CZ402097A3 - Deriváty prothrombinu - Google Patents

Description

Vynález se týká nových mutantů prothrombinu nebo jejich derivátů, které se mohou použít jako antagonísty jejich přirozených funkcí.

Dosavadní stav techniky

Mechanismus srážení krve normálně probíhá jednou ze dvou možných cest. Jedna z cest, tak zvaná extrinsinní krevní srážlivost, začíná uvolňováním tromboplastinu a aktivací faktoru VII. Aktivovaný faktor VII dále aktivuje faktor X, následovaný aktivací faktoru V a faktoru II (protrombin) . Faktor Ha (trombin) přeměňuje na konci procesu fibrinogen na fibrin.

Druhá cesta, tak zvaná intrinsinní krevní srážlivost, probíhá přes aktivaci faktoru XII kontaktem a navazující aktivací faktoru XI, faktoru IX a faktoru X v přítomnosti vápníku a faktoru VIII, následována aktivací faktoru II na faktor Ha, který vyvolá koagulaci štěpením fibrinogenu na fibrin. Faktor Ha proto sehrává v obou cestách procesu srážení krve ústřední roli. Proto se intenzivně zkoumaj í antikoagulační prostředky, které by bylo možné použít obzvláště při ošetřování septických šoků, při trombózách, emboliích, arterioskleroze a při srdečních infarktech, dále při krevních transfuzích nebo po operacích. Jednou metodou potlačení krevní srážlivosti je přímé podávání substancí, které inhibují trombin.

-ϊDosud se jako antikoagulační prostředky používají heparin nebo kumarin. Ty jsou ovšem relativně systemické a zvyšují riziko vnitřního krvácení. Oproti tomu hirudin je extremně specifický ve své vazbě na trombin a oproti jiným antikoagulačním prostředkům nabízí ještě další výhody. Nepotřebuje žádné endogení kofaktory, je farmakodynamicky inertní, nevykazuje žádné účinky na krevní buňky, proteiny plasmy (s výjimkou trombinu) nebo enzymy, a není na základě své malé velikosti molekuly imunogení. Hirudin se dále neukládá v orgánech a nezměněný se vylučuje močí.

Hirudin je polypeptid s jedním řetězcem, sestávající z 65 aminokyselin, který přirozeným způsobem vytváří pijavice lékařská (Hirudo medicinalis) v jejích sekretorických žlázách. Hirudin působí jako mimořádně silně vázající a velmi specifický inhibitor vůči proteáze trombin a zabraňuje srážení krve. Mechanismus účinku hirudinu jako inhibitoru trombinu je vyjasněn : C-koncová část hirudinu se váže na aninonová spojovací místa trombinu a obsazuje tak spojovací místo fibrinogenního řetězce trombinu. Navíc blokuje N-koncová část hirudinu aktivní centrum trombinu (Szyperski a spol. 1992, J.Mol.Biol. 228, 1206-1211; Fenton a spol. 1991, Blood.Coagul.Fibrinol.2 : 69-75; Rydel a spol. 1990, Science 249, 277-280; Karshikov a spol. 1992, Prot.Science 1, 727-735; Markwardt 1991, Thromb.Haemost. 66, 141-152). Z toho důvodu je již delší dobu zájem používat hirudin jako specifické antikoagulans.

Od nedávné doby je možné vyrábět velká množství hirudinu rekombinantním způsobem a používat ho pro farmakologická vyšetřování (Rigel a spol. 1993, Circl.Res. 72, 10911102; Loison a spol. 1988, Biotechnol. 6, 72-77; Zawilska

-3a spol. 1993, Thromb.Res. 69, 315-320; Klócking a spol. 1990, Blut 60, 129; Fareed a Valenga 1989, Faseb J. 3, 328; Markwardt a spol. 1988, Pharmazie 43, 202-207). Hírudin se přitom může uplatnit při mnoha klinických aplikacích : při hemodialýze, jako antikoagulační prostředek během pulmonární transluminální koronární angioplastie (PTCA), k profylaxi pooperačních tromboz, k zabránění retrombozy, při mikrovaskulární chirurgii, jako antikoagulační prostředek při hemodialýze a při extrakorporální cirukulaci, k přimíšení k trombolytikám jako příkladně k plasminogením aktivátorům a streptokináze, jako antikoagulační prostředek během operace a pro potlačení klinické srážlivosti.

Při podávání antikoagulačních prostředků je však obtížné přesné dávkování. Příkladně může potlačení trombinu v krevním oběhu způsobený hirudinem nechtěně vést ke komplikacím a krvácení, které vyžaduje okamžitou eliminaci hirudinu z oběhu (Fareed a spol. 1991, Sem.Thromb.Hemost. 17, 137-144; Brůggener a spol. 1989, Pharmazie, 44, 648-649; Fareed a Valenga 1989, FASEB J. 3, 328). Stanovení hladiny hirudinu (diferenciace volného a vázaného hirudinu) v krvi a kontrola vylučování hirudinu je ovšem možná jen nepřímo pomocí stanovení aktivity trombinu. V současné době existuje pouze možnost snižování hladiny hirudinu v krvi přirozeným vylučováním a případně pomocí dialýzy. Bylo rovněž navrhováno podávání protrombinu (Valenga a spol. Sem.

Thromb.Hemost. 15, 316, 1989), avšak přeměna protrombinu v trombin je v oběhu závislá na čase. Přebytek trombinu na druhé straně opět příznivě ovlivňuje sklon ke srážení. Nevýznamná není ani skutečnost, že hírudin tvoří s trombinem velmi silný komplex, který je těžko disociovatelný dokonce i in vitro, takže dávkování hladiny hirudinu mechanismem vytlačení dosud nebylo realistickým způsobem proveditelné.

-4Proto se podle stavu techniky intenzivně hledá použitelný antagonista hirudinu, který je možné cíleně nasadit a který nevykazuje žádné vedlejší účinky postihující srážení krve. Ačkoliv je to známým problémem výzkumu hirudinu (Markwardt F., Haemostasis 21, 11; 1991), neexistuje do dnešní doby žádné praktické řešení použitelné v lékařství.

Bylo navrženo (Brůggener a spol., Pharmazie 44, 648, 1989) provést chemickou změnu trombinu. Přitom se na trombin, který byl vyčištěn z plazmy, navázal diisopropylfluorofosfát. DIP se ukládá do aktivního centra trombinu, čímž se mění trojrozměrná struktura katalytické oblasti. Vzniklý DIP-trombin je enzymaticky inaktivní, váže ale hirudin. Diisopropylfluorofosfát je ovšem mimořádně jedovatý a nebezpečný. V důsledku nepříliš stabilní vazby DIP na trombin může DIP snadno oddisociovat. Komplex DIPtrombin rozpadající se in vivo je proto pro použití v klinické oblasti zcela nevhodný.

Ve VO 93/15757 se navrhují intermediáty protrombinu jako antidota k hirudinu. Tyto produkty jsou ovšem zatíženy obvyklým nebezpečím, které se obecně týká přípravků získaných z plasmy, příkladně kontaminací humanopatogeními viry.

Vedle použití heparinu, kumarinu a hirudinu k zabránění srážení krve jsou rovněž také známy syntetické inhibitory trombinu jako NAPAP (Na-(2-naftylsulforyl-glycyl)D,L-amidinofenylalanin-peptid) nebo PPACK (D-Phe-Pro-ArgCHC1). Dále bylo mezi jiným zjištěno, že je možné přímo jako antikoagulační prostředky použít modifikované proteiny, jako příkladně inaktivované koagulačni faktory. Zvláštním problémem přitom je, že modifikovný protein by in vivo mohl

-5• ·· ·· « · · «· • · # · ·«·· · · · · • ♦» ♦ · · · · · · · · • · · · · · · být případně odstraňován z krve rychlej i, než protein divokého typu. Koagulační proces, zahrnující spolupůsobení intrinsinní a extrinsinní sekvence srážení krve a receptory na povrchu buněk je velmi komplexní. Inaktivovaný koagulační faktor použitelný in vivo pro terapii nebo profylaxi by se proto neměl kromě jeho silně redukované nebo zcela inhibované koagulační aktivity odlišovat v žádné z dalších podstatných vlastností, jako je příkladně kapacita vázání λ receptorů. Požadovaný poločas in vivo ínaktivního proteinu by byl takový, který by odpovídal poločasu aktivního koagulačního faktoru nebo byl dokonce vyšší. Protože obzvláště trombin má velmi krátký poločas in vivo, vytlačil by inaktivní koagulační faktor s prodlouženým poločasem aktivní protein, příkladně trombin, při kompetitivním útlumu posíleném jeho receptorem. To by mělo výhodu, že k účinnému antikoagulačnímu působení ínaktivního proteinu by se musely podávat jen relativně malé dávky.

Předložený vynálezu si proto klade za úkol, dát k dispozici lékařsky použitelný antagonist hirudinu, který v podstatě nevykazuje žádnou enzymatickou aktivitu, která by podporovala srážení krve.

Další úkol předloženého vynálezu spočívá v tom, že bude dán k dispozici inaktivní koagulační faktor, který se v podstatných vlastnostech, jako je příkladně kapacita vázání receptorů, neodlišuje od přirozených proteinů a který . má případně zvýšený poločas in vivo.

Podstata vynálezu

Tento úkol se podle vynálezu řeší novými mutanty protrombinu nebo jejich deriváty, které oproti přirozeným pro-

• 4 4	• ·	• 0 ·	4· • 4	4 4
4 4 4 4	4	•	4,
• · 4 4 4	•	♦	• ♦	44 4	4	♦
• 4	•	•	•	4	4	4
• · · · ·		4 4	4 4 4	4 4		« 4

teinům vykazují jednu nebo několik změn v sekvenci proteinů, jsou buďto inaktivní nebo vykazují aktivitu nejvýše 10 % s výhodou nejvýše asi 0,25 % přirozeného proteinu a u nichž změna sekvence proteinů neovlivňuje vaznou kapacitu ke specifickým trombinovým ligandům a receptorům, jako přirozené a syntetické antikoagulační prostředky. Mutanty protrombinu podle vynálezu nebo jejich deriváty se kromě silně nebo úplně redukované koagulační aktivity a případně změněného poločasu in vivo funkčně neodlišují od jejich přirozeně se vyskytujících proteinů.

Jako mutované mutanty protrombinu nebo jejich deriváty se v rámci předloženého vynálezu rozumí veškeré proteiny, odvoditelné od proteinové sekvence protrombinu, které vykazují podstatné vazné determinanty trombinu, které jsou nutné k vazbě na trombinové specifické, přirozené i syntetické koagulační prostředky. Neměla by se tedy struktura mutantů protrombinu ve srovnání s proteinem divokého typu případně s jeho proteolytickými deriváty mutací pokud možno ne příliš silně měnit, aby byla zajištěna optimální vazba k ligandům, obzvláště k přirozeným ligandům.

Proto je podstatným předpokladem pro mutanty a deriváty podle vynálezu, aby změna proteinové sekvence neovlivnila vaznou kapacitu ke specifickým trombinovým ligandům a receptorům, jako přirozené a syntetické antikoagulační prostředky.

Je třeba vycházet z toho, že mutanty případně deriváty podle vynálezu musí vykazovat vaznou kapacitu nejméně 80 % vazné kapacity přirozeného trombinu, takže vazná kapacita může být považována za nezměněnou. Také mutanty případně deriváty, které vykazují vyšší vaznou kapacitu než přirozený trombin, spadají samozřejmě do předloženého vynálezu.

-Ί • ·· ·· · ·· * · ♦ · · ♦ 9 9 99 9 9 99 • · · · · · ···«

99999 9 9 « ····« • 9 9 9 9 9 99

999 99 99 999 9999

Míra vazné kapacity se může analyzovat každou vhodnou metodou, příkladně kompetitivní analýzou antikoagulačních prostředků mezi mutanty případně deriváty a přirozeným trombinem (Gan a spol., 1993), vyšetřováním vazné aktivity oproti umělým inhibitorům (příkladně s DAPA (=Dansylarginin-N-(3-ethyl-l,5-pentadiyl)-amid), a spol., J. Biol. Chem. 266: 9598, 1991) nebo pomocí vyšetření vazné afinity na » imobilizovaném přirozeném a syntetickém antikoagulačním prostředku případně inhibitoru.

