HU218408B

HU218408B - Eljárás protein C- származékok előállítására

Info

Publication number: HU218408B
Application number: HU9301461A
Authority: HU
Inventors: Bruce Edward Gerlitz; Brian William Grinnell
Original assignee: Eli Lilly And Co.
Priority date: 1992-05-21
Filing date: 1993-05-19
Publication date: 2000-08-28
Also published as: DE69333727D1; CA2096604A1; CZ286016B6; EP0575054A2; PH29911A; JPH0680698A; CN1080658A; IL105757A0; RU2122004C1; JP3564150B2; ES2233925T3; EP0575054B1; HUT69615A; DE69333727T2; NO931840L; FI932282A0; AU3869993A; EP0575054A3; MX9302917A; KR930023370A

Abstract

A találmány tárgya eljárás Q3Q9, FLIN-Q313, illetve FLIN-Q3Q9 humánprotein C-származék előállítására, ahol a Q3Q9 humán protein C-származéknál a natív humán protein C-molekula 313-as és 329-eshelyzetében az aszpa- ragincsoportok helyén glutamincsoportoktalálhatók; a FLIN-Q313 humán protein C-származéknál a natív humánprotein C-molekula 167-es helyzetű aszparaginsavcsoportja helyénfenil-alanin, 172-es helyzetű aszparaginsavcso- portja helyénaszparagincsoport és a 313-as helyzetű aszparagincsoportja helyénglutamin-csoport található; és a FLIN Q3Q9 humán protein C-származéknál a natív humán protein C-molekula 167-es helyzetűaszparaginsavcso- portja helyén fenil-alanin-csoport, 172-es helyzetűaszparaginsavcsoportja helyén aszparagincsoport, a 313-as helyzetűaszparagincsoportja helyén glutamincsoport és a 329-es helyzetűaszparagincsoportja helyén glutamin- csoport található, képezi,amelynek során a megfelelő, a származékokat kódoló DNS-t tartalmazógazdasejtet, amely DNS a protein C könnyű láncát kódoló szekvenciátközvetlenül a vad típusú zimogén protein C pre- propeptidszekvenciájaközelében, attól 3’-irányban és azonos leolvasási keretbentartalmazza, expressziós körülmények között tenyésztik. Szintén atalálmány tárgyát képezik a humán protein C-származékok, az azokatkódoló DNS-molekulák, egy gazdasejt, valamint a humán protein C-származékokat hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítményekelőállítása is. ŕ

Description

KIVONAT

A találmány tárgya eljárás Q3Q9, FLIN-Q313, illetve FLIN-Q3Q9 humán protein C-származék előállítására, ahol a Q3Q9 humán protein C-származéknál a natív humán protein C-molekula 313-as és 329-es helyzetében az aszparagincsoportok helyén glutamincsoportok találhatók; a FLIN-Q313 humán protein C-származéknál a natív humán protein C-molekula 167-es helyzetű aszparaginsavcsoportja helyén fenil-alanin, 172-es helyzetű aszparaginsavcsoportja helyén aszparagincsoport és a 313-as helyzetű aszparagincsoportja helyén glutamincsoport található; és a FLIN Q3Q9 humán protein C-származéknál a natív humán protein C-molekula 167es helyzetű aszparaginsavcsoportja helyén fenil-alanincsoport, 172-es helyzetű aszparaginsavcsoportja helyén aszparagincsoport, a 313-as helyzetű aszparagincsoportja helyén glutamincsoport és a 329-es helyzetű aszparagincsoportja helyén glutamincsoport található, képezi, amelynek során a megfelelő, a származékokat kódoló DNS-t tartalmazó gazdasejtet, amely DNS a protein C könnyű láncát kódoló szekvenciát közvetlenül a vad típusú zimogén protein C prepropeptidszekvenciája közelében, attól 3’-irányban és azonos leolvasási keretben tartalmazza, expressziós körülmények között tenyésztik.

Szintén a találmány tárgyát képezik a humán protein C-származékok, az azokat kódoló DNS-molekulák, egy gazdasejt, valamint a humán protein C-származékokat hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítása is.

A leírás terjedelme 8 oldal

HU 218 408 B

HU 218 408 Β

A találmány a humán gyógyászat területéhez tartozik, és főként véralvadási rendellenességek kezelésére vonatkozik. Közelebbről meghatározva a találmány a humán protein C-molekula származékaira és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények felhasználására irányul.

