HU209650B - Process, agent and kit for diagnosis of prothrombic condition and/or hemostatic systhem - Google Patents

Process, agent and kit for diagnosis of prothrombic condition and/or hemostatic systhem Download PDF

Info

Publication number
HU209650B
HU209650B HU9202149A HU214992A HU209650B HU 209650 B HU209650 B HU 209650B HU 9202149 A HU9202149 A HU 9202149A HU 214992 A HU214992 A HU 214992A HU 209650 B HU209650 B HU 209650B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
vac
polypeptide
detectable marker
anticoagulant
blood
Prior art date
Application number
HU9202149A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Christiaan Reutelingsperger
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=6396455&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU209650(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Boehringer Ingelheim Int filed Critical Boehringer Ingelheim Int
Publication of HU209650B publication Critical patent/HU209650B/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
    • A61K49/0043—Fluorescein, used in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/087—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins the peptide being an annexin, e.g. annexin V
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4721—Lipocortins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2123/00—Preparations for testing in vivo
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4718—Lipocortins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2405/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving lipids
    • G01N2405/04—Phospholipids, i.e. phosphoglycerides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Separation Of Suspended Particles By Flocculating Agents (AREA)
  • Dental Preparations (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • External Artificial Organs (AREA)

Description

A találmány tárgyát protrombikus állapot és a hemosztatikus rendszer aktiválódásának kiindulási pontja és/vagy trombus kimutatására szolgáló reagens és diagnosztikai készlet (kit) és protrombikus állapot kimutatására szolgáló eljárás képezi.
A vér speciális, kötetlen sejtekből áll, amelyek plazmaközegben vannak diszpergálva. A sejt tartalmát a körülötte lévő plazmától úgynevezett plazma-membránok választják el. Ezen a membránok kettősréteget képező foszfolipidekből és olyan társult proteinekből épülnek fel, amelyek részben ebbe a kettősrétegbe vanna beágyazva, részben innen kinyúlnak.
A különböző foszfolipidek nem véletlenszerűen oszlanak meg a kettősréteg külső és belső rétege között, ugyanis a sejtek biztosítják e rétegek aszimmetrikus konfigurációját [Op den Kamp, J. A. E, Ann. Rév. Biochem. 48 47-71 (1979) Zwaal, R. F. A. Biochim. Biophys. Acta 575 163-205 (1978)]. Amíg a foszfatidil-kolin (PC) és a szfingomielin (SPH) a domináns fajták a külső rétegben, addig a foszfatidilszerin (PS), foszfatidil-etanolamin (PE) és a foszfatidil-inozit (Pl) főként a belső rétegben helyezkednek el, a citoszol felé fordulva. Ezen energiaemésztő aszimmetriás állapotnak rendkívül nagy a fiziológiai jeletősége. A PC és az SPH a foszfolipid család legerősebb inért tagjai és a plazma alkotórészeivel szembeni fölöttébb semleges viselkedésükkel éles ellentétet mutatnak a többi foszfolipid fajtával szemben. A külső rétegnek a plazmaproteinekkel szembeni reakció-restsége az abszolút feltétele annak, hogy a vér folyékony állapota fennmaradjon. Ugyanis a véralvadási kaszkádhoz tartozó speciális plazmaproteinek, az úgynevezett alvadási faktorok, ha aktiválva vannak, a vér folyékony állapotát szilárd állapottá tudják változtatni [Jackson, C. M. und Nemerson, Y. Ann. Rév. Biochem. 49 765-811 (1980)]. Az alvadási faktorokat a foszfolipidek, mint például a foszfatidil-szerin, képesek aktiválni.
Bizonyos esetekben, például a véredény sérülése után, kívánatos, sőt életszükséglet lehet, hogy a véralvadási faktorok aktiválódjanak. Ilyen esetben egy speciális vérsejt, a vérlemezke, felfüggeszti membránaszimmetriáját olyan aktiválási mechanizmusok révén, amelyek a foszfatidil-szerint a külső réteghez szállítják, ahol az alvadási faktorok aktiválását elősegíti [Bevers, E. M., Confurius, P. und Zwaal, R. F. A. Biochim. Acta 736 57-66 (1973)].
A vérlemezke plazma-membránja külső rétegének foszfolipid összetételében bekövetkező tervszerű változás a hemosztázis (vérzéscsillapítás) szempontjából nagy fiziológiai jelentőségű, amit például a Scottszindróma [Rosing, J. Bevers, E. M., Comfurius P, Hemker, H. C. can Dieifen, G. Weiss, H. J. und Zwaal R. F. A. Blood 65 1557-1561 (1985)] bizonyít.
A vérélettannak azonban része a kórtan is; azaz egyes esetekben a vér homeosztázisa kóros állapotba kerülhet, amint ez artériás, koronáriás és vénás trombózis esetében előfordul.
A hemosztázis zavarai rendszerint ismeretlen eredetűek (idiopátiásak), és így az orvosok nem tudják előre megjósolni fellépésüket, és nem tudnak profilaktikus terápiát sem elkezdeni.
A jelen találmánynak az a célkitűzése, hogy olyan módszert bocsásson rendelkezésre, amely a hemosztázis zavarainak korai felismerését segíti elő.
A kórtünetek kifejlődésével ellentétben a zavarok kifejlődése a legtöbb esetben lassan megy végbe. A kórtünetek nélküli progressziónak ebben a fázisában az úgynevezett protrombotikus folyamatos aktiválódása. E helyi aktiválódással együtt jelennek meg a perifériás erekben a vérlemezkék, amelyek az aktiválódás korai állapotában vannak. A vérlemezkék éppen belekezdtek külső membrán-rétegük megváltoztatásába. Foszfatidil-szerin van jelen a külső rétegben. Olyan módszereknek, amelyek ezt a protrombikus állapotot diagnosztizálják, igen nagy klinikai jelentősége lenne.