V případě posledně jmenovaného postupu se přirozený syntetický antikoagulační prostředek případně inhibitor imobilizuje na pevné matrici, vyšetřovaný derivát ve vzorku obsahuj ícím určité množství se uvede v kontakt s přirozeným a syntetickým antikoagulačním prostředkem případně inhibitorem, stanoví se množství vázaných mutantů případně derivátů a výsledky se relativizují paralelním stanovením s přirozeným trombinem.

Mutanty případně deriváty podle vynálezu maj i být s výhodou zcela inaktivní, to znamená, že nemají vykazovat žádnou trombinovou aktivitu nebo analogickou trombinovou aktivitu. S úspěchem se však podle vynálezu mohou používat rovněž deriváty s ještě menší aktivitou, neboř aktivita nejvýše 10 %, obzvláště nejvíce asi 0,25 % přirozeného trombinu nevede obecně při podávání derivátů podle vynálezu « k nežádoucím vedlejším účinkům, jako je příkladně sklon ke srážlivosti.

Mutanty případně deriváty podle vynálezu se dále vyznačují tím, že mohou tvořit komplex s hirudinem a jsou tak schopné hirudin neutralizovat. Dále mohou disociovat

komplex, který sestává z plazmatického nebo rekombinantního wt-trombinu s hirudinem a tím komplexně vázat uvolněný hirudin. Z toho kromě toho vyplývá, že uvolněný plazmatický nebo rekombinantní divoký typ (wt) - trombin je znovu aktivní a může splňovat svou úlohu při srážení krve. Toto je také podle vynálezu nutným parametrem pro terapeutické nasazení trombinu.

Výhodné formy provedení mutantů, případně derivátů podle vynálezu vykazuj í poločas in vivo více než j ednu hodinu.

Dále výhodné formy provedení vykazuj í poločas in vivo nejvýše deset minut.

Změna sekvence aminokyselin může spočívat ve výměně jedné nebo více aminokyselin, může také ale spočívat v deleci, s výhodou v deleci, která odpovídá postupu procesování při aktivaci protrombinu nebo v inzerci, pokud se těmito změnami parametrů podstatných podle vynálezu dosáhne ativity nejvýše 10 %, obzvláště nejvýše 0,25 % přirozeného trombinu a delece vazby na ligandy a receptory trombinu. Pojem derivát zahrnuje nejen mutací změněné proteiny, nýbrž také procesované mutované proteiny. K výměně amminokyselin jsou jako zaváděné aminokyseliny vhodné nejlépe takové, které prostorovou strukturu proteinu ovlivní co nejméně. To jsou buď velmi malé aminokyseliny, jako alanin nebo aminokyseliny, které jsou původní aminokyselině velmi podobné a odlišují se od ní pouze funkční skupinou, příkladně asparagin a kyselina asparagová.

Parametry podle vynálezu dělají ze zmíněných mutantů nebo derivátů ideální antagonisty inhibitorů trombinu,

-9• ·· ·· · ·· ·· • · · · · · · · · · · φ • ··· · · · * · ··· · · * · ♦ · · ··· • ·· · · w· · · · «« · · protože nevykazují zmíněné nevýhody podle stavu techniky, totiž nežádoucí srážecí aktivitu, toxicitu nebo chybějící účinnost, případně specifičnost.

Protože deriváty případně mutanty podle vynálezu jsou inaktivní, případně vykazují nejvýše aktivitu asi 10 %, obzvláště nejvýše asi 0,25 % přirozeného trombinu (čímž se trombinová aktivita in vivo mutantů, případně derivátů sníží ještě o něco pod těchto 0,25 %), nemohou potom tyto mutanty případně deriváty vést k nežádoucím účinkům srážení dokonce ani tehdy, jsou-li podány v nadměrných dávkách.

U mutantů případně derivátů podle vynálezu nelze očekávat toxické účinky, protože se téměř nerozlišují od přirozených proteinů a proto mohou být normálním způsobem metabolizovány.

Mutanty nebo deriváty podle vynálezu jsou jako antanisté vysoce účinné a vysoce specifické, protože jejich vazné determinanty jsou oproti přirozeným a syntetickým inhibitorůmů v podstatě nezměněné a odpovídají vazným determinantům přirozeného trombinu.

Výhodné změny proteinové sekvence se týkaj í aminokylin z aktivního centra molekul protrombinu, meizotrombinu nebo trombinu, obzvláště aminokyseliny His-363 a Asp-419, vztaženo na číslování aminokyselin v humánním protrombinu podle obrázku 1 ( číslování aminokyselin se provádí obecně podle obrázku 1, ve kterém j e zobrazena sekvence cDNA a sekvence aminokyselin protrombinu. Místa štěpení faktoru Xa jsou zobrazena v sekvenci cDNA, takže se může odvodit sekvence cDNA a aminokyselin trombinu. Číslování začíná první aminokyselinou zralého protrombinu po odštěpení vodicí

-10·· ·· • « « «

sekvence a propeptidu. Sekvence cDNA protrombinu se opakuje v SEQ.ID.NO.8, sekvence aminokyselin v SEQ.ID.NO.9).

Obzvláště aminokyselina kyselina asparagová-419 (Asp-419) nemá k vázanému hirudinu blízký kontakt a proto je výměna této aminokyseliny v rámci předloženého vynálezu obzvláště výhodná.

Dále jsou rovněž výhodné změny, které se týkají cysteinových zbytků Cys-293 a Cys-439, vztaženo na číslování aminokyselin v protrombinu podle obrázku 1. Tyto mutace umožňují tvorbu derivátu trombinu s jedním řetězcem (protože je zabráněno tvorbě sirných můstků mezi řetězcem B a řetězcem A), který nakonec nevykazuje přes schopnost vazby na hirudin enzymatickou aktivitu (protože chybí řetězec A). V tomto případě se jako partneři výměny nabízejí aminokyseliny serin a alanin.

Protože všechny tyto vybrané deriváty vykazují mutace, které se týkaj í bezprostředně katalytického centra případně disulfidových můstků důležitých pro funkci trombinu, jsou inaktivní. Jak se dá zjistit podle strukturních dat (Rydel a spol,. 1990), nezasahují tyto aminokyseliny ani oblasti, které se týkají vazby přirozených a syntetických inhibitorů, obzvláště hirudinu.

Vynález se proto týká s výhodou mutantů nebo derivátů protrombinu, u nichž byla změněna nejméně jedna aminokyselina, vybraná z His-363 nebo Asp-419 a případně Cys-293 nebo Cys 439, obzvláště mutanty Asp-419.

Zcela mimořádně výhodná forma provedení mutantů případně derivátů podle vynálezu se týká mutantů případně

-11• · · · · ♦ · · ·· »··· ··»· · * · * • · · » * · ···· • ····« ♦ · · ·«· · · • · · · · ··· • · ♦ *· · · *· · tt ·· derivátů, u kterých je aminokyselina Asp-419 vyměněna za Asn.

Ukázalo se, že tato varianta je inaktivní, dokonce oproti umělému substrátu AcOH-H-D-CHG-Ala-Arg-pNA vykazuje zbytkovou aktivitu pouze asi 0,25 %, takže v žádném případě nelze očekávat vedlejší efekty aktivizace srážlivosti. Dále se vazná kapacita tohoto derivátu příkladně oproti hirudinu neodlišuje od přirozeného trombinu, protože strukturní změny, které s sebou přinese výměna Asp za Asn jsou velmi nepatrné a navíc se nacházej í v oblasti proteinu neovlivňuj ící vazbu k přirozeným a syntetickým inhibitorům, obzvláště hirudinu.

Mutované protrombiny odpovídající stavu techniky byly sice již popsány, avšak deriváty, které by vykazovaly požadované vlastnosti ještě nebyly zveřejněny. Jsou to ale právě ty vlastnosti, které činí použití derivátů protrombinu, meizotrombinu a trombinu podle vynálezu tak výhodné.

Příkladně byla popsána řada genetických defektů, které se týkaj í protrombinu a z něj vznikaj ícího trombinu s bodovými mutacemi, přičemž rozdílné mutanty vykazují významně sníženou aktivitu srážení krve (Henriksen R.A,. Methods in Enzymology, Vol. 222, 312 (1939). Tyto mutace se ale vždy týkají změn, u nichž se ještě vždy zjistí určitá, i když redukovaná, trombinová aktivita (zvláště oproti umělým substrátům). Tato zbytková aktivita ale pravděpodobně umožňuje přežívání osob s těmito defekty, z čehož se dá vyvodit, že mutace, která by vedla ke zcela inaktivnímu trombinu, pravděpodobně není schopná přežití.

-12• <· ·

Dále byly provedeny in vitro bodové mutace v protrombinové a trombinové sekvenci k provedení strukturní a funkční analýzy:

Příkladně byl mutován serin-528 v aktivním centru bovinního protrombinu (stejného významu se serin-525 v odpovídajícím humánním protrombinu) na alanin. S takto mutovaným protrombinem byly dále provedeny základní vědecké pokusy ke studiu vlivu těchto mutací na expresi, gamakarboxylaci a aktivaci protrombinu.

Ze strukturní analýzy komplexu trombin-hirudin vyplývá, že také aminokyseliny z aktivního centra trombinu slabě přispívají ke tvorbě komplexu. Tak může obzvláště Ser-525 v humánním protrombinu vytvářet vodíkové můstky k N-terminálním aminokyselinám hirudinu a nacházet se v průměru 3,2 A od N-konce hirudinu. Tím přispívá Ser-525 evidentně k tvorbě hirudinu (Rydel a spol., Science 249, 277, 1990).

Dále bylo zjištěno, že bovinní varianta Ser-528 vykazuje oproti DAPA jen 74 %-ní vaznou kapacitu ve srovnání s přirozeným trombinem. To potvrzuje předpoklad, že tento zbytek šeřinu leží bezprostředně ve vazném determinantu DAPA, případně hirudinu. Proto nesplňují mutace, které se týkají pouze pozice Ser-528 v bovinním protrombinu, případně pozice Ser-525 v humánním protrombinu požadavek dostatečné vazné kapacity v inhibitoru.

Dále byly vyrobeny fragmenty trombinu s většími delecemi (Gan a spol., Arch. Biochem. Biophys. 1993, 301, 228). Byl získán produkt odbourání trombinu, zěta-trombin, který vykazuje aminokyseliny 469-579 aIfa-trombinové sekvence. Pro studie funkce byly mutovány aminokyseliny arginin-517

• «·	• ·		9	• ·	99
• · ·	•	•	• 9	• ·	•
• · · · ♦	•		•	« ···	9
9 9	9	•	9	9	9
·· 99	• ·		9 9 ·	99	9 9

proti glutaminu, kyselina asparagová-519 (proti glutaminu) , případně serin-525 (proti alaninu) a přitom byla u jednotlivých mutantů zjištěna menší aktivita než u trombinu divokého typu. Vazná schopnost hirudinu zůstala u některých zěta-trombinů zachována pouze částečně. Přitom vykazoval mutant Ser-525-Ala sice nižší enzymatickou aktivitu a nej lepší výsledky ve vztahu k vázání hirudinu, vazná kapacita však také při těchto šetřeních ležela výrazně pod • vaznou kapacitou přirozeného trombinu. Sice se ukázalo, že fragmenty trombinu v kompetitivních studiích vaznosti konku- • tují rozdílnou silou vazbě trombin-hirudin a absolutní údaj schopnosti vazby fragmentů na hirudin nebyl získán, výsledky však jasně ukázaly, že vazná kapacita oproti hirudinu byla mutací výrazně snížena.

Tyto zěta-trombiny proto nejsou vhodné pro úkol, který je podstatou vynálezu : ve srovnání s trombiny divokého typu jsou velmi silně změněny a nemůže být zaručena optimální vazba k přirozeným ligandům.

S deriváty protrombínu případně trombinu popsanými podle stavu techniky proto nemohou být splněny požadované parametry.

