FI107586B - Antikoagulantin käyttö diagnostisena aineena - Google Patents

Antikoagulantin käyttö diagnostisena aineena Download PDF

Info

Publication number
FI107586B
FI107586B FI922719A FI922719A FI107586B FI 107586 B FI107586 B FI 107586B FI 922719 A FI922719 A FI 922719A FI 922719 A FI922719 A FI 922719A FI 107586 B FI107586 B FI 107586B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
vac
anticoagulant
polypeptide
plasma
marker
Prior art date
Application number
FI922719A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI922719A0 (fi
Inventor
Christiaan Reutelingsperger
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=6396455&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI107586(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Boehringer Ingelheim Int filed Critical Boehringer Ingelheim Int
Publication of FI922719A0 publication Critical patent/FI922719A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI107586B publication Critical patent/FI107586B/fi

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
    • A61K49/0043—Fluorescein, used in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/087—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins the peptide being an annexin, e.g. annexin V
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4721—Lipocortins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2123/00—Preparations for testing in vivo
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4718—Lipocortins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2405/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving lipids
    • G01N2405/04—Phospholipids, i.e. phosphoglycerides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Dental Preparations (AREA)
  • Separation Of Suspended Particles By Flocculating Agents (AREA)
  • External Artificial Organs (AREA)

