CN114599676A - 新型抗-Nogo-A抗体 - Google Patents

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Abstract

提供了新型人源单克隆中和Nogo‑A特异性抗体以及其片段、衍生物和变体以及相关方法。还提供了与该Nogo‑A特异性抗体相关的多核苷酸、运载体、宿主细胞和试剂盒。抗体、一种或多种免疫球蛋白链及其结合片段、衍生物和变体可以分别在用于Nogo‑A靶向免疫疗法和诊断的药物和诊断组合物中使用。

Description

新型抗-Nogo-A抗体
技术领域
本发明总体上涉及新型人源抗体及其片段、衍生物和生物技术变体，其特异性结合至Nogo-A并中和Nogo-A，可以用于治疗中枢神经系统的疾病和创伤，包括视网膜病变。
背景技术
包括视网膜在内的中枢神经系统组织(CNS)仅具有再生受损组织的有限能力。由各种细胞内在的生长信号传导的阻抑基因以及细胞外在机制阻止CNS再生。后者包括胶质瘢痕中和髓磷脂中所富含的生长抑制因子。Nogo-A已被确定为髓磷脂相关因子之一，其限制脉管系统和神经元细胞两者的受损中枢神经系统的恢复量和可塑性(
Figure BDA0003610104720000011
et al.,PNAS,2013)。它是网状蛋白家族的成员，并且具有至少两种生物活性和药理学不同的结构域，Nogo-66和Nogo-AΔ20，两者均已被示出对神经突生长具有强抑制活性(GrandPre etal.,Nature 417(2002),547-51；Oertle et al.,J.Neurosci.23(2003),5393-406)。因此，已将阻断Nogo-A的抑制活性披露为通过改善和促进血管和神经元的修复和生长来治疗伴随有CNS组织的血管和神经元损伤或退化的疾患或病症的有价值药物靶标(在Pernet,BBA–Molecular Basis of Disease,2017中有综述)。
在此情况下，已有报道，鼠单克隆抗体IN-1促进CNS损伤后的轴突再生和功能恢复，IN-1是针对NI-220/250产生的，NI-220/250是大鼠髓磷脂蛋白，是神经突生长的有效抑制剂(并且随后由nogo A基因编码示出)(Schnell and Schwab,Nature 343(1990),269-272；Bregman et al.,Nature 378(1995),498-501，Thallmair et al.,NatureNeuroscience 1(1998),124-131和Chen et al.,Nature 403(2000),434-439)。已有进一步尝试开发靶向Nogo-A的在治疗上有效的单克隆抗体。例如，WO2004/052932A2描述了鼠抗体11C7，其已示出在体外和体内有效地阻断Nogo-A诱导的抑制(Oertle et al.(2003)，上文提及；Liebscher et al.,Annals of Neurology 58(2005),706-719)。例如，在活体动物中，施用11C7能够刺激大鼠脊髓病变后的轴突生长和行进恢复，并且示出促进CNS缺血性损伤后的血管再生(Liebscher et al.(2005)，上文提及；Joly et al.,Glia 66(2018),2079-2093；Rust et al.,PNAS 116(2019),14270-14279)。另外，由Lindau et al.,Brain(2013)的研究中，已经观察到在皮层脊髓束横断后或在单侧次全光照血栓性卒中后对感觉运动皮质鞘内应用抗体11C7(Wahl et al.,Science 344(2014),1250-5)导致成年大鼠精细前肢运动功能高度恢复。在具有颈脊髓或运动皮质损伤的猕猴中也观察到了通过鞘内应用抗Nogo-A抗体大幅恢复臂-手功能(Freund et al.,Nat Med.12(2006),790-2；Hamadjida et al.,Exp Brain Res.223(2012),321-40)。此外，可以示出Nogo-A失活改进了视网膜损伤后的视觉可塑性和恢复；参见，例如，Mdzomba et al.,Cell Death andDisease(2018)9:727。
进一步的单克隆抗Nogo-A抗体公开于国际申请WO2005/061544A2(鼠抗体2A10及其人源化形式H1L11)、WO2007/068750A2和WO2009/056509A1(ATI355，衍生自单克隆抗体6A3，其在HuMabmouseTM中生成；这种基因重组的小鼠由Medarex Inc生产，其中，人免疫球蛋白基因取代了它们的鼠对应物)。这些抗体中的几个是用于治疗脊髓损伤(SCI)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和多发性硬化(MS)的临床试验主题；参见Schmandke et al.(2014)，上文提及，和Kucher et al.,Neurorehabil.Neural Repair.(2018),578-589。ATI335也被命名为NG-101，并且目前在多中心、多国、安慰剂对照II期研究中进行探究在患有急性颈脊髓损伤(SCI)患者中的安全性和初步疗效，尤其是抗体疗法是否可以改进四肢瘫痪患者的运动功能和生活质量，其中，通过鞘内弹丸注射45mg施用抗体；参见，例如，Clinical Trials.gov标识符：NCT03935321。
总之，迄今为止，单克隆抗Nogo-A抗体的开发对于伴随有包括视网膜在内的中枢神经系统(CNS)的损伤或疾患或退化的疾患或病症的预防性或治疗性治疗具有很大的前景，该障碍或病症诸如脊髓损伤(SCI)、卒中或视网膜病变包括视网膜血管病变。
然而，对于单克隆抗体，产品来源是影响免疫原性的重要因素。尽管与嵌合的、人源化的和人单克隆抗体相比，小鼠抗体已被示出在人中强烈地引发免疫应答，但应当注意的是，嵌合的、人源化的和人单克隆抗体也可以引发高比率的免疫原性，这取决于给药方案和患者群体。事实上，使用噬菌体展示开发的一些人抗体，以及甚至是源自转基因小鼠的全“人”抗体，都可能具有显著的抗药物抗体(ADA)应当；参见，例如，Harding et al.,MAbs.2010May-Jun；2(3):256–265和"Immunogenicity Assessment for TherapeuticProtein Products",U.S.Department of Health and Human Services Food and DrugAdministration Center for Drug Evaluation and Research(CDER)Center forBiologics Evaluation and Research(CBER)August 2014Clinical/Medical。因此，在一些病例中，大量患者中的ADA持续阳性导致治疗中止；参见，例如，Kuriakose et al.,J.Immunology Research(2016),Article ID 1298473,http://dx.doi.org/10.1155/2016/1298473和Davda et al.J.ImmunoTherapy of Cancer(2019)7:105,https://doi.org/10.1186/s40425-019-0586-0。
在此情况下，单克隆抗体的免疫原性也可能是由于抗体制备剂的杂质和异质性，例如由于抗体的化学降解产物，并且因此抗体分子缺乏稳定性；参见，例如，Doevendansand Schellekens,Antibodies 8(2019),21；https://doi.org/10.3390/antib8010021。
发明内容
本发明涉及如在权利要求中表征的、在说明书中公开并在下文的实施例和附图中进一步说明的实施方式。因此，本发明涉及Nogo-A特异性人源单克隆抗体及其结合Nogo-A片段以及本文示例的抗体的等效合成变体和生物技术衍生物，它们特别可用于预防或治疗性治疗伴随有包括视网膜和周围神经系统(PNS)组织在内的中枢神经系统(CNS)的损伤或疾患或退化的不同疾患或病症。
如在实施例中说明的，在复杂的抗体开发过程中，幸运地可以克隆和鉴定出高亲和力人单克隆抗Nogo-A抗体，该抗体能够中和Nogo-A的生物活性，例如通过在生长抑制性CNS髓磷脂的存在下增强神经突生长，通过在成年大鼠在大型单侧运动皮质卒中后增强受损前肢的功能恢复，或者通过在卒中小鼠模型中在卒中损伤后在半暗区中增加血管生成来实现。该抗体至少与先前建立的小鼠抗Nogo-A抗体“11C7”一样有效，该小鼠抗Nogo-A抗体“11C7”被视为“金标准”，例如在卒中研究中使得卒中后熟练使用前肢的功能恢复。尤其，在本发明范围内进行的实验证明，在运动皮质永久性卒中后，本发明的抗Nogo-A抗体在成年小鼠的半暗区中诱导血管生成；参见例如实施例9。因此，本发明的抗Nogo-A抗体的特征通常可以在于促血管生成作用并且能够在损伤后长达三周促进缺血边缘区中的血管修复/生长。另外，或替代地，本发明的抗Nogo抗体的特征在于，能够形成新形成的血管内皮细胞并且与对照相比增加新形成的血管内皮细胞的数目增加具有显著作用；参见例如实施例9。
总之，根据本发明进行的实验成功地鉴定出用于神经突生长和再生以及用于功能性和血管修复(例如卒中后)的有效抗Nogo-A抗体。
此外，如可以在根据本发明进行的进一步实验中示出的，本发明的抗Nogo-A抗体高度可溶于普通缓冲剂诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)(至少高达20mg/ml在PBS中)并且特别稳定，例如重复冷冻-解冻循环(PBS溶液pH7.4，7mg/ml)不会导致可检测水平的聚集和降解产物；参见例如实施例10和图9。
出人意料的是，虽然本发明的抗体结合Nogo-AΔ20(d20)结构域(其延伸超过>160个氨基酸)并且至少与抗Nogo-A抗体11C7一样有效，但它识别的表位不同于11C7和其他已知的抗Nogo-A抗体Ozanezumab和ATI355的表位，并且不与抗体11C7竞争结合Nogo-A。具体而言，如实施例3中示出，本发明的抗体NG004结合延伸的d20加(d20plus)区加抑制区(人氨基酸第543-866位)的C-和N-末端的一些额外氨基酸。表位作图鉴定了人Nogo-A d20加区在内的序列，包括与天然Nogo-A蛋白的氨基酸683-689相对应的氨基酸141-INAALQE-147(SEQID NO:21)，作为由本发明的抗体NG004识别的最小表位；参见实施例4和图3。因此，在一种实施方式中，抗体结合包括氨基酸序列INAALQE(SEQ ID NO：21)的Nogo-A表位；参见实施例4。因此，本发明涉及具有与抗体NG004相同的结合特异性的抗体或其结合片段，即具有以下项的特征：在生长抑制性CNS髓磷脂的存在下增强神经突生长和/或在卒中小鼠模型中在卒中损伤后在半暗区中增加血管生成；并且其中，所述抗体或其结合片段优选地结合Nogo-AΔ20(d20)结构域，并且尤其是氨基酸序列141-INAALQE-147(SEQ ID NO:21)。根据所附实施例中公开的实验和测定可以容易地确定所提及的特征，其中，可以将抗体NG004用作参考抗体。通常，此类抗体将与相应的参考抗体分别在相同表位和肽处竞争结合Nogo-A。
因此，在一种实施方式中，本发明的抗体衍生自抗体NG004并且可以通过包括SEQID NO:2和SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12的氨基酸序列的可变重(VH)链和可变轻(VL)链的互补决定区(CDR)或高变区来表征，如图1A中示出，并在以下图1的图解中进行了解释。在另一种实施方式中，本发明的抗体衍生自抗体NG034并且可以通过包括SEQ ID NO:12和SEQID NO:17的氨基酸序列的VH和VL链的CDR或高变区来表征，如图1B中示出，并在以下图1的图解中进行了解释。
在本发明范围内进行的进一步实验揭示了本发明的抗体能够对表达Nogo-A的细胞和组织进行免疫染色。尤其，已经由免疫荧光染色示出人少突胶质细胞细胞系MO3.13(在细胞内以及在细胞表面上表达Nogo-A)和大鼠神经元细胞系Neuroscreen-1(NS-1)以及大鼠CNS组织中的少突胶质细胞和运动神经元对NG004呈阳性染色，其染色程度与阳性对照抗体11C7和Ozanezumab的染色程度相似。在根据本发明进行的实验过程中，已进一步示出本发明的抗体NG004至少与迄今为止用作金标准的抗体11C7一样有效，例如在含Nogo-A的生长抑制性CNS髓磷脂的存在下具有诱导神经突生长晕的IC50低于15nM甚至低于12nM；参见实施例8。
因此，基于在本发明范围内进行的实验中获得的结果，提供了新型类的抗Nogo抗体，其在治疗上可用于治疗与非期望Nogo-A活性有关的疾患。
虽然借助于参考最初在根据本发明进行的实验中获得并在实施例中描述的人源抗体对本发明进行了说明和描述，但应当理解，本发明的抗体或抗体片段包括抗体的合成和生物技术衍生物，该抗体或抗体片段意指通过化学或重组技术合成的任何工程化抗体或抗体样结合Nogo-A分子，其保留主题抗体的一种或更多种功能特性，尤其是它对Nogo-A的中和活性。因此，尽管为了简明起见可以借助于提及抗体来描述本发明，但除非另有说明，否则其合成和生物技术衍生物以及等效的结合Nogo-A分子意指并且包括在术语“抗体”的含义之内。
本发明的其他实施方式将通过以下描述和实施例变得显而易见。
附图说明
图1：本发明的抗Nogo-A特异性人抗体NG004(A)和NG034(B)的可变区即重链和κ轻链(VH，VL)的氨基酸序列。框架(FR)和互补决定区(CDR)以带下划线的CDR表示。使用了Kabat编号方案(参见http://www.bioinf.org.uk/abs/；Kabat et al.,U.S.Dept.ofHealth and Human Services,"Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983)在提及的网络参考中提到并在WO2015/092077A1第28页的表1中给出，其通过援引并入本文。除非另有说明，否则在本发明的抗体或其结合Nogo-A片段、变体或衍生物中提及的对特定氨基酸残基位置的编号是根据Kabat编号系统，然而这是理论上的并且可能并不等同地适用于本发明的每个抗体。例如，取决于第一个CDR的位置，随后CDR可能以任一方向移位。因此，如果图1和/或序列表中的CDR指示即抗体NG004和NG034的可变重(VH)链和可变轻(VL)链氨基酸序列出现任何偶然错误或不一致，本领域技术人员基于本申请的公开内容能够很好地根据Kabat确定正确的CDR序列，这将用于定义所要求保护的抗体及其Nogo-A-结合片段。描绘了如SEQ ID NO:2和7(A)所示的抗体NG004以及如SEQ ID NO:12和17(B)所示的抗体NG034的可变重链VH和轻链VL序列。如在说明书中进一步解释的，在CDR和/或框架区内，优选保守氨基酸置换，这考虑到原始氨基酸单独的或与相邻氨基酸的物理化学性质，如Mirsky et al.,Mol.Biol.Evol.32(2014)806-819，第813页，图6中所说明的，尤其是AB或LG模型，例如使得交换两个氨基酸的位置。
图2：抗体NG004和NG034与重组表达的人和大鼠Nogo-A以及大鼠胼胝体少突胶质细胞的d20加区的结合特异性。(A)NG004以高亲和力/亲合性结合人Nogo-Ad20加区。NG004的EC50值为0.26nM。(B)NG004弱结合大鼠Nogo-Ad20加区。(C)NG034以高亲和力/亲合性结合人Nogo-A d20加区(NG034的EC50值为0.298nM)。(D)NG034以高亲和力/亲合性结合大鼠Nogo-Ad20加区(NG034的EC50值为0.229nM)。(E)NG004和NG034对大鼠胼胝体少突胶质细胞染色呈阳性，如在固定的大鼠脑组织切片上的免疫荧光染色所示，产生的染色模式与对照抗体Ozanezumab的染色模式相似。单独用Cy3标记(DoxHuCy3)的第二驴抗人抗体未观察到染色。
图3：通过肽扫描(pepscan)分析评估抗体NG004的结合Nogo-A表位。NG004的肽扫描图像。NG004结合发生在肽34、35和36(白框)，覆盖Nogo-Ad20加区的第141-147位氨基酸(肽34：133-EEIKEPENINAALQE-147 SEQ ID NO:22，肽35：137-EPENINAALQETEAP-151SEQ IDNO:23，肽36：141-INAALQETEAPYISI-155SEQ ID NO:24，共有结合序列：141-INAALQE-147SEQ ID NO:21)。
图4：抗体NG004和NG034与抗体Ozanezumab和11C7竞争性结合Nogo-A的交叉竞争测定。NG004未示出与抗体Ozanezumab(A)和11C7(B)的竞争性结合。NG034在人d20加区(C)中未示出与NG004和11C7的竞争性结合。