A protein C egy K-vitamin-függő plazmafehérje, amely főként inaktív diszulfidhidakkal összekapcsolt, mintegy 25 kD relatív molekulatömegű könnyű láncból és mintegy 41 kD relatív molekulatömegű nehéz láncból álló heterodimer formájában kering. A nehéz lánc tartalmazza a szerin proteázinhibitor domént az N-terminálisan elhelyezkedő aktiváló peptiddel együtt, míg a könnyű lánc a gamma-karboxi-glutaminsav-maradékokat tartalmazza, melyek a kalciumfüggő membránkötődéshez és a funkcionális aktivitáshoz szükségesek. A protein C inaktív zimogén alakját aktivált protein C-vé a trombin/trombomodulin komplex alakítja át, amely hasítja az aktiváló peptidet (a keringő zimogén 158-169 szakaszát vagy a preprozimogén 200-211 szakaszát) és így aktivált protein C képződik.

A protein C gyógyhatása jól ismert (lásd például Mang és munkatársai, 4 775 624 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, amely ismerteti a humán protein C-zimogént kódoló DNS-szekvenciát, és Bang és munkatársai, 4 992 373 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, amely eljárást közöl az aktivált humán protein C előállítására). FLIN-ként jelölt humán protein C-származékokat írnak le Gerlitz és munkatársai a 9 130 1450.2 számú európai szabadalmi bejelentésben. Ez a FLIN-származék inkább Phe-csoportot, mint Asp-csoportot tartalmaz az aktiváló peptid 167-helyzetében (a preprozimogén 206-helyzete), és inkább Asn-t, mint Asp-t a nehéz lánc 172-helyzetében (a preprozimogén 214-helyzete). A FLIN-származékot a trombin könnyebben aktiválja, mint a „vad” típusú humán protein C-zimogént. Gerlitz és munkatársai a 91301446.0 számú európai szabadalmi bejelentésben Q313 és Q329 jelű egyéb humán protein C-származékokat írnak le. A Q313 inkább Gin-csoportot, mint Asn-csoportot tartalmaz a vad típusú zimogén 313-pozíciójában, míg a Q329-származék inkább Gin-, mint Asn-csoportot tartalmaz a vad típusú zimogén 329-helyzetében. A Q313- és Q329-származékból hiányzik az a szénhidrátstruktúra, amely a vad típusú molekula e helyein elhelyezkedő Asn-csoporttal általában társul és ezért fokozott amidolitikus és funkcionális aktivitással rendelkezik.

Találmányunk olyan módosított protein C-származékokra is vonatkozik, amelyekben a natív humán protein C 313-helyzetű aminosavát aszparaginról glutaminra, a 167-helyzetű aminosavát aszparaginsavról fenilalaninra, és a 172 aminosavát aszparaginsavról aszparaginra cseréltük ki. E molekulák a natív humán protein C-molekula 329-helyzetében is módosíthatók a vad típusú aszparagincsoport glutamincsoportra való kicserélése útján. A 329-helyzetű csoport csak a 313 csoporttal egyidejűleg változtatható meg, vagy a változtatás a 167 és 172 csoportok kicserélésével összekötve is végrehajtható. E humán protein C-származékok trombin hatására könnyebben aktiválhatok és funkcionálisan aktívabbak a vad típusú humán protein C-molekuláknál vagy bármely más humán protein C-származéknál.

A találmány az új protein C-származékok előállításához felhasználható rekombináns DNS-szerkezetekre, vektorokra és -transzformánsokra is kiterjed, valamint olyan gyógyszerkészítményekre, amelyek hatásos mennyiségű találmány szerinti humán protein C-származékokat tartalmaznak egy vagy több gyógyszerészetileg elfogadható segédanyaggal együtt, továbbá a származékok betegségek kezelésére és megelőzésére történő felhasználására.

A találmány leírásában használt következő meghatározásokat és rövidítéseket az alábbiakban részletezzük.

Q313 - humán protein C-származék, ahol a natív humán protein C-molekula 313-helyzetében az aszparagincsoportot glutamincsoporttá cserélték ki.

Q329 - humán protein C-származék, ahol a natív humán protein C-molekula 329-helyzetében az aszparagincsoportot glutamincsoporttá változtatták meg. A Q313 és Q329 jelű protein C-származékokat Gerlitz és munkatársai a 91301446.0 számú európai szabadalmi bejelentésben és Grinnell és munkatársai a J. Bioi. Chem. 226, 9778-9785 (1991) közleményben ismertetik, és eredményeiket itt hivatkozásként említjük meg.