Description

1 107586
Antikoagulantin käyttö diagnostisena aineena. - Användning av anticoagulant som diagnosmedel.
Esillä olevan keksinnön kohteena ovat aineet, erityisesti anneksiinit, jotka on leimattu detektoitavalla aineella, sekä näiden käyttö diagnosoinnissa.
Veri muodostuu sitoutumattomista erikoissoluista, jotka ovat jakaantuneet plasma-mediumiin. Nk. plasmamembraanit erottavat solun sisällön ympäröivästä plasmasta. Nämä membraanit muodostuvat kaksoiskerroksena olevista fosfolipideistä ja näihin liittyvistä proteiineista, jotka osittain tunkeutuvat tämän kaksoiskerroksen läpi tai työntyvät siitä ulos.
Eri fosfolipidit eivät ole mielivaltaisesti jakaantuneet kaksoiskerroksen ulompaan ja sisempään kuoreen, vaan solut pitävät nämä epäsymmetrisessä konfiguraatiossa (7, 8).
Fosfatidyylikoliini (PC) ja sfingomyeliini (SPH) ovat dominoivia ulommassa kuoressa, kun taas fosfatidyyl1iseriini (PS), fosfatidyylietanoliamiini (PE) ja fosfatidyyli-inositoli (PI) ovat pääasiallisesti logalisoituneet sisempään kuoreen, joka on kohti sytosoluja. Tällä energiaa kuluttavalla asymmet-risyydellä on tavaton fysiologinen merkitys. PC ja SPH ovat fosfolipidiperheen voimakkaimmin inerttejä yhdisteitä ja ne ... käyttäytyvät äärimmäisen neutraalisti plasmakomponenttien * , suhteen eli täysin päinvastoin kuin muut yhdisteet. Tämä ] ' ulomman kuoren reagoimattomuus plasmaproteiinien suhteen on : " ehdoton edellytys veren nestemäisen tilan takaamiselle. Plasman erikoisproteiinit, jotka kuuluvat veren hyytymiskaskadiin, nk.
• · ·."·· hyytymistekijät, voivat nimittäin aktivoituna muuttaa veren : : : nestemäisen tilan kiinteäksi tilaksi (9). Nämä hyytymistekijät voivat aktivoitua fosfoiipidien, kuten fosfatidyyliseriinin vaikutuksesta.
; Monissa tapauksissa, esimerkiksi verisuonen vioittumisen • · • · ♦ • · · • · · • · 2 107586 jälkeen, on tarpeellista, jopa elintärkeää, että hyytymistekijät aktivoituvat. Tällaisessa tilanteessa voi erityinen verisolu, verihiutale, luopua membraaniensa epäsymmetrisyydestä aktivointimekani-smien avulla, jotka kuljettavat fosfatidyyli-seriiniä ulompaan kuoreen, jossa se tukee hyytymistekijöiden aktivointia (10).
Tällä verihiutaleen rasvamembraanin ulomman kuoren suunnitelmallisella fosfoiipidikoostumuksen muutoksella on suuri fysiologinen merkitys hemostaasil1 e, kuten esimerkiksi Scott'in. syndrooma osoittaa (11).
Kuitenkin myös patologia on fysiologiaa; siten veren hemostaasi voi eräissä tapauksissa johtua myös patologisesta tilasta, kuten on asianlaita valtimo-, sydän- ja 1askimotromboosien tapauksessa.
Nämä hemostaattiset häiriöt ovat useimmiten idiopaattisia ja tekevät lääkäreille mahdottomaksi niiden esiintymisen ennustamisen ja profylaktisen hoidon kehittämisen.
Esillä olevan keksinnön tavoitteena oli tuoda esiin apuaineita, jotka auttavat tunnistamaan ennakolta hemostaattiset häiriöt.
... Päinvastoin kuin oireiden kehittyminen häiriöt kehittyvät useimmissa tapauksissa hitaasti. Tämän oireettoman etenemisvai- ’ heen aikana, nk. protromboottisen tilan aikana, koagulaatiojär- • · • ” jestelmä aktivoituu jatkuvasti paikallisesti. Tähän paikalli- seen aktivoitumiseen liittyy ääreisverenkierrossa verihiuta- ·.*: leiden esiintymistä, jotka ovat varhaisessa aktivoitumisti- • · · · lassa. Nämä verihiutaleet ovat siten jo alkaneet muuttaa ulompien plasmamembraanikuoriensa fosfoiipidikoostumusta.
Ulommissa kuorissa on läsnä fosfatidyyliseriiniä. Apuaineilla, jotka kykenevät diagnosoimaan tämän nk. protromboottisen tilan, : olisi suuri kliininen merkitys.
« · • » · « · · « · · » · · * · · « · · • · • * « · « • · • « • · * • · · 3 107586 * Esillä .olevan keksinnön kohteena ovat siten myös apuaineet, jotka kykenevät erottamaan spesifisesti fosfatidyyliseriinin fos fatidyylikoliinistä.
Sen lisäksi, että ääreisverenkierrossa esiintyy heikosti aktivoituneita verihiutaleita, siellä on kiinnittyneinä täysin aktivoituneita verihiutaleita, joiden kohdalla suonen seinämä on patologisessa tilassa. Tätä kohtaa on pidettävä hemostaat-tisen järjestelmän aktivoitumisen laukaisijana. Tämän patologisen kohdan sekä tässä muodostuvan trombin paikallistamisella olisi mitä suurin terapeuttinen mielenkiinto.
Esillä olevan keksinnön kohteena ovat sen vuoksi myös aineet, joilla voidaan paikallistaa hemostaattisen järjestelmän ja/tai trombin aktivoitumisen alkamiskohta.
Veren hyytymismekanismi on entsymaattisten reaktioiden kaskadi, jonka päässä on trombiinin muodostuminen, joka lopuksi muuntaa fibrinogeenin fibriiniksi. Erilaisia esikoagulointireaktioita, * kuten esimerkiksi protrombiinin aktivoitumista faktoreiden Xa ja Va vaikutuksesta katalysoivat fosfolipidipinnat, joihin hyytymistekijät sitoutuvat.
Niihin proteiineihin, jotka sitoutuvat fosfoiipideihin ja jotka • · · *.1 1 häiritsevät f osf olipidipinnoista riippuvia tapahtumia, kuuluu *·"1· yksi ryhmä, jonka sitoutuminen f osf oi ipideihin riippuu
Ca2+:sta.
* · • » · ♦ · · • · Tähän ryhmään, jota kutsutaan myös anneksiineiksi, kuuluvat * ♦
Liookortiini i:n, Ccalpaktiini l:n, proteiini II :n, Lipo- • · · kortiini III:n, p67-Calelektriinin lisäksi myös vaskulaarinen antikoagulanttiproteiini (VAC) ja IBC, PAP, PAPI, PP4, Endoneksiini II ja Lipokortiini V.
* 1
Anneksiinien yhteiset rakenteelliset tunnusmerkit muodostavat f·» • · » • · · • · · * • · · • · · * · · • » · e » • a • · · « » • « 4 107586 _todennäköisesti perustan niiden samankaltaisille sitoutumis-ominaisuuksi11 e Ca2+:n ja fosfoiipidien suhteen. Vaikkakin tämä y1eisominaisuus koskee kaikkia anneksiineja, niiden affiniteetti Ca2+:lle ja eri fosfolipidi1 ajei11 e on selvästi yksilöllistä.
Anneksiinien fysiologiset toiminnat koskevat membraaneihin liittyviä tapahtumia. VAC:n hyytymistä estävän vaikutuksen perusmekanismi selvitettiin fosfoiipidien katalyyttisen kapasiteetin estymisenä VAC:n näiden pinnoille sitoutumisen vaikutuksesta, mikä estää hyytymistä edistävien kompleksien muodostumisen näiden pinnoilla.
Sitoutumistutkimukset ovat osoittaneet, että VAC liittyy reversiibelisti ja kalsiumista riippuvalla tavalla esikoa-guloiviin fosfoiipideihin.
Myös muut sarjan Cd2+, Zn2+, Mn2+ ja Co2+ kaksivalenssiset kationit vaikuttavat positiivisesti liittymiseen, mutta ei kuitenkaan samassa mitassa kuin Ca2+.
Lisäksi havaittiin yllättäen, että Ca2 + - ja Zn2+-ionien läsnäololla on erittäin positiivinen vaikutus VAC:n adsor-boitumiseen fosfoiipidei11 e.
• · · • · · * 1 1