A perifériás erekben fellépő gyengén aktivált vérlemezkék mellett a teljesen aktivált vérlemezkék ott fognak megtapadni, ahol az érfal kóros állapotban van. Ez a hely váltja ki a hemosztatikus rendszer aktiválódását. Ennek a kóros helynek, valamint az itt képződő trombusnak (vérrögnek) a lokalizálása igen nagy terápiás előnyökkel járna.
A véralvadási mechanizmus tulajdonképpen enzimatikus reakciók lépcsőzetes folyamata (kaszkádja), amelynek a végén trombin képződik, amely a legvégén a fibrinogént fibrinné változtatja. A különböző prokoaguláns reakciókat, mint például a protrombinnak a Xa és Va faktorok révén történő aktiválását foszfolipid felületek katalizálják, ahová az alvadási faktorok kötődnek.
Azok között a proteinek között, amelyek foszfolipidekhez kötődnek és foszfolipid felülettől függő folyamatokkal függenek össze, van egy család, melynek tagjai foszfolipidekhez való kötődésükben Ca2+ függőek.
Ehhez a családhoz - tagjait annexineknek is nevezik - tartoznak a lipokortin I, kalpaktin I, protein II, lipokortin ΠΙ és p67-kalelektrin mellett a vaszkuláris antikoaguláns protein is (VÁC), valamint az IBC, PAP, PAPI, PP4, endonexin II és a lipokortin V.
Valószínűleg az annexinek közös strukturális ismertetőjegyei képezik az alapját annak, hogy Ca2+ és foszfolipid kötő tulajdonságaik hasonlóak. Jóllehet ez az általános tulajdonság minden annexinre érvényes, világos egyéni tulajdonsággal rendelkeznek a Ca2+-hoz és a különböző foszfolipidféleségekhez való affinitásuk tekintetében.
Az annexinek fiziológiai funkciói membránfolyamatokkal vannak összefüggésben. Megállapították, hogy a VÁC alvadásgátló hatásának alapmechanizmusa abból áll, hogy a foszfolipidek katalitikus kapacitását úgy gátolja, hogy a felületükhöz kötődik, s ezáltl meggátolja, hogy ezen a felületen alvadást előidéző komplexek képződjenek.
A kötődések vizsgálatai kimutatták, hogy a VÁC társulása a prokoaguláns foszfolipidekkel Ca2+ -függő folyamat.
Más bivalens kationok is - így a Cd2+, Zn2+, Mn2+
HU 209 650 Β és Co2+ - pozitívan befolyásolják az asszociációt, de nem olyan mértékben, mint a Ca2+.
Egyébként meglepő' módon azt találtuk, hogy a VÁC foszfolipidekhez való adszorpcióját a Ca2+ és Zn2+ ionok jelenléte rendkívül pozitívan befolyásolja.
Megállapítottuk, hogy a VÁC bizonyos plazma-kalcium koncentrációk mellett kötődik a foszfatidil-szerinhez, de nem kötődik a foszfatidil-kolinhoz és a szfingomlinhez. A VÁC tehát specifikusan felismeri a külső membrán rétegben PS-t tartalmazó perifériás vérlemezkéket. Ennélfogva a VÁC az érrendszerben specifikusan ismeri fel azokat a helyeket is, ahol PS érintkezik a vérrel.
A VÁC - és ugyanígy a többi annexin is - mivel meg tudja különböztetni a foszfolipideket, ideális reagensként jön számításba a fent ismertetett protrombotikus állapot korai felismerésében.
A jelen találmányban olyan módszereket ismertetünk, amelyekkel meglepő módon először vált lehetővé az érrendszer protrombikus állapotának a felismerése. E diagnózist olyan anyagok specifitása teszi lehetővé, amelyek képesek arra, hogy a vérlemezkék normál állapotához képest megváltozott, protrombikus állapotát felismerjék. Minthogy ezt az állapotot a vérlemezkék normál állapotától az különbözteti meg, hogy a protrombikus vérlemezkék külső rétege tartalmaz foszfatidil-szerint, ezért a találmány szerinti elv alkalmazásához lényegében minden olyan módszer alkalmas, amely a foszfatidil-szerint specifikusan meg tudja különböztetni a foszfatidilkolintól. A találmány szerint alkalmazott anyagokat a foszfatidil-szerinnel szembeni specífitásuk jellemzi, s ezt a leírásban ismertetett kötési kísérletekkel igazoljuk.
A találmány szerinti anyagok specifitásának a kihasználása azt is lehetővé teszi, hogy a hemosztatikus rendszer aktiválódásának a kiindulási pontját és/vagy a trombust lokalizáljuk.
A jelen találmány révén először állnak rendelkezésre olyan reagensek, amelyek egy feltehetően kialakulóban lévő egészségkárosító állapot korai diagnózisát teszik lehetővé, hogy ezáltal a megfelelő terápiás rendszabályokat foganatosíthassuk.
Az előnyös találmány szerinti anyagok az alvadásgátló polipeptidek, amennyiben ezek a foszfatidil-szerin-foszfolipidre nézve a szükséges specifitással rendelkeznek.
Különösen előnyös az annexinek családja, legfőképpen a VÁC.
Annak érdekében, hogy a találmány szerinti anyagok, főleg a VÁC, illetve más annexinek, diagnosztikumként való alkalmazása lehetővé váljék, ezeket ismert módszerekkel jelezni szükséges. Alkalmas jelölési mód lehet például a fluoreszkáló csoportokkal való jelzés vagy a radioaktív jelzés. Előnyösen alkalmazható fluoreszcens marker a fluoreszcein-izotiocianát és előnyös radioaktív markerek a halogének, főként a jód radioaktív izotópjai, például a 131I vagy a 125I vagy az ólom, higany, tallium, technécium vagy indium radioizotópjai (203Pb, 198Hg, 2O1T1, 99mTc, ‘in).
A fluoreszcein-izotiocianátot (SERVA) ismert módon (13) alkalmazzuk a VÁC jelzésére.
A jelzést paramágneses kontrasztanyaggal is végezhetjük, mely RMI rendszerben (magnetic resonance imaging) észlelhető. Itt felhasználhatók a gadolinium-, kobalt-, nikkel-, mangán- vagy vas-komplexek, melyekkel diagnosztikai hatóanyagokként szolgáló olyan konjugátumok állíthatók elő, amelyek MRI rendszerben észlelhetők. Ilyen rendszerekben erős mágneses teret létesítenek az atomok nukleáris spinvektorainak a szervezetben való beállítására. Ezt követően a mezőt megbontják, miáltal az atommagok visszatérnek a kiindulási állapotba. Ezt a folyamatot figyelik és rögzítik.
