DK175704B1 - Inhibering af arteriel thrombotisk okklusion eller thromboenboli - Google Patents
Inhibering af arteriel thrombotisk okklusion eller thromboenboli Download PDFInfo
- Publication number
- DK175704B1 DK175704B1 DK198806400A DK640088A DK175704B1 DK 175704 B1 DK175704 B1 DK 175704B1 DK 198806400 A DK198806400 A DK 198806400A DK 640088 A DK640088 A DK 640088A DK 175704 B1 DK175704 B1 DK 175704B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- activated protein
- protein
- apc
- pharmaceutical composition
- dose
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6464—Protein C (3.4.21.69)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- A61K38/166—Streptokinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/49—Urokinase; Tissue plasminogen activator
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Description
i DK 175704 B1
Den foreliggende opfindelse angår inhibering af arteriel thrombotisk okklusion eller thromboemboli med plasmaderiveret eller ved gensplejsning fremstillet aktiveret protein C (APC) alene eller i kombination med et thromboly-5 tisk middel.
Mange af de kirurgiske fremgangsmåder indebærer risiko for venøs og arteriel thrombose og thromboemboli. Anvendelse af gængse anti-blodplade-aggregerende eller fibrinolytiske lægemidler i intraoperative eller postoperative tilfælde 10 kunne lede til alvorlige blødningskomplikationer. Således kræver anvendelsen af disse midler ekstra forsigtighed.
Selv ved sygdomme, der som en komplikation har arteriel thrombose, har anvendelsen af antithrombotisk og/eller throm-bolytisk behandling uønskede bivirkninger, såsom blødning 15 eller reokklusion under thrombolytisk behandling ved hjerte-infakt, blødning eller thrombose efter kirurgiske indgreb og thrombose efter kirurgiske indgreb, hvori der er anvendt implantater eller andre kardiovaskulære proteseanordninger.
Der er derfor et behov for en antithrombotisk behand-20 ling, som på samme tid kan være antikoagulerende, anti-blodplade-aggregerende og fibronolytisk uden risiko for blødning.
APC er enestående blandt de fysiologiske antikoagulanter, eftersom det inhiberer koagulation og stimulerer fibrinolyse.
APC inhiberer den thrombin-formidlede aktivering af blodpla-25 der samt dannelsen af fibrin og således dannelsen af arteriel thrombe, for størsteparten opbygget af blodplader og fibrin. Anvendelsen af APC nedsætter dosis af vævs-type plaminogen-aktivator (tPA) eller andre thrombolytiske midler ved dets virkninger. Således tilvejebringer APC mere sikker thrombo-30 lyse med mindre risiko for blødning og mindre risiko for reokklusion.
APC er et kraftigt antikoagulerende enzym in vitro og in vivo. APC inhiberer blodkoagulationsveje og dannelsen af thrombin ved proteolytisk spaltning af F.Va og F.Villa, og 35 øger ligeledes fibrinolyse (jvf. Seegers et al.. Thrombosis Res., 1, 443-450 (1972); Kisiel, J. Clin. Invest., 64, 761-
I DK 175704 B1 I
I i
I 769 (1979); Marlar & Griffin, J. Clin. Invest., 66, 1186- I
I 1189 (1980); Marlar et al., Blood, 59, 1067-1072 (1982); I
Clouse & Comp., New Engl. J. Med., 314, 1298-1304 (1986)). I
APC dannes ud fra dets kredsløbsforstadium, dvs. fra det I
5 vitamin K afhængige protein C (PC) ved aktivering med im- I
I mobiliseret thrombin på blodkarendoteliet (jvf. Mammen et I
I al., Thromb. Diath. Haemorrh., 5, 218-249 (1960); Stenflo, I
I J. Biol. Chem., 251, 355-363 (1976); Esmon & Owen, Proc. I
Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2249-2252 (1981)). I protein C- I
10 vejen tjener APC som enzymet, centralt for den modkoblede I
koagulationsregulering. Arvelig mangel på PC er knyttet til I
venøse thromboembolitiske sygdomme (Griffin et al., J. Clin. I
I Invest., 68, 1370-1373 (1981): Bertina et al., Thromb. Hae- I
most., 48, 1-5 (1982); Griffin, Seminars in Thrombosis and I
I 15 Hemostasis, 10, 162-166 (1984); Marciniak et al., Blood, I
65, 15-20 (1985)), men arvelig protein C mangel er ikke I
signifikant knyttet til arteriel thrombose (jvf. Coller et I
I al., Arteriosclerosis, 7, 456-462 (1987). En fusion af APC I
nedsætter blodkoagulationsevnen i forskellige dyremodeller I
20 og hindrer de koagulopatiske og dødelige virkninger ved E. I
I coli infusion i bavianer (Comp & Esmon, J. Clin. Invest.,. I
I 68, 1221-1228 (1981); Comp et al., J. Clin. Invest., 70, I
I 127-134 (1982); Colucci et al., J. Clin. Invest., 74, 200- I
I 204 (1984); Taylor et al., J. Clin. Invest., 79, 918-925 I
I 25 (1987); Burdick & Schaub, Thrombosis Res., 45 413-419 I
I (1987)) . Infusion af et thrombolytisk middel, såsom t-PA, i I
mennesker resulterer ved effektiv thrombolyse i akut hjerte- I
I infarkt (AMI) (Ysuf et al., European Heart Journal, 6, 556- I
I 585 (1985); European Cooperative Study Group, Lancet., 842- I
I 30 847 (1985)). I
I et første aspekt angår den foreliggende opfindelse
I et farmaceutisk præparat til inhibering af akut arteriel I
I thrombotisk okklusion, thromboemboli eller stenose i coro- I
I ! nare, cerebrale eller perifere arterier eller i vaskulære
I : 35 implantater eller til inhibering af arteriel blodpladeafsæt- I
ning, hvilket præparat er karakteriseret ved, at det omfatter I
DK 175704 B1 3 aktiveret protein C med en renhed på mindst 95% i en farmaceutisk acceptabel bærer. I en udførelsesform omfatter et præparat ifølge dette aspekt af opfindelsen tilstrækkeligt med aktiveret protein C til at give en dosis af aktiveret 5 protein C på 0,2 til 1,1 mg/kg-time. Et sådant præparat er anvendeligt ved en metode til inhibering af akut arteriel thrombotisk okklusion, thromboemboli eller stenose i coro-nare, cerebrale eller perifere arterier eller i vaskulære implantater eller til inhibering af arteriel blodafsætning 10 og kan omfatte en effektiv mængde af plasma-deriveret eller rekombinant fremstillet, aktiveret protein C alene eller i kombination med et thrombolytisk middel, såsom vævsplas-minogenaktivator, urokinase, pro-urokinase, streptokinase, en acyleret form af plasminogen eller plasmin og acyleret 15 streptokinase-plasminogen-kompleks.
I et andet aspekt angår opfindelsen et farmaceutisk præparat til inhibering af akut arteriel thrombotisk okklusion, thromboemboli eller stenose i coronare, cerebrale eller perifere arterier eller i vaskulære implantater eller 20 til inhibering af arteriel blodpladeafsætning, hvilket præparat er karakteriseret ved, at det omfatter aktiveret protein C i kombination med et thrombolytisk middel eller en kombination af thrombolytiske midler. I en udførelsesform omfatter et præparat ifølge dette aspekt af opfindelsen 25 tilstrækkeligt med aktiveret protein C til at give en dosis af aktiveret protein C på 0,2 til 1,1 mg/kg-time. Det aktiverede protein C er fortrinsvis mindst 95% rent.
