NO305276B1 - Anvendelse av et antikoagulerende polypeptid som diagnostisk middel samt fremgangsmÕte for konstatering av protrombisk tilstand - Google Patents

Anvendelse av et antikoagulerende polypeptid som diagnostisk middel samt fremgangsmÕte for konstatering av protrombisk tilstand Download PDF

Info

Publication number
NO305276B1
NO305276B1 NO922528A NO922528A NO305276B1 NO 305276 B1 NO305276 B1 NO 305276B1 NO 922528 A NO922528 A NO 922528A NO 922528 A NO922528 A NO 922528A NO 305276 B1 NO305276 B1 NO 305276B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
vac
polypeptide
anticoagulant
use according
detectable marker
Prior art date
Application number
NO922528A
Other languages
English (en)
Other versions
NO922528D0 (no
NO922528L (no
Inventor
Christiaan Reutelingsperger
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=6396455&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO305276(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Boehringer Ingelheim Int filed Critical Boehringer Ingelheim Int
Publication of NO922528D0 publication Critical patent/NO922528D0/no
Publication of NO922528L publication Critical patent/NO922528L/no
Publication of NO305276B1 publication Critical patent/NO305276B1/no

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
    • A61K49/0043—Fluorescein, used in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/087—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins the peptide being an annexin, e.g. annexin V
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4721—Lipocortins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2123/00—Preparations for testing in vivo
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4718—Lipocortins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2405/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving lipids
    • G01N2405/04—Phospholipids, i.e. phosphoglycerides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Separation Of Suspended Particles By Flocculating Agents (AREA)
  • Dental Preparations (AREA)
  • External Artificial Organs (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av et antikoagulerende polypeptid, spesielt et annexin, som er merket med en påvisbar substans, til diagnose, og en fremgangsmåte for konstatering av den protrombiske tilstand.
Blod består av spesielle ubundne celler som er dispergert i et plasma-medium. Celleinnholdet er skilt fra det omgivende plasma gjennom såkalte plasma-membraner. Disse membranene er bygget opp av fosfolipider i form av et dobbelt skikt og av assosierte proteiner som delvis trenger gjennom dobbeltskiktet eller stikker ut fra dette.
De forskjellige fosfolipidene er ikke fordelt vilkårlig over den utvendige og innvendige omhylling av dobbeltskiktet, men holdes i en asymmetrisk konfigurasjon av cellen (7, 8). Mens fosfatidylkolin (PC) og sfingomyelin (SPH) utgjør de dominerende arter av den ytre omhylling, er fosfatidylserin (PS), fosfatidyletanolamin (PE) og fosfatidylinositol (PI) vesentlig lokalisert i den indre omhylling som vender mot cytosolet. Denne energiforbrukende asymmetri-tilstand er av eksepsjonell fysiologisk betydning. PC og SPH er de mest inerte representanter av fosfolipidfamilien og viser i sterk motsetning til de andre representanter, ytterst nøytrale forhold overfor plasmakomponentene. Denne reaksjonstreghet ved den ytre omhylling i forhold til plasmaproteinene er en absolutt forutsetning for å sikre blodets flytende tilstand. Spesielle plasmaproteiner som hører med til blodkoagulasjons-kaskaden, de såkalte koagulasjonsfaktorene, kan nemlig over-føre den flytende blodtilstand til en fast tilstand når de aktiveres (9). Disse koagulasjonsfaktorene kan aktiveres gjennom fosfolipider som fosfatidylserin.
I mange tilfeller, f.eks. etter beskadigelse av et blod-kar, er det nødvendig, ja faktisk livsviktig, at koagulasjonsfaktorene aktiveres. I en slik situasjon kan en spesiell blodcelle, blodplaten, oppgi sin membran-asymmetri gjennom aktiveringsmekanismer som transporterer fosfatidylserin til den ytre omhylling, hvor den understøtter aktiveringen av koagulasjonsfaktorene (10).
Denne systematiske forandring av fosfolipidsammen setningen i den ytterste omhylling av blodplateplasma-membranen har stor fysiologisk betydning for hemostasen, som antydet for eksempel gjennom Scott-syndromet (11).
Til fysiologien hører imidlertid også patologien. Blodets homeostase kan således enkelte ganger også gli over i en patologisk tilstand som ved arterielle, koronare og venøse tromboser.
Disse hemostatiske forstyrrelsene er for det meste idiopatiske og gjør det umulig for legen å forutsi deres forekomst og utvikle profylaktiske terapier.
Formålet med foreliggende oppfinnelse har vært å tilveie-bringe en fremgangsmåte som kunne bidra til tidlig å fastslå hemostatiske forstyrrelser.
I motsetning til symptomutviklingen, forløper utviklingen av forstyrrelsene oftest langsomt. Under denne fase med symptomløs progresjon, den såkalte protrombotiske tilstand, forløper det lokalt en kontinuerlig aktivering av koagulasjonssystemet. Denne lokale aktivering er perifert forbundet med forekomst av blodplater som befinner seg i en tidlig tilstand av aktiveringen. Disse blodplatene har allerede begynt å forandre fosfolipidsammensetningen av deres ytre plasmamembran-omhylling. Fosfatidylserin forekommer i den ytre omhylling. Hjelpemidler som diagnostiserer denne såkalte protrombotiske tilstand, ville være av største kliniske betydning.
Ved siden av forekomsten av svakt aktiverte blodplater i periferien, vil det klebe seg fullstendig aktiverte blodplater der hvor karveggen befinner seg i patologisk tilstand. Disse stedene er å anse som utløsere av aktiveringen av det hemostatiske system. Lokaliseringen av disse patologiske stedene og den trombe som her dannes, ville være av største terapeutiske interesse.
