PT1836500E - Métodos e ensaios para distinguir diferentes formas de doenças e perturbações caracterizadas por trombocitopenia e/ou por interacção espontânea entre o factor de von willebrand (vwf) e plaquetas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "MÉTODOS E ENSAIOS PARA DISTINGUIR DIFERENTES FORMAS DE DOENÇAS E PERTURBAÇÕES CARACTERIZADAS POR TROMBOCITOPENIA E/OU POR INTERACÇÃO ESPONTÂNEA ENTRE O FACTOR DE VON WILLEBRAND (vWF) E PLAQUETAS" A presente invenção refere-se a métodos para distinguir diferentes estados ou formas de doenças e perturbações caracterizadas por trombocitopenia e/ou por interacção espontânea entre o Factor de von Willebrand (vWF) e plaquetas, e/ou para prever a progressão dessa doença ou perturbação.

Em particular, a presente invenção refere-se a métodos para proporcionar parâmetros que podem ser utilizados para distinguir diferentes estados ou formas de doenças e perturbações caracterizadas por trombocitopenia e/ou por interacção espontânea entre o Factor de von Willebrand (vWF) e plaquetas, para seguir a progressão dessa doença ou perturbação, para fazer previsões acerca da progressão dessa doença ou perturbação, para determinar um tratamento ou regime de tratamento adequado para essa doença ou perturbação, para determinar a eficácia terapêutica desse tratamento e/ou, quando indicado, para modificar esse tratamento.

Outros aspectos, formas de realização, utilizações, aplicações e vantagens da invenção tornar-se-ão claros a partir da descrição suplementar aqui apresentada abaixo. A invenção baseia-se na descoberta surpreendente de que os níveis de vWF activado numa amostra biológica obtida de um 2 paciente que sofre ou que se suspeita sofrer de pelo menos uma doença ou perturbação caracterizada por trombocitopenia e/ou por interacção espontânea entre o Factor de von Willebrand (vWF) e plaquetas podem ser utilizados para distinguir diferentes estados ou formas de doenças e perturbações caracterizadas por trombocitopenia e/ou por interacção espontânea entre o Factor de von Willebrand (vWF) e plaquetas, para seguir a progressão dessa doença ou perturbação, para fazer previsões acerca da progressão dessa doença ou perturbação, para determinar um tratamento adequado para essa doença ou perturbação, para determinar a eficácia terapêutica desse tratamento e/ou, quando indicado, para modificar esse tratamento.

Assim, num primeiro aspecto, a invenção refere-se a um método para distinguir diferentes estados ou formas de doenças e perturbações caracterizadas por trombocitopenia e/ou por interacção espontânea entre o Factor de von Willebrand (vWF) e plaquetas e/ou para prever a progressão dessa doença ou perturbação como definido na reivindicação 1. A amostra biológica utilizada no método da invenção é uma amostra que contém vWF, preferivelmente uma amostra que contém vWF e plaquetas. Em particular, a amostra biológica pode ser escolhida de sangue completo, plasma, soro ou outras fracções adequadas do sangue.

No método da invenção, a quantidade (por exemplo, a quantidade absoluta, nivel e/ou concentração) de vWF activado na amostra pode ser comparada com um valor de referência para a quantidade de vWF activado, por exemplo, com um valor de referência obtido de um paciente ou grupo 3 de pacientes sem a doença ou perturbação, com um valor de referência obtido de um paciente ou grupo de pacientes com a doença ou perturbação, com um valor de referência obtido de um paciente ou grupo de pacientes com uma forma diferente da doença ou perturbação. A quantidade de vWF activado na amostra também pode ser comparada com a quantidade de vWF numa ou mais amostras adicionais obtidas do mesmo paciente (por exemplo, obtidas em instantes anteriores e/ou posteriores). Refere-se Secção Experimental abaixo. A quantidade de vWF activado também pode ser comparada com outro parâmetro adequado da amostra.

Por exemplo, a quantidade de vWF activado na amostra também pode ser comparada com a quantidade de vWF não activado e/ou com a quantidade total de vWF (activado e não activado) na mesma amostra. Além disso, uma razão adequada entre a quantidade de vWF activado e vWF não activado na amostra (como a percentagem de vWF activado na amostra relativamente à quantidade total de vWF na amostra) pode ser comparada com um valor de referência, por exemplo, com um valor de referência obtido de um paciente ou grupo de pacientes sem a doença ou perturbação e/ou com um valor de referência obtido de um paciente ou grupo de pacientes com a doença ou perturbação. Para esta finalidade, a quantidade de vWF não activado e/ou a quantidade total de vWF podem ser determinadas de um modo conhecido per se. Refere-se novamente a Secção Experimental abaixo.

Quando a amostra utilizada contiver vWF e plaquetas, a quantidade de vWF activado na amostra também pode ser comparada com o número de plaquetas na mesma amostra. Além 4 disso, uma razão adequada entre a quantidade de vWF activado na amostra e o número de plaquetas na amostra pode ser comparada com um valor de referência, por exemplo, com um valor de referência obtido de um paciente ou grupo de pacientes sem a doença ou perturbação e/ou com um valor de referência obtido de um paciente ou grupo de pacientes com a doença ou perturbação. Para esta finalidade, o número de plaquetas da amostra pode ser determinado de um modo conhecido per se. Refere-se novamente a Secção Experimental abaixo. 0 método de acordo com a invenção pode ser utilizado, em particular, para (proporcionar um ou mais parâmetros que podem ser utilizados pelo médico para) distinguir diferentes estados ou formas, para seguir a progressão, para fazer previsões acerca da progressão, para determinar um tratamento ou regime de tratamento adequado, para determinar a eficácia terapêutica de um tratamento e/ou, quando indicado, para modificar um tratamento para as seguintes doenças e perturbações: Púrpura Trombocitopénica (TTP), síndroma HELLP, doença de von Willebrand do Tipo 2, Sepsia ou síndroma antifosfolípido.

De acordo com uma forma de realização preferida mas não limitadora, o método de acordo com a invenção é utilizado para distinguir diferentes estados ou formas, para seguir a progressão, para fazer previsões acerca da progressão, para determinar um tratamento ou regime de tratamento adequado, para determinar a eficácia terapêutica de um tratamento e/ou, quando indicado, para modificar um tratamento para Púrpura Trombocitopénica (TTP). Em particular, de acordo com esta forma de realização, o método da invenção pode ser utilizado para distinguir entre pacientes com TTP adquirida 5 e pacientes com TTP congénita. Como descrito na Parte Experimental abaixo, uma amostra obtida de um paciente com a forma congénita de TTP conterá significativamente mais vWF activado do que uma amostra obtida de um paciente com a forma adquirida de TTP, desse modo permitindo distinguir pacientes com a forma congénita de TTP de pacientes com a forma adquirida de TTP (por exemplo, pelo médico).

De acordo com outra forma de realização preferida mas não limitadora, o método de acordo com a invenção é utilizado para distinguir diferentes estados ou formas, para seguir a progressão, para fazer previsões acerca da progressão, para determinar um tratamento ou regime de tratamento adequado, para determinar a eficácia terapêutica de um tratamento e/ou, quando indicado, para modificar um tratamento para síndroma HELLP. Por exemplo, de acordo com esta forma de realização, o método da invenção pode ser utilizado para distinguir entre pacientes com pré-eclâmpsia e pacientes com síndroma HELLP (uma forma grave de pré-eclâmpsia). Esta forma de realização também pode ser utilizada para seguir e/ou prever a progressão de pré-eclâmpsia e, em particular, para prever quais os pacientes com pré-eclâmpsia que irão desenvolver HELLP e/ou determinar quais os pacientes com pré-eclâmpsia que têm um risco acrescido de desenvolver HELLP. Como descrito na Parte Experimental abaixo, uma amostra obtida de um paciente com HELLP conterá significativamente mais vWF activado do que uma amostra obtida de uma paciente grávida saudável e do que uma amostra obtida de uma paciente com pré-eclâmpsia, desse modo permitindo distinguir entre pacientes com a síndroma HELLP e sujeitos saudáveis e pacientes com pré-eclâmpsia (por exemplo, pelo médico), e também seguir e/ou prever a progressão de pré-eclâmpsia e, em particular, prever quais 6 os pacientes com pré-eclâmpsia que irão desenvolver HELLP e/ou determinar quais os pacientes com pré-eclâmpsia que têm um risco acrescido de desenvolver HELLP.

Em geral, na invenção, uma amostra pode ser considerada como contendo um nível "aumentado" ou "elevado” de vWF activado se a quantidade, nível ou concentração de vWF activado na referida amostra for maior do que o valor seguinte: [Média] + [2 x DP] em que: [Média] = quantidade média de vWF activado em amostras obtidas de um grupo de voluntários saudáveis; - [2 x DP] = desvio padrão das amostras; sendo entendido, na prática, que amostras de pacientes não saudáveis podem conter níveis de vWF activado significativamente mais altos do que este (comparar com os valores descritos na Parte Experimental abaixo). A quantidade de vWF activado é determinada contactando a amostra biológica com um agente de ligação que é capaz de se ligar especificamente ao vWF activado na presença de vWF não activado e depois determinando a quantidade de vWF activado ligado ao agente de ligação.

Isto pode ser feito, por exemplo, utilizando qualquer ensaio de ligação adequado envolvendo o agente de ligação, como será claro para o profissional, por exemplo, um ensaio imunoabsorvente, como ELISA ou RIA; ensaios envolvendo a utilização de microsséries; técnicas de afinidade envolvendo colunas, esférulas ou outros suportes aos quais 7 o agente de ligação se pode ligar (de modo covalente ou outro); utilização de técnicas de triagem de células (como FACS) envolvendo a utilização de agentes de ligação ligados (de modo covalente ou outro) a esférulas ou a uma etigueta ou marcador adequado (por exemplo, um marcador fluorescente), e outras técnicas envolvendo a utilização de agentes de ligação adequadamente etiquetados.

Também é contemplado implementar o método da invenção utilizando um transportador adequado (como uma tira de papel, um tubo, uma cavidade ou outra superfície ou meio adequado) ao qual o agente de ligação se liga (de modo covalente ou outro). Este transportador pode então ser exposto à amostra, de um modo adequado e durante um período de tempo adequado, sendo depois determinada a quantidade de vWF activado ligado ao transportador. Isto pode ser feito, por exemplo, por um passo subsequente de eluição do vWF ligado do transportador e depois determinando a quantidade de vWF activado eluído; comparando a quantidade de sítios de ligação livres remanescentes no transportador antes e após exposição à amostra, e/ou por medição directa da quantidade de vWF activado ligado ao transportador. Por exemplo, é contemplado que o transportador possa ser dotado de meios indicadores que indicam a quantidade de vWF ligado ao transportador (por exemplo, por uma alteração da cor) , ou que o transportador possa ser adequadamente desenvolvido para proporcionar um sinal (por exemplo, alteração da cor) que é uma medida da quantidade de vWF activado ligado ao transportador. Métodos, técnicas e equipamentos para efectuar esses ensaios de ligação também serão claros para o profissional; refere-se, por exemplo, a Parte Experimental abaixo. Para o ensaio de ligação, o agente de ligação também pode ser imobilizado num suporte adequado, como também será claro para o profissional.

