO20034280L (no) 2003-11-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20050271588A1 (en) Liposome targeting of matrix metalloproteinase inhibitors
US11059718B2 (en) Methods and compositions using peptides and proteins with C-terminal elements
Lv et al. Nanoplatform assembled from a CD44-targeted prodrug and smart liposomes for dual targeting of tumor microenvironment and cancer cells
Sonju et al. Peptide-functionalized liposomes as therapeutic and diagnostic tools for cancer treatment
Li et al. Cathepsin B-responsive nanodrug delivery systems for precise diagnosis and targeted therapy of malignant tumors
Cazzamalli et al. Acetazolamide serves as selective delivery vehicle for dipeptide-linked drugs to renal cell carcinoma
JP6184101B2 (ja) アネキシン１結合化合物に関する方法および組成物
Shi et al. Intelligent “Peptide-Gathering Mechanical Arm” tames wild “Trojan-Horse” peptides for the controlled delivery of cancer nanotherapeutics
JP2004529127A5 (cs)
US10179801B2 (en) Truncated LYP-1 peptides and methods and compositions using truncated LYP-1 peptides
JP2008505049A (ja) ターゲティング組成物及びその製造方法
Accardo et al. Naposomes: A new class of peptide-derivatized, target-selective multimodal nanoparticles for imaging and therapeutic applications
US20130058993A1 (en) Methods and compositions for enhancing wound healing using car peptides
AU2002240989A1 (en) Liposome targeting of matrix metalloproteinase inhibitors
Munekane et al. Preparation and evaluation of 111In-labeled liposomes containing phosphatidylglycerol for detection of macrophages in atherosclerotic plaques
Wang Tumor-specific targeting and intracellular delivery mediated by the folate endocytosis pathway
Roy Small Molecule Targeted Imaging and Therapeutic Agent for Luteinizing Hormone Releasing Hormone Receptor and Fibroblast Activation Protein Alpha
Medina et al. Research Article Liposomal Tumor Targeting in Drug Delivery Utilizing MMP-2-and MMP-9-Binding Ligands
Scherer Mix-and-match nanodendrons for detection and treatment of breast cancer metastases
Bjerg Advanced Drug Delivery Systems-a Synthetic and Biological Applied Evaluation
Lee Tumor-specific drug delivery mediated by the folate endocytosis pathway
Turk Folate-targeted liposomal drug delivery: Applications from cancer to arthritis
Chandran Polymer-based approaches for the therapy of prostate cancer