Q3Q9 - humán protein C-származék, ahol a natív humán protein C-molekula 313-helyzetében az aszparagincsoportokat glutaminná és a 329-helyzetű aszparagincsoportot glutamincsoporttá cseréltük ki.

FI67 - humán protein C-származék, ahol a natív humán protein C-molekula 167 helyzetében az aszparaginsavmaradékot fenil-alaninra cserélték ki. Az FI67 jelű protein C-származékot Bang és munkatársai a 88312201.2 számú európai szabadalmi bejelentésben és Ehrlich és munkatársai az EMBO J. 9, 2367-2373 (1990) közleményben írják le, és eredményeiket itt hivatkozásként közöljük.

LIN - humán protein C-származék, ahol a natív humán protein C-molekulában a 172-helyzetű aszparaginsavcsoportot aszparaginná változtatták meg.

FLIN - humán protein C-származék, ahol a natív humán protein C-molekulában a 167-helyzetű aszparaginsavcsoportot fenil-alaninra és a 172-helyzetű aszparaginsavcsoportot aszparaginra cserélték ki. A LIN és a FLIN jelű protein C-származékokat Gerlitz és munkatársai a 91301450.2 számú európai szabadalmi bejelentésben és Grinnell és munkatársai a „Protein C and Related Anticoagulants” (Bruley D. és Drohan W., szerk., Gulf Publishing Co., Houston, 1990, 13-46. oldal) kézikönyvben írják le, és eredményeiket itt hivatkozásként említjük meg.

FLIN-Q313 - humán protein C-származék, ahol a natív protein C-molekula 167-helyzetű aszparaginsavcsoportját fenil-alaninra, a 172-helyzetű aszparaginsavmaradékát aszparagincsoportra és a 313-helyzetű aszparagincsoportját glutamincsoportra változtattuk meg.

FLIN-Q3Q9 - humán protein C-származék, ahol a natív humán protein C-molekula 167-helyzetű aszparagincsoportját fenil-alaninra, a 172-helyzetű aszparaginsavcsoportját aszparagincsoportra, a 313-helyzetű aszpa2

HU 218 408 Β ragincsoportját glutamincsoportra és a 329-helyzetű aszparagincsoportját glutamincsoportra változtattuk meg.

GBMT transzkripciós egység - módosított transzkripciós szabályozóegység, amely tartalmazza a BK vírus P2 enhancerét közvetlenül az adenovírus „major laté” promotere (MLTF) 5’-irányban elhelyezkedő szabályozóeleméhez bevágva, az adenovírus-2 „major laté” promotert, e promotert elhelyezkedésénél fogva stimulálni képes poli-GT-szakaszt, valamint a hasított 3 részes adenovírus vezérszekvenciáját.

Naszcens fehéqe - mRNS-transzkriptum transzlációjakor (lefordításakor) képződő polipeptid, ami még mindenféle poszttranszlációs módosítás előtt áll. Mégis a transzláció utáni módosítások, mint például a glutaminsavmaradék gamma-karboxilezése és az aszparaginsavmaradékok hidroxilezése elkezdődhet, mielőtt a fehérje az mRNS-transzkriptumról teljesen átíródna.

Protein C-aktivitás - a humán protein C bármely tulajdonsága, amely proteolitikus, amidolitikus, eszterolitikus és biológiai (alvadásgátló és profibrinolitikus) aktivitásokért felelős. Fehérjék antikoaguláns aktivitásának tesztelésére szolgáló módszerek jól ismertek az irodalomból (Grinnell és munkatársai, Bio/Technology 5, 1189-1192(1987)).

Zimogén - proteolitikus enzimek enzimatikusan inaktív prekurzora. Az itt használt protein C-zimogén meghatározás akár kétláncú, akár egyláncú protein C-szekretált, inaktív formáira vonatkozik.

A leírásban használt aminosavrövidítések megfelelnek a „United States Patent and Trademard Office” által elfogadottaknak, amint azt a 37 C. F. R. §1.822 (b) (2) (1990) leírja.