I henhold til oppfinnelsen anvendes et antikoagulerende polypeptid innen annexin-familien som er forsynt med en påvisbar markør, som middel for å skjelne mellom fosfatidylkolin og fosfatidylserin. Videre angår oppfinnelsen anvendelse av et slikt polypeptid som middel for diagnose av protrombiske tilstander, utgangspunktet for forstyrrelsen eller aktiveringen av det hemostatiske system og/eller tromben.
Oppfinnelsen angår også anvendelse av et antikoagulerende polypeptid innen annexin-familien, som er forsynt med en påvisbar markør, for fremstilling av et preparat til å fastslå utgangspunktet for aktiveringen av det hemostatiske system.
Videre angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for konstatering av den protrombiske tilstand, og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at a) blodet som skal undersøkes, blandes ekstrakorporealt med et antikoagulerende polypeptid innen annexin-familien, som bærer en påvisbar markør og b) markeringen assosiert med spesifikke celletyper, analyseres .
Blodkoaguleringsmekanismen utgjør en kaskade av enzymatiske reaksjoner, hvor dannelsen av trombin som tilslutt omdanner fibrinogen til fibrin, befinner seg på slutten av denne. Forskjellige prokoagulante reaksjoner, som for eksempel aktiveringen av protrombin ved hjelp av faktorene Xa og Va, katalyseres av fosfolid-overflater som koagulasjonsfaktorene binder seg til.
Blant de proteiner som binder seg til fosfolipder og som interfererer med prosesser som er avhengige av fosfolipid-overflater, finnes en familie som for sin binding til fosfolipider, er avhengig av Ca<2+>.
Til denne familie, som også kalles annexiner, hører foruten lipocortin I, calpactin I, protein II, lipocortin III, p67-calelectrin, også det vaskulære antikoagulantprotein (VAC) og IBC, PAP, PAPI, PP4, endonexin II og lipocortin V.
De strukturelle felles karakteristika for annexiner, er sannsynligvis grunnlaget for deres lignende Ca<2+>og fosfolipid-bindingsegenskaper. Selv om denne generelle egenskap gjelder for alle annexiner, består det en klar individualitet med hensyn til deres affinitet til Ca<2+>og til de forskjellige fosfolipid-arter.
De fysiologiske funksjoner til annexinene angår membran-assosierte prosesser. Den grunnleggende mekanisme for den koagulasjonshemmende virkning av VAC er erkjent som en hemming av fosfolipidenes katalytiske kapasitet til å binde VAC til deres overflate, hvorved dannelsen av det koagulasjons-befordrende kompleks på deres overflate forhindres.
Bindingsstudier har vist at VAC kalsiumavhengig reversibelt assosierer seg med prokoagulatoriske fosfolipider.
Også andre bivalente kationer fra rekken Cd<2+>, Zn<2+>, Mn<2+>og Co<2+>påvirker assosiasjonen positivt, riktignok ikke i samme utstrekning som Ca<2+>.
Ut over dette er det nå overraskende oppdaget at VAC-adsorpsjonen til fosfolipider påvirkes meget positivt i nærvær
„2+ „ 2+ .
av Ca - og Zn -ioner.
Overraskende er det også fastslått at VAC ved plasma-konsentrasjoner binder seg til fosfatidylserin men ikke til fosfatidylkolin og sfingomyelin. VAC erkjenner og binder således spesifikt perifere blodplater med PS i deres ytre membran-omhylling. Dessuten erkjenner VAC også spesifikt slike steder i det vaskulære systemer som PS utsetter blodet for.
Denne differensiering ved fosfolipidene gjør VAC så vel som de andre annexinene, til et ideelt reagens for tidlig å fastslå den såkalte protrombotiske tilstand som gir seg de ovenfor angitte utslag.
Gjennom foreliggende oppfinnelse er det for første gang mulig å erkjenne den protrombotiske tilstand i det vaskulære system. Denne diagnose muliggjøres gjennom spesifisiteten av substanser, av midler som er i stand til å erkjenne den, i forhold til normaltilstanden, endrede protrombotiske tilstand til blodplatene. Da denne tilstand adskiller seg fra blod-platenes normaltilstand ved at den ytre omhylling bare oppviser fosfatidylserin i den protrombotiske blodplate, er i prinsippet ethvert middel som kan skjelne fosfatidylserin spesifikt fra fosfatidylkolin, egnet til å utnytte dette oppfinnelsesmessige prinsipp. Midler som kan benyttes kjenne-tegnes ved sin spesifisitet overfor fosfatidylserin, hvilket kan fastslås gjennom de bindingsforsøk som er angitt i foreliggende beskrivelse.
Utnyttelsen av denne spesifisitet gjør det dessuten mulig å lokalisere utgangspunktet for aktiveringen av det hemo-
statiske system og/eller tromben.
Gjennom foreliggende oppfinnelse er det således for første gang mulig å gripe til egnede terapeutiske forholdsregler ved en tidlig diagnose av en truende tilstand som muligens er under utvikling.
De midler som anvendes i henhold til oppfinnelsen, er antikoagulerende polypeptider i den utstrekning de oppviser den nødvendige spesifisitet for fosfolipidet fosfatidylserin.
Særlig foretrukket er annexin-familien, spesielt VAC.
For å kunne gjøre bruk av midlene som anvendes i henhold til oppfinnelsen, særlig VAC eller de andre annexinene, som diagnostikum, merkes de på i og for seg kjent måte. Som egnet markør kan for eksempel benyttes markering med fluorescerende grupper, eller radioaktiv markering. Som fordelaktig anvendelig fluorescens-markør kan nevnes fluoresceinisotiocyanat, som fordelaktig anvendelig radioaktiv markør, radio-131 isotopene av halogenene, spesielt av jod, eksempelvis I eller 12 5I eller også bly, kvikksølv, tallium, technetium eller indium (<2>03Pb, 198Hg, 201T1,<99m>Tc, 111In) .
Fluoresceinisotiocyanat (Serva) kan på kjent måte (13) benyttes til merking av VAC.
Merking med et paramagnetisk kontrast-agens som er påvisbart i et MRI-system (magnetic resonance imaging) er også mulig. Det kan benyttes gadolinium, kobolt, nikkel, mangan eller jernkomplekser som det kan fremstilles konjugater med, som diagnostiske agens som er påvisbare i et MRI-system. I slike systemer benyttes et sterkt magnetfelt for i organismen å rette ut atomenes nukleære spinnvektorer. Deretter oppheves feltet, hvorved kjernene vender tilbake til sin utgangs-tilstand. Denne prosess observeres og registreres. Det antikoagulerende polypeptid som således er forsynt med en påvisbar markør, administreres herunder intraarterielt eller intravenøst. Den tilførte mengde avmåles slik at den etter tilstrekkelig inkubasjonstid, holder til den etterfølgende måling.
