DE69333727T2

DE69333727T2 - Protein-C-Derivat

Info

Publication number: DE69333727T2
Application number: DE69333727T
Authority: DE
Inventors: Bruce Edward Indianapolis Gerlitz; Brian William Indianapolis Grinnell
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1992-05-21
Filing date: 1993-05-19
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2013-05-20
Also published as: HU9301461D0; AU3869993A; NO931840L; US5453373A; EP0575054A2; EP0575054B1; KR930023370A; NO931840D0; CA2096604C; IL105757A0; NO311299B1; KR100291529B1; CZ94893A3; CN1080658A; DE69333727D1; HU218408B; FI932282A; CZ286016B6; AU661901B2; MX9302917A

Description

Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Humanmedizin, insbesondere der Behandlung von Blutgerinnungsstörungen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Derivat des Humanprotein C Moleküls, Verfahren der Verwendung dieses Derivats und pharmazeutische Zusammensetzungen, die dieses Protein C Derivat umfassen.
Protein C ist ein Vitamin K abhängiges Plasmaprotein, das hauptsächlich als ein inaktives Disulfid gebundenes Heterodimer zirkuliert, das aus einer leichten Kette von etwa 25 Kilodalton und einer schweren Kette von etwa 41 Kilodalton besteht. Die schwere Kette enthält die Serinproteasedomäne mit ihrem N-terminalen Aktivierungspeptid, während die leichte Kette die Region der gamma-Carboxyglutaminsäurereste enthält, die benötigt wird für die von Calcium abhängige Membranbindungs- und -funktionsaktivität. Das inaktive Humanprotein C-Zymogen wird in aktiviertes Protein C überführt durch die Wirkung des Thrombin/Thrombomodulin-Komplexes, der das Aktivierungspeptid (Reste 158 bis 169 des zirkulierenden Zymogens oder der Reste 200 bis 211 des Prä- oder Preprozymogens) spaltet, um aktiviertes Protein C zu bilden.
Die Rolle von Protein C als therapeutisches Mittel wird weithin anerkannt (s. z. B. Bang et al., US Patent mit der Nr. US 4 775 624 , das die DNS- oder DNA-Sequenz offenbart, die das Humanprotein C Zymogen kodiert und Bang et al., US Patent mit der Nr. US 4 992 373 , das ein Verfahren offenbart zur Herstellung von aktiviertem Humanprotein C). Ein Humanprotein C-Derivat, das als FLIN bezeichnet wird, wurde von Gerlitz et al. offenbart in dem europäischen Patent EP 0 443 975 . Dieses FLIN-Derivat enthält einen Phe-Rest anstelle eines Asp-Rests an der Position 167 des Aktivierungspeptids (Position 206 des Preprozymogens) und einen Asn-Rest anstelle eines Asp-Rests an der Position 172 innerhalb der schweren Kette (Position 214 des Preprozymogens). Das FLIN-Derivat wird leichter aktiviert durch Thrombin als das Humanprotein C-Zymogen vom Wildtyp. Andere Humanprotein C-Derivate, die als Q313 und Q329 bezeichnet werden, wurden offenbart von Gerlitz et al. in der europäischen Patentanmeldung EP 0 443 874 . Das Q313 Derivat enthält einen Gln-Rest anstelle eines Asn-Rests an der Position 313 von dem Wildtypzymogen, während das Q329 Derivat einen Gln-Rest enthält anstelle eines Asn-Rests an der Position 329 von dem Wildtypzymogen. Diesen Q313- und Q329-Derivaten fehlen die Kohlenhydratstrukturen, die normalerweise in Verbindung stehen mit dem Asn-Rest an diesen Stellen auf dem Wildtypmolekül und daher erhöhte amidolytische und funktionelle Aktivitäten zeigen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Derivat des Humanprotein C, das modifiziert ist durch Veränderung der Aminosäure 313 von dem nativen Humanprotein C-Molekül von Asparagin zu Glutamin und durch Veränderung der Aminosäure 167 von dem nativen Humanprotein C-Molekül von Asparaginsäure in Phenylalanin und durch Veränderung der Aminosäure 172 von dem nativen Humanprotein C-Molekül von Asparaginsäure in Asparagin. Das Humanprotein C-Derivat wird leichter aktiviert durch Thrombin und ist auch funktionell aktiver als das Wildtyphumanprotein C-Molekül oder ein anderes Humanprotein C-Derivat.
