AT404357B - Prothrombin-derivate - Google Patents

Description

AT 404 357 B

Die Erfindung betrifft neue Prothrombinmutante oder Derivate davon, die als Antagonisten ihrer natürlichen Funktion eingesetzt werden können.

Der Mechanismus der Blutkoagulation erfolgt normalerweise in einer Kaskade von zwei möglichen Wegen. Eine der Routen, die sogenannte extrinsische Blutgerinnung, beginnt mit der Freisetzung von Thromboplastin und Aktivierung von Faktor VII. Aktivierter Faktor VII wiederum aktiviert Faktor X, gefolgt von einer Aktivierung von Faktor V und Faktor II (Prothrombin). Faktor Ha (Thrombin) wandelt Fibrinogen zu Fibrin am Ende der Kaskade um.

Die andere Route, die sogenannte intrinsische Blutgerinnung, erfolgt über eine Aktivierung von Faktor XII durch Kontakt und anschließender Aktivierung von Faktor XI Faktor IX und Faktor X in Anwesenheit von Calcium und Faktor VIII, gefolgt von einer Aktivierung von Faktor II zu Faktor lla, der die Koagulation durch Spaltung von Fibrinogen zu Fibrin auslöst. Faktor lla spielt daher in beiden Routen der Blutgerinnungskaskade eine zentrale Rolle. Bisher wurde intensiv nach Antikoagulantien geforscht, die insbesondere bei der Behandlung von septischem Schock, bei Thrombosen, Embolien, Arteriosklerose und bei Herzinfarkten, ferner bei Bluttransfusionen oder nach Operationen eingesetzt werden können. Eine Methode zur Unterdrückung der Blutgerinnung ist die direkte Verabreichung von Substanzen, die Thrombin inhibieren.

Bisher wurden als Antikoagulantien Heparin oder Coumarin eingesetzt. Diese sind allerdings relativ systemisch und erhöhen das Risiko für innere Blutungen. Hirudin hingegen ist extrem spezifisch in seiner Bindung an Thrombin und bietet gegenüber den anderen Antikoagulantien noch weiter Vorteile. Es braucht keine endogenen Kofaktoren, ist pharmakodynamisch inert, zeigt keinerlei Wirkung auf Blutzellen, Plasmaproteine (mit Ausnahme von Thrombin) oder Enzyme, und ist auf Grund seiner kleinen Molekülgröße nicht immunogen. Weiters lagert sich Hirudin nicht in Organe ein und wird unverändert im Harn ausgeschieden.

Hirudin ist ein einkettiges Polypeptid aus 65 Aminosäuren, das natürlicherweise durch den medizinischen Blutegel (Hirudo medicinalis) in dessen sekretorischen Drüsen gebildet wird. Hirudin wirkt als äußerst stark bindender und sehr spezifischer Inhibitor gegenüber der Protease Thrombin und verhindert die Blutgerinnung. Der Mechanismus der Wirkung von Hirudin als Thrombininhibitor ist aufgeklärt: Der C-terminale Teil von Hirudin bindet an die Anionenbindungsstellen des Thrombins und belegt somit die Bindungsstelle der Fibrinogenkette am Thrombin. Zusätzlich blockiert der N-terminale Teil von Hirudin das aktive Zentrum von Thrombin (Szyperski et al. 1992, J. Mol. Biol. 228:1206-1211; Fenton et al. 1991, Blood Coagul. Fibrinol.2: 69-75; Rydel et al. 1990, Science 249: 277-280; Karshikov et al. 1992, Prot. Science 1. 727-735; Markwardt 1991, Thromb. Haemost. 66: 141-152). Aus diesem Grund besteht schon seit längerem ein Interesse für die Verwendung von Hirudin als spezifisches Antikoagulans.

Seit kurzem ist man in der Lage, große Mengen an Hirudin auf rekombinantem Wege herzustellen und für pharmakologische Untersuchungen zu verwenden (Rigel et al. 1993, Circl. Res. 72: 1091-1102; Loison et al. 1988, Biotechnol. 6: 72-77; Zawilska et al. 1993, Thromb. Res. 69: 315-320; Klöcking et al. 1990, Blut 60: 129; Fareed und Walenga 1989, FASEB J. 3: 328; Markwardt et al. 1988, Pharmazie 43: 202-207). Dabei ergeben sich mehrere klinische Anwendungen für Hirudin: in der Hämodialyse, als Antikoagulans während der pulmonaren transluminalen koronaren Angioplastie (PTCA), als Beimischung zu Thrombolytika wie z.B. Plasminogenaktivatoren und Streptokinase, als Antikoagulans während der Operation und für die klinische Gerinnungsunterdrückung.

Bei Gabe von Antikoagulantien ist jedoch eine exakte Dosierung schwierig. Zum Beispiel kann die von Hirudin verursachte Hemmung von Thrombin in der Blutzirkulation ungewollt zu Komplikationen und Blutungen führen, die eine sofortige Eliminierung von Hirudin aus der Zirkulation erforderlich machen (Fareed et al. 1991, Sem. Thromb. Hemost. 17: 137-144; Brüggener et al. 1989, Pharmazie 44: 648-649; Fareed und Walenga 1989, FASEB J. 3: 328). Allerdings ist die Bestimmung des Hirudinspiegels (Differenzierung freies und gebundenes Hirudin) im Blut und eine Verlaufskontrolle der HirudinAusscheidung nur indirekt über die Bestimmung der Thrombin-Aktivität möglich. Zur Zeit besteht nur die Möglichkeit, den Hirudinspiegel im Blut durch natürliche Ausscheidung und gegebenenfalls mittels Dialyse zu reduzieren. Auch die Gabe von Prothrombin wurde vorgeschlagen (Walenga et al. Sem. Thromb. Hemost. 15:316:1989), jedoch ist die Umwandlung von Prothrombin in Thrombin in der Zirkulation zeitabhängig. Ein Überschuß an Thrombin begünstigt andererseits wieder die Gerinnungsneigung. Nicht zuletzt bildet Hirudin mit Thrombin einen sehr starken Komplex, der selbst in vitro nur schwer dissoziierbar ist, so daß eine Dosierung des Hirudinspiegels über einen Verdrängungsmechanismus realistischerweise bisher nicht praktikabel war.

Es wurde daher im Stand der Technik intensiv nach einem brauchbaren Antagonisten zu Hirudin gesucht, der gezielt einsetzbar ist und keine die Blutgerinnung betreffenden Nebenwirkungen zeigt. Obwohl dies ein bekanntes Problem der Hirudinforschung ist (Markwardt F., Haemostasis 21:11; 1991), gibt es bis dato keine praktikablen, in der Medizin einsetzbaren Lösungen.

Es wurde vorgeschlagen (Brüggener et al., Pharmazie 44:648; 1989), eine chemische Veränderung des Thrombins vorzunehmen. Dabei wurde Diisopropylfluorophosphat an Thrombin, das aus Plasma gereinigt 2 ΑΤ 404 357 Β wurde, gekoppelt. DIP lagert sich in das aktive Zentrum von Thrombin ein, wodurch die dreidimensionale Struktur des katalytischen Bereiches verändert wird. Das entstandene DIP-Thrombin ist enzymatisch inaktiv, bindet aber Hirudin. Allerdings ist Diisopropylfluorophosphat äußerst giftig und gefährlich. Auf Grund der nicht sehr stabilen Bindung von DIP an Thrombin kann DIP leicht abdissoziieren. Ein in vivo zerfallender DIP-Thrombin-Komplex ist für die Anwendung im klinischen Bereich daher völlig ungeeignet.

In der WO 93-15757 werden Prothrombin-Intermediate als Antidote zu Hirudin vorgeschlagen. Diese Produkte sind allerdings mit den üblichen Gefahren belastet, die allgemein Präparaten, die aus Plasma gewonnen werden, anhaften, z. B. Kontaminationen durch humanpathogene Viren.

Neben der Verwendung von Heparin, Coumarin und Hirudin zur Verhinderung der Blutgerinnung sind ebenfalls auch synthetische Thrombinhibitoren wie NAPAP (Na-(2-Naphtylsulforyl-glycyl)-D,L-amidinophenyla-lanin-peptid) oder PPACK (D-Phe-Pro-Arg-CHCI) bekannt. Ferner wurde u.a. in Betracht gezogen, modifizierte Proteine, wie z.B. inaktivierte Koagulationsfaktoren, direkt als Antikoagulantien einzusetzen. Ein besonderes Problem dabei ist, daß das modifizierte Protein in vivo möglicherweise schneller als das Wildtyp-Protein aus dem Blut entfernt werden könnte. Der Koagulationsprozeß, umfassend das Zusammenwirken der intrinsischen und extrinsischen Blutgerinnungskaskade und Zelloberlächenrezeptoren, ist sehr komplex. Ein in vivo für die Therapie oder Prophylaxe einsetzbarer, inaktivierter Koagulationsfaktor sollte sich daher vom natürlichen Protein, außer durch seine stark reduzierte oder vollständig inhibierte Koagulationsaktivität in keiner weiteren wesentlichen Eigenschaft wie z.B. Rezeptorbindungskapazität unterscheiden. Wünschenswert wäre eine in vivo Halbwertszeit des inaktiven Proteins, die der des aktiven Koagulationsfaktor entspricht oder sogar erhöht ist. Da insbesondere Thrombin eine sehr kurze in vivo Halbwertszeit besitzt, würde ein inaktiver Koagulationsfaktor mit verlängerter Halbwertszeit das aktive Protein, z.B. Thrombin, bei einer kompetitiven Hemmung verstärkt von seinem Rezeptor verdrängt. Dies hätte den Vorteil, daß zur effizienten Antikoagulanswirkung des inaktiven Proteins nur eine sehr relativ geringe Dosis verabreicht werden müßte. ln der WO 91/11519 wird die rekombinante Expression von Blutfaktoren oder Derivaten davon beschrieben, die beispielsweise eine Deletion, Insertion oder einen Aminosäureaustausch aufweisen, wobei die Aktivität jedoch mindestens 50 % sein sollte (Verhältnis von Antigengehalt zu Aktivität).

In der WO 95/13385 werden Thrombinmutanten beschrieben, die sich durch ein bestimmtes Verhältnis von Antikoagulans- (Protein C-Aktivierung) zu Koagulans-Aktivität (Fibrinogen-Clotting-Aktivität unterscheiden. Die Mutanten zeichnen sich insbesondere dadurch aus, daß die Erkennung und Bindung zu einem ihrer Liganden, etwa zu Fibrinogen bzw. an Protein C durch den Thrombin-Thrombomodulin-Komplex, verändert ist. Durch die veränderte Spezifität zu einem seiner Liganden ist die entsprechende Aktivität als Koagulans bzw. Antikoagulans ebenfalls verändert. Demzufolgen weisen die in der WO 95/13385 beschriebenen Mutanten beispielsweise eine reduzierte Koagulansaktivität aufgrund der geänderten Bindung zu Fibrinogen auf.

Die vorliegende Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, einen medizinisch einsetzbaren Antagonisten von Hirudin zur Verfügung zu stellen, der im wesentlichen keine enzymatische Aktivität-aufweist, die die Blutgerinnung fördert.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen inaktiven Koagulationsfaktor zur Verfügung zu stellen, der sich in den wesentlichen Eigenschaften wie z.B. Rezeptorbindungskapazität nicht vom natürlichen Protein unterscheidet und bei dem gegebenenfalls die in vivo Halbwerteszeit erhöht ist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäS durch neue Prothrombinmutanten oder Derivate davon gelöst, die gegenüber dem natürlichen Protein eine oder mehrere Veränderungen in der Proteinsequenz aufweisen, entweder inaktiv sind oder aber höchstens eine Aktivität von etwa 10 %, vorzugsweise höchstens etwa 0,25 %, des natürlichen Proteins aufweisen und bei denen die Veränderung der Proteinsequenz die Bindungskapazität zu thrombinspezifischen Liganden und Rezeptoren, wie natürliche und synthetische Antikoagulantien. nicht beeinflußt. Die erfindungsgemäßen Prothrombinmutanten oder ihre Derivate unterscheiden sich funktionell außer durch eine stark oder vollständig reduzierte Koagulationsaktivität und gegebenenfalls einer veränderten in vivo Halbwertszeit nicht von ihrem natürlich vorkommenden Protein.