Til påvisningen av en protrombotisk tilstand tilsettes testblodet ekstrakorporealt polypeptidet som anvendes i hen hold til oppfinnelsen, eventuelt i nærvær av et ytterligere antikoagulant som ikke nedsetter plasma-kalsiumkonsentrasjonen, eksempelvis heparin, hvoretter den markør som er assosiert med den spesifikke celletype analyseres.
Det merkede polypeptid kan anvendes så vel i blod-isotonisk vandig oppløsning, som med hjelpestoffer, for å oppnå formålet i henhold til oppfinnelsen. Hjelpestoffer kan eksempelvis være TWEEN 80, arginin, fosfatbuffer og fysiologisk akseptable konserveringsmidler. Ytterligere stoffer er velkjent for fagmannen og kan likeledes benyttes.
For den radioaktive merking benyttes f.eks. den kjente jodogenmetodé (12) eller den vanlige kloramin-T-metode. På grunn av dens halveringstid på 8 dager, er<131>lå anbefale for in vivo-diagnosen. Det radioaktivt merkede middel tas opp i blod-isoton vandig oppløsning og injiseres etter steril-filtrering. Helkropps-scintigrafier utføres med et gamma-kamera, f.eks. for<131>II, 2, 4 og 7 dager etter injeksjonen.
Ved siden av de genuine annexinformer, kan også endrede former benyttes ved anvendelsen i henhold til oppfinnelsen.
Det skal særlig henvises til mutanter beskrevet i
EPA 0 293 567. I tillegg er også de fragmenter eller kjemisk modifiserte derivater av annexiner som oppviser spesifisiteten overfor fosfolipidene, fosfatidylserin/fosfatidylkolin og som dermed kan erkjenne den protrombotiske tilstand av de med-virkende blodplater, anvendelige.
Foreliggende oppfinnelse angår spesifikt:
Anvendelse av et antikoagulerende polypeptid fra annexin- familien, fortrinnsvis VAC, som er forsynt med en påvisbar markør.
Anvendelse av et antikoagulerende polypeptid som, som påvisbar markør har fluorescensmerking, fortrinnsvis fluoresceinisotiocyanat, en radioisotop av et halogen, av technetium, bly, kvikksølv, tallium eller indium, særlig
131 I eller<125>I eller et paramagnetisk kontrastmiddel. Anvendelse av et antikoagulerende polypeptid som ovenfor beskrevet for å skjelne mellom fosfatidylserin og fosfatidylkolin.
Anvendelse av et antikoagulerende polypeptid som ovenfor
beskrevet for anvendelse som diagnostikum.
Fremgangsmåte for konstatering av den protrombotiske tilstand, hvorunder a) blodprøven ekstrakorporealt blandes med et antikoagulerende polypeptid eller middel innen annexin-familien, fortrinnsvis VAC, som bærer en påvisbar markør, og b) markeringen som er assosiert med spesifikke celletyper, analyseres.
Et middel som ved siden av et antikoagulerende polypeptid innen annexin-familien, fortrinnsvis VAC, som er forsynt med en påvisbar markør, dessuten inneholder et hjelpestoff som for eksempel fysiologisk natriumklorid oppløsning, TWEEN 80, arginin og/eller fosfatbuffer, hvorunder eventuelt et antikoagulant som ikke reduserer plasma-kalsiumkonsentrasjonen, fortrinnsvis heparin, kan benyttes.
Et analysesett til diagnostisk påvisning av den protrombotiske tilstand eller utgangspunktet for aktiveringen av det hemostatiske system og/eller en trombe, kan inneholde et antikoagulerende polypeptid som beskrevet ovenfor, som er i stand til å skjelne mellom fosfatidylserin og fosfatidylkolin.
I henhold til oppfinnelsen anvendes et antikoagulerende polypeptid som beskrevet ovenfor for å skjelne mellom fosfatidylserin og fosfatidylkolin.
Et antikoagulerende polypeptid som beskrevet ovenfor kan anvendes i henhold til oppfinnelsen, til diagnose av den protrombotiske tilstand eller av utgangspunktet for forstyrrelse av det hemostatiske system eller for tromben.
Materialer og metoder
VAC ble fremstillet analogt med EPA 0 181 465 eller
EPA 0 293 567. De etterfølgende eksperimenter ble utført med VACa, men resultatene er overførbare til de andre annexinene, spesielt også til VACS.
Lipider
Dioleoyl-fosfatidylkolin (DOPC, Nr. P-1013) Dioleoyl-fosfatidyletanolamin (DOPE, Nr. P-0510) Cardiolipin (CL, Nr. C-5646)
Dioleoyl-fosfatidylglycerol (DOPG, Nr. P-9664) Fosfatidylinositol (PI, Nr. P-0639)
Dioleoyl-fosfatidsyre (DOPA, Nr. P-2767)
Sterarylamin (SA, S-6755) og
eggeplomme-sfingomyelin (S-0756) ble anskaffet fra firma Sigma Chemical Co.
Renheten av DOPC og DOPE ble kontrollert ved tynnskikt-kromatografi. Dioleoyl-fosfatidylserin (DOPS) ble fremstillet ved omdannelse av DOPC ifølge (1).<14>C merket DOPS (spesifikk aktivitet 100.000 dpm//xg) ble anskaffet fra Amersham.
Fremstilling av fosfolipid- dobbeltskiktene på silisiumplater
Fosfolipid-dobbeltskikt ble påført med en "Langmuir-film balance" (Lauda type FW-1) som beskrevet av Corsel et al., (2). Hydrofile silisiumplater ble behandlet i 30% kromsvovel-syre og vann i 24 timer og oppbevart i 50% etanol/vann. Før anvendelse ble de grundig renset med et detergent og vann. "Film-balance"-anordningen ble fylt med demineralisert vann og 50/iM CaCl2. På denne nedre fase ble det påsatt 20 fil av en oppløsning som inneholdt 2 g/l fosfolipid i kloroform. DOPS-fraksjonene i dobbeltskiktet ble kontrollert med<14>C merket DOPS i blanding med DOPC. De dannede dobbeltskiktene ble fjernet fra silisiumplatene med scintillasjons-detergentet (Du Pont Formel-989) og den totale radioaktivitet målt i en seintiliasjonsteller.
Måling av bindingen ved ellipsometri
Adsorpsjonen av VAC til fosfolipid-dobbeltskiktene ble målt ved hjelp av et automatisk ellipsometer (2,3)
Bindingsforsøkene ble utført i en hydrofil kyvette som inneholdt 5 ml av en omrørt buffer (0,05M Tris/HCl; 0,1M NaCl; pH=7,5; T=20°C) . De divalente kationene ble tilsatt trinnvis som klorider.
Ved VAC-konsentrasjoner <0,1/xg/ml ble bufferen som inneholdt den spesifikke VAC-konsentrasjon, tilsatt kontinuerlig for å skaffe en tilstrekkelig bufferkapasitet for
VAC.
Ut fra de kombinerte polariserings- og analyseringsdata ble brytningsindeksen og tykkelsen av den adsorberte film bestemt (4). Mengden å av det adsorberte proteinskikt ble bestemt ut fra brytningsindeksen og tykkelsen ved hjelp av en modifisert Lorentz-Lorenz-ligning [1] (3, 5):
