KR100291529B1 - 단백질 씨 유도체 - Google Patents

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KR100291529B1 KR1019930008613A KR930008613A KR100291529B1 KR 100291529 B1 KR100291529 B1 KR 100291529B1 KR 1019930008613 A KR1019930008613 A KR 1019930008613A KR 930008613 A KR930008613 A KR 930008613A KR 100291529 B1 KR100291529 B1 KR 100291529B1
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피터 지. 스트링거
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Abstract

높은 활성 및 트롬빈 활성화에 대한 감소된 의존성을 지닌 인간 단백질 C 유도체들이 기술되어 있다. 상기 유도체들은 그들의 증가된 활성화율, 기능적 활성 및 탄수화물 구조에 있어서 천연형태의 민간 단백질 C와는 다르다. 상기 유도체들을 생산하는데 유용한 DNA 화합물, 이전 벡터, 발현 벡터 및 형질전환체들이 또한 기술되어 있다.

Description

단백질 씨 유도체
본 발명은 인체용 약물, 특히 혈액 응고 질환의 치료에 있어서의 의약 분야에 속한다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 인간 단백질 C 분자의 유도체, 상기 유도체의 사용방법 및 상기 단백질 C 유도체를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
단백질 C는 약 25킬로달톤의 경쇄(light chain) 및 약 41킬로달톤의 중쇄(heavy chain)로 구성되고 디술피드(disulfide)로 연결된 불활성 이형이량체(heterodimer)로서 주로 순환하는, 비타민 K 의존성 혈장 단백질이다. 중쇄는 N-말단 활성화 펩티드를 갖는 세린 단백질 분해효소 도메인을 포함하는 반면, 경쇄는 칼슘-의존성 막결합 및 기능적 활성에 필요한 감마-카르복시글루탐산 잔기의 부위를 포함한다. 불활성 인간 단백질 C 전효소(zymogen)는 활성화 펩티드(순환하는 전효소의 158 내지 169번 잔기 또는 전효소 전구체(preprozymogen)의 200 내지 211번 잔기)를 절단하여 활성 단백질 C를 형성하는 트롬빈/트롬보모듈린 복합체의 작용에 의해 활성화 단백질 C로 전환된다.
치료제로서 단백질 C의 역할은 잘 알려져 있다(예를 들어, 인간 단백질 C 전효소를 코딩하는 DNA 서열을 개시하고 있는 방(Bang)등의 미합중국 특허 제4,775,624호 및 활성화된 인간 단백질 C의 생산 방법을 개시하고 있는 방 등의 미합중국 특허 제4,992,373호 참조). FLIN으로 명명된 인간 단백질 C 유도체가 게르리츠(Gerlitz) 등에 의한 유럽 특허출원 제91301450.2호에 개시되어 있다. 상기 FLIN 유도체는 활성화 펩티드의 167번 위치(전효소 전구체의 206번 위치)에 Asp 잔기 대신 Phe 잔기를, 그리고 중쇄 내의 172번 위치(전효소 전구체의 214번 위치)에 Asp 잔기 대신 Asn 잔기를 포함한다. FLIN 유도체는 야생형(wild type) 인간 단백질 C 전효소보다 더 쉽게 트롬빈에 의해 활성화된다. Q313 및 Q329로 명명된 다른 인간 단백질 C 유도체들은 게르리츠 등에 의한 유럽 특허출원 제91301446.0호에 개시되어 있다. Q313 유도체는 야생형 전효소의 313번 위치에 Asn 잔기 대신 Gln 잔기를 포함하는 반면, Q329 유도체는 야생형 전효소의 329번 위치에 Asn 잔기 대신에 Gln 잔기를 포함한다. 상기 Q313 및 Q329 유도체들은 야생형 분자상의 상기 위치들에서 보통 Asn 잔기와 결합된 탄수화물 구조가 없기 때문에, 증가된 아미드 분해 활성(amidolytic activity) 및 기능적 활성을 나타낸다.
