PT96385B - Processo para a preparacao de um polipeptido anticoagulante da familia das anexinas e de meios de diagnostico que o contem - Google Patents

Processo para a preparacao de um polipeptido anticoagulante da familia das anexinas e de meios de diagnostico que o contem Download PDF

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Description

Descrição referente ã patente de invenção de BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GMBH, alemã, industrial e comercial, com sede em D-6507 Ingelheim am Rhein, Repúbli. ca Federal Alemã, (inventor: Dr. Christiaan Peter Maria Reutelings^ perger, residente na República Fe deral Alemã), para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM POLIPEPTIDO AN TICOAGULANTE DA FAMÍLIA DAS ANEXI NAS E DE MEIOS DE DIAGNÓSTICO QUE
O CONTEM.
DESCRIÇÃO
O objecto da presente invenção são agen tes, especialmente anexinas, gue estão marcados com uma substân cia detectãvel, bem como a sua utilização para fins de diagnóstico.
O sangue consiste em células especiais não ligadas, que se encontram dispersas num meio fluído plasmático. O conteúdo das células está separado do plasma envolvente pelas chamadas membranas de plasma. Estas membranas são constituídas por fosfolípidos, na forma de uma camada dupla, e por proteínas associadas que penetram parcialmente nestas camadas duplas ou que sobressaem delas.
Os diversos fosfolípidos não estão distribuídos ao acaso sobre a camada exterior e a camada interior da camada dupla, pelo contrário, são mantidos pelas células nu1
ma configuração assimétrica (7,8). Enquanto que a fosfatidilcolina (PC) e a esfingomielina (SPH) são as espécies dominantes da camada exterior, a fosfatidilserina (PS), a fosfatidiletanolamina (PE) e o fosfatidilinositol (PI) localisam-se predominan temente na camada interior, voltada para o citosol. Esta assime tria, consumidora de energia, reveste-se de extraordinária importância fisiológica. As PC e SPH são as espécies mais fortemente inertes da família dos fosfolípidos e possuem, em flagran te contraste com as outras espécies, um comportamento extraordi_ nariamente neutro em relação aos componentes do plasma. Esta inércia reactiva da camada exterior, relativamente às proteínas do plasma, é uma exigência absoluta para se garantir o estado fluído do sangue. As proteínas especiais do plasma que pertencem ã cascata de coagulação do sangue, os chamados factores de coagulação, podem nomeadamente transformar o estado líquido do sangue num estado sólido se forem activados (9). Estes factores de coagulação podem ser activados por fosfolípidos, tais como a fosfatidilserina.
Em muitos casos, por exemplo depois da lesão de um vaso sanguíneo, é necessário, ou mesmo vital, que os factores de coagulação sejam activados. Numa tal situação uma célula sanguínea especial, a plaqueta, pode modificar a sua assimetria de membrana através de mecanismos de activação que transportam a fosfatidilserina para a camada exterior, desencadeando-se assim a activação dos factores de coagulação (10).
Esta modificação, obedecendo a um plano fisiológico, da composição de fosfolípidos da camada exterior plasma-membrana das plaquetas sanguíneas, tem uma grande importância fisiológica para a hemostase, como é evidenciado por exemplo pelo síndroma de Scott (11).
à fisiologia pertence também, porém, a patologia; assim, a hemostase do sangue, em alguns casos, pode derivar também de um estado patológico, como é o caso em trombo ses arteriais, das coronárias e venosas.
Estas perturbações hemostãticas são, na sua maioria, idiopáticas e tornam impossível aos médicos prever o seu aparecimento e desenvolver terapias profiláticas.
objecto da presente invenção era, *áJla*i!á4áâáMá»i!MjSBaBy»^ pois, pôr à disposição meios auxiliares que permitam reconhecer prematuramente as perturbações hemostáticas.
Ao contrário do desenvolvimento dos sin tomas, o desenvolvimento das perturbações na maior parte dos ca sos é lento. Durante esta fase de progressão sem sintomas, o chamado estado pró-trombótico, evolui localmente uma activação contínua do sistema de coagulação. Associada a esta activação local está o aparecimento das plaquetas na periferia, as quais se encontram num estado prematuro de activação. Estas plaquetas já começaram, por conseguinte, a modificação da composição de fosfolípidos da camada exterior da sua membrana plasmãtica. A fosfatidilserina está ligada à camada exterior. Os agentes auxi liares que permitam diagnosticar este chamado estado pró-trombó tico assumem pois uma grande importância clínica.
São também objecto da presente invenção os meios auxiliares que permitam distinguir especificamente a fosfatidilserina da fosfatidilcolina.