[1] å = 3d(n2-nb2)/[(n2+2) (r(nb2+2)-v(nb2-l) ) ] ;
nb er bufferens brytningsindeks. Verdiene r=0,254 og v=0,71 ble innsatt for den spesifikke molare refraktivitet og det partielle spesifikke volum (3).
Resultater
Effekten av divalente kationer på bindingen av VAC til fosfolipider
VAC bindes til fosfolipid-membraner som består av 20% DOPS/80%DOPC, i avhengighet av kalsiumkonsentrasjonen. Påfølgende tilsetning av EDTA førte til omgående og fullstendig desorpsjon (Fig. 1). Ved forandringen av de frie Ca +-konsentrasjonene kunne adsorpsjonen utløses igjen flere ganger uten at den adsorberte mengde eller adsorpsjonsgraden endret seg merkbart. Irreversible forandringer av VAC-molekylet eller av fosfolipid-dobbeltskiktene ved adsorpsjonen eller desorpsjonen er derfor ikke sannsynlig. Bindingen var likeledes fullstendig reversibel når kyvetten ble spylt med Ca<2+->fri buffer.
Ca<2+->avhengigheten av VAC-bindingen til fosfolipider er fremstillet i Fig. 2. Ca<2+->dose/virkningskurven viser helt entydig en Ca<2+->konsentrasjon hvor halvdelen av den maksimale VAC-adsorpsjon er nådd: [Ca<2+>]1^2. [Ca<2+>]-verdien avhenger av sammensetningen av fosfolipid-overflaten. Ved fosfolipid-overflater som inneholder 100%, 20%, 5% og 1% DOPS, ble [Ca +] 1y2-verdier på henholdsvis 36 itM, 220/iM, 1,5 mM og 8,6 mM målt (Tab. 1). Disse resultatene stemmer ganske godt overens med [Ca2 + ] 1/,2-verdien på 53fiM som ble målt for endonexin II (=VAC)-binding til ekvimolare blandinger av PS/PC vesikler (6). Den maksimale mengde av det adsorberte protein ^maks^ var uavnen<?i9 av membranens DOPS-fraksjon og utgjorde ca. 0,217 xig/cm2. Ingen adsorps jon kunne fastslås ved rene DOPC-dobbeltskikt inntil en Ca<2+->konsentrasjon på 3 mM.
Adsorpsjonen av VAC til fosfolipid-dobbeltskikt av for-skjellig sammensetning, er vist i Fig. 5. Også her er det tydelig at praktisk talt ingen adsorpsjon av VAC kan iakttas ved rene DOPC-dobbeltskikt. Adsorpsjonen av VAC til stearylamid (SA) er likeledes svak.
Ved forsøk med andre kationer enn Ca<2+>ble det fastslått at bindingen av VAC til fosfolipidene i stor grad er Ca<2+->spesifikk (Fig. 3). Cd<2+>, Zn<2+>, Mn<2+>og Co<2+>viste svak befordring av bindingen; Ba 2 + og Mg 2 + hadde ingen innflytelse. Denne egenskap ved kationene kan i en viss utstrekning korreleres med deres ioneradier.
Sink- synergisme
Høye konsentrasjoner av sinkioner (1 mM) fremmer VAC-adsorpsjon (Fig. 3) bare i liten grad; 50 xxM har overhodet ingen innflytelse på adsorpsjonen. Merkelig nok påvirker denne konsentrasjon bindingen i nærvær av Ca<2+>;det kan således iakttas en synergisme. [Ca<2+>]1^2~verdien falt fra 8,6 til 2,7 mM for dobbeltskikt med kun 1% DOPS ( [Zn2 + ] =50/xM) (Fig. 4) . 50 xtM [Zn2 + ] ligger i det normale området for sink-konsentrasjoner i plasma.
Diagnostiske metoder
1. In vitro- diagnose
a) VAC merkes etter i og for seg kjente fremgangsmåter
(13) med fluoresceingruppen, eksempelvis ved hjelp
av fluoresceinisotiocyanat; det oppnås på denne måte
VAC-FITZ.
b) Blod fra en pasient oppsamles i et lite plastikkrør som inneholder et antikoagulant (f.eks. heparin) som
ikke reduserer plasma-kalsiumkonsentrasjonen, og
VAC-FITC.
c) Etter blanding analyseres blodcellene under bruk av en FACS (fluorescence activated cell sorter). Ved
denne analyse bestemmes den fluorescensintensitet som er assosiert med spesifikke celletyper.
d) Analyse-profilene viser mengden av blodplater med bundet VAC-FITC, dvs. plater med eksponert PS og
dermed forekomst av en protrombotisk tilstand. Denne helsetruende tilstand kan på denne måte erkjennes tidlig og følgelig behandles tidlig.
2. In vivo- diagnose
a) VAC merkes med en kortlivet isotop, eksempelvis<131>I, etter i og for seg kjente fremgangsmåter; det
oppnås<131>I-VAC.
b)<131>I-VAC tilføres pasienten intravenøst.
c) Etter en viss inkubasjonstid underkastes pasienten en hel- eller del-kropps scintigrafi. Fordelingen av radioaktiviteten kan iakttas med et large-field-off - view gamma-kamera. d) Intravaskulære steder med<131>I-VAC-akkumulasjon kjennetegner de steder hvor trombosen utvikler seg.
Egnede trombose-hindrende eller trombose-helbredende forholdsregler kan tidlig innsettes.
Radioaktiv markering
1.1 Forberedelser
1.1.1 Fremstilling av en 500 mmol/ 1 natriumfosfatbuffer 24,5 g natrium-di-hydrogenfosfat-monohydrat ble oppløst i 1 liter bidestillert vann og tilsatt til en oppløsning av
35,3 g di-natrium-hydrogenfosfat i 1 liter bidestillert vann til pH 7,5.
1.1.2. Fremstilling av en 20 mmol/ 1 natriumfosfatbuffer +
150 mmol NaCl ( elueringsbuffer)
2,76 g natrium-di-hydrogenfosfat-monohydrat ble oppløst i 1 liter bidestillert vann og tilsatt til en oppløsning av
2,84 g dinatriumhydrogenfosfat i 1 liter bidestillert vann til pH 7,2. Ved tilsetning av 8,77 g NaCl (150 mmol)
til 1 liter av bufferen, ble elueringsbufferen fremstillet.
1.1.3. Likevektsinnstilling av rensesøylen En PD-10-søyle (Sephadex G25, Firma Pharmacia) ble like-vektsinnstillet med ca. 3 0 ml av elueringsbufferen. 1.1.4. Preparering av reaksionsbeholderen 2 mg IODO-gen (molmasse: 432,09 g/mol); Fig. 6) ble
oppløst i 50 ml diklormetan av høy renhet. 200/il av denne oppløsningen ble pipettert over i et 1,5 ml Eppendorf-glass og oppløsningsmidlet deretter avdampet ved 37°C (termostat-blokk). I reaksjonsglasset var dermed 8 tig (1,85 x 10 mmol) IODO-Gen finfordelt på veggen.
1.1.5. VAC- a benyttet for merkingen
Det ble gått ut fra en oppløsning av 50 mg VAC-a i 4 ml 20 mmol/1 natriumfosfatbuffer pluss 150 mmol/1 NaCl, pH
7,2, fortynnet med 1 ml bidestillert vann. Molmasse VAC-a: 34000 g/mol.
1.1.6. 1- 125 benyttet til merking
1251 Na fra Fa. Dupont, NEN Products, med en total radioaktivitet på kalibreringsdagen på 67,3 MBq (=1,82 mCi). Den spesifikke aktivitet var 15,9 Ci/mg
jod = 1,98 kCi/mmol 1/2 J , hvilket tilsvarte 0,115 tig
-7
jod (9,2 x 10 mmol 1/2 J2). Det aktive Nal var oppløst 1 5,5/il 0,1 mol/l NaOH.
1.2. Jodering
Alt arbeid ble foretatt i isotop-avtrekk bak blyglass-avskj erming.