图5：通过用NG004对大鼠鞘内治疗1周并随后通过免疫荧光染色分析CNS中的Nogo-A和Nogo-B的蛋白水平来分析NG004的体内靶标接合。(A)NG004下调CNS中的内源性Nogo-A水平。(B)NG004上调CNS中的内源性Nogo-B水平。(C)NG004上调CNS中的内源性NgR1水平。
图6：已在小鼠海马的离体测定中分析了NG004对长时程强化(LTP)的作用。(A)用作阳性对照的抗体11C7通过阻断Nogo-A导致LTP增加。FG12是无活性的对照抗体。(B)抗体NG004表现出与11C7相似的离体活性，即增加LTP。(C)更高剂量的NG004(25μg/ml)增加作用大小和起效。
图7：在存在或不存在生长抑制性CNS髓磷脂提取物和抗Nogo-A抗体下，N1E小鼠神经母细胞瘤细胞的体外神经突生长晕测定。(A,B)NG004在大鼠脊髓提取物(SCE)的存在下以剂量依赖性方式刺激神经突生长晕，这与抗体11C7非常相似。(C,D)NG004和NG034在非人灵长类动物(CNSE)的CNS提取物的存在下刺激神经突生长晕，这与抗体ATI355非常相似。相应的无活性对照抗体3.1IgG1没有作用。
图8：成年小鼠体内卒中模型；卒中后3周，局灶性卒中核心周围缺血边缘区的血管修复程度。(A)与对照抗体FG12/B5相比，NG004增加了缺血边缘区内的血管面积。(B)与对照抗体FG12/B5相比，NG004增加了血管分支的数目。(C)与对照抗体FG12/B5相比，NG004增加了缺血边缘区内的血管长度。(D)NG004增加CD31+内皮细胞的增殖率。NG004和11C7的所有参数的作用大小相似。
图9：重复冷冻-解冻循环(B)和在不同pH值(A)后NG004的尺寸排阻色谱法分析示出抗体高度稳定。
图10：缺血性卒中和2周抗Nogo-A治疗后的功能恢复。大鼠接受了单侧光照血栓性卒中，并用两种不同的抗Nogo-A抗体(11C7[4mg/ml]；NG004[4mg/ml或8mg/ml])或者对照抗体(BrdU抗体，4mg/ml)用渗透性微型泵连续鞘内(2ml)治疗两周。不同治疗组的水平阶梯成功评分评价(受损前肢：正确步数/总步数)。(A)损伤后每周水平阶梯表现的时间表。(B)受伤后第63天的表现。与抗BrdU治疗的动物相比，用8mg NG004治疗的动物示出显著的改进。4mg NG004治疗的动物示出明显的改进趋势。
图11：在基于ELISA的CDC测定中使用NG004同种型(IgG1和IgG4)、利妥昔单抗(Rituximab)(IgG1，Mabtera)和那他珠单抗(Natalizumab)(IgG4，Tysibra)来比较C1q结合。NG004 IgG4 S228P示出对C1q的反应性降低，并且表现与其他IgG4(那他珠单抗)相似。
具体实施方式
一般而言，本发明涉及与结合Nogo-A并能够中和Nogo-A的人源单克隆抗体以及其片段、衍生物和变体。更具体地，本发明涉及如在权利要求中所表征、在说明书中公开并在下文的实施例和附图中进一步说明的实施方式。由于它们的人来源，即原始抗体在人体内的成熟，以及它们对Nogo-A的中和能力，抗体具有高治疗价值，并且优选地在人体中基本上是非免疫原性的。
除非另有说明，否则给出的本文所用术语的定义如在牛津大学出版社，1997年，2000年修订和2003年再版，ISBN0198506732；第二版于2006年出版，ISBN0-19-852917-1978-0-19852917-0的牛津生物化学和分子生物学词典中提供的定义。
此外，除非另有说明，否则本文使用的为了表征本发明的术语和表达给出了如WO2015/092077A1中提供的定义，尤其是在第16至42页的“I.定义”小节中，包括第28页表1的CDR定义，其公开内容通过援引明确并入本文。这同样适用于WO2015/092077A1中公开的抗体、多核苷酸等的一般实施方式。另外，不承认“发明背景”中引用的科学出版物和专利申请代表所要求保护的本发明的现有技术，关于Nogo-A和抗Nogo-A抗体、其在宿主细胞中的重组产生、纯化、修饰、药物组合物的配制和治疗用途以及本领域中常见的术语和特征的它们的公开内容可以是本领域技术人员在实施所要求保护的本发明时所依据的；参见，例如，Antibodies A Laboratory Manual 2nd edition,2014by Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,USA，其中，还描述了抗体纯化和储存；工程化抗体，包括简并寡核苷酸的用途、5'-RACE、噬菌体展示和诱变、免疫印迹规程以及最新的筛选和标记技术。
术语“中和”和“中和抗体”分别是在本领域中常用的，抗体意指降低或消除抗原或活微生物的至少一些生物活性。例如，本发明的抗Nogo-A抗体是中和抗体，它若具有足够的量则消除或降低Nogo-A的活性，例如在如实施例中描述的测定中。中和通常由50％抑制浓度(IC 50)定义，并且可以基于中和滴定曲线下的面积(AUC)统计评估。在本文中对本发明的示例性抗Nogo-A抗体的IC50值进行了描述和示出，例如，在图5至8中。尤其，本发明的抗体的中和能力已经并且能够如例如在实施例6-9中所示出的那样进行分析，其中，如通过免疫组织化学发所确定的，抗体下调体内CNS中的内源性Nogo-A，如在小鼠海马LTP测定中确定的，增加长时程突触可塑性(长时程强化，LTP)，在体外神经突生长晕测定中刺激神经突生长晕，并且在体内小鼠卒中模型的半暗区中诱导血管生成。
因此，本发明总体上涉及人源重组单克隆抗Nogo-A抗体及其抗原结合片段，其中和Nogo-A的生物活性并且能够在生长晕抑制CNS提取物的存在下例如如实施例8中所证明的诱导剂量依赖性神经突生长晕和/或例如如实施例9中所证明的诱导卒中半暗区中的血管生成。
胶质衍生的轴突生长抑制性蛋白限制了成体CNS受损后的功能性修复。其中，Nogo-A和例如MAG和OMgp是与神经元(共)受体((co-)receptor)相互作用的抑制剂，例如与NogoA受体诸如Nogo受体-1(NgR1)、鞘脂受体S1PR2或富含亮氨酸的重复以及含免疫球蛋白样结构域的蛋白(也成为LINGO)相互作用，导致抑制轴突生长。例如，在与抑制性蛋白(例如Nogo-A)相互作用下，NgR1复合物会转导导致生长锥塌陷并抑制神经突生长晕的信号。如上所提及，对大鼠鞘内施用NG004的体内研究表明，与对照抗体治疗相比，CNS组织中Nogo-A显著减少。因此，相比于抑制受体结合配体Nogo-A的已知机制，本发明的抗体还降低系统中的配体，即通过下调CNS中的Nogo-A水平，并且因此显示出有效的生物效应。
对大鼠鞘内施用NG004的体内研究进一步表明，Nogo-A受体NgR1上调(参见图5C)，这表明NG004在体内与Nogo-A结合并诱导CNS Nogo-A水平下调及其受体NgR1上调作为补偿机制。
因此，当与同样抑制Nogo-A受体与Nogo-A结合的分子(例如NgR1、S1PR2或LINGO-1)组合时，使用抗Nogo-A抗体，优选抗体NG004或NG034的治疗方法可能会得到进一步改进。尤其，本发明的抗Nogo-A抗体即NG004和NG034从系统中去除Nogo-A，并且Nogo-A受体如NgR1、S1PR2或LINGO-1未受到刺激。这种机制类似于AXER-204，其是最近开发的可溶性人融合蛋白，可作为髓磷脂相关生长抑制剂如MAG、OMgp和Nogo-A的诱饵或陷阱，阻止它们的信号传导并促进神经元生长；参见Bradbury and Oliveira,Brain 143(2020),1618-1622。因此，审慎地预期本发明的抗Nogo抗体可以用于治疗可以用AXER-204治疗的疾病。
因此，在另一方面，本发明涉及联合疗法，将抗Nogo-A抗体，优选NG004或NG034与抑制Nogo-A与其受体复合物或后受体信号通路的阻断剂相结合的分子组合应用于治疗本文定义的外周(PNS)和/或中枢(CNS)神经系统的疾病或创伤。抑制Nogo-A受体结合的分子在本领域中是已知的。例如，WO2007/089601A1中描述了抑制NgR1介导的神经突生长晕抑制的分离的多肽片段，或者Kurihara and Takei,Neural Regen Res.10(2015),46–48中描述了外侧嗅束引导物质(LOTUS)，其与NgR1结合并阻断Nogo-A与NgR1的结合，导致对Nogo-A诱导的轴突生长抑制的阻抑。此外，抗LINGO-1抗体Li81(阿昔单抗(opicinumab))阻断LINGO-1功能，并且在动物模型中示出强大的髓鞘再生活性。该抗体目前正在进行一项2期临床试验的研究，作为对多发性硬化复发个体的潜在治疗；参见Hanf et al.,mAbs 12(1)(2020),1713648。
与Nogo-A相似，髓磷脂相关糖蛋白(MAG)和少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(OMgp)具有轴突抑制作用，并且因此，用本发明的抗Nogo-A抗体治疗可以与抗MAG和/或抗OMgp抗体相组合；参见例如Yu et al.,Transl.Stroke Res.4(2013),477-483and Irving et al.,JCereb Blood Flow Metab.25(2005),98-107。
此外，如例如实施例8中的抗体NG004所证明的，本发明的抗体具有特别高的中和活性与低抑制浓度(IC50)。尤其，本发明抗体的刺激神经突生长晕的IC50值示出为11.16nM，其显著低于迄今为止用作金标准的参考抗体11C7所确定的IC50值；参见图7A。因此，在一种实施方式中，抗Nogo-A抗体或其抗原结合片段在神经突生长晕抑制测定中示出的诱导神经突生长晕的IC50值低于15nM、优选12nM。
如实施例中和附图中进一步说明的，例如在图2中，本发明的抗体最初已经从人供体中分离并且示出结合人Nogo-A。因此，在一种实施方式中，本发明的抗Nogo-A抗体和结合Nogo-A片段衍生自抗体NG004并且相对于来自其他物种诸如大鼠或小鼠的相应抗原而言优先识别人Nogo-Ad20加肽。已经在如本文所述和示出的若干实验测定中测试了本发明抗体的结合特征诸如特异性和亲和力，例如，在实施例3至5和在图2至4中。在此情况下，为了获得结合亲和力的测量，在实施例3中进行的ELISA中确定了本发明抗体的EC50。如所证明的，本发明的抗体显示出由EC50值确定的特别高的表观结合亲和力。尤其，抗体NG004结合人Nogo-Ad20加肽的EC50为0.26nM，而大鼠Nogo-A仅弱结合；参见实施例3。在另一种实施方式中，本发明的抗体源自抗体NG034，其以高亲和力识别人和大鼠Nogo-A。尤其，NG034对于结合人的EC50为0.298nM，以及对于结合大鼠d20加区的EC50为0.229nM；参见实施例3。已通过免疫沉淀测定和随后的蛋白质印迹检测进一步证实了NG004与在HEK细胞上表达的人和大鼠Nogo-A的结合。
因此，本发明的抗体可以优选地表征为在神经突生长晕抑制测定中具有的诱导神经突生长晕的EC50值低于15nM、优选低于12nM、更优选约11nM和/或结合人或大鼠的d20加区的EC50值低于0.5nM，优选低于0.4nM，更优选约0.3nM。然而，也取决于抗体形式，例如是否使用IgG1、IgG4或抗体片段，如Fab片段，IC50和EC50值可能会偏差，并且例如可能高于或低于上文和实施例中提及的值。因此，在本上下文中，术语“约”意指可能不同于实施例中参考抗体确定的值的值，该差异优选地小于一个数目级，并且最优选地在相同数目级内，例如IC50可以是参考值±10nM，以及EC50可以是参考值±0.3nM。
如实施例5和图4在竞争测定中所证明的，主题抗体至少与抗体11C7未示出竞争性结合Nogo-A，并且如所示出的，NG004优选地也不与Ozanezumab竞争性结合Nogo-A。因此，在一种实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段另外或替代地不与抗Nogo-A抗体11C7竞争结合Nogo-A，并且优选也不与Ozanezumab竞争结合Nogo-A。抗体之间的竞争是通过以下的测定来确定，在该测定中，通过参考抗体与常见抗原诸如Nogo-A的特异性结合来抑制受测试的免疫球蛋白。许多类型的竞争性结合测定是已知的；参见Harlow and Lane,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988),(2014)，上文提及。优选地，竞争性结合测定在如实施例5中所述的条件下进行。
神经突生长晕抑制剂Nogo-A包含3个抑制区。两个与剪接变体Nogo-B(Nogo-66位于两个跨膜区和N末端尖端的NIR结构域之间)共有，以及一个与剪接变体Nogo-C(Nogo-66)共有。Nogo-A神经突生长晕的独特、高度抑制结构域位于Nogo-A的外显子3中，并且称为Δ20区(Oertle et al.,J.Neurosci.23(2003),5393-5406)。如实施例3中所示，本发明的抗体结合至包含d20区(Nogo-A-Δ20结构域)加在抑制区C-末端和N-末端处的一些额外氨基酸(人第543-866位氨基酸)的片段，即所谓的d20加区。因此，在本发明的一种实施方式中，抗体与人Nogo-A的第543-866位氨基酸之间的区内的Nogo-A相结合，优选地与包括以下项或由以下项组成的表位和/或肽结合：对应于人Nogo-A第683-689位氨基酸的氨基酸序列141-INAALQE-147(SEQ ID NO:21)；参见实施例4。
使用抗Nogo-A抗体及其抗原结合片段来对本发明进行说明，该抗Nogo-A抗体及其抗原结合片段的特征在于其可变区即结合结构域中包括具有分别在图1A和B中所示的氨基酸序列的可变重(VH)链和可变轻(VL)链。相应的核苷酸和氨基酸序列在下表II中所示。
一如既往，每条链的可变结构域包含称为互补决定区(CDR、CDR-1、-2和-3)的三个高变环。CDR由称为框架区(FR-1、-2、-3和-4)的结构保守区分隔，这些区形成“核心”β-折叠结构，在可变结构域表面上示出这些环。CDR序列的长度和组成是高度可变的，尤其在CDR3中。CDR近似于与抗原相互作用的抗体的互补位，并且因此包含抗原结合残基。因此，通常通过其六个CDR来定义抗体。VH和VL链的上述氨基酸序列中的示例性CDR组描绘于图1A和1B中。然而，如以下所讨论的，本领域技术人员很清楚这样一个事实，可以另外或替代地使用CDR，其氨基酸序列不同于图1A和B中任一个中所示的那些，在CDR2和CDR3的情况下，存在一个、两个、三个或甚至更多的氨基酸序列的差异。如在图1的图解中提及的，本领域技术人员可以根据常见原理例如如在www.bioinf.org.uk/abs中所总结的来容易地鉴定CDR。在此情况下，虽然根据Kabat等人指示图1中描绘的抗体的CDR，本领域技术人员知晓CDR的许多定义是常用的，即
(i)基于序列变异性的Kabat定义，这是最常使用的；
(ii)基于结构环区位置的Chothia定义；
(iii)AbM定义是Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用的两者之间的折衷；以及
(iv)最近引入并基于对可用复杂晶体结构的分析的Contact定义。该定义可能对进行诱变以改变抗体的亲和力最有用，因为这些是参与与抗原相互作用的残基。对于在每个抗体中与每个CDR的摘要数据接触的CDR残基列表，参见例如www.bioinf.org.uk/abs，这也是指抗体建模软件，诸如可在abymod.abysis.org获得的abYmod。
下表I描述了不同概念定义的CDR位置之间的关系。
表I：CDR定义的不同概念。1其中一些定义(特别是对于Chothia环)取决于所检查的个别出版物而异；2任何编号方案都可以用于这些CDR定义，例外的是接触定义使用Chothia或Martin(增强型Chothia)定义；3使用Kabat编号约定编号时，取决于环的长度，Chothia CDR-H1环的端在H32和H34之间变化。(这是因为Kabat编号方案将插入置于H35A和H35B。)
Figure BDA0003610104720000141
对于提及的定义，另参见Kontermann and Dübel(eds.),Antibody EngineeringVol.2,DOI 10.1007/978-3-642-01147-4_3,#Springer-Verlag Berlin Heidelberg2010，尤其是第3章，抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析，第33-51页和Dondelingeret al.,Front.Immunol.9(2018),2278专门处理理解抗体编号和抗原结合表面/残基定义的重要性和影响；参见，例如，Dondelinger等人，图4和图6，说明根据Kabat上文提及，Chothia(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196(1987),901-917)，Contact(MacCallum etal,J.Mol.Biol.262(1996),732-745)和IMGT(