Além do aparecimento de plaquetas fraca mente activadas na periferia, acumulam-se plaquetas completamen te activadas onde as paredes dos vasos sanguíneos se encontram numa condição patológica. Esta localização é considerada como desencadeando a activação do sistema hemostático. A localização deste sítio patológico, assim como do trombo que aqui se forma, reveste-se da maior importância terapêutica. São pois também ob jecto da presente invenção agentes com os quais se possam localizar os pontos de partida da activação do sistema hemostático e/ou de um trombo.
mecanismo da coagulação sanguínea é representado como uma cascata de reacções enzimáticas, em cujo terminus se encontra a formação da trombina que transforma finalmente o fibrinogênio em fibrina. Diversas reacções pró-coagu lantes, como por exemplo a activação da pró-trombina pelos factores Xa e Va, são catalizadas por fosfolípidos superficiais aos quais se ligam os factores de coagulação.
No caso de proteínas que se ligam aos fosfolípidos e que interferem com os processos dependentes dos fosfolípidos superficiais, existe uma família que na sua liga2+ ção dependente do Ca dos fosfolípidos.
A esta família, que também ê designada por anexinas, além de lipocortina I, calpactina I, proteína II, lipocortina III p67-calelectrina, pertence também a proteína an ti-coagulante vascular (VAC) e as IBC, PAP, PAPI, PP4, endonex_i na II e lipocortina V.
As características estruturais globais das anexinas são de facto os fundamentos para as suas proprieda des idênticas de Ca e de ligaçao de fosfolípidos. Se bem que estas propriedades gerais sejam válidas para todas as anexinas, existe uma individualidade nítida no que se refere à sua afinidade para Ca e às diversas espécies de fosfolípidos.
As funções fisiológicas das anexinas re ferem-se a processos associados às membranas. 0 mecanismo básico da acção inibidora da coagulação da VAC foi descrito como uma inibição da capacidade catalítica dos fosfolípidos pela ligação da VAC ã sua superfície, impedindo-se deste modo a ligação do complexo promotor da coagulação â sua superfície.
Os estudos de ligação mostraram que a VAC se associa reversivelmente, dependente do cálcio, com fosfo lípidos pró-coagulatõrios.
2+
Outros catioes bivalentes da serie Cd
2+ 2+ 2+ - ~ Zn , Mn e Co também influenciam positivamente a associação, ~ n 2 + mas nao no mesmo grau que o Ca
Além disso descobriu-se, surpreendentemente, que a adsorção de VAC aos fosfolípidos na presença de
2+ 2+ iões Ca e Zn , é bastante influenciada positivamente. Surpre endentemente, verificou-se que a VAC se liga à fosfatidilserina para concentrações de cálcio no plasma, mas não à fosfatidilcolina e à esfingomielina. A VAC reconhece, e liga-se pois especi. ficamente, às plaquetas periféricas com PS na sua camada de mem brana externa. Além disso a VAC reconhece também os sítios espe^ cíficos no sistema vascular que expõem o PS ao sangue,
Esta diferenciação no caso dos fosfolípidos torna a VAC, e igualmente as outras anexinas, num reagente ideal para se reconhecer prematuramente o chamado estado pró -trombótico, que se desenvolve como foi descrito acima.
Através da presente invenção são revela dos meios com os quais, surpreendentemente, é possível pela
vez identificar o estado pró-trombótico do sistema vascular. Es. ta diagnose é possibilitada pela especificidade de substâncias e de agentes que estão em condições de reconhecer o estado pró-trombótico das plaquetas, modificado relativamente ao estado normal. Como este estado se distingue do estado normal das plaquetas pelo facto de a camada exterior possuir apenas fosfatidilserina das plaquetas pró-trombóticas, é em princípio apropriado para utilização deste princípio de acordo com a invenção um agente que possa distinguir especificamente a fosfatidilseri^ na da fosfatidilcolina. Os meios utilizáveis de harmonia com a invenção caracterizam-se pela sua especificidade â fosfatidilse rina, que é determinável pelos ensaios de ligação indicados nes ta especificação.
A utilização desta especificidade dos meios de acordo com a invenção torna também possível, adicional^ mente, localizar o ponto de partida para a activação do sistema hemostãtico e/ou do trombo.
Com a presente invenção revelam-se pois pela 1§ vez, meios auxiliares que permitem, através da diagnose prematura de um estado de risco de saúde, provavelmente susceptível a desenvolver-se, recorrer a medidas terapêuticas apropriadas .
Os meios preferidos de acordo com a invenção são polipeptídeos anti-coagulantes, desde que possuam a necessária especificidade ao fosfolípido fosfatidilserina.
É especialmente preferida a família das anexinas, particularmente a VAC.
Para se poderem utilizar, como meios de diagnóstico, os agentes de acordo com a invenção, especialmente a VAC ou as outras anexinas, são os mesmos marcados de forma co nhecida por si. Como marcador apropriado refere-se, por exemplo a marcação com grupos fluorescentes, ou a marcação radioactiva.