2 0/il (= 200/xg) av oppløsningen av VAC-Q! beskrevet under
2.1.5., ble overført til den IODO-Gen forbehandlede reaksjonsbeholderen. Den ble lukket og ristet i 20 minutter ved romtemperatur. Deretter ble reaksjonsopp-løsningen påsatt med en pipette på den forberedte PD-10-søyle (s. 2.1.3.). Reaksjonsbeholderen ble etterspylt med 500/xl av elueringsbuf feren (s. 2.1.2.) og denne opp-løsningen likeledes anbragt på PD-10-søylen. Eluatet som derved rant gjennom ble kassert.
1.3. Rensing
Ved påsetting av 0,5 ml porsjoner elueringsbuffer (s. 2.1.2. ) med 2 minutters mellomrom, ble det VAC-a [ 125I] adskilt fra det fremdeles frie<125>I/Na<125>I. Etter 12 fraksjoner var dette rensetrinn ferdig. Fraksjonenes relative aktivitetsinnhold ble målt med en laboratorie monitor (GMZ) (Fig. 7).
Fraksjonene 6 og 7 ble slått sammen, fylt opp til nøyaktig 2, 0 ml med elueringsbuf f er og oppdelt i 100/xl porsjoner og nedfrosset ved -20°C. Substansen ble holdt i beredskap i disse porsjoner for analyse- og
utviklingsarbeid.
2. Analytisk del
2.1 Innholdsbestemmelse
Ved den kromogene substrat-assay ble et VAC- a-innhold på
71,8 fig/ 2, 0 ml oppløsning målt.
2.2 Radioaktivitetsbestemmelse
2.2.1. Total radioaktivitet
Etter opptining av en 100/xl porsjon ble 50/xl av denne [ 12 5I] VAC-a-oppløsning tilsatt med en pipette til 950/xl av den inaktive VAC-a-oppløsning (s. 2.1.5), grundig blandet og 50/xl av denne bragt til måling i LSC-Counter (Beckman). 24,5 MBq (=0,663mCi)/2,0 ml totaloppløsning.
2.2.2 Spesifikk aktivitet
Ut fra gehaltsbestemmelsen og total-radioaktiviteten ble det beregnet en spesifikk aktivitet på
341,5 MBg/mg = 11,61 TBq/mmol
(9,23 mCi/mg = 313,8 Ci(mmol)
2.2.3. Bestemmelse av proteinbundet radioaktivitet ved
TCA- felling
100/xl av VAC-ot-oppløsningen ble tilsatt 50/xl 3% BSA-oppløsning og 150/xl 40% vandig trikloreddiksyre, ristet godt og plassert i kjøleskap i 60 minutter. Det dannede bunnfall ble frasentrifugert.Alikvoter av supernatanten ble overført for måling i LSC-Counter.
Resultat: 99,3% av radioaktiviteten var utfellbar.
2.2.4. Radioaktivitetsutbytte
Av de tilsatte 67,3 MBq ble 24,5 MBq funnet igjen i VAC-a. Aktivitetsutbyttet utgjorde dermed 36,4%.
2.3. Modifikasjonsgrad
Av den spesifikke aktivitet og den anvendte mengde inaktiv VAC-a ble det beregnet at statistisk hvert 6. VAC-a-molekyl ble merket med<125>I-atom.
3.4. Identitet og renhet
Under anvendelse av SDS-PAGE (gradient-gel 7 - 17%, ikke reduserende betingelser) og den påfølgende vurdering av gelen ved sølvfarving (Oakley-metoden), autoradiografi og påvisning under en Linearanalyzer (Fa. Berthold LB 282, Sonde LB 2 820) (Fig. 3) ble substansen undersøkt under sammenligning med det benyttede VAC-a. Substansene var identiske. Andelen av dimert produkt lå tydelig under grensen på 8% som tolereres for inaktive charger.
Tekst til figurene
Fig, l: Alternerende adsorpsjon og desorpsjon av VAC på en fosfolipid-overflate, indusert ved økning hhv. senkning av Ca2 +-konsentrasjonen. Adsorpsjonen av VAC (1/xg/ml) på et 20% DOPS/80% DOPC fosfolipid-dobbeltskikt. Tilsetning av Ca<2+>(3, 4, 6 mM) er angitt med t hhv. E. Fig. 2: Innflytelse av fosfolipid-sammensetningen og Ca<2+->konsentrasjonen på adsorpsjonen av VAC på en fosfolipid-overf late . o 100% DOPS; o 20% DOPS; D 5% DOPS; □ 1 % DOPS; 100% DOPC; samtlige blandinger ble supplert med DOPC. [VAC] = 1/ig/ml. Fig. 3: Effekt av bivalente ioner på adsorpsjonen av VAC. VAC-adsorpsjon på dobbeltskikt av 20% DOPS og 80% DOPC i nærvær av de angitte ioner (1 eller 3 mM) . [VAC] = 1/ig/ml. Fig. 4: Synergistisk effekt av Zn2+ på den Ca<2>"""-avhengige adsorpsjon av VAC på fosfolipid-overflaten.
Effekten av Ca<2+>på VAC-adsorpsjonen på 1% DOPS og 99% DOPC i nærvær av 50/tM Zn<2+>ble målt. [VAC] = 1/xg/ml.
Fig. 5: Adsorpsjon av VAC på fosfolipid-dobbeltskikt av for-skjellig sammensetning.
VAC-adsorpsjonen på dioleoylfosfatidylserin (DOPS), cardiolipin CL) og dioleoylfosfatidyletanolamin (DOPE), enten ren eller blandet med 80% dioleoylfosfatidylkolin (DOPC), på dioleoylfosfatidylglycerol (DOPG), fosfatidylinsositol (PI) og stearylamin blandet med 80% DOPC eller på ren DOPC.
[VAC] = 1/xg/ml; [Ca2 + ] = 3 mM.
Fig. 6:
1,3,4,6-tetraklor-3a-6a-difenyl-glykoluril
(IODO-GEN)
Fig. 7: Radioaktivitetsfordeling i fraksjonene 1-12.
Fig. 8: Radioaktivitetsfordeling under "Linearanalyzer".
Den beregnede blanding ble anbragt på "film balance"-anordningen. Mengden av dobbeltskikt ble målt ved ellipsometri og aktiviteten av<14>C-merket DOPS ble målt med en Beckman 6S 3801 scintillasjonsteller (s.d. <2%) og korrigert for bak-grunnsstrålingen (60 DPM). DOPS-fraksjonen i dobbeltskiktet ble beregnet ved bruk av ligning 2:
Den spesifikke aktivitet av DOPS utgjorde 100.000 -1 2 DPM.iig , overflaten besatt med fosfolipider 0,62 cm .
Den maksimale VAC-adsorpsjon (Tmaks) på de oppførte fosfolipid-overflater sammen med den kalsiumkonsentrasjon som fører til halvparten av den maksimale VAC-binding [Ca 2+^ 1/ 2' er angitt som middelverdi av minst tre forskjellige forsøk med angivelse av de tilsvarende standardavvik,
n.d. = not determined = ikke bestemt
Litteraturfortegnelse
1.. Confurius, P & Zwaal, R. F. A. (1977) Biochim. Biophys. Acta 488, -42. 2. Corsel, J. W., Willems, G. M., Kop, J. M. M. , Cuypers, P. A. & Hermens, W. Th. (1986) J. Colloid Interface Sei. 111, 544-554. 3. Cuypers, P. A., Corsel, J. W., Janssen, M. P., Kop, J. M. M., Hermens, W. TH. & Hemker, H. C. (1983) J. Biol. Chem. 258, 2426-2431. 4. McCrackin, F. L., Passaglia, E., Stromberg, R. R. & Steinberg, H. L. (1963) J.Res.Nat.Bur.Stand.Sect.A 67, 3-377. 5. Kop, J. M. M., Cuypers, P. A., Lindhout, Th., Hemker, H. C. & Hermens, W. Th. (1984) J. Biol. Chem. 259, 13993-13998. 6. Schlaepfer, D. D., Mehlman, T., Burgess, W. H. & Haigler. H. T. (1987) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84, 6078-6082. 7. Op den Kamp, J.A. F. Ann-. Rev. Biochem. 1979, 48: 47-71. 8. Zwaal, R.F.A. Biochim. Biophys. Acta 1978, 515: 163-205. 9. Jackson, CM. und Nemerson, Y. Ann. Rev. Biochem. 1980, 49: 765-811.