Találmányunk szerint humán protein C-származékokat állítunk elő, amelyek megváltozott glikolizációs mintázattal és megváltozott aktiválási régiókkal rendelkeznek. Közelebbről meghatározva e származékok a Q3Q9, FLIN-Q313 és FLIN-Q3Q9 csoportjába tartoznak. A Q3Q9-származék glutamincsoportot tartalmaz a protein C-molekula 313- és 329-helyzetében (az e helyzetekben szokásosan előforduló aszparagincsoportok helyett). A FLIN-Q313-származék fenil-alanin-maradékot tartalmaz a molekula 167-helyzetében és aszparaginmaradékot a molekula 172-helyzetében (az e helyzetekben normálisan előforduló aszparaginsav helyett), valamint a 313-helyzetben glutamincsoportot (az e helyzetben szokásosan előforduló aszparagincsoport helyett). A FLIN-Q3Q9-származékban a 167-helyzetű csoportot aszparaginsavról fenil-alaninra, a 172-helyzetű csoportot aszparaginsavról aszparaginra, a 313-helyzetű csoportot aszparaginról glutaminra és a 329-helyzetű csoportot aszparaginról glutaminra változtattuk meg.

A FLIN-Q313 és FLIN-Q3Q9-származékok magával a trombinnal kivételesen nagy sebességgel aktiválhatok. Ezenfelül úgy a FLIN-Q313-, mint a FLINQ3Q9-származék - eltérően a vad típusú protein C-től - az alvadó humán plazmában képződő trombinnal aktiválható, ami a további alvadékképződés gátlásához vezet. Ez az alvadók aktiválta proenzim lényegesen nagyobb specifikus aktivitással és hosszabb féléletidővel rendelkezik, mint a természetes protein C aktivált formája. Ezért a találmány szerinti származékok helytől függően aktivált trombózisellenes szerekként használhatók, melyek csak jelentős trombinképződéskor mutatnak alvadásgátló hatást.

A találmány szerint a protein C-származékok előállításához szükséges DNS-vegyületeket is előállítjuk. E DNS-vegyületek a protein C könnyű láncát kódoló szekvenciát közvetlenül a vad típusú zimogén protein C prepropeptidszekvenciája közelében, attól 3’-irányban és azonos leolvasási keretben tartalmazzák. A DNS-szekvenciák a protein C-molekula érése közben képződő Lys-Arg dipeptidet, az aktiváló peptidet és a protein C nehéz láncát is kódolják. A 167-, 172- és 313-helyzetben az aminocsoportok változásai megváltoztatják a molekula aktiválását, míg a 313- és 329-helyzetű aminosavcsoport-változások a molekula szénhidráttartalmát változtatják meg.

A szakember számára nyilvánvaló, hogy a genetikai kód degenerációja következtében számos DNS-vegyület képes a fentebb leírt polipeptidek kódolására. Bánd és munkatársai a 4 775 624 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban - melynek eredményeit itt hivatkozásképpen említjük meg - leíqák a humán protein C-molekula vad típusú formáját kódoló DNS-szekvenciát. Bár a szakember könnyen meg tudja határozni, hogy a DNS-szekvenciában milyen változtatásokat kell végrehajtani ahhoz, hogy a leirt pontos polipeptideket kódoló DNS-szakaszok jöjjenek létre, a találmány nem korlátozódik a deponált, specifikus DNSszekvenciákra. Következésképpen az alább és a példákban leírt előnyös találmány szerinti DNS-vegyületek, -vektorok és -transzformánsok kizárólag a találmány illusztrálása szolgálnak anélkül, hogy annak hatókörét korlátoznák. Ezenfelül az Asn Gln-nel történő helyettesítése a 313- és 329-helyzetben szintén csak illusztratív jellegű és nem korlátozza a találmány hatókörét, minthogy Cys és Pro kivételével egyéb helyettesítések is lehetségesek.

A találmány szerinti összes DNS-vegyületeket a humán protein C-gén irányított mutagenezisével állítottuk elő. A mutagenizált zimogénkódoló molekulákat azután beépítettük az eukariótakifejező vektorokba úgy, hogy a zimogén gének kifejeződése a GBMT transzkripciós egységgel irányítható. E vektorokat Escherichia coli K12 AG1 sejtekbe vittük be, deponáltuk őket és 1992. január 14. óta e sejtek a „Northern Régiónál Research Laboratories” (NRRL) gyűjtemény permanens törzstenyészetének részét képezik (Peoria, Illinois). A sajátos kultúrák és hivatkozási számok az 1. táblázatban találhatók.