Como marcador de fluorescência utilizável vantajosamente cita-se o isotiocianato de fluoresceína, e como marcador radioactivo utilizável vantajosamente mencionam-se os radioisótopos dos
131 125 halogéneos, especialmente os do iodo, por exemplo I ou I, * 203 ou também chumbo, mercúrio, tálio, tecnécio ou índio ( Pb, 198Hg, 2O1T1, 99mTc, 111In).
isotiocianato de fluoresceína (Serva) pode ser utilizado de forma conhecida por si (13) para a marcação de VAC.
Também é possível realizar-se a marcação com um reagente de contraste paramagnético que seja detectá vel num sistema MRI (MAGNETIC RESONANCE IMAGING - formação de imagem por ressonância magnética). Podem ser utilizados gadolínio, cobalto, níquel, manganêz ou complexos de ferro, com os quais podem ser preparados conjugados como agentes de diagnõsti co que são detectãveis por um sistema MRI. Nestes sistemas utiliza-se um campo magnético de forte intensidade para orientar os vectores do spin nuclear dos ãtomos no organismo. Em seguida o campo é perturbado, regressando deste modo os núcleos ao seu estado inicial. Este processo é observado e fixado.
polipeptídeo anticoagulante, assim marcado com um marcador detectãvel, é então administrado por via intraarterial ou intravenosa. A quantidade aplicada é escolhida de modo que seja suficiente para a medição subsequente, depois do necessário período de incubação.
Para comprovar um estado prótrombótico adiciona-se extracorporalmente ao sangue ensaiado o polipeptídeo ou o agente, marcados de acordo com a invenção, eventualmen te na presença de um outro agente anticoagulante que não reduza a concentração de cálcio no plasma, como por exemplo heparina, analizando-se então de seguida a marcação associada aos tipos especiais de células.
polipeptídeo marcado de acordo com a invenção pode ser utilizado tanto na forma de uma solução aquosa isotónica ao sangue, como também com substâncias auxiliares para os fins da invenção. Como substâncias auxiliares podem ut_i lizar-se neste caso por exemplo TWEEN 80, arginina, tampão de fosfato e substâncias conservantes fisiologicamente aceitáveis. Diversas outras substâncias são bem conhecidas dos especialistas e podem igualmente ser utilizadas.
Para a realização da marcação radioacti va utiliza-se por exemplo o método do iodogénio conhecido (12) ou o método corrente da cloramina T. Devido ao seu período de semi-vida de 8 dias, para a diagnose in vivo é recomendável
131
I. 0 agente marcado radioactivamente e tomado em solução aquosa isotónica ao sangue; depois da esterilização por filtração é injectado. A cintilografia de corpo inteiro é realizada
131 com uma camara gama, por exemplo para I, 1, 2, 4 e 7 dias de pois da injecçâo.
Além das formas genuínas de anexina são também utilizáveis formas modificadas para a utilização de acor do com a invenção. Recomendam-se especialmente os mutantes descritos na Especificação EPA 0 293 567. Além destes são também utilizáveis os fragmentos, ou os derivados modificados quimicamente, das anexinas que possuam especificidade relativamente aos fosfolípidos fosfatidilserina/fosfatidilcolina e, consequen temente, possam reconhecer o estado prótrombótico das plaquetas participantes.
Os objectivos da presente invenção são em pormenor:
- um polipeptídeo anticoagulante da família das anexinas, de preferência VAC, que está dotado de um marcador detectável. um polipeptídeo anticoagulante que contém como marcador detectãvel a marcação por fluorescência, de preferência isotiocianato de fluoresceina, um radioisótopo de um halogéneo de tecnécio, de chumbo, de mercúrio, de tálio ou de índio, especialmente de preferência os radioisótopos ou ^^^1, ou um reagente de contraste paramagnético.
- um polipeptídeo anticoagulante como foi descrito acima, para a diferenciação de fosfatidilserina e de fosfatidilcolina.
um polipeptídeo anticoagulante como foi descrito acima, para utilização como agente de diagnóstico.
o processo para a determinação do ponto inicial para a acti vação do sistema hemostático, no qual
a) se aplica no sistema, de preferência por via intraarterial ou intravenosa, um polipeptídeo ou um agente anticoagulante dotado de um marcador detectável, da família das anexinas, de preferência VAC, e
b) se observa extracorporalmente, após um período de incubação, a distribuição do polipeptídeo referido, com uma câmara de cintilação gama ou com um aparelho de medição
de ressonância magnética.
- o processo para a determinação do estado prótrombõtico, no qual
a) se mistura extracorporalmente o sangue a ensaiar com um polipeptídeo ou um agente anticoagulante da família das anexinas, de preferência VAC, gue transporta um marcador detectável, e
b) se analisa com a marcação associada ao tipo de células específico.
agentes que além de um polipeptídeo anticoagulante da família das anexinas, de preferência a VAC, dotado de um marcador detectável, contêm adicionalmente uma substância auxili. ar, por exemplo soro fisiológico, TWEEN 80, arginina e/ou um tampão de fosfato, podendo ser utilizado eventualmente um anticoagulante que não reduza a concentração de cálcio no plasma, de preferência a heparina.
um conjunto de análise para a comprovação, no diagnóstico, do estado prótrombõtico ou do ponto inicial de activação do sistema hemostático e/ou de um trombo, contendo um agente ou um polipeptídeo anticoagulante de acordo com a invenção, que esteja em condições de distinguir a fosfatidilserina da fosfatidilcolina.