Yllättäen todettiin, että VAC sitoutuu plasman kalsiumkon- • « ;·, sentraatioissa f osf atidyyliseriiniin, mutta ei f osf atidyy 1 i - • · » . koliinin ja sfingomyeliiniin. Sen vuoksi VAC tunnistaa ja « ♦ « • · · I 1 sitoutuu spesifisesti perifeerisiin verihiutaleisiin, joiden ♦ · 1 '·,/ ulommissa membraanikuorissa on fosfatidyy1iseriiniä. Lisäksi • · « *·’ VAC tunnistaa myös tällaiset vaskulaarisen järjestelmän kohdat spesifisesti, jotka asettavat PS:n alttiiksi verelle.
Tämä fosfolipidien erikoistuminen tekee VÄC:n kuten muutkin anneksiinit ideaaliseksi reagenssiksi, jolla voidaan ennalta • · • · · • · ♦ t · · • ♦ ♦ * · ♦ * · 1 • · · · · • « » 1 • · · « · • · • ♦ ♦ # ft« • · ♦ » · 5 107586 * tunnistaa edellä kuvatunlainen nk. esitromboottinen tila.
Esillä oleva keksintö tuo esiin aineita, joiden avulla on yllättäen ensimmäisen kerran mahdollista tunnistaa verisuoni-järjestelmän esitromboottinen tila. Tämän dignoosin tekee mahdolliseksi niiden aineiden spesifisyys, jotka kykenevät tunnistamaan verihiutaleiden normaalitilaan verrattuna muuttuneen, esitromboottisen tilan. Koska tämä tila eroaa verihiutaleiden normaalitilasta siten, että vain esitromboottisten verihiutaleiden ulommassa kuoressa on fosfatidyyliseriiniä, tämän keksinnön mukaisen periaatteen hyödyntämiseen sopii periaatteessa jokainen aine, joka voi erottaa fosfatidyylise-riinin spesifisesti fosfatidyylikoliinista. Keksinnön mukaisesti käytettäville aineille on tunnusomaista niiden spesifisyys fosfatidyyliseriinin suhteen, mikä saadaan selville kuvauksessa annettujen sitoutumiskokeiden avulla.
Tämän keksinnön mukaisten aineiden spesifisyyden hyödyntäminen tekee lisäksi mahdolliseksi paikallistaa hemostaattisen järjestelmän ja/tai trombin aktivoitumisen alkamiskohdan.
Esillä oleva keksintö tuo siten ensi kertaa esiin apuaineet, jotka mahdollistavat mahdollisesti kehittyvän, terveydelle vaarallisen tilan diagnosoinnin etukäteen, jolloin voidaan »· · V’ ryhtyä sopiviin terapeuttisiin toimiin.
• ·
Hyvänä pidetyt keksinnön mukaiset aineet ovat antikoaguloivia ♦\ϊ polypeptidejä, mikäli niillä on tarvittava spesifisyys fosfa- • · .·. : tidyyl iseriini-f osf oi ipidin suhteen.
* M * ·
Ml * » « » 9 ♦
Erityisen hyvänä pidetään anneksiiniaryhmää, erityisesti VAC:a.
Jotta keksinnön mukaisia aineita, erityisesti VAC:a tai muita anneksiineja voitaisiin käyttää diagnostisina aineina, ne • · * ' i leimataan sinänsä tunnetulla tavalla. Sopivina markkereina
«M
* · • « • · * • * • · • · · • · * »•I « · » I « • «I * · I* » 6 107586 'toimivat esimerkiksi leimaaminen fluoresoivilla ryhmillä tai radioaktiivinen leimaus. Edullisesti käytettävänä fluoresoin-timarkkerina voidaan mainita fluoreseiini-isotiosyanaatti ja edullisesti käytettävinä radioaktiivisina markkereina halogeenien, erityisesti jodin radioisotoopit, esimerkiksi 131I tai -253 tai myös lyijy, elohopea, tallium, teknetium tai indium (20 3p]3/ 19SHg, 2013^ 9 r Ulin).
Fluoreseiini-isotiosyanaattia (Serva) voidaan käyttää sinänsä tunnetulla tavalla VAC:n leimaamiseen.
Mahdollista on myös leimata paramagneettisel1 a kontrastiai-neella, joka voidaan detektoida MRI-systeemissä (Magnetic resonance imaging). Voidaan käyttää gadolinium-, koboltti-, nikkeli-, mangaani- tai rautakomplekseja, joiden konjugaattien kanssa voidaan valmistaa diagnostisia aineita, jotka voidaan detektoida MRI-systeemissä. Tällaisissa järjestelmissä käytetään voimakasta magneettikenttää oikaisemaan organismissa olevien atomien ydinspin-vektorit. Tämän jälkeen kenttä lakkautetaan, jolloin ytimet palaavat lähtötilaansa. Tätä tapahtumaa seurataan ja se lukitaan.
Tällä tavoin detektoitaval1 a markkerilla varustettu antikoa- T ♦ « · : : guloiva polypeptidi annetaan tämän jälkeen vai timonsisäisesti *:1·: tai laskimonsisäisesti. Annettava määrä on mitoitettava siten, ·1· . että se riittää myöhempään mittaukseen riittävän inkubointiajän .·. : kuluttua.
Esitromboottisen tilan osoittamiseksi lisätään tutkittavaan vereen kehon ulkopuolella keksinnön mukaista leimattua poly-peptidiä tai ainetta, mahdollisesti toisen, plasman kalsium-konsentraatiota pienentämättömän antikoagulantin, kuten esimerkiksi hepariinin läsnäollessa, minkä jälkeen analysoidaan *.2: spesifisiin soiutyyppeihin liittyvä markkeeraus.
· • · · 2 « · 7 107586
Keksinnön mukaista leimattua polypeptidiä voidaan käyttää keksinnön mukaiseen tarkoitukseen sekä veren kanssa isotonisessa vesiliuoksessa että yhdessä apuaineiden kanssa. Apuaineina voidaan käyttää esimerkiksi TWEEN 80:a, arginiinia, fosfaattipuskuria ja fysiologisesti sopivia säi1ytysaineita. Ammattimiehet tuntevat parhaiten muut aineet, ja myös näitä voidaan mahdollisesti käyttää.
Radioaktiivisen leimauksen tekemiseen käytetään esimerkiksi tunnettua iodogen-menetelmää (12) tai tavanomaista kloramiini-T-menetelmää. In vivo diagnosointiin on suositeltavaa käyttää -3iI:a sen 8 päivän pituisen puoliintumisajan vuoksi. Radio-aktiivisesti leimattu aine otetaan veren kanssa isotoniseen vesiliuokseen. Steri1ointisuodatuksen jälkeen se injisoidaan. Kokonaiskiiltograafit otetaan gammakameralla esimerkiksi 13iI:lle 1, 2, 4 ja 7 päivän kuluttua injisoinnin jälkeen.
Anneksiinien oikeiden muotojen lisäksi voidaan keksinnön mukaisessa käytössä käyttää myös muutettuja muotoja.
Erityisesti mainittakoon patenttijulkaisussa EPÄ 0 293 567 kuvatut mutantit. Näiden lisäksi voidaan käyttää myös anneksiinien fragmentteja tai kemiallisesti modifioituja johdoksia, ·.· · jotka ovat spesifisiä fosfatidyyliseriini/fosfatidyylikoliini- f osf olipidien suhteen ja jotka sen vuoksi voivat tunnistaa kyseisten verihiutaleiden esitromboottisen tilan.
• «4 • · : Tarkemmin sanottuna esillä olevan keksinnön kohteena ovat: • · · • « • · · - Anneksiinien ryhmään kuuluva antikoaguloiva polypeptidi, erityisesti VAC, joka on varustettu detektoitavalla mark-keri11a.
• · ·. 1: - Antikoagul oiva polypeptidi, joka sisältää detektoivana « · · '·.· · markkerina fluoresointimarkkerin, ensisijaisesti • · ♦ • · · « • ♦ · m · 8 107586 fluoreseiini-isotiosyanaattia, halogeenin, teknetiumin, lyijyn, elohopean, talliumin tai indiumin radioisotooppia, erityisen mielellään 131I:a tai 125I:a tai paramagneettista kontrasti-ainetta.
- Edellä kuvattu antikoaguloiva polypeptidi, jolla erotetaan fosfatidyy1iseriini ja fosfatidyylikoliini.
- Edellä kuvattu antikoaguloiva polypeptidi diagnostisena aineena käyttöä varten.
- Menetelmä hemostaattisen järjestelmän aktivoitumisen alkamiskohdan toteamiseksi, jossa menetelmässä a) systeemiin laitetaan, ensisijaisesti vaitimonsisäisesti tai laskimonsisäisesti, anneksiinien ryhmään kuuluvaa, detektoitavalla markkerilla varustettua antikoaguloivaa polypeptidiä tai ainetta, ensisijaisesti VAC:a, ja b) inkubointiajän jälkeen määritetään mainitun polypeptidin jakaantuminen kehon ulkopuolisesti gamma-tuikekameral1 a tai magneettisen resonanssin mittauksella.
