NO301747B1

NO301747B1 - Fremgangsmåte for å fremstille aktivert protein C (APC)

Info

Publication number: NO301747B1
Application number: NO885109A
Authority: NO
Inventors: John H Griffin; Andreas Gruber; Stephen R Hanson; Lawrence A Harker
Original assignee: Scripps Clinic Res
Priority date: 1987-11-17
Filing date: 1988-11-16
Publication date: 1997-12-08
Also published as: FI104790B; DK640088A; EP0318201B1; DK640088D0; ATE135234T1; DK175704B1; GR3020036T3; FI885331A0; FI885331A; JPH01238536A; NO885109L; EP0318201A2; US5350578A; ES2086301T3; DE3855096T2; DE3855096D1; EP0318201A3; NO885109D0; US5084274A; CA1330036C

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av isolert og renset aktivert protein C (APC). APC brukes til å forhindre arteriell trombotisk okklusjon eller tromboemboli alene eller i kombinasjon med et trombolytisk middel.

Mange kirurgiske fremgangsmåter innebærer risiko for venøs og arteriell trombose og tromboemboli. Tilføring av gjel-dende anti-blodplate eller fibrinolytiske midler i intra-operative eller postoperative tilfeller kan føre til alvor-lige blødningskomplikasjoner. Således krever bruken av disse midler ekstra forsiktighet. Selv ved lidelser som er komplisert med arteriell trombose, har bruken av antitrombotisk og/eller trombolytisk terapi uønskete bieffekter, slik som blødning eller reokklusjon under trombolytisk behandling i myokardialt infarkt, blødning eller trombose etter kirurgisk behandling og trombose etter kirurgisk behandling som anvender transplanter eller andre kardiova-skulære prostetiske midler.

Følgelig er det et behov for en antitrombotisk terapi som samtidig vil være antikoagulerende, virke mot blodplater og fibrinolyse uten risiko for blødning. APC er unik blant de fysiologiske antikoagulanter siden den inhiberer koagule-ring og stimulerer fibrinolyse. APC inhiberer trombin-mediert aktivering av blodplater såvel som dannelsen av fibrin, og således dannelsen av arteriell trombose bygget opp for det meste av blodplater og fibrin. Bruken av APC reduserer dosen av vevstype plasminogen-aktivator (t-PA) eller andre trombolytiske midler ved sin virkning. Således gir APC sikrere trombolyse med mindre risiko for blødning og mindre risiko for reokklusjon.

APC er et kraftig antikoaguleringsenzym in vitro og in vivo. APC inhiberer blodkoaguleringsveier og dannelsen av trombin ved proteolytisk spaltning av Faktor Va og Faktor Villa, og øker også fibrinolyse (Seegers et al., Thrombosis Res., 1, 443-460 (1972); Kisiel. J. Clin. Invest., 64, 761-769 (1979); Marlar & Griffin, «L. Clin. Invest., 66, 1186-1189 (1980); Malar et al., Blood, 59, 1067-1072 (1982); Clouse Sc Comp, New Engl. J. Med. , 314, 1298-1304 (1986)). APC genereres fra sin sirkulerende prekursor, nemlig fra det vitamin K avhengige protein C (PC) , ved aktivering av immobilisert trombin på endotelet hos blodkar (Mammen et al., Thromb. Diath. Haemorrh., 5, 218-249 (1960); Stenflo, J. Biol. Chem,, 251, 355-363 (1976); Esmon & Owen, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78, 2249-2252 (1981). APC, via pro-teinveien tjener som sentralenzym til den negative tilbake-matningsregulering av koaguleringen. Arvet mangel på PC er assosiert med venøse tromboemboliske lidelser (Griffin et al., JN.Clin. Invest., 68, 1370-1373 (1981); Bertina et al., Thromb. Haemost., 48, 1-5 (1982); Griffin, Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 10, 162-166 (1984); Marciniak et al., Blood, 65, 15-20 (1985), men arvet protein-C mangel er ikke signifikant assosiert med arteriell trombose (Coiler et al., Arterioscloerosis, 7, 456-462 (1987). Infusjon av APC minket blodkoagulerbarhet i forskjellige dyremodel-ler og forhindrer koagulopatiske og dødelige effekter i E. coli infusjon i bavianer (Comp & Esmon, Clin. Invest., 68, 1221-1228 (1981); Comp et al., J. Clin. Invest., 70, 127-134 (1982); Colucci et al., J. Clin. Invest., 74, 200-204 (1984); Taylor e al., J. Clin. Invest.. 79, 918-925

(1987); Burdick & Schaub, Thrombosis Res., 45, 413-419

(1987)). Infusjon av et trombolytisk middel lik t-PA i mennesker resulterer i effektiv trombolyse i akutte myokar-diale infarkter (AMI) (Yusuf et al., European Heart Jour-nal , 6, 556-585 (1985); European Cooperative Study Group, Lancet., 842-847 (1985)).

Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte ved fremstilling av renset APC. Slikt APC kan brukes for å hindre akutt arteriell trombotisk okklusjon, tromboemboli eller stenose i koronare, cerebrale eller perifere arterier hos pasienter eller i vaskulære transplanter. Slikt APC tilføres nevnte pasient i en effektiv mengde alene eller i kombinasjon med et trombolytisk middel, slik som vevsplas-minogenaktivator eller dets analoger, urokinase eller dets analoger, prourokinase eller dets analoger, streptokinase eller dets analoger, en acylert form av plasminogen eller plasmin eller deres analoger og acylert streptokinaseplas-minogenkompleks.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er særpreget ved de trekk som er nevnt i krav l's karakteriserende del.

En mer fullstendig forståelse av foreliggende oppfinnelse og flere av de medfølgende fordeler derav vil lett oppnås ettersom oppfinnelsen blir bedre forstått under henvisning til den følgende detaljerte beskrivelse i forbindelse med de vedlagte tegninger, hvor alle figurer refererer til infusjonseffektene av APC alene eller APC og et trombolytisk middel i bavianer brukt for en modell for arteriell trombose: Figurene la til 3a viser infusjonseffektene av lav dose av APC på blodkoaguleringen målt ved å bruke aktivert partiell tromboplastin-tidsassays (APTTs). Figurene 4a og 5a viser infusjonseffektene av høy dose av APC på APTTs. Figurene 6a og 7a viser infusjonseffektene av en kombinasjon av APC og t-PA på APTTs. Figurene lb til 5b viser effekten av APC og figurene 6b og 7b avAPC pluss t-PA på blodstrømning og blødertid. Figurene lc til 5c viser effekten av APC infusjon eller APC- pluss t-PA-infusjon (figurene 6c og 7c) og blodplateavleiring (dvs. dannelsen av trombe) i et Dacron-transplant fra analyser av radiobildedata av radiomerkete blodplater. Figur 8 viser effekten av t-PA-infusjon på blodplateavleiring (dvs. dannelse av trombe) i et Dacron-transplant fra analyser av radiobildedata av radiomerkete blodplater.

Trombosemodellen

En modell for arteriell trombose er blitt undersøkt ogkarakteriserti tidligere eksperimenter (Hanson & Harker, J. Clin. Invest. , 75, 1591-1599 (1985) : Hanson & Harker, Tromb. Haemostas., 53, 423-427 (1985); Hanson et al., Arteriosclerosis, 5, 595-603 (1985) . Denne modell er anvendelig ved vurdering av effektene av legemidler på dannelse av arteriell trombe. Hannbavianer som veide 10-12 kilo ble fjernet for marker og observert i mere enn 40 dager ved søkers dyrestall før forsøkene. Permanente arteriovenøse koblinger ble foretatt mellom lårarterien og venen ved å bruke 3 mm i.d. Silastic-rør. Etterfølgende innsetning av 5 cm lange, 4 mm i.d. Dacron-vaskulære transplanter virket som trombogen overflate, og induserte kontinuerlig blodplate-fibrintrombedannelse inntil progressiv okklusjon av transplantet ved 70+20 min.. Eksperimentielle resultater ved å bruke rekombinant danne APC i bavianen i denne arterielle trombosemodell i bavianer ble erholdt og indikerte lignende resultater til plasma-avledet APC.

Tilførsel av APC og t- PA

Alle bavianer undergikk minst ett kontrolleksperiment før tilførsel av APC. APC ble gitt ved å injisere 1/4 til 1/3 av den totale PC-dose som en bolus, og de gjenværende 3/4 til 2/3 av dosen som kontinuerlig infusjon over én time. Plasseringen av transplantet og bolusinjeksjonen ble foretatt ved tid = 0 og APC ble tilført ved det proksimale punkt av Silastic-shunten. Eksperimentene ble delt i tre grupper; "lavdose" APC gruppen mottok 2,0 - 3,4 mg (totalt) , "høydose" APC gruppen mottok 11 mg (totalt), og kombinasjonsgruppen mottok 2,1 mg APC pluss 1,3 mg t-PA (totalt).