Pode ser utilizado qualquer agente de ligação adequado que se consiga ligar especificamente ao vWF activado na presença de vWF não activado (isto é, um agente de ligação que consiga distinguir entre a conformação activada/de ligação do vWF e a conformação não activada/não de ligação do vWF), em que o agente de ligação tem um sitio de ligação distinto do sitio de ligação da Gplba e em que o agente de ligação é um anticorpo; uma parte ou fragmento de um anticorpo, ou uma proteina ou polipéptido que contém uma ou mais partes ou fragmentos de um anticorpo.

Por exemplo, o agente de ligação pode ser um anticorpo que é capaz de se ligar especificamente ao vWF activado na presença de vWF não activado; uma parte ou fragmento de um anticorpo, em que a referida parte ou fragmento é capaz de se ligar especificamente ao vWF activado na presença de vWF não activado, ou uma proteina ou polipéptido que contém e/ou compreende uma ou mais partes ou fragmentos de um anticorpo, em que pelo menos uma das referidas partes ou fragmentos é capaz de se ligar especificamente ao vWF activado na presença de vWF não activado.

Em particular, a referida parte ou fragmento pode ser um dominio variável, como um dominio variável de uma cadeia pesada e/ou um dominio variável de uma cadeia leve, ou um ScFv compreendendo um dominio variável de uma cadeia pesada e/ou um dominio variável de uma cadeia leve. Esses anticorpos e fragmentos, e métodos para obtê-los, serão claros para o profissional; refere-se, por exemplo, Roitt 9 et al., "Immunology" (6a Edição), Mosby/Elsevier, Edimburgo (2001), e Janeway et al., "Immunobiology" (6a Edição), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, Nova Iorque (2005) .

De acordo com uma forma de realização preferida mas não limitadora, o agente de ligação pode ser um denominado "anticorpo de cadeias pesadas" que é capaz de se ligar especif icamente ao vWF activado na presença de vWF não activado; uma parte ou fragmento de um anticorpo de cadeias pesadas, em que a referida parte ou fragmento é capaz de se ligar especificamente ao vWF activado na presença de vWF não activado, ou uma proteína ou polipéptido que contém e/ou compreende uma ou mais partes ou fragmentos de um anticorpo de cadeias pesadas, em que pelo menos uma das referidas partes ou fragmentos é capaz de se ligar especif icamente ao vWF activado na presença de vWF não activado (por exemplo, uma proteína multivalente contendo dois ou mais desses fragmentos. Essa proteína multivalente pode ter maior afinidade e/ou especificidade para a forma activada do vWF - isto é, comparada com a forma monovalente correspondente - e, assim, pode conduzir a um ensaio com sensibilidade melhorada, menos fundo e/ou melhor razão sinal-ruído).

Anticorpos de cadeias pesadas e métodos para obtê-los foram descritos na área; ver, por exemplo, as referências seguintes, que são citadas como contexto geral: WO 94/04678 (= EP 656 946), WO 96/34103 (= EP 0 822 985) e WO 97/49805 pela Vrije Universiteit Brussel; WO 97/49805 pelo Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie; WO 94/25591 (= EP 0 698 097) e WO 00/43507 pela Unilever N.V.; WO 01/90190 pelo the National Research Council of Canada; 10 WO 03/025020 (= EP 1 433 793) pelo Institute of Antibodies; WO 04/062551, WO 04/041863, WO 04/041865, WO 04/041862 pelo requerente, bem como, por exemplo, Hamers-Casterman et al., Nature, Volume 363, página 446 (1993), e Riechmann e Muyldermans, Journal of Immunological Methods, 231 (1999), páginas 25-38.

Por exemplo, anticorpos de cadeias pesadas contra um antigene desejado podem ser obtidos de uma espécie de camelídeo imunizado com o referido antigene, como descrito no contexto geral mencionado acima.

Também como mencionado nas referências acima, anticorpos de cadeias pesadas de ocorrência natural não contêm as cadeias leves presentes em anticorpos convencionais de 4 cadeias de ocorrência natural (que contêm de forma nativa cadeias pesadas e cadeias leves). Por este motivo, esses anticorpos de cadeias pesadas de ocorrência natural também foram referidos na área como "anticorpos de cadeias simples" (ver, por exemplo, WO 02/085945; não devendo ser confundidos com os denominados "Fv's de cadeia simples" ou "scFv's", que são polipéptidos sintéticos compreendendo um domínio VH ligado de modo covalente a um domínio VL) e como "imunoglobulinas desprovidas de cadeias leves” (ver, por exemplo, EP 0 656 946 e algumas das referências do contexto geral mencionadas acima), e esses termos, para as finalidades da presente descrição, devem ser considerados equivalentes ao termo "anticorpo de cadeias pesadas" como usado aqui.

Como também é mencionado nestas referências, as cadeias pesadas de anticorpos de cadeias pesadas de ocorrência natural contêm domínios CH3, domínios CH2 e um domínio 11 variável, mas - para além das cadeias leves - não têm os domínios CHI presentes nas cadeias pesadas de anticorpos convencionais de 4 cadeias de ocorrência natural. Aqui, os domínios variáveis de anticorpos de cadeias pesadas de ocorrência natural também serão referidos como "domínios VHH", para distinguir os referidos domínios variáveis dos domínios variáveis de anticorpos convencionais de 4 cadeias, habitualmente denominados "domínios VH".

Em geral, os domínios VHh têm uma estrutura que retém o dobramento de imunoglobulinas de domínios VH convencionais. No entanto, comparados com domínios VH, a sequência de aminoácidos de domínios VHH contém uma ou mais substituições (em particular nas suas regiões de arcabouço) que torna(m) a(s) região(regiões)/resíduos do domínio VHH -que, num domínio VH, formariam a interface VH/VL - mais hidrófobos (ver o contexto geral citado acima).

Como também é mencionado no contexto geral citado acima, anticorpos de cadeias pesadas e domínios VHH têm a grande vantagem de serem capazes de se ligar a um antigene sem a presença de quaisquer cadeias leves ou domínios variáveis de cadeias leves, respectivamente. Esta propriedade torna os anticorpos de cadeias pesadas e domínios VHh mais fáceis de obter, de desenvolver, de preparar (em particular) em larga escala, de utilizar e/ou ligar a um suporte do que anticorpos convencionais de 4 cadeias, ou respectivas cadeias leves ou domínios variáveis de cadeias pesadas. Por exemplo, a imobilização de domínios VHH num suporte sólido foi descrita no requerimento internacional WO 01/40310 pela Hindustan Lever Limited. 12

De acordo com uma forma de realização particularmente preferida, o agente de ligação é um Nanocorpo™, e quanto a esse termo refere-se a técnica anterior mencionada acima, o requerimento internacional não pré-publicado PCT/EP2005/ 011819 pelo requerente (registado em 4 de Novembro de 2005 e intitulado "Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies") e os requerimentos de patentes adicionais publicados e não publicados pela Ablynx N.V. [Nota: Nanoclone™, Nanocorpo™ e Nanocorpos™ estão sujeitos a protecção de marca registada ou suas aplicações pela Ablynx N.V.]. Em geral, os Nanocorpos podem ser descritos como proteínas que têm algumas das propriedades funcionais e aspectos estruturais que são característicos de domínios VHH de ocorrência natural. Por exemplo, um Nanocorpo pode consistir num domínio VHh de ocorrência natural, um domínio VHH "humanizado" ou um domínio VH "camelizado", bem como uma proteína parcial ou totalmente sintética, desde que os anteriores tenham (pelo menos algumas) as propriedades funcionais e aspectos estruturais que são característicos de domínios VHH de ocorrência natural. Também se refere o requerimento provisório US não pré-publicado 60/683,474 pelo requerente (referido abaixo), que descreve vários Nanocorpos contra o vWF (incluindo Nanocorpos contra o vWF activado). Como também é mencionado pelo requerente nestes requerimentos e na restante técnica anterior mencionada acima, os Nanocorpos também podem ser formatados e utilizados em formatos multivalentes e/ou com múltiplas especificidades. 0 requerimento internacional WO 04/062551 pelo requerente descreve anticorpos de cadeias pesadas contra diferentes domínios do vWF e contra ambas as formas activada e não activada do vWF, os domínios VHH desses anticorpos de 13 cadeias pesadas, Nanocorpos™ baseados nesses e métodos para obtê-los. Estes anticorpos de cadeias pesadas e domínios VHH são particularmente adequados para utilização nos métodos descritos aqui. Por exemplo, um anticorpo de cadeias pesadas de acordo com WO 04/062551 (ou respectivo domínio VHh) que é dirigido contra a forma activada do vWF (por exemplo, contra a forma activada do domínio AI do vWF) pode ser utilizado para determinar a quantidade de vWF activado numa amostra de acordo com o método da invenção, ao passo que um anticorpo de cadeias pesadas de acordo com WO 04/062551 (ou respectivo domínio VHh ou um Nanocorpo™ baseado naquele) que é dirigido contra a forma não activada do vWF (por exemplo, contra a forma não activada do domínio AI) ou contra ambas as formas activada e não activada do vWF (por exemplo, contra o domínio A3 do vWF) pode ser utilizado no método da invenção para determinar a quantidade de vWF não activado numa amostra ou a quantidade total de vWF numa amostra, respectivamente.

Alguns Nanocorpos™ particularmente preferidos mas não limitadores dirigidos contra a forma activada do vWF são os Nanocorpos dirigidos contra a forma activada do domínio AI do vWF que são descritos no requerimento internacional WO 04/062551, incluindo mas não se limitando a AU/VWFa-11 ("a-11"); AU/VWFa-12 ("a-12") e/ou AU/VWFa-16 ("a-16"). Como mencionado acima, é contemplado que a utilização de formas multivalentes (como bivalentes ou trivalentes) destes Nanocorpos™ (isto é, polipéptidos nos quais dois, três ou mais destes Nanocorpos (que podem ser iguais ou diferentes) estão ligados entre si, opcionalmente via uma sequência de ligação adequada, novamente como descrito no requerimento internacional WO 04/062551) podem conduzir a maior afinidade e/ou especificidade para a forma activada do vWF 14 - isto é, comparados com o Nanocorpo monovalente correspondente - e, assim, podem conduzir a um ensaio com maior sensibilidade, menos fundo e/ou a melhor razão sinal-ruído. Quanto à concepção e preparação dessas proteínas monovalentes refere-se novamente WO 04/062551, bem como o contexto geral de Nanocorpos referido acima.

Outros Nanocorpos que podem ser utilizados nos métodos da presente invenção são descritos no requerimento provisório US não pré-publicado 60/683,474 pelo requerente (registado em 20 de Maio de 2005 e intitulado "Nanobodies™ for the treatment of aggregation-mediated disorders") .