I et yderligere aspekt angår opfindelsen anvendelsen af aktiveret protein C til fremstilling eller præparation af 3 0 et medikament til anvendelse ved en behandling af akut arteriel thrombotisk okklusion, thromboemboli eller stenose i coronare, cerebrale eller perifere arterier eller i vaskulære implantater, eller til inhibering af arteriel blodpladeaf-sætning.
35 I et fjerde aspekt angår opfindelsen anvendelsen af en kombination af aktiveret protein C og et eller flere
I DK 175704 B1 I
I 4 I
thrombolytiske midler til fremstilling eller præparation af I
et medikament til anvendelse ved en behandling af akut arte- I
riel thrombotisk okklusion, thromboemboli eller stenose i I
coronare, cerebrale eller perifere arterier eller i vaskulære I
5 implantater, eller til inhibering af arteriel blodpladeaf- I
sætning. I
I et yderligere aspekt angår opfindelsen en frem- I
gangsmåde til fremstilling af et farmaceutisk præparat ifølge I
H opfindelsen eller aktiveret protein C til en anvendelse I
10 ifølge opfindelsen, hvilken fremgangsmåde er karakteriseret I
ved, at det aktiverede protein C opnås ved: I
(a) oprensning af protein C fra en kilde indeholdende I
I protein C ved anvendelse af en immunoaffinitetssøjle, I
I °g i
15 (b) aktivering af det rensede protein C ved anvendelse af I
immobiliseret thrombin. I
H Foretrukne træk og udførelsesformer for opfindelsen I
er beskrevet i underkravene 3-12, 14, 16-22 og 24-31. I
En mere fuldstændig forståelse af den foreliggende I
I 20 opfindelse og mange af de fordele, som følger deraf, vil I
I let fås, idet opfindelsen bliver lettere forståelig under I
H henvisning til den følgende detaljerede beskrivelse i forbin- I
I delse med de medfølgende tegninger, hvori alle tegninger I
refererer til virkningerne af infusion af APC alene eller I
I 2 5 APC og et thrombolytisk middel i bavianer, anvendt til en I
arteriel thrombosemodel: I
I På tegningen viser figurerne la-3a virkningen af I
I infusioner af APC i lav dosis på størkning af blod, målt
I ved anvendelse af aktiveret partiel thromboplastintidsbestem- I
I 30 melse (APTTs) I
I Figurerne 4a og 5a viser virkningen af infusioner af I
I APC i høj dosis på APTTs. I
I Figur 6a og 7a viser virkningen af infusioner af en H
I kombination af APC og t-PA på APTTs. I
I 35 Figurerne lb-5b viser virkningen af APC og figurerne
I 6b og 7b af APC plus t-PA på blodgennemstrømning og blød- I
DK 175704 B1 5 ningstid.
Figurerne lc-5c viser virkningen af APC-infusion eller APC- plus t-PA-infusion (figurerne 6c og 7c) på blod-pladeaflejring (dvs. thrombedannelse) i et "Dacon"-implantat 5 ud fra analyse af data fra radioaktiv billeddannelse af radiomærkede blodplader.
I fig. 8 er vist virkningen af t-PA infusion på blod-pladeaflejring (dvs. thrombedannelse) i en "Dacron"-implantation ud fra analyse af data fra billeddannelse ved radio-10 aktiv stråling fra radiomærkede blodplader.
Thrombose-modelien.
Man har undersøgt og karakteriseret en arteriel throm-bosemodel ved tidligere forsøg (Hanson & Harker, J. Clin. Invest., 75, 1591-1599 (1985); Hanson & Harker, Thromb.
15 Haemostas. , 53, 423-427 (1985); Hanson et al., Arteriosclerosis, 5, 595-603 (1985)). Denne model er anvendelig til bedømmelse af virkningen af lægemidler på arteriel thrombedannelse. Han-bavianer, der vejer mellem 10 og 12 kg, kureres for orm, og observeres i mere end 4 0 dage i et dyreanlæg 20 forud for forsøgene. Permanente arteriovenøse anastomosaer etableres mellem lårarterien og -venen ved anvendelse af "Silastic"-rør med en indre diameter på 3 mm. Senere indskud af 5 cm lange vaskulære "Dacron"-implantater med en indre diameter på 4 mm tjener som thrombogen overflade, idet der 25 induceres kontinuert blodplade-fibrin-thrombedannelse, indtil I der sker en tiltagende okklusion af implantatet til tiden I 70 ± 20 minutter. Der fås forsøgsresultater ved anvendelse af ved gensplejsning fremstillet APC i bavianer i denne arterielle thrombosemodel i bavianer, som tyder på lignende 30 resultaterne for det plasma-deriverede APC.
Indgift af APC og t-PA.
Alle bavianer gennemgår mindst et kontrolforsøg forud for APC-indgift. APC indgives ved at injicere fra en fjerdedel til en tredjedel af den samlede PC-dosis som en bolus, 35 og de resterende fra tre fjerdedele til to tredjedele af dosis som en kontinuert infusion i en time. Indskuddet af
I DK 175704 B1 I
I 6 I
transplantatet og bonusinjektionen foretages ved tiden 0, I
og APC indgives ved det proksimale sted for "Silastic"-ana- I
I stomosen. Forsøgene opdeles i tre grupper. "Lavdosis"-APC-
I gruppen får i alt fra 2,0-3,4 mg, "højdosis" APC-gruppen får I
5 i alt 11 mg, og kombinationsgruppen får i alt 2,1 mg APC I
plus i alt 1,3 mg t-PA. I
Fremstilling af APC. I
Humant plasma prothrombinkomplekskoncentrat (Immuno I
I AG, Wien, Østrig) er kilden til protein C. Der fremstilles I
10 et monoklonalt antistof, rettet mod PC'ets lette kæde (med I
H betegnelsen C3), og det kobles til cyanbromid-aktiveret I
H "Sepharose 4B" (Pharmacia, Uppsala, Sverige), og prothrom- I
H binkomplekskoncentratet, fortyndet i en puffer (0,02 M/l I
I Tris, 0,002 M/l EDTA; 0,002 M/l benzamidin; 0,1 M/l NaCl, I
I 15 0,075 mM/1 pAPMSF, 0,02% Na-azid, 0,02% Tween 20, pH-værdi I
I =7,4), påføres på en søjle. PC elueres. mwed 2 M thiocyanat I
I og dialyseres mod tris-pufret saltvand (0,01 M tris pr. I
liter, 0,14 M natriumchlorid pr. liter, pH-værdi = 7,4). I
Renset PC aktiveres ved anvendelse af thrombin-"Sepharose"- I
20 perler som beskrevet i Marlar et al., Blood, 59, 1067-1072 I
I (1982) . I
Det rensede APC ses på SDS-page som to bånd, og der I
detekteres ikke nogen signifikant kontaminering (a 5%) med I
andre proteiner. Ved nogle præparater separeres de spor-
H 25 mængder af thrombin, som verificeres ved størkningsbestem- I
I melse, ved at anvende enten Bio-Rex 70 absorption eller I
I hurtig proteinvæskechromatografi ("Fast Protein Liquid Chro- I
I matography", FPLC) på en "mono-Q"-søjle (Pharmacia, Uppsala, H
I Sverige) . Aktiviteten af det rensede APC måles ved aktiverede I
I 30 partielle thromboplastin størkningstidsbestemmelser (APTT) I
(Marlar et al., Blood, 59, 1067-1072 (1982), som måler anti- I
koagulantaktivitet, og ved chromogene substratbestemmelser, I
og resultaterne sammenlignes med aktiviteten af et på forhånd I
I renset APC-præparat og med aktiviteten af APC, dannet ved I
I 35 at sætte PC-aktivatoren, "Protac" (American Diagnostics,
I Greenwich, CT, USA), til normalt human plasma. I
DK 175704 B1 7
Amidolytiske og antikoagulant-bestemmelser af renset APC.