Ebenso offenbart und beansprucht werden rekombinante DNS oder DNA-Konstruktionen, Vektoren und Transformanten, die brauchbar sind bei der Herstellung des neuen Humanprotein C-Derivats. Ferner werden pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge des Humanprotein C-Derivats der Erfindung in Kombination mit ein oder mehr pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoffen ent halten, offenbart und beansprucht sowie Verfahren der Verwendung dieses Derivats bei der Behandlung und Vorbeugung oder Prävention von Krankheitszuständen.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, wie sie offenbart und in dieser Beschreibung beansprucht ist, sind die folgenden Begriffe und Abkürzungen wie unten definiert.
Q313 – ein Humanprotein C-Derivat, worin der Asparaginrest an der Position 313 von dem nativen Humanprotein C-Molekül ausgetauscht worden ist gegen einen Glutaminrest. Das Protein C-Derivat Q313 ist offenbart in Gerlitz et al., europäische Patentanmeldung mit der Anmeldenummer 91 301 446.0 und Grinnell et al., 1991, J. Biol. Chem. 226: 9778 bis 9785.
F167 – ein Humanprotein C-Derivat, worin der Asparaginsäurerest an der Position 167 des nativen Humanprotein C-Moleküls ausgetauscht worden ist gegen Phenylalanin. Das Protein C-Derivat F167 wird offenbart in Bang et al., europäisches Patent EP 0 323 149 und Ehrlich et al., 1990, EMBO J. 9: 2367 bis 2373.
LIN – ein Humanprotein C-Derivat, worin der Asparaginsäurerest an der Position 172 des nativen Humanprotein C-Moleküls ausgetauscht worden ist gegen einen Asparaginrest.
FLIN – ein Humanprotein C-Derivat, worin der Asparaginsäurerest an der Position 167 des nativen Humaprotein C-Moleküls ausgetauscht worden ist gegen einen Phenylalaninrest, und der Asparaginsäurerest an der Position 172 des nativen Protein C-Moleküls ausgetauscht worden ist gegen einen Asparaginrest. Die Protein C-Derivate LIN und FLIN werden offenbart in Gerlitz et al., europäische Patentanmeldung EP 0 443 875 und Grinnell et al., in Protein C and Related Anticoagulants (Herausgeber D. Bruley und W. Drohan) 13 bis 46 (Gulf Publishing Co., Houston, 1990).
FLIN-Q3131 – ein Humanprotein C-Derivat, worin der Asparaginsäurerest an der Position 167 des nativen Humanproteins C-Moleküls ausgetauscht worden ist gegen einen Phenylalaninrest, der Asparaginsäurerest an der Position 172 des nativen Protein C-Moleküls ausgetauscht worden ist gegen einen Asparaginrest, und der Asparaginrest an der Position 313 des nativen Protein C-Moleküls ausgetauscht worden ist gegen einen Glutaminrest.
GBMT Transkriptionseinheit – eine modifizierte Transkriptionskontroll- oder steuerungseinheit, umfassend den P2 Enhancer des BK Virus, nahe beabstandet zu dem stromaufwärts Regulationselement von dem Adenovirus „major late promoter" (starker später Promotor) (MLTF), dem Adenovirus-2 major late promoter, einem Poly-GT-Element, das angeordnet ist, um den Promoter zu stimulieren und eine DNS- oder DNA-Sequenz, die die gespaltene Dreiteilige Leader-Sequenz oder Anführungssequenz von Adenovirus enthält.
Im Entstehen begriffenes oder aufkeimendes Protein – das Polypeptid, das erzeugt wird bei der Translation von einem mRNS- oder mRNA-Transkripts, vor einer beliebigen posttranslationalen Modifizierung. Jedoch können posttranslationale Modifizierungen, wie eine gamma-Carboxylierung von Glutaminsäureresten und Hydroxylierung von Asparaginsäureresten beginnen, stattzufinden, bevor ein Protein vollständig übersetzt oder aus einer Translation aus einem mRNS- oder mRNA-Transkript hervorgegangen ist.
Protein C-Aktivität – eine beliebige Eigenschaft von Humanprotein C, die verantwortlich ist für proteolytische, amidolytische, esterolytische und biologische (gerinnungshemmende oder profibrinolytische) Aktivitäten. Verfahren zum Testen der gerinnungshemmenden Protein-Aktivität sind in der Technik bekannt, d. h. s. z. B. Grinnel et al., 1987, Bio/Technology 5: 1189 bis 1192.
Zymogen – ein enzymatisch inaktiver Vorläufer eines proteolytischen Enzyms. Protein C-Zymogen, wie es in dieser Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf sekretierte, inaktive Formen, ob einkettig oder zweikettig, von Protein C.
Alle Aminosäurenabkürzungen, die in dieser Offenbarung verwendet werden, sind solche, die vom Patent- und Markenamt der Vereinigten Staaten (United States Patent and Tradmark Office) akzeptiert werden, wie es festgeschrieben ist in 37 C. F. R. § 1.822 (b) (2) (1990).