Az észlelhető markerrel rendelkező alvadásgátló polipeptidet intraartériásan vagy intravénásán adjuk be. Az alkalmazott mennyiséget úgy szabjuk meg, hogy az a megfelelő inkubációs időt követő méréshez elegendő legyen.
A protrombikus állapot kimutatásához a vizsgálandó vérhez - extrakorporálisan - hozzáadjuk a találmány szerint jelzett polipeptidet vagy az azt tartalmazó reagenst, adott esetben a plazma kalcium koncentrációját nem csökkentő egy további antikoaguláns - ilyen például a heparin - jelenlétében, s ezután a specifikus sejt-típusokhoz asszociált jelzést analizáljuk.
A találmány szerinti polipeptidet izotóniás vizes oldatban is a segédanyagokkal együtt is alkalmazhatjuk a találmány szerinti célra. Segédanyagként használhatunk például Tween 80-at, arginint, foszfátpuffert és fiziológiásán elviselhető konzerváló szereket. Egyéb, a szakemberek által jól ismert anyagok ugyancsak használhatók.
A radioaktív jelzés keresztülviteléhez például az ismert jodogén módszert [Franker P. J., Speck, J. C., Biophys. Rés. Comm. 80 849-857 (1978)], vagy a szokásos kloramin-T módszert alkalmazhatjuk. A131I 8 napos felezési ideje miatt az in vivő diagnózishoz ajánlott. A radioaktív jelzett anyagot izotóniás vizes oldatba vesszük fel. Steril szűrés után injektáljuk. Az egész testre kiteijedő szcintigráfiát gamma-kamerával, például 13II esetén az injekció utáni 1., 2., 4. és 7. napon végezzük el.
Az annexinek eredeti formái mellett módosított formák is használhatók a találmány szerinti alkalmazáshoz.
Főként az EP-A-0 293 567 számú európai szabadalmi bejelentésben leírt mutánsokra utalunk. Alkamazhatók tehát az annexinek fragmentumai vagy kémiailag módosított származékai is, amelyek specifikusak a foszfatidil-szerin/foszfatidil-kolin foszfolipidekre és így fel tudják ismerni az illető vérlemezkék protrombikus állapotát.
A találmány tárgyát képező megoldásban alvadásgátló polipeptidként az annexinek családjából származó VAC-ot alkalmazzuk, mely észlelhető jelzéssel van ellátva.
Észlelhető markerként fluoreszcens jelzést, előnyösen fluoreszcein-izotiocianátot, vagy halogén, technécium, ólom, higany, tallium vagy indium radioizotópot, előnyösen 13,I-t vagy 125I-t vagy paramágneses kontrasztanyagot tartalmaz.
HU 209 650 Β
A fent leírt alvadásgátló polipeptid a foszfatidilszerin és foszfatidil-kolin megkülönböztetésére alkalmas.
A találmány tárgyát képezik részletezve a következők:
- Eljárás a protrombikus állapot megállapítására, mely a következőket foglalja magába:
(a) a vizsgálandó vérhez extrakorporálisan az annexinek családjából való VÁC polipeptidet keverünk, amely észlelhető markert hordoz, és (b) a specifikus sejt-típusokhoz asszociált jelzést mérjük.
- Reagens, amely az annexinek családjához tartozó és észlelhető markénál jelzett alvadásgátló polipeptid (VÁC) mellett még segédanyagot is tartalmaz, például fiziológiás konyhasó oldatot, Tween 80-at, arginint és/vagy foszfát-puffért, és amelyben adott esetben olyan antikoagulánst előnyösen heparint - használhatunk, amely a plazma kalcium koncentrációját nem csökkenti.
- Diagnosztikai reagenskészlet (kit) a protrombikus állapot vagy a hemosztatikus rendszer aktiválásának kiindulópontja és/vagy egy trombus kimutatására, mely egy olyan találmány szerinti reagenst, amely egy olyan alvadásgátló polipeptidet (VÁC) tartalmaz, mely a foszfatidil-szerint a foszfatidil-kolintól megkülönböztetni képes, továbbá olyan segédanyagokat és adott esetben segédeszközöket, amelyek a kimutatás gyors elvégzését is lehetővé teszik.
A találmány szerinti alvadásgátló polipeptidek a foszfatidil-szerin és a foszfatidil-kolin megkülönböztetésére, ezáltal a diagnózisára alkalmazhatóak.
Anyagok és módszerek
A VÁC előállítását az EP-A-0 181 465 vagy az EP-A-0 293 567 számú európai szabadalmi bejelentés szerint végezzük. Az alábbi kísérleteket VÁC a-val végeztük, de az eredmények más annexinekre, főként a VÁC β-ra is átvihetők.
Lipidek
A Sigma Chemical Co. cégtől az alábbi anyagokat szereztük be:
Dioleil-foszfatidil-kolin (DOPC, Nr. P-1013),
Dioleil-foszfatidil-etanolamin (DOPE, Nr. P0510),
Kardiolipin (CL, Nr. C-5646),
Kardiolipin (CL, Nr. C-5646),
Dioleil-foszfatidil-glicerin (DOPG, Nr. P—9664),
Foszfatidil-nozit (Pl, Nr. P-0639),
Dioleil-foszfatidsav (DOPA, Nr. P-2767),
Sztearil-amin (SA, S-6755) és
Tojássárga szfingomielin (S-0756).
A DOPC és a DOPE tisztaságát vékonyréteg kromatográfiával ellenőriztük. A dioleil-foszfatidil-szerint a DOPC konverziójával [Confurius, P. and Zwaal, R. F. A. Biochim Biophys. Acta 488 1-42 (1977)] szerint állítottuk elő. A 14C-vel jelzett DOPS (specifikus aktivitás: 100 000 dpm/pg) beszerzése az Amersham cégtől történt.
Foszfolipid kettősrétegek előállítása szilícium-lemezeken
A foszfolipid kettősrétegeket „Langmuir-film balance” (Lauda FW-1 típus) segítségével, Corsel és munkatársai [Corsel, J. W. Williems, G. M. Köp, J. M. M„ Cuypers, P. A. and Hermens, W. Th., J. Colloid Interface Sci. 111 544-554 (1986)] által leírt módon visszük fel a lemezekre. A hidrofil szilícium-lemezeket 24 óra hosszat 30%-os krómkénsavban és vízben kezeljük és 50% etanol/víz elegyben tároljuk. A lemezeket alkalmazásuk előtt detergenssel és vízzel alaposan megtisztítjuk. A „film balance”-ot ionmentesített vízzel és 50 μΜ-os kalcium-kloriddal töltjük meg. Erre az első fázisra 20 μΐ olyan oldatot viszünk fel, amely körülbelül 2 g/1 foszfolipidet tartalmaz kloroformban. A kettősrétegben lévő DOPS frakciókat 14C-vel jelzett DOPS és DOPC keverékében vizsgáljuk. A kialakult kettősrétegeket a szilícium-lemezekről szcintillációs detergenssel (Du Pont Formel-989) távolítjuk el, és az össz-radioaktivitást szcintillációs számlálóban mérjük.