1. táblázat

Kultúra	Hivatkozási szám
E. coli K12 AGl/pGT-h-Q3Q9	NRRL B-1893 8
E. coli K12 AGl/pGT-h-FLIN-Q313	NRRL B-18939
E. coli K12 AGl/pGT-h-FLINQ3Q9	NRRL B-18940

HU 218 408 Β

Szokásos módszerek segítségével jutunk a kultúrákhoz és izoláljuk a plazmidokat, melyeket közvetlen fertőzéssel szaporítunk eukariota gazdasejteken a humán protein C-származékok létrehozása céljából. Előnyös a plazmidokkal olyan gazdasejteket fertőzni, amelyekben az adenovírus E1A korai génterméke kifejeződik, minthogy a GBMT transzkripciós szabályozóegységben található BK enhancer működésénél fogva az expressziót leghatásosabban El A jelenlétében fokozza. A GBMT transzkripciós szabályozóegységet részletesebben írják Berg és munkatársai a 91301451.0 számú európai szabadalmi bejelentésben, melynek eredményeire itt hivatkozásként utalunk. A szakember tudja, hogy számos gazdasejt szintetizálja a nagy DNS-vírus korai géntermékét, vagy erre késztethető. Mégis a találmány szerinti humán protein C-származékok szintetizálására a legelőnyösebb sejtvonal a humán vese 293 sejtvonal, melyet Bang és munkatársai a 4 992 373 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben írnak le, és ennek eredményeire itt hivatkozásként utalunk. A sejtvonalban való kifejeztetés után a származékokat a sejttenyészet felülúszójából „tisztítjuk ki” Yan eljárását követve (4 981 952 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), melynek eredményeit itt hivatkozásként említjük meg.

A találmány szerinti DNS-szekvenciák kémiai úton szintetizálhatok, vagy restrikciós fragmentumok egyesítése, vagy ismert technikák kombinációja útján. DNSszintetizátorok beszerezhetők és felhasználhatók a találmány szerinti DNS-vegyületek felépítésére.

A találmány szerinti jellemző vektorok közé tartozik a GBMT-átíró egység, amely úgy helyezkedik el, hogy az adenovírus késői promotere által stimulálja a kódolószekvenciákat. A szakember tudja, hogy számos eukariota promoter, enhancer és expressziós vektor ismert és használható a találmány szerinti protein C-származékokat létrehozó DNS-szekvenciák kifejeztetésére. A szakember azonban azt is felismeri, hogy az eukarióta expressziós vektorok enhancer elem nélkül is tudnak működni. A találmány fő aspektusát nem a származékok kifejeztetésére használt sajátos enhancer vagy promoter képezi, hanem inkább az új DNS-szekvenciák, és e szekvenciákból felépülő megfelelő fehérjék.

A találmány szerinti vektorok nagyszámú eukarióta, főleg emlős gazdasejtbe juttathatók be, illetve ezekben expresszálhatók. Az NRRL-nél deponált vektorok mind tartalmazzák a higromicinrezisztenciáért felelős gént. Azonban a szelekciót lehetővé tevő markert nem tartalmazó vektorok könnyen létrehozhatók és átmeneti próbák végzésére használhatók, vagy a sejtvonalakba együtt juttathatók be más vektorokkal, amelyek szelekciót lehetővé tevő markereket tartalmaznak. A találmány szerinti vektorok olyan szekvenciákat is tartalmazhatnak, amelyek hozzájárulnak az E. coli replikációjához, minthogy plazmid DNS-t általában hatékonyabban lehet E. coliból, mint más gazdaszervezetekből izolálni.

A találmány szerinti jellemző DNS-szekvenciákban és plazmidokban számos módosítás és változtatás hajtható végre. Például a genetikai kód degenerációja lehetővé teszi a nukleotidok cseréjét a polipeptidet kódoló régiókban, valamint a transzlációs stopszignálban anélkül, hogy a polipeptidet kódoló szekvencia megváltozna. Az ilyen kicserélhető szekvenciák a humán protein C ismert aminosav- vagy DNS-szekvenciájából vezethetők le és a következő szokványos szintetikus vagy irányított mutageneziseljárasokkal hozhatók létre. A szintetikus eljárások lényegében Itakura és munkatársai [Science 198, 1056 (1977)] és Crea és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978)] szerint végezhetők el. Ezért találmányunk semmiképpen sem korlátozódik a DNSszakaszok és plazmidok sajátos példáira.