Fremstilling av APC

Humant plasmaprotrombinkomplekskonsentrat var kilden for protein C. Et monoklonalt antistoff rettet mot den lette kjeden av PC (betegnet C3) ble fremstilt og koblet til CN-bromid-aktivert "Sepharose 4B", og protrombinkomplekskon-sentratet fortynnet i en buffer (0,02 M/l Tris, 0,002 M/l EDTA; 0,002 M/l benzamidin; 0,1 M/l NaCl, 0,075 mM/1 pAPM-SF, 0,02% Na-azid, 0,02 % "Tween 20"; pH 7,4 ble satt på kolonne. PC ble eluert med 3 M tiocyanat og dialysert mot tris-bufret saltvann (0,01 M/l Tris; 0,14 M/l NaCl, pH 7,4) . Renset PC ble aktivert ved å bruke trombin-sefarose-perler som beskrevet i Marlar et al., Blood, 59, 1067-1072

(1982) .

Det rensete APC kom til syne på SDS-PAGE som to bånd og ingen signifikant forurensning (>. 5 %) av andre proteiner ble funnet. I enkelte preparater ble spormengder av trombin bekreftet ved koaguleringsassay separert ved å bruke enten "Bio-Rex 70" absorpsjonen eller Rask Proteinvæskekromato-grafi (FPLC) på en "Mono-Q-kolonne (Pharmacia, Uppsala, Sverige. Aktiviteten av det rensete APC ble målt i aktivert partiell tromboplasintid (APTT) koaguleringsassay (Marlar et al., Blood, 59, 1067-1072) som målte antikoaguleringsak-tivitet og i kromogene substratassays, og resultatene ble sammenlignet med aktiviteten av et på forhånd renset APC-preparat og med aktiviteten av APC dannet ved tilsetning av PC-aktivatoren, Protac (American Diagnostica, Greenwich, CT), til normalt humant plasma.

Amidolvtiske og antikoaguleringsassay av renset APC Forskjellige mengder (0,5 - 5fil) av APC oppløsning eller av renset APC referanseløsning (0,5 mg/ml) ble tilsatt 210 jzl buffer inneholdende 0,01 M Tris-HCl, 0,14 M NaCl, 1% ovalbumin, 0,02 % natriumazid, 0,05 % "Tween-80", pH 8,0, og prøvene ble plassert i mikrotiterplatebrønner. Etter tilsetning av 20 pil kromogent substrat, S-2401 (4,6 mM) , ble forandringen i absorbans av prøven avlest ved å bruke en ELISA-plateleser ved romtemperatur. Amidolytisk aktivitet av APC ble bestemt ved å sammenligne de observerte verdier med referanseverdiene. Antikoaguleringsaktiviteten ble bestemt ved å bruke APTT assay. I dette assay ble fortynninger av normalt humant plasma (nhp) foretatt ved å bruke protein C manglende plasma (pcdp) som fortynningsmid-del. 100 fil av disse blandinger ble blandet med 100 fil "Protac" reagens og 100 p. 1 APTT reagens. Etter 5 min.s inkubering ble 100/xl CaCl2(50 mM) tilsatt og koagule-ringstiden bestemt. Siden nhp inneholder 4,0/xg/ml protein C, ble aktivitetten av ukjente APC-oppløsninger bestemt ved sammenligning med standardkurvene erholdt for fortynninger nhp. I noen eksperimenter ble standardkurvene for den amidolytiske aktivitet av APC dannet under anvendelse av fortynninger av nhp-aktivert med "Protac". I enkelte eksperimenter ble S-2366 brukt i stedet for S-2401. Den spesi-fikke aktivitet av alle preparater av APC var i godt sam-svar med verdier for APC basert på proteininnhold bestemt ved absorbans ved 280 nm ved å bruke en ekstinksjonskoeffi-sient på 1,4 pr. cm pr. mg/ml.

Dosene av APC beskrevet her i bavianeksperimentene indikerer den funksjonelle aktivitet av APC-preparatene sammenlignet med normalt humant plasma og renset APC som standar-der. De rensete APC-preparater viste en antikoaguleringseffekt på humant og bavianplasma under APTT assay'et og spaltet kromogenet oligopeptid-paranitroanilidsubstrater, S-2366 og S-2401 på en konsentrasjonsavhengig måte. t-PA fra en melanoma-cellelinje var elskverdigst fremskaffet Dr. Desire Coiler (Leuven, Belgia).

Studier for å etablere antitrombotiske egenskaper av APC ved arteriell trombose.

Blodstrøm i shunten

Blodstrømmen ble målt ved å bruke et "Doppler"-flowmeter plassert rundt det distale segment av "Silastic"-røret. Verdiene ble gitt i ml/min, og lå i området på 100-200 ml/min (lik 13,3 - 26,5 cm/sek. hastighet) forutsatt arterielle strømningsbetingelser. Strømningsverdiene ble målt ved faste intervaller gjennom eksperimentene. Metoden var beskrevet i Hansen & Harker et al., Arteriosclerosis, 5, 595-603 (1985) .

Blodplateavleiring i " Dacron"- transplantet

Avleiringen av<I:a>ln-merkete blodplater ble påvist med scintillasjonskamerabilder av transplantet. Blodplatemer-kingsmetodene og dataanalyse var de samme som beskrevet i Hanson & Harker , Thromb. Haemostas., 53, 423-427 (1985) med den eneste modifisering at ligningen var forenklet av antallet av blodplater i transplantet som følger: cpm- transplant X blodplatetelling/ ml

cmp/ml av helt blod

Varigheten av avbilding var også forlenget til to timer fra initieringstiden (t=0) av transplantet og APC-bolusen i APC-eksperimentene. Siden akkumulering av blodplater van-ligvis nådde et platå i kontrolleksperimentene innen én time, ble denne én-times periode ikke overskredet under avbilding av inhiberingen av blodplateavleiring. Inhibering av blodplateavleiring i behandlete dyr ble uttrykt som % av totalt antall blodplater avleiret i kontrolleksperimentene ved 30 og 60 minutter's tidene. Ligningene for utregningen av inhibering er vist i tabell I. Siden blodplateavleiring avhenger av blodplateantallet (Harker&Hanson, Thromb. Haemostas., 53, 423-427 (1985) ble korrigering av inhibering av blodplateavleiring foretatt ved å bruke ligningen i tabell I.

Tappingstider

Standardiserte templat-tappingstider ble utført på den barberte underside av underarmen før og under eksperimentet som beskrevet i Malpass et al., Blood, 57, 736-740 (19981), med to snitt, hver 5 mm lange og 1 mm dype, ved 40 mm Hg oppumping av sphygmomanometer.

Undersøkelse av antikoaguleringseffekter og av in vivo plasmanivåer av APC

Antikoaguleringseffekt av APC-infusjon ble målt ved å utføre APTT-assays ved regelmessige intervaller fra arteri-elt blod tappet i natriumcitrat. Forsøket ble foretatt innen 5 til 10 minutter fra prøvetakning for å minimalisere in vitro inhibering av APC av plasma protein C inhibi-tor (er) . For å bestemme nivåer av sirkulerende APC, ble et kromogent amidolytisk assay utviklet. ELISA mikrotiter-plater (Dynatech-Immunlon eller Costar) ble belagt med det anti-protein C monoklonale antistoff C3, som ikke innvirker i vesentlig grad på den amidolytiske aktivitet av enzymet. Blodet ble tappet inn i 3,8 % citrat, 4,6% benzamidinopp-løsning (9:1) og plasmaet erholdt etter umiddelbar sentri-fugering ble holdt ved -80°C inntil undersøkt. 10 p. 1 av denne plasmaprøve ble fortynnet til 160-200/xl med et Tris-bufret saltvann inneholdende 1% BSA som bærer og en 0,3 6 % benzamidin som enzyminhibitor og dette ble inkubert i 1 time ved 37°C i de antistoff-belagte brønner. Oppløsningen ble fjernet og brønnene vasket for å fjerne ubundne be-standdeler og benzamidinet. Derpå ble et kromogent substrat, enten S-2366 eller S-2401 tilsatt og spaltningsgra-den av substratet ble målt spektrofotometrisk. Ved å bruke standard APC-fortynninger ble APC-konsentrasjonen i plasma-prøvene regnet ut fra kalibreringskurven.

Resultater som angir at APC er antitrombotisk under arterielle strømningsbetingelser.

