JP2005528351A

JP2005528351A - 活性化プロテインｃ製剤

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Publication number: JP2005528351A
Application number: JP2003574110A
Authority: JP
Inventors: ガナパシー・ゴパルラスナム; フアン・リファ; ラルフ・メリディス・リギン; セオドア・アーセイ・シェリガ
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2002-03-08
Filing date: 2003-02-27
Publication date: 2005-09-22
Also published as: WO2003075834A2; AU2003213146A1; WO2003075834A3; CA2475738A1; AU2003213146A8; EP1485121A2; US20050143283A1; EP1485121A4

Abstract

本発明はキレート化剤を含む活性化プロテインＣの医薬組成物に関する。好ましくは、その製剤は、活性化プロテインＣ、キレート化剤、充填剤、緩衝剤および／または塩を含み、再構築後のｐＨが約５．５から約６．５である。もしくは、キレート化剤を活性化プロテインＣ医薬組成物に用いる希釈剤に加える。本発明のａＰＣ医薬組成物、ａＰＣ製剤およびその使用法により、使用過程の安定性が改善された。

Description

本発明はヒト医薬の分野に属し、特に活性化プロテインＣによる血管性障害の処置に関する。より具体的には、本発明は組換えヒト活性化プロテインＣの医薬組成物、製剤および使用に関する。

プロテインＣはセリンプロテアーゼであり、凝血カスケードにおけるＶａおよびＶＩＩＩａ因子を不活性化することによりホメオスタシス調節に関与する、天然に存在する抗凝血因子である。プロテインＣは重鎖Ｎ末端のドデカペプチドの離脱により活性化し、酵素活性を有する活性化プロテインＣ（ａＰＣ）となる。

ａＰＣの血液凝固カスケードにおける酵素的な働きに加え、ａＰＣは分解も可能である。活性化プロテインＣの分解により、完全長鎖に類似した抗凝血活性を持つ変異型、またはより活性の低い変異型が生じ得る。Fosterら(WO91/09951)によると、ａＰＣは完全長軽鎖中に欠失がある活性変異型を含みうる。Fosterは、そのような変異型は１４９から１５２アミノ酸残基を含み、これらの軽鎖欠失による実質的な活性変化はないことを記載している。

Fosterらと対照的に、本出願人は、１−１５０、１−１５１および１−１５２軽鎖変異型は活性であるが、１−１４９軽鎖変異型はより活性が低いことを発見した。この低活性変異型は、効力が減少し抗凝血因子としての機能性が低下している。

患者へのａＰＣ投与は、ａＰＣ製剤の凍結乾燥製剤を希釈剤で再構築し、静脈注入溶液剤に加え、静脈輸血を通じて何時間もかけて投与される。この使用過程のａＰＣ溶液剤は、より活性の低い１−１４９ａＰＣＣ末端軽鎖変異型が存在するため効力レベルが減少している。従って、１−１４９ａＰＣＣ末端軽鎖変異型分解産物レベルを最小にすることが、ａＰＣ製剤の使用過程効力を強力にする上で重要である。

本出願人は、キレート化剤をａＰＣ製剤とともに使用される希釈剤へ、またはａＰＣ製剤そのものへ添加することにより、ａＰＣの溶液安定性が改善されることを発見した。Linnauら(AU 9892449)は、プロテインＣを含む少なくとも２つの血液凝固因子の医薬調製およびキレート化剤の使用について述べている。カルシウムイオンがマグネシウムの存在により、またはＥＤＴＡなどのキレート化剤もしくはクエン酸のような関連物質の添加により置換されると、調製中のトロンビン早熟形成が妨げられる。Linnauらは活性化プロテインＣの調製、そして活性化プロテインＣが切断変異型を形成する傾向またはその安定性に対して持ち得る金属イオンまたはキレート化剤の効果を示していない。このように当分野には、安定で効力のある活性化プロテインＣ製剤を調製する必要が残っている。従ってこれらの発見により、使用過程で効力のあるａＰＣ製剤であって、それを必要とする患者への投与に適するものを医療提供者が調製できるようになる。

発明の概要

本発明はａＰＣを含む医薬組成物およびキレート化剤を提供する。該医薬組成物は該キレート化剤を含有する。

本発明はまたａＰＣを含む医薬組成物、希釈剤およびキレート化剤を提供する。該希釈剤は再構築希釈剤もしくは静脈注入溶液剤のいずれかであり、キレート化剤を含有する。

本発明はさらに凍結乾燥製剤形態の医薬組成物を提供する。これらの医薬組成物はａＰＣ、キレート化剤、充填剤、緩衝剤および／または塩を含有する。再構築すると、該医薬組成物のｐＨは約５．５から６．５となる。

本発明はまたａＰＣ凍結乾燥製剤を調製する方法であって、活性化プロテインＣ、充填剤およびキレート化剤を含む医薬製剤を凍結乾燥する方法を提供する。

また本発明は、ａＰＣ医薬溶液剤を調製する方法であって、活性化プロテインＣを含む凍結乾燥製剤をキレート化剤を含有する希釈剤により再構築する方法を提供する。

さらに本発明は、ａＰＣ医薬溶液剤を調製する方法であって、活性化プロテインＣおよび充填剤を含む凍結乾燥製剤をキレート化剤を含有する希釈剤により再構築する方法を提供する。