A humán protein C zimogén formái régi és jól ismert eljárásokkal aktiválhatok aktív humán protein C-származékokká. A protein C-egyedül trombinnal, trombin/trombomodulin komplexszel, Russel-féle kígyóméreggel vagy számos más eszközzel aktiválható. A humán protein C-származékok aktivitása trombinaktiválást követően teljes amidolitikus próbákkal vagy antikoagulációs próbákkal határozható meg. A trombinaktiválás és protein C-próbák (amidolitikus és antikoaguláns) Grinnell és munkatársai szerint [Bio/Technology 5, 1187-1192 (1987)] hajthatók végre, amelyre itt hivatkozásként utalunk.

A találmány szerinti rekombináns humán protein C-származékok számos, éren belüli alvadással járó szerzett betegség megelőzésére és kezelésére használhatók, beleértve a mély vénás trombózist, tüdőembóliát, perifériás artériás trombózist, szívből vagy perifériás artériákból származó embólusokat, akut szívizominfarktust, trombózisos „stroke”-ot, angina pectorist, perifériás érsebészeti beavatkozást, szervátültetést és disszeminált intravaszkuláris koagulációt (DIC). Ezek a protein C-származékok hatékonyan használhatók heterozigóta protein C-hiányban és ezzel együtt mélyvénás trombózisban szenvedő betegeknél, valamint purpura tulminánsban szenvedő homozigóta protein C-hiányos betegeknél. Az aktivált protein C-származékok mások gyógyászati javallatát a mélyvénás trombózis és tüdőembólia megelőzése jelenti, melyeket jelenleg alacsony dózisú heparinnal kezelnek.

A találmány szerinti származékok és aktivált alakjaik ismert módszerekkel gyógyszerkészítményekké formulálhatók, melynek során a humán protein C-származékot vagy a találmány szerinti aktivált protein C-származékot gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal keveijük össze. Alkalmas hordozókat és készítményeket - beleértve más humán fehérjéket, például humán szérumalbumint tartalmazókat - írnak le például a „Remington’s Pharmaceutical Sciences” (16. kiadás, 1980, Mack Publishing Co., Osol és munkatársai, szerk.) kézikönyvben. Az ilyen készítmények hatásos mennyiségű protein C-származékokat vagy aktivált protein C-származékokat tartalmaznak megfelelő mennyiségű hordozóanyaggal együtt. A protein C-származékot tartalmazó készítmény parenterálisan vagy más úton adható a betegnek, amely biztosítja, hogy a véráramba hatásos formában jusson be.

A következő példák célja a találmány bemutatása anélkül, hogy a találmány hatókörét korlátoznák.

HU 218 408 Β az aktiválási idő függvényében ábrázolva. A képződött aktivált protein C mennyisége minden kísérletnél kevesebb az összes kiindulóanyag 10%-ánál. Az eredmények a 3. táblázatban láthatók.

1. példa

Humán protein C-származékok előállítása A találmány szerinti expressziós vektorokat E. coli sejtekből izoláljuk, majd 293 sejtekbe transzformáljuk, a transzformánsokat 37 °C-on szelektáljuk, majd tenyésztjük és így lényegében Bang és munkatársai (4 992 373 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) leírása szerint - melyet itt hivatkozásként említünk meg - humán protein C-származékokat kapunk. A származékokat a sejttenyészet felülúszójából „tisztítjuk ki” lényegében a 4 981 952 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi eljárásban megadott eljárás segítségével, melyet itt hivatkozásként említünk meg.

2. példa

Véralvadásgátló aktivitások

Teljesen aktivált protein C nyerése céljából az anyagot 10 mM trombin és oldható rekombináns humán trombomodulin TMD-75 komplexével aktiváljuk Parkinson és munkatársai [J. Bioi. Chem. 265, 12 602-12 610 (1990)] leírása szerint, amelyre itt hivatkozásként utalunk. Az aktivált molekulák antikoaguláns aktivitását az aktivált parciális tromboplasztinidő (ΑΡΤΙ) próbával határozzuk meg. Az eredményeket a

2. táblázat tartalmazza.