Unter mutierten Prothrombinmutanten oder Derivaten davon werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung sämtliche von der Proteinsequenz des Prothrombin ableitbaren Proteine verstanden, die die wesentlichen Bindungsdeterminanten des Thrombin aufweisen, welche zur Bindung an die thrombinspezifischen, natürlichen und synthetischen Antikoagulantien notwendig sind. Es sollte daher die Struktur der Prothrombinmutante im Vergleich zum Wildtyp-Protein bzw. zu dessen proteolytischen Derivaten möglichst nicht allzu stark durch die Mutationen verändert werden, so daß eine optimale Bindung zu den Liganden, insbesondere zu den natürlichen Liganden, gewährleistet wird.

Daher ist eine wesentliche Voraussetzung für die erfindungsgemäßen Mutanten und Derivate, daß die Veränderung der Proteinsequenz die Bindungskapazität zu thrombinspezifischen Liganden und Rezeptoren, 3

AT 404 357 B wie natürliche und synthetische Antikoagulantien, nicht beeinflußt.

Es ist davon auszugehen, daß die erfindungsgemäßen Mutanten bzw. Derivate eine Bindungskapazität von zumindest 80 % der Bindungskapazität des natürlichen Thrombin aufweisen müssen, so daß die Bindungskapazität als nicht beeinflußt angesehen werden kann-Auch Mutanten bzw. Derivate, welche eine höhere Bindungskapazität als das natürliche Thrombin aufweisen, fallen selbstverständlich unter die vorliegende Erfindung.

Das Maß an Bindungskapazität kann mit jeder geeigneten Methode analysiert werden, beispielsweise mit Antikoagulantien-kompetitiver Analyse zwischen Mutante bzw. Derivat und natürlichem Thrombin (Gan et al., 1993), mit Untersuchungen zur Bindungsaffinität gegenüber künstlichen Inhibitoren (z.B. mit DAPA ( = Dansylarginin-N-(3-ethyl-1,5-pentandiyl)-amid); Pei et al., J.Biol.Chem. 266: 9598, 1991) oder mittels Untersuchung der Bindungsaffinität an einem immobilisierten natürlichen und synthetischen Antikoagulans bzw. Inhibitor.

Bei letzterem wird das natürliche synthetische Antikoagulans bzw. der Inhibitor an einer festen Matrix immobilisiert, eine das zu untersuchende Derivat in einer bestimmten Menge enthaltende Probe mit dem natürlichen und synthetischen Antikoagulans bzw. dem Inhibitor in Kontakt gebracht, die Menge an gebundener(m) Mutante bzw. Derivat bestimmt und die Ergebnisse mit einer Parallelbestimmung mit natürlichem Thrombin relativiert.

Die erfindungsgemäßen Mutanten bzw. Derivate sollen vorzugsweise gänzlich inaktiv sein, d.h. sie sollen keinerlei Thrombinoder Thrombin-analoge Aktivität aufweisen. Jedoch können Derivate mit geringfügiger Aktivität ebenfalls erfolgreich erfindungsgemäß verwendet werden, da eine Aktivität von höchstens etwa 10 %, onsbesöndere von höchstens 0,25 % des natürlichen Thrombins bei der Verabreichung der erfindungsgemäßen Derivate im allgemeinen nicht zu unerwünschten Nebeneffekten, wie z.B. Gerinnungsneigung, führt.

Die erfindungsgemäßen Mutanten bzw. Derivate zeichnen sich weiters dadurch aus, daß sie einen Komplex mit Hirudin bilden können, und dadurch imstande sind, Hirudin zu neutralisieren. Ferner können sie einen Komplex, der aus plasmatischem oder rekombinantem wt-Thrombin mit Hirudin besteht, dissoziieren und das dadurch freigewordene Hirudin komplexieren. Daraus ergibt sich außerdem, daß das freigewordene plasmatische oder rekombinante Wildtyp (wt)-Thrombin wieder aktiv ist und seiner Aufgabe bei der Blutgerinnung nachkommen kann. Dies ist auch erfindungsgemaß ein notwendiger Parameter für den therapeutischen Einsatz der Thrombinderivate.

Bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Mutanten bzw. Derivate weisen eine in vivo Halbwertszeit von mehr als einer Stunde auf.

Weiter bevorzugte Ausführungsformen weisen eine in vivo Halbwertszeit von maximal 10 Minuten auf.

Die Veränderung der Aminosäuresequenz kann im Austausch von einer oder mehreren Aminosäuren bestehen, sie kann aber auch in einer Deletion, vorzugsweise einer Deletion, welche dem Prozessierungs-vorgang bei der Aktivierung von Prothrombin entspricht, oder einer Insertion bestehen, wenn durch diese Veränderungen die erfindungswesentlichen Parameter eine Aktivität von höchstens etwa 10 %, onsbeson-dere von höchstens 0,25 % des natürlichen Thrombins sowie eine Deletion Bindung an Thrombin-Liganden und -Rezeptoren erfüllt werden. Der Begriff "Derivat" soll sowohl die nur durch Mutation veränderten als auch die prozessierten mutierten Proteine umfassen. Für den Austausch von Aminosäuren eignen sich als einzuführende Aminosäuren diejenigen am besten, die die Raumstruktur des Proteins so wenig wie möglich beeinflussen. Das sind entweder sehr kleine Aminosäuren, wie Alanin, oder Aminosäuren, die der ursprünglichen Aminosäure sehr ähnlich sind und sich von dieser nur durch eine funktionelle Gruppe unterscheiden, zum Beispiel Asparagin und Asparaginsäure.

Die erfindungsgemäßen Parameter machen die erwähnten Mutanten bzw. Derivate zu idealen Thrombininhibitor-Antagonisten, da sie die im Stand der Technik erwähnten Nachteile, nämlich unerwünschte Gerinnungsaktivität, Toxizität oder mangelnde Effizienz bzw. Spezifität nicht aufweisen.

Da die erfindungsgemäßen Mutanten bzw. Derivate inaktiv sind bzw. allerhöchstens eine Aktivität von etwa 10 %, insbesondere von höchstens etwa 0,25 % des natürlichen Thrombins aufweisen (wodurch die in-vivo-Thrombin-Aktivität der Mutanten bzw. Derivate noch um einiges unter diesen etwa 0,25 % liegt), können diese selbst dann nicht zu unerwünschten Gerinnungseffekten führen, wenn sie in Oberdosis verabreicht werden. Für die erfindungsgemäßen Mutanten bzw. Derivate ist kein toxischer Effekt zu erwarten, da sie sich von den natürlichen Proteinen kaum unterscheiden und daher normal metabolisiert werden können.

Die erfindungsgemäßen Mutanten bzw. Derivate sind als Antagonisten hocheffizient und hochspezifisch, da ihre Bindungsdeterminanten gegenüber den natürlichen und synthetischen Inhibitoren im wesentlichen unverändert sind und denen des natürlichen Thrombins entsprechen. 4

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Bevorzugte Veränderungen der Proteinsequenz betreffen Aminosäuren aus dem aktiven Zentrum des Prothrombin-, Meizothrombin- oder Thrombinmoieküls, insbesondere die Aminosäuren His-363 und Asp-419, bezogen auf die Aminosäurenumerierung in humanem Prothrombin gemäß Fig.1 (Die Numerierung der Aminosäuren erfolgt generell nach Fig. 1 in der die cDNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz von Prothrombin gezeigt ist. Die Spaitstellen des Faktors Xa sind in der cDNA Sequenz angezeigt, so daß man die cDNA- und Aminosäuresequenz des Thrombins ableiten kann. Die Numerierung beginnt mit der 1. Aminosäure des reifen Prothrombins nach Abspaltung der Leadersequenz und des Propeptides. Die cDNA Sequenz des Prothrombins ist in SEQ. ID.NO. 8, die Aminosäuresequenz in SEQ. ID.NO. 9 wiedergegeben.). insbesondere die Aminosäure Asparaginsäure-419 (Asp-419) hat keinen nahen Kontakt zum gebundenen Hirudin, weshalb der Austausch dieser Aminosäure im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt wird.

Zusätzlich sind die Veränderungen, welche die Cysteinreste Cys-293 und Cys-439 betreffen, bezogen auf die Aminosäurenumerierung in Prothrombin gemäß Fig. 1, ebenfalls bevorzugt. Diese Mutationen ermöglichen die Bildung eines einkettigen Thrombinderivats (da die Schwefelbrückenbindung zwischen der B-Kette und der A-Kette verhindert wird), welches schließlich trotz Bindungsfähigkeit zu Hirudin keine enzymatische Aktivität aufweist (da die A-Kette fehlt). In diesem Fall bieten sich die Aminosäuren Serin und Alanin als Austauschpartner an.

Da alle diese ausgewählten Derivate Mutationen aufweisen, die unmittelbar das katalytische Zentrum betreffen bzw. für die Funktion von Thrombin wichtige Disulfidbrücken, sind sie inaktiv. Wie anhand von Strukturdaten (Rydel et al., 1990) festzustellen ist, betreffen diese Aminosäuren auch keine Regionen, die die Bindung von natürlichen und synthetischen Inhibitoren, insbesondere Hirudin, betreffen.

Die Erfindung betrifft daher bevorzugt Prothrombinmutanten oder Derivate, bei denen mindestens eine Aminosäure, ausgewählt aus His-363 oder Asp-419 und gegebenenfalls Cys-293 oder Cys-439, verändert worden ist, insbesondere Asp-419-Mutanten.

Eine ganz besonders bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Mutanten bzw. Derivate betrifft Mutanten bzw. Derivate, bei welchen die Aminosäure Asp-419 gegen Asn ausgetauscht ist.

Es hat sich gezeigt, daß diese Variante inaktiv ist, sogar gegen das künstliche Substrat AeOH-H-D-CHG-Ala-Arg-pNA nur eine Restaktivität von etwa 0,25 % aufweist, so daß keinerlei gerinnungsaktiven Nebeneffekte zu erwarten sind. Weiters ist die Bindungskapazität dieses Derivats beispielsweise gegenüber Hirudin nicht von der des natürlichen Thrombins zu unterscheiden, da die strukturelle Veränderung, die der Austausch Asp gegen Asn mit sich bringt, sehr gering ist und sich darüberhinaus in einer die Bindung zu den natürlichen und synthetischen Inhibitoren, insbesondere Hirudin, nicht betreffenden Region des Proteins befindet.

Es sind zwar im Stand der Technik mutierte Prothrombine beschrieben worden, jedoch Derivate, welche die beanspruchten Eigenschaften aufweisen, sind noch nicht geoffenbart worden. Es sind aber gerade diese Eigenschaften, welche die Verwendung der erfindungsgemäßen Prothrombin-, Meizothrombin- und Thrombinderivate so vorteilhaft machen.

Beispielsweise wurde eine Reihe genetischer Defekte beschrieben, die Prothrombine und daraus entstehende Thrombine mit Punktmutationen betreffen, wobei die verschiedenen Mutanten eine drastisch verringerte Blutgerinnungsaktivität aufweisen (Henriksen R.A., Methods in Enzymology, Vol. 222:312 (1993). Diese Mutationen betreffen aber allesamt Veränderungen, bei denen immer noch eine gewisse, wenngleich reduzierte Thrombinaktivität festzusteilen ist (insbesondere gegenüber künstlichen Substraten). Diese Restaktivität ermöglicht aber wahrscheinlich erst das Überleben von Personen mit diesen Defekten, woraus zu schließen ist, daß eine Mutation, welche zu einem gänzlich inaktiven Thrombin führt, wahrscheinlich nicht überlebensfähig ist.

Weiters wurden in vitro Punktmutationen in der Prothrombinund Thrombinsequenz durchgeführt, um Struktur- und Funktionsanalysen durchzuführen:

Beispielsweise wurde das Serin-528 im aktiven Zentrum des bovinen Prothrombins (gleichbedeutend mit dem Serin-525 im entsprechenden humanen Prothrombin) zu einem Alanin mutiert. Mit einem derart mutierten Prothrombin wurden daraufhin grundlagenwissenschaftliche Experimente durchgeführt, um den Einfluß dieser Mutation auf die Expression, 7-Carboxylierung und Aktivierung von Prothrombin zu studieren.

Die Strukturanalyse des Thrombin-Hirudin-Komplexes hat ergeben, daß auch Aminosäuren aus dem aktiven Zentrum von Thrombin zur Bildung des Komplexes einen schwachen Beitrag leisten. So kann insbesondere Ser-525 im humanen Prothrombin Wasserstoffbrücken zur N-terminalen Aminosäure von Hirudin ausbilden und sich im Radius von 3,2 A vom N-Terminus von Hirudin befinden. Damit trägt Ser-525 offenbar zur Bindung von Hirudin bei (Rydei et al, Science 249:277, 1990). 5

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Weiters wurde festgestellt, daß die bovine Ser-528-Variante gegenüber DAPA nur mehr eine 74 %-ige Bindungskapazität, verglichen mit dem natürlichen Thrombin, aufweist. Dies bestätigte die Annahme, daß dieser Serinrest unmittelbar in der DAPA- bzw. Hirudin-Bindungsdeterminante liegt. Daher erfüllen Mutationen, die nur die Ser-528-Stelle in bovinem Prothrombin bzw. die Ser-525-Stelle in humanem Prothrombin betreffen, nicht das Erfordernis der ausreichenden Bindungs-Kapazität zum Inhibitor.