Die vorliegende Erfindung stellt ein Protein C-Derivat bereit, das veränderte Glykosylierungsmuster aufweist und das auch veränderte Aktivierungsregionen oder -bereiche aufweist. Insbesondere steht dieses Derivat für FLIN-Q313. Das Derivat FLIN-Q313 enthält einen Phenylalaninrest an Position 167 des Moleküls und einen Asparaginrest an der Position 172 des Moleküls (anstelle oder eher als den Asparaginsäurerest, der normalerweise in diesen Positionen gefunden wird sowie einen Glutaminrest an der Position 313 (anstelle oder eher als den Asparaginrest, der normalerweise an dieser Position gefunden wird).
Das Derivat FLIN-Q313 zeigt außergewöhnlich hohe Raten der Aktivierung durch Thrombin alleine. Außerdem kann das Derivat FLIN-Q313 anders als das Humanprotein C vom Wildtyp durch Thrombin, das bei der Gerinnung in Humanplasma erzeugt wird, aktiviert werden, was zu einer Inhibierung oder Hemmung einer weiteren Gerinnungsbildung führt. Dieses gerinnungsaktivierte Proenzym weist eine beträchtlich größere spezifische Aktivität und längere Halbwertszeit auf als die aktivierte Form von natürlichem Protein C. Das Derivat der vorliegenden Erfindung kann daher als ein ortsaktiviertes antithrombotisches Mittel oder gerinnungshemmendes Mittel verwendet werden, das keine gerinnungshemmende Aktivität aufweist außer in Gegenwart von beträchtlicher Thrombinbildung.
Die Erfindung stellt auch eine DNA- oder DNS-Verbindung bereit zur Verwendung bei der Herstellung des Protein C-Derivats. Diese DNS-Verbindung umfasst die Kodierungssequenz für die leichte Kette von Humanprotein C, das unmittelbar benachbart dazu angeordnet ist stromabwärts und im Translationsleserahmen mit der Prepropeptidsequenz von einem Wildtypzymogenprotein C. Die DNS-Sequenzen kodieren auch das Lys-Arg Dipeptid, das verarbeitet wird während der Reifung oder Maturation des Protein C-Moleküls, des Aktivierungspeptids und der schweren Kette des Protein C-Moleküls. Die Veränderungen in den Aminosäureresten an den Positionen 167, 172 und 313 verändern die Aktivierung des Moleküls, während die Veränderung in dem Aminosäurerest an der Position 313 den Kohlenhydratgehalt des Moleküls verändert.
Die Leute vom Fach werden erkennen, dass aufgrund der Degeneration oder Entartung des genetischen Kodes eine Vielzahl von DNS-Verbindungen die oben beschriebenen Polypeptide kodieren kann. Bang et al., US Patent mit der Nummer US 4 775 624 offenbart und beansprucht die DNA- oder DNS-Sequenz, die die Wildtypform des Humanprotein C-Moleküls kodiert. Da der Fachmann leicht bestimmen kann, welche Veränderungen in der DNS-Sequenz verwendet werden können, um die anderen DNS-Sequenzen zu konstruieren, die exakt die Polypeptide, wie sie in dieser Beschreibung offenbart sind, kodieren, ist die Erfindung nicht auf die spezielle DNS-Sequenz, die durch Hinterlegung offenbart ist, beschränkt. Demzufolge sind die unten und in den beigefügten Beispielen beschriebenen Konstrukti onen für die bevorzugten DNS-Verbindungen, Vektoren und Transformanten der Erfindung nur zur Veranschaulichung gedacht und beschränken den Schutzbereich der Erfindung nicht. Außerdem ist die Substitution von Gln anstelle von Asn an der Position 313 nur zur Veranschaulichung gedacht und beschränkt den Schutzbereich der Erfindung nicht, da andere Substitutionen, mit der Ausnahme von Cys oder Pro, verwendet werden können.
Die DNS-Verbindung der vorliegenden Erfindung wurde hergestellt durch ortsgerichtete Mutagenese des Humanprotein C-Gens. Das mutagenisierte Zymogen, das das Molekül kodiert, wurde dann in einen eukaryotischen Expressionsvektor insertiert, so dass die Expression des Zymogens betrieben werden kann durch die GBMT Transkriptionseinheit. Dieser Vektor wurde transformiert in Escherichia coli K12 AG1 Zellen und hinterlegt und zum Bestandteil gemacht der permanenten Stammkultursammlung der Northern Regional Research Laboratories in Peoria, Illinois 61604 am 14. Januar 1992. Die spezielle Kultur und Hinterlegungsnummer werden gefunden in der Tabelle I. Tabelle I