Claims (18)

1. Anvendelse av et antikoagulerende polypeptid innen annexin-familien som er forsynt med en påvisbar markør, som middel for å skjelne mellom fosfatidylkolin og fosfatidylserin.
2. Anvendelse av et antikoagulerende polypeptid innen annexin-familien som er forsynt med en påvisbar markør, som middel for diagnose av protrombotiske tilstander, utgangspunktet for forstyrrelsen eller aktiveringen av det hemostatiske system og/eller tromben.
3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2 av et polypeptid i form av VAC.
4. Anvendelse ifølge et av kravene 1-3 av et polypeptid i form av VAC-a eller VAC-S.
5. Anvendelse ifølge et av kravene 1-4 av en fluorescerende markør fortrinnsvis fluoresceinisotiocyanat, eller til radio aktiv merking, en radioisotop av et halogen, av technetium, bly, kvikksølv, tallium eller av indium, fortrinnsvis<1>31I eller<125>I, eller et paramagnetisk kontrastmiddel.
6. Anvendelse ifølge krav 1 til 5 av et hjelpestoff.
7. Anvendelse ifølge krav 6 av et hjelpestoff i form av fysiologisk natriumkloridoppløsning, arginin- og/eller fosfatbuffer.
8. Anvendelse ifølge krav 1-7 av en antikoagulant, fortrinnsvis heparin, som ikke reduserer plasma-kalsiumkonsentrasjonen.
9. Anvendelse av et antikoagulerende polypeptid innen annexin-familien, som er forsynt med en påvisbar markør, for fremstilling av et preparat til å fastslå utgangspunktet for aktiveringen av det hemostatiske system.
10. Anvendelse ifølge krav 9 av polypeptidet VAC.
11. Anvendelse ifølge krav 9 eller 10 av polypeptidet VAC-a eller VAC-S.
12. Anvendelse ifølge et av kravene 9-11 av en påvisbar markør i form av en radioisotop, fortrinnsvis en av radioisotopene<125>I,<1>23I,131I, ^In,<99m>Tc, 203Pb, 198Hg eller<201>Tl eller et paramagnetisk kontrastelement.
13. Fremgangsmåte for konstatering av den protrombotiske tilstand, karakterisert vedat a) blodet som skal undersøkes, blandes ekstrakorporealt med et antikoagulerende polypeptid innen annexin-familien, som bærer en påvisbar markør og b) markeringen assosiert med spesifikke celletyper, analyseres.
14. Fremgangsmåte ifølge 13, karakterisert vedat polypeptidet er VAC.
15. Fremgangsmåte ifølge krav 13 eller 14,karakterisert vedat det som påvisbar markør benyttes fluoresceingruppen eller en radioisotop, fortrinnsvis en av radioisotopene 125 I, 123 I, 131 I,1<11>In,<99m>Tc,<203>Pb,<198>Hg eller<201>T1.
16. Fremgangsmåte ifølge krav 13 til 15,karakterisert vedat det dessuten tilsettes et hjelpestoff.
17. Fremgangsmåte ifølge krav 16,karakterisert vedat det som hjelpestoff benyttes fysiologisk natriumkloridoppløsning, arginin-og/eller fosfatbuffer.
18. Fremgangsmåte ifølge krav 16 eller 17,karakterisert vedat det dessuten benyttes et antikoagulant, fortrinnsvis héparin som ikke reduserer plasma-kalsiumkonsentrasjonen.
NO922528A 1989-12-27 1992-06-26 Anvendelse av et antikoagulerende polypeptid som diagnostisk middel samt fremgangsmÕte for konstatering av protrombisk tilstand NO305276B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3942988 1989-12-27
PCT/EP1990/002257 WO1991009628A1 (de) 1989-12-27 1990-12-19 Verwendung eines antikoagulant als diagnostikum