Der sættes forskellige mængder (fra 0,5 til 5 mikro-liter APC-opløsning eller renset APC-referenceopløsning 5 (0,5 mg/ml)) til 210 mikroliter puffer indeholdende 0,01 M
tris-HCl, 0,14 M NaCl, 1% ovalumbin, 0,02% Na-azid, 0,05%
Tween-80, pH-værdi = 8,0, og prøverne anbringes i mikrotiter-pladebrønde (Corning, Dynatech-Immulon eller Costar). Efter tilsætning af 20 mikroliter chromogent substrat S-2401 (4,6 10 mM) , aflæses ændringen i prøvens absorbans ved anvendelse af en ELISA-pladeaflæser ved stuetemperatur. Den amidolytiske aktivitet af APC bestemmes ved at sammenligne de observerede værdier med referenceværdierne. Den an ti ko agu lerende virkning bestemmes ved anvendelse af APTT-analyse. Ved denne analyse 15 fremstilles fortyndinger af normalt humant plasma (nhp) ved anvendelse af plasma uden protein C (pcdp) som fortyndingsmiddel. 100 Mikroliter af disse blandinger blandes med 100 mikroliter af "Protac"-reagenset (American Diagnostica) og 100 mikroliter APTT-ragens (General Diagnostics). Efter 5 20 minutters inkubation tilsættes der 100 mikroliter 50 mM calciumchlorid, og størkningstiden bestemmes. Eftersom nhp indeholder 4,0 mikrogram protein C pr. ml, bestemmes aktiviteten af ukendte APC-opløsninger ved sammenligning med de standardkurver, der fås fortyndinger af nhp, aktiveret med 25 "Protac". Ved nogle forsøg anvendes S-2366 i stedet for S-2401. Den specifikke aktivitet af alle APC præparationer stemmer godt med værdier for APC, baseret på proteinindhold, bestemt ved absorbans ved 280 nanometer ved anvendelse af en extinktionskoefficient på 1,4 pr. cm pr. mg/ml.
30 APC-doserne, beskrevet i bavianforsøgne, viser den funktionelle aktivitet af APC-præparationerne, sammenlignet med normalt human plasma og renset APC som standarder.
De rensede APC-præparationer viser en antikoagulerende virkning på human og bavian-plasmaer ved anvendelse af APTT-35 bestemmelsen, og spalter chromogene oligopeptid-paranitroani-lid-substrater, S-2366 og S-2401 (Kabi, Stockholm, Sverige)
I DK 175704 B1 I
I I
på en måde, der afhænger af kondentrationen. t-PA fra en I
melanomcellelinie fås fra Dr. Desire Collen (Leuven, Bel- H
gien). I
Undersøgelser til påvisning af de antithrombotiske I
5 virkninger af APC ved bakteriel thrombose. I
H Blodgennemstrømning i anastomosen. I
Blodgennemstrømningen måles ved anvendelse af en H
I Doppler strømningsmåler, tilpasset rundt om det distale I
I segment af "Silastic"-røret. Værdierne angives i ml/min. og I
. 10 ligger i et interval fra 100-200 ml/min (svarende til en I
I hastighed fra 13,3 til 26,5 cm/sek.) under forudsætning af I
arterielle strømningsbetingelser. Strømningsværdierne regi- H
I streres med regelmæssige mellemrum under forsøgene. Metoden H
I er beskrevet i Hanson & Harker et al., Arteriosclerosis, 5, I
I 15 595-603 (1985) . I
I Blodpladeaflej ring i "Dacron"-implantatet. H
I Aflejringen af 111In-mærkede blodplader detekteres I
I ved billeder af implantatet, taget med scintillationskamera. I
I Blodplademærkningsmetoderne og dataanalysen er den samme H
20 som beskrevet i Hanson & Harker, Thromb. Haemostas., 53, H
I 423-427 (1985), idet den eneste ændring er, at ligningen I
I for antallet af blodplader i implantatet forenkles som føl- I
I ger: I
cmp-implantat X blodpladeantal/ml H
25 ---
I cmp/ml af fuldblod H
I Varigheden af billeddannelsen udstrækkes ligeledes I
I til to timer fra initieringstidspunktet for implantatet og H
I 30 APC-bolus'en til tiden nul i APC-forsøgene. Eftersom blodpla- I
I deakkumulation sædvanligvis når et plateau i løbet af en time H
I i kontrolforsøg, overskrides denne éntimesperiode ikke med H
I hensyn til billeddannelse af inhiberingen af blodpladeaflej -
I ring. Inhibering af blodpladeaflejring i behandlede dyr I
3 5 udtrykkes som procent af det samlede antal blodplader, af lej- I
I ret i kontrolforsøgene, til tiderne 30 og 60 minutter. Lig- I
I ningerne til beregning af inhibering er vist i tabel I. H
DK 175704 B1 9
Eftersom blodpladeaflejring afhænger af blodpladeantal' (Har-ker & Hanson, Thromb. Haemostas., 53, 423-427 {1985), fore tages korrektion af inhibering af blodpladeaflej ring ved anvendelse af den ligning, der er angivet i tabel I.
5 Blødningstider.
Standardiserede blødningstider udføres på den raserede inderside af underarmen forud for og under forsøget som-beskrevet i Malpass et al., Blood, 57, 736-740 (1981) med to indsnit, som hver er 5 mm lange og 1 mm dybe, med et 10 sphygmomanometer-tryk på 40 mm Hg.
Undersøgelser af antikoagulerende virkninger og af in vivo plasmaniveauer af APC.
Antikoagulerende virkning af APC-infusion måles ved at udføre APTT-bestemmelser med regelmæssige mellemrum fra 15 arterieblod optaget i natriumcitrat. Undersøgelsen sker inden for fra 5 til 10 minutter fra prøveudtagning for at minimere in vitro inhiberingen af APC med plasma protein C inhibitor(er). Til bestemmelse af kredsløbs APC-niveauerne udvikles der en chromogen amidolytisk analyse. ELISA mikro-20 titerplader (Dynatech-Immunion eller Costar) overtrækkes med det anti-protein-C-monoklonale antistof, C3, som ikke påvirker den amidolytiske aktivitet af enzymet signifikant.
Blod optages i 3,8% citrat, 4,6% benzamidin-opløsning i forholdet 9:1, og det plasma, der fås efter øjeblikkelig 25 centrifugering, holdes ved -80°C, indtil det undersøges. 10 Mikroliter af denne plasmaprøve fortyndes til 160-200 mikro-liter med tris-pufret saltvand indeholdende 1% BSA som bærer og 0,36% benzamidin som enzyminhibitor og inkuberes i 1 time ved 37°C i de antistofovertrukne brønde. Opløsningen 30 fjernes, og brøndene vaskes til fjernelse af ubundne bestanddele og benzamidinet. Derefter tilsættes et homogent substrat, enten S-2366 ekller S-2401, og spaltningshastigheden af substratet måles spektrofotometrisk. Under anvendelse af standard APC-fortyndelser beregnes APC-koncentrationerne 35 i plasmaprøverne ud fra kalibreringskurven.
Resultater, som påviser, at APC er antithrombotisk
DK 175704 B1 I
I I
under arterielle strømningsbetingelser. I
I fig. ia-3a er vist APTT-varigheden i "lavdosis"- I
H forsøgene (åbne cirkler) . En dosis på i alt 2,0-3,4 mg human I
H APC næsten fordobler APTT-værdierne i gennemsnit. Efter I
5 afslutning af APC-infusionen (lodrette pil) falder APTT- I
værdierne med stigende takt, og det målte APC-niveau, baseret I
på amidolytisk aktivitet, falder (fuldt optrukne linie), I
hvilket tyder på en kredsløbshalveringstid på 12-16 minutter. I
I fig. 4a og 5a er vist virkningen af "højdosis"-APC på I
10 APTTs. Indgift af 11 mg APC resulterer i en 3-4 gange så I
lang varighed i APTT i begge forsøg. APTT-ændringsmønstret I
og det målte APC-niveau efter afslutning af infusionen viser I
de samme halveringstidsværdier for APC (ca. 12 minutter) I
for disse højere doser af APC. En kombination af 2,1 mg I
15 APC og 1,3 mg t-PA har den samme virkning på APTTs som "lav- I
dosis"-APC har alene (fig. 6a og 7a). APTT-Værdierne er i I
intet af forsøgene faldet til startværdien (ved tiden 0 I
minutter) ved afslutningen af observationen (ved tiden 120 I
minutter). I
H 20 De samme figurer (fig. la-7a) viser ændringerne i I
APC-niveauerne, målt ved hjælp af den chromogene analyse, I
beskrevet ovenfor (de udfyldte cirkler). Der måles en total I
I koncentration fra 0,38 til 0,70 mikrogram APC-plasma pr. ml I
i "lavdosis"-forsøgene (fig. la-3a), 0,94 til 1,64 mikro- I
25 gram/ml i "højdosis"-forsøgene (fig. 4a og 5a) og fra 0,30 I
til 0,90 mikrogram/ml i kombinationsforsøgene (fig. 6a og I
H 7a). Kredsløbshalveringstiden for APC i bavianerne, bestemt I
ved amidolytisk aktivitetsbestemmelsen, er den samme som I
I den, der bestemmes ud fra APTT-bestemmelserne, uden hensyn I
30 til den samlede dosis af APC-enzymet. In vivo kredsløbs- I
I APC-niveauerne vender ikke fuldstændig tilbage til startvær- I
I dierne i løbet af to timer. Forskellen i APC-doser på fem I
I gange i "højdosis"-forsøgene, sammenlignet med "lavdosis"- I
I forsøgene, resulterer ikke i fem gange højere kredsløbs I
I 35 APC-niveauer, hvilket tyder på en effektiv clearence eller I
I temporær opbevaringsmekanisme eller receptorformidlet regu- I
DK 175704 B1 11 lering af APC.
Ved seks af de syv forsøg forbliver blødningstiderne inden for normalintervallet (fig. Ib og 3b-7b i de lodrette segmenter) med en let gennemsnitlig forøgelse. I et af "lav-5 dosis"- forsøgene er blødningstiderne forlængede og unormale (fig. 2b) både forud for og under og efter forsøget. Eftersom blødningstiden var unormalt lang i dette dyr forud for APC-infusionen, skyldes den lange blødningstid, der iagttages under APC-infusion, ikke APC. Disse resultater 10 tyder på, at APC i kredsløbet ved de anvendte doser ikke signifikant ændrer den hæmostatiske blodpladefunktion, målt ved standardiseret blødningstidsteknik. Der iagttages ikke nogle suffusioner, hæmatomer eller genblødning ved læsions-j steder på vævet (dvs. symanchetter), hvilket er typisk ved 15 højere doser af t-PA.
Blodgennemstrømningen opretholdes uden mindskning i forsøgene under APC-indgift (fig. lb-7b, udfyldte cirkler) i modsætning til kontrolforsøg for de samme dyr, hvor der regelmæssigt sker okklusion. Seks af de syv implantater 20 forbliver åbne i hele observationsperioden med god arteriegennemstrømning. I en af APC-t-PA-forsøgene (fig. 6b) svigter "Dacron"-implantatet til tiden 115 minutter. I fire af de ni kontrolforsøg okkluderer implantaterne inden for en time, og disse implantater svigter til tiden 70 + 20 minutter, 25 når der ikke er noget effektivt antithrombotisk middel i kredsløbet. Blodgennemstrømningsændringerne i de to kontrolforsøg er vist i fig. 3b og 7b. Fig. 3b viser strømningshastighederne i den anden kontrol, når implantatet forbliver åbent i op til 1 time (det første implantat blev okkluderet) .
30 I fig. 7 kan man se hurtig fremadskridende okklusion af kontrolimplantatet. Disse data viser, at APC alene eller i kombination med t-PA virker antithrombotisk under arteriegennemstrømningsbetingelser. "Høj dosis"-APC-forsøgene viser langvarige antithrombotiske virkninger, eftersom gennemstrøm-35 ningen ikke ændrer sig signifikant i to timer.
I fig. lc-7c er vist resultaterne af analyser af
I DK 175704 B1 I
I 12 I
I data vedrørende radioaktiv billeddannelse. Værdierne udtryk- H
ker det samlede antal blodplader, aflejret i "Dacron"-implan- . I
I tatet i maksimalt en time ved kontrolforsøget og to timer I
I ved APC-forsøgene. Udfyldte cirkler (de fuldt optrukne li- I
5 nier) viser antallet af aflej rede blodplader ved bakteriel H
thrombedannelse, når APC indgives ved infusion, medens åbne H
cirkler (----) viser resultaterne for kontrolforsøg, som er H
foretaget i de samme dyr. Man kan se den typiske S-formede H
I kurve i kontrolforsøgene som beskrevet i Hanson & Harker, I
I 10 Thromb. Haemostas., 423-427 (1985). Aflejringen af blodplader I
i implantatet inhiberes signifikant i hvert APC- eller APC- H
I t-PA-forsøg, sammenlignet med kontrolforsøgene. Inhiberings- H
H graden er angivet i procent i tabel I. De korrigerede værdier H
I for inhibering af blodpladeaflejring (I2- tabel I) er hen- H
I 15 holdsvis 34%, 52% og 42% i "lavdosis"-forsøgene til tiden I
I 30 minutter (gennemsnitsværdi 43%, jvf. fig. lc-3c) . Ved I
I "højdosis"-forsøgene er værdierne 74% og 64% ved tiden 30
I minutter (gennemsnit: 69%) og 72% og 83% ved tiden 60 minut- H
I ter (gennemsnit: 78%, jvf. fig. 4c og 5c) og ved APC-t-PA- I
20 forsøgene 53% og 36% ved tiden 30 minutter (gennemsnit: H
45%, jvf. fig. 6c og 7c). Der ses en langvarig inhibering af H
blodpladeaflej ring i disse "højdosis" undersøgelser efter I
I afslutning af APC-infusion. I fig.' 8 er vist resultaterne
I af nogle tidligere undersøgelser med t-PA i den samme for- H
I 25 søgsmodel. 1 mg t-PA (0,1 mg/kg/time)-infusion har i disse H
I forsøg en antiblodplade-aggregerende virkning, som ligger. H
I derimellem. H
I Ved disse resultater påvises det, at human APC inhi-
I berer arteriel thrombedannelse på en måde, der afhænger af H
I 30 dosis, og at kombination af APC og t-PA inhiberer arteriel H
I thrombedannelse. Dette viser, at APC-infusion kunne mindske
I den antithrombotiske dosis af t-PA. Disse virkninger af APC I
I opnås uden en signifikant forlængelse af blødningstiden og H
uden risici for blødning. H
I 35 Fordel. I
I Human APC-infusion alene eller i kombination med et H
DK 175704 B1 13 thrombolytisk middel <t-PA) kan anvendes som et terapeutisk middel til mennesker med arteriel thrombose. Resultaterne af undersøgelserne viser, at APC er et særdeles, kraftigt anti-thrombotisk middel under arterielle gennemstrømningsbetingel-5 ser ved plasmaniveauer fra 0,24 til 1,6 mikrogram/ml.