V těchto citacích nelze také nalézt žádné údaje o terapeutických nebo diagnostických možnostech použití těchto mutantů (derivátů) protrombínu nebo fragmentů zéta trombinu.

Proto se předložený vynález podle dalšího aspektu týká použití mutantů nebo derivátů protrombínu jako léčiva, obzvláště k výrobě lékařských preparátů k zabránění vedlejších efektů při antikoagulačním ošetřování nebo jako diagnostika.

-14• ·· ·· ·· · · · ♦ • · · ·· • · ··« · · • · · · «♦· «· ··

Toto použití podle vynálezu mutantů případně derivátů je obzvláště výhodné při antikoagulačním ošetřování hirudinem, heparinem, antitrombinem III a/nebo jejich deriváty a syntetickými inhibitory.

Lékařské ošetřování podle vynálezu proto zahrnuje podávání účinné dávky mutantů protrombinu nebo jeho derivátů pacientům, s výhodou intravenosním podáním. Účinná dávka se řídí individuálně pro jednotlivé případy a měla by se s výhodou optimalizovat za použití výsledků získaných stanovením trombinu a/nebo hirudinu.

Při použití podle vynálezu se přirozeně s výhodou použijí mutanty protrombinu případně deriváty protrombinu s vlastnostmi podle vynálezu týkajícími se chybějící trombinové aktivity a dostatečné vazné kapacity, za určitých podmínek jsou ale také použitelné známé deriváty, obzvláště takové, které jsou výrazně inaktivní, jako příkladně analog k výše popsanému bovinnímu mutantu Ser-528 (případně jeho trombinový derivát), přičemž se ale musí zohlednit nedostatek zhoršené vazné kapacity.

Je všeobecně známo, že poločas proteinů in vivo v krevním oběhu se ovlivňuje glykosylací. Proteiny z buněk savců se přitom mohou vyskytovat v glykosylované podobě přes aminokyselinové boční řetězce asparaginu (N-glykosylace) a serin/threoninu (O-glykosylace), lokalizovanými na povrchu proteinu. Přitom se glykosylací cirkulujících proteinů dosáhne zhoršení vylučování z krevního oběhu, to znamená prodloužení poločasu. Rekombinantní proteiny vyrobené manipulací buněk savců přirozeně obsahují glykosylace obvyklé a přirozené pro savce a odpovídaj í tím povrchové

-15• ·· ·· ··· ·· ···· ········ ♦ ♦···· · · ·« • ····· · · ' ···· · • · · · ·· · · ··· ·· ·· ···«· ·· struktuře odpovídajících humánních proteinů.

Mutacemi aminokyselin umístěných na povrchu proteinu, jako příkladně asparagin (Asn), případně serin (Ser) nebo Thereonin (Thr) na jiné aminokyseliny nebo delecí jedné z těchto aminokyselin může být příkladně zrušena nativní glykosylace. Je známo, že slabě glykosylované nebo neglykosylované proteiny se z oběhu vylučuj i rychlej i, to znamená, že jejich poločas je zkrácen.

Naproti tomu se může mutací a výměnou aminokyselin jednotlivých aminokyselin umístěných na povrchu proteinu za příkladně asparagin zvýšit počet glykosylačních míst molekuly proteinu a tím také prodloužit poločas in vivo. V závislosti na počtu mutovaných, deletovaných nebo dodatečně zavedených asparaginových zbytků v proteinu se tím případně může měnit poločas.

Pro použití podle vynálezu mutantů nebo derivátů protrombinu jako antagonistů proti inhibitorům trombinu jsou vhodné obzvláště takové mutanty, u nichž se mutací zkrátí poločas proteinu. S výhodou se proto jako antagonlsty použijí takové mutanty, které mají poločas nejvýše 10 minut.

Lékařské použiti podle vynálezu mutovaných mutantů, případně derivátů protrombinu zahrnuje také jejich použití jako antikoagulační prostředky kompetitivním tlumením trombinu, případně jako antagonisté jeho přirozených funkcí. To umožňuje v lékařství řídit srážení krve téměř přirozeným produktem.

Na základně parametrů podle vynálezu a nezměněné vazné kapacity pro specifické receptory a ligandy se mutanty pro-16-

• ·· ·· · ·	• · * ·	♦ • ·	• · • ·	• · • t
• · · · ·	• ♦	•	• ···	•	•
• ·	• ·	•	•	•	•
··· ·♦	• ·	·· ·	• ·	• ·

trombinu nebo jejich deriváty hodí obzvláště jako antikoagulační prostředky in vivo.

Pro použití podle vynálezu mutantů protrombinu nebo jeho derivátů jako antikoagulační prostředky jsou obzvláště vhodné takové mutanty, u nichž je cílenou výměnou aminokyselin zvýšen poločas proteinu. S výhodou se proto jako antikoagulační prostředky použijí takové inaktivní mutanty, které vykazují poločas vyšší než 1 hodina.

Při použití mutantů protrombinu podle vynálezu jako antikoagulační prostředky se tyto pro aplikaci, stejně jako u přirozeného proteinu procesuj í in vivo na inaktivní trombin, který je potom schopen vytlačit aktivní trombin, vyskytující se v krvi, z jeho receptorů. Mutanty protrombinu se případně mohou také aktivovat in vitro na odpovídaj ící trombinové nebo meizotrombinové mutanty a aktivovanou formu použít přímo pro podávání pacientům. Podle dávkování mutantů protrombinu podle vynálezu nebo jejich derivátů v léčivu se může zpomalit nebo úplně zastavit srážení krve in vivo. Používání mutantů protrombinu nebo jejich derivátů, které se vyznačují zvýšeným poločasem in vivo má zvláštní výhodu, že tyto cirkulují v krvi podstatně déle než jejich přirozené proteiny a mohou proto efektivně ovlivňovat srážení krve. Navíc se může k dosažení efektivního antikoagulačního účinku případně také odpovídajícím způsobem redukovat množství terapeuticky podaného proteinu.

Pro použití in vivo mutantů protrombinu nebo jejich derivátů podle vynálezu jako antikoagulační prostředek se neočekávají toxické vedlejší efekty, protože jsou in vivo normálně metabolizovány způsobem odpovídajícím jejich

-17přirozeným proteinům.

Mutované deriváty protrombinu podle vynálezu se s výhodou vyrábějí za použití rekombinantních DNA-technik. Proto se týká vynález také způsobu výroby mutantů případně derivátů protrombinu, u kterých je mutována genetická informace protrombinu, s výhodou bodově mutována a exprimuje se v eukaryotickém expresním systému a následně se získá exprimovaný derivát.

S výhodou se přitom využije humánní sekvence.

Exprese v eukaryotickém systému poskytuje na rozdíl od bakteriálního systému výhodu, že se provádějí také posttranslační modifikace jako glykosylace a karboxylace a tím je exprimovaný protein vhodnější k použití pro člověka.

K získání peptidů podle Gan a spol. se exprimují mutované sekvenční části trombinu v E.coli a rekombinantní peptidy se in vitro uměle opatří sirným můstky. Výtěžek exprimovaných a k pokusům vhodných struktur podobných trombinu byl tomu přiměřeně velmi nízký. Ztráta aktivity trombinu může být způsobena absencí velkých částí trombinové sekvence stejně jako provedenými mutacemi.

Exprese v E.coli jak ji popisuje Gan a spol. není vhodná pro proteiny s vlastnostmi podle vynálezu, protože tento expresní systém neprovádí žádné glykosylace a také skladba exprimovaných proteinů neodpovídá fyziologické struktuře. Podle vynálezu by se ale měly provádět pokud možno malé změny v derivátech ve srovnání s divokým typem trombinu. Pro studie funkčností podle Gan a spol. ale nebylo důležité, že exprimované zět«-trombiny na jedné

-18straně nevykazují žádné uhlohydráty (jediné glykosylační místo ve fyziologickém trombinu (asparagin-553) chybí) a skladba peptidu in vitro se provádí komplikovaným způsobem. Tímto způsobem se dosáhlo jen nepatrných výtěžků.

Při způsobu podle předloženého vynálezu se s výhodou bodově mutuje cDNA-sekvence humánního protrombinu nebo cDNA-sekvence humánního trombinu, čímž se provede výměna nejméně jedné aminokyseliny v sekvenci aminokyselin. V případě protrombinu se místo mutace podle vynálezu nalézá v oblasti sekvence protrombinu, která pro aktivaci protrombinu leží v sekvenci trombinu.

S výhodou se mutované deriváty protrombinu exprimuji za řízení SV40-promotory v CHO-DUXS Bll-v buňkách (Urlaub a Chasin, Proč. nati. acad. sci. USA 77, 4216, 1980). Exprese se ale může provádět každým běžným expresním systémem, jako jsou kvasinky, permanentní buněčné linie nebo virové expresní systémy, a s každou libovolnou buněčnou linií, která zaručí, aby se protein správně procesoval a secernoval v jeho funkční formě. Ke správnému procesování derivátů nepatří pouze úplná glykosylace, nýbrž také úplná gama-karboxyláce. K běžným eukaryotickým expresním systémům patří kvasinky, permanentní buněčné linie (které se získají buď stabilní integrací cizí DNA do chromozomů hostitelské buňky, příkladně Věro, MRC5, CHO, BHK, 293, SK-Hepl, obzvláště buňky jater a ledvin, nebo ale použitím vektoru permanentně přenášeného v episomálním stavu, příkladně vektorů, které se odvozují od viru Papilloma a příkladně rostou v buňkách C-127), nebo virové expresní systémy jako Vaccinia-Virus, Baculovirus, nebo retrovirové systémy jako buněčné linie se mohou obecně použít Věro, MRC5, CHO, BHK, 293, SK-Hepl, obzvláště buňky jater a ledvin.

-19V návaznosti na získáváni exprimovaných derivátů se pak mohou provádět ještě další zpracovací kroky. Jednou možností při dalším zpracování mutantů, případně derivátů protrombinu je procesní krok, při kterém se derivát protrombinu štěpí pomocí proteázy hadího jedu (Venom) na analoga meizotrombinu. Tato analoga meízotrombinu jsou potom rovněž použitelná jako antagonisté k přirozeným funkcím trombinu, nevykazují ale žádnou enzymatickou aktivitu trombinu. Přitom jsou použitelné všechny způsoby známé z literatury.

Dále se může získaný derivát protrombinu štěpit pomocí trypsinu, s výhodou imobilizovaného trypsinu na derivát trombinu. Může se ale přirozeně použít každá obvyklá metoda ke štěpení protrombinu na trombin, tedy také taková, která vyžaduje další vhodné proteázy, příkladně s hadím jedem z E.carinatue (Ecarin) nebo z O.scvutellatus.

Deriváty podle vynálezu se k přípravě preparátů zpracují buď s fyziologickým roztokem soli a případně se lyofilizují nebo se lyofilizují v destilované vodě a před podáváním se rekonstituují s fyziologickým roztokem. Alternativně k tomu se ale mohou přípravky připravovat také v jiných obvyklých roztocích a/nebo s farmaceutickými nosnými nebo pomocnými látkami k použití.

Podle vynálezu jsou preparáty připraveny pro parenterálnl podávání, to znamená ve vhodné formě pro subkutánní, intramuskulární nebo intravenozní podávání.

Další nezanedbatelná výhoda přípravků podle vynálezu spočívá v tom, že na základě jejich výroby nejsou konta-20• ·· ·♦ · ·· ·· • · · · · · · · · · · · • · · ·· · ···· • ····· · · · ··· · · • · · · · ··· •·· · · ·· ··· ·· ·· minovány viry. Přípravky se mohou před jejich uvolněním pro lékařské účely vyšetřit na možné znečištění zbytkovými nukleinovými kyselinami expresní buněčné linie mimořádně citlivou metodou PCR (popsanou příkladně v rakouské patentové přihlášce A 1830/94) a v případě potřeby opakovaně přečistit.