A kötés mérése ellipszometriával
A VÁC adszorpcióját a foszfolipid-kettősrétegekhez automatikus ellipszométer segítségével mértük (2,3).
A kötési kísérleteket hidrofil küvettában végezzük, mely 5 ml kevert puffért tartalmaz (0,05 M trisz. HC1; 0,1 M NaCl; pH = 7,5; T = 20 °C). A kétértékű kationokat klorid formában, lépésenként adagoljuk.
pg/ml VÁC koncentrációknál a specifikus VÁC koncentrációt tartalmazó puffért folyamatosan adagoljuk, hogy a VÁC részére kielégítő pufferkapacitást biztosítsunk.
A kombinált polarizáló és analizáló adatokból meghatározzuk a reffaktív indexet és az adszorbeált film vastagságát (d) (4). Az adszorbeált proteinréteg menynyiségét (Γ) a refraktív indexből és vastagságát a módosított Lorentz-Lorenz egyenletből [1] határozzuk meg:
Γ= 3d(n2-nb2)/[(n2+2)(r(nb2+2)-v(nb2-l))] [1], ahol nb a puffer reffaktív indexe.
A specifikus moláris aktivitásra az r = 0,254 és a parciális specifikus térfogatra a v = 0,71 értéket alkalmaztuk [Köp, J. Μ. M. Cuypers, P. A., Lindhout, Th., Hemker, H. C. and Hermens W. Th., J. Bioi, Chem. 259 13993-13998 (1984)].
Eredmények
Divalens kationok hatása a VÁC foszfolipidekhez való kötődésére
A VÁC a kalcium koncentrációitól függően kötődött a 20% DOPS/80% DOPC-ból álló foszfolipid membránokhoz. Ezt követően EDTA adása azonnali és teljes deszorpcióhoz vezetett (1. ábra). A szabad Ca2+ ion koncentráció változtatásával többször ki lehetett váltani az adszorpciót anélkül, hogy az adszorbeált mennyiség vagy az adszorpció sebessége észrevehetően változott volna. Nem valószínű tehát, hogy a VÁC molekulák vagy a foszfolipid kettősrétegek irreverzíbi4
HU 209 650 Β lisen megváltoznak az adszorpció vagy a deszorpció következtében. A kötés ugyancsak teljesen reverzibilis volt, amikor a küvettát Ca2+-mentes pufferrel mostuk.
A VÁC foszfolipidekhez való kötődésének Ca2+függését a 2. ábrán mutatjuk be. A Ca2+-dózis - hatás görbe teljesen egyértelműen mutat egy olyan Ca2+ koncentrációt, amelynél a maximális VAC-adszorpció felét lehet elérni: [Ca2+J1/2. A [Ca2+],/2 érték a foszfolipid felületének az összetételétől függ. Azon foszfolipid felületek esetén, amelyek 100%, 20%, 5% és 1% DOPS tartalmúak, a következő [Ca2+]1/2 értékeket mértük: 26 μΜ, 220 μΜ, 1,5 μΜ, illetve 8,6 mM (1. táblázat). Ezek az eredmények jól egyeznek az endonexin H-nek (=VAC) PS/PC ekvimoláris keverékéből álló vezikulákhoz való kötődésénél mért 53 μΜ-os [Ca2+1/2-értékkel (6)]. Az adszorbeált protein maximális mennyisége (Fmax) független volt a membrán DOPS frakciójától és körülbelül 0,217 μg/cm2-t tett ki. Tiszta DOPC-kettősrétegek esetén - 3 mM Ca2+ koncentrációig - nem lehetett adszorpciót megállapítani.
Az 5. ábrán mutatjuk be a VÁC adszorpcióját a különböző összetételű foszfolipid kettősrétegekhez. Itt is megnyilvánult, hogy tiszta DOPC-kettősrétegeknél gyakorlatilag nem lehetett VÁC adszorpciót megfigyelni. Ugyanígy gyenge a VÁC adszorpciója sztearilaminhoz (SA).
A nem Ca2+ ionokkal végzett kísérletekben megállapítottuk, hogy a VÁC kötődése a foszfolipidekhez nagymértékben Ca2+-specifikus (3. ábra). ACd2+, Zn2+, Mn2+ és a Co2+ kis mértékben mozdították elő a kötődést; a Ba2+ és a Mg2+ ionoknak nem volt befolyásuk. A kationoknak ez a tulajdonsága bizonyára az ion sugarával van összefüggésben.
Cink színergizmus
A cink ionok magas koncentrációban (1 mM) is csak csekély mértékben mozdítják elő a VÁC adszorpcióját (3. ábra); 50 μΜ egyáltalán nem befolyásolja az adszorpciót. Ez a koncentráció Ca2+ jelenlétében meglepő módon befolyásolja az adszorpciót: szinergizmus figyelhető meg. A [Ca2+]1/2 érték 8,6 mM-ról 2,7 mMra esik a csak 1% DOPS tartalmú kettősrétegek esetén ([Zn2+] = 50 μΜ) (4. ábra). Az 50 μΜ [Zn2+] a plazma cink koncentrációjának normál tartományán belül van.
Diagnosztikai eljárások
1. In vitro diagnózis (a) A VÁC jelzését ismert módon, fluoreszcein csoporttal, például fluoreszcein-izotiocianáttal (FITC) végezzük [Reisher, J. I. and Orr, H. C., Anal. Biochem. 26 178-179 (1986)]; így jutunk a VAC-FITC-hez.
(b) A plazma kalcium koncentrációját nem csökkentő alvadásgátlót (például heparint) tartalmazó műanyag csövecskébe vért veszünk.
(c) Összekeverés után a vérsejteket FACS (fluorescein activated cell sorter) segítségével analizáljuk. Ez az analízis a specifikus sejt-típusokhoz társult fluoreszcencia intenzitást határozza meg.
(d) Az analízisek képe a VAC-FITC-cel kötődött vérlemezkék mennyiségét mutatja, azaz a kihelyeződött PS-sel rendelkező vérlemezkék, s így protrombikus állapot fennállását. Ezen egészséget veszélyeztető állapotot ilyen módon időben felismerhetjük, tehát időben gyógyíthatjuk.
2. In vitro diagnózis (a) A VÁC jelzését ismert eljárással, rövidéletű izotóppal, például l31I-dal végezzük; így jutunk a 131IVAC-hoz.
(b) A131I-VAC készítményt intravénásán adjuk be a betegnek.
(c) Bizonyos inkubációs idő után a beteget teljes vagy részleges test-szcintigráfiának vetjük alá. A radioaktivitás eloszlását egy large-field-of-view gamma-kamerával figyeljük.
(d) Azok az intravaszkuláris helyek, ahol a 131IVAC akkumulálódott, jelzik azokat a helyeket, ahol a trombózis előrehalad. Időben megkezdhetők az alkalmas trombózist gátló, illetve trombózist gyógyító eljárások.
1. Radioaktív jelzés
1.1. Előkészítés
1.1.1. 500 mmól/l nátrium-foszfát puffer előállítása liter bidesztillált vízben feloldunk 24,5 g nátriumdihidrogén-foszfát monohidrátot és 1 liter bidesztillált vízben feloldunk 35,5 g dinátrium-hidrogén-foszfátot. Ez utóbbi oldathoz hozzáadjuk az előző oldatot pH = 7,5 eléréséig.