Weiters wurden Thrombinfragmente mit größeren Deletionen hergestellt (Gan et al., Arch. Biochem. Biophys. 1993:301, 228). Es wurde ein Abbauprodukt von Thrombin, f-Thrombin, erhalten, das die Aminosäuren 469 bis 579 der α-Thrombinsequenz aufweist. Für Funktionsstudien wurden die Aminosäuren Arginin-517 (gegen Glutamin), Asparaginsäure-519 (gegen Glutamin) beziehungsweise Serin-525 (gegen Alanin) mutiert und dabei bei den einzelnen Mutanten eine geringere Aktivität als bei Wildtyp-Thrombin festgestellt. Die Hirudinbindungsfähigkeit blieb bei einigen f- Thrombinen nur teilweise erhalten. Dabei zeigte die Ser-525-Ala Mutante zwar die geringste enzymatische Aktivität und die besten Resultate in Bezug auf die Hirudinbindung, jedoch lag die Bindungskapazität auch in diesen Untersuchungen deutlich unter der von natürlichem Thrombin. Zwar wurde gezeigt, daß die Thrombinfragmente in kompetitiven Bindungsstudien in unterschiedlicher Stärke mit einer Thrombin-Hirudinbindung konkurrieren und eine Absolutangabe der Bindungsfähigkeit der Fragmente an Hirudin wurde nicht gemacht, die Ergebnisse zeigten jedoch klar, daß die Bindungskapazität gegenüber Hirudin durch die Mutation erheblich verringert worden ist.

Diese f-Thrombine sind daher für die der Erfindung zu Grunde liegenden Aufgabe nicht geeignet: sie sind im Vergleich zu den Wildtyp-Thrombinen sehr stark verändert und eine optimale Bindung zu den natürlichen Liganden kann nicht gewährleistet werden.

Mit den im Stand der Technik beschriebenen Prothrombin- bzw. Thrombinderivaten konnten daher die geforderten Parameter nicht erfüllt werden. ln diesen Zitaten sind auch keinerlei Angaben über eine therapeutische oder diagnostische Einsatzmöglichkeit dieser Prothrombinmutanten (-derivate) oder f-Thrombinfragmente zu finden.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einem anderen Aspekt die Verwendung von Prothrombinmutanten oder Derivaten davon als Arzneimittel, insbesondere zur Herstellung einer medizinischen Präparation zur Verhinderung von Nebeneffekten bei einer Antikoagulationsbehandlung,oder als Diagnostika. Diese erfindungsgemäße Verwendung der Mutanten bzw. Derivate ist besonders bevorzugt bei Antikoagulationsbehandlungen mit Hirudin, Heparin, Antithrombin III und/oder deren Derivaten, sowie synthetische Inhibitoren.

Bei der erfindungsgemaßen Verwendung werden natürlich bevorzugt die Prothrombinmutanten bzw. -derivate mit den erfindungsgemäßen Eigenschaften bezüglich mangelnder Thrombin-Aktivität und ausreichender Bindungskapazität eingesetzt, unter gewissen Bedingungen sind aber auch bekannte Derivate einsetzbar, insbesondere solche, die weitgehend inaktiv sind, wie z.B. ein Analoges zu der oben beschriebenen bovinen Ser-528-Mutante (bzw. deren Thrombin-Derivat), wobei man aber den Mangel der verschlechterten Bindungskapazität in Kauf nehmen muß.

Es ist allgemein bekannt,daß die in vivo Halbwertszeit der Proteine in der Blutzirkulation durch die Glykosylierung beeinflußt wird. Proteine aus Säugertierzellen können dabei über an der Proteinoberfläche lokalisierte Aminosäuren-Seitenketten von Asparagin (N-Glykosylierung) und Serin/Threonin (O-Glykosylie-rung) glykosyliert vorliegen. Dabei wird durch die Glykosylierung von zirkulierenden Proteinen eine Verzögerung der Ausscheidung aus dem Blutkreislauf, d.h. Verlängerung der Halbwertszeit, erhalten. Rekombi-nante Proteine, hergestellt duch Manipulation von Säugertierzellen, sind naturgemäß mit dem für Säugetiere üblichen und natürlichen Glykosylierungen versehen und entsprechen somit der Oberflächenstruktur der entsprechenden humanen Proteine.

Durch Mutation von an der Oberfläche eines Proteins gelegenen Aminsoäuren, wie z.B. Asparagin (Asn) bzw. Serin (Ser) oder Threonin (Thr) in eine andere Aminosäure, oder durch Deletion einer dieser Aminosäuren kann z.B. die native Glykosylierung aufgehoben werden. Es ist bekannt, daß schwach oder nicht-glykosyiierte Proteine wesentlich schnelleraus der Zirkulation ausgeschieden werden, d.h. daß ihre Halbwertszeit verkürzt ist.

Im Gegenzug kann durch Mutation und Aminosäureaustausch von einzelnen an der Proteinoberfläche gelegenen Aminosäuren in z.B. Asparagin die Anzahl der Glykosylierungsstellen eines Proteinmoleküls erhöht und damit auch die in vivo Halbwertszeit verlängert werden. Abhängig von der Anzahl der mutierten, deletierten oder zusätzlich eingeführten Asparagin-Resten im Protein kann dadurch gegebenenfalls die Halbwertszeit variiert werden. Für die erfindungsgemäße Verwendung der Prothrombinmutanten oder Derivaten davon als Antagonisten gegenüber Thrombininhibitoren eignen sich insbesondere solche Mutanten, bei denen durch Mutation die Halbwertszeit des Proteins verkürzt wird. Vorzugswese werden daher als Antagonisten solche Mutanten 6

AT 404 357 B eingesetzt, die eine Halbwertszeit von maximal 10 Minuten aufweisen.

Die erfindungsgemäße medizinische Verwendung der mutierten Prothrombinmutanten bzw. Derivate umfaßt auch ihre Verwendung als Antikoagulantien durch kompetitive Hemmung des Thrombins bzw. als Antagonisten ihrer natürlichen Funktionen. Dies ermöglicht der Medizin mit einem nahezu naturidenten Produkt die Blutgerinnung zu steuern.

Auf Grund der erfindungsgemäßen Parameter und der unveränderten Bindungskapazität zu spezifischen Rezeptoren und Liganden eignen sich Prothrombinmutanten oder ihre Derivate insbesondere als Antikoagulatien in vivo. Für die erfindungsgemäße Verwendung der Prothrombinmutanten oder Derivaten davon als Antikoagulatien eignen sich insbesondere solche Mutanten, bei denen durch gezielten Aminosäureaustausch die Halbwertszeit des Proteins erhöht wird. Vorzugsweise werden daher als Antikoagulatien solche inaktiven Mutanten eingesetzt, die eine Halbwertszeit von mehr als 1 Stunde aufweisen.

Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Prothrombinmutanten als Antikoagulantien werden diese nach Applikation, entsprechend dem natürlichen Protein, in vivo zu inaktivem Thrombin prozessiert, das dann in der Lage ist, im Blut vorkommendes, aktives Thrombin von seinen Rezeptoren zu verdrängen. Die Prothrombinmutante kann gegebenenfalls auch in vitro zur entsprechenden Thrombin- oder Meizothrombin-mutante aktiviert werden und die aktivierte Form direkt für die Verabreichung am Patienten eingesetzt werden. Entsprechend der Dosierung der erfindungsgemäßen Prothrombinmutante oder deren Derivaten in einem Arzneimitel kann in vivo die Blutgerinnung verlangsamt oder vollständig gestoppt werden. Die Verwendung von Prothrombinmutanten oder Derivate davon, die sich durch eine erhöhte in vivo Halbwertszeit auszeichnen, zeigen den besonderen Vorteil, daß sie wesentlich länger im Blut zirkulieren als ihre natürlichen Proteine und daher effektiv die Blutgerinnung beeinflussen können. Zudem kann für eine effektive Antikoagulanswirkung die Menge an therapeutisch eingesetztem Protein gegebenenfalls auch entsprechend reduziert werden. Für die in v/'vo-Anwendung der erfindungsgemäßen Prothrombinmutanten oder deren Derivate als Antikoagulatien ist kein toxischer Nebeneffekt zu erwarten, da sie in vivo entsprechend ihrer natürlichen Proteine normal metabolisiert werden.

Die erfindungsgemäßen mutierten Prothrombinderivate werden bevorzugt unter Verwendung der rekom-binanten DNA-Technik hergestellt. Daher betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Prothrombindmutanten bzw. -derivaten, bei welchem die genetische Information von Prothrombin mutiert, vorzugsweise punktmutiert, wird und in einem eukaryotischen Expressionssystem exprimiert wird und anschließend das exprimierte Derivat gewonnen wird.

Vorzugsweise werden dabei die humanen Sequenzen verwendet.

Die Expression in eukaryotischen Systemen bietet im Gegensatz zu bakteriellen Systemen den Vorteil, daß auch post-translationelle Modifikationen wie Glykosylierung und Carboxylierung durchgeführt werden und damit das exprimierte Protein besser geeignet für die Anwendung am Menschen machen.

Zur Gewinnung der Peptide in Gan et al. wurden die mutierten Sequenzteile von Thrombin in E.coli exprimiert und die rekombinanten Peptide in vitro künstlich mit Schwefelbrücken versehen. Die Ausbeute an exprimierten und zu Versuchen geeigneten Thrombin-ähnlichen Strukturen war dementsprechend sehr gering. Der Verlust der Thrombinaktivität kann auf des Fehlen großer Teile der Thrombinsequenz genauso zurückgeführt werden, wie auf die eingeführten Mutationen.

Die Expression in E.coli, wie in Gan et al. beschrieben, ist für Proteine mit den erfindungsgemäßen Eigenschaften nicht geeignet, da dieses Expressionssystem keine Glykosylierung durchführt und auch die Faltung der exprimierten Proteine nicht der physiologischen Struktur entspricht. Erfindungsgemäß sollten aber möglichst wenig Veränderungen in den Derivaten im Vergleich zum Wildtyp-Thrombin vorgenommen werden. Für die funktionellen Studien in Gan et al. war es aber unwichtig, daß die exprimierten f-Thrombine einerseits keine Kohlehydrate aufweisen (die einzige Glykosylierungssteile im physiologischen Thrombin (Asparagin-53) fehlte) und die Faltung des Peptides in vitro auf komplizierte Weise durchgeführt worden ist. Durch dieses Verfahren gelangt man nur zu geringsten Ausbeuten.

Bei einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird die cDNA-Sequenz des humanen Prothrombins oder die cDNA-Sequenz des humanen Thrombins vorzugsweise punktmutiert, wodurch ein Austausch mindestens einer Aminosäure in der Aminosäuresequenz herbeigeführt wird. Im Falle von Prothrombin ist die Mutationsstelle erfindungsgemäß in dem Bereich der Prothrombinsequenz zu finden, die nach Aktivierung des Prothrombins in der Thrombinsequenz liegt

Vorzugsweise werden die mutierten Prothrombinderivate unter Kontrolle des SV40-Promoters in CHO-DUXS B11-Zellen (Urlaub & Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216, 1980) exprimiert. Die Expression kann aber mit jedem gängigen Expressionsystem, wie Hefe, permanente Zellinien oder virale Expressionssysteme, und mit jeder beliebigen Zellinie erfolgen, welche gewährleistet, daß das Protein richtig prozes- 7

AT 404 357 B siert und in seiner funktionellen Form sezerniert wird. Zur richtigen Prozessierung der Derivate gehört nicht nur die vollständige Glykosylierung, sondern auch die vollständige 7-Carboxylierung. Zu den gängigen eukaryotischen Expressionssystemen zählen Hefe, permanente Zellinien (die entweder durch stabile Integration der Fremd-DNA in die Wirtszellchromosomen erstellt werden, z.B. Vero, MRC5, CHO, BHK, 293, Sk-Hep1, insbesondere Leber- und Nierenzellen, oder aber durch die Verwendung eines im episomalen Zustand permanent weitervererbten Vektors, z. B. Vektoren, die von Papilloma-Viren abgeleitet werden und z.B. in C-127-Zellen wachsen), oder virale Expressionssysteme, wie Vaccinia-Virus, Baculovirus oder retrovirale Systeme. Als Zellinien können allgemein Vero, MRC5, CHO, BHK, 293, Sk-Hep1, insbesondere Leber- und Nierenzellen, eingesetzt werden.