また本発明は、処置を必要とする患者を処置する方法であって、本発明の医薬組成物を該患者に投与する方法を提供する。

加えて本発明は、本発明の医薬組成物の血栓性疾患などの処置への使用を提供する。

本明細書にて開示、請求する本発明の用語を以下に定義する。

ａＰＣまたは活性化プロテインＣは、組換えあるいは血漿由来の活性化プロテインＣを意味する。ａＰＣはヒト活性化プロテインＣであるのが好ましいが、他の種の活性化プロテインＣまたは活性化プロテインＣ誘導体を含んでもよい。プロテインＣ誘導体の例は、Gerlitzら、米国特許5,453,373およびFosterら、米国特許5,516,650からなる群から選択される。

ＡＰＴＴ−活性化部分トロンボプラスチン時間。

ｒ−ｈＰＣ−組換えヒトプロテインＣ酵素前駆体。

ｒｈＡＰＣ−組換えヒト活性化プロテインＣ。

ｒ−ａＰＣ−プロテインＣ酵素前駆体をインビトロまたはインビボで活性化することによって、または例えばヒト腎臓２９３細胞からの分泌などの、原核生物細胞、真核生物細胞またはトランスジェニック動物からの酵素前駆体としてのプロテインＣの活性化型の直接分泌によって産生され、次いで当業者に既知の技術により精製され、活性化された組換え活性化プロテインＣ。その例はYan、米国特許4,981,952およびCottingham、WO 97/20043に記載されている。

継続注入−溶液剤の血管への導入を実質的にとぎれることなく一定時間続けること。

ボーラス注射−一定量（いわゆるボーラス）の薬剤を一度に注入すること。

投与に適する−治療薬として用いるのに適当な凍結乾燥製剤または溶液剤。

酵素前駆体−本明細書で用いられるプロテインＣ酵素前駆体は、１または２鎖の分泌型非活性プロテインＣを意味する。

製薬的に許容される緩衝剤−製薬的に許容される緩衝剤は当分野で既知である。製薬的に許容される緩衝剤はリン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムまたはＴＲＩＳを含む。

キレート化剤−製薬的に許容される多座配位子であり、その分子は単一の金属イオンと複数の結合を形成し、環状構造を取ることができる。

希釈剤−希釈剤は状況により、再構築希釈剤または静脈注入溶液剤である。再構築希釈剤は、凍結乾燥製剤を液状に復元するのに用いられる。静脈注入溶液剤は医薬組成物または医薬製剤を患者に投与するためのビヒクルとして用いられる溶液剤である。凍結乾燥製剤は静脈注入溶液剤に加えられる前に再構築される。再構築溶液剤もしくは静脈注入溶液剤としての希釈剤のいくつかの例は、0.9％塩化ナトリウム、塩化カリウムと塩化ナトリウム、グルコースと塩化ナトリウム、5％デキストロース、乳酸化リンガー液、3％塩化ナトリウム、注射用滅菌水およびリンガー注射液を含む。

ＥＤＴＡ−状況により、単独あるいは塩錯体の一部にあるエチレンジアミン四酢酸。好ましいＥＤＴＡ型は、エデト酸二カリウム、エデト酸二ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ＥＤＴＡ遊離酸、ＥＤＴＡ二ナトリウム塩、ＥＤＴＡ二ナトリウム塩二水和物、ＥＤＴＡ二ナトリウム−カルシウム塩、ＥＤＴＡ二カリウム塩、ＥＤＴＡ三カリウム塩、ＥＤＴＡナトリウム塩、ＥＤＴＡ三ナトリウム塩、ＥＤＴＡ四ナトリウム塩水和物、ＥＤＴＡ四ナトリウム塩四水和物、ＥＤＴＡ第二鉄−ナトリウム塩、ＥＤＴＡ第二鉄−ナトリウム塩水和物および他の塩や水和物からなる群から選択される。エデト酸なる語はエチレンジアミン四酢酸の略語である。

活性化プロテインＣは、ヘパリンおよび経口ヒドロキシクマリン型抗凝血剤などの市販の抗凝血剤よりも治療指数が幅広い抗血栓剤である。活性化プロテインＣはまた血栓性障害の処置に有用である。ａＰＣは抗血栓剤として、血栓性脳卒中、深在性静脈血栓症、肺塞栓症、末梢動脈血栓症、心臓または末梢動脈由来の塞栓、急性心筋梗塞、播種性血管内血液凝固および急性前毛細血管閉塞または急性毛細血管後閉塞、ならびに移植または網膜血栓症などの血管内凝固を含む多岐にわたる後天性病態の処置に計り知れない影響を持つ。活性化プロテインＣは、敗血症、移植、火傷、妊娠、大手術、外傷または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）に付随する、後天性凝固性亢進病態または後天性プロテインＣ欠乏症の処置に有用である。本発明の製剤は本明細書記載の医薬組成物を患者に投与する処置法を提供する。本発明の製剤はさらに、ひとつまたはそれ以上のこれらの状態に罹患している患者の処置における本明細書記載の医薬組成物の使用を提供する。