Figurene la til 3a viser APTT forlengningen i "lavdose"-eksperimentene (åpne sirkler). 2,0 - 3,4 mg total dose av human APC omtrentlig doblet APTT-verdiene gjennomsnittlig. Etter avslutning av APC-infusjonen (vertikal pil) sank APTT-verdiene progressivt og det målte nivå av APC basert på amidolytisk aktivitet sank (heltrukken linje i fig. lb), noe som antydet en sirkulasjonshalveringstid på 12-16 minutter. Figurene 4a og 5a viser effekten av "høydose"-APC på APTT. Tilføring av 11 mg APC resulterte i en 3-4 gangers forlengning av APTT i begge eksperimenter. Mønstret av APTT-forandringer og det målte nivå av APC under avslut-ningen av infusjonen indikerer lignende halveringstidver-dier av APC (ca. 12 min.) for disse høyere doser av APC. Kombinasjon av APC (2,1 mg) og t-PA (1,3 mg) hadde den samme effekt på APTT som lavdose-APC hadde alene (fig. 6a og 7a). I ingen av eksperimentene ble APTT minket til startverdien (ved 0 min.) ved slutten av observasjonen (ved 120 min.).

De samme figurer (fig. la til 7a) viser forandringene i APC-nivåene målt med det kromogene assay beskrevet ovenfor (lukkete sirkler). Et totalt område på 0,38 til 0,70/xg/ml av APC plasmakonsentrasjonen i "lavdose"-eksperimentene (fig. la til 3a), 0,94 til 1,64 ug/ ml i "høydose"-eksperimentene (fig. 4a og 5a) og 0,30 til 0,90/xg/ml i kombina-sjonseksperimentene (fig. 6a og 7a) ble målt. Sirkulasjons-halveringstiden for APC i bavianene bestemt ved amidolytiske aktivitetsassay var lik den bestemt fra APTT bestem-melsene, uavhengig av den totale dose av APC-enzymet. In vivo sirkulerende APC nivåer vente ikke fullstendig tilbake til start-verdiene innen to timer. Den fem gangers for-skjell i APC-doser brukt i høydose- sammenlignet med lavdose -eksperimentene , resulterte ikke i fem gangers høyere sirkulerende APC-nivåer, noe som antydet en effektiv fjer-ning eller midlertid lagringsmekanisme eller reseptorme-diert regulering av APC.

I seks av de syv eksperimenter forble tappingstidene i det normale område (fig. lb og 3b til 7b vertikale segmenter) med en svak gjennomsnittlig økning. I ett av "lavdose"-eksperimentene var tappingstidene forlenget og abnormale (fig. 2b) både før og under og etter eksperimentet. Siden tappingstiden var abnormalt lang i dette dyret før APC infusjon, var den lange blødertid observert under APC-infusjonen ikke grunnet APC. Disse resultater antyder at sirkulerende APC ved de anvendte doser ikke endrer signifikant den hemostatiske blodplaterunksjon målt med standardiserte tappetidsteknikker. Det var ingen suffusjoner, hematomer eller gjenblødning observert ved stedene med vevsskade (dvs. sømmer) typiske for høyere doser av t-PA.

Blodstrømmen ble opprettholdt uminket i eksperimentene under APC-tilførsel (fig. lb til 7b, fylte sirkler), i motsetning til kontrolleksperimenter for samme dyr, hvor okklusjon inntraff regelmessig. Seks av de syv implantater forble åpne gjennom hele observasjonsperioden med god arteriell strømning. I et av APC-t-PA-eksperimentene (fig. 6b) sviktet Dacron-implantatet med 115 min.. I fire av de ni kontrollstudier okkluderte implantatene innen én time, og disse implantater svikter etter 40 + 20 minutter når det ikke er noe effektivt antitrombotisk middel i sirkulasjo-nen. Blodstrømningsforandringer i to kontrolleksperimenter er vist i fig. 3b og fig. 7b. Fig. 3b viser strømningsgra-dene av den andre kontroll når implantatet forble åpent opp til 1 time (det første implantat ble okkludert). I fig. 7b kan rask progressiv okklusjon av kontrollimplantatet obser-veres. Disse data viste at APC alene eller i kombinasjon med t-PA er antitrombotisk under arterielle strømningsbe-tingelser. "Høydose"-APC-eksperimentene viste langvarige antitrombotiske effekter da strømmingen ikke forandrer seg vesentlig i løpet av to timer.