Im Anschluß an die Gewinnung der exprimierten Derivate können dann noch weitere Bearbeitungsschritte durchgeführt werden. Eine Möglichkeit bei der Weiterverarbeitung von Prothrombinmutanten bzw. -derivaten ist ein Verfahrensschritt, bei welchem das Prothrombinderivat mittels einer Schlangengift-Protease (z.B. Venom Protease) in Meizothrombinanaloge gespalten wird. Diese Meizothrombinanalogen sind dann ebenfalls als Antagonisten zu den na-türlichen Funktionen von Thrombin einsetzbar, zeigen aber keine enzymatische Thrombinaktivität. Dabei sind alle aus der Literatur bekannten Verfahren einsetzbar.

Weiters kann ein erhaltenes Prothrombinderivat mittels Trypsin, vorzugsweise immobilisiertem Trypsin, in das Thrombinderivat gespalten werden. Es kann aber natürlich jede gängige Methode zur Spaltung von Prothrombin in Thrombin zum Einsatz kommen, also auch solche, die sich anderer geeigneter Proteasen bedienen.

Die erfindungsgemäßen Derivate werden zur Aufbereitung der Präparationen entweder mit einer physiologischen Salzlösung bereitet und gegebenenfalls lyophilisiert, oder in destilliertem Wasser lyophilisiert und vor Verabreichung mit einer physiologischen Salzlösung rekonstituiert. Alternativ dazu können die Präparationen aber auch in anderen gebräuchlichen Lösungen und/oder mit einem pharmazeutischen Träger- oder Hilfsstoff für den Einsatz bereitgehaiten werden.

Erfindungsgemäß liegen die Präparationen in einer für die parenterale Verabreichung, d.h. für die subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Verabreichung geeigneten Form, vor.

Ein nicht zu vernachlässigender weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Präparationen liegt darin, daß sie auf Grund ihrer Herstellung frei von Kontaminationen durch Viren sind. Die Präparationen können vor ihrer Freigabe für die medizinische Anwendung zusätzlich mit einer äußerst sensitiven PCR-Methode (beispielsweise in der AT 401270 B beschrieben) auf eine mögliche Verunreinigung durch Rest-Nukleinsäuren der Expressionszellinie hin untersucht und notwendigenfalls nochmals gereinigt werden.

Die erfindungsgemäßen Derivate müssen schließlich auf ihre Fähigkeit, ihre natürlichen Liganden binden zu können überprüft werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde dazu ein Testsystem erarbeitet, bei dem die Bindungskapazität der (Pro-)Thrombin-Derivate zu Hirudin oder Hirudinderivaten in einfacher und reproduzierender Weise qualitativ und quantitativ analysiert wird. Dieses Testsystem besteht aus einer festen Matrix, an der natürliches oder rekombinantes Hirudin, Derivate oder Peptide davon gebunden ist. An dieses immobilisierte Hirudin wird schließlich das erfindungsgemäße Derivat gebunden und kann durch eine anschließende Detektionsreaktion nachgewiesen werden.

Daher betrifft die Erfindung auch eine feste Matrix, an der natürliches oder rekombinantes Hirudin, Derivate oder Peptide davon gebunden sind, und deren Verwendung bei der Bestimmung von Thrombin oder Thrombinderivaten. Die Bestimmung kann sowohl die Quantifizierung als auch die Bestimmung der Bindungskapazität des Thrombin oder Thrombinderivats umfassen.

Unter fester Matrix ist erfindungsgemäß jegliche feste Phase zu verstehen, an welcher der natürliche und synthetische Inhibitor wirksam immobilisiert werden kann, beispielsweise natürliche Polymere, wie Cellulose, Stärke, Dextran, Alginate, Agarose, Collagen, insbesondere die in der Immobilisierungstechnologie weitverbreiteten Sepharose- bzw. Cellulosematerialien, synthetische Polymere, wie Polyacrylamid, Polyvinylalkohol, Methylacrylat, Nylon oder Oxirane, welche leicht zu anwenderfreundlichen Vorrichtungen geformt werden können, wie z.B. Mikrotiterplatten, und schließlich anorganische Materialien, wie poröse Gläser, Silikagel, etc. (siehe auch Römpp-Lexikon der Biotechnologie, Seiten 385 ff.).

Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann eine einfache und präzise Bestimmung der Thrombin-bzw. Thrombinderivatkonzentration vorgenommen werden, wobei nicht nur das aktive Thrombin selbst bestimmt werden kann, sondern auch enzymatisch inaktives oder nur schwach aktives Prothrombin oder Thrombin und Derivate davon. Weiters läßt sich die erfindungsgemäße Vorrichtung auch auf Grund ihrer anwenderfreundlichen Gestaltung indirekt zur Konzentrationsbestimmung von jeglichen Thrombin-bindenden Substanzen, wie Thrombininhibitoren, aber insbesondere von Hirudin, einsetzen. Darüberhinaus ist auch eine Bestimmung der Bindungsstärke von Thrombin oder Thrombinderivaten zu den jeweils untersuchten natürlichen und synthetischen Inhibitoren mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung bestimmbar. 8

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Als Thrombin oder Thrombinderivate werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung sämtliche von der Proteinsequenz des Prothrombins ableitbaren Proteine verstanden, insbesondere die oben beschriebenen mutierten Thrombin-, Meizothrombin- oder Prothrombin-Derivate. Dabei kann das Derivat aber auch an den Bindungsdeterminanten verändert sein, solange diese Veränderungen eine Bindung an die natürlichen und synthetischen Inhibitoren nicht ausschließen. Die Thrombinderivate können sich von natürlichem Thrombin durch eine oder mehrere Punkt-Deletions- oder Insertionsmutationen unterscheiden. Prothrombinderivate, Meizothrombin sowie dessen Derivate können ebenfalls mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung bestimmt werden und sind - soweit es die Bestimmung derselben betrifft - im Rahmen der vorliegenden Erfindung ebenfalls als Thrombinderivate anzusehen.

Zur eigentlichen Quantifizierung von Thrombin, Thrombinderivaten und/oder Hirudin oder Hirudinderivaten wird erfindungsgemäß ein Testkit vorgesehen, welcher die erfindungsgemäße Vorrichtung sowie einen oder mehrere Behälter mit Reagentien für eine spezifische Detektionsreaktion, vorzugsweise eine thrombinderivatspezifische Detektionsreaktion, enthält. Dabei ist unter spezifischer Detektionsreaktion jede geeignete Detektionsreaktion zu verstehen, insbesondere solche Reaktionen, die mit Farbstoffen arbeiten (Peroxidase, alkalische Phosphatase, Lumineszenzreaktionen, Biotin, Avidin oder Biotin-Streptavidin (als Verstärkersysteme» oder radioaktive Bestimmungsmethoden.

Vorzugsweise wird die in der Handhabung einfachere Farbreaktion zur Konzentrationsbestimmung der radioaktiven Bestimmung vorgezogen. Im besonderen werden für die Erfindung Peroxidasemarkierte Schaf-Anti-Thrombin-Antikörper verwendet und die für die Peroxidasereaktion gängigen Substratlösungen zur Farbreaktion eingesetzt.

Der erfindungsgemäße Testkit enthält weiters einen Behälter mit einer ein Trägerprotein beinhaltenden physiologischen Pufferlösung, wodurch die Reproduzierbarkeit der Quantifizierung erheblich verbessert wird.

Die spezifische Detektionsreaktion im Rahmen des erfindungsgemäßen Testkits ist vorzugsweise eine markierte Thrombin-bindende Substanz, da in der Klinik die Bestimmung von Thrombin häufig gegenüber den anderen bestimmbaren Komponenten von herausragender Wichtigkeit ist. Im Stand der Technik ist eine Vielzahl von markierten Thrombin-bindenden Substanzen bekannt. Erfindungsgemäß kommt bevorzugt ein Farbstoff-markierter polyklonaler oder monoklonaler Antikörper gegen Thrombin zur Anwendung. Die Detektion mittels chromogenen Substanzen wird häufig gegenüber radioaktiven Bestimmungsmethoden bevorzugt, da die Farbstoffreaktionen keine radioaktiven Kontaminationen mit sich bringen und die strengen Sicherheitsmaßnahmen beim Arbeiten mit radioaktivem Material die radioaktive Bestimmungsmethode oft sehr unpraktisch machen.

Das Detektionsverfahren kann nach den in der Proteinchemie gängigen Verfahrensschritten ablaufen. Zur Bestimmung der Konzentration von Thrombin oder Thrombinderivaten wird eine Thrombinlösung mit der Hirudin-gekoppelten festen Matrix für 15 Minuten bis 16 Stunden, vorzugsweise zwischen 45 Minuten und 4 Stunden inkubiert. Die Reaktion findet üblicherweise in einem physiologischen Puffer, vorzugsweise in einem Tris-HCl-Puffer, statt. Es ist von besonderem Vorteil, wenn dem physiologischen Salzpuffer ein Trägerprotein, wie z.B. Albumin, zugesetzt wird.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testkits umfaßt weiters eine Thrombinhaltige Referenzlösung, die die Erstellung einer zuverlässigen Eichgerade im Testsystem erlaubt.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Quantifizierung von Thrombin oder Thrombinderivaten, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist: • Inkubieren einer Lösung, welche eine zu quantifizierende Menge an Thrombin oder Thrombinderivaten enthält, mit Hirudin oder einem Hirudinderivat, welches auf einer festen Matrix immobilisiert ist, wobei das Thrombin oder das Thrombinderivat an das immobilisierte Hirudin oder Hirudinderivat gebunden wird, - gegebenenfalls Entfernen von nicht-gebundenem Thrombin oder Thrombinderivat. - Durchführen einer spezifischen Detektionsreaktion, wobei die Menge an gebundenem Thrombin oder Thrombinderivat bestimmt wird.

Das Durchführen der spezifischen Detektionsreaktion kann entweder im Rahmen des erfindungsgemäßen Testkits mit den Reagentien für eine spezifische Detektionsreaktion durchgeführt werden oder direkt durch eine Meßvorrichtung auf der festen Matrix selbst, etwa mit einem Sensorchip mit angeschlossener Meßanlage.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einfacher Weise durchgeführt werden, wobei es sich besonders für die rasche und unkomplizierte Anwendung im klinischen Bereich eignet.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft ein Verfahren, bei welchem die spezifische Detektionsreaktion eine Farbreaktion ist, wobei die Konzentration an Thrombin oder Thrombinderivat durch Korrelation mit der Intensität der Farbreaktion bestimmt wird. 9

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Das erfindungsgemäBe Verfahren eignet sich gemäß einem weiteren Aspekt auch zur Quantifizierung von Hirudin oder Hirudinderivaten, wobei ein solches Verfahren durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist: - Inkubieren einer Lösung mit einer zu quantifizierenden Menge an Hirudin oder Hirudinderivat mit einer Lösung mit einer bekannten Menge an freiem Thrombin oder Thrombinderivat, - Bestimmen der nach dem Inkubieren mit dem Hirudin- oder Hirudinderivat verbliebenen freien Thrombin- oder Thrombinderivat-Konzentration durch das oben geschilderte erfindungsgemäße Verfahren und - Bestimmen der Menge an Hirudin- oder Hirudinderivat durch Rückrechnen aufgrund der Unterschiede zwischen der ursprünglichen bekannten und der bestimmten Menge an Thrombin- oder Thrombinderivat.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung bzw. des erfindungsgemäßen Testkits zur Quantifizierung von Thrombin, Thrombinderivaten und/oder Hirudin oder Hirudinderivaten sowie zur Bestimmung der Bindungsstärke von Thrombin oder Thrombinderivaten zu Hirudin oder Hirudinderivaten.

Es hat sich nämlich überraschenderweise gezeigt, daß mit diesem Testkit erstmals auch die Bindungsstärke von Thrombin oder Thrombinderivaten an Hirudin oder anderen Thrombin-hindernden Substanzen bestimmt werden kann. Die Bindungsstärke von Thrombin an Hirudin wird vor allem dann interessant, wenn Thrombinderivate vorliegen, deren Bindungseigenschaften an Hirudin unbekannt sind.

Weiters kann der Testkit zur funktionsanalyse von Hirudin-Antagonisten eingesetzt werden. Und bei Austestung von Hirudinpeptiden oder Hirudinderivaten als effektive Antikoagulantien läßt sich das Verfahren ebenfalls anwenden.