- Menetelmä esitromboottisen tilan toteamiseksi, jossa mene-telmässä • · • · • « · . a) kehonulkoisesti sekoitetaan tutkittavan veren kanssa ** '] anneksiinien ryhmään kuuluvaa antikoaguloivaa polypeptidiä tai ainetta, parhaiten VAC:a, joka sisältää detektoi tavaa « · ♦ * markkeria ja b) analysoidaan spesifisiin solutyyppeihin liittyvä markkee- raus.
♦ » · • «1 • » · • · · « · · ♦ i 1 • · · • · · « ·»» • · · 1 107586 9 - Aine,'joka sisältää anneksiinien ryhmään kuuluvan, detektoi-valla markkerilla varustetun antikoaguloivan polypeptidin, ensisijaisesti- VAC:n lisäksi apuainetta, esimerkiksi fysiologista keittosuolaliuosta, TWEEN 80:a, arginiinia ja/tai fosfaattipuskuria, jolloin mahdollisesti voidaan käyttää plasman kaisiumkonsentraatiota alentamatonta anti-koagulanttia, ensisijaisesti hepariinia.
- Esitromboottisen tilan tai hemostaattisen järjestelmän ja/tai trombin aktivoitumisen alkamiskohdan osoittamiseen tarkoitettu diagnostinen kitti, joka sisältää keksinnön mukaista ainetta tai antikoaguloivaa polypeptidiä, joka kykenee erottamaan fosfatidyyliseriinin fosfatidyylikoliinista.
- Keksinnön mukaisen antikoaguloivan polypeptidin tai aineen käyttö fosfatidyyliseriinin ja fosfatidyylikoliinin erottamiseen.
- Keksinnön mukaisen antikoaguloivan polypeptidin tai aineen käyttö esitromboottisen tilan tai hemostaattisen järjestelmän häiriön tai trombin alkamiskohdan diagnosoimiseen.
Materiaalit la menetelmät • · · • · · • · # • VAC valmistettiin joko patenttijulkaisun EPÄ 0 181 465 tai patenttijulkaisun EPÄ 0 293 567 mukaisesti. Seuraavat kokeet .’.J suoritettiin VACarlla, mutta tulokset ovat siirrettävissä myös • · : muille anneksiineille, erityisesti myös VACfi:lle.
• · · • · • · · • · ♦ • ♦ ♦
Lipidit
Dioleoyyli-fosfatidyylikoliini (COPC, n:o P-1013)
Dioleoyyli-fosfatidyylietnaoliamiini (DOPE, n:o P-0510),
Kardiolipiini (CL, n:o C-5646), Dioleoyyli-• · 1 ' *. 1: fosfatidyyliglyseroli (DOPG, n:o P-9664), *«« ·.· 1 Fosfatidyyli-inositoli (PI, n:o P-0639), • · · • « · • · · · · • » • 1 »·· • · • · • · · ♦ · · • · 10 107586
Dioleoyyli-fosfatidihappo (DOPA, n:o P-2757),
Stearyy1iamiini (SA, S-6755) ja munankeltuaisen sfingomyeliini (S-0756) saatiin Sigma Chemical Co-yhtiöltä.
D0PC:n ja DOPE:n puhtaus tutkittiin ohutlevykromatografisesti. Dioleyyli-fosfatidyyliseriini (DOPS) valmistettiin muuntamalla DOPC viitteen (1) mukaisesti. 14C-leimattu DOPS (ominaisaktii-visuus 100.000 dpm/μg) saatiin Amersham-yhtiö1tä.
Fosfoijpidi-kaksoiskerrosten valmistaminen piilevyille
Fosfolipidi-kaksoiskerrokset levitettiin Corsel’in et ai. (2) kuvaamalla "Langmuir-film balance"-laitteella (Lauda Typ FW-1).
Hydrofiiliset piilevyt käsiteltiin 24 tuntia 30-prosenttisessa kromirikkihapossa ja vedessä ja säilytettiin 50-prosenttisessa etanoli/vesi-seoksessa. Ennen niiden käyttöä ne puhdistettiin perusteellisesti detergenti11ä ja vedellä. "Film balance” täytettiin demineralisoidulla vedellä ja 50 μΜ CaCl2:lla. Tämän alafaasin päälle laitettiin 20 μΐ liuosta, joka sisälsi noin 2 g/1 fosfolipidiä kloroformissa. Kaksoiskerrosten DOPS-jakeet tutkittiin 14C-leimatulla DOPS:11a seoksena DOPC:n kanssa.
Tehdyt kaksoiskerrokset poistettiin piilevyiltä tuike- , ^ detergentillä (Du Pont Formel-989) ja kokonaisradioaktiivisuus ♦ · · '·1 2 1 mitattiin tuikelaskimessa.
• · • · • 1·· Sitoutumisen mittaaminen el 1 ipsometrisesti • · • « » • · · • · :1·.· VAC:n adsorptio fosfolipidi-kaksoiskerroksiin mitattiin • 1 .1!1. kuvatulla tavalla automaattisen el lipsomittarin avulla (2,3).
Sitoutumistutkimukset suoritettiin hydrofii1isessä kyvetissä, joka sisälsi 5 ml sekoitettua puskuria (0,05 M Tris/HCl; 0,1 M NaCl; pH=7,5; T=20°C). Kahdenarvoiset kationit lisättiin vähi- « » 1 *· 1· telien kloridina. < 0,1 ug/ml VAC-konsentraatioissa lisättiin »«» • ♦ 1 V 1 jatkuvatoimisesti puskuria, joka sisälsi tämän VAC-konsentraa- • · · · ♦ # 1 2 • »· • 1 • « ·»» • · * · i · « • ♦♦ • · , , 107586 _L. _L.
* tion, j-otta VAC:lla olisi riittävä puskurikapasiteetti .
Yhdistetyistä polarisaatio- ja analyysiarvoista määritettiin adsorboituheen kaivon taitekerroin ja paksuus d (4). Adsorboituneen proteiinikerroksen määrä Γ määritettiin taitekertoimesta ja paksuudesta modifioidun Lorentz'in ja Lorenz’in yhtälön [1] avulla (3,5): [1] r=3d(n2-nb2)/[(n2+2)(r(nb2+2)-v(nb2-l))]; nb on puskurin taitekerroin. Spesifiselle moolidefraktiol1 e ja spesifiselle osatilavuudelle käytettiin arvoja r=0,254 ja v=0,71 (3).
Tulokset
Kahdenarvoisten kationien vaikutus VAC:n sitoutumiseen fosfoiipideihin VAC sitoutuu kaisiumkonsentraatiosta riippuvalla tavalla fosfoiipidimembraaneihin, jotka muodostuvat 20-prosenttisesti DO?S:sta ja 80-prosenttisesti DOPC:sta. EDTA:n myöhempi lisääminen johti heti tapahtuvaan ja täydelliseen desorptioon (kuvio 1). Muuttamalla vapaata Ca2+-kosnentraaticta voitiin adsorptio ;T: käynnistää useita kertoja muuttamatta merkittävästi adsorboi- ..··· tunutta määrää tai adsorptionopeutta. Adsorption tai desorption ;·. aiheuttamat VAC-molekyylin tai fosfolipidi-kaksoiskerrosten » · · ; irreversiibelit muutokset eivät sen vuoksi ole todennäköisiä.
» ·· ! *. Sitoutuminen oli myös täysin reversiibeliä, kun kyvetti huuh- ♦ · · • · · *..* del tiin Ca2+-ioneja sisältämättömällä puskurilla.
• * · i · ♦ VAC:n fosfoiipideihin sitoutumisen riippuvuus Ca2^:sta on esitetty kuviossa 2. Ca2+-annos-vaikutus-käyrä näyttää täysin yksiselitteisesti Ca2+-konsentraation, jossa saavutetaan puolet • · · maksimaalisesta VAC:n adsorptiosta: [Ca2 + ]:/2. [Ca2 + ]i/2-arvo riippuu fosfolipidin pinnan koostumuksesta. Fosfoiipidipin- • · • « · « · * • · * • · · • * « · · « · « · • · -• · * ♦ · 107586 12 noilla, ;;o2ka sisälsivät 100 %, 20 ·ί, 5 % jsl 1 % DOPSia, mitattiin 'Ca24]i/2-arvoiksi 36 μΜ, 220 μΜ, 1,5 mM ja 3,6 mM (taulukko 1). Nämä tulokset sopivat varsin hyvin yhteen ΓCa2+]1/2-a-von 53 μΜ kanssa, joka on mitattu endoneksiinin II (=VAC) sitoutumiselle samamoolisiin PS/Pc-vesikkelien seoksiin (S). Adsorboituneen proteiinin maksimaalinen määrä (Tmax) ei riippunut membraanin DOPS-jakeesta ja oli noin 0,217 ug/'cm2. Puhtailla DOPC-kaksoiskerroksi11 a ei voitu todeta mitään adsorptiota 3 mM Ca2+-konsentraatioon asti.
VAC:n adsorptio koostumukseltaan erilaisiin fosfolipidi-kaksoiskerroksiin on esitetty kuviossa 5. Myös tästä käy selväksi, että puhtailla DOPC-kaksoiskerroksi1 la ei havaita käytännöllisesti katsoen mitään VAC:n adsorptiota. Myös VÄC:n adsorptio stearyyliamidiin (SA) on heikkoa.