1.1.2. 150 mMNaCl tartalmú 20 mM nátrium-foszfát puffer előállítása (elúciós puffer) liter bidesztillált vízben feloldunk 2,76 g nátriumdihidrogén-foszfát monohidrátot és 1 liter bidesztillált vízben feloldunk 2,84 g dinátrium-hidrogén-foszfátot. Ez utóbbi oldathoz hozzáadjuk az előző oldatot pH = 7,2 eléréséig. A kapott puffer 1 literéhez hozzáadunk 8,77 g nátrium-kloridot (150 mmol), s így kapjuk az elúciós puffért.
1.1.3. A tisztításhoz használt oszlop kiegyensúlyozása
Egy PD-10 oszlopot (Sephadex G-25; Pharmacia) körülbelül 30 ml elúciós puffenel hozunk egyensúlyba.
1.1.4. A reakcióhoz szükséges edényzet előkészítése mg IODO-GEN-t (móltömeg: 432,09 g/mól; 6. ábra) feloldunk 50 ml legtisztább metilén-dikloridban. Ebből az oldatból 200 μΐ-t bepipettázunk egy Eppendorf-edénybe, majd 37 °C-on (termosztátblokk) az oldószert elpárologtatjuk. Ilyen módon 8 μg (1.85xl0'2 mmól) IODO-GEN-t vittünk fel finom eloszlásban a reakció-edény falára.
1.1.5. Jelzéshez használt VÁC
A 150 mM NaCl tartalmú 20 mM nátrium-foszfát puffer (pH = 7,2) 4 ml-ében 50 mg VAC-a-t oldunk
HU 209 650 Β fel, ezt az oldatot 1 ml bidesztillált vízzel hígítjuk. (A VAC-α móltömege 34.000 g/mól.)
1.1.6. Jelzéshez használt125
A Dupont cégtől (NEN Products) beszerzett Na125I össz-radioaktivitása a kalibrálás alapján 67,3 MBq (= 1,82 mCi). Specifikus aktivitás: 15,9 Ci/mg jód - 1,98 kCi/mmól 1/2 I2, mely 0,115 pg jódnak felel meg (9,2xl0'7 mmól 1/2 I2). Az aktív nátrium-jodidot 5,5 pl 0,1 M nátrium-hidroxidban oldjuk fel.
7.2. Jódozás
Minden munkát izotóp elszívó fülkében, ólomüveg-ernyő mögött végeztük. A 2.1.5. pontban leírt VAC-α oldatból 20 pl-t (= 200 pg) bemérünk a IODOGEN-nel előkezelt reakció-edénybe. Ezután a reakcióelegyet pipettával felvisszük az előkészített PD-10 oszlopra (lásd a 2.1.3. pontot). A reakció-edényt még 500 pl elúciós pufferrel (lásd a 2.1.2. pontot) átöblítjük és ezt az oldatot ugyancsak felvisszük a PD-10 oszlopra. Az átfolyt eluátumot eldobjuk.
1.3. Tisztítás
Két perces időközönként 0,5-0,5 ml elúciós puffer felvitelével a VAC-α [125I]-t elválasztjuk a még szabad 125I/Na125I-tól. Tizenkét frakció leszedése után ezt a tisztítási lépést befejezzük. A frakciók viszonylagos aktivitás tartalmát egy laboratóriumi monitorral (GMZ) méqük (2. kép).
A 6. és 7. frakciót egyesítjük, elúciós pufferrel pontosan 2,0 ml-re töltjük fel, 100 pl-es részletekre osztjuk és -20 °C-on lefagyasztjuk. Ezeket a mintákat használjuk fel analitikai és fejlesztő munkákhoz.
2. Analitikai rész
2.1. Tartalmi meghatározás
A kromogén substrat-assay-vel 2,0 ml oldatban 71,8 pg VAC-α tartalmat mértünk.
2.2. Radioaktivitás meghatározása
2.2.1. Össz-radioaktivitás
Felolvasztunk egy 100 pl-es részletet és ebből a [125I]VAC-a oldatból 50 pl-t hozzápipettázunk 950 pl inaktív VAC-α oldathoz (lásd a 2.1.5. pontot), jól öszszekeverjük és ebből 50-50 pl-eket használunk LSCCounter-ben (Bechman) való méréshez. Eredmény:
24,5 MBq (= 0,663 mCi)/2,0 ml össz-oldat.
2.2.2. Specifikus aktivitás
A tartalmi meghatározás és az össz-radioaktivitás adataiból kapott specifikus aktivitás:
341,5 MGq/mg= 11,61 TBq/mmól (9,23 mCi/mg = 313,8 Ci/mmól)
2.2.3. A proteinhez kötött radioaktivitás meghatározása TCA-kicsapás segítségével
A VAC-α oldat 100 pl-éhez hozzáadunk 50 pl 3%-os
BSA oldatot és 150 pl 40%-os vizes triklór-ecetsavat, jól összerázzuk és 60 percig hűtőszekrényben állni hagyjuk. A kapott csapadékot lecentrifugáljuk. A felülúszó alikvot mennyiségeit LSC-Counter-ben méljük. Eredmény: a radioaktivitás 99,3%-a volt kicsapható.
2.2.4. Visszakapott radioaktivitás
A VAC-a-ba bevitt 67,3 MBq-ből 24,5 MBq-t kapunk vissza. Az aktivitásból tehát 36,4%-ot nyertünk vissza.
2.3. Módosulást fok
A specifikus aktivitásból és az inaktív VAC-α bevitt mennyiségéből kiszámítottuk, hogy statisztikusan minden hatodik VAC-α molekula volt 125I atommal jelezve.
2.4. Azonosság és tisztaság
SDS-PAGE (7-17% grádiens gél; nem redukáló körülmények) alkalmazásával és ezután a gélek ezüst festéssel (Oakley-módszer), autogradiográfiával és lineár-analizátorral (Berthold cég; LB 282, LB 2820 szonda) (3. kép) való kiértékeléssel vizsgáltuk az anyagot a bevitt VAC-a-val összehasonlítva. Az anyagok azonosak voltak, a dimer termék részaránya jóval az inaktív sarzsoknál megengedett 8%-os határ alatt volt.
Az ábrák rövid leírása
1. ábra: a VÁC váltakozó adszorpciója és deszorpciója foszfolipid felületén, melyet a Ca2+ koncentráció növelésével, illetve csökkentésével indukálunk. A VÁC (1 pg/ml) adszorpciója 20% DOPS/80% DOPC foszfolipid kettősrétegre. A Ca2+ adást (3, 4, 6 mM) T, illetve V jel mutatja.
2. ábra: A foszfolipid összetétel és a Ca2+ ion koncentráció befolyása a VÁC foszfolipid felülethez való adszorpciójára. O 100% DOPS; • 20% DOPS; Δ 5% DOPS; □ 1% DOPS;0 100% DOPC; valamennyi keverékben DOPC kiegészítés van jelen. [VÁC] = pg/ml.
3. ábra: Bivalens ionok hatása a VÁC adszorpciójára. A VÁC adszorpciója 20% DOPS és 80% DOPC összetételű kettősrétegekre a megadott ionok (1 vagy 3 mM) jelenlétében. [VÁC] = 1 pg/ml.
4. ábra: A Zn2+ szinergetikus hatása a VÁC foszfolipid felületre való Ca2+-függő adszorpcióra. 50 pM Zn2+ jelenlétében mértük a Ca2+ hatását a VÁC 1% DOPS és 99% DOPC összetételű felületre történő adszorpciójára [VÁC] = 1 pg/ml.
5. ábra: VÁC adszorpciója különböző összetételű foszfolipid kettősrétegekre. VÁC adszorpciója tiszta dioleil-foszfolipid-szerinre (DOPS), kardiolipinre (CL) és dioleilfoszfatidil-etanol-aminra (DOPE) vagy tisztán vagy 80% dioleil-foszfatidil-kolinnal keverve, továbbá dioleil-foszfatidil-glicerinre