Der erfindungsgemäße Testkit eignet sich daher, alle im Zusammenhang mit Thrombin, Hirudin und der Blutgerinnung auftretenden Fragen in Hinblick auf Konzentration, Bindungsstärke und Funktionalität zu beantworten. Dabei ist besonders hervorzuheben, daß auf Grund der Spezifität der Bindung von Hirudin an Thrombin ein äußerst exaktes Ergebnis erzielt werden kann. Verunreinigungen durch andere Blutfaktoren oder Proteine können das Ergebnis nicht verfälschen. Auch die Anwesenheit von Prothrombin stört die Analysen nicht, da Prothrombin nicht an Hirudin bindet.

Es ist zwar bekannt, Hirudin an Mikrotiter-Platten zu koppeln, um mit diesen ELISA-Platten Anti-Hirudin-Antikörper zu testen, eine Quantifizierung oder Bestimmung der Bindungskapazität wurde jedoch nicht mit diesen Platten beschrieben. (Mille B. et al., Clin.Chem. 40:734, 1994).

Bei der Herstellung einer Hirudin-gekoppelten festen Matrix wird Hirudin in einem Puffersystem an die Matrix gekoppelt.

Als Puffersystem eignet sich jeder Puffer, der frei ist von Aminogruppen, wie Phosphatpuffer, Citratpuffer oder vorzugsweise Carbonatpuffer. Der pH-Wert des Puffersystems sollte in der Menge zwischen 6 und 10 liegen, vorzugsweise bei pH 9,3 bis 9,7.

Erfindungsgemäß wird bei der Kopplungsreaktion von Hirudin an den festen Träger zwischen einer und 48 Stunden, vorzugsweise zwischen einer und 16 Stunden inkubiert. Die Inkubationszeit richtet sich im wesentlichen nach der Inkubationstemperatur, wobei vorzugsweise bei einer Kopplungsreakton in der Kälte (4 *C) für 16 h, bei Raumtemperatur zwei bis drei Stunden und bei 37 *C eine Stunde inkubiert wird.

Nach der Kopplungsreaktion wird erfindungsgemäß das überschüssige, nicht gebundene Hirudin mit einem Waschpuffer aus einer physiologischen Salzlösung, vorzugsweise aus einem Tris-HCl-Puffer, entfernt. Diesem Waschpuffer kann ein Detergens, vorzugsweise Tween 20, zugesetzt sein, wobei die Detergenskonzentration zwischen 0,01 und 1 %, vorzugsweise bei 0,1 % liegt.

Mit dem erfindungsgemäßen Testkit lassen sich Konzentrationen von Thrombin oder Thrombinderivaten im Bereich von 0,1 pg/ml bis zu 100 mg/ml Thrombin, vorzugsweise im Bereich von 0,1 ng/ml bis 200 ng/ml Thrombin bestimmen.

Nicht zuletzt eignet sich der erfindungsgemäBe Testkit zum Unterscheiden von Thrombinen mit rekombinant gestalteten, gezielten Mutationen, Deletionen oder Insertionen, wobei daraufhin getestet werden kann, ob die Bindungsfähigkeit zu Hirudin unabhängig von der enzymatischen Aktivität erhalten geblieben ist.

Dieser erfindungsgemäße Test oder erfindungsgemäße Testkit kann speziell zum Einsatz kommen, wenn für eine medizinische Fragestellung der Thrombinspiegel im Blut bestimmt werden soll, um mit einer genau dosierten Hirudin-Gabe Thrombosen zu verhindern.

Dieser Test hat außerdem den besonderen Vorteil, daß auch Thrombin bestimmt werden kann, das funktionell nicht aktiv ist und das daher in den Tests, die die enzymatische Aktivität des Thrombins erfassen, nicht nachweisbar ist. Dies ist zum Beispiel bei genetischen Defekten der Fall, wenn physiologisch inaktive Thrombinformen vorliegen. 10

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Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele und dazugehörigen Zeichnungsfiguren, auf die sie jedoch nicht beschränkt sein soll, noch weiter erläutert.

Es zeigen: Fig.1 den kodierenden Teil der cDNA-Sequenz von rekombinantem humanen Prothrombin und die daraus ableitbare AminoSäuresequenz, wobei die physiologischen Spaltstellen zur Prozessierung des Proteins beziehungsweise die Spaltstellen des Faktors Xa zur Aktivierung des Prothrombins zu Thrombin eingezeichnet sind; Fig.2 das Sequenzprotokoll; Fig.3 eine Zusammenfassung der Punktmutation eines bevorzugten Prothrombinderivats im Vergleich zum wt-Prothrombin, wobei die unterstrichenen Amino-säure/Nukleotide ausgetauscht worden sind; Fig.4A das Flußschema der Klonierung des Prothrombin-Asn419; Fig.4B einen Western Blot zum Vergleich von plasmatischem Prothrombin, rekombinantem wt-Prothrombin und Prothrombin-Asn419; Fig.5: die denaturierende Elektrophorese einzelner Reinigungsstufen von rekombinantem Prothrombinderivat (A: Zellkulturüberstand; B: Eluat 3; C: Eluat 4; D: Molekulargewichtsmarker); Fig.6: die denaturierende Elektrophorese einzelner Stufen der Bildung von Thrombin-Asn99 aus Prothrombin-Asn419 (A: Prothrombin-Asn419; B: Eluat 3; C: humanes Thrombin; D: Molekulargewichtsmarker); Fig.7 die Bindung von Thrombin-Asn99 (A), rekombinantem wt-Thrombin (B) und humanem plasmatischen Thrombin (C) an immobilisiertes Hirudin; Fig.8 Abhängigkeit der Thrombinfluoreszenz von der Hirudinkonzentration (die Fluoreszenz bei 341 nm (Exitation 280 nm) von 390 nM Thrombin-Asn99 (A), 326 nM rekombinantes wt-Thrombin (B) und 350 nM humanes plasmatisches Thrombin (C) wurde in Abhängigkeit der Hirudinkonzentration bestimmt, die Fluoreszenz ohne Hirudin wurde als 0 %, die Fluoreszenz bei Hirudinsättigung als 100 % dargestellt); Fig.9 die Neutralisierung von Hirudin durch Thrombin-Asn99; Fig.10 die Wiederherstellung der Thrombinaktivität aus dem Hirudin-Thrombin-Komplex durch Zugabe von Throm-bin-Asn99 durch unterschiedliche Konzentrationen von Thrombin-Asn99: (A) 0,2 ug/ml, (B) 0,4 ug/ml, (C) 1 ug/ml); Fig.11 die Neutralisation von Hirudin im Plasma (dabei ist die Gerinnungszeit in Anwesenheit von

Hirudin (x~x) und ohne Hirudinzusatz (.......) in Abhängigkeit von der Konzentration an Thrombin-

Asn99 im Test dargestellt); Fig. 12 die molekulare Struktur des katalytischen Zentrums im Thrombin-Hirudin-Komplex (Vergleich von humanem Thrombin und rekombinantem Thrombinderivat), wobei mit Pfeilen auf die durch Mutation Asp-»Asn hervorgerufene Strukturveränderung hingewiesen wird und Ser, His und Asp bzw. Asn die Lage der Aminosäuren des katalytischen Zentrums im Thrombinmolekül und Ile die N-terminale Aminosäure von Hirudin bezeichnen.

Beispiele:

Beispiel 1 zeigt am Beispiel Prothrombin Asn419 die Verfahrensweise, wie ein punktmutiertes Prothrombin erhalten werden kann. Beispiel 2 demonstriert die Reinigung und Funktionsanalyse des Prothrombinderivats. Beispiel 3 zeigt die Gewinnung und Funktionsanalyse des Thrombinderivats. Beispiel 4 quantifiziert die Bindungsaktivität des Thrombinderivats an Hirudin; Beispiel 5 überprüft das Prothrombinderivat auf seine Fähigkeit als Antagonist von Hirudin zu wirken, Beispiel 6 zeigt, daß Hirudin durch das Thrombin-Derivat neutralisiert werden kann. In Beispiel 7 wird gezeigt daß das Thrombin-Derivat Thrombin aus einem Thrombin-Hirudin-Komplex wieder aktivieren kann; Beispiel 8 zeigt, daß das Thrombin-Derivat auch im Plasma wirksam ist und Beispiel 9 zeigt die Gewinnung und Funktionsanalyse eines Meizothrom-bin-Derivats.

Beispiel 1: Konstruktion von pSV-Fllwt und pSV-FII-Asn419 (Asp zu Asn)

Das Plasmid pSV/S (Nucl. Acids Res. 17: 2365:1989) wurde mit Notl geschnitten, um das interne ß-Galactosidasegen-Fragment zu entfernen. Der verbleibende Vektor wurde religiert und pSV genannt.

Um den größten Teil der 3'-seitig der Polyadenylierungsstelle gelegenen und später möglicherweise störenden Polylinker-Sequenz zu entfernen, wurde pSV mit Hindlll und Xbal geschnitten. Nach Entfernen des kleinen Polylinker-Fragments wurden die Vektor-Enden mit Klenow-Enzym aufgefüllt und religiert. Das resultierende Plasmid wurde pSVA genannt.

Anschließend wurde in die 5'-seitig des l6/l9S-lntrons gelegene Xhoi Stelle eine 'Multiple Cloning Site' (MCS) mit geeigneten Restriktions-Schnittstellen eingefügt.

Die MCS wurde in Form zweier komplementärer Oligonukleotide chemisch synthetisiert: 5'-TCGACCATGG ACAAGCTTAT CGATCCCGGG AATTCGGTAC CGTCGACCTG CAGGTGCACG GGCCCAGATC TGACTGACTG A-3' (Seq.lD.No.1) und 5'-TCGATCAGTC AGTCAGATCT GGGCCCGTGC ACCTGCAGGT CGACGGTACC GAATTCCCGG GATCGATAAG CTTGTCCATG G-3'. (Seq. ID . No. 2)

Die beiden Oligonukleotide wurden "annealed" und in pSVA gesetzt. Da das MCS-lnsert zwar Xhol- 11

AT 404 357 B kompatible, "sticky "-Enden, jedoch keine vollständigen Xhol-Stellen aufwies, wurde die Ligations-Reaktion mit Xhol geschnitten. Nicht schneidbare Xonstrukte repräsentierten das gewünschte Plasmid, welches pSV-MCS III genannt wurde.

Ein DNA-Fragment mit der vollständigen, humanen wt-Prothrombin-cDNA wurde mittels partiellem Ncol-und vollständigem Smal-Restriktionsverdau aus Plasmid pTKemc-PT2 (WO 91/11519) ausgeschnitten.

Dieses Fragment wurde in den Vektor pSV-MCS III gesetzt, nachdem er ebenfalls über partiellen Ncol-und vollständigen Smal-Verdau vollständig geöffnet worden war.

Das resultierende Plasmid wurde pSV-Fllwt genannt und exprimiert wt-Prothrombin, wie durch transiente Expression in COS-Zellen und stabile Expression in CHO-Zellen nachgewiesen wurde; die Reihenfolge der funktionellen Elemente auf pSV-Fllwt ist SV40-Promoter/Enhancer (der frühen Gene), SV40-5' UTR, wt-Prothrombin-cDNA, SV40-16s/19s-lntron, SV40-Polyadenylierungs-Stelle, und pUC 19-Sequenzen (mit bakteriellem Replikations-Ursprung und Ampicillin-Resistenz-Gen).

Um die Asparaginsäure des katalytischen Zentrums des Thrombin in ein Asparagin zu mutieren und somit eine inaktive Mutante des Thrombins herzustellen, wurde pSV-Fllwt mutiert; Das für die genannte Asparaginsäure kodierende Kodon befindet sich auf einem EcoRV-Dralll-Restriktionsfragment. Beide Restriktionsstellen sind einzigartig in pSV-Fllwt vorhanden. Die beabsichtigte Mutagenese wurde mittels Polymeraseketten-Reaktion mit dem Primer-Paar 2104/2066 (Seq.lD.No.3 und 4) durchgeführt, in deren Folge das wt-Prothrombin-EcoRV-Dralll-Fragment durch das die Mutation enthaltende PCR Ecll36ll-Dralll-Fragment substituiert wurde.

Die beiden Oligonukleotide wurden chemisch synthetisiert;

Primer 2104 (5’ -TAACTGACGG TCCTTGAGCT CCATGTTGGA AAAGATCTAC ATC-3') (Seq.lD.No.3) als 5' Primer; nach der Polymeraseketten-Reaktion wird die Ecl 13611 'half site' auf die EcoRV 'half site' des Vektors ligiert, wodurch zwar auf DNA-Ebene einige Nukleotide des wt-Prothrombin verändert wurden, die Aminosäuresequenz jedoch wie im wt-Prothrombin erhalten bleibt.