본 발명은 천연 인간 단백질 C 분자의 313번 아미노산을 아스파라긴에서 글루타민으로 변화시키고, 천연 인간 단백질 C의 167번 아미노산을 아스파르트산에서 페닐알라닌으로 변화시키고, 그리고 천연 인간 단백질 C 분자의 172번 아미노산을 아스파르트산에서 아스파라긴으로 변화시킴으로써 변형된 인간 단백질 C의 유도체들에 관한 것이다. 상기 분자들은 또한 천연 인간 단백질 C 분자의 329번 위치에서 야생형 아스파라긴 잔기를 글루타민 잔기로 변화시킴으로써 변형될 수도 있다. 329번 잔기의 변화는 오직 313번 잔기에서의 변화와 함께 일어나거나, 또는 167번 및 172번 잔기에서의 변화와 함께 일어날 수도 있다. 상기 인간 단백질 C 유도체들은 트롬빈에 의해 더 쉽게 활성화되고, 또한 야생형 인간 단백질 C 분자 또는 다른 어떠한 인간 단백질 C 유도체보다 기능적으로 활성이다.
신규한 인간 단백질 C 유도체를 생산하는데 유용한 재조합 DNA 구성물, 벡터 및 형질전환체도 역시 개시되고 특허청구되어 있다. 또한, 본 발명의 인간 단백질 C 유도체 유효량을 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 함유하는 약학 조성물 뿐만 아니라, 질병 상태의 치료 및 예방에 있어서 상기 유도체를 사용하는 방법도 역시 개시되고 특허청구되어 있다.
본 명세서에 개시되고 특허청구된 바와 같이 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어들 및 약자들은 다음과 같이 정의된다.
Q313-천연 인간 단백질 C 분자의 313번 위치에 있는 아스파라긴 잔기가 글루타민 잔기로 변화된 인간 단백질 C 유도체.
Q329-천연 인간 단백질 C 분자의 329번 위치에 있는 아스파라긴 잔기가 글루타민 잔기로 변화된 인간 단백질 C 유도체. 단백질 C 유도체들인 Q313 및 Q329는 게르리츠등의 유럽 특허출원 제91301446.0호 및 그린넬(Grinnell) 등의 문헌(J. Biol. Chem. 226. 9778-9785(1991)에 개시되어 있고, 그의 교시 내용은 본 명세서에 참고 문헌으로서 인용되어 있다.
Q3Q9-천연 인간 단백질 C 분자의 313번 위치에 있는 아스파라긴 잔기가 글루타민 잔기로 변화되고 천연 인간 단백질 C 분자의 329번 위치에 있는 아스파라긴 잔기가 글루타민 잔기로 변화된 인간 단백질 C 유도체.
F167-천연 인간 단백질 C 분자의 167번 위치에 있는 아스파르트산 잔기가 페닐알라닌으로 변화된 인간 단백질 C 유도체. 단백질 C 유도체 F167은 방(Bang) 등의 유럽 특허출원 제88312201.1호 및 에를리히(Ehrlich) 등의 문헌(EMBO J. 9, 2367-2373(1990))에 개시되어 있고, 그의 교시 내용은 본 명세서에 참고문헌으로서 인용되어 있다.
LIN-천연 인간 단백질 C 분자의 172번 위치에 있는 아스파르트산 잔기가 아스파라긴 잔기로 변화된 인간 단백질 C 유도체.
FLIN-천연 인간 단백질 C 분자의 167번 위치에 있는 아스파르트산 잔기가 페닐알라닌으로 변화되고, 천연 단백질 C 분자의 172번 위치에 있는 아스파르트산 잔기가 아스파라긴 잔기로 변화된 인간 단백질 C 유도체.
단백질 C 유도체들인 LIN 및 FLIN은 게르리츠 등의 유럽 특허출원 제91301450.2호 및 그린넬 등의 문헌(Protein C and Related Anticoagulants(eds. Bruley, D. & Drohan, W.) 13-46(Gulf Publishing Co., Houston, 1990)에 개시되어 있고, 그의 교시 내용은 본 명세서에 참고문헌으로서 인용되어 있다.
FLIN-Q313-천연 인간 단백질 C 분자의 167번 위치에 있는 아스파르트산 잔기가 페닐알라닌으로 변화되고, 천연 단백질 C 분자의 172번 위치에 있는 아스파르트산 잔기가 아스파라긴 잔기로 변화되고, 천연 단백질 C 분자의 313번 위치에 있는 아스파라긴 잔기가 글루타민 잔기로 변화된 인간 단백질 C 유도체.