本発明はａＰＣの安定な製剤および使用に関する。安定な凍結乾燥製剤はａＰＣおよびキレート化剤からなる。さらに状況に応じて本製剤には、マンニトール、トレハロース、ラフィノースおよびスクロースからなる群から選択される凍結乾燥製剤用の充填剤が加えられる。さらに、溶液剤の塩濃度によりイオン強度を随意に調節できる。イオン強度の創出に通常用いる製薬的に許容される塩は、塩化カリウム（ＫＣｌ）および塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含むがそれに限定されない。凍結乾燥産物は適当な希釈剤によって再構築される。好ましくは、再構築後の溶液のｐＨは約５．５から約６．５である。効果的なｐＨ調節を維持するために、ａＰＣ溶液は製薬的に許容される緩衝剤を含む。代表的な緩衝系にはトリス−酢酸、クエン酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウムが含まれる。好ましい製剤の利用法は、安定な凍結乾燥ａＰＣ産物をキレート化剤を含有する希釈剤で再構築して用いる方法である。また、好ましい製剤の利用法は、安定な凍結乾燥ａＰＣ産物を希釈剤で再構築し、その後キレート化剤を含む静脈注入溶液剤に加えるか、静脈注入溶液剤に加えた後にキレート化剤を加える方法である。

製剤におけるａＰＣ、緩衝剤、塩濃度、ｐＨ、温度および充填剤間の分子間相互作用は複雑である。しかし、上述のいずれかの成分またはパラメーターを有するａＰＣ製剤にキレート化剤を加えるかもしくは、ａＰＣ製剤とともに用いられる希釈剤にキレート化剤を加えることにより、活性の小さい１−１４９ａＰＣＣ末端軽鎖変異型分解産物を抑制できる。本発明の製剤は安定であり、酵素学的に活性であり、分解の少ないａＰＣを提供する。本発明により１−１４９ａＰＣＣ末端軽鎖変異型量の増加が抑制または阻止された。好ましくは、１−１４９ａＰＣＣ末端軽鎖変異型レベルの増加は５％以下である。より好ましくは１−１４９ａＰＣＣ末端軽鎖変異型レベルの増加は３％以下である。さらにより好ましくは、１−１４９ａＰＣＣ末端軽鎖変異型レベルの増加は２％以下である。もっとも好ましくは、１−１４９ａＰＣＣ末端軽鎖変異型レベルの増加は１％以下である。この安定性は、調製過程および製剤状態を注意深く制御すること、またキレート化剤を付加することにより得られる。

具体的なａＰＣ供給源は本発明の実施可能性に影響しないが、１つの例示的な供給源を後述の調製例１および２に示している。好ましくは、ａＰＣは他のビタミンＫ依存タンパク質およびプロテインＳ、プロテインＺなどの因子ならびに因子ＩＩ，ＶＩＩ，ＩＸおよびＸを含まない。本明細書記載の製剤は、凍結乾燥し、再構築した後に直接投与するか、または状況に応じて静脈注入溶液剤で希釈後に投与するかのいずれかに適した医薬品を対象とするものである。

本発明のキレート化剤の使用により、金属の隔離方法を提供する（金属を隔離しなければ１−１４９軽鎖変異型を生じるａＰＣ分解が促進されるおそれがある）。代表的なキレート化剤は、エデト酸二カリウム、エデト酸二ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ＥＤＴＡ遊離酸、ＥＤＴＡ二ナトリウム塩、ＥＤＴＡ二ナトリウム塩二水和物、ＥＤＴＡ二ナトリウム−カルシウム塩、ＥＤＴＡ二カリウム塩、ＥＤＴＡ三カリウム塩、ＥＤＴＡナトリウム塩、ＥＤＴＡ三ナトリウム塩、ＥＤＴＡ四ナトリウム塩一水和物、ＥＤＴＡ四ナトリウム塩四水和物、ＥＤＴＡ第二鉄−ナトリウム塩、ＥＤＴＡ第二鉄−ナトリウム塩一水和物および他の塩および水和物を含む。もっとも好ましいキレート化剤はＥＤＴＡ二ナトリウム塩である。当業者は本発明の製剤に他の多くのキレート化剤が利用できることを認識するであろう。キレート化剤の最適濃度は希釈剤中に存在する金属量に依存する。しかし、すべての金属を隔離するのに十分な濃度のキレート化剤が使用されている限り、必要量を超える過剰なキレート化剤によって医薬組成物または医薬製剤がなんら不適当な影響を受けることはない。なお、当業者はキレート化剤の使用量の上限は生理学的許容内であることを認識するであろう。主に、キレート化剤の量はａＰＣ濃度に基づいて決定される。好ましくは、キレート化剤の量は１μＭから１０ｍＭである。より好ましくは、キレート化剤の量は２０μＭから５ｍＭである。２．５ｍｇ／ｍＬａＰＣを用いる時の好ましいキレート化剤濃度は、１μＭから１０ｍＭである。２．５ｍｇ／ｍＬａＰＣを用いる時のより好ましいキレート化剤濃度は２０μＭから５ｍＭである。さらにより好ましくは、２．５ｍｇ／ｍＬａＰＣを用いる時のキレート化剤濃度は５０μＭから１ｍＭである。２．５ｍｇ／ｍＬａＰＣを用いる時のもっとも好ましいキレート化剤濃度は５００μＭである。また、５ｍｇ／ｍＬａＰＣを用いる時の好ましいキレート化剤濃度は１μＭから１０ｍＭである。５ｍｇ／ｍＬａＰＣを用いる時のより好ましいキレート化剤濃度は２０μＭから５ｍＭである。さらにより好ましくは、５ｍｇ／ｍＬａＰＣを用いる時のキレート化剤濃度は５００μＭから３ｍＭである。５ｍｇ／ｍＬａＰＣを用いる時のもっとも好ましいキレート化剤濃度は１ｍＭである。キレート化剤を本製剤を含む希釈剤とともに用いることにより、少なくとも室温で２４時間ａＰＣを安定化できる。