Primer 2066 (5’-GCAGACACAC AGGGTGAATG TAGTCACTGA AGGCAACAGG CTTCTTCAGC TTCATCAGGG CAATATTCCG GTCCAGGTTC TCCCGC-3') (Seq.lD. No.4) als 3’ Primer; durch diesen Primer wird auf DNA-Ebene die Asparaginsäure in Asparagin mutiert, eine Sspl-Restriktionsstelle eingeführt und eine Ncil-Stelle verloren.

Die PC-Reaktion wurde unter Standardbedingungen bei einer "annealing" Temperatur von 55 *C durchgeführt.

Das resultierende Plasmid pSV-FIIAsn419, das die Asp—Asn-Mutation beinhaltet, wurde durch sein Restriktionsmuster mit EcoRV, Dralll, Sspl, und Neil im Vergleich mit pSV-Fllwt identifiziert.

Das Flußschema des Klonierungsweges ist in Fig. 4A gezeigt.

Die erwartete Nukleotid-Sequenz des Ecl136ll-Dralll-Inserts in pSV-FIIAsn4l9 wurde durch anschließende Sequenzierung mit den 5'-und 3’-Primern 2197 (5'-CATAAGCCTG AAATCAACTC-3’) (Seq.lD.No.5) bzw. 2198 (5'-CTTCGGAGCG TGGAGTCATC-3') (Seq.lD.No.6) bestätigt.

Dihydrofolatreduktasegen-defiziente CHO-DUKS B11 wachsen routinemäßig in "Voll-Medium" (DMEM/Ham's F12 1:1 Medium, supplementiert mit 2mM Glutamin, 0,075% Bicarbonat, 100IU Penicillin und 100 mg Streptomycin/ml, 10% foetalem Kälberserum, sowie 10 mg Desoxyadenosin, Adenosin, und Thymidin pro ml).

Mittels modifizierter CaPO*-Methode (Graham und van der Eb, Virology 52: 456, 1973) wurden die Zellen mit 10 ug pSV-Fllwt bzw. pSV-FIIAsn-419 und 1 ug pSV-dhfr (Fischer et al., FEBS Lett. 351:345, 1994) kotransfiziert: zur DNA in 250 ml ImM Tris pH 8,0, 0,ImM EDTA wurden 25 ml 2,5M CaCh addiert. Anschließend wurden 250 ml 280mM NaCI, 45mM Hepes, 2,8mM NaiHPCU, pH 7,12 zugegeben. Nach 10 Minuten wurde das entstandene DNA-Kopräzipitat zu den subkonfluenten Zellen gegeben.

Sechs Stunden später wurde das Medium abgesaugt und die Zellen mit 15% Glyzerin in PBS überschichtet. Eine Minute später wurde das Glyzerin abgesaugt, die Zellen mit PBS gewaschen, und die Zellen mit frischem "Vollmedium" versehen. 48 Stunden später wurden die Zellen trypsiniert und in unterschiedlichen Konzentrationen in "Selektions-Medium" (DMEM/F12 1:1 Medium ohne Hypoxanthin, Glycin und Thymidin; supplementiert mit 2mM Glutamin, 100IU Penicillin and 100 mg Streptomycin/ml, und 10% dialysiertem foetalen Kälberserum mit einem Ausschlußvolumen von lO.OOOKd) aufgeteilt. Bei regelmäßigen Mediumwechseln 2-3 mal in der Woche wurden Zellklone nach etwa 10 Tagen sichtbar. Eine weitere Woche später wurden die resultierenden Zellklone isoliert und in separaten Zellkultur-Schalen zur Konfluenz gewachsen. In serumfreien 24-Stunden-Zellkulturüberständen mit sekretiertem, rekombinanten wt-Prothrombin bzw. ProthrombinAsn419 in Selektionsmedium (supplementiert mit 10 ug Vitamin Κι/ml, aber ohne Kälberserum) wurden anschließend Antigenmenge und qualitative Integrität (Western Blot Analyse), Funktionalität (geeignete Aktivitätstests) und Interaktion des zu Thrombin aktivierten Prothrombin mit Hirudin untersucht. Die Zellzahl wurde nach 12 ΑΤ 404 357 Β

Trypsinieren der Zellen im Zellzahlmeßgerät der Fa. Schärfe. Reutlingen, Deutschland) bestimmt.

Zur Western Blot-Analyse wurden 10ul Zellkulturüberstand reduziert und denaturiert, und in denaturierenden 4% sammel-/8% Trenngelen nach Lämmli (Nature 227: Θ80ρρ, 1970) mit dem BioRad Mini-Protean II Dual Slab Gel-System aufgetrennt (BioRad Laboratories, Richmond, CA, USA). Die Proteine wurden nach erfolgtem Gellauf mit dem BioRad Mini Trans-Blot-System (BioRad Laboratories, Richmond, CA, USA) in Transferpuffer (25mM Tris, 192mM Glycin) auf Nitrozellulose-Membranen transferiert. Zur Visualisierung des rekombinanten Proteins wurde das Protoblot-System der Fa. Promega (Madison, WIS, USA) verwendet. Als Antikörper zur Prothrombin-Bindung wurde Kaninchen Anti-Prothrombin-Serum (Best. No.A325) der Fa. Dakopatts (Glostrup, Dänemark) eingesetzt. (Fig.4B)

Beispiel 2: Reinigung und Aktivitätsbestimmung von rekombinantem wt-Prothrombin und Prothrombinderivaten a) Reinigung des rekombinanten wt-Prothrombins und des Prothrombin-Asn419

Material: Anionen-Austauschersäule Fraktogel EMD TMAE 6 50, 1,6 x 5 cm (Merck)

Flüssigkeitschromatographiegerät FPLC LCC-500 (Pharmacia) anti-Prothrombin Immunglobulin (Stago) Lösungen: 50 mM Tris/HCI Puffer pH 7,4 (Puffer A) 50 mM Tris/HCI Puffer pH 7,4, 180 mM NaCI (Puffer B) 50 mM Tris/HCI Puffer pH 7,4, 300 mM NaCI (Puffer C) 50 mM Tris/HCI Puffer pH 7,4, 160 mM NaCI, 10 mM Ca-Acetat (Puffer D) Für die Gewinnung des rekombinanten wt-Prothrombins und des Prothrombinderivats wurde Zellkulturüberstand von transformierten CHO-Zellen aus Beispiel 1 verwendet, der ein lösliches rekombinantes Prothrombinderivat enthielt.

Die Reinigung des rekombinanten wt-Prothrombins und des Prothrombinderivats aus dem Zellkulturüberstand erfolgte durch Flüssigkeitschromatographie. Während der Chromatographie wurde der Verlauf in üblicher Weise durch Absorptionsmessung bei 280 nm verfolgt Der Gehalt an Prothrombin bzw. an Prothrombinderivaten der einzelnen Fraktionen und Eluate wurde in üblicher Weise mittels ELISA unter Verwendung von handelsüblichem Prothrombinpräparat als Standard ermittelt.

Die Gesamtproteinkonzentration wurde nach der Methode von Bradford, M. (Anal. Biochem. 72, 248 (1976)) ermittelt.

Das Reinigungsverfahren ist in Fischer et al„ J.Biotechn. 38:129, 1995, beschrieben.

Die Daten zur Reinigung des wt-Prothrombins werden nicht gezeigt.

Zur Reinigung des Prothrombin-Asn419 wurde die Anionen-Austauschersäule mit Puffer A äquilibriert und anschließend wurden 970 ml Zellkulturüberstand (Prothrombingehalt (ELISA) 20 ug/ml; Proteinkonzentration 2,7 mg/ml) mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/Minute aufgetragen. Nicht an das Austauschergel gebundenes Material wurde durch Spülen der Säule mit Puffer A entfernt (Eluat 1: 1030 ml: 1,2 mg/ml). Anschließend wurden schwach an die Säule gebundene Proteine durch Spülen der Säule mit Puffer B entfernt (Eluat 2: 20 ml; Prothrombingehalt (ELISA) 2 ug/ml; Gesamtproteingehalt 10,0 mg/ml). Danach wurde die Säule mit Puffer C eluiert und an der Säule gebundenes Protein wurde im Eluat (Eluat 3: 30 ml; Prothrombingehalt (ELISA) 355 ug/ml; Gesamtproteingehalt 16 mg/ml) erhalten. Anschließend wurde die Säule durch Waschen mit 1 M NaCI-Lösung regeneriert und mit Puffer D äquilibriert. 28 ml des Eluates 3 wurden mit Puffer A 1,9-fach verdünnt und Ca-Acetat wurde zur Endkonzentration von 10 mM zugesetzt. Diese Lösung wurde wiederum durch die Anionen-Austauschersäule filtriert und mit Puffer D gespült, wobei ungebundenes Protein im Eluat (Eluat 4: 60 ml; Prothrombingehalt (ELISA) 170 ug/ml) erhalten wurde. In den einzelnen Stufen der Chromatographie wurde das Protein durch denaturierende SDS-Polyacrylamidgel-ElektrophoreSe (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970) untersucht. Fig.5 zeigt mittels SDS-PAGE die Reinigung des Prothrombinderivats. Aus der Darstellung ist ersichtlich, daß das Prothrombinderivat im Eluat 4 in reiner Form erhalten wurde. b) Aktivitätsbestimmung des Prothrombinderivats:

Alle Reinigungsstufen und Eluate wurden hinsichtlich der Gerinnungsaktivität von Prothrombin mittels Prothrombin-Zeit-Test (Quick AJ, J. Biol. Chem. 109:73, 1935 und Denson KWE et al, in Laboratory Diagnosis, Blackwell R. Scientific Publications Oxford 1976, Seite 31 Off.) untersucht. Weder im Zellkulturüberstand, den einzelnen Reinigungsstufen, noch in den Eluaten 1 - 4 konnte Prothrombinaktivität nachgewiesen werden. 13

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Beispiel 3: Gewinnung, Analyse und Aktivitätsbestimmung von wt-Thrombin und Thrombin-Asn99 a) Gewinnung von Thrombin-Asn99:

Die Gewinnung von Thrombin-Asn99 erfolgte analog zur Methode, welche in der EP-A-0 565 512 beschrieben wird, indem das Prothrombin Asn419 mittels immobilisiertem Trypsin gespalten wird.

Das nach der Aktivierungerhaltene Eluat wurde mittels denaturierender SDS-PAGE untersucht (Fig.6). Die Ergebnisse der SDS-PAGE zeigen, daß rekombinantes Prothrombinderivat in ein Thrombinderivat (Thrombin-Asn99) mit einem Molekulargewicht von 33.000 (schwere Kette) umgewandelt wurde.

Parallel dazu wird nach demselben Verfahren rekombinantes wtProthrombin zu Thrombin aktiviert. b) Analyse der Aminosäuresequenz des Thrombinderivats Thrombin Asn99

Die N-terminale Aminosäuresequenzanalyse ergab folgende zwei Sequenzen: (A) Thr-Ala-Thr-Ser-Glu-Tyr-Gln-Thr-Phe-Phe-Asn-Pro-Arg-Thr-Phe; (B) Ile-Val-Glu-Ser-Asp-Glu-Ile-Gly-Met-Ser-Pro-Trp-Gln. Die Sequenzen zeigen somit, daß das rekombinante Thrombinderivat durch Proteolyse an den authentischen Spaltstellen von Prothrombin (Arg27l-Thr272 und Arg320-Ile32l) als zweikettiges Molekül mit a-Thrombin-Struktur gewonnen wurde.

Zur besseren Veranschaulichung der räumlichen Struktur des Thrombin Asn99-Hirudin-KomplexeS zeigt Fig.12 die molekulare Struktur des katalytischen Zentrums. Die Fig. 12 zeigt den Vergleich von humanem Thrombin und dem rekombinanten Thrombinderivat Asn99. c) Die Aktivitätsbestimmung des rekombinanten Thrombin-Asn99 erfolgte nach drei voneinander unabhängigen Methoden. I. Bestimmung der Thrombinaktivität mittels chromogenem Substrat

Die Bestimmung der Thrombinaktivität mittels chromogenem Substrat erfolgte bei 25 *C in 50mM Tris/HCl-Puffer, 150 mM NaCI, 0,1 % PEG 6000, pH 8,0, mit einer Konzentration des synthetischen chromogenen Substrats von 0,2mM AcOH-DH-CHG-Ala-Arg-pNA (TH-1, Pentapharm) in einem Volumen von 1 ml. Es wurde die Absorption bei 410 nm zeitabhängig bestimmt. Als Referenz wurde Thrombinstandard mit definierter Aktivität (Immuno AG) verwendet. Die Verdünnungen der Proben erfolgte im Testpuffer mit einem Zusatz von 1 % Prionex (Collagenhydrolysat, Pentapharm).