Deriváty podle vynálezu se na konec musí přezkoumat na jejích schopnost vázat jejich přirozené ligandy. V rámci předloženého vynálezu proto byl vypracován testovací systém pomocí kterého se jednoduchým a reprodukovatelným způsobem kvalitativně a kvantitativně analyzuje vazná kapacita (pro)-trombinových derivátů vůči hirudinu nebo derivátům hirudinu. Tento testovací systém sestává z matrice, na níž je vázán přirozený nebo rekombinantní hirudin, jeho deriváty nebo peptidy. Na tomto zmobilizovaném hirudinu se váže derivát podle vynálezu a může se dokázat navazující detekční reakcí.

Proto se vynález týká také pevné matrice, na kterou se váže přirozený nebo rekombinantní hirudin, jeho deriváty nebo peptidy, a jeho použití při stanovení trombinu nebo derivátů trombinu. Stanovení může zahrnovat jak kvantifikaci , tak i stanovení vazné kapacity trombinu nebo derivátů trombinu.

Jako pevná matrice se podle vynálezu rozumí každá pevná fáze, na které může být účinně imobilizován přírodní a syntetický inhibitor, příkladně přirozené polymery jako celulóza, škrob, dextran, alginát, agarosa, kolagen, obzvláště v imobilizačních technologiích široce používané materiály na základě sefarosy, případně celulózy, syntetické polymery, jako polyakrylamid, polyvinylalkohol, methylakry-21• ·· ·· · ·· ·· ·· « · ·*·* * · · · ····· · · · ···· · • · · · · · · ··· ·· ·· ··« ·· ·· lát, nylon nebo oxirany, které se mohou snadno zpracovávat na přípravky se snadným použitím, jako příkladně mikrotitrační desky, a konečně anorganické materiály, jako porézní skla, silikagel a tak dále (viz také Rómpp-Lexikon der Biotechnologie, stránky 385 a další).

S přípravkem podle vynálezu se může provádět jednoduché a přesné stanovení koncentrace trombinu, případně derivátů trombinu, přičemž se může stanovit nejen aktivní trombin sám, ale i enzymaticky inaktivní nebo jen slabě aktivní protrombin nebo trombin a jejich deriváty. Dále se může přípravek podle vynálezu také na základě jeho snadného použití použít nepřímo ke stanovení koncentrace daných substancí, kteé váží trombin, jako inhibitorů trombinu, ale obzvláště hirudinu. Navíc je pomocí přípravku podle vynálezu také možné provést stanovení vazné síly trombinu nebo derivátů trombinu na příslušné vyšetřované přirozené nebo syntetické inhibitory.

Jako trombin nebo deriváty trombinu se v rámci předloženého vynálezu rozumí veškeré proteiny odvoditelné od proteinové sekvence protrombinu, obzvláště výše popsané mutované deriváty trombinu, meizotrombinu nebo protrombinu. Přitom ale může být derivát změněn také na vazných determinantech, pokud tyto změny nevylučují vazbu na přirozené a syntetické inhibitory. Trombinové deriváty se mohou odlišovat od přirozeného trombinu jedno- nebo vícebodovými delečními nebo inzertními mutacemi. Deriváty protrombinu, meizotrombin a jeho deriváty se mohou rovněž stanovit přípravkem podle vynálezu a jsou - pokud se týká stanovení samotného - v rámci předloženého vynálezu posuzovány rovněž jako deriváty trombinu.

-22K vlastní kvantifikaci trombinu, derivátů trombinu a/nebo hírudinu nebo derivátů hirudinu je podle vynálezu k dispozici testovací souprava, která obsahuje přípravek podle vynálezu a jeden nebo několik zásobníků s reagenciemi pro specifické detekční reakce, s výhodou pro specifické detek- ční reakce derivátů trombinu. Přitom se jako specifická detekční reakce rozumí každá vhodná detekční reakce, ob- zvláště takové reakce, které probíhají s barevnými látkami (peroxidáza, alkalické fosfatázy, luminiscenční reakce, biotin, avidin nebo biotin-streptavidin (jako zesilovací systémy)) nebo metody radioaktivního stanovení.

S výhodou se při stanovení koncentrace dává přednost před radioaktivní metodou barevné reakci, která je jednodušší v zacházení. Ve zvláštním případě se pro vynález používají peroxidem maskované ovčí antitrombinové protilátky a běžné roztoky substrátů k barevné reakci pro reakce peroxidáz.

Testovací souprava podle vynálezu obsahuje dále zásobník s fyziologickým pufrovacím roztokem obsahuj ícím nosný protein, čímž se značně zlepší reprodukovatelnost kvantifikace.

Specifická detekční reakce v rámci testovací soupravy podle vynálezu je s výhodou značkovaná substance která váže trombin, protože v klinice je stanovení trombinu oproti dalším stanovitelným složkám často mimořádně důležité. Podle stavu techniky je známo velké množství značkovaných substancí vážících trombin. Podle vynálezu se s výhodou použijí polyklonální nebo monoklonální protilátky proti trombinu, značkované barvivém. Detekci pomocí chromogeních

-23substancí se často dává přednost před radioaktivními metodami stanovení, protože reakce s barvivý s sebou nepřináší žádnou radioaktivní kontaminaci a přísná bezpečnostní opatření při práci s radioaktivním materiálem způsobují, že radioaktivní metody stanovení jsou často velmi nepraktické.

Způsob detekce se může provádět procesními kroky běžnými v chemii proteinů. Ke stanovení koncentrace trombinu nebo derivátů trombinu se inkubuje trombinový roztok s pevnou matricí pojenou s hirudinem po dobu 15 minut až 16 hodin, s výhodou mezi 45 minutami a 4 hodinami. Reakce se obvykle provádí ve fyziologickém pufru, s výhodou v pufru Tris-HCl. Zvláštní výhodou je, jestliže se k fyziologickému solnému pufru přidá nosný protein, příkladně albumin.

Při výhodné formě provedení testovací souprava podle vynálezu zahrnuje dále referenční roztok obsahující trombin, který umožňuje zhotovení spolehlivé cejchovací přímky pro testovací systém.

Podle dalšího aspektu se vynález týká způsobu kvantifikace trombinu nebo derivátů trombinu, který se vyznačuje následuj ícími kroky :

inkubace roztoku, který obsahuje kvantifikované množství trombinu nebo trombinového derivátu, hirudinem nebo derivátem hirudinu, který je imobilizován na pevné matrici, přičemž trombin nebo derivát trombinu je vázán na imobilizovaný hirudin nebo derivát hirudinu, případně odstranění nenavázaného trombinu nebo derivátu trombinu, provedení specifické detekční reakce, při které se

-24• ·· ·· ♦ ···· • · · · · · · · · · · · • · · · · ····· • ····· · · · ···· · • ······· ♦ ♦ · ·· · · · · · · ··· stanoví množství vázaného trombinu nebo derivátu trombinu.

Provedení specifické detekční reakce se může provádět buďto v rámci testovací soupravy podle vynálezu s reagenciemi pro specifické detekční reakce nebo přímo měřicím zařízením na samotné pevné matrici, třeba sensorovým chipem s připojeným měřicím zařízením.

Způsob podle vynálezu se může provádět jednoduše, čímž se obzvláště hodí pro rychlé a nekomplikované použití v oblasti klinické praxe.

Výhodná forma provedení způsobu podle vynálezu se týká způsobu, při kterém je specifická detekční reakce barevnou reakcí, přičemž koncentrace trombinu nebo derivátu trombinu se stanoví korelací s inenzitou barevné reakce.

Způsob podle vynálezu se podle dalšího aspektu hodí také ke kvantifikaci hirudinu nebo derivátů hirudinu, přičemž tento způsob je charakterizován následujícími kroky : inkubace roztoku s hirudinem nebo derivátem hirudinu, jehož množství se má stanovit, s roztokem se známým množstvím volného trombinu nebo derivátu trombinu, stanovení koncentrace volného trombinu nebo derivátu trombinu zbývaj ícího po inkubaci s hirudinem nebo derivátem hirudinu výše popsaným způsobem podle vynálezu a stanovení množství hirudinu nebo derivátu hirudinu zpětným přepočtem na základě rozdílu mezi původně známým a stanovovaným množstvím trombinu nebo derivátu trombinu.

-25Podle dalšího aspektu se předložený vynález týká použití přípravku podle vynálezu případně testovací soupravy podle vynálezu ke kvantifikaci trombinu, derivátů trombinu a/nebo hirudinu nebo derivátů hirudinu a ke stanovení vazné síly trombinu nebo derivátů trombinu k hirudinu nebo derivátům hirudinu.

Překvapivě se totiž ukázalo, že s touto testovací soupravou je možné poprvé stanovit také vazné síly trombinu nebo derivátů trombinu na hirudin nebo na jiné substance potlačující trombin. Vazné síly trombinu na hirudin jsou zajímavé především pro deriváty trombinu, jejichž vazné vlastnosti na hirudin nejsou známé.

Dále se může testovací souprava použít k analýze funkčnosti antagonistů hirudinu. Způsob se dá rovněž použít pro testování hirudinových peptidů nebo derivátů hirudinu jako efektivních antikoagulačních prostředků.

Testovací souprava podle vynálezu se proto hodí k zodpovězení všech otázek vyskytujících se v souvislosti s koncentrací, vaznými silami a funkčností trombinu, hirudinu a srážení krve. Přitom je třeba obzvláště vyzdvihnout, že na základě specifiky vazby hirudinu na trombin se může dosáhnout mimořádně přesného výsledku. Znečištění j inými krevními faktory nebo proteiny nemůže výsledek zkreslit. Ani přítomnost protrombinu analýzu neruší, protože protrombin se na hirudin neváže.

Je sice známo napojení hirudinu na mikrotitrační desky a provádění testování antihirudinových protilátek s těmito ELISA-deskami, avšak kvantifikace nebo stanovení vazné

-26kapacity s těmito deskami nebylo popsáno (Mille B. a spol., Clin.Chem. 40, 734, 1994).

Při výrobě pevné matrice spojené s hirudinem se hirudin na matrici napojí v pufrovacím systému.

Jako pufrovací systém je vhodný každý pufr, který neobsahuje aminoskupiny, jako fosfátový pufr, cítrátový pufr nebo s výhodou karbonátový pufr. pH-hodnota pufrovacího systému by měla ležet v rozmezí mezi 6 a 10, s výhodou při pH 9,3 až 9,7.

Podle vynálezu se při napojovací reakci hirudinu na pevný nosič inkubuje mezi jednou a 48 hodinami, s výhodou mezi jednou a 16 hodinami. Inkubační doba se v podstatě řídí podle inkubační teploty, přičemž se s výhodou při napojovací reakci inkubuje za chladu (4 °C) po dobu 16 hodin, při teplotě místnosti dvě až tři hodiny a při teplotě 37 °C jednu hodinu.

Po napoj ovací reakci se podle vynálezu přebytečný nevázaný hirudin odstraní promývacím pufrem z fyziologického roztoku soli, s výhodou pufrem Tris-HCl. K tomuto promývacímu pufru se může přidat detergent, s výhodou Tween 20, přičemž koncentrace detergentu leží mezi 0,01 a 1 %, s výhodou 0,1 %.

Testovací soupravou podle vynálezu je možné stanovovat koncentrace trombinu nebo derivátů trombinu v rozmezí od 0,1 pg/ml až do 100 mg/ml trombinu, s výhodou v rozmezí od 0,1 ng/ml až do 200 ng/ml trombinu.

Neméně významná je vhodnost testovací soupravy podle

-27• ·· ·· ·«« ·· ·· ♦ · · ♦ ······ • · · · · « 9 9 99 • · · · · 9 * « · · · · «9 • 9 9 9 9 9 99

999 99 99 999 99 9 9 vynálezu k rozlišení trombinů s rekombinantně vytvořenými cílenými mutacemi, delecemi nebo inzercemi, přičemž se může testovat, zda vazná schopnost k hirudinu zůstává zachována nezávisle na enzymatické aktivitě.

Tento test podle vynálezu nebo testovací souprava podle vynálezu se může zvláště použít, jestliže se má pro lékařské účely stanovit hladina trombinů v krvi, aby se přesně odměřenou dávkou hirudinu zamezilo trombózám.