ａＰＣ製剤の好ましい充填剤は、スクロース、トレハロースおよびラフィノースである。より好ましい充填剤は、スクロースおよびラフィノースである。最も好ましい充填剤はスクロースである。製剤中の充填剤量は、重量対重量で表すと、ａＰＣ１部に対し充填剤１から１０部である。さらに製剤中の充填剤濃度は、凍結乾燥過程における重要な製剤変数である。充填剤の最適濃度は、ａＰＣ量および選択された充填剤の種類に依存する。凍結溶液中の好ましいスクロース濃度は１０から４０ｍｇ／ｍＬである。より好ましいスクロース濃度は１５から３０ｍｇ／ｍＬである。もっとも好ましい凍結溶液中のスクロース濃度は２．５ｍｇ／ｍＬのａＰＣ製剤中１５ｍｇ／ｍＬである。もっとも好ましい凍結溶液中のスクロース濃度は５．０ｍｇ／ｍＬのａＰＣ製剤中３０ｍｇ／ｍＬである。ａＰＣ製剤中に充填剤が存在することにより、化学的および生理学的安定性を増大させることができる。

凍結乾燥および再構築より前は、溶液が自然分解状態になるのをできるだけ抑えるために、ｐＨは５．５から６．５の範囲に維持するのが望ましい。製剤の好ましいｐＨは、ｐＨ約５．６からｐＨ約６．４である。より好ましくはｐＨ約５．７から約６．３である。さらにより好ましくはｐＨ約５．８から約６．２である。それよりさらに好ましくは、ｐＨ約５．９から約６．１である。もっとも好ましいｐＨはｐＨ約６．０である。

効果的なｐＨ調節を維持するために、ａＰＣ溶液は製薬的に許容される緩衝剤を含むのがよい。従って、凍結乾燥過程において、製剤は任意であるが好ましくは製薬的に許容される緩衝剤を含む。代表的な緩衝系はトリス−酢酸、クエン酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウムを含む。より好ましい緩衝系は、クエン酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウムを含む。もっとも好ましい緩衝剤はクエン酸ナトリウムである。緩衝系の好ましいモル濃度は１０ｍＭから５０ｍＭである。緩衝系のより好ましいモル濃度は１０ｍＭから２０ｍＭである。もっとも好ましいモル濃度は４０ｍＭである。当業者は本発明の製剤に他の多くの緩衝系が利用できることを認識するであろう。

凍結乾燥および再構築過程中も同様に、イオン強度を調節して溶液の状態を安定に保つ。一般にイオン強度は溶液の塩濃度によって決定する。イオン強度の創出に通常用いる製薬的に許容される塩は、塩化カリウム（ＫＣｌ）および塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含むがそれに限定されない。本発明の好ましい塩は塩化ナトリウムである。塩化ナトリウム濃度は１５０ｍＭより大きいのが好ましい。より好ましくは、凍結溶液中の塩化ナトリウム濃度は１５０ｍＭから１０００ｍＭである。ａＰＣを２．５ｍｇ／ｍＬ含む製剤において、凍結溶液中のより好ましい塩化ナトリウム濃度は１５０ｍＭから６５０ｍＭである。さらにより好ましくは、凍結溶液中の塩化ナトリウム濃度は２５０ｍＭから４５０ｍＭである。それよりさらに好ましくは、凍結溶液中の塩化ナトリウム濃度は３００ｍＭから４００ｍＭである。ａＰＣを２．５ｍｇ／ｍＬ含む製剤において、もっとも好ましい凍結溶液中の塩化ナトリウム濃度は３２５ｍＭである。

同様に、ａＰＣを５．０ｍｇ／ｍＬ含む製剤において、凍結溶液中のより好ましい塩化ナトリウム濃度は１５０ｍＭから１０００ｍＭである。さらにより好ましくは、凍結溶液中の塩化ナトリウム濃度は２５０ｍＭから７５０ｍＭである。それよりさらに好ましくは、凍結溶液中の塩化ナトリウム濃度は４００ｍＭから７００ｍＭである。ａＰＣを５．０ｍｇ／ｍＬ含む製剤において、凍結溶液中のもっとも好ましい塩化ナトリウム濃度は６５０ｍＭである。