Die Aktivitätsbestimmung ergab eine Aktivität von 0,24 nmol/min ug Protein für das rekombinante Thrombinderivat Thrombin-Asn99. Damit weist Thrombin-Asn99 lediglich eine Aktivität von 0,24 % im chromogenen Assay gegenüber dem humanen plasmatischen Thrombin auf.

Tabelle 1

Bestimmung der Thrombinaktivität mittels chromogenem Substrat Thrombinderivat spezifische Aktivität (nmol/min ug Protein) Thrombin-Asn99 0,24 rekombinantes wt-Thrombin 98,4 humanes plasmatisches Thrombin 102,0 II. Bestimmung der Aktivität unter Verwendung eines Thrombinstandards

Alle Thrombinderivate wurden bezüglich ihrer Thrombinaktivität unter Verwendung eines Thrombinstandards (Immuno AG) definierter Aktivität untersucht. In dieser Aktivitätsbestimmung wurde für das Thrombin-Asn99 keine Aktivität gefunden (Tabelle 2). 14

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Tabelle 2

Bestimmung der Aktivität unter Verwendung eines Thrombinstandards Thrombinderivat Aktivität (ΙΕ/mg Protein) Thrombin-Asn99 0 rekombinantes wt-Thrombin 1656 humanes plasmatisches Thrombin 1509,0 III. Aktivltätsbestimmung durch Titration des aktiven Zentrums

Die Titration des aktiven Zentrums der Thrombinderivate erfolgte nach der Methode von M.F. Doyle und P.E. Haley (Methods in Enzymology (1993), 222, 299-312), unter Verwendung von p-Nitrophenyl-p’-Quanidinobenzoat als Substrat und eines Extinktionskoeffizienten von 16.595 M‘1 cm"' bei 410 nm.

Humanes plasmatisches Thrombin, rekombinantes wt-Thrombin und Thrombin-Asn99 wurden mit dieser Methode auf ihren Gehalt an aktivem Zentrum (aktive Thrombinkonzentration) untersucht. Dabei konnte für Thrombin-Asn99 kein aktives Zentrum ermittelt werden (Tabelle 3).

Tabelle 3

Aktivitätsbestimmung durch Titration des aktiven Zentrums Thrombinderivat Konzentration aktives Thrombin (nmol/mg Protein) Thrombin-Asn99 0 rekombinantes wt-Thrombin 16,34 humanes plasmatisches Thrombin 16,89

Zusammenfassung: Im Unterschied zu rekombinantem wt-Thrombin und humanem plasmatischen Thrombin zeigt Thrombin-Asn99 nur in einer von drei Testmethoden eine äußerst geringe Thrombinaktivität, die ca. 1/400 der nativen Thrombinaktivität entspricht. Rekombinantes wt-Thrombin und humanes plasmatisches Thrombin zeigen sehr ähnliche Aktivitätsmuster.

Beispiel 4: Quantifizierung der Hirudinbindung des rekombinanten Thrombinderivats I. Die Bindungsfähigkeit zu Hirudin von dem Thrombinderivat Thrombin-Asn99 wurde mittels eines ELISA-Tests untersucht und mit humanem plasmatischen Thrombin und rekombinantem wt-Thrombin verglichen. Dieser ELISA-Test beruht auf der Verwendung von immobilisiertem Hirudin. Gemäß einer der Ausführungsformen dieses Tests wird Thrombin an Hirudin, welches an Mikrotiterplatten immobilisiert ist, gebunden und über Antikörper mit anschließender Farbreaktion nachgewiesen. Dieser Test ist unabhängig von der enzymatischen Aktivität des Thrombins.

Zur Herstellung der ELISA-Platten wird rekombinantes Hirudin Variante 1 (Variante 1; Firma Rhein Biotech, BRD; 2 ug/ml, 100 ul) an Mikrotitrationsplatten gebunden. Nach dem Waschen wurden rekombinantes wt-Thrombin, Thrombin Asn99 oder humanes plasmatisches Thrombin (100 ul einer Lösung mit Konzentrationen laut Fig.7) zugegeben und für eine Stunde inkubiert. Nicht-gebundenes Thrombin wurde entfernt und gebundenes Thrombin mittels Peroxidase-markier-tem anti-Thrombin-Immunglobulin (Sheep anti-human Thrombin; Enzyme Research Lab. Inc., Indiana USA; 100 ul einer ’/iooo-Verdünnung) nachgewiesen (Fig.7). Die Messung der Absorption erfolgte bei 450 nm.

Aus den Ergebnissen ist klar ersichtlich, daß sowohl rekombinantes wt-Thrombin (Fig.7B), humanes plasmatisches Thrombin (Fig. 7C), als auch Thrombin-Asn99 (Fig.7A) in identischer und konzentrationsabhängiger Weise an immobilisiertes Hirudin binden. II. Bestimmung der Bindung von Hirudin an Thrombin mittels Änderung der Fluoreszenz aromatischer Aromasäuren im Thrombinmolekül und Bestimmung der Bindungskonstante von Hirudin an Thrombinderivate. 15 ΑΤ 404 357 Β

Anhand von Fluoreszenzemissionen wurde unter Verwendung des PC-Programms ENZFITTER (RJ. Leatherbarrow, Elsevier-Biosoft, 1987) unter Zugrundelegung eines Bindungsmodells mit einer gemeinsamen Bindungsstelle die Bindungskonstante von Thrombin zu Hirudin ermittelt. Die Bestimmung der intrinsischen Fluoreszenz aromatischer Aminosäuren der Thrombinderivate erfolgte in 50mM Tris/HCl-Puffer, 150mM NaCI, 0,1 % PEG 6000, pH 7,4. Die Exitation erfolgte bei 280 nm (Spaltbreite 2,5 nm), die Emission wurde zwischen 300 nm und 400 nm (Spaltbreite 5 nm) registriert.

Die intrinsische Fluoreszenz von Tryptophan im Thrombinmolekül wurde bei 280 nm angeregt und die Emission zwischen 300 nm und 400 nm ohne Hirudinzusatz bzw. in Anwesenheit von Hirudin gemessen. Die Fluoreszenz bei 341 nm (Exitation 280 nm) von 390 nM Thrombin-Asn99, 326 nM rekombinantes wt-Thrombin und 350 nM humanes plasmatisches Thrombin wurde in Abhängigkeit der Hirudinkonzentration bestimmt.

Wieder wird das Thrombinderivat Thrombin-Asn99 mit rekombinantem wt-Thrombin und humanem plasmatischen Thrombin verglichen. Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß sich in Anwesenheit von Hirudin zu allen drei Thrombinderivaten die Fluoreszenz von Tryptophan im Thrombinmolekül (Hirudin besitzt kein Tryptophan) wesentlich erhöht (Fig.8). Dies ist offensichtlich auf die Herausbildung eines Hirudin-Thrombin-Komplexes zurückzuführen.

Dadurch kommt es offenbar zu einer strukturellen Änderung im Thrombinmolekül, die die Fluoreszenzeigenschaften von Tryptophan beeinflussen. Aus Raumstruktur-Analysen des Thrombin-Hirudin-Komplexes ist bekannt, daß insbesondere Trp 51, Trp 148 und Trp 227 aus Thrombin durch Hirudinbindung in Kontaktnähe zum Inhibitor gelangen.

Fig.8 zeigt im Vergleich die Abhängigkeit der Thrombinfluoreszenz von der Hirudinkonzentration. Für alle drei Thrombinderivate wurden sehr ähnliche Bindungen von Hirudin an Thrombin erhalten. Die Bindung von Hirudin an alle drei Thrombinderivate entspricht einer Sättigung und ergibt eine Bindungsstelle je Thrombinmolekül.

Die Daten aus Fig.8 wurden benutzt, um die Bindungskonstanten von Hirudin an die Thrombinderivate zu bestimmten (Tabelle 4). Es ist ersichtlich, daß für alle Thrombinderivate sehr ähnliche und sehr hohe Assoziationskonstanten erhalten wurden.

Tabelle 4

Bindungskonstanten von Hirudin an die Thrombinderivate Thrombinderivat Assoziationskonstante des Thrombin-Hirudin-Komplexes (M ') Thrombin-Asn99 3.7 x 107 rekombinantes wt-Thrombin 4,3 x 107 humanes plasmatisches Thrombin 3,2 x107

Beispiel 5: Rekombinantes Prothrombin als Hirudin-Antagonist

Material: Koagulometer KC 10 (Amelungen GmbH, Deutschland)

Prothrombin-freies Normalplasma (Immuno AG, Wien)

Prothrombin-Konzentrationsstandard (Immuno AG, Wien)

Rekombinantes Hirudin (Rhein Biotech, Deutschland)

In einem üblichen Laborverfahren wurde mittels eines Prothrombin-Zeit-Testes die Zeit ermittelt, die nach Aktivierung der an der Blutgerinnung beteiligten Faktoren benötigt wird, um Normalplasma zur Gerinnung zu bringen. In diesem Test wird durch Zugabe von Ca2+-lonen zur Mischung aus 1. Prothrombinfreiem Normalplasma (welches jedoch alle anderen Gerinnungsfaktoren enthält) und 2. Prothrombin-Konzentrationsstandard (Prothrombin mit definierter Aktivität) der Gerinnungsfaktor Xa gebildet, welcher dann Prothrombin (Faktor II) in Thrombin (Faktor Ha) umwandelt. Thrombin bewirkt dann die Umwandlung von löslichem Fibrinogen in unlösliches Fibrin. Dies führt zur Bildung von Blutgerinnseln. Der Zeitabstand zwischen Aktivierung mittels Zugabe der Ca2+-Ionen und der Bildung des Blutgerinnsels wird dabei automatisch durch das Koagulometer bestimmt. Bekannterweise hängt die Zeitdauer der Blutgerinnung von der Konzentration des Prothrombins bzw. der Konzentration des gebildeten aktiven Thrombins ab. Je höher die Thrombinkonzentration im Reaktionsgemisch ist, desto geringer ist die Gerinnungszeit. Bei der Zugabe eines Thrombininhibitors, wie Hirudin, kommt es nach der Umwandlung von Prothrombin in Thrombin zur Herausbildung eines inaktiven Thrombin-Hirudin-Komplexes, so daß das in diesem Komplex gebundene 16

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Thrombin sich nicht mehr an der Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin beteiligen kann. Folglich verlängert sich die Gerinnungszeit aufgrund der verringerten Menge an aktivem Thrombin. Bei einem Überschuß an Inhibitor über Thrombin kommt es zur vollständigen Hemmung der Blutgerinnung. Wird jedoch zu einem Testsystem sowohl ein Thrombin-Inhibitor wie Hirudin und eine weitere Komponente, die ihrerseits den Inhibitor bindet, aber nicht an der Blutgerinnung beteiligt ist, zugegeben, verringert sich die Wirkung des Inhibitors auf Thrombin. Dann ist die Gerinnungszeit wieder verkürzt. In Tabelle 5 sind die Ergebnisse verschiedener Untersuchungen zusammengefaßt:

Aus den Ergebnissen der Tabelle 5 geht hervor: 1. Prothrombin führt zu einer raschen Bildung des Blutgerinnsels. 2. Hirudin führt zur Hemmung der Blutgerinnung. 3. Das rekombinante Prothrombinderivat führt zu keiner Blutgerinnung. 4. Das rekombinante Prothrombinderivat führt zu keiner Beeinflussung der Blutgerinnung durch natürliches Prothrombin. 5. Durch Zugabe von rekombinantem Prothrombinderivat wird die Hirudin-abhängige Hemmung der

Blutgerinnung aufgehoben.