Kultur Hinterlegungsnummer

E. coli K12 AG1/pGT-h-FLIN-Q313 NRRL B-18939
Die Kultur wird erhalten, und das Plasmid wird isoliert unter Verwendung herkömmlicher Techniken, und kann dann direkt transfiziert oder eingeschleust werden in eukaryotische Wirtszellen für die Herstellung des Derivats von Humanprotein C. Es ist bevorzugt, das Plasmid in Wirtszellen zu transfizieren, die das Adenovirus E1A sehr frühe (immediate-early) Genprodukt erzeugen, dadurch dass der BK Enhancer, der in den GBMT-Transkriptionskontrolleinheitsfunktionen gefunden wird, wirkt, um die Expression, die am wirksamsten in der Gegenwart von E1A ist, zu steigern. Die GBMT-Transkriptionskontrolleinheit ist vollständiger beschrieben in Berg et al., europäische Patentanmeldung EP 0 445 939 . Leute vom Fach erkennen, dass eine Anzahl von Wirtszellen ein sehr frühes Genprodukt von einem großen DNS Virus exprimieren oder dazu gebracht werden können, es zu exprimieren. Die am meisten bevorzugte Zelllinie zur Expression des Humanprotein C-Derivats der vorliegenden Erfindung ist die Menschennieren 293 Zelllinie, die offenbart wird in Bang et al., US Patent mit der Nr. 4 992 373. Nach der Expression in der Zelllinie wird das Derivat gereinigt aus dem Zellkulturüberstand unter Verwendung des Verfahrens von Yan, US Patent mit der Nr. US 4 981 952 .
Die DNA- oder DNS-Sequenz der Erfindung kann chemisch synthetisiert werden oder durch die Kombination von Restriktionsfragmenten oder durch Kombination von Techniken, die in der Technik bekannt sind. DNS-Synthesemaschinen sind verfügbar und können verwendet werden, um die DNS-Verbindungen der vorliegenden Erfindung zu konstruieren.
Der zur Veranschaulichung dienende Vektor der Erfindung umfasst die GBMT-Transkriptionseinheit, die in der Lage ist, die Transkription der Kodierungssequenzen durch den Adenovirus „late" (spät) Promoter" zu stimulieren. Die Leute vom Fach erkennen, dass eine große Anzahl von eukaryotischen Promotern, Enhancern und Expressionsvektoren im Stand der Technik bekannt sind und verwendet werden können, um die DNS Sequenzen zu exprimieren, um die Protein C-Derivate der vorliegenden Erfindung herzustellen. Die Leute vom Fach erkennen auch, dass ein eukaryotischer Expressionsvektor funk tionieren kann ohne ein Enhancer-Element. Ein Schlüsselgesichtspunkt der vorliegenden Erfindung liegt nicht in dem speziellen oder besonderen Enhancer oder Promoter, der verwendet wird, um die Derivate zu exprimieren, sondern vielmehr in der neuen DNS Sequenz und im entsprechenden Protein, das aus der Sequenz hergestellt wird.
Der Vektor der vorliegenden Erfindung kann transformiert werden und exprimiert werden in einer großen Verschiedenheit von eukaryotischen Wirtszellen, insbesondere Säugerwirtszellen. Der Vektor, der bei der NRRL hinterlegt ist, enthält das Hygromycinresistenz verleihende Gen. Jedoch Vektoren, die keinen selektierbaren Marker enthalten, können leicht konstruiert werden und können verwendet werden, um Übergangsessays durchzuführen oder können mit oder co-transformiert werden in Zelllinien zusammen mit anderen Vektoren, die selektierbare Marker enthalten. Der Vektor der Erfindung kann auch Sequenzen umfassen, die eine Replikation in E. coli erlauben, da es in der Regel effizienter ist, Plasmid DNS eher in E. coli herzustellen, als in anderen Wirtsorganismen.