Muilla kuin Ca2 + -kationei11 a suoritetuissa kokeissa todettiin, että VAC:n sitoutuminen fosfoiipideihin on voimakkaasti Ca2 + -spesifinen (kuvio 3). Cd24·, Zn2+, Mn2+ ja Co2+ edistivät sitoutumista vähäisesti; Ba2+:lla ja Mg2+:lla ei ollut mitään vaikutusta. Tämä kationien ominaisuus voidaan tietyllä tavalla korreloida niiden ionisäteisiin.
• · · • « · » · * .;··· Sinkkisynerqia • ♦ « · - .·, : Suuret sinkki-ionikonsentraatiot (1 mM) eristävät vähäisessä • · · määrin VAC:n adsorptiota (kuvio 3); konsentraatiol la 50 μΜ ei • ·« !..* ollut mitään vaikutusta adsorptioon. Yllättäen tämä konsentraa- • * » * • · * * tio vaikuttaa sitoutumiseen Ca24_:n läsnäollessa; kyseessä on synergia. fCa2+]i/2-arvo laski 8,6:sta 2,7 mMraan kaksoisker-roksilia, joissa oli vain 1 % D0PS:a ([Zn2+]=50 μΜ) (kuvio 4). 50 μΜ [Zn24-] on plasman normaaleissa sinkkikonsentraation • · V\ rajoissa.
• ·« * * « · * • · « • · * · # »·· • · · • · ··· • · • « • · · V · * « « , * 107586 13
Diagnostiset menetelmät 1. in vitro-diagnoosi a) VAC leimataan sinänsä tunnetulla menetelmällä iluore-seiiniryhmäl1ä, esimerkiksi f 1uoreseiini-isotiosyanaatin avulla (13)/ t ä x i a - a v a i.. a saadaan VAC-F X TC.
b) Potilaan verta kerätään muoviputkeen, joka sisältää plasman kalsiumkonsentraatiota alentamatonta antikoa-gulanttia (esim. hepariinia) ja VAC-?ITC:a.
c) Sekoittamisen jälkeen verisolut analysoidaan käyttämällä FACS-1aitetta (fluorescence activated ceil sorter). Tämä analyysi antaa spesifisiin soiutyyppeihin liittyvän fluoresenssin intensiteetin.
d) Analyysiprofiilit antavat verihiutaleiden, joihin on sitoutunut VAC-FITC:a, so. verihiutaleiden, joissa on kulkeutunutta PS:a, määrän ja siten esitromboottisen tilan olemassaolon. Tällä tavoin tämä terveydelle vaarallinen tila voidaan ennakolta todeta ja siten hoitaa ' »’·1; etukäteen.
* » • · ·1, 2. in νίχο.-diagnoosi * ·· • · * 1 a) VAC leimataan lyhytikäisellä isotoopilla, esimerkiksi « 1 ♦ ** ** -311:11 a sinänsä tunnetuilla menetelmillä; saadaan -3-I- b) i3iI-VAC appiikoidaan laskimonsisäisesti potilaalle.
c) Tietyn inkubointiajän jälkeen potilaalle tehdään koko » · .'Γ kehon tai osakehon skintigrafia. Radioaktiivisuuden ’/ jakaantumista voidaan seurata 1arge-field-of-view gamma- ; ί’ί «f· M1 « I·1
» I
t » * 1 1
• M
< · ' «··«
4 I
107586 14 kameral1 a .
d) Laskimonsisäiset kohdat, joihin on kerääntynyt 1311-VAC : a, ilmoittavat paikat, joihin tromboosi kehittyy.
Näin voidaan ryhtyä etukäteen sopiviin, trombooseja estäviin tai trombooseja parantaviin toimiin.
1. Radioaktiivinen leimaus 1.1 Esivalmistelut 1.1.1. Valmistetaan 500 mi 11imoolia/1 natriumfosfaatti-puskuria 24,4 g natrium-di-vetyfosfaattimonohydraattia liuotetaan 1 litraan kahdesti tislattua vettä ja lisätään liuokseen, jossa on 35,5 g di-natrium-vetyfosfaattia 1 litrassa kahdesti tislattua vettä, pH-arvoon 7,5.
1.1.2. Valmistetaan 20 mi 11imoolia/1 natriumvetyfosfaat-tipuskuria + 150 millimoolia/ natriumkloridia (eluointi-puskuri) 2,76 g natrium-divetyfosfaattimonohydraattia liuotetaan 1 litraan tislattua vettä ja lisätään liuokseen, jossa on —: 2,84 g di-natrium-vetyfosfaattia 1 litrassa kahdesti • · :·. tislattua vettä, pH-arvoon 7,2. Eluointipuskuri valmiste- • · · : taan lisäämällä 8,77 g natriumkloridia (150 millimoolia) 1 • · · I I litraan puskuria.
• · · • · · • · ··» *’ 1.1.3. Puhdistuspylvään tasapainoitus PD-10-pylväs (Sephadex G25, Fa. Pharmacia) tasapaino!tetaan noin 30 ml :11a eluointipuskuria.
• · · 1.1.4. Reaktioastian esikäsittely V 2 mg IODO-geniä (moolimassa: 32,09 g/mooli; kuvio 6) • · · « » « 1 « · · « · · • · 107586 15 liuotetaan 50 ml:aan dikloorimetaania (reinst). 200 μΐ tätä liuosta pipetoidaan 1,5 ml:n Sppendorf"astiaan ja sen jälkeen, liuotin haihdutetaan pois OT^C^ssa (lämpö levy) . Reaktioastian seinämään on näin laitettu tasaisesti 3 ug (1,85 x 10'2 millimoolia) ICDO-geniä.
1.1.5. Leimaamiseen käytetty VAC-a Lähdetään liuoksesta, joka sisältää 50 mg VAC-a:a 4 ml:ssa 20 mi 11imoolia/1 natriumfosfaattipuskuria + 150 millimoo-lia/1 KaCl, pH 7,2, laimennettu 1 ml :11a kahdesti tislattua vettä. VAC-a:n moolimassa: 34000 g/mooli.
1.1.5. Leimaamiseen käytetty J-125
Na125J:n (Dupont, NEN Products) kokonaisradioaktiivisuus kaiibrointipäivänä 67,3 MBq (=1,82 mCi). Ominaisaktiivisuus on 15,9 Ci/mg jodi = 1,98 kCi/millimooii 1/2 J2, joka vastaa 0,115 ug jodia (9,2 x 10~7 millimooli 1/2 J2). Aktiivinen NaJ on liuotettu 5,5 pl:aan 0,1 mooli/1 NaOH:a.
1.2 Jodaus
Kaikki työt suoritettiin isotooppivetokaapissa lyijylasi-suojien takana. 20 μΐ (= 200 pg) kohdassa 2.1.5 kuvattua • · : VAC-a-liuosta laitettiin IODO-genillä esikäsiteltvvn *:··· reaktioastiaan. Tämä suljettiin ja ravisteltiin 20 minuut- # tia huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen reaktioliuas lai- : tettiin pipetillä esivalmistettuun PD-10-py1vääseen (kts.
; 2.1.3.). Reaktioastia huuhdeltiin vielä 500 ulilla eluoin- • · · I..* tipuskuria (kts. 2.1.2.) ja myös tämä liuos laitettiin PD- * 10-pylvääseen. Tällöin ulosvirtaava eluaatti heitettiin pois.
1.3 Puhdistaminen '·/·· VAC-α [125J] erotettiin vielä vapaasta 125j/jja i25j:sta :T: lisäämällä kulloinkin 0,5 ml eluointipuskuria (kts. 2.1.2.) V 2 minuutin välein. 12 jakeen jälkeen tämä puhdistusvaihe • » » ·»· • « · • · * · • · · • » • · • · · • · · ♦ · # · 107586 16 oli tapahtunut loppuun. Jakeiden suhteellinen aktiivisuus-pitoisuus mitattiin 1aboratoriomonitori11 a (GMZ) (kuvio 2).
Jakeet 6 ja 7 puhdistettiin, täytettiin eiuointipuskuri11 a tarkalleen 2,0 ml:ksi, jaettiin 100 μΐ osiin ja pakastettiin -20°C:een. Aine oli näissä erissä valmiina käytettäväksi analyysien tekoon ja kehitystyöhön.
2. Analyyttinen osa 2.1 Pitoisuuden määritys
Kromogeenisel1ä substraattimenetelmäl1ä mitattiin VAC-a-pitoisuudeksi 71,8 ug/2,0 ml liuosta.
2.2 Radioaktiivisuuden määrittäminen 2.2.1. Kokonais radioaktiivisuus
Yhden 100 μΐ erän sulattamisen jälkeen pipetoitiin 50 μΐ tätä [125] VAC-a-liuosta 950 μ1:33η epäaktiivista VÄC-α- liuosta (kts. 2.1.5.), sekoitettiin hyvin ja tästä otettiin kulloinkin 50 μΐ LSC-laskimessa (3eckman) tapahtuvaa mit- tausta varten. 24,5 MBq (= 0,663 mCi) / 2,0 ml kokonais- ' : liuosta.
• · • · • · · . 2.2.2. Spesifinen aktiivisuus • · · ’· Pitoisuuden määrityksestä ja kokonaisradioaktiivisuudesta • · saatiin spesifiseksi aktiivisuudeksi: • 1 1 ’.· · 341,5 MBq/mg = 11,61 TBq/mi 11 imool i (9,23 mCi/mg = 313,8 Ci(mi 11imooli) 2.2.3. Proteiiniin sitoutuneen radioaktiivisuuden määritys : TCA-saostuksel 1 a 100 pl:aan VAC-α-1 iuosta lisättiin 50 μΐ 3-prosenttista *· · BSA-liuosta ja 150 μΐ 40-prosenttista vesipitoista tri- • · · » · · «·( · » · • · · • · • · · • · 107586 17 kloorietikkahappoa, ravisteltiin hyvin ja annettiin seistä 60 minuuttia kylmäkaapissa. Muodostunut sakka poistettiin sentrifugoimal1 a. Supernatantista otettiin tasamäärät LSC-1askimeen mittausta varten.