ａＰＣ：塩：充填剤率（ｗ：ｗ：ｗ）は、製剤が凍結乾燥過程に適したものであるための重要な因子である。その率は、ａＰＣ濃度、選択した塩とその濃度、および選択した充填剤とその濃度によって様々である。特に、ａＰＣ１部に対して塩が約７から８部、充填剤が約５から７部の重量比が好ましい。より好ましいのは、ａＰＣ１部に対して塩が約７．５から約８部、充填剤が約５．５から約６．５部の重量比である。もっとも好ましいのは、ａＰＣ１部に対して塩が約７．６部、充填剤が約６部の比率である。

好ましい塩は、（ａＰＣを２．５ｍｇ／ｍＬ含む製剤において）濃度が３２５ｍＭの、および（ａＰＣを５．０ｍｇ／ｍＬ含む製剤において）濃度が６５０ｍＭの、塩化ナトリウムであり、スクロース１に対して約１．３：１の比率（ｗ：ｗ）がよい。この濃度は、凍結乾燥過程で塩の結晶化を引き起こすのに十分高い濃度であり、たいていの場合、凍結乾燥可能なａＰＣ、スクロースおよびクエン酸の非結晶混合物ができあがる。つまり、好ましい濃度である３２５ｍＭおよび６５０ｍＭのＮａＣｌのイオン強度により、凍結乾燥過程の製剤は安定化する。

本発明はまた、安定な凍結乾燥製剤を調製する方法であって、ａＰＣおよびキレート化剤、好ましくは約２．５ｍｇ／ｍＬａＰＣ、約１５ｍｇ／ｍＬスクロース、約１９ｍｇ／ｍＬＮａＣｌ、約５００μＭＥＤＴＡ二ナトリウム、およびｐＨが５．５より大きく、６．５より小さいクエン酸ナトリウム緩衝液を含む溶液剤を凍結乾燥する方法を提供する。さらに本発明は、安定な凍結乾燥製剤を調製する方法であって、約５ｍｇ／ｍＬａＰＣ、約３０ｍｇ／ｍＬスクロース、約３８ｍｇ／ｍＬＮａＣｌ、約１ｍＭＥＤＴＡ二ナトリウム、およびｐＨが５．５より大きく、６．５より小さいクエン酸ナトリウム緩衝液を含む溶液剤を凍結乾燥する方法を提供する。そのような凍結乾燥製剤は当分野で周知の方法で調製できる。

また、本発明は血管内凝固を含む疾患状態を処置する方法であって、製剤を投与する方法を提供する。

ａＰＣは、好ましくは、効果的な剤形で血流中に確実に運搬するために、適当な投与量を約１から約９６時間かけて継続注入するといった方法で非経口に投与する。投与するａＰＣ量は約０．０１ｍｇ／ｋｇ／時から約０．０５ｍｇ／ｋｇ／時である。あるいは、ａＰＣは、約５分から約３０分かけてボーラス注射により一時間あたりに適当な投与量の一部を注入し、続いて約２３時間から約４７時間適当な投与量を継続注入することにより、結果的に２４時間から４８時間で適当な投与量を投与することができる。

次の実施例は、本発明の実行方法の説明を助けるものであり、本発明の例証である。本発明の範囲は次の実施例のみであるという意味では決してない。

調製例１
ヒトプロテインＣの調製
組換えヒトプロテインＣ（ｒ−ｈＰＣ）を、Yan、米国特許4,981,952に記載されており、その教示全体が参照として本明細書に組み込まれている方法のような、当業者に周知の方法によって、ヒト腎臓２９３細胞にて調製した。ヒトプロテインＣをコードする遺伝子は、Bangら、米国特許4,775,624に記載請求されており、その教示全体は参照として本明細書に組み込まれている。２９３細胞におけるヒトプロテインＣの発現に用いられるプラスミドには、Bangら、米国特許4,992,373に記載され、その教示全体が参照として本明細書に組み込まれている、プラスミドｐＬＰＣを用いた。プラスミドｐＬＰＣの構造はまた、ヨーロッパ特許公報0 445 939、およびGrinnellら、1987、Bio/Technology 5:1189-1192に記載されており、その教示全体はまた参照として本明細書に組み込まれている。手短に説明すると、そのプラスミドを２９３細胞に移入し、それから安定な形質転換体を同定し、無血清培養液にて継代培養して育てた。発酵の後、精密濾過法により無細胞培養液を得た。

ヒトプロテインＣは、Yan、米国特許4,981,952の技術を適用して培養液から分離した。精製培養液をＥＤＴＡ二ナトリウム塩中４ｍＭに調製し、陰イオン交換樹脂(Fast-Flow Q, Pharmacia)に吸収させた。４カラム体積の２０ｍＭトリス、２００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４溶液、および２カラム体積の２０ｍＭトリス、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４溶液で洗浄した後、結合組換えヒトプロテインＣ酵素前駆体を、ｐＨ７．４の２０ｍＭトリス、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ_２溶液で溶出させた。溶出したプロテインは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって判断したところ、９５％より高い純度であった。