Viele Veränderungen und Variationen der vorliegenden zur Veranschaulichung dienenden DNS Sequenzen und Plasmide sind möglich. Zum Beispiel erlaubt die Degeneration des genetischen Kodes die Substitution der Nukleotide in den Polypeptidkodierungsregionen, sowie in dem Translationsstoppsignal, ohne Veränderung der kodierten Polypeptidsequenz. Solche ersetzbaren oder austauschbaren Sequenzen können abgeleitet werden aus der bekannten Aminosäure- oder DNS Sequenz von Humanprotein C und können konstruiert werden durch Anwendung folgender herkömmlicher Synthese- oder ortsgerichteter Mutageneseverfahren. Synthetische Verfahren können ausgeführt werden im Wesentlichen gemäß den Verfahren von Itakura et al., 1977 Science 198: 1056 und Crea et al. 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 5765. Daher ist die vorliegende Erfindung keineswegs beschränkt auf die DNS Sequenz und das Plasmid, das speziell als Beispiel aufgeführt ist.
Verfahren zur Aktivierung von Zymogenformen von Humanprotein C zu aktivierten Humanprotein C-Derivaten sind alt und im Stand der Technik gut bekannt. Protein C kann aktiviert werden durch Thrombin allein, durch einen Thrombin/Thrombomodulin-Komplex, von Russell's Vipergift oder durch eine Vielzahl von anderen Mitteln. Die Aktivität von Humanprotein C-Derivaten kann gemessen werden unter Anwendung oder Befolgung der Thrombinaktivierung entweder durch gesamtamidolytische Assays oder Tests oder durch Antikoagulations- oder Gerinnungsassays. Die Thrombinaktivierung und Protein C-Assays (amidolytisch und gerinnungshemmend) werden durchgeführt gemäß der Lehre von Grinnell et al., 1987, Bio/Technology 5: 1187 bis 1192.
Das rekombinante Humanprotein C-Derivat der vorliegenden Erfindung ist brauchbar bei der Vermeidung oder Prävention und Behandlung von einer Vielzahl von erworbenen Krankheitszuständen, bei denen intravaskuläre Koagulation eine Rolle spielt, einschließlich einer tiefen Venenthrombose, Lungenembolie, periphären Arterienthrombose, einer Embolie, die dem Herz oder periphären Arterien entspringt, akutem Myocardinfarkt, thrombotischen Schlägen, instabiler Angina, periphären vaskulären Operation, Organtransplantation und disseminierte intravaskuläre Koagulation. Dieses Protein C-Derivat kann auch wirkungsvoll verwendet werden bei der Behandlung der beträchtlichen Anzahl von Patienten mit heterozygoten Protein C-Mängeln, die wieder auftretende tiefe Venenthrombose darstellen und im Fall Patienten mit homozygotem Protein C-Mangel mit Purpura fulminans. Eine noch weitere therapeutische Indikation der aktivierten Protein C-Derivate ist die Vermeidung einer tiefen Venenthrombose und Lungenembolie, die zur Zeit behandelt wird mit geringen Dosen von Heparin.
Das Derivat und das aktivierte Gegenstück der vorliegenden Erfindung kann formuliert werden gemäß den bekannten Verfahren, um pharmazeutische brauchbare Zusammensetzungen herzustellen, wobei das Humanprotein C-Derivat oder aktivierte Protein C-Derivate der vorliegenden Erfindung kombiniert wird in einer Beimischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägervehikel. Geeignete Trägervehikel und ihre Formulierung, einschließlich anderer Humanproteine, z. B. Humanserumalbumin, sind z. B. beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausgabe, 1980, Mack Publishing Co., herausgegeben von Osol et al. Solche