Fig. lc til 7c viser resultatene av analyse av radiobildedata. Verdiene uttrykte det totale antall blodplater avleiret i "Dacron"-implantatet etter et maksimum på 1 time i kontrollen og 2 timer i APC-eksperimentene. Fulle sirkler (—•—) viser antallet blodplater avleiret ved arteriell trombusdannelse når APC ble infusert, mens åpne sirkler viser resultatene for kontrolleksperimenter foretatt i de samme dyr. Den typiske sigmoide kurve kan obser-veres i kontrollene som beskrevet i Hanson & Harker Thromb. Haemostas., 423-427 (1985). Avleiringen av blodplater i implantatet ble signifikant hemmet i hvert APC eller APC-t-

PA-eksperiment, sammenlignet med kontrollene. Graden av inhibering ble gitt i prosent i tabell I. De korrigerte verdier for inhibering av blodplateavleiring (I2, tabell I) var henh. 34%, 52% og 42% i "lavdose"-eksperimentene ved 3 0 min., (i gjennomsnitt 43%). (Fig. lc til 3c). I "høydose"-eksperimentene var verdiene 74% og 64% ved 30 min. (gjennomsnitt 69%) og 72% og 83% ved 60 min. (gjennomsnitt 78%)

(fig. 4c og 5c) og APC-t-PA eksperimentene 53% og 36% ved 30 min. (gjennomsnitt 45%) (fig. 6c og 7c). En langvarig inhibering av blodplateavleiring ble observert i "høydose"-studiene etter avslutning av APC infusjon. Fig. 8 viser resultatene av enkelte foregående studier med t-PA i samme eksperimentelle modell. 1 mg t-PA (0,1 mg/kg/time) infusjon hadde en mellomliggende antiblodplateeffekt i disse eksperimenter .

Søkers resultater gir bevis for at human APC inhiberer arteriell trombusdannelse på doseavhengig måte, og at kombinasjon av APC med t-PA inhiberer arteriell trombusdannelse. Dette viser at APC-infusjon kan redusere den antitrombotiske dose av t-PA. Disse effekter av APC ble oppnådd uten en signifikant forlengelse av blødertiden og uten risiko for blødning.

Fordeler

Infusjon av human APC eller i kombinasjon med et trombolytisk middel (t-PA) kan anvendes som et terapeutisk middel hos mennesker med arteriell trombose. Resultatene av studi-ene gir bevis for at APC er et meget kraftig antitrombotisk middel under arterielle strømningsbetingelser ved plasmanivåer ved 0,24 til 1,6/xg/ml.

Fra eksperimentene kan det konkluderes at APC alene eller APC i kombinasjon med et tromobolytisk middel er et meget effektivt antitrombotisk middel for kompleks trombusdannelse under arterielle strømningsbetingelser.

APC alene eller en kombinasjon av APC med et trombolytisk middel slik som t-PA inhiberer kraftig både deltagelsen av blodplater og fibrindannelse i akutt arteriell trombose av en kompleks type, en prosess som ikke reagerer på heparin eller for tiden tilgjengelige antiblodplatemidler når de brukes alene eller i kombinasjon. Siden APC er et fysiologisk materiale, har dets tilførsel kraftige antitrombotiske effekter uten å forårsake signifikant nedsettelse av primær hemostase (som målt i blødertidforsøkene) eller synlig toksisitet.

Anvendelse

Terapi som bruker APC alene eller APC i kombinasjon med et trombolytisk middel er anvendelig for vaskulære lidelser innbefattende arteriell trombose.