- a utilização de um polipeptídeo anticoagulante ou de um agente de acordo com a invenção para a distinção da fosfati^ dilserina e da fosfatidilcolina.
a utilização de um polipeptídeo anticoagulante ou de um agente de acordo com a invenção para a diagnose do estado prótrombõtico ou do ponto inicial da perturbação do sistema hemostático ou do trombo.
MATERIAIS E MÉTODOS
A VAC foi preparada ou analogamente à Especificação EPA 0 181 465, ou â Especificação EPA 0 293 567. As experiências adiante foram realizadas com VAC<?< , todavia os resultados são também extensíveis às outras anexinas, especialmente também a VAC/Ó .
Lípidos
Os dioleoil-fosfatidilcolina (DOPC), nQ, P-1013) dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE, ηθ. P-0510), cardiolipina (CL, nQ. C-5646) dioleoil-fosfatidilglicerol (DOPG, nQ. P-9664), fosfatidilinositol (PI, nQ. P-0639), ácido dioleoil-fosfatídico (DOPA, nQ. P-2767), estearilamina (SA, S-6755) e esfingomielina de gema de ovo (S-0756) foram obtidos da Firma Sigma, Chemical Co.
A pureza de DOPC e DOPE foi comprovada por cromatografia de camada delgada. A dioleoil-fosfatidilserina (DOPS) foi preparada por conversão de DOPC de acordo com (1). 14 ·,
A DOPS marcada com C (actividade especifica 100 000 dpm/pg) foi obtida de Amersham.
Preparação de camadas duplas de fosfolípidos sobre placas de silício
As camadas duplas de fosfolípidos foram aplicadas com um Langmuir-film balance (Lauda tipo FW-1) como é descrito por Corsel et al (2). Placas de silício hidrófilas foram tratadas durante 24 horas em ácido cromossulfúrico a 30% e água e conservaram-se numa mistura a 50% etanol/água. Antes da sua utilização foram lavados perfeitamente com um detergente e água.
film balance foi cheio com água des_ mineralizada e 50 μΜ de cloreto de cálcio. Sobre esta fase infe rior aplicaram-se 20 jul de uma solução que continha cerca de 2 g/litro de fosfolípido em clorofórmio. As fracções de DOPS na 14 camada dupla foram verificadas com DOPS marcado com C em mistura com DOPC. As camadas duplas completas foram removidas das placas de silício com o detergente de cintilação (Du Pont fórmu la 989) e mediu-se a radioactividade total num contador de cintilação.
Medição da ligação por elipsometria
A adsorção de VAC à camada dupla de fo_s
folípido foi medida com auxílio de um elipsómetro automático co mo é descrito em (2,3) .
Os ensaios de ligação foram realizados numa cuvete hidrófila que continha 5 ml de um tampão homogéneo (0,05 M tris/HCl; 0,1 M NaCl; pH = 7,5; T = 20°C). Os catiões bivalentes foram adicionados como cloreto separadamente.
Para concentrações de VAC inferiores a 0,1 pg/ml o tampão, que continha a concentração específica de VAC, foi adicionado continuamente para proporcionar à VAC uma capacidade tampão suficiente.
A partir dos dados combinados de polarA zação e análise determinou-se o índice de refracção e a espessu ra d da película adsorvida (4). A quantidade Γ da camada de pro teína adsorvida foi determinada a partir do índice de refracção e da espessura por meio de uma equação de Lorentz-Lorenz modifi cada [1) (3,5):
[1] r=3d(n2-nb2)/[(n2+2)(r(nb2+2)-v(nb2-l))];
nb é o índice de refracção do tampão. Os valores r = 0,254 e v = 0,71 foram utilizados para a refractividade molar específica e o volume específico parcial (3).