Figure BDA0003610104720000142
the internationalImMunoGeneTics information
Figure BDA0003610104720000143
www.imgt.org)的经典CDR定义中的不同。AbM定义是Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用的两者之间的折衷。
Figure BDA0003610104720000151
上图对CDR-H1(VH-CDR1)的替代定义进行了说明。Kabat和Chothia编号方案水平地示出，并且CDR的Kabat、Chothia、AbM和Contact定义在两个编号方案上方和下方用箭头示出。
在一种实施方式中，本发明涉及人源单克隆抗Nogo-A抗体或其结合Nogo-A片段、合成衍生物或生物技术衍生物，其中，其片段或衍生物包括含有VH互补决定区(CDR)1、2和3的可变重(VH)链以及含有如Kabat定义的VL CDR1、2和3的可变轻(VL)链，其中：
(a)VH-CDR1包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(b)VH-CDR2包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(c)VH-CDR3包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(d)VL-CDR1包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(e)VL-CDR2包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换，以及
(f)VL-CDR3包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换；或者
(g)VH-CDR1包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(h)VH-CDR2包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(i)VH-CDR3包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(j)VL-CDR1包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(k)VL-CDR2包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换，以及
(l)VL-CDR3包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换。
另外，或替选地，本发明的抗体或其抗原结合片段的特征可以在于：
(a)该VH链包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或多个氨基酸置换；和
(b)VL包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或多个氨基酸置换；或者
(c)VH包括SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或多个氨基酸置换；和
(d)VL包括SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或多个氨基酸置换；
优选地，其中，VH和VL链氨基酸序列与SEQ ID NO:2和17分别具有至少90％的同一性。在该实施方式中，优选地，根据Kabat定义的一个或多个CDR基本保持不变。然而，在互补位对应于CDR的简化假设下，CDR的Chothi定义可以另外或替代地使用，因为它们与可变区中存在的结构环非常相关。因此，为了提供与主题抗体NG004和NG034等效的抗Nogo-A抗体，如果在根据Kabat定义的CDR中进行，优选至少一个或所述一个或多个中的两个、优选地不超过两个氨基酸置换在由Chothia和/或IMGT定义的CDR之外进行，以及最优选在根据Kabat和Chothia定义的CDR的重叠之外进行。
例如，关于分别在CDR、可变重链和轻链以及框架氨基酸序列内的氨基酸置换，优选地进行保守氨基酸置换例如根据Mirsky et al.,Mol.Biol.Evol.32(2014),806-819中分析和描述的最频繁的氨基酸置换；参见Mirsky等人,第813页图6。尤其，在VH-CDR1中，S可以被T置换；在VH-CDR3中，V可以被E置换，T可以被S置换和/或M可以被V置换；在VL-CDR1中，R可以被K置换，R可以被E置换，和/或T可以被置换；在VL-CDR2中，S可以被A置换和/或A可以被G置换；并且在VL-CDR3中，P可以被S置换。如所提及的，优选地选择在Mirsky et al.(2014)，上文提及的图6中所示出的模型LG和AB中的任一个或优选两个中属于同一类别的氨基酸置换，LG模型由于倾向于保持氨基酸特性而被优选，并且其中，优选地选择氨基酸置换使得基本保持原始氨基酸的物理化学特性，即疏水性、极性或带电荷特性或例如在进行两个或更多个氨基酸置换的情况下，它们相互补偿以共同提供表面的物理化学特性。在优选的实施方式中，本发明的抗体包括的VH和/或VL区的氨基酸序列变体与图1A和B中示出的VH和VL区具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
当然，除了理论考虑之外，还存在用于在合理的时间和不适合的主旨内鉴定CDR变体的实验方法。例如，Tiller等人在Front Immunol.8(2017),986中描述了使用自然多样性诱变使抗体可变结构域易于亲和力成熟。事实上，早在几年前，Rajpal等人，在PNAS 102(2005),8466–8471中报道了通过使用组合文库大大改进抗体亲和力的通用方法，并且用抗TNF-α抗体D2E7
Figure BDA0003610104720000171
对他们的方法进行了说明，鉴定出在21个CDR位置的38个置换，这些置换使得与TNF-α结合的亲和力更高。最近，Cannon等人在PLOS ComputationalBiology,https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1006980May 1,2019中描述了实验指导的计算抗体亲和力成熟与从头对接、建模和计算机合理设计亲和力成熟，连同丙氨酸扫描，允许微调蛋白-蛋白对接模型，随后能够鉴定两个单点突变，这些突变增加了杂交瘤衍生抗体AB1对其抗原鼠CCL20的亲和力。
因此，虽然每种抗体都是独特的并且可能具有不同的特征，但是一旦已经提供了先导候选物，本领域技术人员考虑到如本申请中公开的本发明的教导，以及鉴于迄今为止开发的计算设计和实验方法则能够获得等效的抗Nogo-A抗体，其保持抗体的期望特征，诸如实施例中说明的和权利要求中具体限定的抗Nogo-A抗体所描述的那些特征。在此情况下，很好理解变体抗体基本上保持亲本抗体的结合特异性，例如与亲本抗体竞争结合Nogo-A而不与一种或多种、优选所有提及的现有技术抗体竞争，即至少不与11C7竞争，优选地也不与Ozanezumab竞争，其可以根据实施例5中描述的竞争测定进行评估。尤其，源自抗体NG004的本发明抗体不与抗体11C7和Ozanezumab竞争。然而，优选地，本发明的抗体在其免疫球蛋白链的一条或两条中包括如图1中所示的可变区的一个、两个或全部三个CDR或者与图1所示的可变区的CDR具有90％、91％，92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的一个、两个或全部三个CDR。另外或替选地，来自FR的一个或多个框架区(FR)与图1A和B中描绘的相应FR具有80％的同一性，优选地与图1A和B中描绘的框架区具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，存在1、2、3或全部4种FR(各自与图1A和B中示出的FR分别具有至少90％、90-95％和/或95-99％的同一性)。
如在本领域中已知的，可变重链的CDR3(VH-CDR3)似乎主要决定抗原特异性；参见，例如，Xu and Davis,Immunity 13(2000),37-45。在此情况下，注意到驱动特异性的是重链CDR3的多样性，而VH-CDR1和VH-CDR2残基具有广泛的交叉反应性，并受体细胞超突变的改进；参见Davis,Semin.Immunol.16(2004),239-243。因此，在一种实施方式中，本发明的抗体具有参考抗体NG004的免疫学特征并且能够在各自表位上与其竞争结合Nogo-A，在它们的可变区中至少包括相应参考抗体的VH-CDR3或者氨基酸序列与参考VH-CDR3具有至少90％的同一性、优选95％的同一性、以及更高96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH-CDR3。例如，参考抗体的变体抗体可以保留参考(亲本)抗体的VH-CDR3，而VH-CDR1和/或VH-CDR2可以包含一个或多个氨基酸置换；参见上文提及。
在本发明的另外额外或替代实施方式中，可以将抗Nogo-A抗体、其抗原结合片段、合成的或生物技术变体优化为具有对靶标具有适当的结合亲和力以及药代动力学和稳定性特性。因此，易于选自由糖基化、氧化、脱氨作用、肽键断裂、异天冬氨酸形成和/或未配对半胱氨酸组成的组的修饰的CDR或可变区中的至少一个氨基酸被缺乏该改变的突变氨基酸置换，或者其中至少一个碳水化合物部分缺失或化学地或酶促地添加至抗体，参见例如Liuet al.,J.Pharm.Sci.97(2008),2426-2447；Beck et al.,Nat.Rev.Immunol.10(2010),345-352；Haberger et al.,MAbs.6(2014),327-339。
可以进一步修饰免疫球蛋白或其编码cDNA。因此，在另一实施方式中，本发明的方法包括产生嵌合抗体、鼠化抗体、单链抗体、Fab片段、双特异性抗体、融合抗体、标记抗体或其中任何一种的类似物的一个或多个步骤中的任何一个。相应的方法对于本领域技术人员是已知的并且描述于例如在以下中：Harlow and Lane"Antibodies,A LaboratoryManual",CSH Press,Cold Spring Harbor(1988)First edition；Second edition byEdward A.Greenfield,Dana-Farber Cancer
Figure BDA0003610104720000191
2014,ISBN 978-1-936113-81-1。例如，Fab和F(ab')2片段可以重组产生或通过免疫球蛋白分子的蛋白水解切割产生，使用酶诸如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab')2片段)。F(ab')2片段包含可变区、轻链恒定区和重链CH1结构域。这样的片段足以用于例如涉及将免疫球蛋白的免疫特异性部分与检测试剂诸如放射性同位素偶联的免疫诊断程序。
在一种实施方式中，本发明的抗体因此可以以选自由单链Fv片段(scFv)、F(ab')片段、F(ab)片段和F(ab')2片段、Fd、Fv、单链抗体和二硫键连接的Fv(sdFv)组成的组的形式提供和/或该抗体为嵌合鼠-人或鼠化抗体。
然而，如根据本发明的实施例所示，优选使用完整的IgG抗体，其中，该抗体包括恒定结构域。恒定结构域可以是天然的，即最初连同可变结构域克隆或是异源的，例如，在设想动物研究的情况下的鼠恒定结构域。优选地，恒定结构域是人源的，具有不同IgG亚型，例如IgG1与IgG4或分别与天然存在于人中的抗体的恒定结构域相比不同的同种异型和等位基因。“同种异型”的定义要求抗体试剂可用于从血清学上确定同种异型。如果仅在序列水平上进行确定，则必须将多态性描述为“等位基因”。如果已经实验证明对应等位基因-同种异型，或者如果单个序列与已证明的序列相同，则这不妨碍建立与同种异型的对应。
在本发明的优选实施方式中，恒定结构域分别与CDR以及VH和VL链中的至少一个是异源的，例如免疫球蛋白重链恒定结构域和/或免疫球蛋白轻链恒定结构域，优选IgG型的那些。另外，或替代地，抗体的异源部分可以是哺乳动物分泌信号肽。换言之，在一种实施方式中，本发明的抗Nogo-A抗体及其结合Nogo-A片段、合成衍生物和生物技术衍生物是(i)融合蛋白，包括与VH区和/或VL区或至少一个CDR异源的多肽序列；和/或(ii)多肽的非天然变体，衍生自免疫球蛋白，所述非天然变体包括相对于野生型多肽包括一个或更多个氨基酸缺失、置换和/或插入的重链恒定区。
如所提及的，存在五种免疫球蛋白同种型，其中，免疫球蛋白G(IgG)在人血清中含量最高。高度保守的四个亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定区有所不同，特别是其铰链和上部CH2结构域有所不同。这些区涉及与IgG-Fc受体(FcgR)和C1q两者的结合。因此，不同的亚类具有不同的效应物功能，无论是在触发FcgR表达细胞，导致吞噬作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，还是激活补体两个方面都如此。Fc区还包含新生儿Fc受体(FcRn)的结合表位，负责延长的IgG半衰期、胎盘转运和通过粘膜表面的双向转运。然而，FcRn也在骨髓细胞中表达，它连同经典的FcgR和补体参与吞噬作用和抗原呈递两者。这些特性、IgG多态性和呈糖基化形式的抗体的翻译后修饰如何影响IgG功能描述于Vidarsson et al.,(2014)IgG subclasses and allotypes:from structure to effectorfunction.Front.Immunol.5:520.doi:10.3389/fimmu.2014.00520and de Taeye et al.,Antibodies 2019,8,30；doi:10.3390/antib8020030。优选地，存在于本发明抗体中的免疫球蛋白重链和/或轻链恒定结构域是IgG型，最优选IgG4类或同种型。当期望降低免疫效应物功能时，人免疫球蛋白G同种型4(IgG4)抗体是抗体疗法的潜在候选者。
在本发明抗体的一种实施方式中，可以使用本领域已知的技术将Fc部分突变以减少免疫效应物功能。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其他方式)可以降低应用于脑脊液/CNS区室的修饰抗体与血脑屏障的跨上皮转运蛋白的Fc受体结合，从而增加其Nogo-A蛋白结合。在其他情况下，可能是与本发明一致的恒定区修饰缓和了补体结合，并且因此降低了血清半衰期和缀合的细胞毒素的非特异性结合。恒定区的还其他修饰可用于修饰二硫键或寡糖部分，由于增加的抗原特异性或抗体灵活性而允许增强的组织抗原相互作用。所得的生理特征、生物利用度及修饰的其他生化作用，诸如Nogo-A蛋白结合和中和、生物分布和血清半衰期，可以使用公知的免疫学技术容易地测量和量化，而无需过度实验。完全不与Fcγ受体(FcγR)和补体蛋白C1q结合的重组人IgG抗体(hIgG)，并且因此具有消除的免疫效应物功能，可用于各种治疗应用。发现Leu234Ala和Leu235Ala的组合(通常称为LALA突变)消除了FcγRIIa结合，并示出消除了IgG1和IgG4两者与FcγRI、IIa和IIIa的可检测结合，并且LALA-PG突变是相对于单独的LALA突变的改进，因为它们使小鼠和人IgG中的Fc功能无效；相应综述参见，例如，Saunders(2019)Conceptual Approaches toModulating Antibody Effector Functions and Circulation Half-Life.Front.Immunol.10:1296.doi:10.3389/fimmu.2019.01296和Schlothauer et al.,Protein Engineering,Design and Selection 29(2016),457-466。
IgG4抗体是能够经历称为Fab臂交换(FAE)的过程的动态分子。这导致具有未知特异性的功能性单价双特异性抗体(bsAbs)，并且因此可能会降低治疗疗效。如在实施例中说明的，在特定优选的实施方式中，本发明的抗体属于包括S228P突变的IgG4类或同种型。S228P突变防止体内和体外IgG4Fab臂交换，如使用新定量免疫测定和生理基质制备的组合所证明的那样；参见Silva et al.,J.Biol.Chem.290(2015),5462–5469。如实施例12中所证实，NG004 IgG 4S228P确实示出对C1q的反应性降低，并且表现与其他IgG4抗体，如那他珠单抗相似。