FLIN-Q3Q9-천연 인간 단백질 C 분자의 167번 위치에 있는 아스파르트산 잔기가 페닐알라닌으로 변화되고, 천연 단백질 C 분자의 172번 위치에 있는 아스파르트산 잔기가 아스파라긴 잔기로 변화되고, 천연 단백질 C 분자의 313번 위치에 있는 아스파라긴 잔기가 글루타민 잔기로 변화되고, 천연 단백질 C 분자의 329번 위치에 있는 아스파라긴 잔기가 글루타민 잔기로 변화된 인간 단백질 C 유도체.
GBMT 전사 단위-아데노바이러스 주 후기 프로모터(adenovirus major late promoter, MLTF)의 업스트림 조절 인자에 인접한 BK 바이러스의 P2 증진자(enhancer), 아데노바이러스-2주 후기 프로모터, 상기 프로모터를 자극하도록 위치한 폴리 GT 엘리먼트 및 3부분으로 스플라이스(splice)된 아데노바이러스의 리더서열(leader sequence) 함유 DNA 서열을 포함하는 변형된 전사 조절 단위.
초기 단백질-임의의 번역후 변형(post-translational modification) 이전의 mRNA 전사물의 번역 후 생산되는 폴리펩티드. 그러나, 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화 및 아스파르트산 잔기의 히드록실화와 같은 번역후 변형은 mRNA 전사물로부터 단백질이 완전히 번역되기 전에 일어날 수도 있다.
단백질 C 활성-단백질 분해활성, 아미드 분해활성, 에스테르 분해활성 및 생물학적 활성(항응고 또는 섬유소 전구물질(profibrin) 용해활성)의 원인이 되는 인간 단백질 C의 임의의 특성. 단백질 항응고 활성에 대한 시험 방법은 당분야에 공지되어 있다(예를 들어, Grinnell 등, Bio/Technology 5, 1189-1192(1987) 참조).
전효소(Zymogen)-효소적으로 불활성인 단백질 분해성 효소의 전구체, 본 명세서에 사용된 단백질 C 전효소는 단쇄든 이중쇄이든 분비된, 불활성 형태의 단백질 C를 말한다.
본 명세서에 사용된 모든 아미노산 약어는 37 C.F.R ξ1.822(b)(2)(1990)에 기재된 바와같이 미합중국 특허청(United States Patent and Trademark Office)에 의해 인정된 것들이다.
본 발명은 변경된 글리코실화 패턴을 갖고, 또한 변경된 활성화 영역을 갖는 인간 단백질 C 유도체를 제공한다. 특히, 상기 유도체들은 Q3Q9, FLIN-Q313 및 FLIN-Q3Q9를 포함한다. 유도체 Q3Q9는 단백질 C 분자의 313번 및 329번 위치에(상기 위치들에서 정상적으로 발견되는 아스파라긴 잔기 대신에) 글루타민 잔기를 포함한다. 유도체 FLIN-Q313은 분자의 167번 위치에 페닐알라닌 잔기 및 분자의 172번 위치에 아스파라긴 잔기를(상기 위치들에서 정상적으로 발견되는 아스파르트산 잔기 대신에) 포함할 뿐만아니라 313번 위치에(이 위치에서 정상적으로 발견되는 아스파라긴 잔기 대신에) 글루타민 잔기를 포함한다. 유도체 FLIN-Q3Q9에서, 167번 위치에 있는 잔기는 아스파르트산에서 페닐알라닌으로, 172번 위치에 있는 잔기는 아스파르트산에서 아스파라긴으로, 313번 위치에 있는 잔기는 아스파라긴에서 글루타민으로, 그리고 329번 위치에 있는 잔기는 아스파라긴에서 글루타민으로 변화되었다.