HU 209 650 B (DOPG), foszfatidil-inozitra (Pl) és sztearilaminra (SA) 80% DOPC-foszfolipiddel keverve vagy tiszta DOPC-ra [VÁC] = 1 pg/ml; [Ca2+] = 3 mM.
6. ábra: l,3,4,6-tetraklór-3a-6a-difenil-glikol-uril (IODO-GEN).
7. ábra: A radioaktivitás eloszlása az 1-12. frakciókban.
8. ábra: Radioaktivitás elosztása a lineár-analizátor alatt
1, táblázat
A szilíciumlemezekre felvitt fosrfolipid kettősrétegek kiértékelése
14C-DOPS a film-balance- on Foszfolipid mennyisége ellipszometríásan pg/cm2 Aktivitás dpm Mért DOPS frakció %
2 0,396 453 1,9
5 0,409 1133 4,5
20 0,401 5006 20
100 0,442 27174 99
A számított keveréket a „film-balance”-ra vittük fel. A kettősréteget ellipszometriával mértük. A 14C-jelzett DOPS mérését Beckman 6S 3801 szcintillációs számlálóban (v. ö. <2%) végeztük, a háttérsugárzást korrigáltuk (60 dpm). A kettősrétegben a DOPS frakciót a [2] egyenlettel számítottuk ki:
Frakció = mennyiség (pMm2)xspecifikus aktivitás (dpmxpg-1 aktivitás(dpm)xfelület (cm2)
A Dops specifikus aktivitása: 100 000 dpm x pg'1; a foszfolipiddel fedett terület: 0,62 cm2.
2. táblázat
A különbözőfoszfolipid felületekhez való maximális VAC-kötődés fele
Lipid (mól%/mól%) TmaxtS. D. (pg/cm2) [Ca2+]i/2±S.D. (mM)
DOPS (100) 0,195 ±0,025 0,036 ±0,013
DOPS/DOPC (20/80) 0,222 ±0,014 0,22 ±0,06
DOPS/DOPC (5/95) 0,229 ±0,004 1,5 ±0,5
DOPS/DOPC (1/99) 0,234 ±0,007 8,6 ±2,5
Kardioli- pin/DOPC (20/80) 0,209 ±0,011 0,039 ±0,022
DOPG/DOPC (20/80) 0,212 ±0,003 0,155 ±0,027
PI/DOPC (20/80) 0,221 ±0,005 0,47 ±0,05
DOPA/DOPC (20/80) 0,207 ±0,006 0,75 ±0,26
DOPE/DOPC (20/80) 0,213 ±0,003 0,86 ±0,21
Szfingomielin/DOPC (20/80) 0,225 ±0,014 7±3
DOPC (100) n. d. >30 mM
A maximális VÁC kötődés felét előidéző kalcium koncentráció [Ca2+]1/2 mellett a felsorolt foszfolipid felületeken létrejött maximális VAC-adszorpciókat (^max) legalább három különböző kísérlet középértékeként - a megfelelő standard deviációkkal - adtuk meg.
n. d. = nőt determined = nincs meghatározva.
3. Diagnosztikai készlet (kit)
3.1. Összetevők
3.1.1.1. fiola:
A fiola VAC-FITC-t (fluoreszcein-izotiocianáttal jelzett VAC-polipeptidet) tartalmaz 140 mM nátriumkloriddal, 2,5 mM kalcium-kloriddal, 1 mg/ml BSAval és 3 mM nátrium-aziddal kiegészített 10 mM HEPES/NaOH (pH=7,4) pufferban.
3.1.2. II. fiola:
A fiola hígító oldatként 140 mM nátrium-kloriddal,
2,5 mM kalcium-kloriddal, 1 mg/ml BSA-val és 3 mM nátrium-aziddal kiegészített 10 mM HEPES/NaOH (pH=7,4) puffért tartalmaz.
A mennyiségeket úgy választjuk meg, hogy egyegy fiola tartalma általában 100 meghatározáshoz legyen elegendő. Ez azt jelenti, hogy például az I. fiola olyan mennyiségű VAC-FITC-t tartalmaz, ami az alább leírt meghatározási eljárás során a vérmintával elegyített és végtérfogatra hígított tesztelegyben általában 1 pg/ml körüli VAC-protein-koncentrációt biztosít. Értelemszerűen a II. fiolában levő hígító oldat össztérfogatát is ennek a követelménynek megfelelően választjuk meg.
3.2. Specifitás
A VAC-polipeptid a foszfatidil-szerinhez (PS) nagy affinitással rendelkező foszfolipid-kötő protein. A foszfatidil-szerint az ép vérlemezkék normális körülmények között szigorúan a plazma membrán belső oldalán tartják. A vérlemezkék aktiválódása a foszfatidil-szerinnek a membrán felszínére való kerülését eredményezheti. A vérlemezkék trombita vagy kollagén által való aktivál(ód)ása foszfatidil-szerin gyors felszínre való kerülését eredményezi. A felszínre került foszfatidil-szerint katalizálja a K-vitamin-függő koagulációs faktorok koagulációs reakcióit, ezáltal gyorsítja a trombin képződését, és következésképpen a hemosztatikus és trombolitikus folyamatokat.
3.4. Reaktivitás
A VAC-polipeptidnek kicsi az affinitása a normál/ép vérsejtekhez. A vörösvérsejtekhez, a nem aktivált vérlemezkékhez és a leukocitákhoz alig kötődik. Erősen kötődik viszont aktivált vérlemezkékhez, amelyek felszínére foszfatidil-szerin került.
3.5. Alkalmazás
A diagnosztikai készlet használható mind izolált vérsejtmintákhoz, mind teljes vérmintákhoz. Aramlásos citometriához is használható.
HU 209 650 B
3.6. A mérési eljárás kivitelezése
A vért heparinra vagy savas citrát/dextróz elegyre (acid-citrate-dextrose; ACD) gyűjtjük. [Kívánt esetben a készlethez mellékelhető a megfelelő alvadásgátló oldat/oldatkeverék vagy ezt tartalmazó, térfogatjelöléssel ellátott fiola, ampulla/ vagy centrifugacsőként kialakított vérmintavevő cső is.] A vérminta vagy mérhető közvetlenül is, egy 200 g-nál 10 percig tartó centrifugálással vérlemezkékben dús plazmává is feldolgozható. A mintából 10 μΐ-t elegyítünk a II. fiolából vett 230 μΐ oldattal. Ehhez az elegyhez 10 μΐ VAC-FITColdatot adunk az I. fiolából. 1-2 perc eltelte után áramlásos citometriával elvégezzük az analízist. Teljes vérminta esetében ajánlatos az illető sejttípus áramlásos citometriás szelekciójának elvégzése. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy 10 μΐ vérmintát 1 μΐ fikoeritrinnel (phycoerythrin) jelzett anti-CD antitesttel előinkubálunk. Vérlemezkék vizsgálata esetén például ajánlatos 10 μΐ vérmintát 1 μΐ fikoeritrinnel jelzett anti-CD42b antitesttel előinkubálni.
Az összes műveletet szobahőmérsékleten végezzük.
3.7. Tárolás
A barna fiolákba töltött reagenskészletet 4-8 °C-on fénytől védve (sötétben) tároljuk.
A szakterületen járatosak számára magától értetődő, hogy az itt vázlatosan leírt reagenskészlettől eltérő más készletek is kialakíthatók, illetve összeállíthatók a találmány lényegétől való eltérés nélkül. így a korábbiakban szemléltető példaként leírtakkal együtt a diagnosztikai készlet leírása sem tekinthető az oltalmi kör korlátozásának.