该领域的已知问题是反复冷冻-解冻循环会使抗体变性，引起其形成降低其结合能力(冷冻-解冻受损)的聚集体；参见例如，Abcam抗体储存指南。这种抗体劣化对治疗性抗体尤其有害，因为聚集或降解不仅会导致抗体活性降低，而且会导致免疫原性应答(Ishikawa et al.,Biol.Pharm.Bull.33(2010),1413-1417)。相比之下，本发明的抗体特别稳定。如尺寸排阻色谱法(SEC)所证明的，对抗体进行反复冷冻-解冻循环不会导致20x冷冻-解冻后的聚集和降解；参见实施例10和图9B。另外，可以示出，如通过SEC确定的，使本发明的抗体经历pH6至8之间的不同pH值不影响抗体的完整性；参见实施例10和图9A。不受理论的束缚，但由于先前的观察表明恒定结构域本身不是或不单独负责以适用于向人受试者施用的浓度的制剂的稳定性和/或适用性，因此可变区并且尤其是CDR和VH和VL分别被认为赋予抗体分子必要的完整性和稳定性。因此，本发明的抗体优选地至少包括根据上述任何定义的，优选地根据Kabat定义的以及最优选地分别在图1A或B中描绘的基本上完整的VH和VL氨基酸序列的CDR，然而可以允许约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、99％或100％的变化，尤其是在考虑保守氨基酸置换时。
本发明还涉及编码本发明的抗体或其抗原结合片段或其免疫球蛋白VH和VL的一种或多种多核苷酸，优选地，其中，一种或多种多核苷酸是cDNA。
在本发明的优选实施方式中，多核苷酸包括以下项、或基本上由以下项组成、或由以下项组成：具有编码如表II中描述的抗Nogo-A抗体的VH或VL链的多核苷酸序列的核酸。在这方面，本领域技术人员将容易理解编码轻链和/或重链的多核苷酸可以由一种或多种多核苷酸编码。因此，在一种实施方式中，多核苷酸包括以下项、或基本上由以下项组成、或由以下项组成：具有如表II中描述的抗Nogo-A抗体的VH和VL链的多核苷酸序列的核酸。
表II：本发明的抗体NG004和NG034的可变区(VH，VL)的核苷酸和氨基酸序列。加下划线的粗体核苷酸或氨基酸表示可变链序列中的CDR编码区。
Figure BDA0003610104720000231
在本发明的一种实施方式中，一种或多种多核苷酸与异源核酸连接，例如表达控制序列诸如启动子、转录和/或翻译增强子序列、内部核糖体结合位点、编码肽前导序列的核酸，用于在宿主中重组表达等。因此，本发明涉及编码人源重组抗Nogo-A抗体或其结合Nogo-A片段、合成衍生物或生物技术衍生物的多核苷酸，其中，该多核苷酸编码：
(i)如Kabat所定义的，包括CDR1、2和3的VH链，和/或包括VLCDR1、2和3的VL链，其中：
(a)VH-CDR1包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(b)VH-CDR2包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(c)VH-CDR3包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(d)VL-CDR1包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(e)VL-CDR2包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换，以及
(f)VL-CDR3包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换；和/或
(ii)VH链和/或VL链，其中：
(a)该VH链包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或多个氨基酸置换；和
(b)VL包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或多个氨基酸置换；
优选地，其中，VH和VL链氨基酸序列与SEQ ID NO:2和17分别具有至少90％的同一性；
(iii)如Kabat所定义的，包括CDR1、2和3的VH链，和/或包括VL CDR1、2和3的VL链，其中：
(a)VH-CDR1包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(b)VH-CDR2包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(c)VH-CDR3包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(d)VL-CDR1包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换，
(e)VL-CDR2包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换，以及
(f)VL-CDR3包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换；和/或
(iv)VH链和/或VL链，其中：
(a)该VH链包括SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或多个氨基酸置换；和
(b)VL包括SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或多个氨基酸置换；
优选地，其中，VH和VL链氨基酸序列与SEQ ID NO:12和17分别具有至少90％的同一性。
另外，本发明涉及与异源核酸连接的多核苷酸，其中，该多核苷酸选自由以下项组成的组：
(a)编码包括重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段的多核苷酸，该重链可变区(VH)包括分别具有SEQ ID NO：3、4和5中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中，该VH在与包括SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时与Nogo-A结合；
(b)编码包括VL的免疫球蛋白轻链或其片段的多核苷酸，该VL包括分别具有SEQID NO:8、9和10中所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中，该VL在与包括SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的VH配对时与Nogo-A结合；
(c)多核苷酸，其编码：
(i)包括VH的免疫球蛋白重链或其片段，该VH包括分别具有SEQ ID NO:3、4和5中所示的氨基酸序列的CDR1、2和3；和
(ii)包括VL的免疫球蛋白轻链或其片段，该VL包括分别具有SEQ ID NO:8、9和10中所示的氨基酸序列的CDR1、2和3；
(d)编码包括VH的免疫球蛋白重链或其片段的多核苷酸，该VH包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，其中，该VH在与包括SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的VL配对时与Nogo-A结合；
(e)编码包括VL的免疫球蛋白轻链或其片段的多核苷酸，该VL包括SEQ ID NO:7所示氨基酸序列，其中，该VL在与包括SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的VH配对时与Nogo-A结合；
(f)编码包括VH的免疫球蛋白重链或其片段以及编码包括VL的免疫球蛋白重链或其片段的多核苷酸，该VH包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，该VL包括SEQ ID NO:7所示氨基酸序列；
(g)如(a)-(f)中任一项所述的多核苷酸，其中，CDR包括一个或多个、优选不超过两个氨基酸置换和/或可变区序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7具有至少90％的同一性。
替代地，本发明涉及与异源核酸连接的多核苷酸，其中，该多核苷酸选自由以下项组成的组：
(a)编码包括重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段的多核苷酸，该重链可变区(VH)包括分别具有SEQ ID NO：13、14和15中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中，该VH在与包括SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时与Nogo-A结合；
(b)编码包括VL的免疫球蛋白轻链或其片段的多核苷酸，该VL包括分别具有SEQID NO:18、19和20中所示的氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中，该VL在与包括SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的VH配对时与Nogo-A结合；
(c)多核苷酸，其编码：
(i)包括VH的免疫球蛋白重链或其片段，该VH包括分别具有SEQ ID NO:13、14和15中所示的氨基酸序列的CDR1、2和3；和
(ii)包括VL的免疫球蛋白轻链或其片段，该VL包括分别具有SEQ ID NO:18、19和20中所示的氨基酸序列的CDR1、2和3；
(d)编码包括VH的免疫球蛋白重链或其片段的多核苷酸，该VH包括SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，其中，该VH在与包括SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的VL配对时与Nogo-A结合；
(e)编码包括VL的免疫球蛋白轻链或其片段的多核苷酸，该VL包括SEQ ID NO:17所示氨基酸序列，其中，该VL在与包括SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的VH配对时与Nogo-A结合；
(f)编码包括VH的免疫球蛋白重链或其片段以及编码包括VL的免疫球蛋白重链或其片段的多核苷酸，该VH包括SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，该VL包括SEQ ID NO:17所示氨基酸序列；
(g)如(a)-(f)中任一项所述的多核苷酸，其中，CDR包括一个或多个、优选不超过两个氨基酸置换和/或可变区序列与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:17具有至少90％的同一性。
此外，本发明涉及一种或多种运载体，该一种或多种运载体包括这些多核苷酸中的一种或多种，优选地，其中，该运载体是表达运载体并且该一种或多种多核苷酸可操作地连接至表达控制序列。
可以使用本领域公知的用于操作核苷酸序列的方法，例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等来产生多核苷酸，并且如果需要，可以对其操作(参见例如，Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Fourth Edition):Three-volume set；Green and Sambrook(2012)ISBN 10:1936113422/ISBN 13:9781936113422Cold Spring Harbor Laboratory Press；update(2014)ISBN 978-1-936113-42-2和Ausubel et al.,eds.,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,NY(1998)及其更新中描述的技术，其全部内容通过援引均并入本文)，以生成具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸置换、缺失和/或插入。
一旦获得了编码本发明的抗体分子或抗体的重链或轻链或其部分(优选包含重链或轻链可变结构域)的多核苷酸，则可以使用本领域公知的技术通过重组DNA技术生产用于生产抗体分子的运载体。因此，本文描述了用于通过表达包含编码核苷酸序列的抗体的多核苷酸来制备蛋白的方法。本领域技术人员公知的方法可以用于构建包含抗体编码序列和适当的转录和翻译控制信号的表达运载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。因此，本发明提供了可复制运载体，其包括编码本发明抗体分子或者其重链或轻链，或者重链或轻链可变结构域的核苷酸序列，可操作地连接至启动子。这样的运载体可以包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(参见例如国际申请WO86/05807和WO89/01036；以及美国专利号5,122,464)并且抗体的可变结构域可以被克隆到这种运载体用于表达整个重链或轻链。
本文所用的术语“运载体”或“表达运载体”意指根据本发明用作负载体以将期望基因引入宿主细胞并在宿主细胞中表达的运载体。如本领域技术人员所知，此类运载体可以容易地选自由质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒组成的组。一般而言，与本发明相容的运载体将包括选择标志物、适当的限制性位点以促进期望基因的克隆以及进入真核或原核细胞和/或在真核或原核细胞中复制的能力。该标志物可以为营养缺陷型宿主提供原营养、杀生物剂抗性(例如抗生素)或对重金属诸如铜的抗性。选择性标志物基因可以直接连接至待表达DNA序列，或者也可以通过共转化引入同一细胞中。mRNA的最佳合成可能还需要额外的元件。这些元件可以包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。对于双链抗体的表达，编码重链和轻链两者的一个或更多个运载体可以在宿主细胞中共表达用于表达整个免疫球蛋白分子，如在下文中所详述的。
宿主细胞可以用本发明的两种表达运载体共转染，第一种运载体编码重链衍生的多肽，以及第二种运载体编码轻链衍生的多肽。两种运载体可以包括相同的选择标志物，使重链多肽和轻链多肽能够同等表达。替代地，可以使用编码重链多肽和轻链多肽两者的单一运载体。在这种情况下，轻链有利地置于重链之前以避免过量的无毒重链；参见Proudfoot,Nature 322(1986),52；Kohler,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980),2197。重链和轻链的编码序列可以包括cDNA或基因组DNA。通过常规技术将一个或多个表达运载体转移到宿主细胞中，并且然后通过常规技术培养转染的细胞以产生用于本文所述方法的抗体。因此，本发明还涉及包括本发明的一种或多种多核苷酸或者一种或多种运载体的宿主细胞。
如本文所用，“宿主细胞”是指含有使用重组DNA技术构建并编码至少一种异源基因的运载体的细胞。在对从重组宿主中分离抗体的过程的描述中，除非另有明确说明，否则术语“细胞”和“细胞培养物”可互换用于表示抗体来源。换言之，从“细胞”中回收多肽可以意指从旋转下来的全细胞或从包含培养基和悬浮细胞两者的细胞培养物中回收。
目前，几乎所有治疗性抗体仍然在哺乳动物细胞系中产生，以降低由于改变的非人糖基化模式引起的免疫原性风险。然而，糖基化工程酵母、昆虫细胞系和转基因植物的最新发展使得有望获得具有“类人”翻译后修饰的抗体。此外，更小的抗体片段，包括没有任何糖基化的双特异性抗体，已在细菌中成功生产，并已进入临床试验。来自非哺乳动物来源的第一批治疗性抗体产品有望在未来几年内推出。于2013年7月29日在线公开，doi:10.3389/fimmu.2013.00217的Frenzel et al.,Front Immunol.2013；4:217中给出了对可以应用于制备本发明的人源重组抗Nogo-A抗体或其结合Nogo-A片段、合成衍生物或生物技术衍生物的现有抗体生产系统，包括它们对不同应用的可用性进行了综述，并且由Vazquez-Lombardi et al.,Nature protocols 13(2018),99-117；and Hunter et al.,Optimization of protein expression in mammalian cells.Current Protocols inProtein Science 95(2019),e77.doi:10.1002/cpps.77中对哺乳动物细胞中人抗体的瞬时表达进行了描述。