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO922528D0 NO922528D0 (no) 1992-06-26
NO922528L NO922528L (no) 1992-08-26
NO305276B1 true NO305276B1 (no) 1999-05-03

Family

ID=6396455

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO922528A NO305276B1 (no) 1989-12-27 1992-06-26 Anvendelse av et antikoagulerende polypeptid som diagnostisk middel samt fremgangsmÕte for konstatering av protrombisk tilstand

Country Status (15)

Country Link
EP (2) EP0806670B1 (no)
JP (1) JP3135261B2 (no)
KR (1) KR0181520B1 (no)
AT (2) ATE164083T1 (no)
AU (1) AU642202B2 (no)
CA (1) CA2070647C (no)
DE (3) DE4040817A1 (no)
ES (1) ES2113372T3 (no)
FI (1) FI107586B (no)
HU (2) HUT61491A (no)
NO (1) NO305276B1 (no)
NZ (1) NZ236620A (no)
PT (1) PT96385B (no)
WO (1) WO1991009628A1 (no)
ZA (1) ZA9010319B (no)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5627036A (en) * 1989-12-27 1997-05-06 Boehringer Ingelheim International Gmbh Use of an anticoagulant as a diagnostic agent
EP1138334A3 (en) * 1992-06-09 2002-04-03 Neorx Corporation Pretargeting methods and compounds
WO1995014788A1 (en) * 1993-11-24 1995-06-01 University Of Washington Blood coagulation retardants and devices
US5968477A (en) * 1994-01-24 1999-10-19 Neorx Corporation Radiolabeled annexin conjugates with hexose and a chelator
CA2180555C (en) * 1994-01-24 2004-12-14 Sudhakar Kasina Radiolabeled annexins
US20030220233A1 (en) 1994-01-24 2003-11-27 Neorx Corporation Radiolabeled annexins
DE69518319T2 (de) * 1994-03-16 2000-12-14 Mallinckrodt, Inc. Verwendung von oberflächenaktiven substanzen zur stabilisierung von peptiden und proteinen zur radiopharmazeutischen verwendung
CA2185535C (en) * 1994-04-11 2000-10-24 Christiaan Peter Maria Reutelingsperger A method for detecting and/or optionally quantifying and/or separating apoptotic cells in or from a sample
EP0765166B1 (en) * 1994-06-16 2003-05-21 Neorx Corporation Radiolabeled annexin-galactose conjugates
EP1364964A1 (en) * 1994-06-16 2003-11-26 Neorx Corporation Radiolabeled annexingalactose conjugates
US5886143A (en) * 1994-12-07 1999-03-23 Neorx Corporation Hepatic-directed compounds and reagents for preparation thereof
EP0799050B1 (en) * 1994-12-07 2004-08-11 Neorx Corporation Radiolabeled annexin-galactose cluster conjugates
EP1486509A3 (en) * 1994-12-07 2005-03-23 Neorx Corporation Radiolabeled annexin-galactose cluster conjugates
US5955605A (en) * 1995-02-21 1999-09-21 Neorx Corporation Biotinidase resistant biotin-DOTA conjugates
FR2736197B1 (fr) * 1995-06-29 1997-09-12 Univ Paris Curie Nanoparticules magnetiques couplees a de l'annexine et leur utilisation