유도체 FLIN-Q313 및 FLIN-Q3Q9는 트롬빈 단독 사용에 의해 예외적으로 높은 활성화율을 나타낸다. 또한, 야생형 인간 단백질 C와는 달리, 유도체 FLIN-Q313 및 FLIN-Q3Q9는 모두 인간 혈장의 응고 과정에서 생성된 트롬빈에 의해 활성화되어 더 이상의 응괴(clot)형성을 억제할 수 있다. 이러한 응괴-활성화된 전효소(proenzyme)는 천연 단백질 C의 활성화된 형태보다 실질적으로 비활성이 더 크고 반감기가 더 길다. 따라서, 본 발명의 유도체들은 트롬빈 생성이 상당한 경우를 제외하고는 항 응고 활성을 갖지 않는, 위치(site)-활성화된 항혈전제(anti-thrombotic agents)로서 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 단백질 C 유도체를 만드는데 사용하기 위한 DNA 화합물을 제공한다. 상기 DNA 화합물들은 야생형 전효소 단백질 C의 펩티드 전구물질(prepropeptide) 서열의 다운스트림에 바로 인접하여 위치하고 상기 서열과 함께 번역 리딩 프레임(translational reading frame)내에 있는 단백질 C의 경쇄에 대한 코딩 서열을 포함한다. 상기 DNA 서열들은 또한 단백질 C 분자의 성숙(maturation) 과정에서 프로세싱되는 Lys-Arg 펩티드, 활성화 펩티드 및 단백질 C 분자의 중쇄를 코딩한다. 167, 172 및 313번 위치에 있는 아미노산 잔기들의 변화는 분자의 활성화를 변경시키는 반면, 313 및 329번 위치에 있는 아미노산 잔기들의 변화는 분자의 탄수화물 함량을 바꾼다.
당업자는 유전적 암호의 축퇴(degeneracy)로 인해 다양한 DNA 화합물들이 상술한 폴리펩티드들을 코딩할 수 있음을 인지할 것이다. 모든 교시 내용이 본 명세서에 참고문헌으로서 인용된 방 등의 미합중국 특허 제4,775,624호는 야생형 형태의 인간 단백질 C 분자를 코딩하는 DNA 서열을 개시하고 청구하고 있다. 당업자라면 본 명세서에 개시된 것과 똑같은 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 다른 DNA 서열을 제작하기 위해 DNA 서열은 어떻게 변화시킬 수 있는지를 쉽게 결정할 수 있기 때문에, 본 발명은 기탁에 의해 개시된 특정 DNA 서열에만 한정되지는 않는다. 결과적으로, 본 발명의 바람직한 DNA 화합물, 벡터 및 형질전환체의 제작에 대한 하기 설명 및 첨부된 실시예에 기술된 구성물들은 단지 예시적일 뿐이고 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 또한, 313 및 329번 위치에서 Asn 대신 Gln의 치환은 예시적인 것이며, Cys 또는 Pro를 제외한 다른 치환체들도 사용될 수 있다.
본 발명의 모든 DNA 화합물들은 인간 단백질 C 유전자의 위치 제한적 돌연변이화(site-directed mutagenesis)에 의해 제조되었다. 그 다음 전효소 유전자의 발현이 GBMT 전사 단위에 의해 추진되도록 변이된 전효소 코딩 분자들을 진핵 생물 발현 벡터내로 삽입하였다. 상기 벡터들은 대장균(Escherichia coli) K12 AG1 세포내로 형질전환되고 1992년 1월 14일자로 기탁되어 북부지구 연구소(Northern Regional Research Laboratories, 미국 61604 일리노이주 피오리아 소재)의 영구 보존 배양물 수집의 일부가 되었다. 특정 배양물들 및 수탁번호는 표 1에 나타나 있다.