Tento test má kromě toho tu zvláštní výhodu, že se může stanovit také trombin, který není funkčně aktivní a který proto v testu, který zjišťuje enzymatickou aktivitu trombinů není prokazatelný. K tomu dochází příkladně v případě genetických defektů, kdy se vyskytují fyziologicky inaktivní formy trombinů.

Příklady provedení vynálezu

Vynález bude ještě blíže vysvětlen pomocí následujících příkladů provedení a k nim příslušným obrázkům, aniž by však na ně měl být omezen.

Obrázky zobrazují :

Obrázek 1 kóduj ící část sekvence cDNA rekombinantního lidského protrombinu a z něj odvoditelnou sekvenci aminokyselin, přičemž jsou zakreslena fyziologická místa štěpení k procesování proteinu případně místa štěpení faktoru Xa k aktivaci protrombinu na trombin;

-28Obrázek 2 sekvenční protokol;

Obrázek 3 shrnutí bodové mutace výhodného derivátu protrombinu ve srovnání s wt-protrombinem, přičemž podtržené aminokyseliny/nukleotidy byly vyměněny;

Obrázek 4A postupové schéma klonování protrombin-Asn 419;

Obrázek 4B

Vestern Blot ke srovnání s plasmatickým protrombinem, rekombinantním wt-protrombinem a protrombin-Asn419;

Obrázek 5 denaturační elektroforézu jednotlivých čisticích stupňů rekombinantního derivátu protrombinu (A : zbytek buněčné kultury, B : eluát 3, C : eleuát 4, D : markér molekulové hmotnosti);

Obrázek 6 denaturační elektroforézu jednotlivých stupňů tvorby trombin-Asn99 z protrombin-Asn419 (A : protrombin-Asn419, B : eluát 3, C : lidský trombin, D : markér molekulové hmotnosti);

Obrázek 7 vazbu trombin-Asn99 (A), rekombinantního wt-trombínu (B) a humánního plasmatického trombinu (C) na imobílizovaný hirudin;

Obrázek 8

-29·· ·· · ·· • · · · · · · · · · ··· · · » · · ···· · • · · · · · · • · · · · · · · ·· · · závislost fluorescence trombinu na koncentraci hirudinu (fluorescence při 341 nm (exitace 280 nm) 390 nM trombin-Asn99 (A), 326 nM rekombinantní wt-trombin (B) a 350 nM lidský plasmatický trombin (C) se stanoví v závislosti na koncentraci hirudinu, fluorescence bez hirudinu je tedy znázorněna jako 0 %, fluorescence při nasycení hirudinem 100 %);

Obrázek 9 neutralizaci hirudinu trombinem-Asn99;

Obrázek 10 obnovení trombinové aktivity komplexu hirudin-trombin přidáním trombin-Asn99 rozdílnými koncentracemi trombin-Asn99 : (A) 0,2 gg/ml, (B) 0,4 pg/ml, (C) 1 pg/ml)

Obrázek 11 neutralizaci hirudinu v plasmě (přitom je znázorněna doba srážení v přítomnosti hirudinu (x---x) a bez přídavku hirudinu (......) v závislosti na koncentraci trombin-Asn99 při testu);

Obrázek 12 molekulární strukturu katalytického centra v komplexu trombin-hirudin (srovnání lidského trombinu a rekombinantního derivátu trombinu), přičemž šipky ukazuj í na strukturní změnu vyvolanou mutací Asp na Asn a Ser, His a Asp případně Asn označuj í polohu aminokyselin katalytického centra v molekule trombinu a Ile N-koncovou aminokyselinu hirudinu.

-30Příklady

Příklad 1 ukazuje na příkladu protrombin-Asn419 způsob procesu, kterým se může získat bodově mutovaný protrombin;

Příklad 2 demonstruje čištění a analýzu funkčnosti derivátu protrombinu;

Příklad 3 ukazuje získání a analýzu funkčnosti derivátu trombinu;

Příklad 4 kvantifikuje vaznou kapacitu derivátu trombinu na hirudin;

Příklad 5 zkoumá derivát protrombinu z hlediska jeho schopnosti působit jako antagonista hirudinu;

Příklad 6 ukazuje, že se hirudin může neutralizovat derivátem trombinu;

Příklad 7 ukazuje, že trombinový derivát může opět aktivovat trombin z komplexu trombin-hirudin;

Příklad 8 ukazuje, že derivát trombinu je účinný také v plasmě a

Příklad 9 ukazuje získání a analýzu funkčnosti derivátu meizotrombinu.

Příklad 1

Konstrukce pSV-FIIwt a pSV-FII-Asn419 (Asp na Asn)

-31• · · · · 4 · · « · ··* · · ·«· * · · · • ··· · · · · · ···· « O · · · · · · · • · · ·· · · · · · · · ··

Plasmid pSV|3 (Nucl.Acids Res. 17, 2365, 1989) se rozštěpí pomocí Notl k odstranění interního fragmentu β-galaktozidázy. Zbývající vektor se religuje a nazývá se pSV.

K odstranění větší části 3 -lokalizovaného polyadenylačního místa a později možná rušivé sekvence polylinkeru se pSV štěpí pomocí HindlII a Xbal. Po odstranění malého fragmentu polylinkeru se konce vektoru vyplní enzymem Klenow a religuje. Výsledný plasmid se nazývá pSVdelta.

Následně byl do 5 Xhol místa intronu 16/19S zaveden Multiple Cloning Sítě (MCS) s vhodnými restrikčními štěpícími místy.

MCS byl chemicky syntetizován jako duplex komplementárních oligonukleotidů :

-TCGACCATGG ACAAGCTTAT CGATCCCGGG AATTCGGTAC CGTCGACCTG CAGGTGCACG GGCCCAGATC TGACTGACTG A-3 (Seq.ID.No.1) a

-TCGATCAGTC AGTCAGATCT GGGCCCGTGC ACCTGCAGGT CGACGGTACC GAATTCCCGG GATCGATAAG CTTGTCCATG G-3 (Seq.ID.No.2)

Oba polynukleotidy byly annealed a umístěny do pSVdelta. Protože insert MCS je sice Xhol kompatibilní, vykazuje sticky-konce avšak žádná úplná Xhol místa, byla ligační reakce štěpena Xhol. Neštěpitelné konstrukty reprezentují požadovaný plasmid, který byl nazván pSV-MCS III.

Jeden fragment DNA s úplným lidským wt-protrombin-32-

cDNA byl pomocí parciálního Ncol- a úplného Smál- restrikčního štěpení vyjmut z plasmidu pTKemc-PT2 (VO 91/11519).

Tento fragment byl umístěn do vektoru pSV-MCS III, poté, co byl úplně otevřen rovněž pomocí parciálního Ncola úplného Smál- restrikčního vynětí.

Výsledný plasmid byl nazván pSV-FIIwt a exprimován wt-trombin, jak bylo prokázáno transientní expresí v buňkách COS a stabilní expresí v buňkách CHO; pořadí funkčních prvků na pSV-FIIwt je SV40-promotor/enhancer (časný gen), SV40-5 UTR, wt-protrombin-cDNA, SV40-16s/19s-intron, SV40-polyadenylační místo a pUC 19-sekvence (s bakteriálním replikačním původem a genem rezistentním na ampicilin).

K mutaci kyseliny asparagové katalytického centra trombinu na asparagin a tím výrobě inaktivního mutantu trombinu se mutuje pSV-FIIwt : kódující kodon pro uvedenou kyselinu asparagovou se nachází na restrikčním fragmentu EcoRVDralII. Obě restrikční místa jsou k dispozici výhradně v pSV-FIIwt. Zamýšlená mutageneze se provede pomocí reakce řetězce polymerázy s primárním párem 2104/2066 (Seq.ID.No.3 a 4), v jejímž důsledku se fragment wt-protrombin-EcoRVDralII nahradí fragmentem PCR Ecll36II-DraIII obsahujícím mutaci.

Oba oligonukleotidy se syntetizují chemicky :

Primer 2104 (5 -TAACTGACGG TCCTTGAGCT CCATGTTGGA AAAGATCTAC ATC-3 (Seq.ID.No.3) jako 5 primer; po reakci řetězce polymerázy se EclI36II half site ligeruje§ na EcoRV half site vektoru, čímž se sice na rovině DNA změní některé nukleotidy wt-protrombinu, sekvence aminokyselin

-33• ·· «· · ·· ·· ·· · ♦ · · ·· · · · · ······ ···· • · · · · · · · · ···· · • ···· · · · • · · · · * · · ·· ·· ·· však zůstane zachována jako ve wt-protrombinu.

Primer 2066 (5 -GCAGACACAC AGGGTGAATG TAGTCACTGA AGGCAACAGC CTTCTTCAGC TTCATCAGGG CAATATTCCG GTCCAGGTTC TCCCGC-3 (Seq.ID.No.4) jako 3 primer; tímto primerem se mutuje na rovině DNA kyselina asparagová na asparagin, zavede se restrikční místo SspI a ztratí se § místo Ncil.

Reakce PC se provádí za standardních podmínek při teplotě annealing 55 °C.

Výsledný plasmid pSV-FIIAsn419, který obsahuje mutaci Asp na Asn se identifikuje jeho restrikčním vzorkem pomocí EcoRV, DraliI, SspI a Ncil ve srovnání s pSV-FIIwt.

Postupové schéma cesty klonování je zobrazeno na obrázku 4A.

Očekávaná sekvence nukleotidů v inzertu Ecll36IIDralII v pSV-FIIAsn419 byla potvrzena následným sekvenováním s primery 5 - a 3 - 2197 (5 -CATAAGCCTG AAATCAACTC-3 (Seq.ID.No.5) případně 2198 (5 -CTTCGGAGCG TGGAGTCATC-3 (Seq.ID.No.6).

Buňky CHO-DUKS Bil, deficitní na dihydrofolatreduktasový gen, se pěstují rutinně ve Voll-Medium (DMEM/ Ham s F 12 1 : 1 Medium, obohacené 2mM glutaminu, 0,075 % bikarbonátu, 100IU penicilinu a 100 mg streptomycinu/ml, 10 % fetálního telecího sera, a 10 mg desoxyadenosinu, adenosinu a thymidinu na ml).

Pomocí modifikované metody CaPO^ (Graham a van der Eb,

-34« ·· ·· · ·· ·· • · · · 4 * «· · ·· » • ····· · · * ··· · · * ·· »· · · · ··· · · ·· · · · · · ··

Virology 52, 456, 1973 se buňky kotransfekují 10 gg pSV-FIIwt případně pSV-FIIAsn-419 a 1 gg pSV-dhfr (Fischer a spol., FEBS Lett. 351, 345, 1994): k DNA ve 250 ml lmM Tris pH 0,8, 0, lmM EDTA se přidá 25 ml 2,5M CaC12. Následně se přidá 250 ml 280 mM NaCl, 45mM Hepes, 2,8 mM Na₂HP0₄, pH 7,12. Po 10 minutách se vzniklý koprecipitát DNA přidá k subkonfluentním buňkám.

šest hodin pozděj i se medium odsaj e a buňky se převrství 15 % glycerinu v PBS. Minutu pozděj i se glycerin odsaje, buňky se promyjí PBS a buňky se opatří čerstvým Vollmedium.

hodin pozděj i se buňky trypsinuj i a v rozdílných koncentracích se rozdělí v Selektions-Medium (DMEM/F12 : 1 medium bez hypoxantinu, glycinu a thymidinu; přidá se mM glutaminu, 100 IU penicilinu, a 100 mg streptomycinu/ml a 10 % dialyzovaného fetálního telecího sera s konečným objemem 10 000 Kd). Při pravidelné výměně media 2-3 krát týdně byly asi po 10 dnech viditelné buněčné klony. Další týden později se výsledné buněčné klony izolují a ponechají se růst ke konfluenci v separátních miskách pro buněčné kultury. Ve 24-hodinových zbytcích buněčných kultur neobsahujících sérum se sekretovaným, rekombinantním wt-protrombinem případně protrombinAsn419 v selekčním mediu (doplněno 10 gg vitaminu K-^/ml, avšak bez telecího sera) se následně vyšetřuje množství antigenu a kvalitativní integrita (analýza Vestern Blot), funkčnost (vhodné testy aktivity) a interakce protrombinu aktivovaného ke trombinu s hirudinem. Počet buněk byl stanoven po trypsinaci buněk v přístroji na počítání buněk firmy Schárfe, Reutlingen, Deutschland).