2. táblázat

Protein C	Antikoaguláns aktivitás egység/mg	Relatív aktivitás
Vad típus	325+65	1
Q313	577+17	1,8
LIN	289+13	0,9
F167	283+27	0,9
FLIN	313+65	1
FLIN-Q313	552+37	1,7

3. példa

Aktiválási sebesség

Az aktiválási sebességek meghatározásához humán trombint (10 nM) használunk, melyet 20 mM Trist (pH 7,4), 0,15 M NaCl-ot, 0,1 mg/ml borjúszérum-albumint és 3 mM CaCl₂-ot tartalmazó eleggyel reagáltatunk. Az aktiválási reakcióban a tisztított protein C - vad típusú és származékok - koncentrációja 0,81-1,61 μΜ. Az aktiválási sebesség meghatározásához az aktivációs keverékből különböző időpontokban alikvotokat veszünk ki 96 lyukú lemezbe, majd 0,75 M végkoncentrációjú kromogén szubsztrát (S-2366) hozzáadása után az amidolitikus aktivitást 405 nm-en a percenkénti abszorpcióegység változásaként adjuk meg, ThermoMax kinetikus mikrotiterlemez-leolvasó (Molecular Devices) segítségével. A sebességeket úgy határozzuk meg, hogy az optikai denzitás (OD) percenkénti változását a képződött aktivált protein C mennyiségévé alakítjuk, az egyes fehérjékre meghatározott fajlagos aktivitásokat

3. táblázat

Protein C	Aktiválási sebesség trombinnal, ng/min	Aktiválás relatív sebessége
Vad típus	0,53+0,1	1
Q329	0,23^a	0,4
Q313	1,1+0,2	2
Q3Q9	l,62^a	3,3
LIN	2,2+0,4	4
F167	6,3 + 1,0	12
FLIN	15,9+4,0	30
FLIN-Q313	32,3+6,4	61
FLIN-Q3Q9	45,0^a	84

^a A standard eltérés nélküli sebességek olyan kísérletekből szármáznak, ahol n=2.

Az aktiválás relatív sebességeit hasonló próbában határozzuk meg trombint és trombomodulint használva. Az alkalmazott trombomodulinmolekula azonos a Parkinson és munkatársai által leírt, fentebb idézett oldható humán trombomodulinnal. Az eredményeket a 4. táblázat tartalmazza.

4. táblázat

Protein C	Relatív aktiválási sebességek trombin és trombomodulin hatására
Vad típus	l^a
Q313	2,6+0,6
LIN	2,1 3+0,2
F167	3,5+0,8
FLIN	2,7“
FLIN-Q313	9,2+1,0

^a A standard eltérés nélküli sebességek olyan próbákból származnak, ahol n=2.

4. példa

Humán plazma olvadásakor mért antikoagulánsaktivitás nM koncentrációban vad típusú humán protein C-t és FLIN-Q313-származékot, továbbá Helena standard ΑΡΤΙ reagenst adunk humán plazmához, és 5 percen át 37 °C-on inkubáljuk. A plazma alvadását 8 mM végkoncentrációjú CaCl₂ hozzáadásával indítjuk el és megmérjük az alvadási időt. Párhuzamos kísérletekben aktivált protein C-aktivitás semlegesítésére képes monoklonális antitestet adunk kontrollplazmához és zimogén vad típusú protein C-t vagy FLIN-Q313-származé5

HU 218 408 Β kot tartalmazó plazmához. Az eredmények az 5. táblázatban láthatók.

5. táblázat

Protein C	Alvadási idő (sec)
+Ab	-Ab
Semmi (kontroll)	30±4	32±3
Vad típus	36±4	33±5
FLIN-Q313	36±4	75±5

A megalvadt plazmában indukált alvadási aktivitás szintjét a vad típusú humán protein C és az FLIN-Q313származék koncentrációjának függvényében határozzuk meg és az adatokat az alvadási idő megnyúlásával fejezzük ki. A próbában az alap alvadási idő 27-35 sec. Az eredményeket a 6. táblázat tartalmazza.

(A fenti 5. táblázatban az „Ab” szimbólum antitestet jelent.)

6. táblázat

Protein C	Dózis (nM)	Alvadási idő megnyúlása (sec)
Vad típus	8	0±3
FLIN-Q313	8	20±6
Vad típus	16	0±5
FLIN-Q313	16	37±6
Vad típus	32	0±5
FLIN-Q313	32	77±6
Vad típus	64	0±5
FLIN-Q313	64	235±6