Tulos: 99,3 % radioaktiivisuudesta oli saostuvaa.
2.2.4. Radioaktiivisuussaanto Käytetystä 67,3 MBq:sta löydettiin uudelleen 24,5 MBq VAC-a:ssa. Aktiivisuussaanto oli siten 36,4 %.
2.3 Modifiointiaste
Spesifisestä aktiivisuudesta ja käytetystä epäaktiivisen VAC-a:n määrästä laskettiin, että tilastollisesti joka 6. VAC-a-molekyyli oli leimautunut 125J-atomi11 a.
3.4 Identtisyys ja puhtaus Käyttämällä SDS-PAGE:a (gradienttigeeli 7 - 17 %, ei-pelkistävissä olosuhteissa) ja sen jälkeen arvioimalla geeli hopeavärjäyksellä (Oakley-menetelmä), autoradio-grafoimalla ja detektoimalla lineaarianalysaattorilla (Berthold LB 282, sondi LB 2820) (kuvio 3) tutkittiin aine *:··· käytettyyn VAC-a:an verrattuna. Aineet olivat identtisiä, dimeerisen tuotteen osuus oli selvästi pienempi kuin • : epäaktiivisi 1 le erille hyväksytty 8 % raja.
« · · • · • · • · · • · ·
Piirustuksissa: * · t • · 1
Kuvio 1: VAC:n vuorotellen tapahtuva adsorptio ja desorptio fosfolipidipinnalle Ca2+-konsentraation nostamisen tai alentamisen indusoimana. VAC:n (1 ug/ml) adsorptio 20 % DOPS/80 % • · DOPC fosfoiipidi-kaksoiskerrokseen. Ca2+:n lisäys (3,4,6 mM) on merkitty ^ :11a tai ^:lla.
« · « · « • « · • · · • 1 « « · • · • · • «· • · 107586 18
Kuvio 2: Fosfoiipidikoostumuksen ja Ca2+-konsentraation vaikutus VAC:n adsorptioon fosfoiipidipinnal1 e. o 100 % DOPS; o 20 % DOPS; Δ 5 % DOPS; O 1 % DOPS; 100 % DOPC; kaikki seokset täydennettiin DOPC:lla [VAC] = 1 ug/ml.
Kuvio 3: Kahdenarvoisten ionien vaikutus VAC:n adsorptioon. VAC:n adsorptio kaksoiskerroksiin, joissa oli 20 % DOPS:a ja 80 % DOPC:a, annettujen ionien läsnäollessa (1 tai 3 mM).
[VAC] = 1 ug/ml.
Kuvio 4: Zn^in synergistinen vaikutus VAC:n Ca2+-riippuvaan adsorptioon fosfolipidipinnoille. Mitattiin Ca2+:n vaikutus VAC:n adsorptioon (1 % DOPS ja 99 % DOPC), kun mukana oli 50 μΜ Zn2+:a. [VAC] = 1 pg/ml.
Kuvio 5: VAC:n adsorptio koostumukseltaan erilaisiin fosfoli-pidi-kaksoiskerroksiin. VAC:n adsorptio dioleoyylifosfatidyy-liseriiniin (DOPS), kardiolipiiniin (CL) ja dioleoyylifos-fatidyylietanoliamiiniin (DOPE) joko sellaisenaan tai sekoitettuna 80 % kanssa seuraavia: dioleoyylifosfatidyylikoliini (DOPC), dioleoyylifosfatidyyliglyseroli (DOPG), fosfatidyyli-inositoli (PI) ja stearyy1iamiini sekoitettuna 80 % kanssa : DOPCra tai puhtaaseen DOPC:an. [VAC] = 1 ug/ml; [Ca2+] = 3 mM.
• «
Kuvio 6: 1,3,4,6-Tetrakloridi-3o-6a-difenyyli-qlykoluriili : (IODO-GEN) « · ♦ • · * » • · · • · · i..1 Kuvio 7: Radioaktiivisuuden jakaantuminen jakeisiin 1-12.
• # ♦
Kuvio 8: Radioaktiivisuuden jakaantuminen 1ineaarianalysaatto-rissa.
• · • · · • ·« • · ·«· • · · « · · » • · • · · • « · • t · • · · • · • · • · · * · • · • « · • i» • 1 · · · • « 107586 19
Taulukko 1:
Pii levyjen1päälle laitettujen fosfoiipidi-kaksoiskerrosten arviointi.
14-poPS film Fosfoiipidien Aktiivisuus DOPS-jakeet balance-mene- määrä (ellipso- mitattu telmällä metrisesti) % pg/cm2 DPM % 2 0,396 453 1,9 5 0,409 1133 4,5 20 0,401 5006 20 100 0,442 27174 99
Laskettava seos vietiin "film balance"-laitteeseen. Kaksois-kerroksen määrä mitattiin ellipsometrisesti ja 14C-leimatun DOPS:n aktiivisuus mitattiin Beckmann 6S 3801 tuikelaskimella (standardipoikkeama <2 %) ja korjattiin taustasäteilyn suhteen (60 DPM). DOPS-jakeet kaksoiskerroksessa laskettiin yhtälöllä 2: ·#· ♦ · 1 • · · Määrä(pg/cm2) x ominaisaktiivisuus (DPM.g-1) • · ... ... Jae .=__ • · :t " Aktiivisuus (DPM) x pinta-ala (cm2) • · » • ♦ 1 • · • · *.**: DOPS:n spesifinen aktiivisuus oli 100.000 DPM.g-1, ja fosfoli- • · · : pideillä päällystetty pinta 0,62 cm2.
« · · • · ♦ • · • · · « · « « · · • « • · « * « « • · · • · · • « • · · « · • · # · 4 • · # • · n 107586 20
Taulukko 2:
Puolitettu" arvo maksimaaliselle VAC:n sitoutumiselle eri fosfoiipidipinnoi1 la.
lipidi (mol%/rnol%) Fmaz ± 3.D. [C3“+J , ,---3 . o .
(pg/cm“) mM
DOPS (100) 0,195 ± 0,025 0,02a ± 0,012 DOPS / DOPC (20/80) 0,222 ± 0,014 0,22 ±0,05 DOPS / DOPC ('5/95) 0,229 ± 0,004 1,5 ± 0,5 DOPS / DOPC (1/99) 0,234 ± 0,007 3,5 ± 2,5
Kardiolipiini / DOPC (20/30) 0,209 ± 0,011 0,029 ± 0,022 DOPG / DOPC (20/80) 0,212 ± 0,003 0,155 ± 0,027 PI / DOPC (20/80) 0,221 ± 0,005 0,47 ± 0,05 DOPA / DOPC (20/80) 0,207 ± 0,006 0,75 ± 0,25 DOPE / DOPC (20/80) 0,213 ± 0,003 0,86 ± 0,21
Sfingomyeliini / D0PC (20/80) 0,225 ± Q, 014 7 ±3
DOPC (100) n.d. >30 mM
Maksimaalinen VAC-adsorptio (Tmax) annetuille fosfolipidipin- *:··· noille sekä se kalsiumkonsentraatio, joka puolittaa maksimaa- :·, lisen VAC:n sitoutumisen [Ca2 + ]i/2/ on annettu vähintään kolmen • · # j eri kokeen keskiarvoina yhdessä vastaavien standardipoikkeamien • · · I ! kanssa.
• « i n.d. = ei määritetty.
• · > « · « • · • · 4 • *« • · • · · • « « • · « e • · • « *· • * ·
• M
• · · ··· ♦ ♦ • · • · · • · ···»* 107586 21
Kiriallisuusviitteet 1. Confurius, P & Zwaal, R. F. A. (1977) Biochim.
Biophys. Acata 488, -42.
2. Corsel, J. W., Willems, G. M., Kop, J. M. M.,
Cuypers, P. A. & Hermens, W. Th. (1986) J. Colloid Interface Sci. 111, 544-554.
3. Cuypers, P. A., Corsel, J. W., Janssen, M. P., Kop, J. M. M.,.Hermens, W. TH. & Hemker, H. C. (1983) J.
Biol. Chem. 258, 2426-2431.
4. McCrackin, F. L., Passaglia, E., Strömberg, R. R· & Steinberg, H. L. (1963) J.Res.Nat.Bur. Stand. Sect.A 67, 3-377.
5. Kop, J. M. M., Cuypers, P. A., Lindhout, Th.,
Hemker, H. C. & Hermens, W. Th. (1984) J. Biol.
Chem. 259, 13993-13998.
6. Schlaepfer, D. D., Mehlman, T., Burgess, W. H. &
’ ... Haigler. H. T. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
♦ · · 84, 6078-6082.
♦ r 9 · ·♦· • 4 • · ί *' 7. Op den Kamp, J.A. F. Ann. Rev. Biochem. 1979, 48: V·! 47-71.
• · * » » • ·ν • ♦ 8. Zwaal, R.F.A. Biochim. Biophys. Acta 1978, 515: 163-205.
9. Jackson, C.M. ja Nemerson, Y. Ann. Rev. Biochem.
. . 1980, 49: 765-811.
• · * ' * · • * • · » * « • · ' • t • .·* ♦ • ·· ♦ 4 t ··» • · ♦ 9 4 4 » «· « · « « 22 107586 10. Bevers, E.M., Comfurius, P. ja Zwaal, R.F.A.
Biochim. Biophys. Acata 1983, 736: 57-66.
11. Rosing, J., Bevers, E.M., Comfurius, P., Hemker H.C. can Dieijen, G., Weiss, H.J. ja Zwaal, R.F.A. Blood 1985, 65: 1557-1561.
12. Fraker P.J., Speck, J.C., Biochem. Biophys. Res. Comm. 80./ 849-857, 1978.
13. Reisher, J.I. & Orr, H.C., Anal. Biochem. 1968, 26. 178-179.
• · ·
• · I
> • » • · • · ♦ ft • · • * · • · · • · » · • I · » ·« * · « · · « 9 « « · · • · « · · » * • · • » · « t * » f · « · · • * ♦ • · · I») ti» • * • « « · • ·« * · ♦ *