Como já foi aqui mencionado acima e será suplementarmente explicado na Parte Experimental abaixo, os valores determinados utilizando os métodos da invenção podem ser usados (por exemplo, pelo médico) como parâmetros para distinguir diferentes estados ou formas de doenças e perturbações caracterizadas por trombocitopenia e/ou por interacção espontânea entre o Factor de von Willebrand (vWF) e plaquetas, para seguir a progressão dessa doença ou perturbação, para fazer previsões acerca da progressão dessa doença ou perturbação, para determinar um tratamento adequado para essa doença ou perturbação, para determinar a eficácia terapêutica desse tratamento e/ou, quando indicado, para modificar esse tratamento. Isto pertence ao âmbito do médico com base na divulgação aqui apresentada.

Os métodos e ensaios da invenção também podem ser utilizados em investigação, por exemplo, das doenças e/ou perturbações mencionadas acima e/ou do papel do vWF nessas doenças ou perturbações. 15

Também é descrito um estojo-em-partes para determinar a quantidade de vWF activado numa amostra e, em particular, para utilização num método como descrito aqui, em que o referido estojo-em-partes compreende pelo menos um agente de ligação que é capaz de se ligar especificamente ao vWF activado na presença de vWF não activado (opcionalmente ligado a um transportador ou superfície adequado, como aqui descrito acima) e, opcionalmente, compreendendo meios para determinar a quantidade total de vWF (activado e não activado) na amostra (como será claro para o profissional) e/ou meios para determinar o número de plaquetas na amostra (como será claro para o profissional) e/ou instruções de utilização e/ou uma ou mais partes, elementos ou componentes de estojos para ensaios de ligação conhecidos per se (como será claro para o profissional), em que o referido estojo-em-partes está opcionalmente empacotado numa embalagem ou receptáculo adequado. No referido estojo-em-partes, o agente de ligação é preferivelmente como adicionalmente descrito acima. A invenção também se refere à utilização de um agente de ligação que é capaz de se ligar especificamente ao vWF activado na presença de vWF não activado, como definido acima, para distinguir diferentes estados ou formas de doenças e perturbações caracterizadas por trombocitopenia e/ou por interacção espontânea entre o Factor de von Willebrand (vWF) e plaquetas e/ou para prever a progressão dessa doença ou perturbação, e/ou nos métodos aqui descritos acima e/ou num estojo-em-partes como aqui descrito acima. 0 referido agente de ligação é adicionalmente como aqui descrito acima e pode ser, por exemplo, um anticorpo ou uma 16 parte ou fragmento de um anticorpo (em que o referido anticorpo, parte ou fragmento é capaz de se ligar especif icamente ao vWF activado na presença de vWF não activado); uma proteína ou polipéptido que contém e/ou compreende pelo menos uma parte ou fragmento desse anticorpo; um anticorpo de cadeias pesadas, ou respectiva parte ou fragmento (em que o referido anticorpo de cadeias pesadas, parte ou fragmento é capaz de se ligar especif icamente ao vWF activado na presença de vWF não activado); uma proteína ou polipéptido que contém e/ou compreende pelo menos uma parte ou fragmento desse anticorpo de cadeias pesadas; um Nanocorpo™ (em que o referido Nanocorpo é capaz de se ligar especificamente ao vWF activado na presença de vWF não activado) , ou uma proteína ou polipéptido que contém um ou mais Nanocorpos™.

Como já foi mencionado pelo requerente nos requerimentos referidos acima, os Nanocorpos também podem ser vantajosamente utilizados para fins de imagiologia. De acordo com a presente invenção, verificou-se que agentes de ligação que são capazes de se ligar especificamente ao vWF activado na presença de vWF não activado, e em particular Nanocorpos que são capazes de se ligar especificamente ao vWF activado na presença de vWF não activado, podem ser utilizados, em particular, para imagiologia in vivo com a finalidade de localizar trombos ricos em plaquetas. Para este fim pode utilizar-se um agente de ligação que é etiquetado de qualquer forma adequada (por exemplo, como descrito para Nanocorpos no requerimento provisório US 60/683,474). 0 agente de ligação etiquetado pode então ser administrado a um sujeito (de qualquer modo adequado conhecido per se, por exemplo, por introdução directamente na circulação utilizando injecção ou infusão intravenosa) 17 numa quantidade que é adequada para visualizar quaisquer trombos ricos em plaquetas que possam estar presentes na circulação do sujeito, após o que os trombos podem ser visualizados de qualquer modo conhecido per se, por exemplo, utilizando NMR, MRI, PET ou qualquer outra técnica não evasiva adequada (dependendo da etiqueta utilizada).

Por exemplo, o Nanocorpo AU/VWFa-11 descrito abaixo pode ser utilizado como agente marcador para localizar trombos na rede vascular de pacientes. Em contraste com o vWF em circulação no plasma, o vWF que está presente em trombos está presente numa conformação activa de ligação a plaquetas. Uma vez que o Nanocorpo AU/VWFa-11 reconhece selectivamente o vWF activo, este Nanocorpo será selectivamente dirigido para vWF presente em trombos. Quando o Nanocorpo estiver apropriadamente etiquetado irá localizar especificamente o trombo. Uma etiquetagem apropriada inclui mas não está limitada a radionuclidos utilizados em medicina nuclear (como inIn, 67Ga, 68Ga, 99mTc), etiquetas utilizadas para imagiologia de ressonância magnética (como Gd) ou marcadores para detecção via técnicas ópticas (como ouro coloidal). 0 método da invenção também pode ser utilizado para determinar se há condições de velocidade de cisalhamento alta ou aumentada em qualquer ponto ou localização na circulação de um sujeito. De acordo com a presente invenção, verificou-se que a presença dessas condições de velocidade de cisalhamento alta ou aumentada na circulação conduz a um aumento dos níveis de vWF activado no sangue. Em consequência, os métodos e agentes de ligação descritos aqui, que permitem a medição selectiva dos níveis de vWF activado no sangue, soro ou outra amostra biológica, mesmo 18 na presença de vWF não activado, podem ser utilizados para determinar se há níveis acrescidos de vWF activado - isto é, comparados com um nível de base e/ou medindo a razão entre o nível de vWF activado e o nível total de vWF (ou o nível de vWF não activado - no sangue ou numa amostra de sangue obtida de um paciente, que poderá alertar o médico para o facto de existirem condições de velocidade de cisalhamento alta ou aumentada algures na circulação de um paciente. Sem limitação, isto pode ser, por exemplo, uma indicação da presença de uma constrição total ou parcial do fluxo de sangue algures no corpo do paciente, por exemplo, devido à presença de um trombo ou de placas ateroscleróticas em um ou mais dos vasos sanguíneos (veias e/ou artérias) do sujeito. Estes e outros exemplos de doenças, estados e perturbações que estão associados e/ou que podem conduzir a constrição do fluxo de sangue e/ou a condições de elevada velocidade de cisalhamento na circulação de um paciente serão claros para o profissional, e os métodos e agentes de ligação descritos aqui podem ser utilizados para a detecção (precoce) e/ou diagnóstico de todas essas doenças, estados e perturbações. A invenção será agora adicionalmente descrita pela Parte Experimental não limitadora apresentada abaixo e Figuras não limitadoras adjuntas, nas quais: A Figura 1 é um gráfico que mostra a ligação diferencial do Nanocorpo de referência e AU/VWFa-11 ao ts-vWF e vWF activado por ristocetina. Fig. ÍA/Fig. 1B: Pd-vWF foi imobilizado em cavidades de microtítulo (1 pg/mL, durante a noite a 4°C) e incubado com diferentes concentrações do Nanocorpo de referência biotinilado (Fig. IA, 0-625 nM) e AU/VWFa-11 (Fig. 1B, 0-10 nM). O anticorpo ligado foi 19 detectado com estreptavidina conjugada a HRP. Fig. lC/Fig. 1D: cavidades de microtítulo revestidas com Pd-vWF foram incubadas com o Nanocorpo de referência (62,5 nM, Fig. 1C) e AU/VWFa-11 (1,9 nM, Fig. 1D) na presença ou ausência de diferentes concentrações de ts-vWF (·) ou vWF pré-incubado com 1 mg/mL de ristocetina (5 minutos, temperatura ambiente, o) (0-90 nM para o Nanocorpo de referência e 0-20 nM para o AU/VWFa-11). O anticorpo ligado foi monitorizado utilizando estreptavidina-HRP. A ligação na ausência de vWF foi fixada em 100%. A ligação residual na presença de vWF foi representada graficamente versus a razão vWF (nM) : anticorpo (nM). Os dados representam a média ± DP de 3 experiências. A Figura 2 é um gráfico que mostra as caracteristicas da interacção entre o AU/VWFa-11 e o domínio AI. Fig. 2A: Diferentes concentrações do domínio AI (0-500 nM) foram submetidas a perfusão sobre um "chip" sensor CM5 revestido com 0,08 pmol/mm2 de AU/VWFa-11 a uma taxa de fluxo de 20 pL/minuto. A resposta no equilíbrio (mol AI : mol AU/VWFa-11) foi representada graficamente versus a concentração de vWF/ΑΙ submetida a perfusão sobre o "chip". Fig. 2B: vWF/Al(1238-1481), vWF/ΑΙ(1261-1468) e vWF/ΑΙ(1261-1468)/ R1306Q (500 nM) foram submetidos a perfusão sobre um "chip" sensor CM5 revestido com 0,12 pmol/mm2 de AU/VWFa-11 a uma taxa de fluxo de 5 pL/minuto. A ligação foi permitida durante 240 segundos; em seguida, tampão foi submetido a perfusão sobre o "chip", para permitir a dissociação. A Figura 3 é um gráfico que mostra diferentes sítios de ligação para a Gplba e AU/VWFa-11. Fig. 3A: Cavidades de microtítulo foram revestidas com ts-vWF (37 nM em tampão de NaHC03 50 mM) , durante a noite a 4°C. Após bloqueio das 20 cavidades, durante 1 hora à temperatura ambiente, com 0,5% PVP em PBS, as cavidades foram incubadas com AU/VWFa-11 ou Nanocorpo de referência (1,25 μΜ em PBS, 1 hora, temperatura ambiente). Após lavagem com PBS, foi permitida a ligação de células CHO que expressam o complexo GpIb-IX-V (1 x 105 células em DMEM contendo 0,1% BSA) na presença ou ausência do Nanocorpo de referência ou AU/VWFa-11 (1,25 μΜ) . A ligação destas células foi monitorizada medindo a actividade intrínseca de fosfatase alcalina das células, e foi fixada em 100% na ausência de anticorpos. Os dados representam a média ± DP de 3 experiências. Fig. 3B-D: Sangue completo foi submetido a perfusão sobre lamelas revestidas com colagénio do tipo III (30 pg/cm2 em 0,05 mol/L de ácido acético) na ausência (Fig. 3B) ou presença do Nanocorpo de referência (31,3 ou 125 nM, Fig. 3C) ou AU/VWFa-11 (62,5 ou 625 nM, Fig. 3D) a uma velocidade de cisalhamento de 1600 s_1. Fig. 3E/Fig. 3F: Sangue reconstituído foi submetido a perfusão sobre lamelas revestidas com pd-vWF (15 pg/mL) na ausência (Fig. 3E) ou presença de 625 nM de AU/VWFa-11 (Fig. 3F) a uma velocidade de cisalhamento de 1600 s-1. Após a perfusão, as plaquetas que aderiram foram fixadas em 0,5% glutaraldeído em PBS, foram desidratadas em metanol e coradas com May-Grunwald e Giemsa. Fig. 3G: A adesão de plaquetas foi avaliada utilizando análise computacional e foi expressa em percentagem da superfície coberta com plaquetas (n=3). A Figura 4 é um gráfico que mostra o efeito da ristocetina e da mutação R1306Q na ligação ao AU/VWFa-11. Cavidades de microtítulo foram revestidas, durante a noite a 37°C, com AU/VWFa-11 (5 pg/mL em NaHC03 50 mM, pH 9,6) e foram bloqueadas, durante 30 minutos a 37°C, com 3% BSA, 0,1% Tween-20 em PBS. Após lavagem, as cavidades de microtítulo 21 foram incubadas com meio contendo diferentes concentrações de ts-vWF (quadrados) ou vWF/R1306Q (círculos) (0-3,7 nM) . A ligação foi permitida durante 1 hora a 37°C na presença (símbolos brancos) ou ausência (símbolos pretos) de 1 mg/mL de ristocetina. As cavidades de microtítulo foram lavadas utilizando 0,1% Tween-20 em PBS e foram incubadas com anticorpo policlonal anti-vWF conjugado a HRP. O vWF ligado foi detectado medindo a actividade de peroxidase. Os dados representam a média ± DP de 3 experiências. A Figura 5 é um gráfico que mostra o vWF activado presente em plasma de vWD do tipo 2B. Fig. 5A: Cavidades de microtítulo revestidas com AU/VWFa-11 (5 pg/mL) foram bloqueadas durante 30 minutos com 3% BSA, 0,1% Tween-20 em PBS. NPP () , plasma de indivíduos normais (n=9, símbolos brancos) e plasma de vWD do tipo 2B (n=12, triângulos) foram diluídos em PBS para se obter uma gama de concentrações (0,23-0, 93 nM) . Após lavagem, as cavidades foram incubadas, durante 1 hora a 37°C, com os plasmas diluídos. O vWF ligado foi detectado utilizando anticorpo policlonal anti-vWF conjugado a HRP. A concentração de vWF nas amostras diluídas foi representada graficamente versus a OD490nm medida. O declive medido para NPP foi fixado em 1. As setas indicam os declives para dois pacientes diferentes com vWD do tipo 2B. Os dados representam a média ± DP de 2 experiências. Fig. 5B: Os factores de activação foram calculados utilizando a equação 1 e foram representados graficamente num gráfico de dispersão. As setas indicam os factores de activação calculados para o paciente 1 e 2 da figura A. O factor de activação para os pacientes com vWD do tipo 2B foi significativamente mais elevado do que para os indivíduos normais (p < 0,001) . Os dados representam a média ± DP de 2 experiências. Fig. 5C: 22 0 factor de activação calculado para 9 pacientes com vWD do tipo 2B foi representado graficamente versus as contagens de trombócitos nestas amostras, e verificou-se existir uma correlação significativa (p < 0,003, R2=0,7401). A Figura 6 é um gráfico que mostra a detecção de vWF activado em plasma de TTP. Fig. 6A/Fig. 6C: Cavidades de microtitulo revestidas com AU/VWFa-11 foram incubadas com NPP (), plasma de indivíduos normais (n=9, □) e plasma de pacientes que sofrem de TTP adquirida (Fig. 6A, n=12, ·) ou TTP congénita (Fig. 6C, n=5, A). O plasma foi diluído antes da incubação para se obter uma gama de concentrações de vWF (62-250 ng/mL). 0 vWF ligado foi monitorizado com anticorpo anti-vWF conjugado a HRP. A quantidade de vWF na amostra diluída foi representada graficamente versus a actividade de HRP (OD490nm). Calcularam-se declives, e o declive para NPP foi fixado em 1. As setas indicam os declives para um paciente que sofre de TTP adquirida (1) ou TTP congénita (2). Fig. 6B/Fig. 6D: O factor de activação foi calculado e representado graficamente num gráfico de dispersão. As setas indicam os valores para os pacientes representados graficamente nas Fig. 6A e Fig. 6C. Os factores de activação para TTP adquirida e congénita foram significativamente mais elevados do que para os indivíduos normais (TTP adquirida versus normal: p < 0,0001 e TTP congénita versus normal p < 0,03) . O factor de activação para TTP congénita também estava significativamente aumentado quando comparado com TTP adquirida (p < 0,05). Os dados representam a média ± DP de 2 experiências. A Figura 7 é um gráfico que mostra níveis aumentados de vWF activo na síndroma HELLP. NPP, amostras de indivíduos normais (n=9, □) e controlos grávidos normais (n=9, A; 23 "Grávidas normais"), amostras de pacientes que sofrem de pré-eclâmpsia (n=6, ·; "Pré-eclâmpsia") e de pacientes com síndroma HELLP (n=44, o) foram diluídas em PBS para se obter uma gama de concentrações de vWF (250 - 31,5 ng/mL). As amostras diluídas foram incubadas, durante 1 hora a 37°C, em cavidades revestidas com AU/VWFa-11 (5 pg/mL, revestidas durante a noite a 4°C NaHC03 50 mM, pH 9,6, durante a noite a 4°C) . O vWF ligado foi detectado com anticorpo policlonal anti-vWF conjugado a HRP. A quantidade de vWF na amostra diluída foi representada graficamente versus a actividade de HRP (OD490nm). Calcularam-se os declives, e o declive para NPP foi fixado em 1. Os dados representam a média ± DP de 2 experiências.