• ·· ·· · 9· ·♦ ·· · · · · ·· ··>· • ····· « · « ···« · • ♦ · · · · · · ··· ·· ·· ··· ·· ··

Κ analýze Western Blot se redukuje a denaturuje 10 μΐ zbytku buněčné kultury a v denaturačních 4 % sběrném-/8 % dělicím gelech podle Lámmli (Nátuře 227, 680, 1970) se rozdělí pomocí BioRad Mini-Protean II Duál Slab Gel-Systém (BioRad Laboratořies, Richmond, CA, USA). Proteiny se po uskutečněném vyběhnutí gelu transferují pomocí BioRad Mini Trans-Blot-System (BioRad Laboratories, Richmond, CA, USA) v transferním pufru (25 mM Tris, 192 mM glycin) na nitrocelulozové membráně. K vizualizaci rekombinantního proteinu se použije systém Protoblot firmy Promega (Madison, VIS, USA). Jako protilátka k vazbě protrombinu se použije králičí protrombinové sérum (Obj. No.A325) firmy Dakopatts) (Glostrup, Denmark). (obrázek 4B)

Příklad 2

Čištění a stanovení aktivity rekombinantního wt-protrombinu a derivátů protrombinu

a) Čištění rekombinantního wt-protrombinu a protrombinuAsn419

Materiál : aniontoměničový sloupec Fraktogel EMD TMAE 6 50, 1,6 x 5 cm (Měrek) přístroj pro kapalinovou chromatografii FPLC LCC-500 (Pharmacia) anti-protrombin-immunglobulin (Stago)

Roztoky : 50	mM	Tris/HCl	pufr	pH	7,	4	(puf:	r A)
50	mM	Tris/HCl	pufr	pH	7,	4,	180	mM	NaCl	(pufr	B)
50	mM	Tris/HCl	pufr	pH	7,	4,	300	mM	NaCl	(pufr	C)
50	mM	Tris/HCl	pufr	pH	7,	4,	160	mM	NaCl,	10 mM

octanu vápenatého (pufr D)

-36K získání rekombinantního wt-protrombinu a derivátu protrombinu se použije zbytek buněčné kultury transformoných buněk CHO z příkladu 1, který obsahuje rozpustný rekombinantní derivát protrombinu.

Čištění rekombinantního wt-protrombinu a derivátu protrombinu ze zbytku buněčné kultury se provádí kapalinovou chromatografií. Průběh chromatografie byl sledován obvyklým způsobem měřením absorpce při 280 nm. Obsah protrombinu případně derivátů protrombinu jednotlivých frakcí a eluátů byl zjišťován obvyklým způsobem pomocí ELISA za použití obchodně dodávaného preparátu trombinu jako standardu.

Celková koncentrace proteinu se stanovuje metodou podle Bradford, M. (Anal.Biochem. 72, 248 (1976)).

Proces čištění popisuje Fischer a spol., J.Biotechn. 38, 129, 1995.

Data k čištění wt-protrombinu nejsou uvedena.

K čištění protrombinu-Asn419 se aniontoměničový sloupec ekvilibruje pufrem A a následně se nanese 970 ml zbytku buněčné kultury (obsah protrombinu (ELISA) 20 μg/ml; koncentrace proteinu 2,7 mg/ml) s rychlostí 4 ml/minuta. Materiál nevázaný na gel měniče se odstraní promytím sloupce pufrem A (eluát 1 : 1030 ml : 1,2 mg/ml). Následně se promytím sloupce pufrem B odstraní na sloupec slabě vázané proteiny (eluát 2 : 20 ml; obsah protrombinu (ELISA) 2 pg/ml; celkový obsah proteinu 10,0 mg/ml. Potom se sloupec eluuje pufrem C a v eluátu se získá protein vázaný na sloupec (eluát 3 : 30 ml; obsah protrombinu (ELISA) 355 gg/ml; celkový obsah ·· ·· • · · · • · · · ··

proteinů 16 mg/ml). Následně se sloupec regeneruje promytím 1 M roztokem chloridu sodného a ekvilibruje se pufrem D. 28 ml eluátu 3 se zředí 1,9-násobně pufrem A a ke konečné koncentraci 10 mM se přidá octan vápenatý. Tento roztok se opět filtruje aniontoměničovým sloupcem a promyje se pufrem D, přičemž se v eluátu získá nevázaný protein (eluát 4 : 60 ml; obsah protrombinu (ELISA) 170 pg/ml). V jednotlivých stupních chromatografie se protein vyšetřuje denaturační elektroforezou s SDS-polyakrylamidovým gelem (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970). Obrázek ukazuje čištění derivátu protrombinu pomocí SDS-PAGE. Ze zobrazení je zřejmé, že se derivát protrombinu získá v čisté formě v eluátu 4.

b) Stanovení aktivity derivátu protrombinu :

Všechny čisticí stupně a eluáty se vyšetřují z hlediska aktivity srážlivosti protrombinu protrombinového časového testu (Quick AJ, J.Biol.Chem. 109, 73, 1935 a Denson KVE a spol., v Laboratory Diagnosis, Blackwell R. Scientific Publications Oxford 1976, strana 310 a další). Ani ve zbytku buněčné kultury, ani v jednotlivých čisticích stupních, ani v eluátech 1-4 nebyla prokázána protrombinová aktivita.

Příklad 3

Příprava, analýza a stanovení aktivity wt-trombinu a trombinu-Asn99

a) Příprava trombinu-Asn99 ;

Příprava trombinu-Asn99 se provádí analogickou metodou, jaká se popisuje v EP-A-0 565 512, přičemž se protrombin Asn419 štěpí pomocí imobilizovaného trypsinu.

-38• ♦· ·· · ·♦ ·· ·· · · · * ·· ···· • ·· · · · · · ···· · • · · · · · · ··· ·· ·· ··· ·· ··

Eluát získaný po aktivaci se vyšetřuje pomocí denaturační SDS-PAGE (obrázek 6). Výsledky SDS-PAGE ukazují, že rekombinantní derivát protrombinu se přeměnil na derivát trombinu (trombin-Asn99) s molekulovou hmotností 33 000 (těžký řetězec).

Paralelně s tím se stejným způsobem aktivuje rekombinantní wt-protrombin na trombin.

b) Analýza sekvence aminokyselin trombinového derivátu trombinu Asn99

N-koncová sekvenční analýza amionokyselin poskytutuje dvě následující sekvence : (A) Thr-Ala-Thr-Ser-Glu-Tyr-GlnThr-Phe-Phe-Asn-Pro-Arg-Thr-Phe-; (B) Ile-Val-Glu-Ser-AspGlu-Ile-Gly-Met-Ser-Pro-Trp-Gln. Sekvence tak ukazují, že rekombinantní trombinový derivát byl získán proteolýzou na autentických štěpných místech protrombinu (Arg271-Thr272 a Arg320-Ile321) jako molekula se dvěma řetězci s a-trombinovou strukturou.

K lepšímu znázornění prostorové struktury trombinového komplexu Asn99-hirudin ukazuje obrázek 12 molekulární strukturu katalytického centra. Obrázek 12 ukazuje srovnání humánního trombinu a rekombinantního trombinového derivátu Asn99.

c) Stanovení aktivity rekombinantního trombinu - Asn99 se provádí třemi na sobě nezávislými metodami.

I. Stanovení trombinové aktivity pomocí chromogenního substrátu *· ·· · ·· ·« • · · · ·· · · · · • · ·· · ···· ··· · · · · · ···· · • ♦ ♦ · · ··· ··· ·· ·· ··· ·· ··

Stanovení trombinové aktivity pomocí chromogeního substrátu se provádí při teplotě 25 °C v 50 mM pufru Tris/HCl, 150 mM chloridu sodného 0,1 % PEG 6000, pH 8,0, o koncentraci syntetického chromogenního substrátu 0,2 mM AcOH-DH-CHG-Ala-Arg-pNA (TH-1, Pentapharm) v objemu 1 ml). V závislosti na čase se stanovuje absorbce při 410 nm. Jako referenční vzorek se použije trombinový standard s definovanou aktivitou (Immuno AG). Ředění vzorků se provádí v testovacím pufru s přídavkem 1 % Prionex (hydrolyzát kolagenu, Pentapharm).

Stanovení aktivity poskytuje hodnotu aktivity 0,24 nmol/min/gg proteinu pro rekombinantní trombinový derivát trombin-Asn99. Trombin-Asn99 tak vykazuje pouze 0,24 % aktivity v chromogenním testu oproti humánnímu plazmatickému trombinu.

Tabulka 1: Stanovení aktivity trombinu pomocí chromogenního substrátu

Trombinový derivát	Specifická aktivita (nmol/min gg protein)
Trombin-Asn99	0,24
rekombinantní wt-trombin	98,4
humánní plazmatický trombin	102,0

-40• ·· ·· · ♦· ·· • · · · · ··· · « · · • · · · · · ···· • · · · · · « · · · · · · · • · · · · · · ♦ ··· ·· ·· ··· ·· ··

II. Stanovení aktivity za použití trombinového standardu

Všechny trombinové deriváty se vyšetřují z hlediska jejich trombinové aktivity za použití trombinového standardu (Immuno AG) definované aktivity. Při tomto stanovení aktivity není pro trombín-Asn99 nalezena žádná aktivita (tabulka 2).

Tabulka 2: Stanovení aktivity za použití trombinového standardu

Trombinový derivát	Aktivita (IE/mg proteinu)
Trombin-Asn99	0
rekombinantní wt-trombin	1656
humánní plazmatický trombin	1509,0

III. Stanovení aktivity titrací aktivního centra

Titrace aktivního centra trombinového derivátu se provádí metodou M.F. Doyle a P.E. Haley (Methods in Enzymology (1993), 222, 299-312), za použití p-nítrofenylp -guanidínobenzoátu jako substrátu a extinkčního koeficientu 16.595 cm^ při 410 nm.

Humánní plazmatický trombin, rekombinantní wt-trombin a trombin-Asn99 se touto metodou vyšetřují z hlediska jejich obsahu aktivního centra (aktivní trombinová koncentrace). Přitom není pro trombin-Asn99 zjištěno žádné aktivní centrum

-41(tabulka 3).

Tabulka 3: Stanovení aktivity titrací aktivního centra

Trombinový derivát Koncentrace aktivního trombinu (nmol/mg proteinu)

Trombin-Asn990 rekombinantní wt-trombin16,34 humánní plazmatický trombin16,89

Shrnutí :

Na rozdíl od rekombinantního wt-trombinu a humánního plazmackého trombinu vykazuje trombin-Asn99 v jedné ze tří testocích metod mimořádně nízkou trombinovanou aktivitu, která odpovídá asi 1/400 přirozeného trombinové aktivity. Rekomnantní wt-trombin a humánní plazmatický trombin vykazují velmi podobný vzorek aktivity.

Příklad 4

Kvantifikace vazby hirudinu rekombinantního trombinového derivátu

I. Schopnost vazby na hirudin trombinového derivátu trombin-Asn99 se vyšetřuje pomocí testu ELISA a porovnává se s humánním plazmatickým trombinem a rekombinantním wt-trombinem. Tento test ELISA spočívá na použití imobilizovaného

-42hirudinu. Podle jedné formy provedení tohoto testu se trombin váže na hirudin, který je imobilizován na mikrotitračních deskách a prokazuje se přes protilátky s následnou barevnou reakcí. Tento test je nezávislý na enzyma tické aktivitě trombinu.

K výrobě desek ELISA se váže rekombinantní hirudin Variante 1 (Variante 1; firma Rhein Biotech, SRN; 2 gg/ml, 100 μΐ) na mikrotitrační desky. Po promytí se přidá rekombinantní wt-trombin, trombin-Asn99 nebo humánní plazmatický trombin (100 μΐ o koncentraci podle obrázku 7) a inkubuje se po dobu 1 hodiny. Nevázaný trombin se odstraní a vázaný trombin se prokazuje pomocí antitrombin-imunoglobulinu značkovaného peroxydázou (Sheep anti-human Thrombin; Enzyme Research Lab. Inc., Indiana USA; 100 μΐ o zředění 1/1000 (obrázek 7). Měření absorbce se provádí při 450 nm.

Z výsledků jednoznačně vyplývá, že jak rekombinantní wt-trombin (obrázek 7B), humánní plazmatický trombin (obrázek 7C), tak i trombin-Asn99 (obrázek 7A) se váží na imobilizovaný hirudin identicky a způsobem nezávislým na koncentraci.

II. Stanovení vazby hirudinu na trombin pomocí změny fluorescence aromatické aminokyseliny v molekule trombinu a stanovení vazné konstanty hirudinu na derivát trombinu.

Na základě fluorescenční emise se za použití PC programu ENZFITTER (RJ. Leatherbarrow, Elsevier-Biosoft, 1987) za použití základního vazného modelu se společným vazným místem zjišťuje vazná konstanta trombinu na ··

hirudin. Stanovení intrinsinní fluorescence aromatických aminokyselin trombinového derivátu se provádí v 50 mM pufru Tris/HCl, 150 mM chloridu sodného, 0,1 % PEG 6000, pH 7,4. Excitace se provádí při 280 nM (šířka sloupce 2,5 nm), emise byla registrována mezi 300 nm a 400 nm (šířka sloupce 5 nm) .

Intrinsinní fluorescence tryptofanu v molekule trombinu byla vzbuzena při 280 nm a emise byla naměřena mezi 300 nm a 400 nm bez přídavku hirudinu, případně v přítomnosti hirudinu. V závislosti na koncentraci hirudinu byla určena fluorescence při 341 nm (exitace 280 nm) ve výši 390 nM pro trombin-Asn99, 326 nM pro rekombinantní wt-trombin a 350 nM pro humánní plazmatický trombin.

Dále se srovnává trombinový derivát trombin-Asn99 s rekombinantním wt-trombinem a humánním plazmatickým trombinem. Z výsledků vyplývá, že se v přítomnosti hirudinu u všech třech trombinových derivátů podstatně zvyšuje fluorescence tryptofanu v trombinové molekule (hirudin neobsahuje žádný tryptofan) (obrázek 8). To evidentně vyplývá z tvorby komplexu hirudin/trombin.

Tím evidentně dochází ke strukturálním změnám v molekule trombinu, které ovlivňují fluorescenční vlastnosti tryptofanu. Z analýz prostorové struktury komplexu trombin/hirudin je známo, že obzvláště Trp 51, Trp 148 a Trp 228 z trombinu dospějí vazbou hirudinu do kontaktní blízkosti k inhibitoru.

Obrázek 8 ukazuje ve srovnání závislost fluorescence trombinu na koncentraci hirudinu. Pro všechny tři deriváty trombinu byly získány velmi podobné vazby hirudinu na trom-44-

bin. Vazba hirudinu na všechny tři trombinové deriváty odpovídá sycení a poskytuje jedno vazné místo na molekulu trombinu.

Data z obrázku 8 byla využita ke stanovení vazné konstanty hirudinu na trombinový derivát (tabulka 4). Je zřejmé, že pro všechny trombinové deriváty byly získány velmi podobné a velmi vysoké asociační konstanty.

Tabulka 4: Vazné konstanty hirudinu na trombinové deriváty

Trombinový derivát

Asociační konstanta komplexu trombin-hirudin (Ml)

Trombin-Asn99 3,7 x 10^ *7 rekombinantní wt-trombin 4,3 x 10 humánní plazmatický trombin 3,2 x 10

Příklad5

Rekombinantní protrombin jako antagonista hirudinu

Materiál : Koagulometr KC 10 (Amelungen GmbH, Německo), normální plazma neobsahující protrombin (Immmuno AG, Vídeň), koncentrační standard protorombinu (Immuno AG, Vídeň), rekombinantní hirudin (Rhein Biotech, Německo)

Obvyklým laboratorním postupem se pomocí protrombino-

Λ ·♦ • · ·· •· ·· • · · ·· • ·· ·· ·· vého časového testu zjišťuje doba, která je po aktivaci faktorů podílejících se na srážení krve nutná k tomu, aby se normální plazma začala srážet. V tomto testu se přídavkem

Oj.

iontů Ca ke směsi z 1. normální plazmy neobsahující protrombin (která však obsahuje všechny ostatní faktory srážení) a 2. protrombinového koncentračního standardu (protrombin s definovanou aktivitou) vytváří faktor srážení Xa, který potom přeměňuje protrombin (faktor II) na trombin (faktor Ha). Trombin potom způsobuje přeměnu rozpustného fibrinogenu na nerozpustný fibrin. To vede ke tvorbě krevních sraženin. Časová prodleva mezi aktivací pomocí ni přídavku iontů Ca a tvorbou krevní sraženiny se přitom automaticky stanovuje koagulometrem. Je známo, že tato časová prodleva srážení krve závisí na koncentraci protrombinu případně koncentraci vytvořeného aktivního trombinu. Čím vyšší je koncentrace trombinu v reakční směsi, tím nižší je doba srážení. Při přidání inhibitoru trombinu, jako hirudinu, dochází po přeměně protrombinu na trombin k vytvoření ínaktivního komplexu trombin-hirudin, takže trombin vázaný v tomto komplexu se již nemůže podílet na přeměně fibrinogenu na fibrin. Na základě toho se prodlužuje doba srážení v důsledku sníženého množství aktivního trombinu. Při přebytku inhibitoru oproti trombinu dochází k úplnému útlumu srážení krve. Přidá-li se však do testovaného systému jak inhibitor trombinu jako hirudin, a další složka, která váže inhibitor, avšak nepodílí se na srážení krve, sníží se také účinek inhibitoru na trombin. Potom se doba srážení opět zkrátí. V tabulce 5 jsou shrnuty výsledky různých pokusů :

Z výsledků v tabulce 5 vyplývá :

1.

Protrombin vede k rychlé tvorbě krevní sraženiny.

2. Hírudin způsobuje útlum srážení krve.

3. Rekombinantní protrombinový derivát nezpůsobuje srážení krve.

4. Rekombinantní protrombinový derivát neovlivňuje srážení přirozeným protrombinem.

5. Přídavkem rekombinantního protrombinového derivátu se vyruší útlum srážení krve způsobený hirudinem.

-4Ί-

Tabulka 5
Složky v testu srážení	Doba srážení (sekundy)
Násada (A) Normální plazma neobsahuj ící protrombin 125 mU/ml (12,5 gg/ml) protrombinu	18
Násada (B) Normální plazma neobsahující protrombin 125 mU/ml (12,5 gg/ml) protrombinu 2,5 pg/ml hirudinu	> 100
Násada (C) Normální plazma neobsahující protrombin 25 gg/ml) protrombinového derivátu podle vynálezu	> 100
Násada (D) Normální plazma neobsahující protrombin 125 mU/ml (12,5 gg/ml) protrombinu 25 gg/ml) protrombinového derivátu podle vynálezu	18
Násada (E) Normální plazma neobsahující protrombin 125 mU/ml (12,5 pg/ml) protrombinu 25 gg/ml) protrombinového derivátu podle vynálezu	18

Příklad 6

Neutralizace hirudinu trombinem-Asn99

K testování, zda trombin-Asn99 může neutralizovat hirudin a tím zrušit útlum z hlediska aktivity trombinů se 50 μΐ hirudinu (44 nM, 4 ATU/ml) inkubuje různými koncentracemi trombin-Asn99 po dobu 1 minuty. Následně se přidá 50 μΐ trombinového standardu (3,9 IE/ml), chromogenní substrát v pufru pro měření (0,2 mM substrátu podle příkladu 3c v 50 mM pufru Tris/HCl, 150 mM chloridu sodného, 0,1 % PEG 6000, pH 8,0 a stanoví se aktivita enzymu při teplotě 25 °C. Trombinová aktivita se stanoví fotometricky při 410 nm. Pro srovnání se stanoví trombinová aktivita bez hirudinu (100 % trombinová aktivita) a trombinová aktivita v přítomnosti hirudinu, avšak bez přídavku trombinů-Asn99 (0 % trombinové aktivity). Výsledky jsou uvedeny na obrázku 9.

Jednoznačně je zřejmé, že trombinem-Asn99 se hirudin neutralizuje a tím je zrušen tlumicí účinek hirudinu na aktivní trombin. Zároveň je zřejmé, že při poměru 1 mol trombinů-Asn99 k 1 mol hirudinu je potlačení trombinů neutralizováno.

Příklad 7

Reaktivace komplexu trombin-hirudin trombinem-Asn99

Cílem experimentu je zjistit, zda přídavkem trombinu-Asn99 ke komplexu trombin-hirudin je možné opět získat trombinovou aktivitu, to znamená, zda trombin-Asn99 je schopný neutralizovat hirudin z komplexu trombin-hirudin.

-49K tomu se fotometricky stanovuje kontinuálně aktivita trombinu (konečná koncentrace 0,1 IE/ml) pomocí chromogenního substrátu. Po 3 minutách se přidá hírudin (konečná koncentrace 0,1 ATU/ml) a reakce pokračuje po dobu dalších 4 minut. Potom se přidávají rozdílné koncentrace trombinuAsn99 (konečné koncentrace 0,2 gg/ml, 0,4 gg/ml a 1 pg/ml) a reakce se fotometricky sleduje (obrázek 7).

Obrázek 10 ukazuje, že přídavkem hirudinu k trombinu se jeho aktivita tlumí. Z výsledků je dále zřejmé, že s přidáváním vzrůstající koncentrace trombinu-Asn99 však může být inhibiční účinek hirudinu na trombin opět zrušen.

Je zajímavé, že proces neutralizace hirudinu je závislý na čase; trvá asi 1 minutu, než se hírudin neutralizuje trombinem-Asn99. To je způsobeno velmi vysokou vaznou konstantou hirudinu na trombin, jehož rovnováha je následně v závislosti na čase posunuta ve prospěch volného trombinu a vytváření komplexu hírudin-trombin-Asn99 §.

Příklad 8

Neutralizace hirudinu v plazmě

Cílem pokusů je ukázat, že trombin-Asn99 může neutralizovat také hírudin v plazmě a tím zrušit tlumicí účinek hirudinu na trombin. K provedení se analogicky jako v aPPT-testu smísí 110 μΐ hirudinizované citrátové plazmy (koncentrace hirudinu 1,8 pg/ml se 100 μΐ parciální tromboplastinové reagens (Boehringer Mannheim, SRN) a 10 μΐ trombinu- Asn99 (o 0 - 17 pg/ml podle obrázku 11) a inkubuje se po dobu 3 minuty při teplotě 37 °C. Následně se přidá 100

-50μΐ 25 mM chloridu vápenatého a automaticky se stanovuje doba srážení (obrázek 11).

Z výsledků je zřejmé, že se hirudinem (bez přísady trombinu-Asn99) velmi silně prodlužuje doba srážení. V závislosti na koncentraci, se stoupajícím množstvím trombinu-Asn99 se však opět zkracuje doba srážení, a dosahuje se hodnot obvyklých pro normální plazmu.

Ze zobrazení jasně vyplývá, že i hirudin v plazmě se neutralizuje trombinem-Asn99 a tím se ruší tlumení hirudinu na plazmatický trombin. Výsledky šetření ve své úplnosti ukazují jednoznačně, že vyrobené trombinové mutanty trombinu-Asn99 způsobem odpovídajícím stanovenému cíli mají zanedbatelně malou aktivitu (méně než 0,24 % aktivního trombinu) , avšak hirudin váže identickým způsobem.

Schopnost vázat hirudin umožňuje rekombinantní molekule neutralizovat inhibitor jak v definovaném pufrovaném systému, tak i v plazmě. Navíc je trombin-Asn99 schopen uvolnit hirudin z komplexu trombin-hirudin a neutralizovat jej .