Claims (14)

107586
1. Anneksiinien ryhmään kuuluvan antikoaguloivan polypeptidin käyttö, tunnettu siitä, että se on varustettu detektoivalla markerilla keinona erottaa fosfa- 5 tidyylikoliini ja fosfatidyyliseriini toisistaan.
2. Anneksiinien ryhmään kuuluvan antikoaguloivan polypeptidin käyttö tunnettu siitä, että se on varustettu detektoivalla markkerilla keinona diagnosoida esitromboottinen tila, hemostaattisen järjestelmän häiriintymisen tai aktivoi- 10 tumisen ja/tai trombin alkamiskohta.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen polypeptidin käyttö, tunnettu siitä, että se on VAC.
4. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 3 mukainen polypeptidin käyttö, tunnettu siitä, että se on varustettu VAC-α tai VAC-β.
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 4 mukainen polypeptidin käyttö, tunnettu siitä, että fluoresointileimaukseen käytetään ensisijaisesti fluoreseiini-isotio-20 syanaattia, tai radioaktiiviseen leimaamiseen halogeenin, teknetiumin, lyijyn, • · * . elohopean, talliumin tai indiumin radioisotooppia, erityisen mielellään 131 l:a tai .. 125l:a, tai että käytetään paramagneettista kontrastiainetta. « « • · · * • · • · · • · · l'
| 6. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 5 mukainen polypeptidin käyttö, tunnettu • · · .·;·] 25 siitä, että aine sisältää lisäksi apuainetta. 111
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen polypeptidin käyttö, tunnettu siitä, että « ♦ - .···. apuaineena käytetään fysiologista keittosuolaliuosta, arginiinia ja/tai fosfaatti- »«· .1 . puskuria. • · · • ♦ ♦ • 30 • ♦ • ♦ • · · • · • « 1 « · · • · · • · · • · · • · 107586
8. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 7 mukainen polypeptidin käyttö, tunnettu siitä, että aine sisältää lisäksi antikoagulanttia, ensisijaisesti hepariinia, joka ei alenna plasman kalsiumkonsentraatiota.
9. Menetelmä esitromboottisen tilan toteamiseksi, tunnettu siitä, että a) tutkittavan veren kanssa sekoitetaan kehon ulkopuolisesti anneksiinien ryhmään kuuluvaa antikoaguloivaa polypeptidiä, jossa on detektoiva mark-keri, ja b) analysoidaan spesifisiin solutyyppeihin liittyvä markkeeraus. 10
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypepti-di on VAC.
11. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 15 detektoitavana markkerina käytetään fluoreseiiniryhmää tai radioisotooppia, ensisijaisesti radioisotooppeja 125l, 123l, 1311, 111 In, 99mTc, 203Pb, 198Hg tai 201TI.
12. Jonkin patenttivaatimuksen 9-11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisäksi lisätään apuainetta. 20
• · · • · ’·* [ 13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että apuai- .! * neena käytetään fysiologista keittosuolaliuosta, arginiinia ja/tai fosfaatti pusku- V" ria. • · · • « · • · • · • · · Φ · · !..* 25
14. Patenttivaatimuksen 12 tai 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että φ · · 17 * · · lisäksi käytetään antikoagulanttia, ensisijaisesti hepariinia, joka ei alenna plasman kalsiumkonsentraatiota. • · • · • · « · · • · · • · • · · • · • · • · · • · · « · φ φ φ φ φ φ 107586
FI922719A 1989-12-27 1992-06-12 Antikoagulantin käyttö diagnostisena aineena FI107586B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3942988 1989-12-27
DE3942988 1989-12-27
PCT/EP1990/002257 WO1991009628A1 (de) 1989-12-27 1990-12-19 Verwendung eines antikoagulant als diagnostikum
EP9002257 1990-12-19