Ud fra forsøgene kan man konkludere, at APC alene eller APC i kombination med et thrombolytisk middel er et påfaldende effektivt antithrombotisk middel mod kompleks thrombedannelse under arterielle gennemstrømningsbetingelser.
10 APC Alene eller en kombination af APC og et thrombo lytisk middel, såsom t-PA, inhiberer kraftigt deltagelsen af både blodplader og fibrin dannelse ved akut arteriel thrombose af en kompleks type, en proces, som ikke reagerer på heparin eller gængse tilgængelig antiblodplade-aggregerende 15 lægemidler, når de anvendes alene eller i kombination. Eftersom APC er et fysiologisk materiale, har indgift deraf stærke antithrombotiske virkninger uden at forårsage signifikant svækkelse af primær hæmostase (målt ved blødningst ids-prøver) eller åbenbar toksicitet.
20 Anvendelse.
Behandling under anvendelse af APC alene eller APC i kombination med et thrombolytisk middel er anvendelig til vaskulære forstyrrelser, som er forbundet med arteriel thrombose .
25 Nogle eksempler på arteriel thrombose, hvor APC alene eller i kombination med et thrombolytisk middel er anvendeligt, omfatter de følgende kliniske rammer.
1. Akut arteriel thrombotisk okklusion omfattende coronare, cerebrale eller perifere arterier.
30 2. Akut thrombotisk akklusion eller restenose efter angioplastik.
3. Reokklusion eller restenose efter thrombolytisk behandling. Thrombolytiske midler, såsom t-PA, redder iskæ-misk væv, når det anvendes inden for nogle timer efter akut 35 hjerteattak eller slagtilfælde, ved at genetablere blodgennemstrømning i den okkluderede arterie. For nærværende ople-
I DK 175704 B1 I
I
ver mellem en fjerdedel og en tredjedel af de patienter, ; B
som gennemgår en thrombolytisk reperfusion af okkluderede fl hjertearterier med godt resultat, senere reokklusion, efter I fl at t-PA-infusionen er afbrudt. Denne komplikation sker på fl
5 trods af heparinbehandling med fuld dosis. APC vil have I
fl større virkning end heparin til hindring af reokklusion. I
fl 4. Okklusion af små og store vaskulære implantater. fl
Små vaskulære implantater, dvs. 3-/m i diameter, har en høj I
fl hyppighed af thrombotisk okklusion. APC alene eller i kom- I
10 bination med et thrombolytisk middel er anvendeligt til I
forebyggelse af okklusion. fl
5. Hæmodialyse. De prostetiske overflader og strøm- I
ningsudformningen for alle hæmodialysatorer er thrombogene. I
fl Heparin indgives gængs ved infusion under dialyse. Imidlertid fl 15 er heparin kun delvist effektiv, og begrænser derved genan- fl
vendeisen af dialysatorerne. Heparin har ligeledes et antal I
problematiske bivirkninger og komplikationer. fl fl 6. Hjerte-lunge-by-pass-kirurgi. For at hindre throm- fl
B bedannelse i Oxygenatoren og pumpeapparatet anvendes heparin B
I 20 ofte. Imidlertid inhiberer det ikke blodpladeaktivering og B
B den resulterende transciente blodpladedysfunktion, hvorved B
B der tilvejebringes en prædisposition for postoperative blød- B
B ningsproblemer. fl
fl 7. Hjælpeudstyr til venstre hjertekammer. Denne pumpe- B
fl 25 protese er særdeles thrombogen og resulterer i livstruende fl
fl thromboemboliske begivenheder - komplikationer, som kun B
fl delvis mindskes ved gængse antikoagulerende midler (heparin- B
I eller coumarinlægemidler). I
B 8. Hjælpeudstyr til helt kunstigt hjerte og venstre B
B 30 hjertekammer. B
B 9. Andre arterielle thromboser. APC er anvendelig B
B til arteriel thrombose eller thromboemboli, hvor gængse B
B terapeutiske metoder enten er kontraindicerede eller ikke fl
B virkningsfulde. Eksempelvis er APC anvendeligt til behandling B
B 35 af akut præ- eller postkapillær okklusion, herunder trans- B
B plantationer, nethindethrombose eller mikrothrombotisk nekro fl * 15 DK 175704 B1 se af hvilke som helst organindviklende infektioner, tumorer eller coumarinbehandling.
Alt i alt er humant APC, et naturligt forekommende fysiologisk antithrombotisk human protein, overlegen i for-5 hold til andre tilgængelige antithrornbotiske lægemidler, udtrykt ved blødningstendens (heparin, thrombolytiske lægemidler, antiblodplade-aggregerende lægemidler), toksicitet (nogle antiblodplade-aggregerende lægemidler) antigenitet (streptokinase), clearencehastighed (heparin, antiblodplade-10 aggregerende lægemidler), teratogenitet (coumarinderivater), generelle bivirkninger (antiblodpladeaggregerende lægemidler) mangel på øjeblikkelig virkning (antiblodpladeaggregerende lægemidler, coumarinderivater), allergiske reaktioner (antiblodplade-aggregerende lægemidler, streptokinase, heparin) 15 og hypotensiv virkning (prostacyclin).
APC Kombineret med t-PA eller et andet thrombolytisk middel forbedrer den antithrornbotiske virkning af et thrombolytisk middel alene. Således vil APC-terapi reducere t-PA-doserne eller doserne af andre thrombolytiske midler, der 20 kræves til terapeutiske behandling af thrombose, og derved undgås komplikationerne ved høje doser af thrombolytiske midler.
Den ovennævnte beskrivelse giver detaljer med hensyn til den måde, på hvilken man kan fremstille og anvende udfø-25 relsesformerne ifølge den foreliggende opfindelse.
I DK 175704 B1 I
I i I
i
B
B
11 ' u o 4**i og m to o- · O'
B H) VO i in I ΙΛ O' CO O* VØ · Ί) B
B B
B B
B cn B
* ·η B
Bi σ> μ B
CM-
*h Oo ^ γμ (N n *r o\ n vo h B
H & ro mto^rsr r- \o «> in η ^ B
B B
B
JZ B
B
^ M U - B
B S 0)0 IHI H CO O m Hi Η B
B < M <D »ΙΛ» ΙΛ O' CO 00 O' ! O' B
I I
| - I
\a n H „-, ^o r'røoin oh« co h ·
M j Ρηνβ^ιηιη æ r- r* in <f in H
Η I
H
Η H
H h ' m -a· cn tn in o to r~ ω H
bu 0) o - - - c - - C · c
"! JJ T)vd lt vo id O oro U ίο i O
§ 2 2 I
I I
. H CT> ' H CN O Π (N Η Η ^B
o. WO-.- O
^B enen J m m tn η ο tji lo r o ^B
I «! S' M * i H * Ή ^ X — a> er ·« > h nr' r' — · ja S α m o . <
M ni X 0) rHujini in η n i U ^B
Η n U TJ O IHI <N cn i Gi · ·“ 4) Hi M ^
D ΗI aJ O
„ ·η α c O
H u 41 Ό O Gi ^B
m H 0 ' n O O ΙΛ li tl> f~ — ΰ1 HH O''' ·
H .¾ < Λ ncriovo h -o· -a· cn X ^B
B Li H H H H
B .11 ro — B
i? υ
"Jo Q U
u_i η Οι Οι
^B ^ V-l X rH ICC
n, 4> i 0) in m r in o o o Qiiii
H i a;O Μ 0) Ό cn tf n n -a* con Gi ^B
u (0 0>ΟΐΌ<Ν<3·η Hn n^· '-'<U ^B
π, Η T3 Rj -H
2’ α nS ij £ H
.5 V H
M O t—j Qi s h a. -o S Λ o
" · H CN
f-, H U ja H H
-5 « Dl 0
/ajJH^LnLnra ησι οι h -0) H
c n u f h b r'CN n m οΌ H
rtJjJGq’^n h ^'d* octttH H
CO Η H <D
S « 0.Ό x Ό m oh· —~ H Qi
Cl AD
U U Q 0
Di Di Di u H
< <D> ^(UJQ· i < H JJ Q ·η Η Η MM! α dl nj · -H -ri m HU · * CD U) 0 Η H C · DO 0 H — < <3
CO in n o Ohid O, un cn II ^B
>000·ΗΗΗ HO HH II ^B
D CO l I i 0 I I Oli h ^B
>,ΗΓ-«)ΐί>χ!\£ΐΓ~ ΟιΓ-Γ- QO ·
Q c CO m CO : 00 00 < 00 CD « D 3i ^B
Claims (31)
1. Farmaceutisk præparat til inhibering af akut arteriel thrombotisk okklusion, thromboemboli eller stenose i 5 coronare, cerebrale eller perifere arterier eller i vas-kulære implantater eller til inhibering af arteriel blodpla-deafsætning, kendetegnet ved, at det omfatter aktiveret protein C med en renhed på mindst 95% i en farmaceutisk acceptabel bærer.