[표 1]
배양물을 얻고 통상적인 기술을 사용하여 플라스미드를 단리한 다음, 인간 단백질 C의 유도체의 생산을 위해 진핵 생물 숙주 세포 내로 직접 형질감염(transfection)시킬 수 있다. GBMT 전사 조절 단위에서 발견되는 BK 증진자는 E1A의 존재하에 가장 효율적으로 발현을 증가시키는 기능을 하므로, 플라스미드를 아데노바이러스 EIA 즉, 초기 발현 유전자 생성물(immediate-early gene product)을 발현시키는 숙주 세포내로 형질감염시키는 것이 바람직하다. GBMT 전자 조절 단위는 베르그(Berg)등의 유럽 특허출원 제91301451.0호에 더욱 상세히 기술되어 있고 그의 모든 교시 내용은 본 명세서에 참고문헌으로서 인용되어 있다. 당업자는 다수의 숙주 세포가 큰 DNA 바이러스의 초기 발현 유전자 생성물을 발현시키거나 또는 발현시키도록 만들어질 수 있을 알고 있다. 본 발명의 인간 단백질 C 유도체의 발현을 위한 가장 바람직한 세포주는 인간 신장 293 세포주이고, 이에 대해서는 본 명세서에 참고문헌으로서 인용된 방 등의 미합중국 특허 제4,992,373호에 개시되어 있다. 세포주내에서의 발현 후에, 모든 교시 내용이 본 명세서에 참고문헌으로서 이용된 얀(Yan)의 미합중국 특허 제4,981,952호의 방법을 사용하여 세포 배양물 상층액으로부터 유도체를 정제한다.
본 발명의 DNA 서열은 화학적으로, 또는 제한 절편(restriction fragment)들을 결합시킴으로써, 또는 당분야에 공지된 기술들을 혼용하여 합성될 수 있다. DNA 합성기는 시판되고 본 발명의 DNA 화합물을 제작하기 위해 사용될 수 있다.
예시적인 본 발명의 벡터는 아데노바이러스 후기 프로모터에 의해 코딩 서열의 전사를 촉진하도록 위치되어 있는 GBMT 전사 단위를 포함한다. 당업자는 다수의 진핵생물 프로모터, 증진자 및 발현 벡터들이 당분야에 공지되어 있고 본 발명의 단백질 C 유도체를 생산하기 위해 DNA 서열들을 발현시키는데 사용될 수 있음을 인식하고 있다. 당업자들은 또한 진핵생물 발현 벡터가 증진자 없이 작용할 수 있음을 인식하고 있다. 본 발명의 중요한 측면은 유도체를 발현시키기 위해 사용될 특정 증진자 또는 프로모터에 있기 보다는, 신규한 DNA 서열들 및 상기 서열들로부터 만들어진 상응하는 단백질에 있다.
본 발명의 벡터들은 매우 다양한 진핵생물, 특히 포유동물의 숙주 세포 내로 형질전환되고 그 안에서 발현될 수 있다. NRRL에 기탁된 벡터들은 모두 하이그로마이신(hygromycin) 내성 유전자를 포함하고 있다. 그렇지만, 선택 가능한 표지(marker)를 포함하지 않은 벡터들은 쉽게 제작되어서 임시적 분석을 수행하기 위해 사용될 수 있거나, 선택 가능한 표지를 포함하는 다른 벡터와 함께 세포주 내로 함께 형질전환될 수 있다. 보통 대장균 내에서 플라스미드 DNA를 제조하는 것이 다른 숙주 유기체 내에서 보다 더욱 효과적이므로, 본 발명의 벡터들은 대장균 내에서 복제가 가능한 서열들을 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 예시적인 DNA 서열들 및 플라스미드들의 많은 변형 및 변화가 가능하다. 예를 들어, 유전적 암호의 축퇴는 코딩된 폴리펩티드 코딩 서열의 변경없이 폴리펩티드 코팅 영역 전체를 통해서 뿐만 아니라 번역 종결 신호 내에서도 뉴클레오티드의 치환을 가능하게 한다. 그러한 치환 가능한 서열들은 인간 단백질 C의 공지된 아미노산 또는 DNA 서열로부터 추론될 수 있고, 통상적인 합성 또는 위치-제한적 돌연변이화 방법에 따라 제작될 수 있다. 합성 방법은 실질적으로 문헌[이따꾸라(Itakura) 등, Science 198, 1056(1977); 및 크레아(Crea) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765(1978)]의 방법에 따라 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명은 어떠한 면으로든 특정하게 예시된 DNA 서열 및 플라스미드에 한정되지 않는다.