タンパク質をＮａＣｌ中３Ｍに調製し、次にｐＨ７．４の２０ｍＭトリス、３ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ_２溶液で平衡化した疎水性相互作用樹脂（hydrophobic interaction resin）(Toyopearl Phenyl 650 M, TosoHaas)に吸収させ、プロテインをさらに精製した。ＣａＣｌ_２を含まない２カラム体積の平衡化緩衝液で洗浄した後、組換えヒトプロテインＣをｐＨ７．４の２０ｍＭトリス溶液で溶出させた。

活性化の準備として、溶出したタンパク質から残留カルシウムを除去した。組換えヒトプロテインＣは、金属アフィニティーカラム(Chelex-100, Bio-Rad)に通してカルシウムを除去し、再度陰イオン交換体(Fast Flow Q, Pharmacia)に結合させた。これらの両カラムは直列に配置し、ｐＨ７．４の２０ｍＭトリス、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ二ナトリウム塩溶液で平衡化した。プロテインを充填させた後、カラムを連結から離す前に、Chelex-100カラムを１カラム体積の同緩衝液で洗浄した。陰イオン交換カラムを３カラム体積の平衡化緩衝液で洗浄した後、プロテインをｐＨ６．５の０．４ＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−酢酸溶液で溶出させた。組換えヒトプロテインＣのタンパク質濃度はUV 280 nm 吸光度 E0.1%=1.81で、組換え型ａＰＣ溶液のタンパク質濃度はUV 280 nm 吸光度 E0.1%=1.85でそれぞれ測定した。

調製例２
組換えヒトプロテインＣの活性化
ウシトロンビンを、５０ｍＭＨＥＰＥＳ溶液存在下、ｐＨ７．５、４℃の条件で活性化ＣＨ−セファロース４Ｂ(Pharmacia)に結合させた。この結合反応は、カラムに詰め込んでおいた樹脂上で起こり、今回は約５０００単位トロンビン／ｍＬ樹脂を用いた。トロンビン溶液をカラムを通して約３時間循環させ、２−アミノ−エタノール（ＭＥＡ）を循環溶液中０．６ｍＬ／Ｌの濃度になるまで加えた。ＭＥＡを含んだ溶液をさらに１０から１２時間循環させ、樹脂上の未反応アミンを完全にブロックした。ブロックした後、トロンビン結合樹脂をｐＨ６．５の１ＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリス溶液１０カラム体積で洗浄して非特異的に結合した全てのタンパク質を除去し、活性化緩衝液で平衡化した後に、活性化反応に用いた。

精製ｒ−ｈＰＣは、（全残留カルシウムをキレート化するために）ＥＤＴＡ二ナトリウム中５ｍＭに調製し、ｐＨ７．４の２０ｍＭトリス溶液またはｐＨ６．５の２０ｍＭトリス−酢酸溶液で２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。この物質を、５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液および、ｐＨ７．４の２０ｍＭトリス溶液もしくはｐＨ６．５の２０ｍＭトリス−酢酸溶液のいずれかを用いて３７℃で平衡化したトロンビンカラムに通した。流速は、ｒ−ｈＰＣとトロンビン樹脂が約２０分間接触しているように調節した。流出液は、回収後即座にアミド分解活性分析にかけた。その物質が、確立したａＰＣ標品と比較して特別に（アミド分解）活性を持たない場合、完全にｒ−ｈＰＣを活性化させるためにもう一度トロンビンカラムに通した。その後、次の処理段階までの間ａＰＣ濃度を低く保つため、その物質を上記のｐＨ７．４もしくはｐＨ６．５いずれかの２０ｍＭ緩衝液で１：１に希釈した。

濾過されたトロンビンをａＰＣ物質から除去するために、５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む活性化緩衝液（ｐＨ７．４の２０ｍＭトリスもしくはｐＨ６．５の２０ｍＭトリス−酢酸溶液のいずれか）で平衡化した陰イオン交換樹脂(Fast Flow Q, Pharmacia)にａＰＣを結合させた。トロンビンはこれらの環境下では陰イオン交換樹脂と相互作用せず、カラムを通ってサンプル処理流出液に流れ込む。ａＰＣを一度カラムに通してから、２から６カラム体積の２０ｍＭ平衡化緩衝液で洗浄し、溶出段階において、０．４ＭＮａＣｌ溶液を含むｐＨ６．５の５ｍＭトリス−酢酸溶液もしくはｐＨ７．４の２０ｍＭトリス溶液のいずれかを用いて、結合ａＰＣを溶出させる。ドデカペプチドをより完全に除去するために、カラムを大量体積洗浄した。このカラムから溶出した物質は、凍結溶液（−２０℃）もしくは凍結乾燥粉末のいずれかの状態で保存した。

ａＰＣの抗凝血活性は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）凝血分析において凝血時間の延長を測定することにより決定した。標準曲線は、希釈緩衝液（１ｍｇ／ｍＬ放射性免疫測定グレードウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％ＮａＮ_３）中、プロテインＣ濃度範囲１２５−１０００ｎｇ／ｍＬを測定して決定し、サンプルはいくつかの希釈度でこの濃度範囲内に調製した。それぞれのサンプルキュベットに、５０μＬの非放射性ウマ血漿および５０μＬの再構築した活性化部分トロンボプラスチン時間試薬(APTT Reagent, Sigma)を加え、３７℃で５分間インキュベートした。インキュベート後、適切なサンプルまたは標準溶液５０μＬをそれぞれのキュベットに加えた。基底凝血時間を決定するために希釈緩衝液をサンプルまたは標準溶液の代わりに用いた。フィブロメーター(CoA Screener Hemostasis Analyzer, American Labor)のタイマーは、５０μＬ３７℃ ３０ｍＭＣａＣｌ_２溶液をそれぞれのサンプルまたは標準溶液に加えた直後に開始した。サンプル中の活性化プロテインＣ濃度は標準曲線の線形回帰方程式から算出する。本明細書で報告する凝血時間は、標準曲線サンプルも含めて、３回測定の最小値の平均である。