RESULTADOS
Efeito dos catiões bivalentes sobre a ligação de VAC aos fosfolípidos
A VAC liga-se a membranas de fosfolípidos que consistem em 20% de DOPS/80% de DOPC, em função da concentração de cálcio. A adição subsequente de EDTA conduz a uma dessorção imediata e completa (fig. 1). Através da modificação ~ 2+ da concentração de Ca livre pode provocar-se de novo a adsorção várias vezes, sem que se alterassem substancialmente a quan tidade adsorvida ou a taxa de adsorção. Não se verificaram pois modificações irreversíveis da molécula de VAC ou da camada dupla de fosfolípidos pela adsorção ou dessorção. A ligação foi de facto completamente reversível quando a cuvete era lavada
2+ com tampão isento de iões Ca
2+
A dependência de Ca da ligaçao de VAC aos fosfolípidos está representada na fig. 2. A curva dose de Ca -acçao mostra muito nitidamente uma concentração de Ca à qual se atinge metade do valor máximo de adsorção de VAC:
[Ca ^2/2’ θ valor [Ca 1^/2 ^ePen(^e composição da superfície de fosfolípidos. No caso de superfícies de fosfolípidos que contêm 100%, 20%, 5% e 1% de DOPS mediram-se valores de [Ca2+].de 36 μΜ, 220 μΜ, 1,5 mM ou 8,6 mM (quadro 1). Estes resul*·' Z 2+ tados concordam perfeitamente com o valor [Ca 1^/2 que foi medido para a ligação de endonexina II (=VAC) a misturas equimoleculares de vesículas de PS/PC (6). A quantidade máxima da proteína adsorvida (Imax) foi independente da fracção DOPS da membrana e tinha o valor de cerca de 0,217 jug/cm . Não se verificou qualquer adsorção para camadas de DOPC puro até 2+ uma concentração de Ca de 3 mM.
A adsorção de VAC às camadas duplas de fosfolípido com diversas composições está representada na fig. 5. Também neste caso se verifica nitidamente que no caso de camadas de DOPC puro não se observa adsorção de VAC. É igualmente fraca a adsorção de VAC à estearilamida (SA).
Nos ensaios com outros catiões além de
2+
Ca verificou-se que a ligaçao de VAC aos fosfolípidos é acenr 2+ 2+ 2+ tuadamente especifica do Ca (fig. 3). Os ioes Cd , Zn ,
2+2+ „
Mn e Co mostram uma reduzida promoção da ligaçao; os ioes
Ba e Mg não tiveram qualquer influência. Estas propriedades dos catiões podem estar correlacionadas de certo modo com o seu raio iónico.
Sinergismo do zinco
Concentrações elevadas de iões zinco (1 mM) promoveram apenas de forma fraca a adsorção de VAC (fig.3); o valor 50 pM não teve qualquer influência sobre a adsorção.
Surpreendentemente, esta concentração influenciou a ligação na
2+ 2+ presença de Ca ; observa-se pois sinergismo. O valor [Ca caiu de 8,6 para 2,7 mM para camadas duplas com apenas 1% de DOPS ([Zn2+] = 50 pM)(fig. 4). O valor 50 pM [Zn2+] situa-se na
zona normal de concentrações de zinco no plasma.
Processo de diagnóstico
1°. Diagnose in vitro
a) A VAC é marcada por processos conhecidos por si com o grupo fluoresceina, por exemplo por meio do isotiocianato de fluoresceina (13); obtém-se deste modo a VAC-FITC.
b) É recolhido o sangue de um paciente num tubo de ensaio de plástico, que contém um anticoagulante que não reduz a concentração de cálcio no plasma (por exemplo, heparina) e VAC-FITC.
c) Depois da mistura homogénea as células sanguíneas são analisadas utilizando-se um FACS (fluorescence activated cell sorter). Esta análise determina a intensidade da fluorescência que está associada aos tipos de células específicos.
d) Os peafis de análise mostram a quantidade de plaquetas com VAC-FITC ligado, isto é, as plaquetas com PS exposs to, e consequentemente a indicação de um estado prõtrombótico. Este estado de risco de saúde pode ser reconhecido precocemente deste modo e por conseguinte po de ser sugeito à terapia muito cedo.
2Q. Diagnose in vivo
a) A VAC é marcada com um isótopo de vida curta, por exem
131 pio I por processos conhecidos por si. Obtem-se a 131
I-VAC.
131
b) A I-VAC e aplicada a um paciente por via intravenosa.
c) Depois de um determinado período de incubação submete-se o paciente a uma cintilografia de corpo inteiro ou parcial. A distribuição da radioactividade pode ser ob servada com uma câmara de raios de campo amplo (large-field-of-view gamma-Kamera).
~ 131
d) Os pontos intravasculares com acumulaçao de I-VAC representam a localização de progressão de tromboses. Podem assim ser aplicados a tempo agentes antitrombóti cos apropriados ou medidas para cura da trombose.
1. Marcação radioactiva
1.1 Preparação
1.1.1 Preparação de um tampão de fosfato de sódio a 500 mmole/l· 24,5 g de dihidrogenofosfato de sódio monohidrato são dissolvidos em 1 litro de água bidestilada e adicionam-se a uma solução de 35,5 g de hidrogenofosfato dissódico em 1 l_i tro de água bidestilada até se alcançar o valor de pH 7,5.
1.1.2 Preparação de um tampão de fosfato de sódio a 20 mmole/l + 150 mmole de NaCl (tampão de eluisão)
2,76 g de dihidrogenofosfato de sódio monohidra to foram dissolvidos em 1 litro de água bidestd. lada e adicionados a uma solução de 2,84 g de hidrogenofosfato dissódico em 1 litro de água bidestilada até se atingir o valor de pH 7,2.