Claims (7)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás protrombikus állapot meghatározására azzal jellemezve, hogy
    i) a vizsgálandó vért extrakorporálisan egy észlelhető - előnyösen fluoreszcens vagy radioaktív - markerral ellátott VÁC (vaszkuláris antikoaguláns) polipeptiddel keverjük össze; és ii) a specifikus sejt-típusokhoz asszociált jelzést - előnyösen fluoreszcenciásan vagy radiometriásan méijük.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve. hogy a vizsgálandó vért egy észlelhető markerral ellátott VACa-val keverjük el.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy észlelhető markerral ellátott VÁC polipeptidként VAC-FITC-t (fluoreszcein-izotiocianáttal jelzett VACpolipeptidet) vagy 13lI-VAC-ot keverünk össze a vérrel.
  4. 4. Reagens protrombikus állapot és/vagy hemosztatikus rendszer aktiválódásának kiindulási pontja és/vagy trombikus kimutatására, azzal jellemezve, hogy egy észlelhető - előnyösen fluoreszcens, radioaktív vagy paramágneses - markerral ellátott VÁC polipeptidet és a diagnosztikai reagensek készítésénél szokásosan használt segédanyagokat tartalmaz.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti reagens, azzal jellemezve, hogy észlelhető markerral ellátott VÁC polipeptidként VAC-FITC-t vagy 131I-VAC-ot tartalmaz.
  6. 6. A 4. igénypont szerinti reagens, azzal jellemezve, hogy észlelhető markerral ellátott VACa polipeptidet tartalmaz.
  7. 7. Diagnosztikai reagenskészlet (kit) protrombikus állapot és/vagy hemosztatikus rendszer aktiválódásának kiindulási pontja és/vagy trombus kimutatására, azzal jellemezve, hogy egy 4. igénypont szerinti reagens VÁC polipeptid komponensének egy vagy több egyszeri vagy többszöri adagját és a megfelelő segédanyag(ok), oldószer(ek), előnyösen fiziológiás nátrium-klorid-oldat, emulgeátor(ok), előnyösen Tween 80, arginin és/vagy foszfátpuffer és plazma kalciumkoncentrációját nem befolyásoló alvadásgátló(k), előnyösen heparin egy vagy több egyszeri vagy többszöri adagját és az alkalmazás módszereinek kivitelezését megkönnyítő segédeszköz(öke)t tartalmazza megfelelően kiszerelve.
HU9202149A 1989-12-27 1990-12-19 Process, agent and kit for diagnosis of prothrombic condition and/or hemostatic systhem HU209650B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3942988 1989-12-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU209650B true HU209650B (en) 1994-09-28