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4427646A (en) * 1981-04-02 1984-01-24 Research Corporation Use of radiolabeled peptide derived from crosslinked fibrin to locate thrombi in vivo
US4455290A (en) * 1981-04-02 1984-06-19 Research Corporation Inhibition of fibrin polymerization by a peptide isolated from fibrin Fragment D1
US4820505A (en) * 1985-04-04 1989-04-11 Scripps Clinic And Research Foundation Detection of activated platelets with antibodies to thrombospondin
PT87083B (pt) * 1987-03-28 1992-07-31 Boehringer Ingelheim Int Processo para a preparacao de uma proteina anticoagulante vascular, de adn que codifica para esta proteina e de composicoes farmaceuticas que a contem
DE3810331A1 (de) * 1988-03-26 1989-10-05 Boehringer Ingelheim Int Monoklonale vac-antikoerper

Also Published As

Publication number Publication date
ATE429644T1 (de) 2009-05-15
AU642202B2 (en) 1993-10-14
NO922528D0 (no) 1992-06-26
PT96385A (pt) 1991-10-31
DE59010946D1 (de) 2009-06-04
DE59010815D1 (de) 1998-04-23
JPH05502877A (ja) 1993-05-20
NZ236620A (en) 1997-03-24
WO1991009628A1 (de) 1991-07-11
EP0509026A1 (de) 1992-10-21
NO922528L (no) 1992-08-26
EP0806670A3 (de) 1997-12-10
CA2070647C (en) 2001-04-10
JP3135261B2 (ja) 2001-02-13
PT96385B (pt) 1998-06-30
EP0806670B1 (de) 2009-04-22
EP0806670A2 (de) 1997-11-12
CA2070647A1 (en) 1991-06-28
FI107586B (fi) 2001-09-14
HU9202149D0 (en) 1992-10-28
AU7071191A (en) 1991-07-24
KR0181520B1 (ko) 1999-05-01
HUT61491A (en) 1993-01-28
KR920703121A (ko) 1992-12-17
EP0509026B1 (de) 1998-03-18
HU209650B (en) 1994-09-28
DE4040817A1 (de) 1991-07-04
ES2113372T3 (es) 1998-05-01
ZA9010319B (en) 1992-08-26
FI922719A0 (fi) 1992-06-12
ATE164083T1 (de) 1998-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5955437A (en) Use of an anticoagulant as a diagnostic agent
NO305276B1 (no) Anvendelse av et antikoagulerende polypeptid som diagnostisk middel samt fremgangsmÕte for konstatering av protrombisk tilstand
Bolton et al. A radioimmunoassay for platelet factor 4
Nossel et al. Radioimmunoassay of human fibrinopeptide A
Dawes et al. The release, distribution, and clearance of human β-thromboglobulin and platelet factor 4
Stratton et al. Selective uptake of radiolabeled annexin V on acute porcine left atrial thrombi
Griffin et al. Reevaluation of total, free, and bound protein S and C4b-binding protein levels in plasma anticoagulated with citrate or hirudin
Miletich et al. Human plasma protein Z antigen: range in normal subjects and effect of warfarin therapy
Nossel et al. Measurement of fibrinopeptide A in human blood
Day et al. Localization in vivo of radioiodinated anti-rat-fibrin antibodies and radioiodinated rat fibrinogen in the Murphy rat lymphosarcoma and in other transplantable rat tumors
Holguin et al. Relationship between the membrane inhibitor of reactive lysis and the erythrocyte phenotypes of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria.
BREEN JR et al. Ethanol gelation: A rapid screening test for intravascular coagulation
EP0714405A1 (en) Therapeutic and diagnostic agents for amyloidosis
NO174326B (no) Anveldelse av maalsoekende merket polypeptid
PT85730B (pt) Processo para a preparacao de factor de estimulacao de megacariocitos
Thompson et al. Removal of heparin and protamine from plasma
Kierulf et al. Fibrinemia in medical patients screened by the ethanol test
Chapitis et al. Multiple sedimenting species of properdin in human serum and interaction of purified properdin with the third component of complement.
Dekker et al. MBP–annexin V radiolabeled directly with iodine-124 can be used to image apoptosis in vivo using PET
US20020168722A1 (en) Novel cleaved fragments of fibrinogen
Nossel et al. Potential use of fibrinopeptide A measurements in the diagnosis and management of thrombosis
Ziegler et al. Metabolism of properdin in normal subjects and patients with renal disease.
Wallace et al. Biological activity and conformational stability of the domains of plasma fibronectin
Murakami et al. Studies on the xanthurenic acid-insulin complex: III. distribution of xanthurenic acid and formation of xanthurenic acid-insulin complex in serum
Chandeysson et al. Delayed hemolytic transfusion reaction caused by anti‐P1 antibody

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired