FI103577B - Menetelmä, DNA ja mikro-organismi trombolyyttisen aineen valmistamisek si - Google Patents

Description

103577

Menetelmä, DNA ja mikro-organismi trombolyyttisen aineen valmistamiseksi Tämä keksintö liittyy menetelmään olennaisesti puh-5 taan proteiinin valmistamiseksi, joka on trombolyyttinen aine, joka aktivoi plasminogeenin fibriinin läsnäollessa mutta ei olennaiseti fibrinogeenin läsnäollessa, ja joka on allosteerinen, ja joka proteiini on v-PAel, jolla on kuviossa 26a esitetty aminohappojakso. Keksintö koskee myös trom-10 bosyyttistä ainetta koodaavaa eristettyä DNA:ta ja sillä transformoitua mikro-organismia.

Trombooseja muodostuu, kun verisuoniin muodostuu verihyytymiä. Nämä ovat erotettavissa laskimotrombooseihin, joihin kuuluu keuhkoveritulppa, ja valtimotrombooseihin, 15 joihin kuuluu akuutti sydäninfarkti.

Keuhkoveritulppa ja sydäninfarkti ovat hengenvaarallisia sairaustapauksia, joiden kulkuun on välittömästi puututtava lääketieteellisin toimenpitein.

Monien erilaisten potilaaseen tunkeutumista vaati-20 vien menetelmien lisäksi yle iseksi valtimo- ja laskimotrom- boosien hoitomuodoksi on viime vuosina kehittynyt trombien entsymaattinen hajottaminen plasminogeeniä aktivoivien aineiden avulla. Nämä trombolyyttisiksi aineiksi kutsutut aineet muuttavat plasminogeenin, veren fibrinolyysisystee-25 min inaktiivisen esiasteen entsyymin aktiiviseksi prote- \ olyyttiseksi entsyymiksi, plasmiiniksi. Plasmiini vuoros- • · ,,, taan liuottaa fibriiniä, joka on säiemäistä ainetta ja muo- • · < dostaa merkittävän osan verihyytymästä, ja tästä liukenemisesta seuraa tukkeutuneiden suonten aukeaminen uudelleen ja « · · V * 30 veren virtauksen palautuminen ennalleen. Plasmiini on kui- : tenkin suhteellisen epäspesifinen proteaasi, eli muodostut- : .·. tuaan veressä se tuhoaa proteolyysillä verenvuodon pysäyt- '···, tämisessä korvaamattomia komponentteja (esim. fib- rinogeeniä) ja siten on vaarana, että se tietyissä olosuh-35 teissä aiheuttaa vaarallisia verenvuotoriskejä.

2 103577

Ensimmäisen sukupolven trombolyyttiset aineet, streptokinaasi ja urokinaasi, ovat yhdisteitä, jotka verenkiertoon ruiskutettuina muuttavat plasminogeenin plas-miiniksi kaikkialla verenkierrossa ja aloittavat koko ve-5 renkierron kattavan proteolyysin. Hoidettaessa veritulppia näillä yhdisteillä hoitoon liittyy tästä syystä usein verenvuodosta aiheutuvia komplikaatioita. Otaksuttiin, että tämä ongelma tulisi ratkeamaan tämän jälkeen kehitetyllä f ibriinispesif isellä trombien hajotuksella, jossa käytetään 10 kudostyyppisiä yhdistelmä-plasminogeeniaktivaattoreita, joista käytetään lyhennettä t-PA. Verenkierrossa t-PA:lla on vain alhainen affiniteetti plasminogeeniä kohtaan. Kuitenkin, kun läsnä oli säiemäinen aine, fibriini, jonka kanssa t-PA reagoi spesifisten sitoutumiskohtien avulla, 15 tämä affiniteetti kasvaa moninkertaiseksi ja saa aikaan plasmiinin muodostumisen veritulpan pinnalle. Tämä käsitys pystyttiin todistamaan in vitro -olosuhteissa suoritetuissa kokeissa ja eläinkokeissa, kuitenkin kliiniset tutkimukset osoittavat, että sepelvaltimotukoksen nopeaan liuottamiseen 20 tarvitaan suuria määriä t-PA:ta.

Jos kuitenkin näin suuria t-PA-annoksia annetaan in-fuusiona, se johtaa koko verenkierrossa tapahtuvaan prote-olyysiin, josta seuraa tähän liittyvä verenvuodon vaara samoin kuin streptokinaasin ja urokinaasin tapauksessa oli 25 asianlaita. Niinpä tästä ilmiötä kuvaamaan käytetään nykyi sin ilmaisua t-PA:n suhteellisesta fibriinispesifisyys. Kyseisten ongelmien syynä on t-PA:n ominaispiirre: tämä • · · * molekyyli on aktiivinen proteaasi, joka suotuisissa olosuh teissa (suuri entsyymipitoisuus, pitkä altistusaika, suuri • · · : 30 substraattipitoisuus, optimaalinen pH ja ioniympäristö) •S · muuttaa plasminogeenin plasmiiniksi jopa silloin, kun fib- ; ’·. riiniä ei ole läsnä. Kaikki nämä ehdot täyttyvät nykyisin käytössä olevassa tavallisessa t-PA: 11a suoritettavassa kliinisessä hoidossa.

35 Koetettaessa löytää spesifisempiä, nämä fibriinis- pesif isyysvaatimukset täyttäviä plasminogeeniaktivaattorei- 3 103577 ta, löydettiin uusi luonnossa esiintyvä fibrinolyyttisesti aktiivinen aine, jota kutsutaan v-PA:ksi.

Tämä trombolyyttinen aine, v-PA saadaan Desmodus-suvun lepakoiden syljestä ja sillä on seuraavat luon-5 teenomaiset piirteet: sylkirauhasen cDNA-pankista löydettiin neljä erilaista cDNA:ta, jotka koodaavat neljää erilaista v-PA-pro-teiinia: (1) v-PA ax: suurimolekulaarinen muoto, joka koostuu 10 sormi-rakennealueesta, EFG-rakennealueesta (epidermin kas vutekijä) , Kringel-rakennealueesta ja proteaasirakennealu-eesta (esimerkki 18).

(2) v-PA a2: suurimolekulaarinen muoto, joka koostuu samoista rakennealueista kuin v-PA ox, mutta eroaa v-PA

15 ocystä sekä nukleotidi- että aminohappojaksoltaan.

(3) v-PA β: molekulaarinen muoto, joka koostuu EGF--rakennealueesta, Kringel-rakennealueesta ja proteaasi-rakennealueesta (esimerkki 18) .

(4) v-Pa : pienimolekulaarinen muoto, joka koostuu 20 Kringel-rakennealueesta ja proteaasirakennealueesta.

Aktiivisen aineen, v-PA ox:n, suurin proteiinivyö-hyke osoittaa molekyylipainon olevan 43 000 ± 2 000 (esimerkki 2) määritettynä natriumdodekyylisulfaattigeeli-elektroforeesilla pelkistämättömissä olosuhteissa.

25 Aktiivisen aineen, v-PA β:η, suurin proteiinivyöhyke osoittaa molekyylipainon olevan 39 000 ± 3 000 määritettynä • · natriumdodekyylisulfaattigeelielektroforeesilla pelkistä- • * * *·" ' mättömissä olosuhteissa ja pelkistävissä olosuhteissa mää ritys osoittaa molekyylipainon olevan 43 000 ± 2 000 (esi- ·.· · 30 merkki 1) .

• · · ; Aktiivisen aineen, v-PA, β:η, aktiivinen muoto ; .·. eluoituu geelisuodatuspylväästä ("Superose" 12) molekyyli- • · · ''··, painon ollessa 40 000 ± 2 000 (esimerkki 1) .

Aktiivisen aineen, v-PA β:η, isoelektriset pisteet 35 (pl) vaihtelevat välillä 6,8 - 8,5.

103577 4

Aktiivinen aine reagoi 3H-di-isopropyylifluori-fosfaatin kanssa ja se on siten seriiniproteaasi (esimerkki 9) .

Aktiiviset aineet, v-PA ja v-PA β, hydrolysoivat 5 kromogeenisia peptidejä S-2288 (H-D-Ile-Pro-Arg-pNA) ja S-2444 (<Glu-Gly-Arg-pNA), mutta ei kromogeenistä peptidiä S-2251 (H-D-Val-Leu-Lys-pNA) (esimerkki 16).

Aktiivinen aine ei sitoudu lysiini-"Sepharose"-geeliin pH-alueella 4 - 10,5.

10 Aktiiviset aineet, v-PA ja v-PA β, muodostavat kirkkaan hajoamista osoittavan renkaan fibriinimaljoilla, mutta eivät kaseiinimaljoilla (esimerkki 15).

Aktiiviset aineet, v-PA ax ja v-PA β, sitoutuvat pH:ssa 7,5 Zn++-kelaatt i -"Sepharose"-geeliin (esimerkit 1 15 ja 2).

Aktiivinen aine, v-PA β, aktivoi plasminogeenin ai-nostaan stimuloivien aineiden, kuten fibriinin, läsnäollessa, mutta ei fibrinogeenin läsnäollessa (esimerkki 7).

Aktiivinen aine, v-PA β, ei noudata klassista 20 Michaelisin ja Mentenin kinetiikkaa muuttaessaan plasmino- geeniä plasmiiniksi fibriinimonomeerien läsnäollessa; v-PA β on ailosteerisia ominaisuuksia omaava entsyymi (esimerkki 12) .

Aktiivinen aine hajottaa in vitro -olosuhteissa kon-25 sentraatiosta riippuvalla tavalla ihmisen kokoverihyytymiä (esimerkki 8).

• ·

Liuotetussa hyytymän muodostukseen kykenevässä in • · · ’·’ ’ vitro -systeemissä aktiivinen aine v-PA β ei t-PA:sta poi keten aiheuta mitattavissa olevaa fibrinogeenin hajoamista ·.· * 30 (esimerkki 10) .

• · · :t: : In vitro -olosuhteissa suoritetussa fibrinolyysiko- ; keessa (kansainvälinen hyytymän hajotusmääritys) aktiivinen • · · aine aiheuttaa fibrinolyysin konsentraatiosta riippuvalla tavalla (esimerkki 13).

5 103577

Aktiiviset aineet, v-PA a: ja v-PA β, sitoutuvat hepariini-"Sepharose"-geeliin ja ne voidaan edelleen elu-oida siitä sopivien liuosten avulla (esimerkki 4).

Aktiivinen aine sitoutuu immobilisoituun inhibiitto-5 riin, joka on eristetty eri Erythrina-lajien siemenistä, ja aktiivinen aine voidaan jälleen erottaa siitä sopivilla liuoksilla (esimerkki 3).

Aktiiviset aineet, v-PA ax ja v-PA β, sitoutuvat fibriini-"Celite" reen ja ne voidaan eluoida siitä uudelleen 10 sopivilla menetelmillä (esimerkki 5).

Aktiivinen aine sitoutuu hydroksiapatiittiin tietyissä olosuhteissa ja voidaan jällen eluoida siitä fosfaattia sisältävällä puskuriliuoksella (esimerkki 2).

Aktiiviset aineet, v-PA ja v-PA β, voidaan erot-15 taa toisistaan ja eristää sopivilla menetelmillä (esimerkit 2, 4 ja 5) .

Aktiiviset aineet, v-PA ja v-PA β, eroavat toisistaan N-terminaalisen pään aminohappojaksonsa osalta (esimerkki 6) .

20 Aktiiviset aineet, v-PA a1 ja v-PA β, eroavat toi sistaan aminohappo- ja nukleiinihappojaksonsa osalta (esimerkki 18) .

Aktiivisia aineita vastaava koodaava jakso voidaan liittää vastaavaan "septan"-vektoriin. Nämä ilmentävät ak-25 tiivistä ainetta sopivissa eukaryoottisolusysteemeissä (esimerkki 19) .

• · ... Trombolyyttinen aktiivinen aine v-PA edustaa uutta, « · · • « · • luonnossa esiintyvää plasminogeeniaktivaattoria, joka liuottaa verihyytymiä ihmisen ruumiissa ja siten sopii esi- *.* * 3 0 merkiksi sydäninfarktin hoitoon.

• · « · Tämä aine esiintyy kaikkien Desmodus-suvun lepakko- : lajien syljessä pieninä pitoisuuksina ja tämän eläintyypin sylkirauhasten solut luultavasti ilmentävät sitä. Desmodus-suvun lepakkolajit käsittävät kaikki Amerikan mantereella 35 tavattavat lepakkolajit. Keski-Amerikasta ja Meksikosta tavattavaa Desmodus-sukua on tutkittu erityisen perusteellisesti .

103577 6 Tämä keksintö koskee menetelmää v-PAel:n valmistamiseksi, jolla on kuviossa 26a esitetty aminohappojakso. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. v-PA:ta voidaan myös 5 eristää Desmodus-suvun lepakkolajin syljestä lisäämällä sentrifugoitu sylki puskuriliuokseen, suorittamalla kromatografinen erottaminen "Sepharose"-Zn**-kelaattipylväässä, eluoimalla aktiivinen aine, v-PA, kvantitatiivisesti pylvään pesun jälkeen, suodattamalla talteen otetut fraktiot 10 suolattomissa olosuhteissa "Superose" 12-geeliä käyttäen ja lopuksi suorittamalla fraktioille geelisuodatus fysiologisen suolaliuoksen läsnäollessa. Menetelmässä käytettävät tarkat muuttujat on esitetty esimerkissä 1.

Tämä keksintö käsittää lisäksi eristettyä DNA:ta, 15 jolle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 4 esitetään.

Trombolyyttisen aineen, v-PA:n, paremmuus t-PA:han verrattuna käy ilmi myöhemmin esitetyistä esimerkeistä 7, 8, 10 ja 15.

20 Olennaisesti puhtaalla tarkoitetaan, että proteiini on puhdistettu, esimerkiksi siinä määrin, että sen aktiivisuus on lisääntynyt merkittävästi luonnossa esiintyvään proteiiniin verrattuna. Edullisesti proteiini puhdistetaan niin, että se on homogeeninen ja edullisimmin on vähintään 25 90-prosenttisesti ja erityisen edullisesti yli 95-prosent- • · tisesti puhdas tai vielä tätäkin puhtaampi.

• · ... Tämän keksinnön mukaiset DNA-jaksot voidaan rutii- • · * J * f ’ ninomaisesti liittää tavallisiin, esimerkiksi kaupallisesti saatavilla oleviin vektoreihin, kuten plasmideihin, faagei- « · · *·' ' 30 hin jne., jotka ovat käyttökelpoisia ilmentämiseen esimer- • · · ·.· * kiksi tavallisissa, esimerkiksi kaupallisesti saatavilla j .*. olevissa solulinjoissa. Keksinnön kohteena on siten edel leen mikro-organismi, jolle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 5 esitetään.

35 v-PA:n jaksoja kohtaan spesifiset oligonukleotidi- koettimet konstruoidaan rutiininomaisesti valikoimalla joh- 7 103577 tojaksoalueella tai koko jakson aluella esiintyvät jaksot, jotka eroavat t-PA:sta (ks. kuviossa 27 esitettyä vertailua) .

5 VPA—& 141 CTGTTGTGTGTACTGCTGCTTTGTGGAGCAGTCTTCTCGTTGCCCAGGCA 190 . J III tilli 11111111 111111 m 111111 I Hill Ml t-PA 98 CTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCAGCCA 147 VPäR 191 GGAAACCTACAGGCAaTTGGCAAGGG 216 , 7; IMIN I I III III I , t-PA 148 GGAAATCCATGCCCGATTCAGAAGAG 173 10 Yllä on esitetty DNA-jaksot, jotka edustavat koetin- ta (νΡΑβ) , jolla seulottiin vPAp-klOonista BamHI- ja Alul-restriktioentsyymeillä pilkkomalla saatu cDNA-kirjasto, ja vastaavaa t-PA-cDNA-kloonista saatua jaksoa (t-PA).

Vasta-aineita voidaan myös valmistaa rutiininomai- 15 sesti tavallisilla menetelmillä, esimerkiksi aiheuttamalla niiden muodostuminen eläimissä, kuten vuohissa.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistettua v-PA:ta voidaan antaa t-PA:n käytön suhteen analogisella tavalla nisäkkäille, ihmiset mukaan lukien, mutta sen käyttöön liit- 20 tyy edellä tarkastellusta v-PA:n valikoivuudesta johtuen vähemmän sivuvaikutuksia. Yleensä voidaan käyttää pienempiä annoksia kuin mitä t-PA:ta käytettäessä jouduttaisiin antamaan. Sopivat aktiivisuudet voidaan määrittää rutiininomaisesti käyttämällä tavanomaisia menettelytapoja.

25 Tyypillisiin oireisiin kuuluvat ne oireet, joissa trombo- lyyttiset aineet ovat käyttökelpoisia, esimerkiksi sydänin-farkti, sydänkohtaus, valtimotromboosi jne. Farmaseuttisten • · · formulaatioiden valmistuksessa voidaan käyttää tavallisia galeenisia lisäaineita.

3 0 Esimerkki 1 (Vertailuesimerkki) • # · • · ·

V * Pääasiassa molekulaarisessa muodossa olevaa v-PA

l β : aa sisältävän Desmodus rotundus -vampyyri lepakon 60 ml: n • · · · .***. sylkinäytteen käsittely (a) Zn++-kelaatti-"Sepharose"-kromatografia ' ’ 35 60 ml sylkeä sentrifugoidaan 4 °C:n lämpötilassa ja 6 000 x g:n voimalla. Tästä saatu supernatantti lisätään 103577 8 liuokseen, jonka koostumus on 20 millimoolia Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl ja 0,01 % "Pluronic" F68, ja tämä viedään kro-matografiapylvääseen, joka on täytetty 200 ml :11a kelaat-ti-"Sepharose"-fast flow-geeliä ja tasapainotettu liuok-5 sella, jonka koostumus on 10 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM imidatsoli ja 0,01 % "Pluronic" F68. Pylväs pestään tällä puskuriliuoksella kunnes optinen tiheys 280 nm:n aallonpituudella mitattuna saavuttaa perustason (noin 600 ml). Tämän jälkeen v-PA eluoidaan 1 - 50*mM imidatso-10 ligradientilla (1000 ml), joka on valmistettu liuokseen, jonka koostumus on 10 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl ja 0,01 % "Pluronic" F68 (kuvio 1). Tämä puhdistusvaihe suoritetaan 4 °C:n lämpötilassa.

15 AUFS = Absorptioyksikköjä, koko mitta-alue ---- Amidolyyttinen aktiivisuus i x Y* Π3 U*

* 1, 6 1 600 S

20 f _ » -h ”i / \ l / +j ή 1,2 / L d200 >1^

s / H

3-ο,β / f η «·· ,5 a / 1 / A'-al 'f i * °'f : : : 200 <00 600 900 1000 1200 mi 30 : (b) Geelisuodatus ilman NaCl:a . 5 ml:n erälle Zn**-kelaatti-"Sepharose"-kromato- • · ·

grafiästä saatua v-PA:ta sisältävää fraktiota suoritetaan kromatografia "Superose" 12 HR16/50-kromatografiapylväässä 35 (Pharmacia) käyttäen liuosta, jonka koostumus on 20 mM

9 103577

Tris, pH 8,0, ja 0,01 % "Pluronic" F68, käyttäen FPLC-sys-teemiä (Pharmacia) (kuvio 2).

Amidolyyttinen aktiivisuus 5 b.

Z> * · 0,4 4000- • 11 en

P

P

ω

10 ' H

1 Ή •0,3 ,Ί 3000· ί; ~ i c

e i S

c < c

' -tH

O V I 4-> ™ 0 2 m Γ' 2000- 15 - ' , o ε i ' c \ I ' / -H *

. . / \ H UJ

•5 A ! I -H >1 •h Λ 1 : * ^ ~ 2 * 0,1 I \ j \ ; \ 1000-

20 I ......J. /^vvf I

i . , i tr j’iaai jaa 1T

10 30 50 70 90 ml Tässä puhdistusvaiheessa erottuu proteaasi, jolla 25 ei ole lainkaan fibrinolyyttistä aktiivisuutta. v-PA:ta ^ . sisältävät fraktiot yhdistetään.

• · (c) Geelisuodatus NaCltn läsnäollessa « « · *·* * Ylläkuvatuista v-PA:ta sisältävistä yhdistetyistä fraktioista otettu 2 ml:n erä väkevöidään kylmäkuivaamalla » · · · 30 0,2 ml:ksi ja sille suoritetaan kromatografia "Superose" : 12 HR 10/30 -kromatografiapylväässä (Pharmacia) liuokses- : .·. sa, jonka koostumus on 50 mM Tris pH 8,0, 160 mM NaCl ja • · · • · · · 103577 10 0,01 % "Pluronlc" F68 FPLC-systeemin (Pharmacia) avulla (kuvio 3).

Kuvio 3 5 Geelisuodatus

Amidolyyttinen aktiivisuus w 800 tu „ 10 = - •0.04 - / λ: « 600 - w V V V w * 3 is ·°·°3 t

... S

^ c E Φ

c -S

o *0.02 ϋ ω >, rs >- 20 ~ 200 - 8 •H £ 3 0,01 I .

2 I I o 25 I ~r? „ 1— -I»., — · jk ml 10 20 30 tl» v-PA eluoituu homogeenisenä, terävänä huippuna mo-lekyylipainon ollessa noin 40 000.

' 30 Kootut tulokset puhdistusmenetelmästä on esitetty • · · .* ‘ kuviossa 4.

• · · • · · • · · · 11 103577

cu tn to I

i tn 3 3 -h +J O 4J 4-1 <0 ra 3 co ra a -h ra ra tj n -hm Vimi. λ a

i—i ,3 O O i—I CU KUVIO 4A

ω tx 3 r-t 3 ή >ιλ; ,y cu tn υ ie u >i H I W -H ra -H ra Λί S-l K + = M Z Ή IZ ω ra

i—\ 4" i cu a) •“T E

>, 3 -h <u cu o o in N+Jui o + Se äSll_____ H |

6Ö QOQ

Ψ 3D ooa ;; mi 20 qoq

Mm 11* 000 •H ed O-ι *H •H u

^ ,¾ Kuvio 4B

>1 .* .m u <u ta 4— ►— i—I £

t— >- O O

a o s e 1 * • « » Λ ;·:·; —93 000 68 000 » · · __ •««

30 000 Z0 000 - 11» D0Q

103577 12

Kuviossa 4A on esitetty kustakin puhdistusvaiheesta saaduille näytteille pelkistämättömissä olosuhteissa suoritettu SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi herkällä hopeavärjäysmenetelmällä värjättynä. Kuviossa 4B on osoi-5 tettu, että v-PA β koostuu proteiiniketjusta, koska DTT:llä suoritetun disulfidisiltojen pilkkomisen aikana molekyyli ei katkea kahdeksi proteiinivyöhykkeeksi. Tapahtui ainoastaan molekyylipainon näennäinen kohoaminen mutta tämä selittyy sillä, että DTT suoristaa proteiiniketjun.

10 Rikastetusta aktiivisuudesta valmistetuille väke- vöintituotteille suoritetaan SDS-geelielektroforeesi pelkistämättömissä olosuhteissa vahvuudeltaan 8 - 25-prosent-tisessa gradienttigeelissä. Useat näistä geeleistä värjätään hopeavärjäyksellä proteiinien visualisoimiseksi, toi-15 set pestään "Triton" X-100:ssa (1 %) SDS:n poistamiseksi ja asetetaan fibriini-indikaattorigeelille, joka sisältää plasminogeeniä (Fibrin-Zymographie; Granelli-Piperno, A. ja Reich, E., j. Exp. Med. 148 (1978) 223 - 234).

Aktiivisen aineen, v-PA β:η, aktiivisuus, joka voi-20 daan tunnistaa indikaattorigeelissä olevan kirkkaan hajoamista osoittavan aukon perusteella, vastaa proteiinivyöhykettä, jonka näennäinen molekyylipaino on 39 000 ± 3 000. Kirkas hajoamista osoittava aukko voidaan havaita ainoastaan plasminogeeniä sisältävissä fibriini-indikaattorigee-25 leissä, mutta ei plasminogeeniä sisältämättömissä fibrii- *J**i ni-indikaattorigeeleissä eikä plasminogeeniä sisältävissä kaseiini-indikaattorigeeleillä. Samanlaisille menetelmille altistettu t-PA muodostaa kirkkaita hajoamista osoittavia aukkoja myös plasminogeeniä sisältävissä kaseiini-indi-30 kaattorigeeleissä.

• · t

Puhdistetun aktiivisen aineen, v-PA β:η, aktiivi- « · • t t : suus onkin identtinen sellaisen proteiinin kanssa, jonka näennäinen molekyylipaino on 43 000 ± 2 000 (pelkistävissä olosuhteissa SDS-polyakryyliamidielektroforeesissa, kuvio 35 4B), ja joka muuttaa plasminogeenin plasmiiniksi fibriinin 13 103577 läsnäollessa, mikä johtaa säikeisen aineen, fibriinin, hajoamiseen. Toisin kuin t-PA, joka voi aktivoida plas-minogeenin myös kaseiinin läsnäollessa, v-PA ei kykene muuttamaan plasminogeenia plasmiiniksi kaseiinin läsnäol-5 lessa.

Tätä keksintöä voidaan luonnehtia edelleen jäljempänä esitettyjen esimerkkien valossa.

Esimerkki 2 v-PA ax:n ja v-PA β:η puhdistaminen ja erottaminen 10 Desmodus rotundus -vampyyrilepakon syljestä (a) Zn**-kelaatti-"Sepharose"-kromatografia 20 ml sylkeä sentrifugoidaan 4 °C:n lämpötilassa ja 6 000 x g:n voimalla. Tästä saatu supernatantti lisätään liuokseen, jonka koostumukseksi säädetään 20 mM Tris 15 pH 7,5, 100 mM NaCl ja 0,05 % "Pluronic" F68. Kromatogra-fiapylväs täytetään 8 ml:lla kelaatti-"Sepharose":a ja se on tasapainotettu liuoksella, jonka koostumus on 10 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM imidatsoli ja 0,05 % "Pluronic" F68 ja syljestä saadulle supernatantille suorite-20 taan siinä kromatografia. Pylväs pestään tasapainotuspus-

kuriliuoksella. Tämän jälkeen eluoituu pääasiassa v-PA aL, joka sisältää vielä pienen osan v-PA p:aa, liuoksella, jonka koostumus on 10 mM Tris pH 7,5, 1 M NaCl, 1 mM

imidatsoli ja 0,05 % "Pluronic" F68. Tämän jälkeen eluoi-25 tuu v-PA β, joka vielä sisältää pienen määrän v-PA :tä, 1-50 mM imidatsoligradientilla, joka on valmistettu liuokseen, jonka koostumus on 10 mM Tris pH 7,5, 100 mM

NaCl ja 0,05 % "Pluronic" F68.

• · · • t 1 • · « « • · 1 • 4 m • · · « · # ♦ · • ♦ · • · ♦ · w 103577 14

Kuvio 5

Syljen Zn**-kelaatti“”Sepharose"-kromatografia ♦' » Fibrinolyyttinen aktiivisuus

M

u. Γη--— — / 5 D / «c / v-PAe1 / ° v-PAfl1 // tn «“ I "V / 3

<?/ I

i 5 f/ s 10 Ή > 1 S S j? // s - /f s c M V-PAO £ 3 3 v-ΡΑα, / 3 0) C I / rg

4-> 'Hi, / -H

0 o / ε 15 ä 3 / 1 \ ω I /ί'·Λ 1 1 i .............................. -- i

Yhdistetyt fraktiot 20 (b) Hydroksiapatiittikromatografia

Kromatografiapylväs täytettiin 8 ml:11a hydroksi-apatiittia ja se tasapainotettiin liuoksella, jonka koostumus on 50 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl ja 0,01 % "Pluro-nic" F68. Zn**-kelaattikromatograf iästä saadut aktiivista 25 ainetta sisältävät yhdistetyt fraktiot viedään hydroksi-apatiittipylvääseen ja pestään tasapainotuspuskuriliuok-[ 1 sella, ja v-PA eluoidaan 0,5 - 100 mM:sella Na-fosfaatti- ‘ gradientilla, pH 7,5, joka on valmistettu liuokseen, jonka koostumus on 500 mM NaCl ja 0,01 % "Pluronic" F68 (kuvio • 'I ? 30 6). Aktiiviset fraktiot yhdistetään.

• · « • « · • i t · • · » • · · • · · · 15 103577

Kuvio 6

Yhdistetyille Zn**-kelaattikromatografiafraktioille suoritettu hydroksiapatii11ikromatografia

(h / J

3 / £ ^ < / ^ * s /i? § / ^ 5

O ' / -P

/* t; /« >: 10 /0 /5 ° ΙΟ Ό f ·-. h IIO < c I' Il ^ S 1 \ s n /1 ijx +j

~ ^ /1 1« \ S

20 e ^ / I i‘ \ o

I / ; ·· \ I

?γΛ < i . Yhdistetyt fraktiot * ’ (c) Geelisuodatus ’ Yhdistetyt hydroksiapatiittikromatografifraktiot (kuvio 6) dialysoidaan liuosta vastaan, jonka koostumus on 30 20 mM Tris pH 8,0 ja 160 mM NaCl ja väkevöidään 0,6 mlrksi kylmäkuivaamalla. Tämä väkevöity tuote suodatetaan FPLC- • · • · · • · · ··· · 103577 16 systeemin avulla (Pharmacia) "Superose" 12 HR 16/50 -pylväässä (kuvio 7).

Kuvio 7 5 Yhdistettyjen hydroksiapatiittikromatografiafrak- tioiden geelisuodatus tn u.

io < i 03

S

° <U

% c

O -H

M

•U

H

O

15 11 1 2° 9 II « » « · • · · 30 • · « « · 1 *·' 1 Analysoitaessa geelisuodatuksesta saatujen aktii- visten fraktioiden väkevöintituotetta SDS-polyakryyli- • · · · amidigeelielektroforeesissa pelkistämättömissä olosuhteissa ja värjättäessä tämän jälkeen geeli "Coomassie"-sinellä 17 103577 saadaan näkyviin proteiinivyöhyke, jonka molekyylipaino on 43 000 (kuvio 8).

Kuvio 8 5 Kuvion 7 geelisuodatuksesta saadun v-PA ax:n SDS-polyakryyliamidielektroforeesi. M = molekyylipaino-markkeriproteiinit

M

10 i 93 000 «m»· ' 68 000 • · ‘ · i 43 000 v-PAa.

15 V ·.. ' 1 30 000 «K*· 20 000 ' 20

Kuten kuviosta 8 voidaan nähdä, v-PA on puhdas 25 muista proteiineista. Myös tästä puhdistetusta v-PA:sta saadaan esimerkissä le kuvatulla tavalla indikaattori-geelissä (fibriinitsymografia) hajoamista osoittava aukko, « · · ‘ joka vastaa identtistä molekyylipainoa 43 000. Tämä hajoa mista osoittava aukko havaitaan lisäksi ainoastaan plas- 30 minogeeniä sisältävässä fibriini-indikaattorigeelissä eikä plasminogeeniä sisältävässä kaseiini-indikaattorigeelissä.

• * ♦ ♦ · • · · ··* · 103577 18

Esimerkki 3 v-PA αχ:η ja v-PA β:η eluointi ja sitoutuminen Erythrina latissiman siemenistä saatuun DE-3-trypsiini-inhibiittoriin (ETI) 5 50 mg ETI:tä (Erytech Services LTD, Arcadia, Etelä-

Afrikka) kiinnitetään kovalenttisesti 6,6 g:aan aktivoitua CH "Sepharose" 4B:tä (Pharmacia) valmistajan ohjeiden mukaisesti. 16 ml sylkeä säädetään pH-arvoon 7,5 1-M:sella Tris:illä, pH 6,8 ja näytettä sentrifugoidaan 10 minuutin 10 ajan 4 °C:n lämpötilassa 6 000 x g:n voimalla. Kromatogra-fiaputki HR 10/2 (Pharmacia) täytetään 2 ml:11a ETI CH "Sepharose" 4B:tä (ks. yllä). Tämä affiniteettikromato-grafia suoritetaan FPLC-systeemin (Pharmacia) avulla. Tätä tarkoitusta varten sylkisupernatantti viedään ETI CH 15 "Sepharose" 4B:hen ja se pestään perusteellisesti liuoksella, jonka koostumus on 20 mM Tris pH 7,5, 400 mM NaCl, 1,6 M KSCN ja 0,05 % "Pluronic" F68. Tässä vaiheessa fib-rinolyyttinen sekä amidolyyttinen aktiivisuus eluoituvat yhdessä ja niitä vastaa yksi proteiinihuippu.

«

Iitti • · • « » · · I I I • · »♦ · • # · • · • · • « tl1 • « · * · · · · 19 103577

Kuvio 9 ETI-"Sepharose” 4b -kromatografia

Fraktiot

III I . I I 1 I

c £ 5 15 25

5 D 4J

< X

ITJ

° R

<1)

*- C

•H

I **

\ +J

i $

10 ;! I

:(0 I 1 ,r „ H I Ό 15 'Z γη I 1 ε ι I c c 2 ! ι £ u ι ι c S 2 I|! s ~ 1 1' £ ιΤ> I 1 1“· ί ‘ I 1 o s -1 ' n« .5 20 «j +j J llj λ 4-> C 1 II1 -rl O -H I III i1-i n ° I ill 2 ι Ik ♦

w ! || ^ I

25 Kun tätä kromatografista erottumista analysoidaan SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesin avulla pelkistä- ***** mättömissä olosuhteissa, voidaan varmistaa v-PA:n kahden • · : : ' muodon, v-PA at:n ja v-PA p:n voimakas rikastuminen.

• · · • · « · • · • · · • · · 1 · 20 1 0 3 5 7 7

Kuvio 10 SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (12,5 H) pelkistämättömissä olosuhteissa värjättynä tämän jälkeen "Coomassie"sini-väriaineella. I: 10 μΐ sylkeä, D: 10 pl 5 pylvään suoraan läpäissyttä materiaalia, M: molekyyli- painomarkkeriproteiinit, 16 - 21: fraktioiden numerot kuviosta 9

Il H pjj M 68 000 I l *** M m- ψφ* 43 000

Jh. βΙ - v-pao uoo°

20 I D 16 17 18 19 20 21 M

Tässä sylkinäytteessä esiintyvät kaksi v-PA:n mole-kulaarista muotoa sitoutuvat yllämainituissa olosuhteissa ETI-CH "Sepharose" 4B:hen ja ne voidaan eluoida 1,6 M 25 KSCN:n tai muiden kaotrooppisten aineiden läsnäollessa.

Tämä pitää paikkansa kaikkien aktiivisen aineen muotojen osalta.

• · • · 4

Esimerkki 4 • *.· Aktiivisten aineiden, v-PA c^rn ja v-PA β:η, *:"ϊ 30 eluointi ja sitoutuminen hepariini-"Sepharoseen" : Pakkaamaton FPLC-pylväs (HR 5/5) täytetään yhdellä millilitralla hepariini-"Sepharose":a (Pharmacia). ETI-CH .*·* "Sepharose" 4B -kromatografiästä saatu fraktio 18 (esi merkki 3, kuviot 9 ja 10) dialysoidaan liuosta vastaan, 35 jonka koostumus on 20 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl ja 0,01 % 21 103577

"Pluronic" F68 ja sille suoritetaan kromatografia heparii-ni-"Sepharose":11a FPLC-systeemin (Pharmacia) avulla. Dia-lyysista saadun fraktion lisäämisen jälkeen pylväs pestään liuoksella, jonka koostumus on 20 mM Tris pH 7,2, 50 mM

5 NaCl ja 0,01 % "Pluronic" F68 ja eluoidaan sen jälkeen 50-1 000 mM NaCl-gradientilla, joka on valmistettu liuokseen, jonka koostumus on 20 mM Tris pH 7,2 ja 0,01 % "Pluronic" F68 (kuvio 11).

10 Kuvio 11 ETI-CH-"Sepharose" 4B:stä saadun (esimerkki 3, kuviot 9 ja 10) esipuhdistetun aktiivisen aineen, v-PA:n, hepariini-"Sepharose"-kromatografia

Fraktiot 15 I I I '1 | j

W 10 20 30 / J

lu / y.

0 /o

< I 4~l C

(Λ £7 O C

O *J / IB H

o a / +J

90 ΐ >i o· / fr r—)

£ f O

i /° .S

? /O £ t /O ^

!« /O

il r 25 f\ w - li/ * 1 Iff si • ’ O I m :··*: e i1 . c : , /1 g ....: w il -h

• · 30 I, . SS

5 \ :/1 $ ? \ i i 1 : - j IM.. 11 22 103577

Kuvio 12

Hepariini-"Sepharose"-kromatograflasta (kuvio 11) saaduille aktiivista ainetta sisältäville fraktioille suoritettu SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (12,5 %) 5 pelkistämättömissä olosuhteissa ja sitä seurannut värjäys "Coomassie" Blue -väriaineella. M: Molekyylipainomarkkeri-proteiinit. Numerot vastaavat kuvion 11 fraktioita.

im H 25 26 27 28 29 30 20

Hepariini-"Sepharose" -kromatografiän avulla on mahdollista esimerkiksi sitoa ja eluoida molekulaariset v-PA dj- ja v-PA β -muodot, ts. puhdistaa ne. Kuten kuvioista 11 ja 12 voidaan nähdä, v-PA:n molekulaarinen muo-25 to, v-PA β, sitoutuu heikommin hepariini-"Sepharoseen" kuin molekulaarinen v-PA a1-muoto, ts. v-PA β:η eluoimisek- • · . . si tarvitaan pienempi NaCl-konsentraatio kuin mitä tarvi- • · · '·1·’ taan v-PA o^rn eluointiin. Niinpä tässä esimerkissä kuvat- « · · t ·1 tujen kromatografisten menetelmien avulla on mahdollista ’·**' 30 erottaa nämä kaksi v-PA:n muotoa toisistaan.

« · · · Esimerkki 5

Aktiivisten aineiden, v-PA c^in ja v-PA β:η, eluointi ja sitoutuminen fibriini-"Celiteen"

Af f initeettiväliaine fibriini-"Celite" valmistetaan 35 tunnettujen ohjeiden mukaan (Husain, S., Lipinski, B. ja 23 103577

Gurewich, V., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981) 4265 - 4269). Kromatografiapylväs HR 5/5 (Pharmacia) täytetään yhdellä millilitralla fibriini-"Celite"-materiaalia. ETI-CH "Sepharose" 4B -kromatografiästä saatu fraktio 5 17 (esimerkki 3, kuviot 9 ja 10) dialysoidaan liuosta vas

taan, jonka koostumus on 20 mM Tris pH 8,0, 20 mM NaCl ja 0,01 % "Pluronic" F68 ja sille suoritetaan kromatografia fibriini-"Celite":llä FPLC-systeemin (Pharmacia) avulla. Dialysoidun fraktion lisäämisen jälkeen suoritetaan pesu 10 liuoksella, jonka koostumus on 20 mM Tris pH 8,0, 20 mM

NaCl ja 0,01 % "Pluronic" F68, ja näin havaittu aktiivinen aine eluoidaan 20 - 1000-mM:sella NaCl-gradientilla, joka on valmistettu liuokseen, jonka koostumus on 20 mM Tris pH 8,0 ja 0,01 % "Pluronic" F68 (kuvio 13).

• · » · • · · • · · • · • · · • · « • « • · • · · · · • · · • « · 1 · · 103577 24

Kuvio 13 ETI-CH-"Sepharose" 4B:ssä (esimerkki 3, kuviot 9 ja 10) esipuhdistetun aktiivisen aineen, v-PA:n (v-PA a! ja v-PA β), fibriini-"Celite" -kromatografia ^ Fraktiot STT" s -/

? M

J -P

·Η X

1+7 Ό c o

•S

£ >1 i—1 c

•H

M-l o

X

rO

S

P

>1 Σ>1 r—\

•P

ii, ! « « 1 .1 · v-PA:ta sisältäville fraktioille suoritetaan SDS- ’ polyakryyliamidigeelielektroforeesi (kuvio 14) • · · « · · · • · · 25 103577

Kuvio 14

Fibriini-"Celite"-kromatografiästä (kuvio 13) saaduille aktiivista ainetta sisältäville fraktioille suoritettu 12,5-prosenttinen SDS-polyakryyliamidigeelielektro-5 foreesi pelkistämättömissä olosuhteissa ja sitä seurannut värjäys "Coomassie'’sini-väriaineella. M: Molekyylipaino- markkeriproteiinit. Numerot vastaavat kuvion 13 fraktioita.

2 3 4 5 1 8 1 9 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 M

Aktiiviset aineet v-PA ja v-PA β sitoutuvat al- 20 haisissa NaCl-konsentraatioissa fibriini-"Celiteen" ja ne voidaan eluoida siitä edelleen käyttäen puskuriliuoksessa suurempaa NaCl-konsentraatiota. Tämän vaiheen aikana voidaan havaita, että v-PA β sitoutuu selvästi heikommin fibriini- "Celiteen" kuin v-PA a1# koska toisin kuin v-PA β, 25 v-PA gi -muoto eluoituu ainostaan suuremmilla NaCl-konsent-raatioilla. Niinpä tätä puhdistusmenetelmää voidaan käyttää hyväksi myös v-PA β:η ja v-PA αχ:η erottamisessa toi- • · · sistaan.

• · t : .* Esimerkki 6 30 Puhdistettujen v-PA-muotojen, v-PA c^jn ja v-PA β:η « · · : : : N-terminaalisen pään aminohappojaksoanalyysi

Puhdistettua v-PA ax:tä (esimerkki 2, kuvio 8) tai ."*· v-PA β:θθ (esimerkki 1, kuvio 4) sisältäville fraktioille suoritetaan sopivaa puskuriliuosta vastaan suoritetun dia-35 lyysin jälkeen 12,5-prosenttinen polyakryyliamidigeeli- 103577 26 elektroforeesi pelkistämättömissä olosuhteissa. Elektroforeesin jälkeen geeli poistetaan elektroforeesilaitteesta ja siirretään polyvinyylideenidifluoridikalvolle (Immobilon, Millipore Corp. USA) tavanomaisen menetelmän mukaan (Matsu-5 daira, P., J. Biol. Chem. 262 (1987) 10035 - 10038). Vas taava proteiinivyöhyke leikataan irti veitsellä ja N-terminaalisen pään aminohappojakso määritetään suoraan automaattisessa 477 A Protein Sequencer/120 A Analyzer -laitteessa (Applied Biosystems, USA) . Analyysien suoritus toi-10 stetaan. Havaittiin seuraavat jaksot: v-PA e(i 15 t s to 15

Ala Tyr Gly Vai Ala X Ly» X Glu II» Thr Gin Met Thr Tyr Arg v-rA f: 1 5 10 15 20 Ala Tyr Gly Gly X S«r 61u Leu Arg Cyi Ph· A«n Gly Gly Thr X Gin AI» Ala (X = ei selvää määritystulosta) 25 *:**: Näiden edellä kuvatulla menetelmällä määritettyjen ;V: jaksojen avulla seulottiin Desmodus rotunduksen sylki- • · rauhasesta saatu cDNA-pankki (esimerkki 18) .

« ·

Esimerkki 7 (Vertailuesimerkki) • · 3 0 Esimerkin 1 mukaisesti puhdistetun aktiivisen aineen • « » v-PA β:η plasminogeenin aktivointikyvyn vertailu t-PA:han

Inkuboimalla spesifistä plasminogeeniaktivaattoria « · · ' (PA) plasminogeenin (PLG) kanssa, jonka pitoisuus on riittävän korkea, 37 °C:n lämpötilassa puskuriliuoksesta, 35 esim. 50 mM Tris'ista, pH 7,4, ja 20 mM NaCl:stä, koostu- 27 103577 vassa ympäristössä, saadaan tuotettua plasmiinia seuraavan periaatteen mukaisesti: PA + PLG (± stimulaattori) (1 [PA/PGL (± stimulaattori) ] 5 J.1 PA + Plasmiini (± stimulaattori )

Tällä tavoin muodostunut plasmiini voidaan ha-10 väitä kromogeenisellä tripeptidillä H-D-Val-Leu-Lys-pNA

(S 2251), joka on erittäin spesifinen tälle proteaasille. Tämä reaktio etenee seuraavan periaatteen mukaisesti

Plasmiini + H-D-Val-Leu-Lys-pNA 15 AT

[Plasmiini/H-D-Val-Leu-Lys-pNA] -♦ Plasmiini + pNA

pNA:n (p-nitroaniliinin) tuoton nopeus voidaan määrittää fotometrisesti 405 nm:n aallonpituudella ja se on 20 suoraan verrannollinen plasmiini-entsyymin konsentraa- tioon. Yhdistämällä nämä kaksi periaatetta on mahdollista mitata plasmiinin muodostumisnopeus, joka kuvaa plasmino-geeniaktivaattorin aktiivisuutta. Kuviossa 15 on esitetty t-PA:n ja v-PA:n aikaansaamat plasmiinin muodostumisnopeu-25 det stimulaattoreina olevien fibrinogeenin (hyytymän muo- dostuksen substraatti) ja fibriinin (liuotettava verihyy-tyrnissä oleva säikeinen aine) ollessa läsnä ja niiden ·'·*; puuttuessa.

• · « · • » * » · · • · · « · · « · · 103577 28

Kuvio 15 v-PA β:η aikaansaama plasmiinin muodostumisnopeus verrattuna t-PA:han fibriinin tai fibrinogeenin läsnä- tai poissaollessa 5 ___________ *405 2 | .

I ' / / ' / J I / io 1 I / ' '7 / 15 ' / 1 > / // / o i =~~?~ i ~ · - i

° 1 2 3 4 S

2q aika, h -- v-pa, 2.5yks./ml ---- t-PA, 2.5yks . /ml , + fibriini • ♦ fibrinogeeni 25 ------------ ·. Koe suoritetaan 96-kuoppaisissa mikrotiitterile- vyissä. Kukin kuoppa sisältää kaikkiaan 220 μΐ. Plasmino-geenin pitoisuus on 0,5 μΜ, H-D-VAl-Leu-Lys-pNA:n 0,68 μΜ, 30 t-PA:n 0,05 lU:ta, käytetty v-PA:n aktiivisuus kansainvälisellä verihyytymän hajotusmäärityksellä (Gaffney, P.J., .* * Curtis, A.D., Thrombos. Haemostas 53 (1985) 134 - 136) • « · : määritettynä on kymmenen kertaa suurempi, eli noin 0,5 IU:ta. Stimulaattorien pitoisuus on noin 20 pg/kuoppa.

29 103577

Edellä esitetyn mukaisesti t-PA aktivoi plasmino-geenin myös jopa silloin, kun stimulaattoria ei ole läsnä ja aktivointinopeus on hyvin suuri jopa fibrinogeenin läsnäollessa. Kuvatussa määrityksessä v-PA aktivoi plas-5 minogeenin ainoastaan säikeisen aineen, fibriinin läsnäollessa.

Esimerkki 8 v-PA ax:n ja v-PA β:η trombolyyttisen aktiivisuuden vertailu t-PAihan 10 Tutkitaan uuden aktiivisen aineen trombolyyttinen aktiivisuus verrattuna t-PAihan äskettäin kehitetyssä "hyytymän hajotuksen mikromäärityksessä" (MCLA). Kussakin eri tapauksessa 100 μΐ tuoretta ihmisen kokoverta pipetoi-daan mikrotiitterilevyn kuoppiin ja niihin lisätään vas-15 taavasti 10 μΐ hyytymää muodostavaa ainetta ("Thromborel", Behring-Werke) ja levyjä inkuboidaan 37 °Cin lämpötilassa 1 tunnin ajan. Tuloksena olevat verihyytymät pestään kahdesti fosfaatilla puskuroidulla natriumkloridiliuoksella (PBS) ennen kuin niihin yhdistetään 100 μΐ autologista 20 plasmaa, joka on saatu aiemmin suoritetusta sentrifugoin-nista. Tämän jälkeen plasmaan yhdistetään t-PA- ja v-PA-erät, kumpikin erikseen, pitoisuuksien vaihdellessa välillä 1,56 - 12,5 yks./ml. Tällä tavoin käsiteltyjä mikro-tiitterilevyjä säilytetään 18 tunnin ajan 37 °Cin lämpö-25 tilassa kosteassa kammiossa. Inkubointiajan päätyttyä levyjä ravistellaan ravistelulaitteessa (Red Rotor) ja tämän *. jälkeen kustakin kuopasta otetaan plasmanäyte, ne laimen- netaan suhteessa 1 i 6 kahdesti tislatulla vedellä (tämä saa aikaan hyytymän hajoamisen jälkeen vapautuneiden puna-30 solujen hajoamisen) ja tällä tavoin vapautunut punainen • · veripigmentti määritetään fotometrisesti 492 nmin aallon- ♦ ·' · pituudella mikrotiitterilevyfotometrissä.

103577 30

Kuvio 16a

Ihmisen kokoverihyytymän hajoaminen in vitro: plas-minogeeniaktivaattorien vaikutus 5 400 T------.- • · v-PAfl

A A t—PAP

pj O liuotin ° / · i—1 10 X 300-· // CV3 // en ^ λ

// A

200-- // —-θ--------------θ—- 15 ^^===========^ + ^----"Λ 100-1—-.-.-.-.-.-.-.—ι—ι- 2 5 10 yks ./ml 20

Kuvio 16b

Ihmisen kokoverihyytymän hajoaminen in vitro: plas-minogeeniaktivaattorien vaikutus 800-]- 25 % · — · ν-ΡΑα /· A-A t-PA / * ^ O liuotin / * 600-- / • co / σι / • 't / < / ^ 30 400 ” / 200- ^ ______9___ 35 0-1—,---.----————i----—— 1 .3 10 30 yks./ml 31 103577 Tämän kokeen tulokset voidaan nähdä kuvioista 16a ja 16b: Verrattuna standardina käytettyyn t-PA:han vastaavansuuruiset tehokkaat pitoisuudet uutta aktiivista ainetta hajottavat (määritettynä kansainvälisellä verihyytymän 5 hajotusmäärityksellä) ihmisen kokoverihyytymiä paremmin kuin t-PA. Jo noin 3 yks./ml uutta aktiivista ainetta v-PA β osoittaa kuvatussa koemallissa trombolyyttisen vaikutuksen parantuneen merkittävästi, kun taas 3 yks./ml t-PA:ta ei saa aikaan tuloksia, jotka eroaisivat kontrollinäyt- 10 teestä.

Samanlaisessa kokeessa tutkitaan t-PA:n ja v-PA:n aikaansaaman kokoveren trombolyysin riippuvuutta ajasta.

t-PA:ta ja v-PA:ta inkuboidaan 6,25 yksikön ja 12,5 yksikön erinä kumpaakin erikseen ylläkuvatussa systeemissä 15 23 tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa. 15 tunnin kuluttua otetaan näyte 2 tunnin välein ja valmistetaan samoin kuin fotometrisessä kokeessa. Tulokset on esitetty kuvioissa 17a ja 17b.

103577 32

Kuvio 17a

Ihmisen koko verihyytymän hajoaminen in vitro 5 f 500 η---—------

CS

σ> n Ληη O—O liuotin i 400*·- O · — · σ4ν-ΡΑ30 yks. /ml

* A —A t-PA

10 | * 300-· 200-- __

________A

6=6=6-o 15 10°·· 0-J-1-1-1-1-1-1-1-f- 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 aika (h) 20

Kuvio 17b

Ihmisen kokoverihyytymän hajoaminen in vitro T 500-|-—- C4 a

25 S

? 400-- °—° liuotin • S · — · (JV-PA12.5 yks. /ml φ *: * A—A t-PA .

5 300- A-* 30 200 - , ;·. A--' ' 100-- • · 0-I-1-1-1-1-1-1-1-1-1 35 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 aika (h) 33 103577

Trombolyysin alkaminen trombista vapautuneiden punasolujen määrän perusteella mitattuna on aktiivista ainetta käyttäen selvästi nopeampi kuin t-PA:ta käyttäen.

6,25 yksiköllä uutta aktiivista ainetta havaitaan 23 tun-5 nin kuluttua kohonnut trombolyysi, joka on kaksinkertainen t-PA:n (12,5 yksikköä) aktiivisuuteen verrattuna.

Esimerkki 9

Seriiniproteaasit reagoivat spesifisesti "aktiivisen keskuksen titrausaineen", di-isopropyylifluorifosfaa-10 tin (DIFP) kanssa Tätä tarkoitusta varten aktiivinen aine puskuroidaan pH-arvoon 8,0 ja sekoitetaan suhteessa 1 : 20 propy-leeniglykoliin valmistettuun 3H-DIPF:ään. Näytettä inku-boidaan yön yli huoneen lämpötilassa. Näytteestä otetulle 15 erälle suoritetaan erotus 12,5-prosenttisessa SDS-geelissä pelkistämättömissä olosuhteissa. Tämän jälkeen geeliä in-kuboidaan 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa "Amplify"-liuoksessa (Amersham) ja sen jälkeen se kuivataan. Tämän jälkeen geeliä valotetaan 4 päivän ajan ja sen jälkeen 20 röntgenfilmi kehitetään. Ne seriiniproteaasit, joihin radioaktiivisella leimalla varustettu DIFP on liittynyt, tulevat filmillä näkyviin tummentuneina vyöhykkeinä (kuvio 18). Esimerkiksi t-PA saa aikaan hieman mustuneen suuren vyöhykkeen, jonka näennäinen molekyylipaino on 68 000 ± 25 5 000, sitävastoin uusi aktiivinen aine saa aikaan voimak kaasti mustuneen suuren vyöhykkeen molekyylipainon ollessa e; 39 000 ± 2 000 (v-PA β) ja mustuneen vyöhykkeen molekyyli- . painon 43 000 ± 2 000 kohdalla (v-PA a,). Identtisistä • · *· > « elektroforeettisista olosuhteista saatu kontrolligeeli 30 pestään 1-prosenttisella "Triton" X-100:lla ja asetetaan ' ' sen jälkeen fibrinogeeniä ja plasminogeeniä sisältävälle • : indikaattorigeelille. Elektroforeesilla käsitellyn aktii visen aineen aktiivisuuksien asema on yhtenevä 3H-DIFP:llä leimattujen seriiniproteaasien aikaansaaman mustuneen vyö- 103577 34 hykkeen kanssa, joka edustaa aineen aktiivista prinsiippiä.

Kuvio 18

Autoradiograxnxni 3H-DIFP:llä käsitellyn aktiivisen 5 aineen 3 eri konsentraatiosta

M

200 ooo ·>ντνν.; 92 000 6 9 000 46 000 '4ll v-PAa* "B® ν-ΡΑβ 30 ooo & } ”·}£··. · · 15 ...

1 4 000 ;£·.' ·

Esimerkki 10 (Vertailuesimerkki) t-PA:n ja v-PA β:η aikaansaama fibrinogeenin hajoa-20 minen in vitro -olosuhteissa

Kun t-PA:ta inkuboitiin ihmisen plasmassa 37 °C:n lämpötilassa, hyytymää muodostamaan kykenevän f ibrinogeenin konsentraatio vähenee ajasta riippuen. Tämä johtuu t-PA:n suhteellisesta spesifisyydestä fibriiniä kohtaan ja se on 25 tälle trombolyyttiselle aineelle luonteenomainen piirre. 3 t mg:sta hyytymää muodostamaan kykenevää ihmisen fib-

·’ rinogeeniä ja 1 ml:sta liuosta, jonka koostumus on 50 mM

Tris, pH 7,4 ja 40 mM NaCl, valmistetaan erilliset ’* liuokset, joihin yhdistetään 1 μΜ ihmisen plasminogeeniä.

30 Osaan näistä neste-eristä lisätään 3,1, 6,25, tai 12,5 yk- : Γ: sikköä t-PA:ta ja vastaavasti toiseen erään lisätään samat aktiivisuudet v-PA: ta. Kolmas erä, jossa ei ole plas-minogeeniaktivaattoria, toimii kontrollina. Kutakin käsiteltävää ryhmää kohti käytetään 6 testauserää. Välit- 35 103577 tömästi plasminogeeniaktivaattorien lisäyksen jälkeen poistetaan kaikista testauseristä yksi erä ja hyytymän muodostukseen kykenevä fibrinogeeni määritetään käyttäen Claussin kuvaamaa menetelmää (Clauss, V.A., Acta Haematol.

5 17 (1957) 237 - 246). Osa tästä erästä analysoidaan edel leen geelielektroforeesilla. Testauseristä otetaan lisää näytteitä 2, 4 ja 6 tunnin kuluttua. Fibrinogeenimittaus-ten tulokset on esitetty taulukossa 1.

103577 36

Taulukko I

Inku-

bointi yks./ t-PA v-PA K

5 aika/h ml 12.5 6.25 3.1 12.5 6,25 3.1 tPlg 0 10,3 9.7 9,1 10,5 10,3 10,1 10.0 (sek) 10,0 9.1 10,6 10,4 9.7 10,4 9,7 10,2 9,4 9,9 10.5 10,0 10,3 9.9 10 12.6 11.3 10.5 10.0 9,7 8.9 9.5 12,8 11,0 10.8 9.4 9.6 9.8 9.7 12,7 11.2 10.7 9.7 9,7 __9^6__ 2 12.8 11,9 11.6 10.9 15 12,5 11.2 11,5 11.1 12.7 11,6 11,6 11,0 >300 11.3 11,5 10,5 12,1 11.4 11,2 10,6 11.9 11.4 11,4 10,6 12,0 20 11.4 11.4 10.6 12.0 4 14.5 13.1 12,8 12.4 13.7 13.1 11.9 12.6 >300 14,1 13.1 12.4 12.5 25 18.6 11,6 13.2 11,8 12.1 14.2 12,4 11.9 13,7 12.1 6 13,9 14.4 11.6 12.2 13.1 12.6 30 13.1 13.6 17.1 15.8 12,3 11.8 >300 13.8 17,1 13.4 12.2 12.3 12.8 11.9 13.0 12.1 12.2 13.3 12.2 121.0 12.1 13.2 35

Pig = 1 uM plasminogeeniä 40 ul/ml testauserää [50 yks./ml] mg hyytymän muodostukseen kykenevää fibrinogeeniä/ml testauserää, joka on valmistettu liuokseen, jonka koostumus 40 on 50 mM Tris, 40 mM NaCl, pH 7,4 (lairaennuspuskuriliuos) • · 37 103577

Claussin julkaisun mukaiset hyytymän muodostusajat on esitetty sekunteina. Jo kahden tunnin kuluttua inku-boinnin alkamisesta yhdessäkään t-PA:ta sisältävistä tes-tauseristä ei havaita lainkaan hyytymiskykyistä fibrino-5 geeniä, hyytymisajat olivat >300 s. Sitävastoin merkkiäkään fibrinogeenin hajoamisesta ei esiinny kontrollina olevissa testauserissä tai testauserissä, joihin oli lisätty uutta aktiivista ainetta. Tämä esimerkki osoittaa uuden aktiivisen aineen, v-PA β:η, olevan merkittäväs-10 ti spesifisempi fibriiniä kohtaan kuin t-PA, vaikkakaan v-PA β ei ole absoluuttisesti spesifinen.

Otetuista näytteistä suoritettujen geelielektro-foreesien analyyseissa voidaan edelleen varmistaa, että niissä näyte-erissä ollutta fibrinogeeniä, joissa oli uut-15 ta aktiivista ainetta, ei voida erottaa kontrollinäytteis-sä olleesta fibrinogeenistä edes 6 tunnin inkuboinnin kuluttua, kun taas hajonnutta fibrinogeeniä voidaan havaita t-PA:ta sisältäneissä näyte-erissä jo 2 tunnin kuluttua.

Esimerkki 11

20 Useiden eri plasminogeeniaktivaattoreiden ja v-PA

ax:n ja v-PA β:η sitoutuminen fibriiniin Näyteastiassa inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa 10 minuutin ajan 100 μΐ plasminogeenistä puhdasta fibrinogeeniä (2 mg/ml) liuoksessa, joka sisälsi PBS:ää ja 0,01 % 25 "Tween" 80:aa, 10 μΐ vastaavia plasminogeeniaktivaattorei- ·. ta eri pitoisuuksina ja 10 μΐ trombiinia (0,3 yks.). Tämän jälkeen muodostunut fibriini poistetaan sentrifugoimalla 5 minuutin ajan 10 000 x g:n voimalla ja jäljelle jäänyt • « plasminogeeniä aktivoivan aineen aktiivisuus määritetään 30 supernatantista fibriinimalja-testausmenetelmällä ja tu- • · lokset korjataan lähtötilavuutta vastaaviksi. Rinnakkais- « · · kokeessa samoissa olosuhteissa valmistetaan plasminogeeniä aktivoivista aineista liuokset, joissa ei ole fibriiniä (kontrolli; ei sitoutumista).

103577 38

Kuvio 19 PA:n sitoutuminen plasminogeenistä puhtaaseen fib-riiniin 5 1 00 1 |—|

90.| α 20mM

§ ES3150mM

80- | 70' % db t 10 6°- I | ή

. 50 I I 1 JL

IΓ0: 1 I λι is ! » | lii • "1111 1 11 111 1—PA a<V-PA /iV-PA 0CU-PA urokinaasi 20

Tulokset osoittavat v-PA a^n sitoutuvan yhtä hyvin fibriiniin kuin t-PA:n (kuvio 19) . Sitävastoin v-PA β:η affiniteetti fibriiniä kohtaan on huomattavasti heikompi. Tämä v-PA β:η osoittama affiniteetti fibriiniä kohtaan 25 riippuu voimakkaasti NaCl-konsentraatiosta (kuvio 19).

. Esimerkki. 12 (Vertailuesimerkki) • t-PA:n ja v-PA β:η Glu-plasminogeenin aktivaatiota . vertailevat kineettiset kokeet (A) Astiassa inkuboidaan 20 μΐ plasminogeeniakti-30 vaattoria, 10 μΐ fibriinimonomeerejä (60 μ9/ιπ1) , jotka on

* valmistettu liuokseen, jonka koostumus on 20 mM Tris, pH

• · · ,· · 7,4 ja 600 mM urea, ja 50 μΐ plasmiinista puhdasta plas- minogeeniä (pitoisuudet vaihtelevat välillä 0 - 6 μΜ koko reaktioerässä) liuoksessa, joka koostuu 20 mM:sesta 35 Tris:istä, pH 7,4 ja 170 μl:sta liuosta, jonka koostumus 39 103577 on 20 mM Tris, pH 7,4 ja 0,01 % "Tween" 80, 37 °C:n lämpötilassa sitä samalla sekoittaen.

(B) Toisissa koeputkissa on 37 °C:n lämpötilassa vastaavasti 100 μΐ veteen valmistettua plasmiinispesifistä 5 kromogeenistä substraattia S 2251 (3 mM) ja 400 μΐ liuosta, jonka koostumus on 20 mM Tris ja 180 mM NaCl.

Eri aikoina otetaan (A):sta 20 μ1:η näyte, joka siirretään koeputkeen (B), inkuboidaan vielä tunti 37 °C:n lämpötilassa ja reaktio pysäytetään 300 pl:lla 1 M sitruu-10 nahappoa. Inkuboidussa erässä muodostunut plasmiini pilkkoo kromogeenisen substraatin S 2251:n peptidiryhmän vapauttaen p-nitroaniliinia. Tämän p-nitroaniliinin määrä mitataan fotometrisesti 405 nm:n aallonpituudella.

Ylläkuvatun järjestelyä vastaavalla tavalla valmis-15 tetaan puhdasta plasmiinia käyttäen kalibrointikäyrä, josta muodostuneen plasmiinin määrä voidaan laskea suoraan.

Kuviossa 20 (v-PA β) ja kuviossa 21 (t-PA) on esitetty ylläkuvatulla tavalla saadut koetulokset. Tätä tarkoitusta varten kuvaajassa on kuvattu plasmiinin muodostu-20 misnopeus v plasmiinikonsentraatiota vastaan.

103577 40

Kuvio 20

Glu-plasminogeenin aktivaation kinetiikka luonnollista v-PaO:aa + monomeerejä käyttäen 5 '-*]---] I ’'*·· _ S 1,4- ·“ " * o / o o . „ f cc*’ _ £ · ^ <Τ3 -H w o T · c ε jo.. f 10 s v>- I <· / ' / w 1 / H I -H («til / c 0 8* * / ε h /

Ή / I CO r-H

•Η I Γ3 O · /

E - - / -f O

S °;e” i .X

'S* 0.4- / ^ β~ » > "i °r* I -1 · t « 3 4 · * r 15 > l / Plasminogeeni /"^iM7 / 0.0 4^-1-1-1-1-1- 0 1 2 3 4 5 8

Kuvio 21 20 Glu-plasminogeenin aktivaatio t-PA:ta + monomeerejä käyttäen 4 50 -I— -----------—“ c S · g4r00- e 25 > ^ __ §Jr5°·' '.3 ’· £ ή §3,oo~ 8 ··: ? § • H- 2,50 - § '[ C S’ __ 00 g 2;00 -f· c i * * '—* Λ r· Λ ε _ a 1,50-- / A w

1 * / rH

’ ’ > /L. & 1,00T ~ ; <. o —.

j S " _ Λ 0.0 1Λ 1Λ S* «.· B.0 · · 7 ° 0.50 -f 35 1 j s Plasminogeeni ΛμΜ7 0,00·-»--1—I-·—-* *”” ”* 0,000 0,400 0,800 1,200 1,600 2,000 41 103577 t-PA:n ollessa kyseessä saadaan tyypillinen Micha-elisin ja Mentenin tyyppinen kinetiikka. Kun näistä t-PA--koetuloksista tehdään Lineweaverin ja Burkin kuvaaja (sisäkuva kuviossa 21), saadaan suora viiva.

5 Esitettäessä v-PA β:sta saatuja koetuloksia kuvaajan muodossa saadaan täysin erilainen kuva. v-PA β -plasmino-geeniaktivaattorin kineettinen käyttäytyminen on erilaista t-PA:n käyttäytymiseen verrattuna. Saatu käyrä ei ole Michaelisin ja Mentenin kinetiikan mukainen, vaan on pikem-10 minkin allosteerisen entsyymin tyypillinen kuvaaja; myös

Lineweaverin ja Burkin kuvaaja on tyypillinen allosteeri-selle entsyymille (kuvio 20).

v-PA β -plasminogeeniaktivaattori on allosteerinen entsyymi, toisin kuin t-PA.

15 Esimerkki 13 (Vertailuesimerkki) v-PA β:η vaikutus liuotettuun hyytymänhajotussystee-miin (kansainvälinen hyytymänhajotusmääritys)

Puhdistettu ihmisen fibrinogeeni saadaan hyytymään trombiinilla, kun mukana on vakiomäärä ihmisen plasmino-20 geeniä ja vaihtelevat pitoisuudet plasminogeeniaktivaatto- ria. Tällä tavoin muodostuneessa hyytymässä plasminogeeni muuttuu tämän jälkeen plasmiiniksi plasminogeeniaktivaat-torien vaikutuksesta ja tämä plasmiini vuorostaan liuottaa hyytymässä olevan säikeisen aineen, fibriinin. Mitataan 25 aika, joka kuluu trombiinin lisäyksen ja hyytymän täydel- .* lisen hajoamisen välillä ja tämä esitetään kokologaritmi- sena kuvaajana plasminogeeniaktivaattorin konsentraatiota : vastaan. Yllä esitetyn periaatteen mukaisesti testataan 12,5 - 100 μΐ puskuriliuoksessa olevaa aktiivista ainetta : 30 ja verrataan 12,5 - 100 IU:hun t-PA: ta.

.·.·. Tulokset on esitetty kuviossa 22.

#40 42 103577

Kuvio 22

Kansainvälinen hyytymän hajoamismääritys 5 looo· •N, •s, 7®0 X ^ x ^S'sNw «** *s.

\ «N,

N. "K

H* N* 10 ooo- o ^ 000· 15 *"& ib 55 oo ob J ' 70 , ' lAo

Joo tf*VH)

Uusi aktiivinen aine v-PA β saa aikaan t-PA:han ver-20 rattuna yhdensuuntaisen kuvaajan pitoisuuden vaikutuksesta hajoamisnopeuteen. 100 pl puhdistettua aktiivista ainetta sisältävää liuosta sisältää koetulosten mukaisesti noin 40 yks. t-PA:han verrattavissa olevaa aktiivisuutta.

Testin yksityiskohdat 25 ’ Lyofilisoitu kokeessa käytettävä trombiini (Behring, .· Marburg) liuotetaan 1 ml:aan tislattua vettä. Tämä saa *: aikaan aktiivisuuden, jonka arvo on noin 30 IU/ml. Ihmisen *: plasminogeeni (Kabi, Munchen) liuotetaan liuokseen, jonka koostumus on 2 mM HCl, 50 % glyseriini ja 5 g/1 PEG 6000.

:·. 30 Tästä on tuloksena aktiivisuus, joka vastaa arvoa :·. 10 IU/ml. Ihmisen fibrinogeeniä (Kabi, Miinchen) site, että ♦ · hyytymän muodostukseen kykenevän proteiinin pitoisuudeksi saadaan 2 mg/ml fosfaattipuskuriliuoksessa, jonka koostumus on seuraava: 1,605 g/1 KH2P04, 8,58 g/1 Na2HP04 · 2 H20, 35 100 1/1 "Tween” 80:tä ja 50 mg/1 HSA:ta. t-PA-standardi 43 103577 laimennetaan siten, että aktiivisuudeksi saadaan 1 000 IU/ml.

20 μΐ plasminogeeniä ja 100 μΐ trombiinia pipetoi-daan koeputkeen ja koeputkea inkuboidaan 37 °C:n lämpö-5 tilassa. 1 ml fibrinogeeniä ja 12,5 - 100 μΐ plasmino- geeniaktivaattoria lisätään yhtäaikaa ja ajanottokello käynnistetään. 2 minuutin kuluttua hyytymän pinnalle asetetaan lasihelmi (läpimitta 6 mm) . Kun lasihelmi saavuttaa koeputken pohjan, kello pysäytetään ja aika merkitään koe-10 päiväkirjaan.

Esimerkki 14 (Vertailuesimerkki) v-PA β:η ja t-PA:n sitoutuminen lysiini-"Sepharose" 4B:hen

Plasmiiniaktivaattorien pH säädetään samaksi ja nii-15 tä käsitellään näissä olosuhteissa lysiini-"Sepharosella".

Lysiini-"Sepharose" pestään läpikotaisin ja aktiivisuus määritetään yhdistetyistä supernatanteista. Eluointikokeita ei voitu suorittaa näillä pienillä v-PA-määrillä.

Kuvio 23 20 v-PA β:η ja t-PA:n sitoutuminen lysiini-"Sepharo- seen"

• 100 C

o.

25 J, ^

. 4-J S

O S - Qn ______ · ·: S S 80 f----- ” 2 / : : c m / > i -H Λ / * · H ft . / m <o 6Q / rt en , 3 0 μΊ / < . « 0) -H / Cu

-PC / I

·♦ rtJ -rH . / > : : s H 40 / CO ,u / • c >, / ·

• >1 Ή / T

• r -u / .

<u <#> / I

M 20 ^ 1 35 S* _; 5 , 6 8 § ^——« --^^===^===^^^-- * » - * —

PH

103577 44

Esimerkki 15 (Vertailueslmerkki) v-PA β:η ja t-PA:n aikaansaamia kaseiinin hajoaminen

Plasminogeeniaktivaattorien aktiivisuus voidaan määrittää niinkutsutun fibriinimaljatestin avulla (Astrup, T.

5 ja Mullertz, Arch. Biochem. Biophys 40, (1952) 346 - 351) .

Plasminogeeniaktivaattoreita inkuboidaan etukäteen tehdyissä rei'issä 37 °C:n lämpötilassa. Siinä tapauksessa, että plasminogeeniä on läsnä, muodostunut plasmiini hajottaa fibriinin ja muodostuu kirkas hajoamista osoittava ren-10 gas, jonka läpimitta riippuu käytetystä plasminogeeniakti- vaattoripitoisuudesta. Fibriiniä kohtaan spesifisen plas-minogeeniaktivaattorin osalta on odotettavissa, ettei se vaikuta muihin proteiineihin kuin fibriiniin. Tämä voidaan testata tässä patenttihakemusjulkaisussa kuvattujen mene-15 telmien avulla käyttämällä plasminogeenia ja korvaamalla fibriini kaseiinilla (kuvio 24).

• · « 45 103577

Kuvio 24 v-PA β:η fibriinispesifisyyden testaus t-PA:han verrattuna 5 ' v-PA:n ja t-PA:n fibriinispesifisyys

v-PA A t-PA

10 (yks.) (I.U.) 0,6 1,2 1,8 0,6 1,2 1,8

Kaseiini mm·········

Kaseiini plasminogeeni K

30 • · • · ‘ ' Kuten kuviosta 24 voidaan nähdä, verrattuna t-PA:hän • · : : v-PA β ei osoita minkäänlaisia kirkkaita hajoamista osoit- ; tavia renkaita plasminogeeniä sisältävillä kaseiinimal- joilla. Tämä osoittaa v-PA β:η olevan absoluuttisen spesi-35 finen fibriiniä kohtaan.

46 103577

Esimerkki 16

Useiden eri amidolyyttisten substraattien Km-arvon määritys plasminogeeniaktivaattoreita t-PA ja urokinaasi ja v-PA ax:n ja v-PA β:η aktiivisia muotoja käyttäen 5 Kutakin erillistä 90 μ1:η erää liuosta, jonka koos tumus on 100 mM Tris, pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,01 % "Tween" 80 ja 50 pl:aa vastaavaa kromogeenistä substraattia (kaikki oli hankittu yhtiöstä Kabi Vitrum, Tukholma, Ruotsi), joiden lopulliset konsentraatiot olivat 0,03, 0,06, 0,1, 10 0,3, 0,6 ja 1 mM, inkuboidaan yhdessä vastaavan plas- minogeeniaktivaattorin 10 μ1:η erän (3 yksikköä kuoppaa kohti) kanssa 96-kuoppaisessa levyssä 37 °C:n lämpötilassa ja inkuboinnin aikana vapautuneen p-nitroaniliinin määrä määritetään fotometrisesti 405 nm:n aallonpituudella eri 15 ajankohtina 0-7 tunnin aikana. Tulokseksi saadut koetulokset arvioidaan Lineweaverin ja Burkin kuvaajan avulla ja Km-arvo määritetään (Segel, I.H., Enzyme kinetics, John Wiley and Sons, New York). Käytettiin seuraavia kromogee-nisiä substraatteja: 20 H-D-Val-Leu-Lys-pNA (S-2251) H-D-Ile-Pro-Ars-pNA (S-2288) < Glu-Gly-Arg-pNA (S-2444) 25 Määritettiin seuraavat Km-arvot (millimoolia/1): .* Plasminogeeni- *· aktivaattori S-2288 S-2444 • · » · t-PA 0,7 (1,0) 2,0 ·': 30 Urokinaasi 0,4 (0,2) 0,1 (0,09) v-PA a, 1,0 2,0 v-PA β 2,0 2,0

Suluissa ilmoitetut arvot on saatu kirjallisuudesta (Friedberger, P., Scand. I. Clin. Lab. Invest. 42 (1982) 35 täydennysosa 1.62).

47 103577

Aktiivisen aineen muodoista v-PA ax ja v-PA β saadaan samanlaiset Km-arvot kuin t-PA:sta. v-PA ax, v-PA β ja t-PA eivät saaneet aikaan minkäänlaista muutosta kromogee-nisella substraatilla S-2251.

5 Esimerkki 17

Desmodus rotundus -vampyyrilepakon sylkirauhasesta saatuja plasminogeeniaktivaattoreita koodaavat segmentit sisältävien cDNA-kloonien eristäminen ja luonnehtiminen 1. cDNA-geenipankin valmistaminen 10 Desmodus rotunduksen sylkirauhasista eristetään ko- ko-RNA guanidiniumisosyanaattimenetelmän mukaisesti [Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., MAcDonald, R.J., Rutter, W.J., Biochemistry 18 (1979) 5294 - 5299]. 500 pg:sta ko-konais-RNA:ta eristetään oligo(dt)-selluloosa-affiniteet-15 tikromatografiällä 25 pg poly-At-RNA:ta (Aviv, H., Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69 (1972) 1408 - 1412].

cDNA:n synteesi tapahtuu Gublerin ja Hoffmanin esittämän menetelmän mukaisesti [Gubler, U., Hoffman, B., Gene 25 (1983) 263 - 269] käyttäen Pharmacia LKB Biotechnology 20 AB -yhtiön cDNA Synthex -pakkausta. Yksittäiset vaiheet tapahtuvat tarkalleen valmistajan käyttöohjeiden mukaisesti. EcoRI-sovitinjaksojen (/ mikrogramma) kanssa saatu kaksinauhainen cDNA kytketään EcoRI:llä pilkottuun defos-foryloituun Lambda gt 10 -faagivektoriin (4 pg) käyttäen 25 T4-DNA-ligaasia [Huynh, T.V., Young, A., Davis, R.W., ·’ Practical Approaches in Biochemistry. DNA Cloning, osa 1, * toim. Glowen, D.M., IRL Oxford, Washington, DC (1985)].

• · Ligaasierä pakataan infektoiviin faageihin pakkaamis- uutteita käyttäen (Stratagene-yhtiön, La Jolla, USA, Giga-30 pack II Gold -pakkausuutteet) valmistajan käyttöohjeiden I': mukaisesti. Näin saatu primäärinen cDNA-geenipankki sisäl- , *. tää 1 x 106 yhdistelmä-lambdafaagia.

48 103577 2. cDNA-geenipankin seulominen 32P-leimalla varustetulla ihmisen kudosspesifistä plasminogeeniaktivaattoria (t-PA) vastaavan cDNA-geenin jaksolla

Vampyyrilepakon syljen plasminogeeniaktivaattorin 5 cDNA:n tunnistamisessa toimii koettimena t-PA:n cDNA-jakso [Fisher, R., Waller, E.K., Grossi, G., Thompson, D., Tizard, R. ja Schleuning, W.-D., J, Biol. Chem. 260 (1985) 11223 - 11230], joka on varustettu radioaktiivisella leimalla nick-translaatiota käyttäen [Maniatis, T., Fritsch, 10 E.F., Sambrook, J. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982)]. Kaikkiaan 50 000 rekombinoituneesta lambdafaagista saatu DNA siirretään "Replika"-kalvoille (Gene Screen Plus, Du Pont de Nemours, NEN Research Products -yhtiön tavaramerkki).

15 Kalvojen käsittely ja hybridisointiliuosten koostu mus vastaavat valmistajan ilmoittamia yksityiskohtia. Hyb-ridisointi ja pesu tapahtuvat 42 °C:n lämpötilassa. Lopullinen pesuvaihe tapahtuu 4 x SSC-puskuriliuoksessa. 50 000 seulotusta rekombinoituneesta faagista eristettiin 11 po-20 sitiivista kloonia.

3. Positiivisten kloonien cDNA:n luonnehtiminen

Positiivisten kloonien cDNA-liitosjakso trans-kloo- nataan standardimenetelmien mukaisesti kaupallisesti saatavilla oleviin vektoreihin M13 mp 18 ja M13 mp 19 [Mes-25 sing, J., Meth. Enzymol. 101 (1983) 20 - 769] ja sekvens- .* soidaan dideoksinukleotidimenetelmän mukaisesti [Sanger, '*· F., Nicklen, S. ja Coulson, A.R., Proc. Natl. Acad. Sei.

:: USA 74 (1977) 5463 - 5467]. Verrattaessa yksittäisten kloonien nukleotidijaksoja ihmisen t-PA:n geenin nukleoti-' ·*; 30 dijaksoon [Pennica, D., Holmes, W.E., Kohr, W.J., Harkins, R.N., Vehar., G.A., Ward, C.A., Bennet, W.F., Yelverton, • * E., Seeburg, P.H., Heyneker, H.L. ja Goeddel, D.V., Nature 303 (1983) 214 - 221] saadaan jaksoille tulokseksi suuri identtisyysaste ( > 80 %). Myös johdetut proteiinijak-35 sot ovat erittäin identtisiä ihmisen t-PA:n osien kanssa 49 103577 (> 70 %). Yksikään klooneista ei sisällä täydellistä vam-pyyrilepakon plasminogeeniaktivaattorin geenin cDNA:ta. Yhdestä näistä jaksoista saadut osittaiset jaksot toimivat koettimena toisen Desmodus rotunduksen sylkirauhasesta 5 saadun cDNA-pankin seulomisessa.

Esimerkki 18

Desmodus rotunduksen sylkirauhasen plasminogeeni-aktivaattoria koodaavien täydellisten cDNA-kloonien eristäminen, luonnehtiminen ja sekvenssointi 10 1. cDNA-geenipankin valmistaminen Desmodus rotunduk sen sylkirauhasen RNAista

Kokonais-RNA eristetään vampyyrilepakoiden (D. ro-tundus) sylkirauhasista pilkkomalla guanidiniumisotiosya-naatilla ja sen jälkeen ultrasentrifugoinnilla käyttäen 15 apuna cesiumkloridikerrosta (1). Kolmesta milligrammasta lyofilisoitua kokonais-RNA:ta saadaan 80 pg polyA+-RNA:ta suorittamalla kahdesti affiniteettikromatografia oligo-de-oksitymidiiniselluloosalla (2,3). Viidestä mikrogrammasta tätä valmistetta tehdään Gublerin ja Hoffmanin esittämän 20 menetelmän mukainen cDNA-synteesi (4), jota on muunneltu monella tavalla ("Zap-cDNA" -synteesipakkaus, Stratagene) (5, 6). Ensimmäisen nauhan synteesi aloitetaan sellaisen oligonukleotidin avulla, joka sisältää oligo-deoksitymi-diiniosan ja restriktioentsyymi XhoI:n tunnistusjakson (6) 25 ja synteesi suoritetaan Moloney-hiirileukemiaviruksen käänteiskopiointientsyymiä käyttäen 5-metyylideoksisyti-’· diinin avulla. Toinen nauha syntetisoidaan E. colin : · DNA-polymeraasin avulla E. colin ribonukleaasi H:n läsnä ollessa. Näin muodostuneen kaksinauhaisen cDNA:n päät ta-·': 30 soitetaan T4 DNA-polymeraasilla ja sen jälkeen liitetään

EcoRI-sovi tin jaksoihin T4 DNA-ligaasia käyttäen. Tuloksena ·. olevat DNA:n päät fosforyloidaan T4- polynukleotidikinaa- : sin avulla. Sen jälkeen kun cDNA on pilkottu restriktio- entsyymillä Xho I, suoritetaan geelisuodatus "Sepharose” 35 CL-4B:tä (Pharmacia) käyttäen. Vähintään 500 emäsparin 50 103577 kokoisen cDNA:n sisältävät fraktiot yhdistetään ja saannoksi saadaan noin 1,2 pg cDNA:ta. Yksi kolmasosa tästä määrästä kytketään 3 pg:aan Stratagene-yhtiön (La Jolla, USA) Uni-Zap(TM)XR-bakteriofaagivektorin (patentti haetta-5 vana) EcoRI - XhoI -restiktioentsyymeillä pilkottuja ja defosforyloituja käsivarsia (5, 7). Ligaatioerä pakataan seitsemään erilliseen erään käyttäen "Gigapack" II Gold -pakkausuutteita (Stratagene) (8). Tällä tavoin saadaan primäärinen cDNA-geenipankki, jossa on yli 4 x 106 rekombi-10 noitunutta lambda-bakteriofaagia.

2. Desmodus rotundus -vampyyrilepakon syljestä saatuja plasminogeeniaktivaattoreja koodaavien cDNA-kloonien tunnistaminen Täydellisten cDNA-kloonien tunnistukseen käytetty 15 koetin on AluI - BamHI -restiktioentsyymeillä pilkkomalla saatu 76 emäsparin pituinen DNA-fragmentti (nukleotidit 141 - 216 kuviossa 26c), joka on peräisin ensimmäisestä cDNA-geenipankista (katso esimerkki 17) eristetyn kloonin 5'-päästä. Tämä fragmentti varustetaan radioaktiivisella 20 leimalla nick-translaatiolla (9) [a-32P]-deoksiadenosiini- trifosfaatin läsnäollessa ja tätä fragmenttia käytetään hybridisoinnissa rinnakkaissuodattimiin, joille on immobi-lisoitu kaikkiaan 1,2 x 105 primäärisen cDNA-geenipankin yhdistelmä-bakteriofaagista saatua DNA:ta (10). Hybridi-25 sointi ja pesu suoritetaan 50 °C:n lämpötilassa. Viimeinen .· pesuvaihe tapahtuu 2 x SSC-puskuriliuoksessa. Niistä yli *· 200 kloonista, joista saatiin signaali "Replika"-suodatti- : mien autoradiografiässä, puhdistetaan 50 kloonia suoritta malla jatkomaljaus ja toistetaan yllämainittu plakkisuoda-30 tinhybridisointi. Tällä tavoin eristetään 38 kloonia, joi-sta saadaan selvä positiivinen signaali myös toisessa seu- t · lonnassa.

3. cDNA-kloonien luonnehtiminen ja sekvenssointi

Plasmidi pBluescript SK, joka on eristetyissä posi-35 tiivisissa UnitZAP(TM)XR-bakteriofaagiklooneissa, joihin 51 103577 sisältyy samaan bakteriofaagin segmenttiin liitetty cDNA-fragmentti, poistetaan bakteriofaageista niin kutsutulla "poistolla in vivo -olosuhteissa" (7, 14), jonka tuloksena saadaan kaikkiaan 35 erilaista positiivisista 5 bakteriofaagiklooneista peräisin olevaa pBluescript SK -plasmidikloonia. Plasmidit eristetään Birnboimin ja Dolyn esittämän menetelmän mukaisesti (11) ja niiden sisältämät cDNA:t jaetaan neljään luokkaan, alr α2, β ja^7 , BamHI ja Pstl-entsyymeillä suoritetun restriktioanalyysin (kuvio 10 25) ja 5'-päiden DNA-sekvenssoinnin mukaan. Kaikkien nel jän luokan pisimpien cDNA-kloonien cDNA-osat jatkokloona-taan bakteriofaagivektoreihin M13mpl9 (12) ja sekvenssoi-daan Sangerin esittämän dideoksinukleotidimenetelmän mukaan ("Sequenase"-pakkaus, United States Biochemical 15 Corporation, Cleveland, USA) (13, 15) käyttäen osaksi oligonukleotidialukkeita, jotka on syntetisoitu erityisesti tätä tarkoitusta varten ja jotka ovat komplementaarisia cDNA-osien jaksojen suhteen. Täydelliset cDNA-jaksot (mukaanlukien lyhyt 3'-päässä esiintyvä polyA-ketjujen seg-20 mentti) yhdessä niistä johdettujen proteiinijaksojen kanssa on esitetty kuvioissa 26a, b, c ja d.

» · · • « · • · • · « · • · · • · » • « 52 103577

Kirjallisuusviitteet: I. Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., MacDonald, R.J. Rutter, W.J., Biochemistry 18 (1979) 52 - 94 - 5299.

5 2. Schwab, M. . Alitalo, K. , Varmus, M.E., Bishop, J.M.,

Nature 303 (1983) 497 - 501.

3. Pharmacia LKB Biotechnology AB, mRNA-puhdistuspakkauk-sen käyttöohje sivut 1-16 (julkaisuvuotta ei annettu).

4. Gubler. U., Hoffman. B., Gene 25 (1983) 263 - 259.

10 5. Huse, W.D.. Hansen. C., Strategies 1, (1989) 1-3.

6. Stratagene-yhtiö, ZAP-cDNA-(TM)Synthesis Kit, käyttöohjeen sivut 1-21 (1989).

7. Stratagene-yhtiö, Uni-ZAP(TM)XR Cloning Kit, käyttöohjeen sivut 1 - 11 (1989).

15 8. Stratagene-yhtiö, Gigapack II Gold Packaging Extract- käyttöohjeen sivut 1-5 (1989) 9. Maniatis. T. Fritsch, E.F., Sambrook. J., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1982).

2Ö 10. Du Pont de Nemours, NEN Research Products, Colony/PlaqueScreen, Hybridization Transfer Membrane, ohjeen sivut 1 - 11 (ei julkaisuvuotta).

II. Birnboim, H.C., Doly, J., Nucleic Acids Res. 7 (1979) 1513 - 1523.

25 12. Mossing, J., Meth. Enzymol. 101 (1983) 20 - 79.

13. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A.R., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463 - 5467.

: 14. Short, J.M., Fernandez, J.M., Sorge, J.M., Huse, W.D., ·*·*: Nucleic Acids Res. 16 (1988) 7583-7600.

• « ·;··· 30 15. United States Biochemical Corporation, Step-By-Step .·;·. Protocols For DNA Sequencing with Sequenase Version 2.0, (1988) 1 - 21.

53 103577 f dl (3 β β (3 led «4 bibp bIbpIp M stepbIspBtep bIbpmBigbIbp

Kuvio 25 ·";’; Valikoitujen pBluescript SK -plasmidikloonien restriktiotulokset, joissa on pisimmät cDNA-osat neljästä 35 ryhmästä, alfa 1 (2 plasmidikloonia), alfa 2 (1 plasmidi- 54 103577 klooni), beeta (4 plasmidikloonia) ja gamma (1 plasmidi-klooni), tässä järjestyksessä esitettynä. Plasmidi-DNA-valmisteet, jotka pilkottiin restriktioentsyymeillä BamHI ("B"), PstI ("P") tai näiden kahden restriktioentyymin 5 seoksella ("BP"), erotettiin 1,8-prosenttisessa agaroosi- geelissä. Kokoa mitattiin plasmidi pBR322:lla ("M", Boeh-ringer-Mannheim -yhtiön molekyylipainomarkkeri 5), joka oli pilkottu restriktioentsyymillä Haelll. Selvästi näkyvien fragmenttien koot ovat 587, 540, 504, 458, 434, 267, 10 234, 213, 192 - 184 ja 123 emäsparia (ylhäältä alaspäin luettuna). Agaroosigeeli värjättiin etidiumbromidilla elektroforeesilla tapahtuneen erotuksen jälkeen ja geeli valokuvattiin. Ryhmistä alfa 1 ja beeta sekvenssoitiin vastaavassa järjestyksessä kuviossa vasemmanpuoleisimpina 15 esiintyvät kloonit.

• · • « • « · · » ♦ « · • « • ♦ « · • · » • · · · « « • · · » ♦ · • » ·

Kuvio 26a 55 103577 1 GGCGCTGAAGCCCTGCAAGAGCTGAGCTGACGGGAAATCCTCTCCAGGAGAGAAGGAAGG 60 61 CAAGGAGTGGCGAGTTTAAGGGACACCGCAGAAATGGTGAATACAATGAAGACAAAGCTG 120

MVNTMKTKL

5 121 TTGTGTGTACTGCTGCTTTGTGGAGCAGTCTTCTCGTTGCCCAGGCAGGAAACCTACAGG 180

LCVLLLCGAVFSLPRQETyR

181 CAATTGGCAAGGGGATCCAGAGCATATGGTGTGGCCTGCAAAGACGAAATAACCCAGATG 240

QLARGSRAYGVACKDEITQM

241 ACATACCGGCGACAAGAGTCGTGGCTGCGCCCCGAGGTCAGAAGCAAGCGGGTGGAACAC 300

TYRRQESWLRPEVRSKRVEH

10 301 TGCCAGTGCGATAGAGGCCAGGCCCGGTGCCACACCGTGCCCGTCAACAGTTGCAGTGAA 360

CQCDRGQARCHTVPVNSCSE

361 CCAAGGTGCTTCAATGGGGGGACATGCTGGCAGGCTGTATATTTCTCAGACTTTGTCTGT 420

PRCFNGGTCWQAVYFSDFVC

421 CAGTGCCCTGCAGGATATACGGGGAAACGGTGTGAAGTAGATACCCGTGCCACCTGCTAT 480

QCPAGYTGKRCEVDTRATCY

15 481 GAGGGCCAGGGTGTCACCTACAGGGGCACATGGAGCACAGCAGAAAGTAGGGTTGAGTGT 540

EGQGVTYRGTWSTAESRVEC

541 ATCAACTGGAACAGCAGCCTTCTGACCCGGAGGACCTACAATGGGCGGATGCCAGATGCC 600

INWNSSLLTRRTYNGR MPDA

601 TTCAACCTGGGCCTTGGGAATCACAATTACTGCAGAAACCCAAATGGAGCCCCAAAACCT 660

FNLGLGNHNYCRNPNGAPKP

20 661 TGGTGCTATGTCATCAAGGCAGGGAAGTTCACCTCGGAGTCCTGTAGCGTGCCTGTCTGC 720

WCYVIKAGKFTSESCSVPVC

721 TCCAAGGCCACCTGTGGCCTGAGAAAGTACAAGGAGCCACAGCTTCACAGTACAGGAGGA 780

SKATCGLR KYKEPQLHSTGG

781 CTCTTCACAGACATCACCTCTCATCCATGGCAGGCTGCCATCTTTGCCCAGAACAGAAGG 840

LFTDITSHPWQAAIFAQNRR

25 841 TCATCAGGAGAAAGGTTCTTGTGTGGGGGGATATTGATCAGTTCCTGCTGGGTCCTGACT 900

SSGERFLCGGILISSC WVLT

:**: 901 GCTGCCCACTGCTTCCAGGAGAGCTATCTTCCTGACCAGCTTAAGGTGGTTTTGGGCAGA 960

Vt AAHCFQESYLPDQLKVVLGR

• · 961 ACATACCGGGTGAAACCTGGAGAGGAAGAGCAGACATTTAAAGTCAAAAAATACATCGTC 1020

V TYRVKPGEEEQTFKVKKYIV

* 30 1021 CATAAGGAATTTGATGACGACACTTACAACAATGACATTGCACTGCTGCAGCTGAAATCG 1080

• HKEFDDDTYNNDIALLQLKS

« · 1081 GACTCACCACAGTGTGCCCAAGAGAGTGACAGTGTCCGCGCCATCTGTCTCCCGGAAGCC 1140

DSPQCAQESDSVRAICLPEA

1141 AACCTGCAGCTGCCCGACTGGACAGAATGTGAGCTGTCTGGCTACGGCAAGCATAAGTCA 1200

. ·; NLQLPDWTECELSGYGKHKS

1201 TCTTCTCCTTTCTATTCTGAGCAGCTGAAGGAAGGGCATGTCAGGCTGTACCCCTCCAGC 1260

SSPFYSEQLKEGHVRLYPSS

' ' 35

Kuvio 26a (jatkoa) 56 103577 L261 CGCTGCGCACCCAAGtTTCTGTTTAACAAAACCGTiIACAAAC AACA. JTGTGTGCTCGA 1320

RCAPKFLFNKTVTNNULCAG

5 L321 GACACGCGGAGCGGAGAGATCTATCCAAATGTGCACGATGCCTGCCAGGGTGACTCAGGA 1380

DTRSGEIYPNVHDACQGDSG

L 3 81 GGCCCCTTGGTGTGTATGAATGACAACCACATGACTTTGCTTGGCATCATCAGTTGGGGT 144 0

GPLVCMNDNHMTLLGI I S W G

1441 GTTGGCTGTGGGGAGAAAGACGTTCCAGGTGTATACACCAAGGTTACTAATTACCTAGGC 1500

VGCGEKDVPGVYTKVTNYLG

10 1501 TGGATTCGAGACAACATGCACCTGTAACCAAGAACACACAACTCCCTGGCAGCCCCTGCC 1560

WIRDNMHL

1561 TTCCTCCAGCCCAGAAGAAACACAAGGCAGAATGCTTCCTGACACCAGTTTCTCCACAAG 1620 1621 CCTGCACACAGTACTAGTGGGGGGAGAACGTATAGGAGAGGGGAGAGGGTATACTTCCAC 1680 1681 AGGTACTTCCCACTTCATAAGTTTTCAGGGGATAAGGTCTGATTTAGAATCCATTTCTGT 1740 15 1741 CAGACAAGAAGACAGATAAATGCCAACCCCTCCCAGAACACCACCATCTAGGGCAGACAA 1800 1801 GAGGTAGAATAAAAGCCCAACCTCCTAATCTGTCAACATGAGCAGCTTTGGAAATGGGAC 1860 1861 CACCAAGATGAAAGTATCTTTCTAGTAAAAAATAGCTAGATCCTTCAGTAAAGAAGTATC 1920 1921 ACATTAGAAATAAAATGTCCATGTATAGTCACAAGGACGCCCAACAGCGACCTGGGCCTC 1980 1981 CTAACAAGGAATGGGCTGTCTGGCCAGATTGCGTTCCTCAGGCCATCCTTTAAGTATTTG 2040 20 2041 ACTATCCTCTTTCTACAGCTCTTGGAAGGAATTCCTTTTGTGTACAGTATAAATCTTTTT 2100 2101 CCTTTATAAACTTTATAGTAGAAGAACTGTATCATTCTGATAACTGCTAAACTAGGCTTT 2160 2161 AGCATTTTGATATCAATCCATTGTAGTTGCCACGACTCTGTATTATACTACACTGGAAAA 2220 2221 ATAAATTCAGGCATATTTTTCACTTAAAAAAA 2252 • • · • · • · I « · · « • ·

Kuvio 26b 57 103577 1 GCCCTGCAAGAGCTGAGCTGACGGGAAATCCTCTCCAGGAGAGAAGGAAGGCAAGGAGTG 60 61 GCGAGTTTAAGGGACACCGCAGAAATGGTGAATACAATGAAGACAAAGCTGTTGTGTGTA 120

MVNTMKTKLLCV

5 121 CTGCTGCTTTGTGGAGCAGTCTTCTCGTTGCCCAGGCAGGAAACCTACAGGCAATTGGCA 180

LLLCGAVFSLPRQETYRQLA

181 AGGGGATCCAGAGCATATGGTGTGGCCTGCAGAGACGAAAAAACCCAGATGATATACCAG 24 0

RGSRAYGVACRDEKTQMIYQ

241 CAACAAGAGTCGTGGCTGCGCCCCGAGGTCAGAAGCAAGCGGGTAGAACACTGCCGGTGC 300

QQESWLRPEVRSKRVEHCRC

10 301 GATAGAGGATTGGCCCAGTGTCACACCGTGCCTGTCAAAAGTTGCAGTGAACTGAGGTGC 360

DRGLAQCHTVPVKSCSELRC

361 TTCAATGGGGGGACATGCTGGCAGGCTGCATCTTTCTCAGACTTTGTCTGTCAGTGCCCT 4 20

FNGGTCWQAASFSDFVCQCP

421 AAAGGATATACGGGGAAACAGTGTGAAGTAGATACCCATGCCACCTGCTACAAGGACCAG 480

KGYTGKQCEVDTHATCYKDQ

15 4 81 GGTGTCACCTACAGGGGCACATGGAGCACATCGGAAAGTGGGGCTCAGTGTATCAACTGG 540

GVTYRGTWSTSESGAQCINW

541 AACAGCAACCTTCTGACCCGGAGGACCTACAATGGGCGGAGGTCAGATGCCATCACACTG 600

NSNLLTRRTYNGRRSDAITL

601 GGCCTTGGGAATCACAATTACTGCAGAAACCCAGATAACAACTCAAAACCTTGGTGCTAT 660

GLGNHNY CRNPDNNSKPWCY

20 661 GTCATCAAGGCAAGCAAGTTCATCTTGGAGTTCTGTAGCGTGCCTGTCTGCTCCAAGGCC 7 20

VIKASKFILEFCSVPVCSKA

721 ACCTGTGGCCTGAGAAAGTACAAGGAGCCACAGCTTCACAGTACAGGAGGACTCTTCACA 7 80

TCGLRKYKEPQLHSTGGLFT

7 81 GäCATCACCTCTCATCCATGGCAGGCTGCCATCTTTGCCCAGAACAGAAGGTCATCAGGA 840

DITSHPWQAAIFAQNRRSSG

·.*.· 2^ 641 GAAAGGTTCTTGTGTGGGGGGATATTGATCAGTTCCTGCTGGGTCCTGACTGCTGCCCAC 900

ERFLCGGILISSCWVLTAAH

• · 901 TGCTTCCAGGAGAGGTATCCTCCCCAGCATCTTAGGGTGGTTTTGGGCAGAACATACCGG 960

·.·.· CFQERYPPQHLRVVLGRTYR

• · · : ·* 961 GTGAAACCTGGAAAGGAAGAGCAGACATTTGAAGTCGAAAAATGCATCGTCCATGAGGAA 1020

VKPGKEEQTFEVEKCIVHEE

• · 30 1021 TTTGATGACGACACTTACAACAATGACATTGCACTGCTGCAGCTGAAATCGGGCTCGCCA 1080

*·' * FDDDTYNNDIALLQLKSGSP

1081 CAGTGTGCCCAAGAGAGTGACAGTGTCCGCGCCATCTGTCTCCCGGAAGCCAACCTGCAG 1140

QCAQESDSVRAICLPEANLQ

1141 CTGCCCGACTGGACAGAATGTGAGCTGTCTGGCTACGGCAAGCATAAGTCGTCTTCTCCT 1200 LPDWTECELSGYGKHKSSSP 1 1201 TTCTATTCTGAGCAGCTGAAGGAAGGGCATGTCAGGCTGTACCCCTCCAGCCGCTGCACA 1260

FYSEQLKEGHVRLYPSSRCT

Kuvio 26b (jatkoa) 58 103577 1261 TCGAAGTTTCTGTTT. ^CAJ^ACCGTCACAAACAACATGCTGTGTGi 1GAGACACGCG3 1320

SKFLFNKTVTNNM LCAGDTR

5 1321 AGCGGAGAGATCTATCCAAATGTGCACGATGCCTGCCAGGGTGACTCAGGAGGCCCCTTG 1380

SGEIYPNVHDACQGDSGGPL

1381 GTGTGTATGAATGACAACCACATGACTTTGCTTGGCATCATCAGTTGGGGTGTTGGCTGT 1440

VCMNDNHMTLLGI I SWGVGC

1441 GGGGAGAAAGACATTCCAGGTGTATACACCAAGGTTACTAATTACCTAGGCTGGATTCGA 1500

GEKDIPGVYTKVTNYLGWIR

10 1501 GACAACATGCGCCCATAACCAAGAACACGCAACTCCCTGGCAGCCCCTGCCTTCCTCCAC 1560

D N M R P

1561 CCCAGAAGAAACACAAGGCAGAATGCTTCCTGACACCAGTTTCTCCACAAGCCTGCACAC 1620 1621 AGTACTAGTGGGGGGAGAACGTATAGGAGAGGGGAAAGGGTGTACTTCCACAGGTACTTC 16 80 1681 CCACTTCATAAGTTTTCAGGGGATAAGGTCTGATTTAGAATCCATTTCTGTCAGACAAGA 1740 15 1741 AGACAGATAAATGCCAACCCCTCCCAGAACACCACCATCTAGGGCAGACAAGAGGTAGAA 1800 1801 TAAAAGCCCAACCTCCTAATCTGTCAACGTGAGCAGCTTTGGAAATGGGACCACCAAGAT 1860 1861 GAAAGTATCTTTCTAGTAAAAAATAGCTAGATCCTTCAGTAAAGAAGTATCACATTAGAA 1920 19 21 ATAAAATGTCCATGTATAGTCACAAGGACACCCAACAGCGACCTGGGCCTCCTAAC AAGG 1980 1981 AATGGGCTGTCTGGCCAGATTGCGTTCCTCAGGCCATCCTTTAAGTATTTGACTACCCCC 2040 20 2041 TTTCTACAGCTTTTGGAAGGAATTC CTTTTGTGTACAGTATAAATCTTTTTCCTTTATAA 2100 2101 ACTTTATAGTAGAAGAACTGTATCATTCTGATAACTGCYAAACTAGGCTTTAGCATTTTG 2160 2161 ATATCAATCCATTGTAGTTGCCACAACTCTGTATTATACTACACTGGAAAAATAAATTCA 222.7 2221 GGCATATTTTTCACTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 2257 • 1 • · »««· • · • « ♦ · • · • · * · * · · · « • · « · · > » 1

Kuvio 26c 59 103577 1 GGCCAAGGCTGTGCGGAGAGATTGGCGCTGAAGCCCTGCAAGAGCTGAGCTGACGGGAAA 60 61 TCCTCTCCAGGAGAGAAGGAAGGCAAGGAGTGGCGAGTTTAAGGGACACCGCAGAAATGG 120

M V

5 121 TGAATACAATGAAGACAAAGCTGTTGTGTGTACTGCTGCTTTGTGGAGCAGTCTTCTCGT 180

NTMKTKLLCVLLLCGAVF S L

181 TGCCCAGGCAGGAAACCTACAGGCAATTGGCAAGGGGATCCAGAGCATATGGTGGTTGCA 240

PRQETYRQLARGSRAYGGCS

241 GTGAACTGAGGTGCTTCAATGGGGGGACATGCTGGCAGGCTGCATCTTTCTCAGACTTTG 300

ELRCFNGGTCWQAASFSDFV

301 TCTGTCAGTGCCCTAAAGGATATACGGGGAAACAGTGTGAAGTAGATACCCATGCCACCT 360

CQCPKGYTGKQCEVDTHATC

361 GCTACAAGGACCAGGGTGTCACCTACAGGGGCACATGGAGCACATCGGAAAGTGGGGCTC 420

YKDQGVTYRGTWSTSESGAQ

421 AGTGTATCAACTGGAACAGCAACCTTCTGACCCGGAGGACCTACAATGGGCGGAGGTCAG 480

CINWNSNLLTRRTYNGRRSD

15 481 ATGCCATCACACTGGGCCTTGGGAATCACAATTACTGCAGAAACCCAGATAACAACTCAA 540

AITLGLGNHNYCRNPDNNSK

541 AACCTTGGTGCTATGTCATCAAGGCAAGCAAGTTCATCTTGGAGTTCTGTAGCGTGCCTG 600

PWCYVIKASKFILEFCSVPV

601 TCTGCTCCAAGGCCACCTGTGGCCTGAGAAAGTACAAGGAGCCACAGCTTCACAGTACAG 660

CSKATCGLRKYKEPQLHSTG

20 661 GAGGACTCTTCACAGACATCACCTCTCATCCATGGCAGGCTGCCATCTTTGCCCAGAACA 7 20

GLFTDITSHPWQAAIFAQNR

721 GAAGGTCATCAGGAGAAAGGTTCTTGTGTGGGGGGATATTGATCAGTTCCTGCTGGGTCC 780

RSSGERFLCGGILISSCWVL

781 TGACTGCTGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTATCCTCCCCAGCATCTTAGGGTGGTTTTGG 840

TAAHCFQERYPPQHLRVVLG

.·.· 25 841 GCAGAACATACCGGGTGAAACCTGGAAAGGAAGAGCAGACATTTGAAGTCGAAAAATGCA 900

• RTYRVKPGKEEQTFEVEKCI

• ♦ · · • · 901 TCATCCATGAGGAATTTGATGACGACACTTACAACAATGACATTGCACTGCTGCAGCTGA 960

:,V IHEEFDDDTYNNDIALLQLK

i» · : V 961 AATCGGGCTCGCCACAGTGTGCCCAAGAGAGTGACAGTGTCCGCGCCATCTGTCTCCCGG 1020

SGSPQCAQESDSVRAICLPE

• · 30 1021 AAGCCAACCTGCAGCTGCCCGACTGGACAGAATGTGAGCTGTCTGGCTACGGCAAGCATA 1080

*.** ANLQLPDWTECELSGYGKHK

1081 AGTCGTCTTCTCCTTTCTATTCTGAGCAGCTGAAGGAAGGGCATGTCAGGCTGTACCCCT 1140

. SSSPFYSEQLKEGHVRLYPS

1141 CCAGCCGCTGCACATCGAAGTTTCTGTTTAACAAAAC CGTCACAAACAACATG C TGTGTG 1200 SRCTSKFLFNKTVTNNMLCA 1 1201 CTGGAGACACGCGGAGCGGAGAGATCTATCCAAATGTGCACGATGCCTGCCAGGGTGACT 1260

GDTRSGEIYPNVHDACQGDS

Kuvio 26c (jatkoa) 60 103577 261 CAGGAGGCCCCTTGGTGTGTATGAATGACAACCACA.TGAGTTTGGTV JCATCATCAGTT 1320

GGPLVCMNDNHh l-LLGI I S W

321 GGGGTGTTGGCTGTGGGGAGAAAGACATTCCAGGTGTATACACCAAGGTTACTAATTACC 13Θ0

5 GVGCGEKDIPGVYTKVTNYL

381 TAGGCTGGATTCGAGACAACATGCGCCCATAACCAAGAACACGCAACTCCCTGGCAGCCC 14 4 0

GWIRDNMRP

441 CTGCCTTCCTCCACCCCAGAAGAAACACAAGGCAGAATGCTTCCTGACACCAGTTTCTCC 1500 501 ACAAGCCTGCACACAGTACTAGTGGGGGGAGAACGTATAGGAGAGGGGAAAGGGTGTACT 1560 10 551 TCCACAGGTACTTCCCACTTCATAAGTTTTCAGGGGATAAGGTCTGATTTAGAATCCATT 16 20 521 TCTGTCAGACAAGAAGACAGATAAATGCCAACCCCTCCCAGAACACCACCATCTAGGGCA 16 80 681 GACAAGAGGTAGAATAAAAGCCCAACCTCCTAATCTGTCAACGTGAGCAGCTTTGGAAAT 1740 741 GGGACCACCAAGATGAAAGTATCTTTCTAGTAAAAAATAGCTAGATCCTTCAGTAAAGAA 1800 , _ 801 GTATCACATTAGAAATAAAATGTCCATGTATAGTCACAAGGACACCCAACAGCGACCTGG 1860

1D

361 GCCTCCTAACAAGGAATGGGCTGTCTGGCCAGATTGCGTTCCTCAGGCCATCCTTTAAGT 19 20 921 ATTTGACTACCCCCTTTCTACAGCTTTTGGAAGGAATTCCTTTTGTGTACAGTATAAATC 1980 9 81 TTTTTCCTTTATAAACTTTATAGTAGAAGAACTGTATCATTCTGATAACTGCTAAACTAG 2040 041 GCTTTAGCATTTTGATATCAATCCATTGTAGTTGCCACAACTCTGTATTATACTACACTG 2100 20 101 GAAAAATAAATTCAGGCATATTTTTCACTTAAAAAAA 2137 • · • · · • · · • · • · • · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · « • · · • · ·

Kuvio 26d 61 103577 1 GCTACAGAGAAGCCCGCCCACTGTGGGCCACTGACCCCACCCCCTGCTTTGAAATACAGG 60 61 GGAGGCCGAGGCTGTGCGGAGAGATTGGCGCTGAAGCCCTGCAAGAGCTGAGCTGACGGG 120 121 AAATCCTCTCCAGGAGAGAAGGAAGGCAAGGAGTGGCGAGTTTAAGGGACACCGCAGAAA 180

5 M

181 TGGTGAATACAATGAAGACAAAGCTGTTGTGTGTACTGCTGCTTTGTGGAGCAGTCTTCT 24 0

VNTMKTKLLCVLLLCGAVFS

241 CGTTGCCCAGGCAGGAAACCTACAGGCAATTGGCAAGGGGATCCAGAGCATATGGTGATC 300

LPRQETYRQLARGSRAYGDP

301 CCCATGCCACCTGCTACAAGGACCAGGGTGTCACCTACAGGGGCACATGGAGCACATCGG 360

10 HATCYKDQGVTYRGTWSTSE

361 AAAGTGGGGCTCAGTGTATCAACTGGAACAGCAATCTTCTGATCCGGAGGACCTACAATG 420

SGAQCINWNSNLLIRRTYNG

421 GG CGGATG C CAGAGG CCGTCAAGCTGGGC C TTGGGAATCACAATTACTGTAGAAAC CCAG 4 80

RMPEAVKLGLGNHNYCRNPD

4 81 ATGGAGCCTCAAAACCTTGGTGCTATGTCATCAAGGCAAGGAAGTTCACCTCAGAGTCCT 54 0

15 GASKPWCYVIKARKFTS ESC

541 GTAGCGTGCCTGTCTGCTCCAAGGCCACCTGTGGCCTGAGAAAGTACAAGGAGCCACAGC 600

SVPVCSKATCGLRKYKEPQL

601 TTCACAGTACAGGAGGACTCTTCACAGACATCACCTCTCATCCATGGCAGGCTGCCATCT 6 60

KSTGGLFTDITSHPWQAAIF

661 TTGCCCAGAACAGAAGGTCATCAGGAGAAAGGTTCTTGTGTGGGGGAATATTGATCAGTT 7 20

20 AQNRRSSGERFLCGGILISS

721 CCTGCTGGGTCCTGACTGCTGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTATCCTCCCCAGCATCTTA 780

CWVLTAAHCFQERYPPQHLR

781 GGGTGGTTTTGGGCAGAACATACCGGGTGAAACCTGGAAAGGAAGAGCAGACATTTGAAG 84 0

VVLGRTYRVKPGKEEQTFEV

841 TCGAAAAATGCATCGTCCATGAGGAATTTGATGACGACACTTACAACAATGACATTGCAC 9 00

*.V 25 EKCIVHEEFDDDTYNNDIAL

• · · • '.· 9 01 TGCTGCAGCTGAAATCGGGCTCGCCACAGTGTGCCCAAGAGAGTGACAGTGTCCGCGCCA 9 60 lqlksgspqcaqesdsvrai • · 961 tctgtctcccggaagccaacctgcagctgcccgactggacagaatgtgagctgtctggct 1020

·.· · CLPEANLQLPDWTEC ELSGY

1021 ACGGCAAGCATAAGTCGTCTTCTCCTTTCTATTCTGAGCAGCTGAAGGAAGGGCATGTCA 1080

30 GKHKSSSPFYSEQLKEGHVR

• · · « 1081 GGCTGTACCCCTCCAGCCGCTGCACATCGAAGTTTCTGTTTAACAAAACCGTCACAAACA 1140 lypssrctskflfnktvtnn : : 1141 ACATGCTGTGTGCTGGAGACACGCGGAGCGGAGAGATCTATCCAAATGTGCACGATGCCT 1200 mlcagdtrsgeiypnvhdac 1201 GCCAGGGTGACTCAGGAGGCCCCTTGGTGTGTATGAATGACAACCACATGACTTTGCTTG 126 0

35 QGDSGGPLVCMNDNHKTLLG

Kuvio 26d (jatkoa) 62 103577 1261 GCATCATCAGTTGGGGTGTTGGCTGTGGGGAGAAAGACATTCCAGG. jTATACACCAAGG 1320

5 IISWGVGCGEKDIPGVYTXV

1321 TTACTAATTACCTAGGCTGGATTCGAGACAACATGCGCCCATAACCAAGAACACGCAACT 1380

TNYLGWIRDNMRP

1381 CCCTGGCAGCCCCTGCCTTCCTCCACCCCAGAAGAAACACAAGGCAGAATGCTTCCTGAC 1440 1441 ACCAGTTTCTCCACAAGCCTGCACACAGTACTAGTGGGGGGAGAACGTATAGGAGAGGGG 1500 10 1501 AAAGGGTGTACTTCCACAGGTACTTCCCACTTCATAAGTTTTCAGGGGATAAGGTCTGAT 1560 1561 TTAGAATCCATTTCTGTCAGACAAGAAGACAGATAAATGCCAACCCCTCCCAGAACACCA 1620 1621 CCATCTAGGGCAGACAAGAGGTAGAATAAAAGCCCAACCTCCTAATCTGTCAACGTGAGC 1680 1681 AGCTTTGGAAATGGGACCACCAAGATGAAAGTATCTTTCTAGTAAAAAATAGCTAGATCC 1740 1741 TTCAGTAAAGAAGTATCACATTAGAAATAAAATGTCCATGTATAGTCACAAGGACACCCA 1800 15 1801 ACAGCGACCTGGGCCTCCTAACAAGGAATGGGCTGTCTGGCCAGATTGCGTTCCTCAGGC 1860 1861 CATCCTTTAAGTATTTGACTACCCCCTTTCTACAGCTTTTGGAAGGAATTCCTTTTGTGT 1920 1921 ACAGTATAAATCTTTTTCCTTTATAAACTTTATAGTAGAAGAACTGTATCATTCTGATAA 1980 19 81 CTGCTAAACTAGGCTTTAGCATTTTGATATCAATCCATTGTAGTTGCCACAACTCTGTAT 204 0 20 2041 T ATAC T AC AC TGG AAAAAT AAATT CAGGCATATTTTT CAC TT AAAAAAAAAAAAAAAAAA 2100 • · • · · • · · • · • « « · • · · • t · • · ♦ • · · • · « • · ·

Kuvio 27 63 103577 v-PA-alfa-l-cDNA-jakson (päällekkäisten jaksojen ylärivi) vertailu vastaavaan t-PA:n jaksoon (alarivi) 1 GGCGCTGAAGCCCTGCAAGAGCTGAGCTGACGGGAAATCCTCTCCAGGAG 50

5 I I IMI I IMI Mill I III

1 ....................ACAGGGCTGGAGAGAAAACCTCTGC . . GAG 28 51 AGAAGGAAGGCAAGGAGTGGCGAGTTTAAGGGACAC..CGCAGAAATGGT 98

MM III II I II IIMIMIM I I II III I

29 GAAAG GGAAGGAG CAAG C C G TGAATTTAAGGGAC G C TGTGAAG CAAT CAT 7 8 99 GAATACAATGAAGACAAAGCTGTTGTGTGTACTGCTGCTTTGTGGAGCAG 148 I II 111111111 I III I Mill llllllll llllllllll 10 79 GGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAG 128 149 TCTTCTCGTTGCCCAGGCAGGAAACCTACAGGCAATTGGCAAGGGGATCC 198

Mill I Milli lllllll II I III III III II

129 TCTTCGTTTCGCCCAGCCAGGAAATCCATGCCCGATTCAGAAGAGGAGCC 178 199 AGAGCATATGGTGTGGCCTGCAAAGACGAAATAACCCAGATGACATACCG 248 III I II III Mill III MM III IIIIIII Mill 179 AGATCTTACCAAGTGATCTGCAGAGATGAAAAAACGCAGATGATATACCA 228 15 .....

249 GCGACAAGAGTCGTGGCTGCGCCCCGAGGTCAGAAGCAAGCGGGTGGAAC 298 II III MM 11111111111 I I III11111II IIIII1111 229 GCAACATCAGTCATGGCTGCGCCCTGTGCTCAGAAGCAACCGGGTGGAAT 278 299 ACTGCCAGTGCGATAGAGGCCAGGCCCGGTGCCACACCGTGCCCGTCAAC 348 I Ml MM I II III Ml I II 11111 I Mill Mill 279 ATTGCTGGTGCAACAGTGGCAGGGCACAGTGCCACTCAGTGCCTGTCAAA 328 20 349 AGTTGCAGTGAACCAAGGTGCTTCAATGGGGGGACATGCTGGCAGGCTGT 398 mimmi m iiiiiiii mu mu ii mi immi i 329 AGTTGCAGCGAGCCAAGGTGTTTCAACGGGGGCACCTGCCAGCAGGCCCT 378 399 ATATTTCTCAGACTTTGTCTGTCAGTGCCCTGCAGGATATACGGGGAAAC 448 ii iiiiiiii m ii it iiiiiiii I mu I I him 379 GTACTTCTCAGATTTCGTGTGCCAGTGCCCCGAAGGATTTGCTGGGAAGT 428 449 GGTGTGAAGTAGATACCCGTGCCACCTGCTATGAGGGCCAGGGTGTCACC 498 .V 25 I mm mimmi I mu nm imi mmm m i ... 429 GCTGTGAAATAGATACCAGGGCCACGTGCTACGAGGACCAGGGCATCAGC 478 • · · • * · · · · · * '. 499 TACAGGGGCACATGGAGCACAGCAGAAAGTAGGGTTGAGTGTATCAACTG 548

II M II II I II II II Ml III I II III 1 I Mill I IIIMI

... 479 TACAGGGGCACGTGGAGCACAGCGGAGAGTGGCGCCGAGTGCACCAACTG 528 • · * • » I « * « · 549 GAACAGCAGCCTTCTGACCCGGAGGACCTACAATGGGCGGATGCCAGATG 598 m I m I m m m m I immi iimii mill i ... 30 529 GAACAGCAGCGCGTTGGCCCAGAAGCCCTACAGCGGGCGGAGGCCAGACG 578 • · · ·.· * .....

... 599 C C TT CAAC C TGGG C CTTGGGAATCACAATTAC TG CAGAAAC C CAAATGGA 648 m m iiiiiiii iiiiiiiiii iimii mum μι ii 579 CCATCAGGCTGGGCCTGGGGAACCACAACTACTGCAGAAACCCAGATCGA 628 ’ 649 GCCCCAAAACCTTGGTGCTATGTCATCAAGGCAGGGAAGTTCACCTCGGA 698

I I MM II IIIIIIII III I Mill 111 Ml I II III II

629 GACTCAAAGCCCTGGTGCTACGTCTTTAAGGCGGGGAAGTACAGCTCAGA 678 35 .....

699 GTCCTGTAGCGTGCCTGTCTGCTCCAAGGCCACCTGTG............ 736

II III III MM mill III I I III

679 GTTCTGCAGCACCCCTGCCTGCTCTGAGGGAAACAGTG............ 716

Kuvio 27 (jatkoa) 64 103577 717 ACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGC C TAC CG TGGCACGCACAGC CTCACC 766 5 767 GAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAA 816 817 GGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAAC 866 867 ATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTG 916 917 CTGAAGAACCGCAGGCTGAGGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTC 966 967 CACCTGCG.......................................... 974 15 737 GCCTGAGAAAGTACAAGGAGCCACAGCTTCACAGTACAGGAGGACTCTTC 786

Il 111111 MINI IMI III III II I MMM MMM

975 GCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTC 1024 787 ACAGACATCACCTCTCATCCATGGCAGGCTGCCATCTTTGCCCAGAACAG 836

I MMM MM II II 111111111111111111111 II MM

1025 GCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAG 1074 20 .....

837 AAGGTCATCAGGAGAAAGGTTCTTGTGTGGGGGGATATTGATCAGTTCCT 886

IMU I Mill Mill MM Mill III I Mill MM

1075 GAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCT 1124 887 GCTGGGTCCTGACTGCTGCCCACTGCTTCCAGGAGAGCTATCTTCCTGAC 936

Mill I II MM 11111111111111111111 I II II II

1125 GCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCAC 1174 oc 9 37 CAGCTTAAGGTGGTTTTGGGCAGAACATACCGGGTGAAACCTGGAGAGGA 986 II II I IIII I IIIIIIIIIIIIIIIIIIIII IIIII 11111 ; · : 1175 CACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGA 1224 «;··· 987 AGAGCAGACATTTAAAGTCAAAAAATACATCGTCCATAAGGAATTTGATG 1036

11IIIII MM Mill IIII MM II MMM MIMMI MM

: : : 1225 ggagcagaaatttgaagtcgaaaaatacattgtccataaggaattcgatg 1274 1037 ACGACACTTACAACAATGACATTGCACTGCTGCAGCTGAAATCGGACTCA 1086

30 I I II 111111 11111111II111 II MM MM II MM MM II

: : : 1275 ATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCG 1324 : 1087 ccacagtgtgcccaagagagtgacagtgtccgcgccatctgtctcccgga 1136

I I MIMMI Mill I MMM I I II II II

: 1325 TCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCC 1374 1137 agccaacctgcagctgcccgactggacagaatgtgagctgtctggctacg 1186 II 11II111111III MIMMI II MIMMI II 1111111 35 1375 GGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACG 1424 1187 GCAAGCATAAGTCATCTTCTCCTTTCTATTCTGAGCAGCTGAAGGAAGGG 1236

MMMII II I I MIIMIIMMM MM 111111111 I

1425 GCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCT 1474

Kuvio 27 (jatkoa) 65 103577 1237 CATGTCAGGCTGTACCCCTCCAGCCGCTGCGCACCCAAGTTTCTGTTTAA 1286 II II II II lllllll I III II HIHII II I I II llll 1475 CATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAA 1524 1287 CAAAACCGTCACAAACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACGCGGAGCGGAG 1336

5 II III Hill 1111111111111111111111111 Hillin I

1525 CAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCG 1574 • · · · « 1337 AGATCTATCCAAATGTGCACGATGCCTGCCAGGGTGACTCAGGAGGCCCC 1386 I 1 I llll lllllll 11111111111 II II Hiiliin 1575 GGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCC 1624 » · · « 1387 TTGGTGTGTATGAATGACAACCACATGACTTTGCTTGGCATCATCAGTTG 1436

ΙΙΙΙΠΙΙ llll II II Hiiliini I lllllllllll II

10 1625 CTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTG 1674 1437 GGGTGTTGGCTGTGGGGAGAAAGACGTTCCAGGTGTATACACCAAGGTTA 1486 III I ΙΙΙΙΠΙΙ llll II II II Hill 11 II 111111111 1675' GGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACCAAGGTTA 1724 1487 CTAATTACCTAGGCTGGATTCGAGACAACATGCACCTGTAACCAAGAACA 1536 I II lllllll Hiiliin llllllllll I II llll Hill 1725 CCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGACCAGGAACA 1774 15 .....

1537 CACAACTCCCTGGCAGC.........CCCTGCCTTCCTCCAGCCCAGAAG 1577 I I Hill III lllllllllll 1775 CCCGACTCCTCAAAAGCAAATGAGATCCCGCCTCTTCTTCTTCAGAAGAC 1824 1578 AAACACAAGGCAGAATGCTTCCTGACACCAGTTTCTCCACAAGCCTGCAC 1627

I mil I mill III I II II II III

1825 ACTGCAAAGGCGCAGTGCTTCTCTACAGACTTCTCCAGAC...CCACCAC 1871 20 16 28 ACAGTACTAGTGGGGGGAGAACGTATAGGAGAGGGGAGAGGGTATACTTC 1677

II I I II III llll I II Hiiliin llll I II II

1872 ACCGCAGAAGCGGGACGAGACCCTACAGGAGAGGGAAGAGTGCAT. . TTT 1919 1678 CACAGGTACTTCCCACTTCATAAGTTTTCAGGGGATAAGGTCTGATTTAG 17 27 I lii lllllllll II Ulliini III llllllllll 1920 CCCAGATACTTCCCATTTTGGAAGTTTTCA. .GGACTTGGTCTGATTTCA 1967 1725 AATCCATTTCTGTCAGACAAGAAGACAGATAAATGCCAACCCCTCCCAGA 177 7

••.V 25 llll I I I II I I I II llll II

... 19 68 GGATACTCTGTCAGATGGGAAGACATGAATGCACACTAGCCTCTCCAGGA 2017 i ♦ * • · · · · · · 1778 ACACCACCATCTAGGGCAG.............ACAAGAGGTAGAATAAAA 1814 i π n i mm π ι i m ... 2018 ATGCCTCCTCCCTGGGCAGAAGTGGCCATGCCACCCTGTTTTCAGCTAAA 2067 t * » 1815 GCCCAACCTCCTAATCTGTCAACATGAGCAGCTTTGGAAATGGGACCACC 1864 III lllllllll II Hill I (MUMMU Hl lllllll 30 2068 GCCCAACCTCCTGACCTGTCACCGTGAGCAGCTTTGGAAACAGGACCACA 2117 *;·. 1865 AAGATGAAAGTATCTTTC..TAGTAAAAAATAGCTAGATCCTTCAGTAAA 1912

II lllllll II I II ΙΙΙΙΠΙΙ 111 I 11111 Hill III

2118 AAAATGAAAGCATGTCTCAATAGTAAAAGATAACAAGATCTTTCAGGAAA 2167 1913 GAAGTATCACATTAGAAATAAAATGTCCATGTATAGTCACAAGGACGCCC 1962 π ι n mimmi ι π n iiimiimi ι i 2168 GACGGATTGCATTAGAAATAGACAGTATATTTATAGTCACAAGAGCCCAG 2217 35 .....

1963 AACAGCGACCTGGGCCTCCTAACAAGGAATGGGCTGTCTGGCCAGATTGC 2012 in ι π n mu mm ι 2218 CAGGGC...........TCAAAGTTGGGGCAGGCTGGCTGGCCCGTCATG 2256

Kuvio 27 (jatkoa) 66 103577 2013 GTTCCTCAGGCCATCCTTTAAGT........ATTTGACTATCCTCTTTCT 2054

I I I II IMI I II II II III t II

2257 TTCCTCAAAAGCACCCTTGACGTCAAGTCTCCTTCCCCTTTCCCCACTCC 2306 5 .....

2055 ACAGCTCTTGGAAGGAATTCCTTTTGTGTAC.........AGTATAAATC 2095 nm min iiMiiiimim m mmm 2307 CTGGCTCTCAGAAGGTATTCCTTTTGTGTACAGTGTGTAAAGTGTAAATC 2356 2096 TTTTTCCTTTATAAACTTTATAGTAGAAGAACTGTATCATTCTGATAACT 2145

MM IIIIIMIMMM Mill II I III I I I

2357 CTTTTTCTTTATAAACTTTAGAGTAGCATGA...GAGAATTGTATCATTT 2403 10 2146 GCTAAACTAGGCTTTAGCATTTTGATATCAATCCATTGTA.......... 2185

I llllllllll Mill II III MIMMI II

2404 GAACAACTAGGCTTCAGCATATTTATAGCAATCCATGTTAGTTTTTACTT 2453 2186 ...GTTGCCACGACTCTGTATTATACTACACTGGAAAAATAAATTCAGGC 2232 llllllll II MM 1111111 III 11111111111 2454 TCTGTTGCCACAACCCTGTTTTATACTGTACT____TAATAAATTCAGAT 2499 2233 ATATTTTTCACTTAAAAAAA 2252 15 11111111111 2500 ATATTTTTCACAGTTTTTCC 2519

Kuvio 26a

Alfa-1 -ryhmän pisimmän havaitun plasmidikloonin 20 cDNA-liitosjakson täydellinen DNA-jakso sekä johdettu aminohappojakso. Koodaava jakso alkaa nukleotidista 94 (ATG...) ja loppuu lopetuskodoniin, joka on nukleotidissa 1527 (...TAA). Johdettu aminohappojakso on esitetty yksikirjaimisella koodilla, jossa kukin aminohappo on sitä koo-25 daavan tripletin ensimmäisen nukleotidin kohdalla.

.* . Kuvio 26b • · · • ·

Alfa-2 -tyypin plasmidikloonin cDNA-liitosjakson • · · · « • · täydellinen DNA-jakso sekä johdettu aminohappojakso. Koo-'·’ daava jakso alkaa nukleotidista 85 (ATG...) ja loppuu lo- 30 petuskodoniin, jokaon nukleotidin 1518 (...TAA) kohdalla.

·.· : Johdettu aminohappojakso on esitetty yksikirjaimisella koo- •\·’ ·’ dilla, jossa kukin aminohappo on sitä koodaavan tripletin : .·. ensimmäisen nukleotidin kohdalla.

Kuvio 26c 35 Beeta-ryhmän pisimmän havaitun plasmidikloonin 67 103577 (ATG...) ja loppuu lopetuskodoniin, joka on nukleotidin 1412 (...TAA) kohdalla. Johdettu aminohappojakso on esitetty yksikirjaimisella koodilla, jossa kukin aminohappo on sitä koodaavan tripletin ensimmäisen nukleotidin koh-5 dalla.

Kuvio 26d

Gamma-tyypin plasmidikloonin cDNA-liitosjakson täydellinen DNA-jakso sekä johdettu aminohappojakso. Koodaava jakso alkaa nukleotidista 180 (ATG...) ja loppuu lopetus-10 kodoniin, joka on nukleotidin 1364 (...TAA) kohdalla. Johdettu aminohappojakso on esitetty yksikirjaimisella koodilla, jossa kukin aminohappo on sitä koodaavan tripletin ensimmäisen nukleotidin kohdalla.

Esimerkki 19 15 Aktiivista ainetta, v-PA:ta, koodaavat jaksot sisäl tävien ilmentämisvektorien konstruktio ja sen testaaminen mikroinjektiolla oosyytteihin v-PA-muotojen alf a2, β ja <y cDNA-klooneista saadut koodaavat jaksot saadaan pilkkomalla restriktioendonuk-20 leaasilla EcoRI, ja sen jälkeen kun ne on käsitelty E. colin DNA-polymeraasi I:n Klenowin fragmentilla ja eristetty matalassa lämpötilassa sulavasta agaroosista valmistetuista geeleistä, ne liitetään E. colin DNA-polymeraasi I:n Klenowin fragmentilla täytetyn ja vasikan suo-25 Ien fosfataasilla (Boehringer-Mannheim) käsitellyn pSVL- • · ;·.·. EcoRI'-vektorin Xbal-kohtaan. Oikea orientaatio testataan

BamHI:llä. pSVL-EcoRI:ssä käytetään kaupallisesti saata- ... villa olevan SV40-ilmentämisvektorin pSVL johdannaista • · · * (Pharmacia).

•« · • · · • · « 5 68 103577

Kaavio ilmentämisvektori pSVL-EcoRI:stä, jossa v-PA-kloo-nauskohta on osoitettu

Polylinker-jakson e,S,°2 ® S alue ,5,31

lyöhMinen CTCG AGTCTAG ACCCGGGQ AGCTCGQ ATCC

lenylaatio (_I_i _I_|_J

M, ......... xhQ , xba , Sma , S(JC , 0amH I

I V t

Acy i A.

/ Ne / »«MU / ».I ·' /

UM

/ i v-'PA ^ ^ 15 ,-*-1 Näin tuotetut ilmentämisvektorit puhdistetaan cesiumkloridigradientilla ja niitä käytetään mikroinjek-20 tiossa Xenopus laevis -oosyytteihin.

Injektio oosyytteihin suoritettiin seuraavien siteerattujen artikkelien mukaisesti: 1. Gurdon, J.B. ja Wakefield, L., teoksessa "Micro-injection and Organelle Transplantation Techniques", toim.

25 Celis, J.E., Graessmann, A., ja Loyter, A., Academic ; . ; Press, Lontoo, 1986.

• · 2. Colman, A., teoksessa "Transcription and Trans-...·; lation - A Practical Approach", toim. Hames, R.J. ja

Higgins, S.J., IRL-Press Oxford, 1984.

• · ·

30 3. Langer, G., "Analyse des Drosophila UI SURNA

... Promotors in homologen in vitro und heterologen in vitro « i t ’;*/ Transkriptionssystemen", tohtorinväitöskir ja, Kaisers- ’ lauternin yliopisto, 1987.

Sen jälkeen kun v-PA -ilmentämisvektoreilla injek-35 toidut oosyytit on upotettu fibriinimaljaan, joka on val- 69 103577 mistettu Barthin kasvatusalusaa käyttäen (kirjallisuusviite 2), muodostuu kirkkaita hajoamista osoittavia aukkoja. Kun fibriinimaljan tilalla käytetään kaseiinimaljaa, ei tapahdu hajoamista (alr a2, β). Niissä oosyyteissä, joi-5 hin injektoitiin vektori, joka ei sisältänyt v-PA -jaksoa, ei kirkasta hajoamista osoittavaa aukkoa esiinny.

v-PA:n cDNA-jaksot sisältävät toiminnallisen signaalipeptidijakson, joka vastaa v-PA -proteiinin kuljetuksesta ulos solusta.

10 Nämä tulokset osoittavat selvästi, että tällä tavoin saadut v-PA:n cDNA-kloonit ovat täydellisiä ja että ne tuottavat aktiivista, fibriinille absoluuttisen spesifistä vaikuttavaa ainetta sen jälkeen, kun ne on liitetty sopivaan ilmentämisvektoriin.

« · • · 1 • · · • · • · • · • · · • · i • · · • · · I I I • · · · · t · · • · ·

Claims (5)

103577

1. Menetelmä olennaisesti puhtaan proteiinin valmistamiseksi, joka on trombolyyttinen aine, joka aktivoi 5 plasminogeenin fibriinin läsnäollessa mutta ei olennaises ti fibrinogeenin läsnäollessa, ja joka on allosteerinen, ja joka proteiini on v-PAal, jolla on kuviossa 26a esitetty aminohappojakso, tunnettu siitä, että mainittua proteiinia koodaavaa DNA:ta ilmennetään mikro-organismis-10 sa, joka on transformoitu vektorilla, joka sisältää maini tun DNA:n.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tuotetaan olennaisesti puhdas proteiini, jonka N-terminaalinen aminohappojakso on Ala-Tyr-

15 Gly-Val -Ala-...

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tuotetaan olennaisesti puhdas proteiini, jonka N-terminaalinen aminohappojakso on Ala-Tyr-Gly-Vai - Ala-Cys -Lys-Asp-Glu-1 le-Thr-Gln-Met-Thr-Tyr-Arg-...

4. Eristetty DNA, tunnettu siitä, että se koodaa patenttivaatimuksessa 1 määriteltyä proteiinia ja että sillä on kuviossa 26a esitetty nukleotidisekvenssi.

5. Mikro-organismi, tunnettu siitä, että se on transformoitu vektorilla, joka sisältää patenttivaa-25 timuksen 4 mukaista DNA:ta. • · « * · • · · • · · • · • · • · · · • · · • · « · • · · • · · 103577