Por adição de 8,77 g de cloreto de sódio (150 mmole) a 1 litro do tampão anterior preparou-se o tampão de eluição.
1.1.3 Equilíbrio da coluna de purificação
Uma coluna PD-10 (Sephadex G25, Firma Pharmacia) foi equilibrada com cerca de 30 ml do tampão de eluição.
1.1.4 Preparação do reactor mg de IODO-GEN (massa molar: 432,09 g/mol; fig. 6) foram dissolvidos em 50 ml de diclorome tano puro. 200 pl desta solução foram pipetados para um vaso de Eppendorf de 1,5 ml e seguidamente evaporou-se o dissolvente a 37QC (bloco termostático). No reactor ficaram pois 8 pg
_2 (1,85 x 10 mmol) de IODO-GEN finamente dividi do aplicado sobre a parede.
1.1.5 VAC-QÍ utilizada para marcação
Partiu-se da solução de 50 mg de VAC-o< em 4 ml de tampão de fosfato de sódio a 20 mmol/litro + 150 mmol/litro de NaCl, pH 7,2, diluido com 1 ml de ãgua bidestilada. Massa molar de VAC-o< : 34000 g/mol.
1.1.6 1-125 utilizado para marcação
125
Na I da Firma Dupont, NEN Products, com 67,3 MBq (=1,82 mCi) de radioactividade total no dia de calibração. A actividade específica era de
15,9 Ci/mg de iodo = 1,98 kCi/mmol 1/2 I9, que corresponde a 0,115 ug de iodo (9,2 x 10 mmol 1/2 Ig). O Nal activo foi dissolvido em 5,5 μΐ de hidróxido de sódio a 0,1 mol/litro.
1.2 Iodação
Todos os trabalhos foram realizados na ausência de isótopo, com protecção de uma blindagem de vidro de chumbo.
jil (=200 pg) da solução descrita em 2.1.5 de Vac-o< foram transferidos para o reactor tratado com IODO-Gen Este foi fechado e foi agitaado 20 minutos à temperatu ra ambiente. Seguidamente a solução reactiva foi retirada com uma pipeta e aplicada sobre a coluna PD-10 jã preparada (ver 2.1.3). O reactor foi em seguida lavado com 500 pl do tampão de eluição (ver 2.1.2) e esta solução foi igualmente aplicada à coluna PD-10. O eluído recolhido na sequência desta operação foi descartado.
1.3 Purificação
Por aplicação de, em cada caso, 0,5 ml de tampão de eluição (ver 2.1.2) a intervalos de 2 minutos separou-se então o VAC-OC ^25I/Na125].
ainda livre. Depois de obtidas 12 fracções, este passo
de purificação terminou. 0 teor relativo de actividade da fracção foi medido com um monitor laboratorial (GMZ) (fig. 2).
As fracções 6 e 7 foram reunidas, foram completadas com tampão de eluição até ao volume exacto de 2,0 ml, dividiu-se em porções de 100 μΐ e congelou-se a -20QC. A substância presente nestas porções esta va pronta para fins analíticos e trabalhos de desenvol vimento.
2. Parte analítica
2.1 Determinação de teor
Num ensaio de substrato cromogéneo mediu-se um teor de VAC- «K de 71,8 jag/2,0 ml de solução.
2.2 Determinação da radioactividade
2.2.1 Radioactividade total
Depois de se descongelar uma porção de 100 μΐ adicionaram-se por meio de uma pipeta 50 μΐ de_s 125 ta solução [ I]VAC-O( a 950 μΐ da solução inac tiva de VAC-0Í (ver 2.1.5), misturou-se bem e tomaram-se desta mistura porções de 50 μΐ cada uma para medição num contador LSC (Beckman).
24,5 MBq (=0,663 mCi)/2,0 ml de solução total.
2.2.2 Actividade especifica
A partir da determinação do teor e da radioacti vidade total obteve-se uma actividade específica de 341,5 MBq/mg = 11,61 TBq/mmol (9,23 mCi/mg = 313,8 Ci(mmol)
2.2.3 Determinação da radioactividade ligada ã protei na por precipitação de TCA
100 μΐ da solução de VAC-o( foram misturados com 50 μι da solução de BSA a 3% e com 150 Pl de ãcido tricloroacético em solução aquosa a 40%, agitou-se bem e deixou-se repousar em fri15
gorífico durante 60 minutos. 0 sedimento formado foi removido por centrifugação. Aplicaram-se quantidades alíquotas do sobrenadante no contador LSC para medição.
Resultado: 99,3% da radioactividade perderam-se por precipitação.
22.4 Rendimento da radioactividade
Dos 67,3 MBq utilizados 24,5 MBq foram determinados na VAC-oC. Consequentemente o rendimento de actividade foi de 36,4%.