전효소 형태의 인간 단백질 C를 활성화 인간 단백질 C 유도체로 활성화하기 위한 방법은 종래 기술로서 당분야에 잘 공지되어 있다. 단백질 C는 트롬빈 단독 사용에 의해, 트롬빈/트롬보모듈린 복합체에 의해, 러셀(Russell)의 살모사 독액에 의해, 또는 다양한 다른 수단에 의해 활성화될 수 있다. 인간 단백질 C 유도체의 활성은 총 아미드 분해 분석(total amidolytic assays)에 의해 또는 항응고 분석에 의해 트롬빈 활성화 후에 측정될 수 있다. 트롬빈 활성화 및 단백질 C 분석(아미드 분해 및 항응고)은 그린넬(Grinnell)의 문헌(Bio/Technology 5, 1187-1192(1987))의 교시 내용에 따라 수행되었고, 이 문헌의 내용은 본 명세서에 참고 문헌으로서 인용되어 있다.
본 발명의 재조합 인간 단백질 C 유도체는 심정맥 혈전증, 폐동맥 색전증, 말초 동맥 혈전증, 심장 또는 말초동맥 기인 색전증, 급성 심근경색, 혈전성 발작, 불안정 협심증, 말초 혈관수술, 장기 이식 및 파종성 혈관내 응고와 같은 혈관내 응고를 포함하는 다양한 후천성 질병 상태의 예방 및 치료에 유용하다. 상기 단백질 C 유도체는 재발하는 심정맥 혈전증을 보이는 수많은 이종접합형 단백질 C 결핍 환자의 치료 및 전격성 자반을 지닌 동형접합형 단백질 C 결핍 환자의 경우에 효과적으로 사용될 수 있다. 활성화된 단백질 C 유도체의 또다른 치료적 효능은 일반적으로 낮은 투여량의 헤파린으로 치료되는 심정맥 혈전증 및 폐동맥 색전증의 예방이다.
본 발명의 유도체 및 활성화된 상대물들은 약학적으로 유용한 조성물들을 제조하기 위한 공지 방법에 따라 제조될 수 있고, 그에 따라 본 발명의 인간 단백질 C 유도체 또는 활성화된 단백질 C 유도체는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 배합된다. 인간 혈청 알부민과 같은 다른 인간 단백질을 포함하여 적당한 담체 및 그들의 제제는, 예를들어 문헌(Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th ed. Mack Publishing Co., edited by Osol et al., 1980)에 기술되어 있고, 상기 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 인용되어 있다. 그러한 조성물들은 숙주에 대한 효과적인 투여에 적당한 약제학적으로 허용되는 조성물을 제조하기 위해 적당량의 담체와 함께 유효량의 단백질 C 유도체, 또는 활성화된 상대물을 포함한다. 단백질 C 유도체 조성물은 비경구적으로, 또는 효과적인 형태로 혈류로의 전달을 보장하는 다른 방법들에 의해 투여될 수 있다.
하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 수단으로서 제공되며 이를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
[실시예 1]
[인간 단백질 C 유도체의 생산]
본 명세서에 참고문헌으로 인용된 방 등의 미합중국 특허 제4,992,373호의 교시와 실질적으로 동일하게 본 발명의 발현 벡터를 대장균 세포로부터 단리한 다음 293 세포내로 형질전환시키고, 형질전환체를 37℃에서 선별한 후, 배양하여 인간 단백질 C 유도체를 생산하였다. 본 명세서에 참고문헌으로 인용된 얀의 미국 특허 제4,981,952호의 교시와 실질적으로 동일하게 유도체를 세포 배양 상등액으로부터 정제하였다.
[실시예 2]
[항응고 활성]
완전히 활성화된 단백질 C는 본 명세서에 참고문헌으로서 인용된 파킨슨(Parkinson) 등의 문헌(J. Biol. Chem. 265, 12602-12610(1990))에 기술된 바와 같이 10nM 트롬빈을 가용성 재조합 인간 트롬보모듈린 TMD-75와 함께 사용하여 재료를 활성화함으로써 수득하였다. 활성화된 분자의 항응고 활성은 활성화된 부분 트롬보 플라스틴 시간 응고 분석(activated partical thromboplastin time clotting assay)으로 측정하였다. 그 결과는 하기 표 2에 나타나 있다.