Parte Experimental

Plaquetas e Factor de von Willebrand coexistem na circulação, mas só ocorre interacção em sítios de lesão. Nestes sítios, o vWF funciona como ponte molecular entre a matriz subendotelial exposta e o complexo GpIb-IX-V em plaquetas. Para esta interacção é necessária uma mudança no domínio AI do vWF para uma conformação de ligação à Gplb. No presente artigo é discutido o domínio variável do anticorpo de lama ("Nanocorpo™") AU/VWFa-11 que consegue distinguir a conformação não de ligação da conformação de ligação do vWF. Este domínio variável de anticorpo reconhece um sítio no domínio AI que apenas é exposto por activação do vWF. Verificou-se que a afinidade do AU/VWFa-11 para o domínio AI isolado é 77 nM, mas a introdução da mutação R1306Q da Doença de von Willebrand do tipo 2B ou incubação com ristocetina aumentou a eficiência da ligação. Utilizando AU/VWFa-11, estudou-se a conformação do vWF no plasma de pacientes com vWD do tipo 2B e com Púrpura 24

Trombocitopénica Trombótica (TTP). Apesar de estas doenças terem diferentes aparências fenotipicas, ambas são caracterizadas por trombocitopenia causada por interacção espontânea plaquetas-vWF. 0 plasma de pacientes com vWD do tipo 2B e com TTP continha níveis significativamente aumentados de vWF activado (respectivamente p < 0,001 e p < 0, 0001) . Além disso, em pacientes com vWD do tipo 2B verificou-se existir uma correlação inversa entre a quantidade de vWF activado e o número de plaquetas. O vWF de pacientes com a forma congénita de TTP estava significativamente mais activado do que o vWF de pacientes com TTP adquirida (p < 0,05) . Em conclusão, foi possível utilizar um ensaio imunoabsorvente com AU/VWFa-11 para detectar TTP e para distinguir entre TTP adquirida e congénita. Também permitiu proporcionar uma ferramenta para investigar o papel do vWF noutras doenças. A adesão de plaquetas à parede de vasos lesionados é um processo em múltiplos passos que envolve vários componentes, incluindo o Factor de von Willebrand (vWF). O vWF é uma glicoproteína adesiva que circula no plasma na forma de uma série de subunidades multiméricas.1 Esta estrutura multimérica permite ao vWF funcionar como ponte molecular entre a matriz subendotelial e o complexo Glicoproteína (Gp) da superfície de plaquetas Ib/IX/V. A formação do complexo entre o vWF e o receptor de GpIb/IX/V é particularmente importante para prender as plaquetas às superfícies vasculares expostas a sangue com fluxo rápido.2 A interacção entre o vWF e o complexo GpIb/IX/V é mediada por regiões específicas de ambos os componentes: os resíduos do vWF 1238-1481 (o denominado domínio AI) compreende um sítio interactivo para os resíduos 1-290 da 25

Gplba.3 Apesar de a estrutura deste complexo ter sido resolvida ao nível atómico4, algumas questões respeitantes a esta interacção têm permanecido obscuras. Por exemplo, apesar da noção de que o vWF e Gplba coexistem na circulação, a sua interacção não ocorre em condições normais. Em contraste, o domínio Al recombinante isolado exibe ligação espontânea à Gplba. Aparentemente é requerida uma mudança de um modo de não ligação para um modo de ligação do domínio Al do vWF no seu ambiente multimérico para induzir a formação do complexo.4 Todavia, a base molecular deste passo de activação é amplamente desconhecida. A activação do domínio Al pode ser induzida por vários meios. Ocorre activação não fisiológica do domínio Al por imobilização directa de vWF purificado sobre superfícies artificiais, como vidro ou plástico. Também se obtém activação in vitro do vWF por adição de moduladores, como o componente do veneno de serpente botrocetina, ou o antibiótico ristocetina.5'6 Além disso, a activação fisiológica do vWF é induzida pela sua ligação ao componente da matriz subendotelial colagénio, ou em condições de muito alta tensão de cisalhamento. Também vários estados patológicos podem conduzir à formação prematura do complexo entre o vWF e Gplba plaquetária. Algumas mutações de ganho de função no domínio Al do vWF podem aumentar a afinidade para a Gplba. Essas mutações estão associadas à doença de von Willebrand do tipo 2B, cujos pacientes são caracterizados por perda de multímeros de alto peso molecular do plasma, agregação aumentada de plaquetas induzida pela ristocetina, um tempo de hemorragia prolongado e trombocitopenia.7'8 Outro estado descrito como permitindo a adesão espontânea de plaquetas refere-se à 26 dimensão do vWF multimérico. 0 vWF multimérico é armazenado em corpos de Weibel-Palade em células endoteliais e é libertado por estimulação.9-11 0 vWF libertado de novo está enriquecido em multimeros ultra-grandes (UL)-vWF, que têm o potencial para se ligarem a plaquetas na ausência de quaisquer moduladores.12 A libertação directa das moléculas UL-vWF na circulação é prevenida por proteólise destes multimeros na superfície endotelial.13 Este processo é mediado pela protease recentemente identificada ADAMTS-13, que procede à clivagem do vWF maduro entre os resíduos Metl605 e Tyrl606.14'15 Depois de clivados pela ADAMTS-13, os multimeros residuais perderam a capacidade para se ligarem espontaneamente a plaquetas. A importância da actividade da ADAMTS-13 é ilustrada pela doença com risco de vida Púrpura Trombocitopénica Trombótica (TTP), na qual a actividade da ADAMTS-13 é baixa ou nula. A deficiência de ADAMTS-13 é causada por anticorpos inibidores (TTP adquirida)16 ou por mutações no gene que codifica a ADAMTS-13 (TTP congénita)17'18. Na ausência de actividade da ADAMTS-13, um excesso de multimeros UL-vWF é libertado na circulação, o que conduz a ligação espontânea a plaquetas e subsequente formação de trombos na microvasculatura.19 Isto causa anemia hemolítica, falha renal, deficiências neurológicas, febre e, por vezes, coma.20

Apesar da vWD do tipo 2B e da TTP estarem associadas a diferentes aparências fenotípicas, têm em comum o facto de pelo menos parte dos multimeros do vWF em circulação existir numa conformação activa. A presença de vWF activado pode ser determinada indirectamente medindo a agregação plaquetária dependente da ristocetina. No entanto, este método é pouco sensível e não pode ser utilizado quando o nível de antigene vWF é baixo. Descreve-se aqui um domínio 27 variável de anticorpo monoclonal derivado de lama que reconhece o vWF imobilizado mas não o vWF nativo, sugerindo que este domínio variável de anticorpo reconhece um epítopo no domínio AI do vWF que fica exposto por activação do vWF. Este domínio variável de anticorpo foi subsequentemente utilizado para monitorizar a presença de vWF activado em amostras de plasma de pacientes com vWD do tipo 2B e com TTP. Esta análise revelou que, na circulação de ambos os grupos de pacientes, os níveis de vWF activado estão aumentados 2-10 vezes em comparação com indivíduos normais.

Materiais e Métodos

Proteínas e anticorpos A Gplba recombinante (resíduos 1-290) foi expressa e purificada como descrito.4 O anticorpo Gplba (2D4) foi uma oferta amável do Dr. H. Deckmyn (Kortrijk, Bélgica). A botrocetina foi adquirida ao Kordia Laboratory Supplies (Leiden, Países Baixos). O (pd)-VWF derivado do plasma foi purificado de crioprecipitados (Haemate P 250 IE,

Behringwerke AG, Marburg, Alemanha) como descrito.21 A albumina do soro bovino e colagénio placentário humano do tipo III provieram da Sigma e a albumina humana (Fracção V) proveio da MP Biochemicals (Irvine, CA E.U.A.). Anticorpos policlonais contra o vWF e anticorpos conjugados a HRP contra o vWF foram obtidos da Dakocytomation (Glostrup, Dinamarca).

Construção e expressão de proteínas recombinantes

A construção do vector de expressão pNUT que codifica o ts-vWF e VWF/R1306Q foi descrita previamente.22-24 O 28 vWF/Al(1261-1468) e vWF/Al(1261-1468)-R1306Q foram clonados no vector de expressão pPIC9 e super-expressos em Pichia pastoris.4 Construiu-se pNUT-vWF/Al(1238-1481) gerando um produto de PCR com o "primer" directo e "primer" reverso 5'-G€<3CKXXKXXmK3^^ , para os quais pNUT-VWF serviu de modelo. Após a análise de sequências, o fragmento BamHI-Notl foi ligado num vector pNUT digerido com BamHI-Notl contendo uma cauda C-terminal de 6 histidinas. 0 ts-VWF, VWF/R13 06Q e VWF/Al(1238-1481) foram expressos de forma estável em células de rim de hamster bebé que também super-expressam furina para remoção apropriada do pró-péptido.22 As proteínas completas foram purificadas de meio sem soro condicionado como descrito.25 0 VWF/Al(1238-1481) foi purificado de meio de expressão utilizando cromatografia de Ni2+/NTA.4 0 VWF/Al(1261-1468) e VWF/Al (1261-1468)-R1306Q foram expressos em Pichia pastoris e purificados em heparina sefarose, seguido de filtração em gel.4 A análise de SDS-PAGE revelou que todas as proteínas recombinantes foram purificadas até à homogeneidade. A estrutura multimérica do ts-vWF e VWF/R1306Q foi analisada utilizando electroforese em gel com 0,1% SDS, 1% agarose como descrito previamente. 26

Produção e selecção de domínios variáveis de anticorpos (Nanocorpos™)

Anticorpos de lama foram dirigidos por imunização com uma preparação de ts-vWF contendo multímeros de elevado peso molecular. A imunização e construção de bibliotecas foram efectuadas como descrito.27 Para a selecção de domínios variáveis de anticorpos, as cavidades de uma placa de microtítulo Maxisorp (NUNC, Dinamarca) foram revestidas com 29 5 pg/mL de VWF/A1(1238-1481) em tampão de NaHC03 50 mM (pH 9,6, durante a noite a 4°C). Após lavagem, as cavidades foram bloqueadas, durante 3 horas à temperatura ambiente, com PBS contendo 1% caseína (PBS-C) e foram incubadas com os fagos (2 horas à temperatura ambiente). As cavidades foram lavadas 10 vezes com PBS e os fagos ligados eluíram com tampão de glicina 0,2 M (pH 2,4, 20 minutos à temperatura ambiente). Os fagos eluídos foram adicionados a células TG1 de E. coli com crescimento exponencial28 e as células foram plaqueadas em LB-ampicilina. Na segunda ronda, os fagos foram novamente suspensos em 10 pg/mL de ts-vWF recombinante antes da incubação em cavidades de microtítulo revestidas com VWF/A1 (1238-1481) . As cavidades foram lavadas 7 vezes durante 30 minutos com 10 pg/mL de ts-VWF, e os fagos ligados foram eluídos e infectaram células TG-1. A expressão foi induzida por adição de isopropil-l-tio^-D-galactopiranósido 1 mM a uma cultura de células TG-1 (OD600nm=0,5) , e as proteínas periplasmáticas foram extraídas como descrito29 e analisadas quanto à ligação ao VWF/A1(1238-1481) revestido (2 pg/mL) . A ligação foi detectada com um anticorpo policlonal de coelho anti-lama (Dakocytomation) e um anticorpo de cabra anti-coelho conjugado a HRP (Ablynx, Zwijnaarde, Bélgica). O DNA de todos os clones positivos foi digerido com Hinfl, e clones com diferentes padrões de Hinfl foram utilizados para transformação na estirpe não supressora de E. coli, células WK-6.27 Amostras periplasmáticas foram preparadas como descrito e domínios variáveis de anticorpos foram purificados até à homogeneidade utilizando resina Ni2+/NTA.

Ensaio de competição 30 A especificidade da interacção entre o AU/VWFa-ll e vWF activado foi avaliada num ensaio imunoabsorvente, no qual pd-vWF purificado (3,7 nM) foi imobilizado em cavidades de microtitulo (Costar, Cambridge MA, E.U.A.). As cavidades foram bloqueadas com PBS contendo 3% BSA e 0,1% Tween-20 durante 1 hora a 37°C e foram incubadas com diferentes concentrações de um Nanocorpo de referência (de acordo com WO 04/062551) e AU/VWFa-ll biotinilado (0-625 nM) em PBS durante 1 hora a 37°C. A ligação dos domínios variáveis de anticorpos foi monitorizada com estreptavidina conjugada a HRP, e determinou-se a concentração dos anticorpos à ligação semi-máxima. Estas concentrações foram utilizadas no ensaio de competição, no qual cavidades revestidas com pd-vWF foram incubadas com qualquer um dos anticorpos na ausência ou presença de concentrações indicadas de ts-vWF ou ts-vWF pré-incubado com 1 mg/mL de ristocetina (5 minutos à temperatura ambiente) (vWF solúvel 0-115 nM para o Nanocorpo de referência e 0-38 nM para o AU/VWFa-ll). Após lavagem, as cavidades foram incubadas com estreptavidina conjugada a HRP (Dakocytomation, Dinamarca) e a ligação foi detectada medindo a actividade de HRP utilizando o-fenilenodiamina (OPD) como substrato.

Análise de Ressonância de Plasmões de Superfície

Foram conduzidos estudos de ligação por Ressonância de Plasmões de Superfície (SPR) utilizando um sistema Biacore 2000 (Biacore AB, Uppsala, Suécia). O AU/VWFa-ll foi imobilizado num "chip" sensor CM5 utilizando o estojo de acoplamento de amina como recomendado pelo fornecedor (Biacore AB, Uppsala, Suécia). Utilizou-se como controlo V128H, um nanocorpo que reconhece o domínio A3 do vWF. A ligação do VWF/A1(1238-1281), VWF/Al(1261-1468) e VWF/A1 31 (1261-1468)- R1306Q (uma mutação do tipo 2B) ao canal revestido com AU/VWFa-11 foi corrigida quanto à ligação ao canal revestido com V128H. A ligação das construções de vWF aos nanocorpos imobilizados foi efectuada em NaCl 150 mM, Hepes 25 nM, 0,005% Tween-20 (pH 7,4) a 25°C, com uma taxa de fluxo de 5 pL/minuto. A superfície foi regenerada por aplicação subsequente de trietilamina 50 mM e tampão de formato (NaHCC>2 10 mM e NaCl 150 mM pH 2,0) .

Adesão estática de células CHO que expressam o complexo GpIb-IX—V a vWF imobilizado

Ts-vWF (37 nM) foi imobilizado durante a noite a 4°C em cavidades de microtítulo (Nunclon, NUNC, Dinamarca) em NaHCCb 50 mM (pH 9,6). As cavidades foram bloqueadas com 0,5% PVP em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente e foram incubadas com AU/VWFa-11 1,25 μΜ ou Nanocorpo de referência (1 hora à temperatura ambiente). Após lavagem três vezes com PBS, foi permitida a ligação de células CHO que expressam o complexo GpIb-IX-V (oferta generosa do Dr. Lopez), 1 x 105 células em DMEM contendo 0,1% BSA) a vWF imobilizado (90 minutos a 37°C) na presença ou ausência do Nanocorpo de referência ou AU/VWFa-11 (1,25 μΜ). As cavidades foram lavadas e a ligação das células foi detectada medindo a actividade intrínseca de fosfatase alcalina das células CHO, utilizando como substrato fosfato de p-nitrofenilo (PNP, Sigma) diluído em tampão de lise (3 mg/mL de PNP em 1% Triton-X-100, ácido acético 50 mM, pH 5, 0) .

Adesão de plaquetas a Colagénio do tipo III e vWF 32

As perfusões sobre colagénio do tipo III foram efectuadas com sangue completo, recolhido de voluntários saudáveis que negaram terem ingerido aspirina ou outros fármacos anti-inflamatórios não esteróides durante os 10 dias precedentes, em 0, 1 volumes de 50 pg/mL de PPACK (H-D-Phe-Pro-Arg-Clorometilcetona, Bachem, Torrence, CA E.U.A.) e 20 U/mL de Pentassacárido. Lamelas Thermanox (NUNC, Dinamarca) foram revestidas com colagénio do tipo III , e sangue completo foi submetido a perfusão sobre as lamelas durante 5 minutos a 1600 s_1. As perfusões sobre lamelas revestidas com vWF foram efectuadas com sangue reconstituído a uma velocidade de cisalhamento de 1600 s_1 como descrito.30 Após a perfusão, as lamelas foram lavadas, fixadas e coradas30 e a adesão de plaquetas foi avaliada utilizando análise computacional com o "software" ÓPTIMAS 6.0 (Dutch Vision Systems BV, Breda, Países Baixos). Todas as perfusões foram efectuadas 3 vezes.

Materiais de pacientes

Recolheram-se amostras de plasma de dadores saudáveis (n=9), de pacientes com vWD do tipo 2B (n=10) e de pacientes com TTP adquirida (n=12) ou congénita (n=5) em citrato a 3,1% utilizando um sistema Vacutainer. A vWD do tipo 2B foi diagnosticada em famílias com o padrão típico de uma perturbação autossómica hereditária de hemorragia com trombocitopenia, elevada agregação plaquetária induzida por ristocetina e ausência de multímeros de vWF altamente multimérico em electroforese em gel. Os pacientes com púrpura trombocitopénica trombótica adquirida foram caracterizados por trombocitopenia, anemia hemolítica negativa em Coombs e presença de eritrócitos fragmentados no sangue periférico. Foram excluídas outras causas de 33 anemia hemolítica e trombocitopenia e todos os pacientes foram tratados com mudança de plasma. Observou-se em todos os pacientes uma resposta à mudança de plasma. Recolheram-se amostras de plasma antes do tratamento, tendo-se verificado ausência de actividade da ADAMTS-13 nestas amostras. Amostras de plasma de cinco pacientes com uma forma congénita de TTP foram amavelmente fornecidas pelo Dr. J.P. Girma (Hopital de Bicetre, Paris, França). Plasma pobre em plaquetas (PPP) foi transferido em alíquotas e congelado a -80°C. Para plasma reunido normal (NPP), PPP de 40 dadores saudáveis foi reunido e armazenado em alíquotas a -80°C. Todos os pacientes deram o seu consentimento informado à amostragem de sangue destinado a fins científicos.

Ensaio imunoabsorvente quanto ao vWF activado

Os níveis de antigene vWF foram quantificados como descrito anteriormente.26 Cavidades de microtítulo (Maxisorb, NUNC, Dinamarca) foram revestidas, durante a noite a 4°C, com 5 pg/mL de AU/VWFa-11 em NaHC03 50 mM (pH 9,6) e foram bloqueadas com PBS contendo 3% BSA e 0,1% Tween-20 durante 30 minutos a 37°C. As cavidades foram lavadas 3 vezes com PBS contendo 0,1% Tween-20 e foram incubadas com meio de cultura contendo ts-VWF ou VWF-R1306Q, ou amostras de plasma (1 hora 37°C). Todas as amostras foram diluídas em PBS para uma concentração de vWF entre 0,23 e 1,85 nM. Após lavagem três vezes com PBS-Tween, as placas foram incubadas com anti-vWF policlonal conjugado a HRP (1,3 pg/mL) em PBS durante 1 hora a 37°C. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS-Tween, e a ligação foi detectada medindo a actividade de HRP utilizando como substrato o-fenilenodiamina (Merck, Alemanha). Utilizou-se plasma reunido normal (NPP) como 34 padrão em cada ELISA. 0 declive das diferentes amostras de plasma foi comparado com o declive da ligação a NPP utilizando a equação 1. 0 factor calculado com a equação 1 foi denominado factor de activação. (decliveamostra/decliveNPp) = factor de activação (Equação 1)

Variação do ensaio imunoabsorvente de AU/VWFa-11

Para determinar a variação intra-experiências do ensaio imunoabsorvente de AU/VWFa-11, cavidades de uma placa de microtitulo revestidas com AU/VWFa-11 foram incubadas com uma amostra (indivíduo normal n° 7) 10 vezes. Além disso, a amostra n° 7 foi medida em 10 experiências diferentes, para determinar a variação inter-experiências. Utilizou-se NPP como padrão e calculou-se o factor de activação. A variação intra-experiências foi 7,1% e a variação entre experiências diferentes foi 13,7%.

Análise e estatística de dados A análise de dados de SPR e de dados do ensaio imunoabsorvente de AU/VWFa-11 foi efectuada utilizando Graph Pad Prism (GraphPad Prism versão 4.0 para Windows, GraphPad Software, San Diego, CA). Os dados foram expressos em média com desvio padrão. Conduziu-se um teste t desemparelhado com correcção Welch para comparar os níveis médios de vWF activado entre os diferentes grupos de pacientes. Um p < 0,05 foi considerado significativo.

Resultados 35

0 Nanocorpo AU/VWFa-11 reconhece especificamente a conformação activa do vWF

Para se obterem anticorpos que reconhecem predominantemente o vWF activado mas não nativo, um lama foi imunizado com preparações de vWF purificado que continham UL-vWF (dimensão dos multimeros maior do que 20 subunidades). Subsequentemente, o repertório de anticorpos do animal foi clonado e seleccionaram-se domínios variáveis de anticorpos monoclonais quanto à sua capacidade para se ligarem a vWF imobilizado por tecnologia de expressão em fagos. Os domínios variáveis de anticorpos anti-vWF que foram isolados por este procedimento foram então rastreados quanto à ligação a um fragmento AI recombinante imobilizado. Dos domínios variáveis que foram obtidos seleccionaram-se dois para análise suplementar, AU/VWFa-11 e um Nanocorpo de referência. Os dois domínios foram monitorizados quanto à sua capacidade para distinguir vWF nativo de vWF activado por ristocetina. Para esta finalidade, ts-vWF recombinante purificado foi imobilizado em cavidades de microtítulo. Este procedimento conduz a alterações conformacionais na molécula, permitindo a ligação de anticorpos que são específicos para o vWF activado. Como esperado, ambos os anticorpos biotinilados ligaram-se ao vWF imobilizado de um modo dependente da dose e saturável. Obteve-se ligação semi-máxima a 62,5 nM para o Nanocorpo de referência ou a 1,9 nM para o AU/VWFa-11 (Fig. 1A/B). Utilizaram-se estas concentrações num ensaio de competição onde foi estudada a ligação dos anticorpos na presença de diferentes concentrações de ts-vWF solúvel ou ts-vWF pré-incubado com ristocetina (Fig. 1B) . A presença de uma concentração molar igual de ambos os competidores reduziu a ligação do Nanocorpo de referência biotinilado em 36 ±90%. Em contraste, a ligação de AU/VWFa-11 biotinilado não foi afectada na presença de um excesso molar de 20 vezes de ts-vWF, ao passo que o vWF activado com ristocetina interferiu na ligação de um modo dependente da dose. Aparentemente, o AU/VWFa-11 tem o potencial para reconhecer selectivamente vWF que está, pelo menos em parte, numa conformação activada.

AU/VWFa-11 reconhece epltopo no domínio AI A interacção entre o Nanocorpo AU/VWFa-11 e o domínio AI do vWF foi seguidamente investigada de forma mais pormenorizada. Em primeiro lugar, a interacção entre o AU/VWFa-11 e VWF/A1(1238-1481) foi monitorizada de forma quantitativa utilizando análise de SPR. Várias concentrações de VWF/A1(1238-1481) (0-500 nM) foram submetidas a perfusão sobre AU/VWFa-11 imobilizado (0,08 pmol/mm2) a uma taxa de fluxo de 20 pL/minuto. O VWF/A1(1238-1481) associou-se ao Nanocorpo imobilizado de um modo dependente da dose, saturável e reversível (Fig. 2A) . A análise baseada no equilíbrio da ligação do domínio AI isolado ao AU/VWFa-11 imobilizado revelou uma constante de afinidade de 77 nM. Numa abordagem alternativa, comparou-se a ligação do Nanocorpo AU/VWFa-11 a três variantes do domínio AI: VWF/A1(1238-1481) (que inclui regiões flanqueadoras do domínio Al), VWF/A1(1261-1468) (que não tem as regiões flanqueadoras) e VWF/A1(1261-1468)-R1306Q (que contém a mutação do tipo 2B Argl306 em Gin). Os três domínios VWF/A1 foram submetidos a perfusão sobre um "chip" sensor CM5 revestido com AU/VWFa-11 (0,12 pmol/mm2), a uma taxa de fluxo de 5 pL/minuto, e ligaram-se ao Nanocorpo (Fig. 2B). A perfusão de VWF/A1 (1261-1468) sobre o "chip" revestido com AU/VWFa-11 originou um sinal maior 37 do que a perfusão de VWF/A1(1238-1481). Além disso, o VWF/A1(1261-1468)-R1306Q ligou-se de modo mais eficiente do que o VWF/A1(1261-1468). Estes resultados podem sugerir que a exposição do epitopo do Nanocorpo AU/VWFa-11 se baseia, de facto, na activação do domínio AI.

Gplb e AU/VWFa-11 ligam-se a regiões diferentes do domínio AI A conformação induzida pela ristocetina, imobilização de vWF ou uma mutação de vWD do tipo 2B promove a ligação à Gplba, e esta conformação também é especificamente reconhecida pelo AU/VWFa-11. Em consequência, considerou-se a possibilidade de o AU/VWFa-11 e Gplba se ligarem a regiões semelhantes no domínio AI. Isto foi primeiramente testado num ensaio de adesão estática, no qual se permitiu a ligação de células CHO que expressam o complexo GpIb-IX-V a ts-vWF imobilizado na presença ou ausência do Nanocorpo de referência acima ou do Nanocorpo AU/VWFa-11. Como esperado, as células CHO ligaram-se de modo eficiente ao vWF imobilizado (Fig. 3A), confirmando que a imobilização do vWF induz a mudança para uma conformação de ligação à Gplb. Esta interacção foi parcialmente inibida (até 59%) por 1,25 μΜ do Nanocorpo de referência. Em contraste, mesmo na presença de AU/VWFa-11 1,25 μΜ, a ligação das células CHO ao vWF imobilizado não foi afectada, sugerindo que o sítio de ligação para o AU/VWFa-11 é distinto do sítio de ligação para a Gplba.

Uma vez que o efeito de ambos os Nanocorpos na ligação do vWF à Gplba pode ser diferente em condições de fluxo, estudou-se o seu efeito num ensaio de perfusão. Sangue completo humano foi submetido a perfusão sobre uma 38 superfície de colagénio do tipo III a cisalhamento elevado (1600 s_1). Nestas condições, a adesão de plaquetas depende totalmente da interacção entre o vWF e a Gplba.31 Na ausência de Nanocorpos, estas condições originaram uma cobertura de plaquetas de 67,8 ± 8,3% (n=3) (Fig. 3B). A presença do Nanocorpo de referência foi associada a uma cobertura decrescida de plaquetas (49,8 ± 4,5% e 24,9 ± 3,1% na presença de anticorpo 31,3 e 125 nM, respectivamente) (Fig. 3C). Em contraste, mesmo na presença de anticorpo AU/VWFa-11 625 nM, a cobertura de plaquetas ainda foi semelhante à ocorrida na sua ausência (73,3 ± 4,4%, Fig. 3D) . Além disso, a adesão de plaquetas a uma superfície de vWF não foi afectada na presença de AU/VWFa-11 (Fig. 3E/F). Estes dados são compatíveis com a perspectiva de que a Gplba e anticorpo AU/VWFa-11 se ligam a diferentes regiões do domínio AI.

Ensaio imunoabsorvente para a detecção de vWF activado em solução

Apesar de a Gplba e Nanocorpo AU/VWFa-11 se ligarem a sítios distintos do vWF, ambos têm em comum o facto de apenas reconhecerem o vWF na sua forma activada, que é induzida, por exemplo, por imobilização, ristocetina ou mutações de vWD do tipo 2B. Esta caracterí stica única possibilita a utilização deste anticorpo para a detecção de vWF activado em solução. Como primeiro exemplo, comparou-se a ligação de ts-VWF recombinante e VWF/R1306Q recombinante ao Nanocorpo AU/VWFa-11 imobilizado. Assim, este Nanocorpo particular foi imobilizado em cavidades de microtítulo e foi incubado com várias concentrações (0-3,7 nM) de ts-vWF e VWF/R1306Q na ausência e na presença de ristocetina. A quantidade de vWF ligado foi subsequentemente monitorizada 39 utilizando anticorpos policlonais conjugados a HRP contra o vWF. No que se refere ao ts-vWF foi possivel observar alguma ligação, mas os valores da absorvância permaneceram inferiores a 0,3 (Fig. 4). A adição de ristocetina originou um forte aumento da ligação, representado por um aumento de 6 vezes da absorvância (até 1,85). Esta diferença foi quantificada calculando os declives respectivos das partes lineares iniciais da curva. Este procedimento revelou que o declive para vWF/ristocetina aumentou 2,7 vezes comparado com o ts-vWF isolado. Foi possivel observar um aumento semelhante do declive, comparado com o ts-vWF, para o VWF/R1306Q na ausência de ristocetina (Fig. 4). Além disso, este aumento não foi suplementarmente intensificado na presença de ristocetina. Aparentemente, este ensaio proporciona uma ferramenta útil para detectar vWF em circulação contendo um domínio AI na conformação activa.

Detecção de vWF activado em plasma de pacientes

Uma vez que o Nanocorpo AU/VWFa-11 foi particularmente eficiente na detecção de vWF activo em solução, foi testado se este Nanocorpo poderia ser utilizado para a detecção de vWF activo em plasma de pacientes. Em primeiro lugar analisou-se o plasma de pacientes previamente definidos como sendo do tipo 2B, bem como de um grupo de indivíduos normais. Como referência utilizou-se plasma reunido normal (NPP) (ver materiais e métodos). Os valores de absorvância obtidos para NPP permaneceram baixos (Fig. 5A), e o declive foi fixado em 1. Também para cada um dos indivíduos normais só foram detectados valores baixos de absorvância, sugerindo quantidades pequenas de vWF activo nos seus plasmas (Fig. 5A) . O declive médio comparado com NPP foi 0,70±0,13 (n=9; Fig. 5B). Em contraste, foi possível 40 determinar quantidades elevadas de vWF activo nos plasmas dos pacientes com vWD do tipo 2B, como ilustrado pelos valores de absorvância fortemente aumentados (Fig. 5A) . Calculou-se o declive médio: 8,4±4,5 (n=10; p=0,0006 comparado com indivíduos normais; Fig. 5B) . Assim, este ensaio parece, de facto, ser útil para analisar a presença de vWF activo em plasma de pacientes.

Correlação entre a activação do vWF e a contagem de plaquetas É interessante notar que o factor de activação determinado para o vWF no plasma de pacientes com vWD do tipo 2B variou consideravelmente (1,95 - 14,0). Esta variação não foi encontrada no plasma de indivíduos normais (0,51 - 0,89). 0 vWF contendo mutações do tipo 2B liga-se espontaneamente a plaquetas, conduzindo a eliminação acrescida de plaquetas e vWF. Assim, considerou-se a possibilidade de a activação relativa do vWF em circulação ter influenciado a formação de complexos plaquetas-vWF. Para abordar esta questão, a contagem de plaquetas nas diferentes amostras de plasma foi medida e representada graficamente versus o factor de activação. Observou-se uma forte correlação inversa entre estes parâmetros (Fig. 5C, p < 0,003, R2=0, 7401).

Detecção de vWF activo em plasma de pacientes com TTP

Um segundo grupo de pacientes que foi analisado quanto à presença de vWF activo no seu plasma consistiu em pacientes sem actividade de ADAMTS-13, manifestada clinicamente como TTP. Foi possível distinguir dois grupos: um grupo foi definido como consistindo em pacientes com uma deficiência congénita de ADAMTS-13 (n=5), ao passo que um segundo grupo 41 tinha uma deficiência adquirida de ADAMTS-13 (n=12). Comparados com o grupo de indivíduos normais (ver acima), os pacientes com deficiência adquirida de ADAMTS-13 aparentaram ter níveis aumentados de vWF activo no seu plasma. Calculou-se o declive médio: 1,52±0,40 (p < 0,0001), significativamente maior comparado com o grupo de indivíduos normais. Também os pacientes com deficiência congénita de ADAMTS-13 tinham vWF activo no seu plasma. É interessante notar que a quantidade de vWF activo (declive=5,85 ± 3,3) estava aumentada não só comparada com os indivíduos normais (p < 0,03), mas também comparada com os pacientes com deficiência adquirida de ADAMTS-13 (p < 0,05). Além disso, não se observou sobreposição dos valores do declive entre cada um dos indivíduos normais e os dois grupos de pacientes. Isto sugere que o ensaio poderá ser útil para o diagnóstico de deficiência de ADAMTS-13, pois permite uma distinção rápida entre deficiência adquirida e congénita de ADAMTS-13.

vWF na conformação de ligação à Gplb na síndroma HELLP

Um terceiro estado patológico caracterizado por trombocitopenia é a síndroma HELLP (Hemólise, Enzimas do Fígado Aumentadas e Baixa Contagem de Plaquetas). Os níveis do antigene vWF estão aumentados durante a gravidez normal e ainda mais em pacientes que sofrem de pré-eclâmpsia e HELLP (hemólise, enzimas do fígado aumentadas e baixa contagem de plaquetas), que é considerada uma forma grave de pré-eclâmpsia. HELLP é caracterizada por trombocitopenia consumptiva e é um risco de morbidez e mortalidade maternas e neonatais. Analisou-se a ligação do vWF ao AU/VWFa-11 num ensaio imunoabsorvente para controlos grávidos normais (n=9), pacientes com pré-eclâmpsia (n=6) e pacientes 42 durante a síndroma HELLP (n=44). 0 factor de activação calculado para pacientes com pré-eclâmpsia não estava significativamente aumentado comparado com os controlos grávidos normais. No entanto, em pacientes que sofrem de síndroma HELLP, o nível de vWF activado estava significativamente aumentado comparado com controlos grávidos normais (p < 0,0001) e comparado com pacientes com

pré-eclâmpsia (p < 0,0001). O factor de activação do vWF exibiu uma correlação significativa com os níveis do antigene vWF e com a actividade do cofactor da ristocetina vWF medidos nas mesmas amostras (coeficiente de correlação de Spearman 0,908, p < 0,0001).

Discussão

Durante a adesão de plaquetas à parede do vaso lesionado, o vWF funciona como ponte molecular entre a matriz subendotelial exposta e o complexo GpIb-IX-V. Para a interacção entre a Gplba e o domínio AI do vWF é necessária activação por uma mudança do modo de não ligação para o modo de ligação. Apesar de, em vários estados patológicos, como vWD do tipo 2B e TTP, ocorrer interacção espontânea entre o vWF e plaquetas, até à data não foi desenvolvido nenhum ensaio para detectar a presença dessas moléculas de vWF activado directamente no plasma. São aqui descritos anticorpos e seus domínios variáveis que são capazes de distinguir entre o estado de repouso e o estado activado do vWF. Utilizando este anticorpo foi mostrado que o vWF activado circula no plasma de pacientes com vWD do tipo 2B e TTP.

Para desenvolver um anticorpo que conseguisse distinguir entre a conformação de ligação e não de ligação à Gplb do 43 vWF imunizaram-se lamas com ts-vWF recombinante. Os lamas produzem uma proporção substancial das suas imunoglobulinas funcionais na forma de homodimeros de cadeias pesadas sem cadeias leves.32 Estes anticorpos são pequenos (16 kD) e foi relatado que reagem especificamente e com afinidade elevada com os seus antigenes.27 Além disso, é relativamente fácil gerar uma biblioteca e rastrear muitos anticorpos utilizando tecnologia de expressão em fagos. Este procedimento deu origem a um Nanocorpo, AU/VWFa-11, que se verificou reconhecer especificamente o domínio AI se o vWF fosse pré-incubado com ristocetina (Figura 1) . 0 sítio de ligação do AU/VWFa-11 no domínio AI do vWF também ficou exposto quando foi introduzida uma mutação de vWD do tipo 2B, R1306Q (Figura 2B e 4). Dumas et al.33 mostraram num modelo que a mutação R1306Q induz uma alteração conformacional que origina uma interacção forte e espontânea com a Gplb. Isto pode sugerir que o AU/VWFa-11 se liga a uma região que apenas fica exposta quando o vWF está numa conformação de ligação à Gplb.

Considerámos a possibilidade de o AU/VWFa-11 reconhecer uma região no sítio de ligação da Gplba. No entanto, a ligação induzida por botrocetina do vWF à Gplba recombinante não foi afectada por um excesso de AU/VWFa-11. Além disso, a ligação de células CHO que expressam o complexo GpIb-IX-V a vWF imobilizado e a ligação de plaquetas a colagénio do tipo III, ou vWF em condições de fluxo, permaneceram inalteradas na presença de um excesso do Nanocorpo. Estas observações sugerem que a Gplba e AU/VWFa-11 se ligam a sítios diferentes do domínio Al, ou que a afinidade da Gplba para o seu sítio de ligação é mais elevada do que a afinidade do AU/VWFa-11. 0 último caso é improvável, pois 44 sabe-se que anticorpos de lama se ligam aos seus antigenes com afinidade elevada.27

Numa tentativa para identificar suplementarmente o sitio de ligação para o AU/VWFa-11 estudou-se a ligação de dois domínios Al diferentes ao domínio do anticorpo. 0 domínio AI utilizado para a selecção dos anticorpos, VWF/A1(1238-1481), também continha os péptidos flanqueadores N e C-terminais do domínio Al. A análise de SPR revelou que a remoção destes péptidos flanqueadores melhorou a exposição do sítio de ligação para o AU/VWFa-11 (Figura 2B). Uma vez que o AU/VWFa-11 é específico para a conformação de ligação à Gplb do vWF, este resultado sugere que as regiões flanqueadoras do domínio Al desempenham um papel na mudança da conformação não de ligação para a de ligação. Estes resultados estão de acordo com o relato de Nakayama et al.34, que sugere que os péptidos flanqueadores influenciam a interacção entre a Gplba e o vWF.