Family

ID=6396455

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9202149A HUT61491A (en) 1989-12-27 1990-12-19 Process and reagent for diagnosing prothrombic state
HU9202149A HU209650B (en) 1989-12-27 1990-12-19 Process, agent and kit for diagnosis of prothrombic condition and/or hemostatic systhem

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9202149A HUT61491A (en) 1989-12-27 1990-12-19 Process and reagent for diagnosing prothrombic state

Country Status (15)

Country Link
EP (2) EP0806670B1 (hu)
JP (1) JP3135261B2 (hu)
KR (1) KR0181520B1 (hu)
AT (2) ATE164083T1 (hu)
AU (1) AU642202B2 (hu)
CA (1) CA2070647C (hu)
DE (3) DE4040817A1 (hu)
ES (1) ES2113372T3 (hu)
FI (1) FI107586B (hu)
HU (2) HUT61491A (hu)
NO (1) NO305276B1 (hu)
NZ (1) NZ236620A (hu)
PT (1) PT96385B (hu)
WO (1) WO1991009628A1 (hu)
ZA (1) ZA9010319B (hu)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5627036A (en) * 1989-12-27 1997-05-06 Boehringer Ingelheim International Gmbh Use of an anticoagulant as a diagnostic agent
ATE210464T1 (de) * 1992-06-09 2001-12-15 Neorx Corp BIOTIN-DOTA KONJUGATE UND DEREN VERWENDUNG IN ßPRETARGETINGß VERFAHREN
AU1186295A (en) * 1993-11-24 1995-06-13 University Of Washington Blood coagulation retardants and devices
US5968477A (en) * 1994-01-24 1999-10-19 Neorx Corporation Radiolabeled annexin conjugates with hexose and a chelator
ATE237366T1 (de) * 1994-01-24 2003-05-15 Neorx Corp Radioaktiv-markierte annexine
US20030220233A1 (en) 1994-01-24 2003-11-27 Neorx Corporation Radiolabeled annexins
HUT76623A (en) * 1994-03-16 1997-10-28 Mallinckrodt Medical Inc Stabilization of peptides and proteins for radiopharmaceutical use
JP2824155B2 (ja) * 1994-04-11 1998-11-11 ネクシンズ・リサーチ・ベー・ブイ 試料中の又は試料からアポトーシス細胞を検出し及び／又は場合により定量し及び／又は分離するための方法
ATE240749T1 (de) * 1994-06-16 2003-06-15 Neorx Corp Radioaktivmarkierte annexin-galaktose konjugate
EP0765166B1 (en) * 1994-06-16 2003-05-21 Neorx Corporation Radiolabeled annexin-galactose conjugates
DE69533366T2 (de) * 1994-12-07 2005-08-04 Neorx Corp., Seattle Radioaktivmarkierte annexin-galaktose-cluster konjugate
US5886143A (en) * 1994-12-07 1999-03-23 Neorx Corporation Hepatic-directed compounds and reagents for preparation thereof
JPH10512852A (ja) * 1994-12-07 1998-12-08 ネオルクス コーポレイション 放射性標識化アネキシン−ガラクトースクラスター複合体
US5955605A (en) * 1995-02-21 1999-09-21 Neorx Corporation Biotinidase resistant biotin-DOTA conjugates
FR2736197B1 (fr) * 1995-06-29 1997-09-12 Univ Paris Curie Nanoparticules magnetiques couplees a de l'annexine et leur utilisation

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4427646A (en) * 1981-04-02 1984-01-24 Research Corporation Use of radiolabeled peptide derived from crosslinked fibrin to locate thrombi in vivo
US4455290A (en) * 1981-04-02 1984-06-19 Research Corporation Inhibition of fibrin polymerization by a peptide isolated from fibrin Fragment D1
US4820505A (en) * 1985-04-04 1989-04-11 Scripps Clinic And Research Foundation Detection of activated platelets with antibodies to thrombospondin
PT87083B (pt) * 1987-03-28 1992-07-31 Boehringer Ingelheim Int Processo para a preparacao de uma proteina anticoagulante vascular, de adn que codifica para esta proteina e de composicoes farmaceuticas que a contem
DE3810331A1 (de) * 1988-03-26 1989-10-05 Boehringer Ingelheim Int Monoklonale vac-antikoerper

Also Published As

Publication number Publication date
KR920703121A (ko) 1992-12-17
NO922528L (no) 1992-08-26
FI922719A0 (fi) 1992-06-12
DE59010946D1 (de) 2009-06-04
EP0509026A1 (de) 1992-10-21
PT96385A (pt) 1991-10-31
NO922528D0 (no) 1992-06-26
ES2113372T3 (es) 1998-05-01
CA2070647A1 (en) 1991-06-28
ATE164083T1 (de) 1998-04-15
NO305276B1 (no) 1999-05-03
CA2070647C (en) 2001-04-10
EP0509026B1 (de) 1998-03-18
ZA9010319B (en) 1992-08-26
HUT61491A (en) 1993-01-28
FI107586B (fi) 2001-09-14
DE59010815D1 (de) 1998-04-23
KR0181520B1 (ko) 1999-05-01
WO1991009628A1 (de) 1991-07-11
EP0806670A2 (de) 1997-11-12
NZ236620A (en) 1997-03-24
EP0806670B1 (de) 2009-04-22
EP0806670A3 (de) 1997-12-10
AU642202B2 (en) 1993-10-14
JP3135261B2 (ja) 2001-02-13
ATE429644T1 (de) 2009-05-15
DE4040817A1 (de) 1991-07-04
HU9202149D0 (en) 1992-10-28
PT96385B (pt) 1998-06-30
JPH05502877A (ja) 1993-05-20
AU7071191A (en) 1991-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5627036A (en) Use of an anticoagulant as a diagnostic agent
Weiss et al. Quantitative assay of a plasma factor deficient in von Willebrand's disease that is necessary for platelet aggregation. Relationship to factor VIII procoagulant activity and antigen content
Dachary-Prigent et al. Annexin V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation: a flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl groups
Griffin et al. Reevaluation of total, free, and bound protein S and C4b-binding protein levels in plasma anticoagulated with citrate or hirudin
Holguin et al. Relationship between the membrane inhibitor of reactive lysis and the erythrocyte phenotypes of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria.
Key et al. Tissue factor and its measurement in whole blood, plasma, and microparticles
HU209650B (en) Process, agent and kit for diagnosis of prothrombic condition and/or hemostatic systhem
US20030064414A1 (en) Rapid assessment of coagulation activity in whole blood
Weiss et al. Studies of platelet function and proteins in 3 patients with Glanzmann's thrombasthenia
Duchemin et al. A new assay based on thrombin generation inhibition to detect both protein C and protein S deficiencies in plasma
Thompson et al. Removal of heparin and protamine from plasma
Kierulf et al. Fibrinemia in medical patients screened by the ethanol test
Krajewski et al. Real-time measurement of free thrombin: evaluation of the usability of a new thrombin assay for coagulation monitoring during extracorporeal circulation
Nossel et al. Potential use of fibrinopeptide A measurements in the diagnosis and management of thrombosis
Bouma et al. Factor‐VIII antigen and platelet retention in a glass bead column
Parzer et al. Plasma protein adsorption to hemodialysis membranes: studies in an in vitro model
Frank et al. Factor XII activation markers do not reflect FXII dependence of thrombin generation induced by polyvinylchloride
Kawakami et al. Elevated plasma levels of α2‐plasmin inhibitor–plasmin complex in patients with rheumatic diseases. Possible Role of Fibrinolytic Mechanism in Vasculitis
Kisker et al. The effects of combined platelet and leukapheresis on the blood coagulation system
CA2039173C (en) Factor ix chromogenic assay
Boger et al. Development and clinical evaluation of immunoluminometric assays for lactoferrin and elastase-α1-proteinase inhibitor complexes in body fluids with special references to bronchoalveolar lavage and neonatal sepsis
Arkin et al. The hypercoagulability states
Tornai et al. Endothelium releases more von Willebrand factor and tissue-type plasminogen activator upon venous occlusion in patients with liver cirrhosis than in normals
Poort et al. Rabbit polyclonal antibodies against the calcium-dependent conformation of factor IX and their application in solid phase immunoradiometric assays
Kao et al. The bleeding diathesis in human glycogen storage disease type I: in vitro identification of a naturally occurring inhibitor of ristocetin-induced platelet aggregation