Enkelte eksempler på arteriell trombose, hvor APC alene eller i kombinasjon med et trombolytisk middel er anvendelig innbefatter de følgende kliniske tilstander. 1. Akutt arteriell trombotisk okklusjon innbefattende koronære, cerebrale eller perifere arterier. 2. Akutt trombotisk okklusjon eller restenosis etter angioplasti. 3. Reokklusjon eller restenose etter trombolytisk terapi. Trombolytiske midler slik som t-PA redder ischemisk vev når det brukes innen et par timer etter hjerteangrep eller slag ved å re-etablere blodstrøm i den tilstoppete arterie. For tiden undergår mellom 1/4 og en 1/3 av pasientene som har lykkes i trombolytisk reperfusjon av okkluderte koronarar-terier etterfølgende reokklusjon etter avslutning av t-PA infusjon. Denne komplikasjon inntreffer til tross for fulldose-heparinterapi. APC vil ha større effektivitet enn heparin ved å forhindre reokklusjon. 4. Okklusjonen av små og store vaskulære implantater. Vaskulære implantater av liten størrelse, dvs. 3-/mm i diameter, har en høyfrekvens av trombotisk okklusjon. APC alene eller i kombinasjon med et trombolytisk middel er anvendelig for å forhindre okklusjon. 5. Hemodialyse. De prostetiske overflater og strømnings-mønster av alle hemodialyseanordninger er trombogene. For tiden infuseres heparin under dialyse. Imidlertid er heparin kun delvis effektiv, og begrenser derved gjenbruken av dialyseanordninger. I tillegg har heparin et antall vanske-lige bieffekter og komplikasjoner. 6. Kardiopulmonar forbipasseringskirurgi. For å forhindre trombedannelse i oksygenatoren og pumpeapparaturen anvendes for heparin. Imidlertid inhiberer den ikke blodplateaktive-ring og den resulterende transiente blodplatedysfunksjon

som predisponerer for blødningsproblemer post-operativt.

7. Venstre ventrikulære hjerteassisteringsanordning. Denne prostetiske pumpe er sterkt trombogen og resulterer i livstruende tromboemboliske tilstander - komplikasjoner som kun delvis reduseres ved vanlige antikoaguleringsmidler (heparin- eller kumarinmidler). 8. Fullstendige, kunstige hjerte- og venstre ventrikulære hj elpeanordninger. 9. Annen arteriell trombose. APC er anvendelig for arteriell trombose eller tromboemboli hvor for tiden anvendte terapeutiske tiltak enten ikke bør brukes eller ikke er effektive. F.eks. er APC anvendelig for behandlingen av akutt pre- eller postkapillær okklusjon, innbefattende transplantasjoner, retina trombose, eller mikrotrombotisk nekrose av alle organskadende infeksjoner, tumorer eller kumarinbehandling.

Oppsummeringsvis er human APC et naturlig forekommende fysiologisk antitrombotisk humant protein, og overlegent andre tilgjengelige antitrombotiske midler med hensyn til blødertendens (heparin, trombolytiske midler, antiblodplatemidler), toksisitet (enkelte antiblodplatemidler), anti-genisitet (streptokinase), klargjøringshastighet (heparin, antiblodplatemidler, teratogenisitet (kumarinderivater), generelle bieffekter (antiblodplatemidler), mangel på umiddelbar effektivitet (antiblodplatemidler, kumarinderivater) , allergiske reaksjoner (antiblodplatemidler, streptokinase, heparin) og hypotensiv effekt (prostacyklin).

APC kombinert med t-PA eller andre trombolytiske midler forbedrer den antitrombotiske effekt av et trombolytisk middel alene. Således vil APC-terapi redusere dosene av t-PA eller andre trombolytiske midler som kreves for terapeutisk behandling av trombose, og derved unngå komplikasjone-ne med høye doser av trombolytiske midler.

Beskrivelsen ovenfor gir detaljer angående måten som utfø-relsesformer av foreliggende oppfinnelse kan bli foretatt og brukt.

Claims

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av isolert og renset aktivert protein C for å danne en blanding for terapeutisk bruk, karakterisert ved(a) å isolere og rense protein C fra en kilde som inneholder protein C, hvor protein C renses ved å bruke en immuno-affinitetskolonne som har bundet til seg et antistoff som binder til den lette kjede av protein C, og (b) å aktivere det rensede protein C ved å bruke immobilisert trombin for å danne et aktivert protein C i en blanding, hvor det aktiverte protein C er minst 95% rent, og eventuelt (c) tilsette et trombolytisk middel eller en kombinasjon av trombolytiske midler til blandingen, hvor det trombolytiske middel er valgt fra gruppen omfattende vevs-plasminogen-aktivator, urokinase, prourokinase, streptokinase, en acylert form av plasminogen eller plasmin, acylert streptokinase -plasminogen-kompleks og analoger derav.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat kilden for protein C er plasma, plasma-avledet eller rekombinant avledet.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat kilden for protein C er en fraksjon av humant plasma.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedkilden for protein C er et plasma-trombin-kompleks-konsentrat.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den ytterligere omfatter, før trinn c), å fjerne ethvert trombin fra det isolerte, aktiverte protein C ved å bruke et spesifikt trombin-bindende materiale.