一旦本发明的抗体分子已经被重组表达，则本发明的整个抗体、其二聚体、单独的轻链和重链、或其他免疫球蛋白形式都可以根据本领域的标准程序来纯化，包括例如通过色谱法(例如，离子交换、亲和力，特别是通过对蛋白A后的特异性抗原的亲和力，以及尺寸柱色谱法)、离心、差异溶解度，例如硫酸铵沉淀，或通过用于纯化蛋白的任何其他标准技术；参见，例如，Scopes,"Protein Purification",Springer Verlag,N.Y.(1982)和Antibodies A Laboratory Manual 2nd edition,2014by Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,USA。因此，本发明还涉及用于制备抗Nogo-A抗体和/或其片段或其一条或多条免疫球蛋白链的方法，所述方法包括：
(a)在允许表达抗Nogo-A抗体、其结合Nogo-A片段或者一条或多条免疫球蛋白链的条件下培养如上文所定义的宿主细胞，该细胞包括如上文所定义的一种或多种多核苷酸或一种或更多种运载体；和
(b)从培养物中分离抗Nogo-A抗体、结合Nogo-A片段或其一条或多条免疫球蛋白链。
此外，本发明还涉及由如上文定义的多核苷酸编码和/或可通过用于上述重组生产它们的方法获得的抗Nogo-A抗体、其结合Nogo-A片段和一条或多条免疫球蛋白链。
在某些实施方式中，抗体多肽包括通常不与抗体结合的氨基酸序列或者一个或更多个部分。在下文中更加详细的描述了示例性修饰。例如，本发明的抗体或其结合Nogo-A片段如单链Fv抗体片段可以包括柔性接头序列，或可以被修饰以添加功能部分或可检测标记(例如PEG、药物、毒素，或标记诸如荧光、化学发光、放射性、酶、核磁、重金属、标签、标志等)；例如，通用技术参见Antibodies A Laboratory Manual 2nd edition,2014by ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,USA；动态细胞成像的荧光标记策略的进展参见Dean and Palmer,Nat.Chem.Biol.10(2014),512–523；以及抗体药物缀合物和抗体模拟物的基于酶的标记策略参见Falck and Müller,Antibodies 7(2018),4；doi:10.3390/antib7010004。
本发明的抗体多肽可以包括融合蛋白、基本上由融合蛋白组成或由融合蛋白组成。融合蛋白是嵌合分子，其包括例如具有至少一个靶标结合位点的免疫球蛋白结合Nogo-A结构域和至少一个异源部分，即在自然界中不与其天然连接的部分。氨基酸序列通常可以存在于在融合多肽中结合在一起的单独蛋白中，或者它们可以通常存在于相同蛋白中但在融合多肽中以新的排列方式放置。例如，可以通过化学合成或通过产生和翻译其中肽区以所期望关系编码的多核苷酸来产生融合蛋白。
应用于多核苷酸或多肽的术语“异源的”意指该多核苷酸或多肽源自与之比较的实体的其余部分不同的实体。例如，如本文所用，待与抗体或其抗原结合片段、变体或类似物融合的“异源多肽”衍生自相同物种的非免疫球蛋白多肽，或不同物种的免疫球蛋白或非免疫球蛋白多肽。
人源重组抗Nogo-A抗体或其结合Nogo-A片段、合成衍生物或生物技术衍生物任选地作为融合蛋白和/或如上文所述标记然后根据本领域已知的标准技术提供用于各种应用；参见，例如，Antibodies A Laboratory Manual 2nd edition,2014by Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,USA。Sifniotis et al.,Antibodies 2019,8(2),36；https://doi.org/10.3390/antib8020036中描述了治疗性抗体设计、制造和制剂的当前进展，其中还讨论了用于战略设计具有调节功能的抗体的计算方法的进展。
本发明涉及组合物，其包括本发明的上述结合Nogo-A分子例如抗体或其结合Nogo-A片段、变体或生物技术衍生物，或者如上文所定义的本发明的一种或多种多核苷酸、一种或多种运载体或细胞。在一种实施方式中，本发明的组合物是药物组合物并且进一步包括药学上可接受的载体。
本发明的一种或多种多核苷酸和包括所述一种或多种多核苷酸的组合物可以用于治疗方法。例如，在Hoecke and Roose,J.Transl.Med.17(2019),54中总结了将呈DNA或mRNA形式的编码核苷酸序列的抗体用于治疗剂的用途。这些核苷酸序列可以直接向待治疗的受试者施用，允许原位产生相应的抗体。此外，Schlake et al.,Cellular andMolecular Life Sciences 76(2019),301-328描述了体内基于DNA的抗体表达以及相应的质粒和病毒运载体，例如用于治疗方法和被动免疫疗法的通过体外转录(IVT)制备的腺相关病毒(AAV)和mRNA构建体。一般而言，RNA疫苗接种是不断扩展的领域，其具有的应用来自癌症免疫疗法、神经退行性疾病、传染病、组织再生和蛋白替代疗法。
因此，本发明的一种或多种多核苷酸包括RNA并且可以用于细胞中的翻译以用于治疗剂。因此，本发明的一种或多种多核苷酸，尤其是RNA可以用于在靶细胞中生成本发明的抗体。用于生产合适RNA的各种方法是本领域技术人员已知的并且是商购的，例如，用于体外转录、RNA加帽和用于制造poly(A)尾mRNA以在细胞中翻译的试剂盒。在WO2008/083949A2中描述了用于表达相应抗体的编码抗体的未经修饰和经修饰RNA以及转录方法和用于表达抗体的方法。在WO2009/127230A1中描述了适合抑制和/或避免先天免疫刺激应答的经修饰(m)RNA。此外，已经开发出通过CELLSCRIPTTM使用的技术，其中，RNA包含假尿苷(Ψ)和/或5-甲基胞苷(m5C)代替相应的U或C标准核苷(canonical nucleoside)。与不包含经修饰核苷的相应mRNA相比，这样的RNA已示出具有较低的免疫原性并以高得多的水平翻译成蛋白。例如Karikóet al.,Immunity 23(2005),165-175,Karikóet al.,MolecularTherapy 16(2008),1833-1840和Anderson et al.,Nucleic Acids Res 38(2010),5884-5892中描述了相应的技术。此外，EP 1604688 A1描述了具有增强的G/C含量和优化的密码子使用的稳定化和翻译优化的mRNA。例如，在Kormann et al.,Nature Biotechnology 29(2011),154-157and WO 2007/024708 A2中描述了用于修饰RNA的其他方法。
因此，在一种实施方式中，本发明的一种或多种多核苷酸是RNA，其可以是未经修饰或如上所述经修饰并且适用于翻译成相应抗体的mRNA或其衍生物。
如上所述，本发明涉及包括本发明的多核苷酸的运载体。在一种实施方式中，运载体是基因转移运载体，例如腺相关病毒(AAV)运载体。用于使用AAV运载体治疗神经退行性疾病的治疗方法例如描述于WO 2015/035190 A1和Lui et al.,The Journal ofNeuroscience 36(2016),12425–12435中，两者都与AAV运载体抗tau抗体有关。这样的构建体可以用于将编码抗体的基因直接递送至大脑，从而绕过血液：脑屏障。此外，WO2017/189963A1总体上描述了具有病毒基因组的新型AAV颗粒以及使用这些构建体(例如，VAD)来治疗、预防、诊断和研究疾病、疾患和/或病症的方法，该病毒基因组经工程化以编码抗体和基于抗体的组合物。Qu et al.,Neural Regen Res 14(2019),931-938中综述了AAV在中枢神经系统中神经退行性疾病中的进展和临床应用。
由于许多有利的特征，AAV运载体广泛用于基因疗法的方法中。AAV在受感染的细胞中不复制，并且因此与任何已知的疾病无关。此外，可以将AAV引入多种宿主细胞中，而不整合到宿主细胞的基因组中，并且能够感染休眠细胞和分裂细胞两者。AAV在体内转导非复制和长寿命细胞，从而导致目标蛋白的长期表达。另外，可以利用细胞和分子生物学技术操作AAV，以产生携带编码在AAV病毒基因组中的有效载荷的无毒颗粒，可以递送到靶组织或细胞系而副作用有限或没有副作用。鉴于上述，使用AAV进行运载体抗体递送将允许更持久的疗效、更少的剂量治疗以及在整个治疗时期更一致的抗体水平。
AAV是细小病毒科的成员，并且包括少于约5,000个核苷酸的线性、单链DNA基因组。AAV需要与辅助病毒(即腺病毒或疱疹病毒)共同感染，或辅助基因的表达，用于有效复制。用于施用治疗性核酸的AAV运载体通常缺失大约96％的亲本基因组，使得仅保留包含DNA复制和包装的识别信号的末端重复(ITR)。这消除了由于病毒基因表达引起的免疫学或毒副作用。另外，如果需要，递送特异性AAV蛋白至生产细胞能够将包括AAV ITR的AAV运载体整合到细胞基因组的特定区中(参见，例如，美国专利6,342,390和6,821,511)。包括整合的AAV基因组的宿主细胞在细胞生长或形态中没有示出变化(参见，例如，美国专利4,797,368)。可以使用本领域已知的任何AAV血清型生成AAV运载体。若干AAV血清型和超过100种AAV变体已从腺病毒库或从人或非人灵长类动物组织中分离出来(例如，Wu et al.,Molecular Therapy 14(3),(2006),316中有综述)。
除了编码本发明抗体或其抗原结合片段的核酸序列外，AAV运载体还可以包括表达控制序列，诸如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、转录终止子、内部核糖体进入位点(IRES)等，其提供核酸序列在宿主细胞中的表达。示例性表达控制序列在本领域中是已知的并且描述于例如Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology,Vol.185,Academic Press,San Diego,CA.(1990)中。
因此，本发明涉及基因转移运载体，其包括编码本发明抗体的分离的核酸序列。该基因转移运载体可以是如上所述的腺相关病毒(AAV)运载体。
本发明还分别提供呈包装或试剂盒形式的药物和诊断组合物，其包括一个或多个容器，该容器填充有一种或多种上述成分，例如本发明的抗Nogo-A抗体、其结合Nogo-A片段、生物技术衍生物或变体、多核苷酸、运载体或细胞。与这样的一个或多个容器相关的可以是由管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，该通知反映由该机构批注的用于人施用的制造、使用或销售。另外或替代地，该试剂盒包括用于适当的基于免疫的诊断测定的试剂和/或说明书。该组合物，例如本发明的试剂盒当然特别适用于伴随Nogo-A存在的疾病或疾患的风险评估、诊断、预防和治疗，并且尤其适用于治疗如上本文所讨论的通常与Nogo-A相关的疾患。
本发明的药物组合物可以根据本领域公知的方法进行配制；参见例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy(2000)by the University ofSciences in Philadelphia,ISBN 0-683-306472。合适的药物载体的实施例在本领域中是公知的，并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂诸如油/水乳剂、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。包括此类载体的组合物可以通过公知的常规方法配制。关于基于RNA的组合物，在国际申请WO 2020/089342 A1、WO 2019/207060A1和WO 2018/232355A1中，分别描述了用于向受试者有效施用RNA的基于脂质的制剂和基于聚合物的制剂。此外，Perche et al.,Molecular Therapy:Nucleic Acids 17(2019)中描述了将RNA封装到中性脂质多聚复合物(lipopolyplex)(LPP)中。Romani et al.,Scientific Reports 7(2017),10863还描述了用于RNA-脂质复合物静脉内施用的方法。这些药物组合物可以以合适的剂量向受试者施用。合适组合物的施用可以通过不同的方式，例如通过静脉内、腹腔内、皮下、肌肉内、鼻内、玻璃体内、局部或真皮内施用或脊或脑递送来实行。气溶胶制剂诸如鼻喷雾制剂包括活性剂与防腐剂和等渗剂的纯化水溶液或其他溶液。优选地将这样的制剂调节至与鼻粘膜相容的pH和等渗状态。
给药方案将由主治医师和临床因素确定。正如在医学领域中所公知的，任何一位患者的剂量都取决于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康以及同时施用的其他药物。
由于其生长限制特性，Nogo-A会对神经系统损伤和疾病具有负面作用。因此，与其各种神经生物学作用相关，Nogo-A与一系列CNS损伤和疾病有关。原则上，将Nogo-A相关疾病理解为与神经和/或血管修复相关的神经系统的疾病或创伤。Nogo-A抑制被认为在外周(PNS)和中枢(CNS)神经系统的各种疾病中具有有益作用，即更特别是在神经退行性疾病诸如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、路易(Lewy)样病理或其他一般性痴呆，颅脑损伤，颅侧、脑或脊创伤后的疾病，卒中或脱髓鞘性病变。这种脱髓鞘性病变包括但不限于多发性硬化、单相脱髓鞘(monophasic demyelination)、脑脊髓炎、多灶性白质脑病、全脑炎、马-比二氏(Marchiafava-Bignami)病、脑桥髓鞘溶解、肾上腺脑白质营养不良、佩利措伊斯-梅茨巴赫(Pelizaeus-Merzbacher)病、海绵变性、亚历山大(Alexander's)病、卡纳万(Canavan's)病、异染性脑白质营养不良和克拉伯(Krabbe's)病。
另外，退行性眼疾患可以直接或间接涉及视网膜或角膜细胞的变性，包括一般性缺血性视网膜病变、前部缺血性视神经病变、所有形式的视神经炎、湿性和干性年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、囊样黄斑水肿(CME)、视网膜色素变性、斯塔夏茨(Stargardt's)病、贝斯特氏(Best's)卵黄状视网膜变性、雷伯氏(Leber's)先天性黑矇及其他遗传性视网膜变性、病理性近视、早产儿视网膜病变和莱伯氏(Leber's)遗传性视神经病变、角膜移植或屈光角膜手术的后遗症和疱疹性角膜炎。此外，已示出，Nogo-A可以在精神病症中，尤其是在精神分裂症和抑郁症中发挥作用。
体内研究证实，用本发明的抗体治疗使得小鼠卒中模型中需要精细运动控制的活动任务得到更好恢复，如不规则的水平阶梯交叉示出；参见实施例11和图10。
因此，本发明还涉及治疗与Nogo-A相关的疾病或疾患的方法，该疾病或疾患包括上述那些，优选PNS或CNS疾病，该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的前述结合Nogo-A分子、抗体、多核苷酸、运载体或细胞中的任一种。原则上，本发明的抗Nogo-A抗体适用于治疗与本文“背景技术”上文提及部分中引用的先前抗Nogo-A抗体相关的参考中公开的相同的疾病和疾患。
在进一步的实施方式中，可以期望可用于治疗与Nogo-A相关的PNS或CNS疾病、疾患或症状的其他剂共同施用或依次施用。例如，本发明的抗体或其结合Nogo-A片段、变体或生物技术衍生物可以与以下项组合施用：抗炎剂诸如但不限于卒中或脊髓损伤后作为用于阻断进一步神经元受损的手段和抑制轴突再生的皮质类固醇，神经营养因子诸如神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)，或用于神经退行性疾病的其他药物诸如ExelonTM(利斯的明(Rivastigmine))或左旋多巴(Levodopa，L-DOPA(3,4-二羟基-L-苯丙氨酸))。用于治疗卒中的其他合适的组合配偶体是阿替普酶和去氨普酶(DSPA，例如，在WO90/09438中公开)。在一种实施方式中，本发明提供了包括本发明的抗体或结合Nogo-A片段和去氨普酶，尤其用于治疗卒中的组合，以及包括所述组合的药物组合物。如本文所用，当两种剂同时施用或以使得剂将同时作用的方式独立施用时，两种药剂被称为联合施用。
由代号、通用或商品名称标识的活性成分的结构可以获自标准纲要“默克索引”的实际版本或来自数据库，例如国际专利(例如IMS World Publications)或由IMS Health提供的其他数据库。
在另实例中，可以将表达本发明的抗体或其结合Nogo-A片段、变体或衍生物的细胞移植到脊髓损伤部位以促进整个损伤部位的轴突生长。这种移植的细胞将提供用于在损伤或创伤后恢复脊髓功能的手段。这些细胞可以包括胎儿神经或组织移植物的不同谱系的嗅鞘细胞和干细胞。
在本说明书的全文中引用了若干文件。全部引用的参考(包括文献参考、已发布的专利、包括背景部分和制造商的说明书、说明等的在本申请中引用的已公布专利申请)的内容均通过援引明确并入本文；然而，不承认引用的任何文件确实是本发明的现有技术。
通过参考以下具体实施例可以获得更完整的理解，这些实施例仅出于说明目的提供，而不旨在限制本发明的范围。
实施例
实施例1：抗Nogo-A抗体的分离和鉴定
利用Reverse Translational MedicineTM(RTMTM)技术鉴定靶向Nogo-A的人源抗体，该技术是Neurimmune AG的专有技术平台，最初在国际申请WO2008/081008中进行了描述，但经过修改、进一步精炼并特别适用于靶标Nogo-A。
实施例2：抗体序列的确定和重组表达
上文鉴定的抗Nogo-A抗体的可变区的氨基酸序列分别基于从人记忆B细胞获得的mRNA和cDNA序列确定；参见图1A、B。具有人或小鼠恒定结构域的全人IgG1抗体的重组表达基本上如WO2008/081008的实施例中所述进行，例如，如第99页和第100页的方法部分中所述。
通过与数据库诸如Abysis(http://www.bioinf.org.uk/abysis/)中可用的参考抗体序列进行比较来确定框架和互补决定区，并使用Kabat编号方案(http://www.bioinf.org.uk/abs/)注释。
实施例3：结合特征
神经突生长晕抑制剂Nogo-A包含3个抑制区。两个与剪接变体Nogo-B(Nogo-66位于两个跨膜区和N末端尖端的NIR结构域之间)共有，以及一个与剪接变体Nogo-C(Nogo-66)共有。Nogo-A神经突生长晕的独特、高度抑制结构域位于Nogo-A的外显子3中，并且称为Δ20区(d20；人aa第566-748位)(Oertle et al.,J.Neurosci.23(2003),5393-5406)。为了确认抗体NG004 NG034的结合特性并监测与其他物种如大鼠的交叉反应性，用包含d20区加抑制区(人aa第543-866位)的一些额外氨基酸C末端和N末端的片段进行ELISA。该片段被称为大鼠或人d20加，并且在大肠杆菌(E.coli)中重组产生。为了检查抗体与d20加区的强结合，并比较主题抗体NG004和NG034与已知抗体(11C7和Ozanezumab)的结合特性，使用ELISA并比较EC50值。
根据标准方案(Engvall&Perlmann,J.Immunol.109(1972),129–135,Engvall&Perlmann,Immunochemistry 8(1971),871–874)进行ELISA。简而言之，用3μg/ml的大鼠或人序列衍生的d20加包被ELISA板，用5％乳粉(Rapilait，Migros)封闭并用NG004探测。每个板包含作为内标系列稀释的11C7和/或Ozanezumab。最后，将板与相应的第二抗体(11C7与抗小鼠HRP(Invitrogen,A16078)、NG004和Ozanezumab与抗人HRP(Sigma,A0170-1ML))孵育。用TMB底物(ThermoFisher)对板进行显影并用1M HCl终止。在Tecan Sparc读板器上进行读数。
如图2A示出，NG004在生理pH下，以在低nM范围内的高亲和力结合人d20加区，具有的EC50为0.26nM。抗体11C7的EC50值为0.14nM以及对于Ozanezumab为0.20nM。相应的大鼠肽d20加仅被NG004弱结合(图2B)。这些数据证实Δ20区是Nogo-A蛋白内的活性结合位点。
如图2C和D示出，NG034在生理pH下，以在低nM范围内的高亲和力结合人和大鼠两者的d20加区，具有的人形式的EC50为0.298nM，以及大鼠形式的EC50为0.229nM。
另外，已经示出NG004和NG034阳性地染色大鼠胼胝体少突胶质细胞(未固定)(图2E)、大鼠胼胝体脊髓(固定)以及固定的人MO3.13、大鼠NS-1细胞以及大鼠CNS组织中的少突胶质细胞和运动神经元，其中染色模式与例如Ozanezumab的染色模式相似。
实施例4：评估抗体NG004的结合表位
使用对重叠肽的扫描进行NG004的表位作图。将Nogo-A的d20加区序列(人Nogo-A的aa543-866)合成为线性15聚体肽，在各个肽之间具有11个氨基酸重叠。将这些肽点在硝酸纤维素膜(JPT Peptide Technologies，Berlin，Germany)上。将膜在甲醇中活化5min，并在RT下在TBS中洗涤10min。在RT下用
Figure BDA0003610104720000381
-Block(Carl Roth GmbH+Co.KG德国，卡尔斯鲁厄)将非特异性结合位点封闭2小时。在室温下将NG004(1μg/ml)在
Figure BDA0003610104720000391
-Block中孵育3小时。使用HRP缀合的驴抗人IgG第二抗体确定初次抗体的结合。使用ECL和Image Quant 350检测(GEHealthcare，Otelfingen，瑞士)显影和评价印迹。
抗体NG004识别点34、35和36(图3，白框)，它们对应于Nogo-A的d20加区内的序列141-INAALQE-147。此外，已经进行了丙氨酸和截断扫描，以确认鉴定的最小表位。
实施例5：竞争测定
该测定是基于由Kwak&Yoon,J.Immunol.Methods 191(1996),49-54提供的方法。尤其，包被抗原hu d20+，随后用在TBS-0.1％吐温20中的5％乳粉封闭。封闭后，在特定抗体的EC50浓度或更高浓度下孵育竞争抗体11C7和Ozanezumab。洗涤后，将NG004或NG034的小鼠IgG1或人IgG4同种型以30μg/ml(200nM)的浓度开始以系列稀释添加到孔中。经12次稀释进行了3倍连续稀释。如果发生与竞争者抗体的竞争，则将导致NG004或NG034的结合降低，示出为EC50值的变化和/或高浓度平台的吸光度值减少。
NG004未示出与抗体Ozanezumab(图4A)和11C7(图4B)竞争性结合Nogo-A。NG034未示出与抗体11C7和NG004竞争性结合Nogo-A(图4C)。
实施例6：体内模型中的靶标参与
经由渗透性微型泵(Alzet 2ML1泵)向完好的成年大鼠(LongEvans,Janvier)在脊髓腰经鞘内以10μl/h的泵送速率施用抗体，持续7天。在此时期之后，处死动物并处理组织以评价抗体对生物标志物的作用。尤其，将动物麻醉并经心脏灌注盐水随后经心脏灌注4％福尔马林。然后将CNS组织样品包埋入OCT封固介质中，冷冻并在低温恒温器上切割。在选定的生物标志物即Nogo-A、Nogo-B和NgR1上测试注入的抗体NG004.m1、11C7(阳性对照)和同种型对照抗BrdU(AbDSerotec)的作用。
用Prism7.0(GraphPad Software Inc.)和R(R版本3.4.1)进行了统计分析。对于随时间推移的组内统计检验，使用常规的单向ANOVA随后为Dunnett多重比较检验。为了检测组间和组内随时间的差异以及对超过两个组随时间的比较，将使用具有重复测量的双向ANOVA，随后为Tukey多重比较检验。将所有实验的显著性阈值设置为*P<0.05。较小的P值表示为**P<0.01和***P<0.001。在条形图中，所有数据都绘制为平均值±SEM(平均值的标准误差)。在箱线图中，数据表示为中位数±第25百分位(方框)和最小/最大(须(whisker))。在所有图表中，点代表动物个体。
如通过免疫荧光染色评估，在分别用2mg和4mg NG004治疗大鼠进行的鞘内治疗，持续1周，使得CNS中内源性Nogo-A蛋白水平下调(图5A)。将抗体11C7用作阳性对照。相比之下，NG004和11C7上调CNS中的内源性Nogo-B蛋白水平(图5B)。与用对照抗BrdU抗体治疗的大鼠相比，用抗Nogo-A抗体NG004和11C7输注7天的大鼠海马CA3区示出显著更高的NgR1荧光强度。因此，NgR1显著上调(图5C)。
实施例7：LTP测定
已经示出用抗体11C7中和Nogo-A显著增加小鼠海马中的长时程突触可塑性(长时程强化，LTP)(Delekate et al.,PNAS 108(2011),2569-2574)。根据公布的协议(Delekateet al.(2011),supra)，对NG004增加LTP的效力进行了分析。
如图6B示出，NG004表现出与阳性对照11C7相似的离体活性(比较图6A和B)。另外，更高剂量的NG004(25μg/ml)会增加作用大小和起效。
实施例8：体外神经突生长测定
为了评估抗Nogo-A抗体的生物活性，进行了神经突生长抑制测定。当用粗制脑和脊髓清洁剂提取物(含有Nogo-A的提取物)处理培养的神经元细胞时，神经突生长晕受到抑制。早期的研究示出，这种抑制活性可以通过针对Nogo-A的特异性抗体例如11C7、ATI355或Ozanezumab中和约20％(Oertle et al.(2003),supra；Liebscher et al.(2005),supra；Weinmann et al.,Mol.Cell Neurosci.32(2006),161-173)。该测定是根据由Rubin etal.,Europ.J.Neurosci.7(1995),2524-2529建立的方案与改编来进行的，其中，示出大鼠脊髓提取物或非人灵长类CNS提取物(CNSE)(包含Nogo-A)抑制原代神经元或神经母细胞瘤细胞的神经突生长，并且通过功能活性的抗Nogo-A抗体进行这种抑制的部分逆转/中和。测试了NG004和NG034与阳性对照抗Nogo-A抗体11C7和ATI355相比的生物活性。
N1E-115细胞系由T.Amano、E.Richelson和M.Nirenberg于1971年通过克隆C-1300自发性小鼠神经母细胞瘤肿瘤而建立。N1E-115细胞由美国标准培养物收藏所(AmericanType Culture Collection，ATCC)提供；订购号：
Figure BDA0003610104720000411
CRL-2263.为了分化，贴壁的N1E-115细胞在48孔板于分化培养基(补充有2％L-谷氨酰胺的
Figure BDA0003610104720000412
培养基)中生长。收获细胞并重悬于无血清分化培养基中以获得2.2×104个细胞/ml的细胞悬浮液密度。然后将每孔450μl的细胞悬浮液铺板到48孔板中，得到最终密度为每孔1×104个细胞，并在37℃下于5％CO2在加湿培养箱中孵育24小时，然后添加抑制性提取物和测试抗体。
为了确保独立测定的可比性，每次进行新的CNS提取物制备时，都需要确定CNS提取物的半最大抑制(HMI50)值。用每个浓度三个孔进行确定CNS提取物的HMI50值的程序，如下：将CNS提取物以逐渐增加的浓度(5μg/ml、10μg/ml、12.5μg/ml、15μg/ml 20μg/ml、40μg/ml)添加到在PBS中预混至每孔50μl的最终体积的N1E-115细胞中。24小时后，对细胞进行固定并用考马斯染色用于分析。使用半自动化IN细胞分析仪2500HS对经考马斯染色的细胞成像，其中在预定位置获取每个孔的八张10×明场图像，分析其中四张以确定HMI50值。HMI50值是基于形态学标准通过眼睛评估的：对于溶剂对照(PBS)，大约80％的N1E-115细胞示出中长神经突；由例如12.5μg/mlCNS提取物，带神经突的细胞数目减少到60％；由例如20μg/mlCNS提取物，带神经突的细胞数目减少到40％；由例如40μg/mlCNS提取物，带神经突的细胞的数目减少到几乎0％。基于这些形态学标准，可以将HMI50值定义为与溶剂对照条件相比，50％的细胞示出带有神经突的细胞形态。对于使用相同来源的CNS提取物的每个实验，HMI50值保持恒定。如果制备了新的CNS提取物，则需要再次确定HMI50。
用CNS提取物和待测试抗体(NG004.h4.m1-骨架人IgG4S228P；NG004.m1-骨架小鼠IgG1)处理N1E-115细胞，并孵育另外的24小时，然后固定，进行考马斯染色和图像采集。为了分析TIFF图像，使用Fiji(ImageJ软件)的内置栅格插件和细胞计数器插件。基于物镜放大率将像素转换为μm2。将计数框架栅格叠加到图像上，线之间的每个点大小(21'708.8μm2)具有固定面积。通过使用计算机鼠标，通过Fiji细胞计数器软件插件对每个图像(计数器1)的细胞体进行标记和计数。同样，对神经突(长于细胞体直径的突起)和栅格线(计数器2)之间的交叉点进行标记。为了精确量化神经突的生长晕，设置了特定的截止值：(a)当细胞体接触相框外边界时不计数；(b)当突起长于细胞体直径时，突起被认为是神经突；(c)与计数框外边界的交叉点不计算在内；(d)死细胞被排除在计数之外。通过圆形和小形态在视觉上判断那些被认为的死细胞(Ronn et al.,J.Neurosci.Methods 100(2000),25-32)。然后通过以下公式计算交叉点数和细胞数之间的所得比率：每个细胞的平均神经突生长晕＝交叉点总数/细胞总数。
对于每个实验条件，对三个孔重复/实验和三个独立实验中的每一个的四个图像进行了分析。用GraphPad Prism 7.03软件进行数据绘图和统计分析。使用事后单向ANOVA统计分析数据。
如图7A和B示出，用抗体NG004治疗分化的大鼠CNS提取物处理的N1E-115细胞刺激神经突生长晕，即，Nogo-A诱导抑制神经突生长晕被逆转。NG004对这种作用的IC50值为11.16nM，以及阳性对照抗体11C7的IC50值为19.34nM。此外，图7C和7D示出抗Nogo-A抗体NG004和NG034表现出与内参考抗体ATI355相似的功能活性，用于在生长抑制性灵长类CNS提取物的存在下增强神经突生长晕。抗Nogo-A抗体NG004和NG034中和了粗制非人灵长类CNS提取物(包含Nogo-A)介导的神经突生长晕抑制，并在系统发育上接近人的物种中表现出生物活性的证据。将同种型对照抗体3.1(重组人抗IAV HA抗体Fab片段mAb3.1,Wyrzuckia et al.,J.Virol.88(2014),7083-7092)用作阴性对照，并且将抗Nogo-A抗体ATI355作为阳性对照。
实施例9：体内卒中小鼠模型中的血管生成
除了它的抑制神经突神经突外，Nogo-A还示出在发育中的CNS中充当血管生成的负调节物(
Figure BDA0003610104720000431
et al.,Proc Natl Acad Sci 110(2013),E1943-52)。因此，研究了在小鼠卒中模型中(Rust et al.,PNAS 116(2019),14270-14279和Watson et al.,Ann.Neurol.17(1985),497–504)，与先前建立的抗Nogo-A抗体11C7或对照抗体FG12/B5(Muranova et al.,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.60(2004),172-174)相比，单克隆抗Nogo-A抗体NG004在卒中损伤后在半暗区增加血管生成的潜力。经由植入脑室的渗透性微型泵向卒中的成年小鼠施用抗体，持续14天。21天后，处死动物并处理组织以评价半暗区中的血管网络以及抗体(NG004、11C7、FG12/B5)对血管面积分数、血管分支数、血管长度和直径以及卒中后管之间的距离的作用。因此，成年雌性小鼠(10周)根据建立的方案(Wahl et al.,Science 50(2014),1250-1255,and Bachmann et al.,J.Neurosci.34(2014),3378–3389)接受右运动皮质光照血栓性卒中。为了标记增殖的血管内皮细胞，小鼠在卒中后第6、7和8天接受了三个连续的i.p.注射5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU，50mg/kg体重，ThermoFisher)。在卒中后21天，使用Click-iT EdU Alexa Fluor 647成像套件(ThermoFisher)在40μm自由浮动冠状缝切面上检测到EdU掺入。对于持续的CNS递送，将抗体填充到带有32ga导管(CR3218，ReCathCo，LLC，2853-106Oxford Boulevard，AllisonPark，PA15101)的渗透性Alzet微型泵型号1002中并根据已知方案(Ineichen etal.,Nature Protocols 12(2017),104–131)应用于健侧脑的侧脑室。每只动物接受一个填充有指定抗体的渗透性泵：IgG1小鼠单克隆抗体11C7(阳性对照)；FG12/B5(阴性对照)；IgG1嵌合单克隆抗体NG004。所有抗体的浓度为7mg/ml。为了评估一般健康状况，每天对动物称重，并根据先前公布的方案(Shelton et al.,J.Neurosci.Methods 168(2008),431–442)记录交互式神经评分。尽管接受NG004的动物在最初几天内往往有更好的恢复，但未观察到组间的统计差异。21天后，处死动物并经心脏灌注，并根据标准方案(Rust et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 116(2019),14270–14279)获得脑切片。为了评估输注的抗体NG004、11C7和FG12/B5对半暗区内血管生成的作用，评价了对不同的生物学相关血管参数包括血管面积分数、血管长度、血管分支、血管距离和距离的变异性。此外，通过将核苷酸类似物和有丝分裂标志物EdU掺入CD-31阳性血管内皮细胞的胞核中来评估新形成的管的形成，如在用抗CD31抗体(大鼠，1:50，BDBiosciences#550274)进行免疫组织化学染色后确定的。
通过量化缺血边缘区内的CD31/EdU双阳性细胞的数目来鉴定新生成的血管。用ImageJ(FIJI)来分析图像。将图像转换为8位格式，并使用自适应阈值插件手动阈值化以获得二值化图像。应用0.5像素的中值来去除噪声。手动选择目标区(ROI)并分析所有参数；1)面积分数：ROI中已经高亮且不为零的像素百分比；2)血管长度：使用插件骨架长度工具对图像进行骨架化并分析——将ROI中所有结构的长度相加；3)通过分析骨架工具评估分支数目；4)通过计算单个管之间最小距离的NND工具计算管的距离和变异性。从计算的平均值和标准偏差，以获得有关ROI中管之间分布的平均距离和变异性的信息。将血管长度和分支数目的值归一化为目标区的总面积。用Prism 7.0(GraphPad Software Inc.)和R(R版本3.4.1)进行统计分析。对于随时间推移的组内的统计检验，使用常规的单向ANOVA随后为Dunnett多重比较检验。为了检测组间和组内随时间的差异以及对超过两个组随时间的比较，使用具有重复测量的双向ANOVA，随后为Tukey多重比较检验。对于行为恢复和出芽纤维之间的相关性分析，应用了Spearman相关性。将所有实验的显著性阈值设置为*P<0.05。较小的P值表示为**P<0.01和***P<0.001。在条形图中，所有数据都绘制为平均值±SEM(平均值的标准误差)。在箱线图中，数据表示为中位数±第25百分位(方框)和最小/最大(须)。在所有图表中，点代表动物个体。
如图8中示出，在卒中后21天，与对照组相比，经NG004和11C7治疗的动物的卒中脑组织在缺血边缘区示出更高度发达的血管床。这示出为血管占据的总面积分数增加(NG004，0.12±0.03；11C7，0.115±0.03；对照，0.07±0.01)，每mm2的分支数目增加(NG004，379.18±96.62；11C7，349.4±71.96,对照,156.79±31.82)，以及以mm/mm2的血管长度(NG004,21.90±3.83,11C7,20.03±1.69；对照，12.89±2.82)(图8A-C)。在11C7和NG004之间的任何血管参数均未检测到差异。重要的是，所有组之间的卒中大小均未检测到差异(数据未示出)。据推测，缺血边缘区更发达的血管床是通过新形成的血管生成的。因此，在血管生成高峰损伤后6-8天每日全身注射核苷酸类似物EdU(50mg/kg体重)。在缺血边缘区计数新形成的血管内皮细胞(CD31+)。观察到，与对照组(28.51±8.8)相比，接受抗Nogo-A抗体(NG004:55.20±12.7,11C7:57.30±19.57)的两组中每mm2的CD31/EdU+细胞数目的增加(图8D)。总之，与损伤后三周接受对照抗体的动物相比，已示出用抗Nogo-A抗体治疗的两组的血管修复均增强至无法区分的程度。还示出，在NG004和11C7治疗的两组中新形成的血管内皮细胞的数目增加至相同的程度。因此，NG004是用于卒中后血管修复的有效抗Nogo-A抗体。
实施例10：抗体完整性和稳定性
为了分析抗体的稳定性和完整性，根据标准方案(Porath&Flodin,Nature 183(1959),1657-1659)进行尺寸排阻色谱法法(SEC)。简而言之，将抗体透析到不同的缓冲剂中。透析后，将抗体转移到试管中并在40和4℃下孵育长达9周。在第1、2、4和9周时，抽取样品并注入SuperdexTM200增加柱的Amersham的100μl环中，流速为0.75ml/min；使用在pH7.4下的Dulbecco PBS作为运行缓冲剂。
如图9A和B中示出，抗体NG004在不同的pH值(pH 6、7.4、8)和在人造CSF中以及在反复冷冻-解冻循环后高度稳定。此外，未观察到降解和聚集，并且保持了亲合力(数据未示出)。
实施例11：用NG004治疗后活动任务的功能恢复
在单侧光照血栓性卒中的大鼠模型中评价了鞘内应用后，人NG004单克隆抗Nogo-A抗体与先前建立的抗Nogo-A抗体11C7或对照抗体(“抗BrdU”)相比在运动功能恢复上，尤其是在熟练前肢的功能恢复上的临床前疗效。
为了解决功能恢复，对适应环境和处理良好的年轻成年雌性Long-Evans大鼠进行了精细运动行为任务(水平阶梯测试)的训练，并在三个疗程中记录了它们的基线行为表现。然后应用针对感觉运动皮质的光照血栓性卒中，并经由渗透性泵向卒中大鼠鞘内施用抗体(11C7；NG004(IgG1嵌合单克隆抗体NG004)；抗BrdU)，持续14天。在卒中诱导后(损伤后4天(dpi))以及长达9周(7、14、21、28、35、42、49、56和63dpi)每周记录一次动物的行为表现。
将40只大鼠分为以下组：
1.NG004_4mg:10只大鼠接受14天累积剂量的4mg的NG004；
2.NG004_8mg:10只大鼠接受14天累积剂量的8mg的NG004；
3. 11C7：10只大鼠接受14天累积剂量的4mg的11C7(阳性对照)；
4.抗BrdU：10只大鼠接受14天累积剂量的4mg的针对BrdU的鼠单克隆抗体(阴性对照)，
其中，必须处死四只动物(第1组的两只动物和第2组的一只动物和第4组的一只动物)。
将动物安置在单独通风的笼子(IV型)中，每组三只，在恒定的12h黑暗/光照循环下，随意进食和饮水。在从供应商(Janvier.Labs,LeGenest-Saint-Isle，法国)处到达后，将40只雌性Long Evans大鼠(年龄：12-16周，体重：200-250g)在动物设施中适应一周。之后，实验者在实验开始前一周根据标准程序处理动物，以降低应激水平。
不规则水平阶梯步行测试是用于评价熟练步行的运动和协调测试，其中判断特定前爪在不规则间隔的阶梯梯级上的位置；参见Maier et al.,J Neurosci.28(2008),9386-403.。水平阶梯步行测试装置由金属梯级(直径3mm)和透明Plexiglas制成的侧壁组成，可以将其插入以创建阶梯跑道，梯级之间的最小距离为1cm，以及总长度为1m。梯级不规则地间隔开，以唤起对具有最大距离为3cm的台阶位置的皮质重新评估。连续三天记录基线水平阶梯性能。每场记录三次运行，并在所有运行的高速视频记录中分析爪子在梯级上的位置。
如先前在Lindau et al.,Brain 137(2014),739-756和Watson et al.,Annalsof Neurology 17(1985),497-504中所述的，所有动物都接受了单侧光照血栓性卒中以使其优选爪子的感觉运动皮质病变。这些动物从它们的损伤中恢复得很好。受影响的前肢示出瘫痪的体征，但动物能够行走、攀爬、进食和梳理自己。对于持续的CNS递送，通过填充有指定的抗体的经准备的渗透性泵递送抗体，在光照血栓性卒中手术后立即将导管插入腰部液体空间。14天后移除泵并开始行为测试。对于水平阶梯数据的分析，将正确前肢/爪子放置的成功率计算为相应肢体所走总步数的百分比。
使用Prism 7.0(GraphPad Software Inc.)进行统计分析。对于随时间推移的组内统计检验，使用双向ANOVA，随后进行LSD(最小显著差数)Fisher检验。为了检测特定时间点的组间差异，使用未配对的单尾t检验。对于行为恢复与CST颈脊髓萌芽之间的相关性分析，应用了Spearman相关性。将所有实验的显著性阈值设定为*P<0.05。较小的P值表示为**P<0.01和***P<0.001。在条形图中，所有数据都绘制为平均值±SEM(平均值的标准误差)。在所有图表中，点代表动物个体。
与经对照抗体治疗的动物相比，经抗Nogo-A治疗的动物在水平阶梯任务中示出改进的功能恢复。
在损伤后第4天，所有动物的成功率均示出相当的下降(对于抗BrdU：下降至34.43％±8.08％，对于抗Nogo-A治疗11C7：下降至38.37％±4.87％，对于NG004 4mg/ml下降到34.85％±6.12％，对于NG004 8mg/ml下降到33.75％±5.25％)。从第14天开始，与经抗BrdU治疗的动物相比，经抗Nogo-A抗体NG004 8mg/ml和11C7治疗的动物的性能持续提高，并在损伤后第63天达到显著性差异；参见图10。因此，结果示出抗Nogo-A抗体NG004治疗导致需要精细运动控制的活动任务的更好恢复，如不规则的水平阶梯交叉所示。
实施例12：抗Nogo-A抗体NG004具有降低的补体依赖性CDC
进行C1q结合ELISA测定以分析关于抗Nogo-A抗体的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性的Fc特征，其中，测量人C1q(SigmaC1740-5mg)的沉积。在1μg/ml抗体包被的聚苯乙烯板上评估C1q沉积，将该板用八种不同浓度的C1q(1.2至20μg/ml)在TBS-0.1％v/v吐温200.15mM CaCl2和1mM MgCl2中在37℃下孵育1小时。对于检测，使用绵羊抗人C1q多克隆抗体(biorad2221-5004P)。使用具有已知作用机制的两种临床抗体作为对照。将利妥昔单抗(人IgG1)作为阳性对照，以及那他珠单抗(人IgG4)作为阴性对照。NG004 IgG4 S228P的内部阳性对照是IgG1同种型中的NG004。10min后，用1M HCl终止比色TMB反应，并在TECAN Spark读板器上测量450nm处的OD。
与IgG1同种型相比，NG004 IgG4 S228P抗Nogo-A抗体和那他珠单抗显示出降低的C1q结合活性；参见图11。这些结果示出NG004 IgG4 S228P的行为与其他IgG4相似，并且具有降低的CDC。
序列表
<110> 诺华康制药股份公司（NOVAGO THERAPEUTICS AG)
<120> 新型抗-Nogo-A抗体
<130> PPI22170393DE
<150> EP 19205006.0
<151> 2019-10-24
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<223> NG004可变重链(VH)序列
<400> 1
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agg agc cat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His
20 25 30
gct atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gca gtt aca tca tat gat gga acc aat aaa tac tac gca gac tcc gtg 192
Ala Val Thr Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cga ttc acc atc tcc aaa gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
ctg caa atg gac agc ctc aga gtt gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga ggc cga gca gtg gct ggt acg agg gaa gat tat tgg ggc cag 336
Ala Arg Gly Arg Ala Val Ala Gly Thr Arg Glu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 360
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Thr Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Ala Val Ala Gly Thr Arg Glu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Ser His Ala Met His
1 5
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Val Thr Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Gly Arg Ala Val Ala Gly Thr Arg Glu Asp Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 339
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<223> NG004可变κ链(VK)序列
<400> 6
gac atc cag atg acc cag tct cca gac tcc ctg gct gtg tct ctg ggc 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
gag agg gcc acc atc aac tgc aag tcc agc cag agt gtt tta ttc agc 96
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Phe Ser
20 25 30
tcc aac agt aag aac tac tta gct tgg tac cag cag aaa cca gga cag 144
Ser Asn Ser Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
cct cct aag gtg ctc att tac tgg gca tct acc cgg gaa tcc ggg gtc 192
Pro Pro Lys Val Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
cct gac cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc act ctc acc 240
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
atc agc agc ctg cag gct gaa gat gtg gca gtt tat tac tgt cag caa 288
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
tat tat act act cgc cct acg ttc ggc cta ggg acc aaa gtg gat atc 336
Tyr Tyr Thr Thr Arg Pro Thr Phe Gly Leu Gly Thr Lys Val Asp Ile
100 105 110
aaa 339
Lys
<210> 7
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Phe Ser
20 25 30
Ser Asn Ser Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Val Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Thr Thr Arg Pro Thr Phe Gly Leu Gly Thr Lys Val Asp Ile
100 105 110
Lys
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Phe Ser Ser Asn Ser Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Gln Gln Tyr Tyr Thr Thr Arg Pro Thr
1 5
<210> 11
<211> 342
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(342)
<223> NG034可变重链(VH)序列
<400> 11
gag gtg cag ctg gtg gag act ggg gga ggc ttg gtc cca ccg ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Pro Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc acc aac tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