Příklad 9

Příprava a analýza funkčnosti meizotrombinu-Asn419

K přípravě rekombinantního meizotrombinu-Asn419 se použije protrombin-Asn419 z příkladu 1. Protrombin-Asn419 se inkubací s Venom-proteázou Ecarin přemění v meizotrombinAsn419. Přitom se protrombin-Asn419 rozpustí na 0,2 mg/ml v 20 mM pufru Tris/HCl, pH 7,4, 150 mM chloridu sodného, 5 mM chloridu vápenatého, a na vždy 1 protrombin-Asn419 se

-51přidá 20 ng Ecarinu (výrobek firmy Pentapharm). Aktivace se provádí při teplotě 4 °C po dobu 4 hodiny. Výsledný meizotrombin-Asn419 se analogicky jako je čištění trombinu-Asn99 (příklad 3) čistí a izoluje afinitní chromatografií na peptidovém gelu.

Tímto způsobem připravený meizotrombin-Asn419 má stejnou molekulovou hmotnost jako protrombin-Asn419 72 000, a sestává z protrombinového řetězce F1/F2/A (molekulová hmotnost 52 000, N-koncové sekvence aminokyselin Ala-AsnThr-Phe-Leu-Gla-Gla-) a B-řetězce (molekulová hmotnost 32 000, N-koncová sekvence aminokyselin Ile-Val-Glu-SerAsp-Ala-Glu-Ile).

Analogicky k příkladům 3 (c) I až III se vyšetřují enzymatické vlastnosti meizotrombinu-Asn419. V žádném z testovacích postupů nebyla zjištěna pro meizotrombin-Asn419 žádná aktivita.

Analogicky k příkladu 4 (I) a (II) bylo zjištěno, že meizotrombin-Asn419 se v závislosti na koncentraci se silou srovnatelnou s humánním plazmatickým trombinem váže na immobilizovaný hirudin a zvyšuje intenzitu fluorescence aromatických aminokyselin vazbou na hirudin, jako je popsáno pro trombin-Asn99.?

Analogicky k příkladu 6 je pro meizotrombin-Asn419 ukázáno, že neutralizuje hirudin a tím ruší tlumení trombinu. Při poměru 1 mol meizotrombinu-Asn419 k 1 mol hirudinu je tlumení trombinu neutralizováno.

Analogicky k příkladu 7 je pro meizotrombin-Asn419

-52• · ukázáno, že přídavkem meizotrombinu-Asn419 ke komplexu trombin-hirudin může být hirudin z tohoto komplexu opět vyloučen a tím získá trombin opět svoji aktivitu. Přitom získaná data odpovídají datům trombinu-Asn99.

Analogicky k příkladu 8 je pro meizotrombin-Asn419 ukázáno, že je schopný neutralizovat hirudin v plazmě a tím zrušit tlumící účinek na trombin. Přitom získaná data odpovídají datům trombinu-Asn99.

Příklad 10

Charakterizace trombinu-Asn99 a meizotrombinu-Asn99 in vivo

Účinky trombinu-Asn99 a meizotrombinu-Asn99 na neutralizaci hirudinu byly vyšetřovány na zvířecím modelu : 3 minuty po intravenózním podání dávky hirudinu ve výši 0,5 mg na kg tělesné hmotnosti (200 μΐ) nebo 200 μΐ roztoku chloridu sodného myším NMRI (tělesná hmotnost 20 g; každá testovací skupina zahrnuje 10 myší) bylo injikováno 2,5 mg trombinAsn99/kg tělesné hmotnosti a 5,0 mg meizotrombin-Asn99 (vždy 200 μΐ). Po dalších 3 minutách byla narkotizovaným myším odebrána srdeční punkcí krev. Získaná citrátovaná plazma byla vyšetřována z hlediska parciálního tromboplastinového času (PTT), trombinového času (TT), antitrombinového potenciálu (aPT) a koncentrace trombinu-Asn99 a meizotrombinu-Asn99 v plazmě, přičemž každé měření bylo prováděno třikrát.

K měření PTT se míchá 50 μΐ citrátované myší plazmy s 50 μΐ citrátované plazmy s deficitním faktorem II a 100 μΐ parciální tromboplastinové reagens při teplotě 37 °C po dobu 3 minuty. Srážení se nastartuje přídavkem

-53100 μΐ 25 mM chloridu vápenatého. K měřeni TT se míchá 50 μΐ citrátované myší plazmy se 150 μΐ citrátované plazmy s deficitním faktorem II při teplotě 37 C po dobu 3 minuty. Srážení se nastartuje přídavkem 100 μΐ trombinového standardu (7 jednotek/ml).

Ke stanovení aPT byla TT všech myší skupin 1 až 8 porovnána s cejchovací křivkou doby srážení různých koncentrací trombinového standardu (1 jednotka/ml až 10 jednotek/ ml), z čehož vyplynula efektivní trombínová koncentrace v jednotlivých pokusech TT. Rozdíly, které se objevily v efektivních trombinových koncentracích v pokusech s myší plazmou v testovacích skupinách 1 a 5 k efektivním trombinovým koncentracím v pokusech s myší plazmou v testovacích skupinách 2 až 4 případně 6 až 8, rezultují v antitrombinovém potenciálu, přičemž rozdíl v 1 trombinové jednotce/ml je definován jako jedna antitrombinová jednotka.

Koncentrace plazmy trombinu-Asn99 a meizotrombinuAsn99 byla stanovena přídavkem sériově ředěné plazmy k imobilizovanému hirudinu, přičemž trombin-Asn99 a meizotrombin-Asn99 byl detekován pomocí ovčího konjugátu anti-trombin-IgG-peroxidáza. K analýze byly připraveny cejchovací přímky s koncentracemi trombinu-Asn99 a meizotrombinu-Asn99 3 ng/ml až 100 ng/ml.

Výsledky těchto pokusů jsou uvedeny v tabulce 6 :

-54• · ·

Tabulka 6 :

Parametr	Trombin-Asn99 testovací skupina	Meizotrombin-Asn99 testovací skupina
1	2	3	4	5	6	7	8
PTT (sek)	23,8	42,3	24,0	26,2	22,4	38,2	21,0	21,8
TT (sek)	11,4	19,8	11,6	11,7	11,6	19,3	11,2	12,0
aTP (ATU)	0	4,3	0	0,33	0	3,8	0	0,12
Koncentrace plazmy	0	0	16	10	0	0	39	16

Tato data ukazují, že injekce hirudinu (testovací skupina 2 a 6) způsobí zvýšení PTT nejméně ve výši 75 %, zvýšení TT nejméně ve výši 60 %, výskyt vysokého aPT a žádnou detekci trombinu v plazmě.

Samotné podání trombinu-Asn99 (testovací skupina 3) a meizotrombinu (testovací skupina 7) nevykazuje žádné významné změny v parametrech srážlivosti, ve srovnání s testovacími skupinami 1 případně 5 však bylo možné oba proteiny detekovat v myší plazmě.

Injekce hirudinu, následovaná trombinem-Asn99 (testovací skupina 4) a injekce hirudinu, následovaná meizotrombinem-Asn99 (testovací skupina 8) má za výsledek normalizaci PTT a TT, přičemž aPT je výrazně redukováno. Oba proteiny tedy evidentně mohou neutralizovat hirudin v krtevním oběhu a přitom redukovat koncentraci volného hirudinu.

-55Komplexní hirudinové formy trombinu-Asn99 a meizotrombinu-Asn99 jsou méně reaktivní oproti imobílizovanému hirudinu a proto byly v plazmě nalezeny nižší koncentrace trombinu-Asn99 a meizotrombinu-Asn99.

Claims (15)

1. Mutanty protrombinu nebo jejich deriváty, vyznačující se tím, že vykazují výměnu aminokyseliny Asp-419, vztaženo na číslování aminokyselin v protrombinu podle obrázku 1, vykazují aktivitu nejvýše asi 0,25 % přirozeného proteinu a u nichž změna sekvence proteinů neovlivňuje vaznou kapacitu k hirudinu, heparinu a antitrombinu III.

2. Mutanty protrombinu nebo jejich deriváty podle nároku 1, vyznačující se tím, že vykazují poločas in vivo více než jednu hodinu.

3. Mutanty protrombinu nebo jejich deriváty podle nároku 1, vyznačující se tím, že vykazuj í poločas in vivo nejvýše 10 minut.

4. Mutanty protrombinu nebo jejich deriváty podle některého z nároků 1 až 3,vyznačující se tím, že je vyměněna aminokyselina Asp-419 za Asn.

5. Mutanty protrombinu nebo jejich deriváty podle jednoho z nároků 1 až 4,vyznačující se tím, že vykazují výměnu aminokyseliny Cys-293 a/nebo Cys-439, vztaženo na číslování aminokyselin v protrombinu podle obrázku 1.

6. Mutanty meizotrombinu vyznačující se tím, že jsou strukturně stabilní, vykazují výměnu nejméně jedné aminokyseliny v aktivním centru, vykazují aktivitu nejvýše asi 0,25 % přirozeného proteinu a u nichž změna sekvence proteinů neovlivňuje vaznou kapacitu ke specifickým ligandům a receptorům.

7. Mutanty meizotrombinu podle nároku 6, vyznačující se tím, že vykazuj í výměnu aminokyselin Cys-293 a/nebo Cys-439, vztaženo na číslování aminokyselin v protrombinu podle obrázku 1.

8. Mutanty meizotrombinu podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že je vyměnněna aminokyselina Asp-419 za Asn.

9. Farmaceutické přípravky obsahující mutanty protrombinu nebo jejich deriváty které vykazují výměnu aminokyseliny Asp-419, vztaženo na číslování aminokyselin v protrombinu podle obrázku 1, vykazují aktivitu nejvýše asi 0,25 % přirozeného proteinu a u nichž změna sekvence proteinů neovlivňuje vaznou kapacitu k hirudinu, heparinu a antitrombinu III, a fyziologicky snášelnivý nosič.

10. Farmaceutické přípravky podle nároku 9, vyznačující se tím, že vykazuj í výměnu aminokyselin Cys-293 a/nebo Cys-439, vztaženo na číslování aminokyselin v protrombinu podle obrázku 1.

11. Farmaceutické přípravky podle nároku 9 nebo 10, vyznačující se tím, že v podstatě neobsahují virovou kontaminaci a znečištění zbytkovou DNA z expresní linie.

12.

Použití mutantů protrombinu nebo jejich derivátů,

-58··· • · ♦· • ••4 · které vykazují výměnu aminokyseliny Asp-419, vztaženo na číslování aminokyselin v protrombinu podle obrázku 1, vykazují aktivitu nejvýše asi 0,25 % přirozeného proteinu a u nichž změna sekvence proteinů v podstatě neovlivňuje vaznou kapacitu k hirudinu, heparinu a antitrombinu III, k výrobě léčiva k zamezení vedlejších efektů při antikoagulačním ošetřování hirudinem, heparinem, antitrombinem III a/nebo jejich derivátům.

13. Použití podle nároku 12, vyznačující se tím, že mutanty protrombinu vykazují výměnu aminokyselin Cys-293 a/nebo Cys-439, vztaženo na číslování aminokyselin v protrombinu podle obrázku 1.

14. Použití mutantů protrombinu nebo jejich derivátů, které vykazují výměnu aminokyseliny Asp-419, vztaženo na číslování aminokyselin v protrombinu podle obrázku 1, vykazují aktivitu nejvýše asi 0,25 % přirozeného proteinu a u nichž změna sekvence proteinů v podstatě neovlivňuje vaznou kapacitu k hirudinu, heparinu a antitrombinu III, k výrobě přípravků, které vykazují antagonistický účinek proti přirozeným nebo syntetickým inhibitorům trombinu, obzvláště hirudinu, heparinu, antitrombinu III a/nebo jejich derivátům.

15. Použití podle nároku 14, vyznačující se tím, že mutanty protrombinu vykazují výměnu aminokyselin Cys-293 a/nebo Cys-439, vztaženo na číslování aminokyselin v protrombinu podle obrázku 1.