Zusammensetzungen enthalten eine wirksame Menge des Protein C-Derivats oder aktivierten Gegenstücks zusammen mit einer geeigneten Menge eines Trägervehikels, um pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzungen bereitzustellen, die geeignet sind für die wirksame Verabreichung an den Wirt oder Patienten. Die Protein C-Derivatzusammensetzung kann parenteral verabreicht werden oder durch andere Verfahren, die eine Lieferung oder Versorgung des Blutstroms in einer wirksamen Form gewährleisten.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt als Mittel zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung und sollten nicht als eine Beschränkung daraufhin ausgelegt werden.
Beispiel 1
Herstellung von Humanprotein C-Derivaten
Der Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung wird isoliert aus E. coli Zellen, dann transformiert in Menschennieren 293 Zellen, die Transformanten werden ausgewählt bei 37°C, dann kultiviert, um das Humanprotein C-Derivat herzustellen, im Wesentlichen gemäß der Lehre von Bang et al., US Patent mit der Nr. US 4 992 373 . Das Derivat wird aus dem Zellkulturüberstand gereinigt im Wesentlichen gemäß der Lehre von Yan, US Patent mit der Nr. US 4 981 952 .
Beispiel 2
Antikoagulations- oder gerinnungshemmende Aktivitäten
Vollständig aktiviertes Protein C wurde erhalten durch Aktivierung des Materials mit 10 nM Thrombin im Komplex mit löslichem rekombinanten Humanthrombomodulin TMD-75, wie beschrieben von Parkinson et al, 1990, J. Biol. Chem. 265: 12602 bis 12610. Die gerinnungshemmende Aktivität des aktivierten Moleküls wurde gemessen mit einem aktivierten Teilthromboplastinzeitgerinnungsassay. Die Ergebnisse sind gezeigt in der Tabelle II.
Tabelle II
Beispiel 3
Aktivierungsraten
Die Aktivierungsraten wurden bestimmt unter Verwendung von humanem Thrombin (10 nM) in einer Reaktionsmischung, die 20 mM Tris, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,1 mg/ml BSA und 3 mM CaCl₂ enthielt. Gereinigtes Protein C, sowohl Wildtyp als auch Derivat, wurden bei einer Konzentration von 0,81 bis 1,61 μM in der Aktivierungsreaktion verwendet. Die Aktivierungsraten wurden bestimmt durch Entfernung von Aliquoten aus dem Aktivierungsreaktionsgemisch bei verschiedenen Zeitpunkten in eine Platte mit 96 Vertiefungen und nachfolgend durch die Zugabe von dem chromogenen Substrat (S-2366) bis zu einer Konzentration von 0,75 mM. Die amidolytische Aktivität wurde gemessen als die Veränderung in den Absorptionseinheiten/Minute bei 405 nM in einem ThermoMax kinetischen Mikrotiterplattenleser (Molecular Devices). Die Raten wurden bestimmt durch Konvertierung der Veränderung in OD/Minute in die Menge an erzeugtem aktivierten Protein C unter Verwendung der speziellen Aktivitäten, die für jedes Protein bestimmt wurden und durch Auftragung gegenüber der Aktivierungszeit. Die Menge an aktiviertem Protein C, das erzeugt wurde, war geringer als 10% von dem gesamten Ausgangsmaterial in allen Experimenten. Die Ergebnisse sind in der Tabelle III gezeigt.
Tabelle III
Relative Aktivierungsraten wurden auch bestimmt mit dem selben Assay- oder Testsystem unter Verwendung von Thrombin und Thrombomodulin. Das Thrombomodulinmolekül, das verwendet wurde, war das lösliche Humanthrombomodulin von Parkinson et al., siehe oben. Die Ergebnisse sind gezeigt in der Tabelle IV. Tabelle IV