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI922719A0 FI922719A0 (fi) 1992-06-12
FI107586B true FI107586B (fi) 2001-09-14

Family

ID=6396455

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI922719A FI107586B (fi) 1989-12-27 1992-06-12 Antikoagulantin käyttö diagnostisena aineena

Country Status (15)

Country Link
EP (2) EP0806670B1 (fi)
JP (1) JP3135261B2 (fi)
KR (1) KR0181520B1 (fi)
AT (2) ATE164083T1 (fi)
AU (1) AU642202B2 (fi)
CA (1) CA2070647C (fi)
DE (3) DE4040817A1 (fi)
ES (1) ES2113372T3 (fi)
FI (1) FI107586B (fi)
HU (2) HUT61491A (fi)
NO (1) NO305276B1 (fi)
NZ (1) NZ236620A (fi)
PT (1) PT96385B (fi)
WO (1) WO1991009628A1 (fi)
ZA (1) ZA9010319B (fi)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5627036A (en) * 1989-12-27 1997-05-06 Boehringer Ingelheim International Gmbh Use of an anticoagulant as a diagnostic agent
ATE210464T1 (de) * 1992-06-09 2001-12-15 Neorx Corp BIOTIN-DOTA KONJUGATE UND DEREN VERWENDUNG IN ßPRETARGETINGß VERFAHREN
WO1995014788A1 (en) * 1993-11-24 1995-06-01 University Of Washington Blood coagulation retardants and devices
US20030220233A1 (en) 1994-01-24 2003-11-27 Neorx Corporation Radiolabeled annexins
CA2180555C (en) * 1994-01-24 2004-12-14 Sudhakar Kasina Radiolabeled annexins
US5968477A (en) 1994-01-24 1999-10-19 Neorx Corporation Radiolabeled annexin conjugates with hexose and a chelator
JP3812680B2 (ja) * 1994-03-16 2006-08-23 マリンクロッド・インコーポレイテッド 放射性医薬用途のペプチド類およびタンパク質類の安定化
JP2824155B2 (ja) * 1994-04-11 1998-11-11 ネクシンズ・リサーチ・ベー・ブイ 試料中の又は試料からアポトーシス細胞を検出し及び／又は場合により定量し及び／又は分離するための方法
WO1995034315A1 (en) * 1994-06-16 1995-12-21 Neorx Corporation Radiolabeled annexin-galactose conjugates
ATE240749T1 (de) * 1994-06-16 2003-06-15 Neorx Corp Radioaktivmarkierte annexin-galaktose konjugate
JPH10512852A (ja) * 1994-12-07 1998-12-08 ネオルクス コーポレイション 放射性標識化アネキシン−ガラクトースクラスター複合体
US5886143A (en) * 1994-12-07 1999-03-23 Neorx Corporation Hepatic-directed compounds and reagents for preparation thereof
EP0799050B1 (en) * 1994-12-07 2004-08-11 Neorx Corporation Radiolabeled annexin-galactose cluster conjugates
US5955605A (en) * 1995-02-21 1999-09-21 Neorx Corporation Biotinidase resistant biotin-DOTA conjugates
FR2736197B1 (fr) * 1995-06-29 1997-09-12 Univ Paris Curie Nanoparticules magnetiques couplees a de l'annexine et leur utilisation

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4427646A (en) * 1981-04-02 1984-01-24 Research Corporation Use of radiolabeled peptide derived from crosslinked fibrin to locate thrombi in vivo
US4455290A (en) * 1981-04-02 1984-06-19 Research Corporation Inhibition of fibrin polymerization by a peptide isolated from fibrin Fragment D1
US4820505A (en) * 1985-04-04 1989-04-11 Scripps Clinic And Research Foundation Detection of activated platelets with antibodies to thrombospondin
PT87083B (pt) * 1987-03-28 1992-07-31 Boehringer Ingelheim Int Processo para a preparacao de uma proteina anticoagulante vascular, de adn que codifica para esta proteina e de composicoes farmaceuticas que a contem
DE3810331A1 (de) * 1988-03-26 1989-10-05 Boehringer Ingelheim Int Monoklonale vac-antikoerper

Also Published As

Publication number Publication date
KR920703121A (ko) 1992-12-17
HU9202149D0 (en) 1992-10-28
EP0806670A2 (de) 1997-11-12
WO1991009628A1 (de) 1991-07-11
CA2070647C (en) 2001-04-10
KR0181520B1 (ko) 1999-05-01
NO305276B1 (no) 1999-05-03
AU642202B2 (en) 1993-10-14
NO922528D0 (no) 1992-06-26
NZ236620A (en) 1997-03-24
EP0509026A1 (de) 1992-10-21
PT96385A (pt) 1991-10-31
DE59010815D1 (de) 1998-04-23
FI922719A0 (fi) 1992-06-12
EP0509026B1 (de) 1998-03-18
PT96385B (pt) 1998-06-30
EP0806670B1 (de) 2009-04-22
ATE164083T1 (de) 1998-04-15
AU7071191A (en) 1991-07-24
ES2113372T3 (es) 1998-05-01
HU209650B (en) 1994-09-28
ATE429644T1 (de) 2009-05-15
DE4040817A1 (de) 1991-07-04
EP0806670A3 (de) 1997-12-10
JP3135261B2 (ja) 2001-02-13
JPH05502877A (ja) 1993-05-20
ZA9010319B (en) 1992-08-26
DE59010946D1 (de) 2009-06-04
CA2070647A1 (en) 1991-06-28
NO922528L (no) 1992-08-26
HUT61491A (en) 1993-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5955437A (en) Use of an anticoagulant as a diagnostic agent
FI107586B (fi) Antikoagulantin käyttö diagnostisena aineena
DiDonato et al. Function and distribution of apolipoprotein A1 in the artery wall are markedly distinct from those in plasma
Shaikh et al. Quantitative studies of transfer in vivo of low density, Sf 12-60, and Sf 60-400 lipoproteins between plasma and arterial intima in humans.
Gregg et al. Abnormal in vivo metabolism of apolipoprotein E4 in humans.
Hwang et al. Hepatic uptake and degradation of unilamellar sphingomyelin/cholesterol liposomes: a kinetic study.
Vigushin et al. Metabolic and scintigraphic studies of radioiodinated human C-reactive protein in health and disease.
Murakami et al. 18 F-labelled annexin V: a PET tracer for apoptosis imaging
Biere et al. Amyloid β-peptide is transported on lipoproteins and albumin in human plasma
RU2228765C2 (ru) Способ визуализации смерти клеток в области тела млекопитающего субъекта in vivo
Hwang et al. Fate of lipid vesicles in vivo: a gamma-ray perturbed angular correlation study.
Lahorte et al. Biodistribution and dosimetry study of 123I-rh-annexin V in mice and humans
Brzoska et al. Imaging analyses of coagulation-dependent initiation of fibrinolysis on activated platelets and its modification by thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor
Assmann et al. Apoprotein A metabolism in Tangier disease
Dekker et al. MBP–annexin V radiolabeled directly with iodine-124 can be used to image apoptosis in vivo using PET
Glueck et al. Abnormal calcium binding associated with hyperglobulinemia, clotting defects, and osteoporosis: a study of this relationship
Furmaniak-Kazmierczak et al. Protein S enhances C4b binding protein interaction with neutrophils
England et al. Studies on the transcobalamins
Scott et al. The rapid differentiation of type IIb von Willebrand's disease from platelet-type (pseudo-) von Willebrand's disease by the “neutral” monoclonal antibody binding assay
McLeish et al. Role of intracellular calcium in priming of human peripheral blood monocytes by bacterial lipopolysaccharide
Esmon et al. Lupus anticoagulants, thrombosis and the protein C system
Verkman et al. Water and nonelectrolyte permeability in brain synaptosomes isolated from normal and uremic rats
Wardell Drug displacement from protein binding: source of the sulphadoxine liberated by phenylbutazone
Nigam et al. Serum and platelet sialic acid in acute myocardial infarction
Clarke et al. Stability of plasma low density lipoprotein with abnormal glycolipid composition from patients with Fabry's disease