2. Farmaceutisk præparat til inhibering af akut arte riel thrombotisk okklusion, tromboemboli eller stenose i coronare, cerebrale eller perifere arterier eller i vaskulære implantater eller til inhibering af arteriel blodpladeafsæt -ning, kendetegnet ved, at det omfatter" aktiveret 15 protein C i kombination med et thrombolytisk middel eller en kombination af thrombolytiske midler.
3. Farmaceutisk præparat ifølge krav 1, omfattende tilstrækkeligt med aktiveret protein C til at give en dosis af aktiveret protein C på 0,2 til 1,1 mg/kg-time.
4. Farmaceutisk præparat ifølge krav 2, omfattende tilstrækkeligt med aktiveret protein C til at give en dosis af aktiveret protein C på 0,07 til 1,1 mg/kg-time.
5. Farmaceutisk præparat ifølge krav 3 eller 4, omfattende tilstrækkeligt med aktiveret protein C til at give 25 et plasmaniveau af aktiveret protein C i området fra 0,1 til 1,6 pg/ml.
6. Farmaceutisk præparat ifølge krav 2, 4 eller 5, kendetegnet ved, at det aktiverede protein C er mindst 95% rent. 30
'7. Farmaceutisk præparat ifølge ethvert af kravene 1-6, kendetegnet ved, at det aktiverede protein C er plasma-deriveret.
8. Farmaceutisk præparat ifølge ethvert af kravene 1-6, kendetegnet ved, at det aktiverede protein 35. er fremstillet ved en rekombinant teknik.
9. Farmaceutisk præparat ifølge krav 3 eller 4, om- I DK 175704 B1 I I I fattende et thrombolytisk middel eller en kombination af I I thrombolytiske midler. I
10. Farmaceutisk præparat ifølge ethvert af de fore- I gående krav, omfattende et eller flere thrombolytiske midler' I 5 valgt blandt vævsplasminogenaktivator, urokinase, pro-uro- I kinase, streptokinase, en acyleret form af plasminogen, I I plasmin, og acyleret streptokinase-plasminogen-kompleks. I
11. Farmaceutisk præparat ifølge krav 10, hvor det I thrombolytiske middel er vævsplasminogenaktivator, omfattende I 10 en mængde, som giver en dosis på 0,1 til 0,4 mg/kg-time. I
12. Farmaceutisk præparat ifølge krav 7, k e n d e- I tegnet ved, at vævsplasminogenaktivatoren udgør en I mængde, som giver en dosis på ca. 0,13 mg/kg-time. I
13. Anvendelse af aktiveret protein C til fremstilling I 15 eller præparation af et medikament til anvendelse ved en I behandling af akut arteriel thrombotisk okklusion, thrombo- I emboli eller stenose i coronare, cerebrale eller perifere I I arterier eller i vaskulære implantater eller til inhibering I I af arteriel blodpladeafsætning. I I 20
14. Anvendelse ifølge krav 13,kendetegnet I ved, at behandlingen omfatter tilvejebringelse af en dosis I I af aktiveret protein C på 0,2 til 1,1 mg/kg-time hos en I patient. I
15. Anvendelse af en kombination af aktiveret protein I I 25 C og et eller flere thrombolytiske midler til fremstilling I H eller præparation af et medikament til anvendelse ved behand- I I ling af akut arteriel thrombotisk okklusion, thromboemboli I I eller stenose i coronare, cerebrale eller perifere arterier I I eller i vaskulære implantater eller til inhibering af arte- I 30 riel blodpladeafsætning. I
16. Anvendelse ifølge krav 15,kendetegnet I ved, at behandlingen omfatter tilvejebringelse af en dosis I I af aktiveret protein C på 0,07 til 1,1 mg/kg-time hos en I I patient. I 35 17. Anvendelse ifølge ethvert af kravene 13-16, I I kendetegnet ved, at behandlingen omfatter til- I DK 175704 B1 19 vejebringelse af et plasmaniveau af aktiveret protein C i område fra 0,1 til 1,6 /^g/ml.
17. Anvendelse ifølge krav 15, kendetegnet ved, at det eller de thrombolytiske midler er valgt blandt 5 vævsplasminogenaktivator, urokinase, pro-urokinase, streptokinase, en acyleret form af plasminogen, plasmin, og acy-leret streptokinase-plasminogen-kompleks.
18. Anvendelse ifølge krav 17, kendetegnet ved, at det thrombolytiske middel er vævspiasminogenaktiva- 10 tor, og metoden omfatter tilvejebringelse af en dosis på 0,1 til 0,4, fortrinsvis ca. 0,13 mg/kg-time af vævsplas minogenaktivator hos patienten.
19. Anvendelse ifølge ethvert af kravene 13-18, kendetegnet ved, at det aktiverede protein C er 15 plasma-deriveret eller fremstillet ved en rekombinant teknik.
20. Anvendelse ifølge ethvert af kravene 13-18, kendetegnet ved, at det aktiverede protein C eller kombinationen af aktiveret protein C og et eller flere thrombolytiske midler er i en farmaceutisk acceptabel bærer.
21. Anvendelse ifølge ethvert af kravene 13-20, kendetegnet ved, at det aktiverede protein C er isoleret og renset.
22. Anvendelse ifølge krav 21, kendetegnet ved, at det aktiverede protein C er mindst 95% rent. 25
.23. Fremgangsmåde til fremstilling af aktiveret pro tein C til en anvendelse ifølge krav 13 eller et farmaceutisk præparat ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det aktiverede protein C opnås ved: (a) oprensning af protein C fra en kilde indeholdende 30 protein C ved anvendelse af en immunoaffinitetssøjle, og (b) aktivering af det rensede protein C ved anvendelse af immobiliseret thrombin.