ｒｈＡＰＣ製剤（Eli Lilly and Company製；２ｍｇ／ｍＬａＰＣ、１５．２ｍｇ／ｍＬスクロース、１２ｍｇ／ｍＬＮａＣｌおよびｐＨが５．５より大きく６．５より小さいクエン酸緩衝液）を用い、５ｍＭ、１０ｍＭおよび２０ｍＭＥＤＴＡ二ナトリウム溶液を含む、新たに調製し、濾過した０．９％塩化ナトリウム溶液(Eli Lilly and Company製)の入ったバイアル(〜1-mg/mL)で、静脈内注入溶液安定性実験を行った。０．９％塩化ナトリウム溶液(Eli Lilly and Company製)、注射用滅菌水、ＵＳＰ中に調製したｒｈＡＰＣ製剤の1-mg/mL Ｉ．Ｖ．溶液、および０．９％塩化ナトリウム溶液注射の150-mL Abbott ＰＶＣＩ．Ｖ．バッグ、ＵＳＰ中に調製したｒｈＡＰＣ製剤の1-mg/mL Ｉ．Ｖ．溶液を対照に用いた。これらの研究から生じたＣ末端軽鎖変異型（ＬＣ／ＭＳで表す）を表１Ａおよび１Ｂに示した。

表１Ａ
調製直後の０．９％塩化ナトリウム溶液、注射用滅菌水、ＵＳＰ（対照）、および５ｍＭ、１０ｍＭおよび２０ｍＭＥＤＴＡ二ナトリウム溶液を含む０．９％塩化ナトリウム溶液を含有するバイアル中、ｒｈＡＰＣ製剤の〜1-mg/mL Ｉ．Ｖ．溶液におけるＣ末端軽鎖変異型の結果

Ｎ／Ａ＝該当なしＮＤ＝検出限界２％未満

表１Ｂ
０．９％塩化ナトリウム溶液注射、ＵＳＰ（対照）の150-mL Abbott ＰＶＣＩ．Ｖ．バッグ、および５ｍＭ、１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．０４ｍＭＥＤＴＡ二ナトリウム溶液を含む０．９％塩化ナトリウム溶液中の滅菌ポリプロピレン管における、ｒｈＡＰＣ製剤の〜1-mg/mL Ｉ．Ｖ．溶液でのＣ末端軽鎖変異型の結果

Ｎ／Ａ＝該当なしＮＤ＝検出されず
検出限界２％未満

ｒｈＡＰＣ製剤（Eli Lilly and Company製；２ｍｇ／ｍＬａＰＣ、１５．２ｍｇ／ｍＬスクロース、１２ｍｇ／ｍＬＮａＣｌ、およびｐＨが５．５より大きく６．５より小さいクエン酸緩衝液）を用いて、０．９％塩化ナトリウム溶液注射、ＵＳＰ（対照）の150-mL B. Braun/McGaw PAB（登録商標）Ｉ．Ｖ．バッグにおける200-μg/mL ｒｈＡＰＣＩ．Ｖ．溶液、および２０μＭ、５０μＭおよび１００μＭのＥＤＴＡ二ナトリウム溶液をそれぞれ含む０．９％塩化ナトリウム溶液注射、ＵＳＰの150-mL B. Braun/McGaw PAB（登録商標）Ｉ．Ｖ．バッグにおける200-μg/mL ｒｈＡＰＣＩ．Ｖ．溶液の静脈注入溶液安定性実験を行った。これらの実験のｒｈＡＰＣ濃度、効力およびｐＨ測定結果を表２Ａに示す。これらの実験のＬＣ／ＭＳ結果を表２Ｂに示す。

表２Ａ
０．９％塩化ナトリウム溶液注射、ＵＳＰ（対照）の150-mL PAB（登録商標）Ｉ．Ｖ．バッグ、および２０μＭ、５０μＭおよび１００μＭのＥＤＴＡ二ナトリウム溶液を含む０．９％塩化ナトリウム溶液注射、ＵＳＰの150-mL PAB（登録商標）Ｉ．Ｖ．バッグにおけるｒｈＡＰＣ製剤の〜200-μg/mL Ｉ．Ｖ．溶液でのｒｈＡＰＣ濃度、効力およびｐＨ測定結果