2.3 Grau de modificação
A partir da actividade específica e da quantidade utilizada de VAC-tX inactiva calculou-se es tatisticamente que uma em cada 6 moléculas de VAC-Of es 125 tava marcada com um atomo de I.
3.4 Identidade e pureza
Utilizando-se o ensaio SDS-PAGE (intervalo de gradiente 7-17%, condições não reductoras) e a avaliação subsequente do gel por coloração com prata (método Oakley), autoradiografia e detecção no analisa dor linear (Firma Berthold LB 282, sonda LB 2820) (fig 3) ensaiou-se a substância em comparação com a VAC-oC utilizada. As substâncias eram idênticas e a fracção do produto dímero situava-se nitidamente abaixo do limite de 8% tolerado para cargas inactivas.
Legendas e figuras
Fig. 1: Adsorção e dessorção alternadas de VAC numa superfície de fosfolípido, induzida por aumento ou redução da con ~ 2+ centraçao de Ca .A adsorçao de VAC (1 pg/ml) a uma camada dupla de fosfolipidos de 20% de DOPS/80% de DO~ 2+ - ♦
PC. A adiçao de Ca (3, 4, 6 mM) esta marcada por » ou
Fig. 2: Influência da composição de fosfolípido e da concentra ~ 2+ ~ -r çao de Ca sobre a adsorçao de VAC sobre uma superfície de fosfolípido.
o 100% DOPS; o 20% DOPS;â 5% DOPS; Π 1% DOPS;4 100% DOPC; Todas as misturas foram completadas com DOPC. [VAC] = 1 pg/ml.
Fig. 3: Efeito de iões bivalentes sobre a adsorção de VAC. Adsorção de VAC em camadas duplas de 20% de DOPS e 80% de DOPC na presença dos iões indicados (1 ou 3 mM).
[VAC] = 1 pg/ml.
, 2+ _
Fig. 4: Efeito smergetico de Zn sobre a adsorçao, função de
2+ - < . < .
Ca , de VAC à superfície de fosfolípidos.
2+
Mediu-se o efeito de Ca sobre a adsorçao de VAC em 1% de DOPS e 99% de DOPC na presença de 50 pM de Zn2+. [VAC] = 1 jug/ml.
Fig. 5: Adsorção de VAC em camadas duplas de fosfolípidos com diversas composições. A adsorção de VAC à dioleoilfosfatidilserina (DOPS), cardiolipina (CL) e dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) quer puras quer misturadas com 80% de dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) , a dioleoil_ fosfatidilglicerol (DOPG), fosfatidilinositol (PI) e estarilamina misturada com 80% de DOPC ou DOPC pura. [VAC] = 1 pg/ml; [Ca2+] = 3 mM.
Fig. 6: 1,3,4,6-tetracloro-3oC , 6<K -difenil-glicolurilo (IODO-GEN)
Fig. 7: Distribuição da radioactividade nas fracções 1-12.
Fig. 8: Distribuição da radioactividade no analisador linear.
<^^rc5»S«233EK3Xj^^
Avaliação das camadas duplas de fosfolí
Quadro 1:
pidos que foram aplicadas em placas de silício.
14 C-DOPS no film balance Quantidade de fosfolípidos (elipsométrico) Actividade Fracção DOPS medida
% pg/cm2 DPM O, Ό
2 o,396 453 1,9
5 0,409 1133 4,5
20 0,401 5006 20
100 0,442 27174 99
A mistura calculada foi aplicada sobre o film balance. A quantidade da camada dupla foi medida por . . . . 14 elipsometria e a actividade do DOPS marcado com C foi medida com um contador de cintilação Beckmann 6S 3801 (S.d. <2%) e cor rigiu-se quanto à radiação de fundo (60 DPM). A fracção de DOPS na camada dupla foi calculada pela equação 2;
-i
Quantidade(pg/cm ) x actividade específica (DPM.pg
Fracção = 2
Actividade (DPM) x Superfície (cm )
A actividade específica de DOPS era de »1
100 000 DPM.pg , e a superfície coberta com fosfolípidos era de 0,62 cm2.
Quadro 2;
Metade da ligação máxima de VAC a diver sas superfícies de fosfolípidos.
Lipidos (mol%/mol%) Imax + S.D. 2 (pg/cm ) [Ca2+] l/2± S mM
DOPS (100) 0,195+0,025 0,036+0,013
DOPS / DOPC (20/80) 0,222+0,014 0,22 +0,06
DOPS / DOPC (5/95) 0,229+0,004 1,5 ±0,5
DOPS / DOPC (1/99) 0,234+0,007 8,6 +2,5
Cardiolipina / DOPC (20/80) 0,209+0,011 0,039+0,022
DOPG / DOPC (20/80) 0,212+0,003 0,155+0,027
PI / DOPC (20/80) 0,221+0,005 0,47 +0,05
DOPA / DOPC (20/80) 0,207+0,006 0,75 +0,26
DOPE / DOPC (20/80) 0,213+0,003 0,86 +0,21
Esfingomielina / DOPC (20/80) 0,225 +0,014 7 +3
DOPC (100) n.d. >30 mM
A adsorção máxima de VAC (Imax) ãs superfícies com fosfolípidos conjuntamente com a concentração de cálcio que conduziu a metade da ligação máxima de VAC [Ca ] são os valores médios de pelo menos três ensaios diferentes, es tando indicados os correspondentes desvios padrão.
n.d. = não determinado.