24. Fremgangsmåde ifølge krav 23, kendete g- 35 net ved, at protein C er deriveret fra plasma eller fremstillet ved en rekombinant teknik. I DK 175704 B1 I I I
25. Fremgangsmåde ifølge krav 23 eller 24, k e η- I dete, gnet ved, at kilden til protein C er en human I plasmafraktion. I
26. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 23-25, I 5 kendetegnet ved, at kilden til protein C er et I plasma-prothrombinkompleks-koncentrat. I
27. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 23-26, I H kendetegnet ved, at der til immunoaffinitetssøjlen I er bundet et antistof, som binder til den lette kæde af I 10 protein C. I
28. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 23-27, I kendetegnet ved, at eventuelt tilbageværende I thrombin fjernes fra det aktiverede protein C ved anvendelse I af Bio-Rex 70-absorption eller hurtig protein-væskechromato- I I . 15 grafi. I
29. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 23-28, I kendetegnet ved, at et thrombolytisk middel eller I en kombination af thrombolytiske midler blandes med det I aktiverede protein C og bæreren. I I 20
30. Fremgangsmåde ifølge krav 29,kendeteg- I net ved, at det thrombolytiske middel er vævsplasminogen- I aktivator, urokinase, pro-urokinase, streptokinase, en acy- I leret form af plasminogen, plasmin, eller acyleret strep- tokinase-plasminogen-kompleks. I I 25
31. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 23-30, I I kendetegnet ved, at der produceres aktiveret I protein C, som isoleres og renses til mindst 95% renhed. I
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US12170287 | 1987-11-17 | ||
US07/121,702 US5084274A (en) | 1987-11-17 | 1987-11-17 | Inhibition of arterial thrombotic occlusion or thromboembolism |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DK640088D0 DK640088D0 (da) | 1988-11-16 |
DK640088A DK640088A (da) | 1989-05-18 |
DK175704B1 true DK175704B1 (da) | 2005-01-24 |
Family
ID=22398288
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK198806400A DK175704B1 (da) | 1987-11-17 | 1988-11-16 | Inhibering af arteriel thrombotisk okklusion eller thromboenboli |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5084274A (da) |
EP (1) | EP0318201B1 (da) |
JP (1) | JP2766986B2 (da) |
AT (1) | ATE135234T1 (da) |
CA (1) | CA1330036C (da) |
DE (1) | DE3855096T2 (da) |
DK (1) | DK175704B1 (da) |
ES (1) | ES2086301T3 (da) |
FI (1) | FI104790B (da) |
GR (1) | GR3020036T3 (da) |
NO (1) | NO301747B1 (da) |
Families Citing this family (43)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5084274A (en) * | 1987-11-17 | 1992-01-28 | Scripps Clinic And Research Foundation | Inhibition of arterial thrombotic occlusion or thromboembolism |
GB8819607D0 (en) * | 1988-08-17 | 1988-09-21 | Wellcome Found | Novel combination |
US5358932A (en) * | 1989-12-29 | 1994-10-25 | Zymogenetics, Inc. | Hybrid protein C |
WO1991009960A1 (en) * | 1989-12-29 | 1991-07-11 | Zymogenetics, Inc. | Hybrid protein c |
US5571786A (en) * | 1990-08-16 | 1996-11-05 | Immuno Aktiengesellschaft | Use of protein C or the activation peptide of protein C for preparing a pharmaceutical preparation |
FR2671973A1 (fr) * | 1991-01-25 | 1992-07-31 | Fondation Nale Transfusion San | Utilisation de la proteine c activee comme agent anti-agregant plaquettaire. |
ES2082465T3 (es) * | 1991-04-16 | 1996-03-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Unidad farmaceutica de envasado que contiene activadores de plasminogeno para la administracion multiple de bolos. |
AT397615B (de) * | 1991-05-14 | 1994-05-25 | Immuno Ag | Arzneimittel enthaltend protein c |
AT402262B (de) * | 1991-06-20 | 1997-03-25 | Immuno Ag | Arzneimittel enthaltend aktiviertes protein c |
AT395596B (de) * | 1991-06-20 | 1993-01-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung von aktiviertem protein c |
AT402263B (de) * | 1991-06-20 | 1997-03-25 | Immuno Ag | Pharmazeutische präparation enthaltend eine thrombolytisch wirkende substanz |
WO1993009807A1 (en) * | 1991-11-18 | 1993-05-27 | The Scripps Research Institute | Methods of inhibiting thrombosis via elevation of circulating endogenous activated protein c levels |
JPH05271098A (ja) * | 1992-03-26 | 1993-10-19 | Teijin Ltd | 活性化プロテインcを有効成分とする抗血小板剤 |
DE4320294A1 (de) * | 1993-06-18 | 1994-12-22 | Immuno Ag | Verwendung von humanem Protein C zur Verhinderung und Behandlung von Thrombozytenablagerungen |
US5520912A (en) * | 1993-07-02 | 1996-05-28 | Immuno Aktiengesellschaft | Prevention and treatment of ischemic events and reperfusion injury resulting therefrom using lys-plasminogen |
JP3043558B2 (ja) * | 1993-10-29 | 2000-05-22 | 財団法人化学及血清療法研究所 | ヒト活性化プロテインc調製物及びその製法 |
US5510330A (en) * | 1994-03-25 | 1996-04-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Combinations of thrombolytically active proteins and non-heparin anticoagulants, and uses thereof. |
US6143719A (en) * | 1995-06-09 | 2000-11-07 | The Regents Of The University Of Michigan | Bradykinin analogs as selective thrombin inhibitors |
JP4680329B2 (ja) * | 1997-03-24 | 2011-05-11 | カーディオム ファーマ コーポレイション | 血管障害の治療方法 |
US6982249B1 (en) | 1997-04-23 | 2006-01-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Bradykinin analogs as selective inhibitors of cell activation |
CA2293429A1 (en) * | 1997-06-05 | 1998-12-10 | Eli Lilly And Company | Methods for treating thrombotic disorders |
HUP0001237A3 (en) | 1997-10-20 | 2002-01-28 | Lilly Co Eli | Methods for treating vascular disorders |
US6953568B1 (en) * | 1998-08-25 | 2005-10-11 | Oklahoma Medical Research Foundation | Targeting of molecules to large vessel endothelium using EPCR |
AU1723200A (en) | 1998-11-23 | 2000-06-13 | Eli Lilly And Company | Method of treating sickle cell disease and thalassemia |
US7074402B2 (en) | 2000-02-04 | 2006-07-11 | The Scripps Research Institute | Neuroprotective, antithrombotic and anti-inflammatory uses of activated protein C (APC) |
US7204981B2 (en) | 2000-03-28 | 2007-04-17 | Eli Lilly And Company | Methods of treating diseases with activated protein C |
WO2001089558A2 (en) | 2000-05-24 | 2001-11-29 | Eli Lilly And Company | Formulations and use of activated protein c and protein c zymogen for treating hypercoagulable states |
US7759506B2 (en) | 2002-02-25 | 2010-07-20 | Diffusion Pharmaceuticals Llc | Bipolar trans carotenoid salts and their uses |
AU2003265898A1 (en) * | 2002-09-05 | 2004-03-29 | Genentech, Inc. | Infusion catheter having an integrated doppler transducer |
WO2004056309A2 (en) | 2002-12-05 | 2004-07-08 | Socratech L.L.C. | Neuroprotective activity of activated protein c is independent of its anticoagulant activity |
US20070142272A1 (en) * | 2003-01-24 | 2007-06-21 | Zlokovic Berislav V | Neuroprotective activity of activated protein c independent of its anticoagulant activity |
US9192657B2 (en) * | 2003-07-08 | 2015-11-24 | The Scripps Research Institute | Activated protein C variants with normal cytoprotective activity but reduced anticoagulant activity |
EP1651252B1 (en) * | 2003-07-08 | 2014-11-26 | The Scripps Research Institute | Activated protein c variants with normal cytoprotective activity but reduced anticoagulant activity |