[표 2]
[실시예 3]
[활성화율(Rates of Activation)]
활성화율은 20mM 트리스, pH 7.4, 0.5M NaCl, 0.1mg/ml BSA 및 3mM CaCl2를 포함하는 반응 혼합물 중의 인간 트롬빈(10nM)을 사용하여 측정하였다. 활성화 반응액 중의 정제된 단백질 C, 즉 야생형 및 유도체 양자의 농도는 0.81 내지 1.61μM이었다. 활성화율은 활성화 반응 혼합물로부터 다양한 시점에 분취량을 취하여 96-웰(well) 평판에 넣은 후, 발색 기질(S-2366)을 0.75mM의 최종농도까지 가하고, 써모맥스(Thermomax) 키네틱 미세-적정 평판 판독기(Molecular Devices사 제품)내에서 405nm에서의 흡광도의 변화(단위/분)로서 아미드 분해 활성을 측정함으로써 결정하였다. 활성화율은 각 단백질에 대하여 측정된 비활성을 사용하여 흡광도/분의 변화를 활성화 단백질 C 생성량으로 환산하고, 활성화 시간에 대하여 플롯팅하여 결정하였다. 모든 실험에서 활성화된 단백질 C의 생성량은 총 출발물질의 10% 미만이었다. 결과는 하기 표 3에 나타나 있다.
[표 3]
a표준편차가 없는 활성화율은 n=2인 연구로부터 얻었다.
상대적인 활성화율을 또한 트롬빈 및 트롬보모듈린을 사용하여 동일한 분석 시스템으로 결정하였다. 사용된 트롬보모듈린 분자는 파킨슨등(상동)의 가용성 인간 트롬보모듈린이었다. 그 결과는 하기 표 4에 나타나 있다.
[표 4]
a표준편차가 없는 활성화율은 n=2인 연구로부터 얻었다.
[실시예 4]
[인간 혈장 응고에 있어서의 항응고 활성]
야생형 인간 단백질 C 및 유도체 FLIN-Q313을, 헬레나(Helena) 표준 APTT 시약과 함께, 20nM의 농도로 인간 혈장에 가하고, 37℃에서 5분동안 배양하였다. CaCl2를 8mM의 최종 농도로 가함으로써 혈장의 응고를 개시시키고, 응고시간을 측정하였다. 동시에 수행하는 실험에서는, 활성화된 단백질 C 활성을 중화시킬 수 있는 단일 클론성 항체를 대조구 혈장 및 전효소 야생형 단백질 C 또는 FLIN-Q313을 포함하는 혈장에 가하였다. 그 결과는 하기 표 5에 나타나 있다.
[표 5]
응고되는 혈장 중에 유도된 응고 활성의 수준은 야생형 인간 단백질 C 및 FLIN-Q313 유도체의 농도의 함수로서 결정되었고 데이터는 응고 시간의 연장으로서 나타내었다. 분석에서 기본 응고 시간은 27 내지 33초였다. 그 결과는 하기 표 6에 나타나 있다.
[표 6]
[실시예 5]
[상대적 반감기의 측정]
혈장 중 인간 단백질 C의 억제는 정상적인(시트르산염화) 인간 혈장을 100nM 활성화된 인간 단백질 C, 활성화된 FLIN-Q313 또는 (비활성화) 전효소 FLIN-Q313과 함께 배양함으로써 측정하였다. 최종 반응에서 혈장 농도는 90%(v/v)이었으며, 나머지 용적은 3mM CaCl2, 150mM NaCl, 20mM 트리스(pH 7.4) 및 1mg/ml BSA를 포함하는 완충액으로 구성되었다. 지정된 시간에 분취량을 취하여 1mM의 최종 농도에서 S-2366을 사용하는 아미드 분해 활성에 의해서 또는 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간에 의해 활성화된 단백질 C 활성을 결정하였다. 응괴-활성화된 FLIN-Q313의 활성 수준은 실시예 4에 기술된 바와 같이 결정하였다. 활성화된 단백질 C 및 활성화된 FLIN-Q313은 모두 약 25분 후에 50% 이상의 활성의 상실을 나타낸 반면, 전효소 FLIN-Q313은 45분 후에도 80% 이상의 활성을 여전히 유지하였다.

Claims (2)

  1. FLIN-Q313 및 FLIN-Q3Q9로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 단백질 C 유도체.
  2. 제1항의 인간 단백질 C 유도체를 코딩하는 재조합 DNA 분자.
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