JP3135261B2 - 抗凝血剤の診断薬としての使用 - Google Patents
抗凝血剤の診断薬としての使用Info
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Description
たアネキシン(annexines)及び診断のためにそれを使
用することに関する。
胞の内容物は、いわゆる原形質膜によって、回りを囲ん
でいる血漿から分離されている。これら膜は、二重層の
形でリン脂質からできており、この二重層を部分的に貫
通しているかまたはそれから突き出ているタンパクと結
合している。
規則に分配されていないで、非対称な形状でその細胞に
よって保持されている(7,8)。ところが、ホスファチ
ジルコリン(PC)及びスフィンゴミエリン(SPH)は、
外殻の優位種であり、ホスファチジルセリン(PS)、ホ
スファチジルエタノールアミン(PE)及びホスファチジ
ルイノシトール(PI)は、細胞質ゾルに面している内側
の殻に広く位置している。この非対称のエネルギー消耗
状態は、例外的な生理学的重要事項に属する。PC及びSP
Hは、リン脂質類の最も不活性な種類であり、他の種類
とは全く対照的に、血漿成分の存在下で例外的な中立的
挙動を示す。血漿タンパクに関連のある外殻のこの反応
活性欠如は、血液が液体のままで存在できることを保証
するための絶対的必須条件である。凝血カスケードに属
する特別の血漿タンパク、即ち、いわゆる凝血因子は、
事実、それらが活性化したときに液状の血液を固体状態
に添加することができる(9)。これら凝血因子は、ホ
スファチジルセリンの如きリン脂質によって活性化され
得る。
の危機を挙げるまでもなく、凝血因子が活性化される必
要がある。そういう状況において、特別な血液細胞、即
ち、血小板は、凝血因子の活性化を促進する外殻にホス
ファチジルセリンを輸送する活性化メカニズムによっ
て、その膜の非対称性を放棄してしまう(10)。
的変化は、例えば、スコット症候群によって示されるよ
うに、血流遮断において主要な生理学的重要事項に属す
る(11)。
て、血液の血流遮断は、ある場合には、動脈、冠状動脈
及び静脈血栓症において起こるように、病的状態に陥る
かも知れない。
athic)であり、医者がそれらの発生を予測し及び予防
処理を開始するのを不可能にしている。
を助ける薬剤を提供することであった。
している。徴候がなく経過するこの段階の間、即ち、前
血栓状態の間は、凝血系の継続的活性化が局部的に起こ
っている。この局部的な活性化に関連して、その周辺に
は、活性化の初期の段階で血小板の発生が起こる。これ
ら血小板は、既に、それらの外側の血漿膜殻のリン脂質
組成を変化させ始めている。ホスファチジルセリンは外
殻に存在している。それ故、このいわゆる前血栓状態を
診断できる薬剤は、極めて臨床的に重要なものであると
いえる。
スファチジルセリンを特異的に区別することのできるア
ジュバントを提供することであった。
に活性化された血小板は、血管壁が病的状態にあるとこ
ろならどこにでも蓄積するであろう。この局在化は、血
流遮断系の活性化の引き金と考えることができる。この
異常点の局在化及びこの点での血栓形成は、主要な治療
的評価に属するであろう。
の開始点及び/または血栓をそれによって突き止め得る
薬剤を提供することであった。
素源を線維素に転化するトロンビンを形成することであ
る酵素反応のカスケードを構成する。例えば、因子Xa及
びVaによるプロトロンビンの活性化の如き多様な前凝血
反応は、凝固因子が結合しているリン脂質表面によって
触媒される。
支障を来すタンパクは、リン脂質に対するそれらの結合
においてCa2+依存性である1つの類を構成している。
チンI、カルパクチンII、タンパクII、リポコルチンII
I、p67−カレレクトリン(calelectrin)、血管抗凝血
タンパク(VAC)及びIBCに加えて、PAP、PAPI、PP4、エ
ンドキネシン(endonexin)II及びリポコルチンVを含
む。
れらのCa2+類似特性及びリン脂質結合特性に基礎を置い
ている。この一般的特性は、全てのアネキシンに当ては
まるとはいえ、Ca2+及び多様なタイプのリン脂質につい
てのそれらの親和性に関して明確な個別性が存在する。
るものである。VACの抗凝血作用の基本的メカニズム
は、リン脂質の表面へのVACの結合によるリン脂質の触
媒能力の阻害であり、それによって、リン脂質表面上で
の凝血促進複合体の形成を妨げるものとして認識され
た。
凝血性リン脂質と可逆的に結合するということがわかっ
てきた。
ンも結合に関して正の作用を有しているが、Ca2+の大き
さとは同じではない。
はCa2+及びZn2+イオンの存在下で異常な程に正に影響を
受けるということがわかった。
ァチジルセリンと結合するが、ホスファチジルコリン及
びスフィンゴミエリンとは結合しないということが分か
った。従って、VACはそれらの外側の膜の外皮中でPSと
共に周辺の血小板を特異的に認識し結合するであろう。
更にまた、VACは血液にPSを提供している血管系におけ
るそれらの位置を特異的に認識するであろう。
を他のアネキシンのように前血栓状態を早期に認知する
ための理想的な薬剤にする。
を最初に認知することが可能である。この診断法は物
質、即ち、正常状態とは異なる血小板の前血栓状態を認
識できる薬剤の特異性によって可能となる。該前血栓状
態は、前血栓性の血小板のみの外皮がホスファチジルセ
リンを示すという点で血小板の正常な状態と異なるの
で、この原理は、ホスファチジルセリンをホスファチジ
ルコリンと特異的に区別することのできる如何なる薬剤
によっても本発明に従って利用される。本発明で使用す
ることのできる薬剤は、ホスファチジルセリンについて
の特異性によって特徴付けられ、この特異性は本明細書
に記載した結合性試験によって決定することができる。
遮断系の活性化の開始点及び/または血栓を突き止める
ことも可能である。
るかも知れない状態を早期に診断することによって、相
応しい治療学的検査を採用するのを可能にする薬剤を提
供する。
って、それらはリン脂質ホスファチジルセリンに対して
必要な特異性を有するものであることが条件である。
薬として使用できるように、それらは公知の方法でラベ
ル化される。好適なラベル化は、例えば、蛍光基でのラ
ベル化または放射性ラベル化によって行うことができ
る。使用するのに都合のよい蛍光マーカーはフルオレセ
インイソシオシアネートであり、一方、使用するのに都
合のよい放射性マーカーはハロゲンの放射性同位元素、
特にヨウ素の放射性同位元素、例えば、131Iまたは125
であり、または鎖、水銀、タリウム、テクネチウムまた
はインジウム(203Pb,198Hg,201Tl,99mTc,111In)であ
る。
a)〕は、公知の方法(13)でVACをラベル化するのに使
用することができる。また、ラベル化はMRI(磁気共鳴
画像)システムで検出可能な常磁性造影剤(paramagnet
ic contrastagent)によっても可能である。MRIシステ
ムで検出可能な診断薬として複合体を供給することので
きるガドリニウム、コバルト、ニッケル、マンガンまた
は鉄の錯体を使用することが可能である。かかるシステ
ムにおいては、有機体中における元素の核スピンベクタ
ーを調整するために強い地場が使用される。次いで、該
地場は壊され、それは核のその最初の状態に戻す。この
プロセスは観察され記録される。
性ポリペプチドは、次いで、動脈または静脈を経由して
投与される。投与される量は、充分なインキュベーショ
ン時間のあとに続く測定にとって満足できる量でなけれ
ばならない。
たポリペプチドまたは薬剤を、適宜、血漿カルシウム濃
度を低下させない更なる抗凝血剤、例えば、ヘパリンの
存在下で、試験されるべき血液に体外から加え、次い
で、特定のタイプの細胞と結合したラベルを分析するの
である。
水溶液中でまたはアジュバントと共に本発明の目的のた
めに使用することができる。アジュバントには、例え
ば、ツィーン(TWEEN)80、アルギニン、リン酸緩衝液
及び生理的に和合性のある保存剤が挙げられる。他の物
質も当業者によく刷られており、使用することができ
る。
または通常のクロラミン−T法を使用して行われる。そ
の8日間の半減期からみて、131Iがインビボでの診断に
推奨できる。放射能ラベル化された薬剤は血液等張性水
溶液中に溶解する。無菌濾過後に注射する。注射してか
ら1、2、4及び7日後に、例えば、131Iに対するガン
マカメラで全身シンチグラフを撮る。
た型を使用することも可能である。
照されるべきである。更にまた、リン脂質ホスファチジ
ルセリン/ホスファチジルコリンに特異的であり、従っ
て、含まれる血小板の前血栓状態を認知できるそのフラ
グメントまたは化学的に修飾したアネキシン誘導体を使
用することもできる。
は検出可能なラベルを有するVAC −検出可能なラベルとして、蛍光ラベル、好ましくはフ
ルオレセインイソチオシアネート;ハロゲン、テクネチ
ウム、鉛、水銀、タリウムまたはインジウムの放射性同
位元素、特に好ましくは131Iまたは125Iまたは常磁性造
影剤を含有する抗凝血性ポリペプチド −ホスファチジルコリンからホスファチジルセリンを区
別するための上記の如き抗凝血性ポリペプチド −診断薬として使用するための上記の抗凝血性ポリペプ
チド −血流遮断系の活性化の開始点を突き止める方法であっ
て、 a)検出可能なラベルを備えたアネキシン由来の抗凝
血性ポリペプチドまたは薬剤、好ましくはVACを、好ま
しくは動脈または静脈経路で系に投与し、 b)インキュベーション時間経過後、前記ポリペプチ
ドの分布を、体外でガンマ−シンチレーションカメラで
または磁気共鳴測定法によって観察する方法、 −前血栓状態を診断する方法であって、 a)試験する血液を検出可能なマーカーを有するアネ
キシン類由来の抗凝血性ポリペプチドまたは薬剤、好ま
しくはVACと体外で混合し、 b)特異的な細胞のタイプの結合したラベルを分析す
る方法 −検出可能なマーカーを有するアネキシン類由来の抗凝
血性ポリペプチド、好ましくはVAC以外に、更に、例え
ば、生理食塩水、ツィーン80、アルギニン及び/または
リン酸緩衝液、適宜使用される血漿カルシウム濃度を低
下させない抗凝血剤、好ましくはヘパリンを含有する薬
剤の使用 −ホスファチジルコリンからホスファチジルセリンを区
別することができる本発明の薬剤または抗凝血剤を含有
する、前血栓状態または血流遮断系の活性化の開始点及
び/または血栓を診断学的に検出するためのキット −ホスファチジルコリンからホスファチジルセリンを区
別するための本発明の抗凝血性ポリペプチドまたは薬剤
の使用 −前血栓状態または血流遮断系の障害の開始点または血
栓の診断のための本発明の抗凝血性ポリペプチドまたは
薬剤 に関する。
様にして作成した。以下の実験はVACαで行ったが、そ
の結果は他のアネキシン、特にVACβにも当てはまる。
3)、 ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン(DOP
E,No.P−0510)、 カルジオリピン(CL,No.C−5646)、 ジオレオイル−ホスファチジルグリセロール(DOPE,No.
P−9664)、 ホスファチジルイノシトール(PI,No.(P−0639)、 ジオレオイル−ホスファチジン酸(DOPA,No.P−276
7)、 ステアリルアミン(SA,S−6755)及び卵黄スフィンゴミ
エリン(S−0756)をシグマ化学社から入手した。
験した。ジオレオイル−ホスファチジルセリン(DOPS)
は(1)に従いDOPCを転化させて合成した。14C−ラベ
ル化DOPS(比活性100,000dpm/μg)をアマシャム(Ame
rsham)社から入手した。
して「ラングミュアー−フィルムバランス」〔ラウダ
(Lauda)タイプFW−1〕を使用し、リン脂質二重層を
適用した。親水性シリコンプレートを30%クロモ硫酸及
び水中で24時間処理し、50%エタノール/水中に保存し
た。使用する前に、それらを洗浄剤及び水で完全に洗浄
した。フィルムバランスを鉱物質除去した水と50μM Ca
Cl2で満たした。クロロホルム中に約2g/のリン脂質を
含有する20μの溶液をこの支持体に適用した。二重層
中のDOPSフラクションをDOPCと混合した14C−ラベル化D
OPSで試験した。満たされた二重層をシンチレーション
洗浄剤(デュポン・フォーミュラ989)でシリコンプレ
ートから除去して、シンチレーションカウンター中で総
放射能を測定した。
うに(2,3)自動楕円偏光測定器で測定した。
l;0.1M NaCl;pH=7.5;T=20℃)を含有する親水性キュ
ベット中で行った。2価のカチオンを塩化物として段階
的に添加した。
付与するために特異的VAC濃度を含有した緩衝液を連続
的に添加した。
び分析データを組み合わせて決定した(4)。吸着した
タンパク質の量Γは偏光したローレンツ−ローレンツ式
〔1〕を使用して屈折率及び厚みから決定した(3,
5); 〔1〕 Γ=3d(n2−nb2)/[(n2+2)(r(nb2+2)−v(nb2−
1))]; nbは緩衝液の屈折率である。r=0.254及びv=0.71の
値を比モル屈折能及び比体積に使用した(3)。
からなるリン脂質膜に結合する。続いてEDTAを添加する
と即座に及び完全に脱着した(第1図)。フリーのCa2+
濃度を変化させることによって、吸着量及び吸着速度に
如何なる目立った変化をもたらすこともなく、数回吸着
を開始させることができた。従って、吸着または脱着に
よって起こるVAC分子またはリン脂質二重層に対する非
可逆的変化はありそうもない。キュベットをCa2+を含ま
ない緩衝液で軽く洗浄すると、結合は完全に元に戻っ
た。
該Ca2+供与量−活性曲線は、1/2の最大VAC吸着が達成さ
れるCa2+濃度:[Ca2+]1/2をはっきりと示している。
[Ca2+]1/2値はリン脂質表面の組成に依存している。1
00%、20%、5%及び1%DOPSを含有するリン脂質表面
で、それぞれ36μM、220μM、1.5mM及び8.6mMの[Ca
2+]1/2値が測定された(表1)。これらの結果は、特
に53μMの[Ca2+]1/2値によく一致しており、それはP
S/PC小胞の等モル混合物に結合したエンドネキシンII
(=VAC)について測定されたものである(6)。吸着
されたタンパクの最大値(Γmax)は膜のDOPSフラクシ
ョンに依存しておらず、約0.217μg/cm2に達した。Ca2+
濃度が3mMまで、純粋なDOPC二重層では吸着は検出され
なかった。
に示す。純粋なDOPC二重層では実質的にVACの吸着が見
られないということが明確に示されている。ステアリル
アミド(SA)へのVACの吸着も弱い。
の結合は優れてCa2+特異的であることが分かる(第3
図)。Cd2+、Zn2+、Mn2+及びCo2+は、あまり進展した結
合を示さない;Ba2+及びMg2+は如何なる影響も示さな
い。カチオンのこの特性はある程度まではそのイオン半
径に関係付けることができる。
吸着を促進するが(第3図);50μMでは吸着に関して
ほんの僅かな効果も有さない。驚いたことに、この濃度
はCa2+存在下で結合に影響を及ぼし;ある相乗効果が存
在する。[Ca2+]1/2値は、1%DOPSしか有さない二重
層について8.6mMから2.7mMに下がる([Zn2+]=50μ
M)(第4図)。50μM[Zn2+]は、血漿亜鉛濃度の正
常範囲内である。
ルオレセインイソチオシアネートでラベル化する;この
場合VAC−FITCが得られる。
ば、ヘパリン)及びVAC−FITCを含有するプラスチック
製試験管に患者の血液を入れる。
血液細胞を分析する。この分析は、特異的タイプの細胞
と結合した蛍光の強度を決定する。
量、即ち、PSに曝された血小板の量を示すものであり、
従って、前血栓状態の存在を示すものである。この方法
によって、健康を脅かす状態が早期に認知され、結果と
して初期段階の治療が可能になるのである。
例えば、131Iでラベル化する;131I−VACが得られる。
体または一部をシンシグラフィーに曝す。広視野ガンマ
カメラを使用して放射能の分布を観察することができ
る。
る点を指示している。適当な血栓防止処置または血栓軽
減処置を早期にとることができる。
ウム・1水和物を溶解し、2回蒸留した1の水に35.5
gのリン酸水素二ナトリウムを溶かした溶液をpHが7.5に
なるまで加えた。
NaCl(溶離緩衝液)の調製 2回蒸留した1の水に2.76gのリン酸二水素ナトリ
ウム・1水和物を溶解し、2回蒸留した1の水に2.84
gのリン酸水素二ナトリウムを溶かした溶液をpHが7.2に
なるまで加えた。溶離緩衝液は1のこの緩衝液に8.77
gのNaCl(150mmol)を添加することによって調製した。
G25、メセルス・ファルマシア社製)を平衡化した。
マス(moleculer mass):432.09g/mol〕を溶解した。1.
5ml容のエッペンドルフ容器に200μのこの溶液をピペ
ットで採り、37℃で溶媒を蒸発させた(恒温ブロッ
ク)。このようにして、8μg(1.85×10-2mmol)のIO
DO−GENを反応容器の内壁に精巧に分散した。
ム緩衝液+150mmol/ NaCl(pH7.2,1mlの2回蒸留した
水で希釈)に50mgのVAC−αを溶解した溶液であった。
分子マスVAC−α:34000g/mol。
ポン,NENプロダクツ製のNa125I。比活性は15.9Ci/mgの
ヨウ素=1.98kCi/mmol 1/2I2であり、0.115μgのヨー
ドに対応する(9.2×10-7mmol 1/2I2)。この活性をNaI
を5.5μの0.1mol/ NaOH中に溶解した。
素を除去しながら行った。1.1.5.に記載したVAC−α溶
液20μ(=200μg)をIODO−GENで前処理した反応容
器の中に移した。この容器を密閉し、周囲温度で20分間
振った。次いで、その反応容器を準備したPD−10カラム
(1.1.3.を参照)にピペットで適用した。該反応容器を
500μの溶離緩衝液(1.1.2を参照)で再度軽く洗浄
し、この溶液もPD−10カラムに適用した。流出した溶離
液は捨てた。
リコットを適用することによって、VAC−α[125I]を
フリーの125I/Na125Iから分離した。12フラクションを
採取して、この精製工程を完結した。実験室モニター
(GMZ)を使用してフラクションの相対的活性濃度を測
定した(第7図)。
0mlに調整してから100μ分量ずつに分割し、−20℃で
凍結した。これらの物質は、分析及び開発研究用にこれ
らの分量で利用できるように保存した。
2.0ml溶液であることが測定された。
[125I]VAC−α溶液を950μの不活性VAC−α−溶液
(1.1.5.を参照)にピペットで加え、完全に混合し、そ
して50μを測定のためにLSCカウンター(ベックマン
製)中に配置した。24.5MBq(=0.663mCi)/2.0ml全溶
液。
1.61TBq/mmol(9.23mCi/mg=313.8Ci/mmol)を得た。
μの40%水性トリクロロ酢酸と混合し、完全に震盪し
冷蔵庫中で60分間立てて置いた。析出物を遠心分離によ
って除去した。上清液のアリコットをLSCカウンターで
測定した。
れた。従って、放射能収率は36.4%であった。
6のうち1のVAC−α分子が125I元素でラベル化されて
いた。
銀染色〔オークレイ(Oakley)法〕によるゲル評価法、
オートラジオグラフィー及びリニアーアナライザー(バ
ートホールドLB282製、プローブLB2820)の下で検出
(第8図)を使用して、使用したVAC−αとの比較によ
って該物質を調べた。該物質は同一であり、2量体生成
物の比率は不活性チャージのために許容される限度であ
る8%よりもかなり下回った。
ン脂質表面上でのVACの交互する吸着及び脱着。20%DOP
S/80%DOPCリン脂質二重層上でのVAC(1μ/ml)の吸
着。Ca2+の添加(3,4,6mM)は↑または▽によって示さ
れている。
脂質組成及びCa2+濃度の影響。
た。
オンの存在下(1または3mM)での20%DOPS及び80%DOP
Cの二重層上でのVAC吸着。
てのZn2+の相乗効果。50μM Zn2+の存在下での1%DOPS
及び99%DOPC上でのVAC吸着についてのCa2+の効果。
吸着。
ルコリン(DOPC)が混ざったジオレオイルホスファチジ
ルセリン(DOPS)、カルジオリピン(CL)及びジオレオ
イルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、80%の
DOPCが混ざったジオレオイルホスファチジルグリセロー
ル(DOPG)、ホスファチジルイソシトール(PI)及びス
テアリルアミン(SA)または純粋なDOPC上でのVAC吸
着。[VAC]=1μg/ml;[Ca2+]=3mM。
ル−グリコールリル(IODO−GEN)。
量の楕円偏光測定器で測定し、14Cラベル化DOPSをベッ
クマン6S3801シンチレーションカウンター(s.d.<2
%)を使用して測定し、自然放射能(60DPM)で補正し
た。二重層中のDOPSフラクションを式2を使用して計算
した。
によって占められた面積は0.62cm2であった。
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Claims (11)
- 【請求項1】検出可能なマーカーを有するアネキシン類
由来の抗凝血ポリペプチドを含有することを特徴とす
る、ホスファチジルコリンからホスファチジルセリンを
区別するための組成物。 - 【請求項2】検出可能なマーカーを有するアネキシン類
由来の抗凝血ポリペプチドを含有することを特徴とす
る、前血栓状態、血流遮断系の障害又は活性化の開始
点、又は血栓の診断用組成物。 - 【請求項3】抗凝血ポリペプチドが血管抗凝血タンパク
(VAC)である請求項1又は2記載の組成物。 - 【請求項4】検出可能なマーカーが、蛍光ラベル、放射
性同位元素又は常磁性造影剤である請求項1又は2記載
の組成物。 - 【請求項5】放射性同位元素が、ハロゲン、テクネチウ
ム、鉛、水銀、タリウム又はインジウムの放射性同位元
素である請求項4記載の組成物。 - 【請求項6】放射性同位元素が、125I、123I、131I、
111In、99mTc、230Pb、198Hg又は201Tlである請求項4
記載の組成物。 - 【請求項7】蛍光ラベルがフルオレセインイソシオシア
ネートである請求項4記載の組成物。 - 【請求項8】さらに、アジュバントを含有する請求項1
〜7のいずれか1項記載の組成物。 - 【請求項9】アジュバントが、生理食塩水、アルギニン
及び/又はリン酸緩衝液である請求項8記載の組成物。 - 【請求項10】さらに、血漿カルシウム濃度を低下させ
ない抗凝血剤を含有する請求項1〜9のいずれか1項記
載の組成物。 - 【請求項11】血漿カルシウム濃度を低下させない抗凝
血剤がヘパリンである請求項10記載の組成物。
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