Protein C Relative Raten der Aktivierung durch Thrombin und Thrombomodulin

Wildtyp 1

Q313 2,6 +/– 0,6

LIN 2,1 +/– 0,2

F167 3,5 +/– 0,8

FLIN 2,7

FLIN-Q313 9,2 +/– 1,0
Beispiel 4
Gerinnungshemmende Aktivität bei der Gerinnung von Humanplasma
Humanprotein C vom Wildtyp und das Derivat FLIN-Q313 wurde zu Humanplasma gegeben bei einer Konzentration von 20 nM zusammen mit einem Helena Standard APTT Reagens und 5 min lang bei 37°C inkubiert. Die Gerinnung des Plasmas wurde gestartet durch die Zugabe von CaCl₂ bis zu einer Endkonzentration von 8 mM, und die Gerinnungszeiten wurden gemessen. In gleichlaufenden Experimenten wurde monoklonaler Antikörper, der in der Lage ist, die aktivierte Protein C-Aktivität zu neutralisieren, zugegeben, um das Plasma und das Plasma, das das Zymogen Wildtyp Protein C oder FLIN-Q313 enthielt, zu kontrollieren oder steuern. Die Ergebnisse sind in der Tabelle V gezeigt.
Tabelle V
Die Konzentrationen oder Werte der Gerinnungsaktivität, die induziert wurden in dem gerinnenden Plasma, wurden bestimmt als eine Funktion der Konzentration von dem Wildtyp Humanprotein C und dem FLIN-Q313 Derivat, und die Daten wurden ausgedrückt als die Verlängerung der Gerinnungszeit. Die Grundgerinnungszeiten in dem Assay betrugen von 27 bis 33 Sekunden. Die Ergebnisse sind in der Tabelle VI gezeigt.
Tabelle VI
Beispiel 5
Bestimmung der relativen Halbwertszeiten
Die Inhibierung oder Hemmung von Humanprotein C in Plasma wurde bestimmt durch Inkubation von normalem Humanplasma (citriert) mit 100 nM aktiviertem Humanprotein C, aktiviertem FLIN-Q313 oder Zymogen (nicht aktiviert) FLIN-Q313. Die Plasmakonzentration betrug 90% (v/v) in der Endreaktion, wobei das verbleibende Volumen bestand aus Puffer, der 3 mM CaCl₂, 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7,4 und 1 mg/ml BSA enthielt. Zu ausgewählten Zeitpunkten wurden Aliquote entfernt, und die Aktivität des aktivierten Protein C wurde bestimmt durch amidolytische Aktivität unter Verwendung von S-2366 bei einer Endkonzentration von 1 mM oder durch die aktivierte Teilthromboplastinzeit. Die Werte der durch Gerinnung oder ein Gerinnsel aktivierten Aktivität von FLIN-Q313 wurde bestimmt wie beschrieben in Beispiel 4. Aktiviertes Protein C und aktiviertes FLIN-Q313 zeigten beide einen mehr als 50% Verlust in der Aktivität nach etwa 25 min, wohingegen Zymogen FLIN-Q313 noch mindestens 80% Aktivität nach 45 min beibehielt.

Claims

Humanprotein C-Derivat, wobei das Derivat D167F:D172N:N313Q ist.
Rekombinantes DNS Molekül, das ein Humanprotein C-Derivat nach Anspruch 1 kodiert.
Das rekombinante DNS Molekül nach Anspruch 2, das ein Plasmid ist.
Das rekombinante DNS Molekül nach Anspruch 3, wobei das Plasmid für das Plasmid pGT-h-D167F:D172N:N313Q (NRRL B-18939) steht.
Wirtszelle, die transformiert ist mit einem rekombinanten DNS Plasmid nach Anspruch 3 oder Anspruch 4.
Die Wirtszelle nach Anspruch 5, die ausgewählt ist aus einer Menschennieren 293 Zelle und einer E. coli Zelle.
Die Wirtszelle nach Anspruch 6, die Menschennieren 293/pGT-h-D167F:D172N:N313Q und E. coli K12 AG1/pGT-h-D167F:D172N:N313Q (NRRL B-18939) ist.
Pharmazeutische Formulierung, umfassend als wirksamen Inhaltsstoff ein Protein C-Derivat, worin das Derivat für D167F:D172N:N313Q steht, assoziiert mit ein oder mehr pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Hilfsstoffen oder Verdünnungsmitteln dafür.
Protein C-Derivat nach Anspruch 1 zur Verwendung als Arzneimittel.
Protein C-Derivat nach Anspruch 9 zur Verwendung als ein antithrombotisches Mittel.
Verwendung eines Protein C-Derivats nach Anspruch 1, bei der Herstellung eines antithrombotischen Mittels.
Verfahren zur Herstellung eines Humanprotein C-Derivats, wobei das Derivat für D167F:D172N:N313Q steht, wobei das Verfahren umfasst a) Transformieren oder Transfizieren einer eukaryotischen Wirtszelle mit einem rekombinanten DNS-Vektor, wobei der Vektor umfasst eine DNS-Sequenz, die das Humanprotein C-Derivat kodiert, b) Kultivierung der transfizierten eukaryotischen Wirtszellen unter Bedingungen, die geeignet sind für die Herstellung des Humanprotein C-Derivats, dann c) Wiedergewinnung des Humanprotein C-Derivats aus dem Überstand der Kultur.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die eukaryotische Wirtszelle für eine Menschennieren 293 Zelle steht.