Ｎ／Ａ＝該当なしＮＤ＝決定できず
*３回分析の平均値

表２Ａのつづき

Ｎ／Ａ＝該当なしＮＤ＝決定できず

表２Ｂ
０．９％塩化ナトリウム溶液注射、ＵＳＰ（対照）の150-mL PAB（登録商標）Ｉ．Ｖ．バッグ、および２０μＭ、５０μＭおよび１００μＭのＥＤＴＡ二ナトリウム溶液を含む０．９％塩化ナトリウム溶液注射、ＵＳＰの150-mL PAB（登録商標）Ｉ．Ｖ．バッグにおけるｒｈＡＰＣ製剤の〜200-μg/mL Ｉ．Ｖ．溶液でのＣ末端軽鎖変位型の結果

Ｎ／Ａ＝該当なしＮＤ＝決定できず
検出限界２％未満

安定な凍結乾燥製剤は、２．５ｍｇ／ｍＬａＰＣ、１５ｍｇ／ｍＬスクロース、１９ｍｇ／ｍＬＮａＣｌ、５００μＭＥＤＴＡ二ナトリウムおよびｐＨが５．５より大きく６．５より小さいクエン酸ナトリウム緩衝液を含む凍結乾燥用溶液によって調製する。また、安定な凍結乾燥製剤は５ｍｇ／ｍＬａＰＣ、３０ｍｇ／ｍＬスクロース、３８ｍｇ／ｍＬＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ二ナトリウムおよびｐＨが５．５より大きく６．５より小さいクエン酸緩衝液を含む凍結乾燥用溶液によって調製する。

安定な凍結乾燥製剤は、２．５ｍｇ／ｍＬａＰＣ、１５ｍｇ／ｍＬスクロース、１９ｍｇ／ｍＬＮａＣｌおよびｐＨが５．５より大きく６．５より小さいクエン酸ナトリウム緩衝液を含む凍結乾燥用溶液によって調製する。また、安定な凍結乾燥製剤は５ｍｇ／ｍＬａＰＣ、３０ｍｇ／ｍＬスクロース、３８ｍｇ／ｍＬＮａＣｌおよびｐＨが５．５より大きく６．５より小さいクエン酸緩衝液を含む凍結乾燥用溶液によって調製する。凍結乾燥および再構築より前は、ｐＨは５．５から６．５の範囲に維持する。凍結乾燥製剤を再構築する際、再構築希釈剤は、再構築後の溶液が１００μＭＥＤＴＡ二ナトリウム溶液になるために十分な量のＥＤＴＡ二ナトリウムを含む。もしくは、再構築した製剤を、静脈注入溶液のような患者への投与に適した希釈剤であって、注入溶液が１００μＭＥＤＴＡ二ナトリウム溶液になるために十分な量のＥＤＴＡ二ナトリウムを含む希釈剤に加える。

【配列表】

Claims

活性化プロテインＣおよびキレート化剤を含む医薬組成物。
凍結乾燥製剤である、請求項１記載の組成物。
充填剤をさらに含む、請求項２記載の組成物。
充填剤がマンニトール、トレハロース、ラフィノース、スクロース、およびそれらの混合物から選択される、請求項３記載の組成物。
トリス−酢酸、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびそれらの組み合わせから選択される緩衝液をさらに含む、請求項４記載の組成物。
再構築すると製剤のｐＨが約５．５から約６．５となる緩衝液をさらに含む、請求項５記載の組成物。
塩を含む請求項６記載の組成物。
塩が塩化カリウムまたは塩化ナトリウムから選択される、請求項７記載の組成物。
活性化プロテインＣ、希釈剤およびキレート化剤を含む医薬組成物。
凍結乾燥製剤である、請求項９記載の組成物。
希釈剤が再構築希釈剤である請求項９記載の組成物。
希釈剤が静脈内注入溶液剤である、請求項９記載の組成物。
キレート化剤が希釈剤中に存在する、請求項９記載の組成物。
充填剤をさらに含む請求項１０記載の組成物。
充填剤がマンニトール、トレハロース、ラフィノース、スクロース、およびそれらの混合物から選択される、請求項１１記載の組成物。
トリス−酢酸、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびそれらの組み合わせから選択される緩衝剤をさらに含む、請求項１２記載の組成物。
再構築すると製剤のｐＨが約５．５から約６．５となるような緩衝剤をさらに含む、請求項１３記載の組成物。
塩を含む請求項１４記載の組成物。
塩が塩化カリウムまたは塩化ナトリウムから選択される、請求項１５記載の組成物。
ａＰＣ凍結乾燥製剤を調製する方法であって、活性化プロテインＣおよびキレート化剤を含む医薬製剤を凍結乾燥する方法。
ａＰＣ凍結乾燥製剤を調製する方法であって、活性化プロテインＣ、充填剤およびキレート化剤を含む医薬製剤を凍結乾燥する方法。
ａＰＣ医薬溶液剤を調製する方法であって、活性化プロテインＣを含む凍結乾燥製剤をキレート化剤を含有する希釈剤により再構築する方法。
ａＰＣ医薬溶液剤を調製する方法であって、活性化プロテインＣおよび充填剤を含む凍結乾燥製剤をキレート化剤を含有する希釈剤により再構築する方法。
処置が必要な患者の処置方法であって、請求項１から１９のいずれか記載の医薬組成物を該患者へ投与する方法。
血栓性疾患の処置を含む、請求項１から１９のいずれか記載の医薬組成物の使用。