Até à data, a activação de plaquetas induzida por ristocetina tem sido muitas vezes utilizada para medir a capacidade de ligação do vWF à Gplb. Este ensaio consegue medir a reactividade do vWF do plasma, mas baseia-se em agregação não fisiológica induzida por ristocetina. 0 AU/VWFa-11 foi especificamente concebido para distinguir o vWF nativo do vWF na conformação de ligação à Gplb. Para medir a actividade são necessárias apenas quantidades muito baixas de vWF, o que torna o ensaio imunoabsorvente baseado no AU/VWFa-11 adequado para medir o estado conformacional do vWF em doenças com níveis baixos do antigene vWF, como TTP. Além disso, o AU/VWFa-11 reconhece um sítio que fica exposto por activação, que pode ser induzida de vários modos, como imobilização do vWF, incubação com ristocetina 45 ou mutações vWD do tipo 2B. Isto torna o ensaio imunoabsorvente com AU/VWFa-11 muito útil para estudar o estado conformacional do vWF em diferentes estados patológicos. A caracteristica única do AU/VWFa-11 de distinguir entre a conformação de ligação e a não de ligação à Gplb do vWF possibilita estudar o vWF em plasmas de indivíduos saudáveis e pacientes que sofrem de vWD do tipo 2B e TTP. 0 plasma de indivíduos saudáveis e NPP exibiu apenas pouca ligação do vWF ao AU/VWFa-11 imobilizado, sugerindo que a maior parte do vWF em circulação está numa conformação não de ligação. Ocorreu alguma ligação residual, indicando que, mesmo em condições fisiológicas, uma proporção muito pequena das moléculas de vWF circula numa conformação activada.

Subsequentemente mediu-se o factor de activação do vWF em vWD do tipo 2B e TTP. Estas duas doenças distintas do ponto de vista fenotípico são caracterizadas por trombocitopenia causada por interacção espontânea plaquetas-vWF. Em ambas as doenças encontraram-se níveis significativamente aumentados de vWF activado em comparação com indivíduos normais (Figura 5 e 6). Além disso observou-se uma correlação inversa entre a activação medida para o vWF em plasma de pacientes com vWD do tipo 2B e os números de plaquetas (Figura 5C). Isto indica um papel directo do vWF activado no surgimento de trombocitopenia. É interessante notar, quando o AU/VWFa-11 foi incubado com plasma de pacientes com TTP congénita, que se verificou que o factor de activação não só estava significativamente aumentado em comparação com indivíduos normais mas também 46 em comparação com pacientes com TTP adquirida. Recolheram-se amostras de plasma de pacientes com TTP adquirida ao serem admitidos no hospital, antes do tratamento com mudança de plasma. Nesta altura, uma parte substancial do vWF activado estava presente nos trombos ricos em plaquetas presentes na microvasculatura. Isto poderá explicar as diferenças dos níveis de vWF activado entre TTP adquirida e congénita. Por outro lado, o diferente contexto molecular de TTP adquirida e congénita também poderá ser responsável pela diferença na activação do vWF. Apesar de ser necessário conduzir outros estudos, o ensaio imunoabsorvente com AU/VWFa-11 parece ser um meio útil para distinguir entre TTP adquirida e congénita.

Em resumo, o novo Nanocorpo descrito aqui é capaz de distinguir entre o estado de repouso e o activado do vWF. 0 ensaio imunoabsorvente com AU/VWFa-11 possibilita a detecção de vWF activado no plasma, o que o torna num meio muito útil para investigar o papel do vWF em diferentes doenças.

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Lisboa, 21 de Setembro de 2010

Claims (19)

1. 52 REIVINDICAÇÕES 1. Método para distinguir diferentes estados ou formas de doenças e perturbações caracterizadas por trombocitopenia e/ou por interacção espontânea entre o Factor de von Willebrand (vWF) e plaquetas e/ou para prever a progressão dessa doença ou perturbação, cujo método compreende os passos seguintes: a) proporcionar pelo menos uma amostra biológica que contém vWF obtido de um paciente que sofre ou que se suspeita sofrer de pelo menos uma doença ou perturbação caracterizada por trombocitopenia e/ou por interacção espontânea entre o vWF e plaquetas; b) determinar na referida amostra biológica a quantidade de vWF que está numa conformação de ligação à Gplb, e c) comparar a quantidade obtida de vWF que está numa conformação de ligação à Gplb com um valor de referência obtido de um paciente ou grupo de pacientes sem ou com um estado ou forma diferente da referida doença ou perturbação, e d) em que a quantidade de vWF que está numa conformação de ligação à Gplb é determinada por contacto da amostra biológica com um agente de ligação que é capaz de se ligar especificamente ao vWF que está numa conformação de ligação à Gplb na presença de vWF que está numa conformação 53 não de ligação à Gplb, e depois determinação da quantidade de vWF que está numa conformação de ligação à Gplb ligado ao agente de ligação, em que o agente de ligação tem um sitio de ligação distinto do sitio de ligação da Gplba e em que o agente de ligação é um anticorpo, uma parte ou fragmento de um anticorpo ou uma proteína ou polipéptido que contém uma ou mais partes ou fragmentos de um anticorpo.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o agente de ligação é capaz de distinguir vWF que está numa conformação não de ligação à Gplb e vWF activado por ristocetina.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o agente de ligação é uma proteína ou polipéptido que é capaz de se ligar especificamente a vWF que está numa conformação de ligação à Gplb na presença de vWF que está numa conformação não de ligação à Gplb.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o agente de ligação é um anticorpo de cadeias pesadas que é capaz de se ligar especificamente a vWF que está numa conformação de ligação à Gplb na presença de vWF que está numa conformação não de ligação à Gplb; uma parte ou fragmento de um anticorpo de cadeias pesadas, em que a referida parte ou fragmento que é capaz de se ligar especif icamente a vWF que está numa conformação de ligação à Gplb na presença de vWF que está numa conformação não de ligação à Gplb, ou uma proteína ou polipéptido que contém uma ou mais partes ou fragmentos de um anticorpo de cadeias pesadas, em que pelo menos 54 uma das referidas partes ou fragmentos é capaz de se ligar especificamente a vWF que está numa conformação de ligação à Gplb na presença de vWF que está numa conformação não de ligação à Gplb.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o agente de ligação é um domínio variável de um anticorpo, em que o referido domínio variável é capaz de se ligar especificamente a vWF que está numa conformação de ligação à Gplb na presença de vWF que está numa conformação não de ligação à Gplb, ou uma proteína ou polipéptido que contém um ou mais domínios variáveis, em que pelo menos um dos referidos domínios variáveis é capaz de se ligar especificamente a vWF que está numa conformação de ligação à Gplb na presença de vWF que está numa conformação não de ligação à Gplb.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que pelo menos um dos referidos domínios variáveis é um domínio variável de uma cadeia pesada.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 5, em que pelo menos um dos referidos domínios variáveis é um domínio variável de um anticorpo de cadeias pesadas.
8. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- 7, em que o agente de ligação é um Nanocorpo que é capaz de se ligar especif icamente a vWF que está numa conformação de ligação à Gplb na presença de vWF que está numa conformação não de ligação à Gplb, ou uma proteína ou polipéptido que contém um ou mais Nanocorpos, em que pelo menos um dos referidos Nanocorpos é capaz de se ligar especificamente a vWF 55 que está numa conformação de ligação à Gplb na presença de vWF que está numa conformação não de ligação à Gplb.
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, em que o agente de ligação é o anticorpo de cadeias pesadas AU/VWFa-11; uma parte ou fragmento do anticorpo de cadeias pesadas AU/VWFa-11 e, em particular, o domínio variável do anticorpo de cadeias pesadas AU/VWFa-11, ou uma proteína ou polipéptido que contém uma ou mais partes ou fragmentos do anticorpo de cadeias pesadas AU/VWFa-11 e, em particular, que contém pelo menos um domínio variável do anticorpo de cadeias pesadas AU/VWFa-11.
10. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a amostra biológica é uma amostra que contém vWF e plaquetas.
11. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a amostra biológica é escolhida de sangue completo, plasma, soro ou outras fracções adequadas do sangue.
12. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a quantidade de vWF que está numa conformação de ligação à Gplb na amostra e o número de plaquetas da amostra são determinados e, opcionalmente, são comparados entre si.
13. 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que as doenças e perturbações caracterizadas por trombocitopenia e/ou por interacção espontânea entre o vWF e plaquetas são escolhidas do 56 grupo que consiste nas seguintes: Púrpura Trombocitopénica (TTP), síndroma HELLP, doença de von Willebrand do Tipo 2, Sepsia, síndroma antifosfolípido.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que as doenças e perturbações caracterizadas por trombocitopenia e/ou por interacção espontânea entre o vWF e plaquetas consistem em Púrpura Trombocitopénica (TTP) e em que o método é utilizado para distinguir pacientes com TTP adquirida de pacientes com TTP congénita.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 13, em que as doenças e perturbações caracterizadas por trombocitopenia e/ou por interacção espontânea entre o vWF e plaquetas consistem em pré-eclâmpsia ou síndroma HELLP e em que o método é utilizado para distinguir pacientes com pré-eclâmpsia de pacientes com síndroma HELLP.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 13, em que as doenças e perturbações caracterizadas por trombocitopenia e/ou por interacção espontânea entre o vWF e plaquetas consistem em pré-eclâmpsia e em que o método é utilizado para prever a progressão da referida pré-eclâmpsia e, em particular, para prever quais os pacientes com pré-eclâmpsia que desenvolverão HELLP e/ou determinar quais os pacientes que têm um risco acrescido de desenvolver HELLP.
17. 17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, em que o agente de ligação é imobilizado num suporte adequado. 57
18. 18. Utilização de um anticorpo que é capaz de se ligar especif icamente a vWF que está numa conformação de ligação à Gplb na presença de vWF que está numa conformação não de ligação à Gplb; de uma parte ou fragmento de um anticorpo, em que a referida parte ou fragmento é capaz de se ligar especificamente a vWF que está numa conformação de ligação à Gplb na presença de vWF que está numa conformação não de ligação à Gplb, ou de uma proteína ou polipéptido que contém uma parte ou fragmento de um anticorpo, em que a referida parte ou fragmento é capaz de se ligar especificamente a vWF que está numa conformação de ligação à Gplb na presença de vWF que está numa conformação não de ligação à Gplb, para distinguir diferentes estados ou formas de doenças e perturbações caracterizadas por trombocitopenia e/ou por interacção espontânea entre o vWF e plaquetas e/ou para prever a progressão dessa doença ou perturbação, e/ou num método para implementá-los, em que o anticorpo tem um sítio de ligação distinto do sítio de ligação da Gplba.
19. 19. Utilização de um anticorpo de acordo com a reivindicação 18, em que o anticorpo é utilizado como agente marcador para localizar trombos ou condições de velocidade de cisalhamento elevada na rede vascular de pacientes. Lisboa, 21 de Setembro de 2010