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Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    - lã Processo para a preparação de um polipeptídeo anticoagulante da família das anexinas, caracterizado por se incorporar na cadeia peptídica um marcador detectável.
    - 2ã Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter como polipeptídeo anticoagulante VAC. (Proteína Anticoagulante Vascular).
    - 3â Processo de acordo com qualquer das rei. vindicações 1 ou 2, caracterizado por se incorporar como marcador detectável a marcação por fluorescência de preferência isotiocianato de fluoresceina, um radioisotopo de um ãtomo de halo géneo, de tecnécio, de chumbo, de mercúreo, de tãlio ou de in131 125 dio, especialmente de preferência I ou I, ou por se utili^ zar um agente de contraste paramagnético.
    - 4§ Processo de acordo com qualquer das rei. vindicações anteriores, caracterizado por se obter um polipepté dio que permite a distinção de fosfatidilserina e fosfatidilcolina.
    - 5ã Processo de acordo com qualquer das rei_ vindicações anteriores, caracterizado por se obter um polipeptí^ deo apto para utilização como meio de diagnóstico.
    - 6ã Processo para a determinação de ponto des partida para a activação de sistema hemostático, caracterizado por:
    a) se introduzir no sistema um polipeptídeo anticoagulante da família das anexinas, dotado de um marcador detectável, e
    b) se observar, após um período de incubação, a divisão do polipeptídeo referido.
    Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o polipeptídeo ser VAC.
    - 8§ Processo de acordo com as reivindicações 6 e 7, caracterizado por se utilizar como marcador detectável
    125
    I, um radio isótopo, de preferência um dos radioisótopos
    123T 131T 111T 99mm 203„ 198„ 201ml .
    I, I, In, Tc, Pb, Hg ou Tl, ou um elemento de contraste paramagnético.
    - 9ã Processo de acordo com qualquer das rei. vindicações 6 a 8, caracterizado por a divisão do polipeptídeo referido ser observada extracorporalmente, com uma câmara de cintilação p (gama) ou por meio de uma medição de ressonância magnética.
    - 10§ Processo para a (fixação) determinação de estado protombõtico caracterizado por
    a) se misturar extracorporalmente o sangue a ensaiar com um po lipeptídeo anticoagulante da família das anexinas que tran£ porta um marcador detectãvel, e
    b) se analisar a marcação associada com os tipos de células es pecíficas.
    - llã Processo de acordo com a reivindicação
    10, caracterizado por o polipeptídeo ser VAC.
    - 12ã Processo de acordo com as reivindicações 10 ou 11, caracterizado por se utilizar como marcador detectãvel o grupo fluoresceina, e um radioisõtopo, de preferência um dos radioisõtopos 125I, 123i, 131I, min, 99itc' 2°3PG' 198Hg ou 2O1T1.
    Processo para a preparaçao de um agente de diagnóstico, caracterizado por se incorporar um polipeptídeo anticoagulante da família das anexinas, dotado de um marcador detectável, quando obtido por um processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5 em combinação com uma substância auxiliar.
    - 14§ Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por se incorporar o polipeptídeo ser VAC.
    - 15â Processo de acordo com as reivindicações 13 ou 14, caracterizado por se incorporar como substância auxiliar soro fisiológico, TWGEN 80, argínina e/ou tampão de fosfato.
    - 16ã Processo de acordo com qualquer das rei. vindicações 14 ou 15, caracterizado por se utilizar adicionalmente um anticoagulante que não reduz a concentração de cãlcio no plasma, de preferência heparina.
    17ã
    Processo de acordo com qualquer das rei vindicações 15 a 16, caracterizado por se obter um agente de diagnóstico apto para utilização como meio de diagnóstico.
    - 18& Processo de acordo com qualquer das rei. vindicações 6 a 13, caracterizado por, em vez de polipeptídeo anticoagulante, se utilizar um dos meios de acordo com uma das reivindicações 13 a 16.
    - 19â Processo para a preparação de um conjun to para a comprovação por diagnóstico do estado protrombõtico ou de ponto de partida da activação do sistema hemostático e/ou de um trombo, caracterizado por compreender um meio de acordo com uma das reivindicações 13 a 16 ou um polipeptídeo anticoagu lante de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, o qual está em condições de distinguir fosfatidilserina da fosfatidilcolina.
    A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente alemão apresentado em 27 de Dezembro de 1989, sob ο ηδ. P. 39 42 988.1.
    Lisboa, 27 de Dezembro de 1990.
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