tct atg cac tgg gtc cgc ctg gct cca ggg aag aga ctg gaa tat att 144
Ser Met His Trp Val Arg Leu Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
tca gct att agt agt gat ggc ggt gac cca ttt tat gca agc tct gtg 192
Ser Ala Ile Ser Ser Asp Gly Gly Asp Pro Phe Tyr Ala Ser Ser Val
50 55 60
aag ggc aga gtc gcc atc tcc aga gac aat tcc aag aag acg ttg tat 240
Lys Gly Arg Val Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Tyr
65 70 75 80
ctt caa atg ggc aga ctg aga cct gag gac acg gct gta tat tat tgt 288
Leu Gln Met Gly Arg Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gtg agt gat gct ttt gat gtc tgg ggc cag ggg aca atg gtc acc gtc 336
Val Ser Asp Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
100 105 110
tct tcg 342
Ser Ser
<210> 12
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Pro Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Leu Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ser Asp Gly Gly Asp Pro Phe Tyr Ala Ser Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Val Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Gly Arg Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ser Asp Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Asn Tyr Ser Met His
1 5
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Ala Ile Ser Ser Asp Gly Gly Asp Pro Phe Tyr Ala Ser Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Asp Ala Phe Asp Val
1 5
<210> 16
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<223> NG034可变κ链(VK)序列
<400> 16
gaa att gtg ctg acc cag tct cca ctc tcc ctg tcc gtc acc ctt gga 48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
cag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt caa agc ctc cta tac agt 96
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
aat ggc aac acc tac ttg aat tgg ttt cag cag agg cca ggc caa tct 144
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
cca agg cgc cta ctt tat agg gtt tct aac cgg gac tct ggg gtc cca 192
Pro Arg Arg Leu Leu Tyr Arg Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
gac aga ttc agc ggc agt ggg tca ggc act cat ttc aca ctg aaa att 240
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
agt agg gtg gag gct gag gat gtt gga gtt tat tac tgc atg caa ggt 288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
aca cac tgg cct cgc acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa 336
Thr His Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 17
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Leu Tyr Arg Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 18
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 19
Arg Val Ser Asn Arg Asp Ser
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Met Gln Gly Thr His Trp Pro Arg Thr
1 5
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由NG004识别的最小表位
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(7)
<223> 由抗体NG004识别的最小表位
<400> 21
Ile Asn Ala Ala Leu Gln Glu
1 5
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽34
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(15)
<223> 肽34: Nogo-A d20加区的第133-147位氨基酸
<400> 22
Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gln Glu
1 5 10 15
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽35
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(15)
<223> 肽35: Nogo-A d20加区的第137-151位氨基酸
<400> 23
Glu Pro Glu Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gln Glu Thr Glu Ala Pro
1 5 10 15
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽36
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(15)
<223> 肽36: Nogo-A d20+区的第141-155位氨基酸
<400> 24
Ile Asn Ala Ala Leu Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile
1 5 10 15

Claims (15)

1.一种人源重组单克隆抗Nogo-A抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段与Nogo-A-Δ20结构域结合并且能够在卒中半暗区中诱导剂量依赖性神经突生长晕和/或血管生成。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段与包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列或由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成肽相结合，和/或包括含有VN互补决定区(CDR)1、2和3的可变重(VH)链和含有VL CDR 1、2和3的可变轻(VL)链，其中：
(a)VH-CDR1包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其变体，其中，所述变体包括一个或两个氨基酸置换，
(b)VH-CDR2包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其变体，其中，所述变体包括一个或两个氨基酸置换，
(c)VH-CDR3包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其变体，其中，所述变体包括一个或两个氨基酸置换，
(d)VL-CDR1包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其变体，其中，所述变体包括一个或两个氨基酸置换，
(e)VL-CDR2包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其变体，其中，该变体包括一个或两个氨基酸置换，以及
(f)VL-CDR3包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其变体，其中，所述变体包括一个或两个氨基酸置换；或者
其中，所述抗体包括含有CDR 1、2和3的VH链，和/或含有VLCDR 1、2和3的VL链，其中：
(g)VH-CDR1包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列或其变体，其中，所述变体包括一个或两个氨基酸置换，
(h)VH-CDR2包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其变体，其中，所述变体包括一个或两个氨基酸置换，
(i)VH-CDR3包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列或其变体，其中，所述变体包括一个或两个氨基酸置换，
(j)VL-CDR1包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列或其变体，其中，所述变体包括一个或两个氨基酸置换，
(k)VL-CDR2包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列或其变体，其中，所述变体包括一个或两个氨基酸置换，以及
(l)VL-CDR3包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列或其变体，其中，所述变体包括一个或两个氨基酸置换。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中：
(a)所述VH包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其变体，其中，所述变体包括一个或多个氨基酸置换；和
(b)所述VL包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或其变体，其中，所述变体包括一个或多个氨基酸置换；优选地，其中：
所述VH和VL氨基酸序列与SEQ ID NO:2和7分别具有至少90％的同一性；或者
(c)所述VH链包括SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其变体，其中，所述变体包括一个或多个氨基酸置换；和
(d)所述VL包括SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其变体，其中，所述变体包括一个或多个氨基酸置换；优选地，其中：
所述VH和VL链氨基酸序列与SEQ ID NO:12和17分别具有至少90％的同一性。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，进一步包括免疫球蛋白重链恒定区、免疫球蛋白轻链恒定区，优选地，其中，所述免疫球蛋白重链和/或轻链恒定区为IgG型。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，包括具有与IgG相比降低的效应物功能的恒定结构域Fc区；优选地，其中，所述恒定结构域为IgG4类。
6.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段为包括S228P突变的IgG4类或同种型。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段选自由以下项组成的组：单链Fv片段(scFv)、F(ab')片段、F(ab)片段和F(ab')2片段、Fd、Fv、单链抗体和二硫键连接的Fv(sdFv)和/或为嵌合鼠-人抗体。
8.编码权利要求1至7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或其免疫球蛋白VH和VL的一种或多种多核苷酸，优选地，其中，所述多核苷酸是cDNA和/或可操作地连接至异源核酸。
9.包括权利要求8所述的一种或多种多核苷酸的一种或多种运载体。
10.包括权利要求8所述的一种或多种多核苷酸或权利要求9所述的一种或多种运载体的宿主细胞。
11.一种用于制备抗Nogo-A抗体、其抗原结合片段或一种或多种免疫球蛋白链的方法，所述方法包括：
(a)培养权利要求10所述的细胞；和
(b)从培养物中分离所述抗体、其抗原结合片段或一种或多种免疫球蛋白链。
12.由权利要求8所述的一种或多种多核苷酸编码或者通过权利要求11所述的方法能够获得的抗体、其抗原结合片段或者一种或多种免疫球蛋白链。
13.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求12所述的抗体或其抗原结合片段，其是
(i)用选自由以下项组成的组的标记物可检测地标记：酶、放射性同位素、荧光化合物、化学发光化合物、生物发光化合物、标签、标记和重金属；
(ii)附接至药物；或者
(iii)包括聚乙二醇。
14.一种组合物，所述组合物包括权利要求1至7、12或13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求8所述的一种或多种多核苷酸、权利要求9所述的一种或多种运载体或权利要求10所述的细胞，优选地，所述组合物是
(i)药物组合物，并且进一步包括药学上可接受的载体；或者
(ii)诊断组合物并且被设计为试剂盒，任选地进一步包括常规用于基于免疫的诊断方法中的试剂。
15.根据权利要求1至7、12或13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求8所述的一种或多种多核苷酸、根据权利要求9所述的一种或多种运载体或根据权利要求10所述的细胞，用于治疗包括视网膜在内的外周(PNS)和/或中枢(CNS)神经系统的疾病或创伤的用途，或者用于在体内检测人或动物体内的Nogo-A的用途，优选地，其中，所述疾病是神经退行性疾病和眼科疾病，所述神经退行性疾病选自由阿尔茨海默病，帕金森病，肌萎缩侧索硬化(ALS)，路易样病理和其他一般性痴呆，颅侧、脑或脊创伤后的疾病，卒中，颅脑损伤、脱髓鞘性病变组成的组；所述眼科疾病选自由糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、湿性和干性年龄相关性黄斑变性(AMD)及其他眼科适应证组成的组。
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