EP1773371A4 (en) * | 2004-07-23 | 2009-12-30 | Univ Rochester | ACTIVATED PROTEIN C INHIBITS SIDE EFFECTS OF PLASMINOGEN ACTIVATOR IN THE BRAIN |
EA017982B1 (ru) | 2005-02-24 | 2013-04-30 | ДИФФЬЮЖН ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ ЭлЭлСи | Фармацевтическая композиция на основе транскаротиноидов и способы лечения опухоли |
US7785857B2 (en) * | 2006-08-31 | 2010-08-31 | Saint Louis University | Protein C variant |
WO2008073603A2 (en) * | 2006-10-31 | 2008-06-19 | The Scripps Research Institute | Dosing regimen of activated protein c and variants having reduced anticoagulant activity |
EP2146948A4 (en) | 2007-04-13 | 2010-08-04 | Diffusion Pharmaceuticals Llc | USE OF BIPOLAR TRANS-CAROTINOIDES AS PRE-TREATMENT AND TREATMENT OF PERIPHERAL VASCULAR DISEASE |
US10130689B2 (en) | 2009-06-22 | 2018-11-20 | Diffusion Pharmaceuticals Llc | Diffusion enhancing compounds and their use alone or with thrombolytics |
EP2575487B1 (en) | 2010-06-02 | 2017-10-18 | Diffusion Pharmaceuticals Llc | Oral formulations of bipolar trans carotenoids |
US20150150954A1 (en) | 2012-07-04 | 2015-06-04 | The University Of Sydney | Treatment of inflammatory skin disorders |
AU2014391082B2 (en) | 2014-04-16 | 2020-04-09 | Zz Biotech Llc | Treatment of abnormal cutaneous scarring |
EP3432929A4 (en) | 2016-03-24 | 2019-11-27 | Diffusion Pharmaceuticals LLC | USE OF BIPOLAR TRANSCAROTINOIDS WITH CHEMOTHERAPY AND RADIOTHERAPY FOR THE TREATMENT OF CANCER |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4766075A (en) * | 1982-07-14 | 1988-08-23 | Genentech, Inc. | Human tissue plasminogen activator |
JPS6011427A (ja) * | 1983-06-29 | 1985-01-21 | Green Cross Corp:The | 血栓溶解性蛋白の疾患局所親和性向上方法 |
GB8319538D0 (en) * | 1983-07-20 | 1983-08-24 | Beecham Group Plc | Compounds |
DE3584902D1 (de) * | 1984-02-29 | 1992-01-30 | Asahi Chemical Ind | Waessrige loesung eines darin in erhoehter konzentration aufgeloesten gewebe-plasminogen-aktivators und herstellungsverfahren. |
AU595173B2 (en) * | 1985-01-08 | 1990-03-29 | General Hospital Corporation, The | Method and use for site-specific activation of substances |
US4775624A (en) * | 1985-02-08 | 1988-10-04 | Eli Lilly And Company | Vectors and compounds for expression of human protein C |
ATE93272T1 (de) * | 1985-06-27 | 1993-09-15 | Zymogenetics Inc | Expression von protein c. |
US5084274A (en) * | 1987-11-17 | 1992-01-28 | Scripps Clinic And Research Foundation | Inhibition of arterial thrombotic occlusion or thromboembolism |
US4929602A (en) * | 1987-11-25 | 1990-05-29 | Scripps Clinic And Research Foundation | Method of inhibiting platelet dependent arterial thrombosis |
-
1987
- 1987-11-17 US US07/121,702 patent/US5084274A/en not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-11-15 CA CA000583138A patent/CA1330036C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-16 ES ES88310800T patent/ES2086301T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-16 AT AT88310800T patent/ATE135234T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-11-16 DE DE3855096T patent/DE3855096T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-16 NO NO885109A patent/NO301747B1/no not_active IP Right Cessation
- 1988-11-16 DK DK198806400A patent/DK175704B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-11-16 EP EP88310800A patent/EP0318201B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-17 JP JP63292222A patent/JP2766986B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-17 FI FI885331A patent/FI104790B/fi not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-10-25 US US07/782,817 patent/US5350578A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-05-27 GR GR960401399T patent/GR3020036T3/el unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FI104790B (fi) | 2000-04-14 |
DK640088A (da) | 1989-05-18 |
EP0318201B1 (en) | 1996-03-13 |
NO301747B1 (no) | 1997-12-08 |
DK640088D0 (da) | 1988-11-16 |
ATE135234T1 (de) | 1996-03-15 |
GR3020036T3 (en) | 1996-08-31 |
FI885331A0 (fi) | 1988-11-17 |
FI885331A (fi) | 1989-05-18 |
JPH01238536A (ja) | 1989-09-22 |
NO885109L (no) | 1989-05-18 |
EP0318201A2 (en) | 1989-05-31 |
US5350578A (en) | 1994-09-27 |
ES2086301T3 (es) | 1996-07-01 |
DE3855096T2 (de) | 1996-07-25 |
DE3855096D1 (de) | 1996-04-18 |
EP0318201A3 (en) | 1990-02-07 |
NO885109D0 (no) | 1988-11-16 |
US5084274A (en) | 1992-01-28 |
CA1330036C (en) | 1994-06-07 |
JP2766986B2 (ja) | 1998-06-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DK175704B1 (da) | Inhibering af arteriel thrombotisk okklusion eller thromboenboli | |
Gold et al. | Coronary thrombolysis with recombinant human tissue-type plasminogen activator. | |
Golino et al. | Antithrombotic effects of recombinant human, active site–blocked factor VIIa in a rabbit model of recurrent arterial thrombosis | |
Nilsson et al. | Effect of venous occlusion on coagulation and fibrinolytic components in normal subjects | |
Patel et al. | Quality improvement guidelines for percutaneous management of acute lower-extremity ischemia | |
HU219682B (hu) | Módosított VII faktor | |
JP2008289498A (ja) | 精製されたマルチメラ−ゼ | |
Kelly et al. | Antihemophilic factor inhibitors: Management with prothrombin complex concentrates | |
Vinazzer | Clinical use of antithrombin III concentrates | |
Gitel et al. | The antithrombotic effects of warfarin and heparin following infusions of tissue thromboplastin in rabbits: clinical implications | |
Dosekun et al. | Ancrod in systemic lupus erythematosus with thrombosis: clinical and fibrinolysis effects | |
FI103577B (fi) | Menetelmä, DNA ja mikro-organismi trombolyyttisen aineen valmistamisek si | |
JP5236952B2 (ja) | 改善された特性を有するfxiiiバリアント | |
Moran et al. | The role of thrombolytic therapy in surgical practice | |
WO1993009807A1 (en) | Methods of inhibiting thrombosis via elevation of circulating endogenous activated protein c levels | |
Jeljaszewicz et al. | Intravascular Coagulation and Fibrinolysis by Stapliylocoagiilase. Comparison with Thrombin | |
US9211317B2 (en) | Method of using prourokinase in facilitated percutaneous coronary intervention in patients with acute myocardial infarction | |
EP1067879B1 (en) | Method for inhibiting thrombosis in a patient whose blood is subjected to extracorporeal circulation | |
Bergstein et al. | Tissue plasminogen activator therapy of glomerular thrombi in the Shwartzman reaction | |
Quick | Thromboplastin as a reagent | |
JP3878668B2 (ja) | 血栓性疾患の治療 | |
Dubber et al. | Acquired Hypofibrinogenaemia—‘The Defibrination Syndrome’ A Study of 7 Patients | |
Roudaut et al. | Thrombolytic treatment of acute thrombotic obstruction with disk valve prostheses: experience with 26 cases | |
Aoki et al. | Severe heat stroke associated with high plasma levels of plasminogen activator inhibitor 1 | |
US20020031518A1 (en) | Plasminogen fragment having activity to inhibit tumor metastasis and growth and process for preparing same technical field |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PUP | Patent expired |