Tabelle 5

Komponenten im Gerinnungstest Gerinnungszeit (Sekunden) Ansatz (A) Prothrombin-freies Normalplasma 125 mU/ml (12,5 ug/ml) Prothrombin 18 Ansatz (B) Prothrombin-freies Normalplasma 125 mU/ml (12,5 ug/ml) Prothrombin 2,5 ug/ml Hirudin > 100 Ansatz (C) Prothrombin-freies Normalplasma 25 ug/ml erfindungsgemäßes Prothrombinderivat > 100 Ansatz (D) Prothrombin-freies Normalplasma 125 mU/ml (12,5 ug/ml) Prothrombin 25 ug/ml erfindungsgemäßes Prothrombinderivat 18 Ansatz (E) Prothrombin-freies Normalplasma 125 mU/ml (12,5 ug/ml) Prothrombin 25 ug/ml erfindungsgemäßes Prothrombinderivat, 2,5 ug/ml Hirudin 35

Beispiel 6: Neutralisierung von Hirudin durch Thrombin-Asn99

Zur Testung, ob Thrombin-Asn99 Hirudin neutralisieren kann und somit die Hemmung bezüglich aktivem Thrombin aufgehoben wird, wurden 50 ul Hirudin (44 nM, 4 ATU/ml) mit verschiedenen Konzentrationen an Thrombin-Asn99 für 1 Minute inkubiert. Anschließend wurden 50 ul Thrombinstandard (3.9 lE/ml), sowie chromogenes Substrat im Meßpuffer (0,2 mM Substrat It. Beispiel 3c in 50 mM Tris/HCl-Puffer, 150 mM NaCI, 0,1 % PEG 6000, pH 8,0) zugegeben und die Enzymaktivität bei 25* C bestimmt. Die Thrombinaktivität wurde bei 410 nm photometrisch bestimmt Als Vergleich wurde die Thrombinaktivität ohne Hirudin bestimmt (100 % Thrombinaktivität), sowie die Thrombinaktivität in Gegenwart von Hirudin jedoch ohne Zusatz von Thrombin-Asn99 (0 % Thrombinaktivität). Die Ergebnisse sind in Fig.9 dargestellt.

Es ist eindeutig ersichtlich, daß durch Thrombin-Asn99 Hirudin neutralisiert wird, und somit die hemmende Wirkung von Hirudin auf aktives Thrombin aufgehoben wird. Gleichzeitig wird deutlich, daß bei einem Verhältnis von 1 Mol Thrombin-Asn99 zu 1 Mol Hirudin die Thrombinhemmung neutralisiert wird. 17

AT 404 357 B

Beispiel 7: Reaktivierung des Thrombin-Hirudin-Komplexes durch Thrombin-Asn99

Ziel des Experimentes war es festzustellen, ob durch die Zu-gabe von Thrombin-Asn99 zum Thrombin-Hirudin-Komplex die Thrombinaktivität wieder zurückgewonnen werden kann, d.h., ob Thrombin-Asn99 in der Lage ist, Hirudin aus dem Thrombin-Hirudin-Komplex zu neutralisieren.

Dazu wurde photometrisch die Aktivität von Thrombin (Endkonzentration 0,1 ΙΕ/ml) mittels chromoge-nem Substrat kontinuierlich bestimmt. Nach 3 Minuten wurde Hirudin (Endkonzentration 0,1 ATU/ml) zugegeben und die Reaktion für weitere 4 Minuten fortgeführt. Danach wurden unterschiedliche Konzentrationen an Thrombin-Asn99 (Endkonzentrationen 0,2 ug/ml, 0,4 ug/ml und 1 ug/ml) zugegeben und die Reaktion photometrisch verfolgt (Fig.7).

Fig.10 zeigt, daß durch Zugabe von Hirudin zu Thrombin dessen Aktivität gehemmt wird. Aus den Ergebnissen ist weiterhin ersichtlich, daß mit Zugabe zunehmender Konzentration von Thrombin-Asn99 die inhibierende Wirkung von Hirudin auf Thrombin jedoch wieder aufgehoben werden kann.

Interessanterweise ist der Prozeß der Hirudinneutralisation zeitabhängig; es dauer ca. 1 Minute, bis Hirudin durch ThrombinAsn99 neutralisiert wird. Dies ist auf die sehr hohe Bindungskonstante von Hirudin an Thrombin zurückzuführen, dessen Gleichgewicht folglich zeitabhängig zugunsten freien Thrombins und der Herausbildung eines Hirudin-Thrombin-Asn99-Komplexes verschoben wird.

Beispiel 8: Neutralisation von Hirudin im Plasma

Ziel der Untersuchung war es zu zeigen, daß Thrombin-Asn99 in der Lage ist, auch im Plasma Hirudin zu neutralisieren und somit eine hemmende Wirkung von Hirudin auf Thrombin aufzuheben. Zur Durchführung wurde in Analogie zum aPPT-Test 110 ul hirudinisiertes Citratplasma (Hirudinkonzentration 1,8 ug/ml) mit 100 ul partiellem Thromboplastin-Reagens (Boehringer Mannheim, BRD) und 10 ul Thrombin-Asn99 (von 0-17 ug/ml It. Fig. 11) gemischt und für 3 Minuten bei 37 *C inkubiert. Anschließend wurden 100 ul 25 mM CaCl2 zugegeben und die Gerinnungszeit automatisch bestimmt (Fig. 11).

Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß durch Hirudin (ohne Zusatz an Thrombin-Asn99) die Gerinnungszeit sehr stark verlängert wird. Konzentrationsabhängig, mit zunehmender Menge an Thrombin-Asn99, verkürzt sich die Gerinnungszeit jedoch wieder, und erreicht die für Normalplasma üblichen Werte.

Aus der Darstellung ist klar ersichtlich, daß auch im Plasma Hirudin durch Thrombin-Asn99 neutralisiert wird, und somit die Hemmung von Hirudin auf plasmatisches Thrombin aufgehoben wird.

Die Gesamtheit der Untersuchungsergebnisse zeigen eindeutig, daß die hergestellte Thrombinmutante Thrombin-Asn99 entsprechend der Zielsetzung nur eine vernachlässigbar kleine Aktivität besitzt (weniger als 0,24 % von aktivem Thrombin), jedoch Hirudin in identischer Weise bindet.

Die Eigenschaft, Hirudin zu binden, befähigt das rekombinante Molekül, den Inhibitor sowohl im definierten Puffersystem, als auch im Plasma zu neutralisieren. Darüberhinaus ist Thrombin-Asn99 in der Lage, Hirudin aus dem Thrombin-Hirudin-Komplex herauszulösen und zu neutralisieren.

Beispiel 9: Gewinnung und Funktionsanalyse von Meizothrombin-Asn419 Für die Gewinnung von rekombinantem Meizothrombin-Asn419 wurde Prothrombin-Asn419 aus Beispiel 1 verwendet. Prothrombin-Asn419 wurde durch Inkubation mit der Venom-Protease Ecarin in Meizothrom-bin-Asn419 umgewandelt. Dabei wurde Prothrombin-Asn419 zu 0,2 mg/ml in 20 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,4, 150 mM NaCI, 5 mM CaCb, gelöst, und auf je 1 ug Prothrombin-Asn419 wurden 20 ng Ecarin (Produkt der Firma Pentapharm) zugegeben. Die Aktivierung erfolgte bei 4*C für 4 Stunden. Das resultierende Meizo-thrombin-Asn419 wurde in Analogie zur Reinigung von Thrombin-Asn99 (Beispiel 3) durch Affinitätschromatographie am Peptid-Gel gereinigt und isoliert

Auf diese Weise hergestelltes Meizothrombin-Asn419 besitzt das identische Molekulargewicht von Pro-thrombin-Asn419 von 72 000, und besteht aus der Prothrombin-F1/F2/A-Kette (Molekulargewicht 52 000, N-terminale Aminosäuresequenz Ala-Asn-Thr-Phe-Ieu-Gla-Gla-) und der B-Kette (Molekulargewicht 32 000, N-terminale Amino-Säuresequenz Ile-Val-Glu-Ser-Asp-Ala-Glu-Ile).

In Analogie zu den Beispielen 3 (c) I bis III wurden die enzymatischen Eigenschaften von Meizothrombin-Asn419 untersucht. In keinem der Testverfahren wurde für Meizothrombin-Asn419 eine Aktivität bestimmt.

In Analogie zu Beispiel 4 (I) und (II) konnte ermittelt werden, daß Meizothrombin-Asn419 in einer konzentrationsabhängigen Weise und mit einer Stärke vergleichbar mit humanem plasmatischen Thrombin an immobilisiertes Hirudin bindet und sich die Fluoreszenzintensität aromatischer Aminosäuren durch die Bindung an Hirudin, wie für Thrombin-Asn99 beschrieben, erhöht

In Analogie zu Beispiel 6 konnte für Meizothrombin-Asn419 gezeigt werden, daß es Hirudin neutralisiert und 18

Claims (17)

1. AT 404 357 B somit die Hemmung bezüglich Thrombin aufhebt. Bei einem Verhältnis von 1 Mol Meizothrombin-Asn419 zu 1 Mol Hirudin wird die Thrombinhemmung neutralisiert. In Analogie zu Beispiel 7 konnte für Meizothrombin-Asn419 gezeigt werden, daß durch die Zugabe von Meizothrombin-Asn419 zum Thrombin-Hirudin-Komplex das Hirudin aus dem Komplex wieder herausgelöst werden kann, und somit das Thromin seine Aktivität wiedergewinnt. Die dabei gewonnenen Daten entsprechen denen von Thrombin-Asn99. In Analogie zu Beispiel 8 konnte für Meizothrombin-Asn419 gezeigt werden, daß es in der Lage ist, im Plasma Hirudin zu neutralisieren und somit die hemmende Wirkung auf Thrombin aufzuheben. Die dabei gewonnenen Daten entsprechen denen von Thrombin-Asn99. Patentansprüche 1. Prothrombinmutante oder Derivat davon, dadurch gekennzeichnet daß es gegenüber dem natürlichen Protein eine oder mehrere Veränderungen in der Proteinsequenz aufweist, keine oder eine Aktivität von höchstens etwa 10 %, vorzugsweise von höchstens etwa 0,25 % des natürlichen Proteins aufweist und bei der die Veränderung der Proteinsequenz die Bindungskapazität zu spezifischen Liganden und Rezeptoren nicht beeinflußt.
2. 2. Prothrombinmutante oder Derivat davon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß sie eine in vivo Halbwertszeit von mehr als einer Stunde aufweist.
3. 3. Prothrombinmutante oder Derivat davon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine in vivo Halbwertzeit von maximal 10 Minuten aufweist.
4. 4. Prothrombinmutante oder Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet daß die Veränderung mindestens ein Aminosäurenaustausch ist.
5. 5. Prothrombinmutante oder Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet daß die Veränderung mindestens eine Aminosäure aus dem aktiven Zentrum betrifft.
6. 6. Prothrombinmutante oder Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Veränderung mindestens eine Aminosäure, ausgewählt aus den Aminosäuren His-363 oder Asp-419 und gegebenenfalls Cys-293 oder Cys-439, bezogen auf die Aminosäurennumerierung in Prothrombin gemäß Fig.1, betrifft.
7. 7. Prothrombinmutante oder Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure Asp-419 gegen Asn ausgetauscht ist.
8. 8. Prothrombinmutante oder Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 als Arzneimittel.
9. 9. Verwendung von Prothrombinmutanten oder Derivaten davon zur Herstellung einer Präparation zur Verhinderung von Nebeneffekten bei einer Antikoagulationsbehandlung.
10. 10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikoagulationsbehandlung mit Hirudin, Heparin, Antithrombin III und/oder deren Derivaten durchgeführt wird.
11. 11. Verwendung von Prothrombinmutanten oder Derivaten davon zur Herstellung einer Präparation, welche antagonistische Wirkung gegenüber einem natürlichen oder synthetischen Thrombininhibitor, insbesondere Hirudin, Heparin, Antithrombin III und/oder deren Derivaten, aufweist.
12. 12. Verwendung von Prothrombinmutanten und Derivaten davon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 als Antikoagulans.
13. 13. Verwendung von Prothrombinmutanten oder Derivaten davon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung einer Präparation zur Antikoagulationsbehandlung.
14. 14. Verfahren zur Herstellung von Prothrombinmutanten oder Derivaten davon nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die genetische Information für Prothrombin mutiert, vorzugswei- 19 ΑΤ 404 357 Β se punktmutiert, und in einem eukaryotischen Expressionssystem exprimiert wird und anschließend das exprimierte Derivat gewonnen wird.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das exprimierte Derivat ein mutiertes Prothrombinderivat ist und in einem weiteren Schritt durch Behandlung mit einer geeigneten Protease, wie Trypsin oder Ecarin, gespalten wird.
16. 16. Pharmazeutische Präparation enthaltend ein rekombinante Prothrombinmutante oder ein Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
17. 17. Pharmazeutische Präparation nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen frei von viralen Kontaminationen und Verunreinigungen durch Rest-DNA von der Expressionszellinie ist. Hiezu 23 Blatt Zeichnungen 20