5. példa

Relatív féléletidők meghatározása A humán protein C gátlását a plazmában úgy határozzuk meg, hogy a normál (citrátos) humán plazmát 100 nM aktivált humán protein C-vel, aktivált FLINQ313-mal vagy zimogén (nem aktivált) FLIN-Q313mal inkubáljuk. A végső reakcióelegyben a plazma koncentrációja 90 térfogat%, a fennmaradó térfogat 3 mM CaCl₂-ot, 150 mM NaCl-ot, 20 mM Trist (pH 7,4) és 1 mg/ml boíjúszérum-albumint tartalmazó pufferből áll. Meghatározott időpontokban alikvotokat veszünk ki és az aktivált protein C aktivitását az amidolitikus aktivitás meghatározása útján állapítjuk meg 1 mM végkoncentrációjú S-2366-ot alkalmazva, vagy az aktivált parciális tromboplasztinidő (ΑΡΤΙ) mérése útján. Az FLIN-Q313-alvadék indukálta aktivitás szintjét a 4. példában leírtak szerint határozzuk meg. Az aktivált protein C és az aktivált FLIN-Q313 aktivitása több mint 50%-kal csökken mintegy 25 perc múlva, míg a zimogén FLIN-Q313 aktivitásának legalább 80%-a még 45 perc múlva is megmarad.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás Q3Q9, FLIN-Q313, illetve FLINQ3Q9 humán protein C-származék előállítására, ahol a Q3Q9 humán protein C-származéknál a natív humán protein C-molekula 313-as és 329-es helyzetében az aszparagincsoportok helyén glutamincsoportok találhatók; a FLIN-Q313 humán protein C-származéknál a natív humán protein C-molekula 167-es helyzetű aszparaginsavcsoportja helyén fenil-alanin, 172-es helyzetű aszparaginsavcsoportja helyén aszparagincsoport és a 313-as helyzetű aszparagincsoportja helyén glutamincsoport található; és a FLIN Q3Q9 humán protein C-származéknál a natív humán protein C-molekula 167-es helyzetű aszparaginsavcsoportja helyén fenil-alanin-csoport, 172-es helyzetű aszparaginsavcsoportja helyén aszparagincsoport, a 313-as helyzetű aszparagincsoportja helyén glutamincsoport és a 329-es helyzetű aszparagincsoportja helyén glutamincsoport található; azzal jellemezve, hogy a megfelelő, a származékokat kódoló DNS-t tartalmazó gazdasejtet, amely DNS a protein C könnyű láncát kódoló szekvenciát közvetlenül a vad típusú zimogén protein C prepropeptidszekvenciája közelében, attól 3’-irányban és azonos leolvasási keretben tartalmazza, expressziós körülmények között tenyésztünk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Q3Q9 humán protein C-származékot állítunk elő.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy FLIN-Q313 humán protein C-származékot állítunk elő.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy FLIN-Q3Q9 humán protein C-származékot állítunk elő.
5. Eljárás az 1. igénypont szerinti humán protein C-származékot kódoló rekombináns DNS-molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy az előállítás során a DNS-molekulát kémiai úton, vagy restrikciós fragmentumok egyesítése útján szintetizáljuk, vagy a natív humán protein C-gént irányított mutagenezisnek vetjük alá, vagy ezen módszerek kombinációját alkalmazzuk.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Q3Q9 humán protein C-származékot kódoló rekombináns DNS-molekulát állítjuk elő.
7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a FLIN-Q313 humán protein C-származékot kódoló rekombináns DNS-molekulát állítjuk elő.
8. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a FLIN-Q3Q9 humán protein C-származékot kódoló rekombináns DNS-molekulát állítjuk elő.
9. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns DNS-molekulaként plazmidot állítunk elő.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy plazmidként pGT-h-Q3Q9 (NRRL-B-18938), pGT-h-FLIN-Q313 (NRRL-B-18939), vagy pGT-hFLIN-Q3Q9 (NRRL-B-18940) plazmidot állítunk elő.
11. Eljárás gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy egy sejtet a 9. igénypont szerinti rekombináns DNS-plazmiddal transzformálunk.

HU 218 408 Β
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy transzformálandó sejtként 293-as sejtet vagy Escherichia coli sejtet alkalmazunk.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként 293/pGT-h-Q3Q9, 293/pGT-h- 5 FLIN-Q313, 293/pGT-h-FLIN-Q3Q9, E. coli K12 AGl/pGT-h-Q3Q9, E. coli K12 AGl/pGT-hFLIN-Q313 vagy E. coli KI2 AGl/pGT-h-FLINQ309 gazdasejtet állítunk elő.
14. Eljárás hatóanyagként a Q3Q9, FLIN-Q313 vagy FLIN-Q3Q9 proteinszármazékot tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a hatóanyagokat egy vagy több gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval, segédanyaggal vagy hígítóanyaggal keverjük össze, és a gyógyszerészetben szokásos módszerek alkalmazásával gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.